KR20110108390A - 레이저로 매개된 박막 절개 및 세포 군체의 이동 - Google Patents

레이저로 매개된 박막 절개 및 세포 군체의 이동 Download PDF

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Abstract

본 명세서에 개시되는 것은 세포 군체를 박막절개하는 방법 및 장치이다. 또한, 개시되는 것은 세포 군체를 정제하는 방법이다. 세포 군체를 박막 절개하는 방법은 알려진 두께를 포함하는 배양 플레이트상에 세포 군체를 제공하는 단계; 자동화 초점 기술을 사용하여 배양 플레이트의 바닥에 배치하는 단계; 및 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법을 수행하기 위한 장치 또한 개시된다.

Description

레이저로 매개된 박막 절개 및 세포 군체의 이동{LASER MEDIATED SECTIONING AND TRANSFER OF CELL COLONIES}
본원은 2009년 1월 12일에 출원된 미국 가출원번호 61/144,101호, 발명의 명칭 "LASER MEDIATED SECTIONING AND TRANSFER OF CELL COLONIES"에 대하여 우선권을 주장하며, 전체가 본 명세서에 참조로서 포함된다.
최근, 주목받는 세포의 기술에서, 특히 줄기세포에 대한 관심이 증가되었다. 줄기세포의 경우에, 상기 주목받는 세포의 기술은 생물학적 과정으로의 새로운 이해를 제공하고, 다양한 질환에 대하여 새롭고 개선된 치료를 제공하기 위하여 줄기세포의 가능성에 기여할 수 있다.
줄기세포는 신체 내에서 수많은 종류의 세포 유형으로 진화할 수 있는 가능성을 갖는다. 신체에 대한 일종의 회복 시스템으로 역할하기 때문에, 줄기세포는 인간 또는 동물이 살아 있는 한 다른 세포를 보충하는 것으로 제한되지 않고 이론적으로 나뉠 수 있다. 줄기세포가 나누어지면, 각각의 새로운 세포는 줄기세포로 남아 있거나, 또는 근세포, 적혈구세포 또는 뇌세포와 같은 더 특화된 기능을 갖는 다른 세포 유형으로 될 가능성을 가진다. 따라서, 줄기세포 및 다른 세포 기술을 개발하는데에 많은 관심이 있고, 그 결과 개선된 배양 기술에 대한 요구도 증가되었다.
많은 줄기세포를 포함하는 세포 배양조직의 특정 유형은 군체로 성장한다. 성장을 증가시키기 위해, 이러한 세포를 배양하는 것은 상기 군체를 세포로 구성된 균일하거나 반균일한 아군체로 박막 절개(즉, 부수거나, 나누거나, 분리함)하는 것이 종종 필요하다. 박막 절개를 달성하기 위한 알려진 방법은 직선자 또는 화학물질의 첨가를 이용하여 군체를 손으로 얇게 자르는 것을 종종 수반한다. 이런 방법은 군체 중의 상당한 수의 세포를 종종 손상하고, 고속 대량 응용에 대해 충분히 빠르지 않다.
이어지는 공개문헌은 본 명세서에 설명되는 기술과 관련이 있고, 이들의 방법, 조성물, 장치 등의 모든 것이 참조로 본 명세서에 포함되며, 본 명세서에서 설명되는 방법, 시스템 및 장치에 임의의 조합으로 활용될 수 있다.
아래의 참고문헌들은 참고로 전체가 포함되어 있다. 미국특허 제7,129,070호 미국특허 제6,534,308호 미국특허 제6,514,722호
Thomson J.A, 등, "Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts" (1998) Science; 282: 1145-1147. Reubinoff B.E., 등, "Embryonic stem cell lines from human blastocyst: Somatic differentiation in vitro. (2000) Nat. Biotechnol; 18:399-404. Draper J. S., 등, "Recurrent gains of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells" (2004) Nat. Biotechnol.; 22:53-54. Buzzard J.J., 등, "Karyotype of human ES cells during extended culture" (2004) Nat. Biotechnol.; 22:381- 382. Mitalipova M., 등, "Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells" (2005) Nat. Biotechnol.; 23:19-20. Oh S.K., 등, "Methods for expansion of human embryonic stem cells" (2005) Stem Cells; 23:605-609. Joannides A., 등, "Automated Mechanical Passage: A novel and efficient method for human embryonic stem cell expansion" (2006) Stem Cells 24:230-235; Thomson, H., "Bioprocessing of embryonic stem cells for drug discovery" Review. (2007) Trends Biotechnol.; 25:224-230. Terstegge S., 등, "Automated maintenance of embryonic stem cell cultures" (2007) Biotechnol. Bioeng.; 96:195-201. Takahashi K., 등, "Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblast by defined factors" (2007) Cell; 131:861-872. Koller, MR., "High-Throughput Laser-Mediated In Situ Cell Purification With High Purity and Yield" (2004) Cytometry; 61A:153-161. Valamehr B., 등, "Hydrophobic surfaces for enhanced differentiation of embryonic stem cell-derived embryoid bodies" (2008) PNAS; 105:14459-14464. Bauwens C, 등, "Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories" (2008) Stem Cells; 26:2300-2310. Ungrin M., 등, "Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates" (2008) PLOS One; 3:1565-1-12. Burridge P., 등, "Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability" (2007) Stem Cells; 25:929-938.
본 명세서에서 논의되는 것은 세포 군체 및 모든 배양조직에 대하여 박막 절개 기술의 속도 및 효율을 개선하는 방법 및 장치이다.
본 명세서에서 설명되는 시스템, 방법 및 장치 각각은 다양한 양태를 가질 수 있으며, 이러한 양태들 중 어느 하나는 바람직한 속성에 대해 단독으로 책임이 있다. 이어지는 청구항에 나타낸 것으로 본 개시물의 범위를 제한하지 않으며, 본 발명의 더 중요한 특징은 이제 간략히 설명될 것이다. 이 설명을 고려한 후에, 구체적으로는 "발명의 상세한 설명" 부분을 읽은 후에, 이 기술의 특징이 어떠한 효과를 제공하는지를 이해할 것이다.
일 양태에서, 세포 군체를 박막 절개하는 방법은, 예를 들어 표면상에 살아있는 세포 군집을 제공하는 단계; 상기 세포 군집을 이미징하는 단계; 상기 군체를 이미지에서 식별될 수 있는(예를 들어, 표현형을 보이는 세포는 이미지를 사용하여 식별될 수 있음) 소정의 표현형에 근거하여 박막 절개하기 위하여 군체를 선택하는 단계; 이미지에서 상기 군체의 모서리의 적어도 일부분을 식별하는 단계; 나머지 배양조직으로부터 상기 군체를 분리하기 위하여 상기 군체의 식별된 모서리에 전자기 복사를 가하는 단계; 및 전자기 복사를 사용하여 하나 이상의 조각으로 상기 군체를 박막 절개하는 단계를 포함할 수 있다. 이 개시물의 문맥에서, 상기 용어 "군체"는 밀접하게 관련된 세포의 집단을 의미하는 것으로 이해되며, 상기 용어 "아군체(subcolony)"는 박막 절개된 큰 군체로부터 유래되는 밀접하게 관련된 세포의 작은 집단을 의미하는 것으로 이해된다. 그러므로, 큰 군체는 다수의 아군체들 또는 밀접하게 관련된 세포의 조각들로 박막 절개되거나 나누어진다.
다른 양태에서, 세포 군체를 박막 절개하는 방법은, 예를 들어 표면상에 살아있는 세포 군체를 제공하는 단계; 상기 세포 군체를 이미징하는 단계; 상기 이미지에서 식별되는(예를 들어, 표현형을 보이는 세포는 이미지를 사용하여 식별될 수 있음) 소정의 표현형을 보이는 특정 군체를 선택하는 단계; 및 전자기 절단선의 패턴을 사용하여 하나 이상의 조각으로 상기 군체를 박막 절개하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 세포 군체를 박막 절개하는 방법은, 예를 들어 표면상에 세포 군체를 제공하는 단계; 상기 세포 군체를 이미징하는 단계; 이미지화된 세포 군체를 전자기 복사 절단선에 대한 패턴으로 분할하는 단계; 및 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하기 위하여 전자기 복사 절단선의 분할된 패턴에 따라 상기 세포 군체에 전자기 복사를 가하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 세포 군체를 박막 절개하는 방법은, 예를 들어 배양조직의 표면상에 세포 군체를 제공하는 단계; 바닥의 두께에 대한 지식 없이 자동화 초점 기술을 사용하여 실제 배양조직 표면의 최적의 초점 위치(focal position)를 찾아내는 단계; 박막 절개를 위한 최적의 초점 위치에 상기 배양조직 표면을 배치하는 단계; 및 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 배양조직 전체 또는 일부를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 세포 군체를 박막 절개하는 방법은, 예를 들어 표면에 살아있는 세포 군체를 제공하는 단계; 상기 세포 군체를 이미징하는 단계; 상기 군체를 이미지에 도시될 수 있는(예를 들어, 표현형을 보이는 세포는 이미지를 사용하여 식별될 수 있음) 소정의 표현형에 근거하여 박막 절개하기 위하여 군체를 선택하는 단계; 상기 이미지에서 상기 군체의 모서리의 적어도 일부분을 식별하는 단계; 나머지 배양조직으로부터 상기 군체를 분리하기 위하여 상기 특정 군체의 식별된 모서리에 전자기 복사를 가하는 단계; 및 이후에, 식별되지 않은 모든 세포를 제거하여 상기 특정 군체를 박막 절개해내기 위하여, 나머지 배양조직에 전자기 복사를 가하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 세포 군체를 박막 절개하는 방법은, 예를 들어 알려진 바닥 두께를 포함하거나 가질 수 있는, 배양 플레이트 상에 세포 군체를 제공하는 단계; 상기 배양 플레이트의 바닥면의 밑면을 식별하기 위하여 자동화 초점 기술을 사용하여 레이저 절단하기 위하여, 최적의 초점 위치에 상기 배양판을 배치하고, 상기 바닥의 알려진 두께에 근거하여 적절한 z-오프셋(offset)을 적용하는 단계; 및 상기 최적의 초점 면에 집중시키는 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 세포 군체를 박막 절개하는 방법은, 예를 들어 배양조직 표면상에 세포 군체를 제공하는 단계; 하부 두께에 대한 지식 없이 자동화 초점 기술을 사용하여 상기 배양조직 표면의 최적의 초점 위치를 찾아내는 단계; 박막 절개를 위한 상기 최적의 초점 위치에서 상기 배양조직 표면을 배치하는 단계; 및 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 일부 배양조직 또는 전체 배양조직을 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서 상기 방법은, 예를 들어 투과광을 사용하여 세포 군체를 이미징한다. 일부 실시예에서 상기 투과광은, 예를 들어 명시야(BF)일 수 있다. 일부 실시예에서 상기 투과광은, 예를 들어 위상차(phase contrast)일 수 있다. 일부 실시예에서 상기 투과광은, 예를 들어 암시야일 수 있다. 일부 실시예에서 상기 투과광은, 예를 들어 미분간섭(differential interference contrast)일 수 있다. 일부 실시예에서 상기 세포 군체의 이미징 단계는, 예를 들어 형광을 사용하는 이미징 단계일 수 있다. 일부 실시예에서 상기 군체의 박막 절개는, 예를 들어 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광열적 메커니즘을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 광열적 메커니즘은, 예를 들어 레이저 파장을 흡수하도록 구성되는 염료를 첨가하여 온도의 상승을 초래하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 광열적 메커니즘은 제자리에서 세포를 광응고(photocoagulate)하도록 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 세포는 상기 레이저의 초점 위치에서 사멸될 수 있다. 일부 실시예에서, 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광기계적(photomechanical) 메커니즘을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 광기계적 메커니즘은 상기 레이저의 초점 위치에서 세포의 물리적 파괴를 수반할 수 있다. 일부 실시예에서, 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광화학적 메커니즘을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 광화학적 메커니즘은 상기 레이저의 초점면에서 선택적 세포사멸(apoptosis)을 유도하도록 UV 레이저를 사용할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 광기계적, 광열적, 및/또는 광화학적 메커니즘은 배양조직을 하나 이상의 조각으로 레이저 매개된 박막 절개를 가능하게 하도록 시약을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 레이저는 연속파 레이저일 수 있거나, 일련의 고 에너지 펄스를 전달하는 펄스화 된 레이저일 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 세포 군체는 예를 들어, 1, 6, 12, 24, 48, 96 또는 384개의 웰 플레이트를 갖는 다수의 웰(well)을 갖는 장치에 포함될 수 있다.
일부 실시예에서 상기 방법은, 예를 들어 박막 절개된 하나 이상의 조각을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시예에서 상기 박막 절개된 하나 이상의 조각의 제거 단계는, 예를 들어 제 1 배양 용기의 유체 중의 현탁액으로 하나 이상의 조각을 옮기는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서 상기 박막 절개된 하나 이상의 조각의 제거 단계는, 예를 들어 상기 제 1 배양 용기의 유체 중의 현탁액으로 하나 이상의 조각을 옮기기 전에 효소와 같은 화학 물질을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서 상기 방법은, 예를 들어 제 2 배양 용기로 상기 하나 이상의 조각을 옮기는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서 상기 제 2 배양 용기는 1, 6, 12, 24, 48, 96 또는 384개의 웰 플레이트와 같은 다수의 웰을 갖는 장치일 수 있다. 일부 실시예에서 상기 박막 절개된 하나 이상의 조각을 제거하는 단계는, 예를 들어 유체 피펫팅(pipetting) 기술을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 유체 피펫팅 기술은 전동식일 수 있다. 일부 실시예에서 상기 방법은, 예를 들어 잔류 배양보조세포층을 씻어내는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 실시예에서 상기 세포 군체는, 살아있는 배아줄기(ES)세포 또는 유도 다분화능(pluripotent) 줄기(iPS)세포를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서 상기 세포 군체는, 예를 들어 ES 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서 상기 세포 군체는, 예를 들어 iPS 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서 상기 세포 군체는, 예를 들어 종양 타원체(tumor spheroids), 배양체, 뉴로스피어(neurosphere), 생식선 줄기세포, 태생암세포, 유방암 줄기세포, 암 줄기세포와 같은 비-ES/iPS 세포, 또는 세포의 집합으로 군체를 형성할 수 있는 임의의 세포 유형을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서 전자기복사 절단선은, 예를 들어 격자 패턴을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 전자기 복사 절단선의 패턴은 세포 군체의 경계로 제한될 수 있다. 일부 실시예에서 상기 방법은, 예를 들어 상기 군체를 박막 절개하기 이전에 이미지화된 세포 군체를 분절하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 세포 군체를 박막 절개하는 방법은, 예를 들어 배양조직 표면상에 살아있는 세포 군체를 제공하는 단계; 상기 세포 군체를 이미징하는 단계; 상기 군체에 대하여 상기 이미지에서 나타나는 원하는 표현형을 근거로 하여 박막 절개하기 위하여 군체를 선택하는 단계; 상기 이미지에서 상기 군체의 모서리의 적어도 일부를 식별하는 단계; 상기 배양조직의 나머지로부터 상기 군체를 분리하기 위하여 상기 군체의 식별된 모서리에 전자기 복사를 가하는 단계; 및 전자기 복사를 사용하여 상기 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서 상기 군체를 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서 상기 군체를 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 펄스당 약 1 μJ 내지 약 50 μJ의 레이저 에너지로 방출될 수 있는 일련의 레이저 펄스의 사용을 포함한다. 일부 실시예에서 상기 군체를 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 약 1 μm 내지 20 μm의 레이저 점(spot) 반경으로 방출될 수 있는 일련의 레이저 펄스의 사용을 포함한다. 일부 실시예에서 상기 군체를 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 한번 내지 다섯 번의 레이저 펄스를 방출할 수 있는 일련의 532 nm 레이저 펄스의 사용을 포함한다. 일부 실시예에서 상기 군체를 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 한번 내지 다섯 번 레이저가 반복하여 방출될 수 있는 일련의 약 532 nm 레이저 펄스의 사용을 포함한다. 일부 실시예에서 상기 군체를 박막 절개하는 단계는, 펄스 간격이 약 5 μm 내지 약 50 μm인 레이저 절단선의 패턴을 포함한다. 일부 실시예에서 상기 군체를 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 격자 간격이 약 5 μm 내지 100 μm인 레이저 격자의 패턴을 포함한다. 일부 실시예에서 상기 군체를 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 약 20 μm 내지 약 2000 μm로 배치된 레이저 절단선의 정사각형 패턴을 포함한다. 일부 실시예에서 상기 군체를 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 박편의 비효소 제거를 위해 약 20 μm 내지 약 300 μm 이격되어 배치된 레이저 절단선의 정사각형 패턴을 포함한다. 일부 실시예에서 상기 군체를 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 줄기세포에서 성숙한 특정 세포 유형으로의 분화에 사용하기 위하여 약 250 μm 내지 약 2000 μm 이격되어 배치된 레이저 절단선의 정사각형 패턴을 포함한다. 일부 실시예에서 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광열적 메커니즘을 포함한다. 일부 실시예에서 상기 광열적 메커니즘은, 예를 들어 레이저 에너지의 흡수율을 높이도록 구성되는 염료를 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광열적 메커니즘은 제자리에서 세포를 광응고하도록 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 세포는 레이저의 초점 위치에서 사멸된다. 일부 실시예에서 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광기계적 메커니즘을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광기계적 메커니즘은 레이저의 초점 위치에서 세포의 물리적 파괴를 수반한다. 일부 실시예에서 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광화학적 메커니즘을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광화학적 메커니즘은 레이저의 초점면에서 선택적 세포사멸을 유도하도록 UV 레이저를 사용한다.
또 다른 양태에서 세포 군체를 박막 절개하는 방법은, 예를 들어 표면상에 살아있는 세포 군체를 제공하는 단계; 상기 세포 군체를 이미징하는 단계; 상기 이미지에서 식별가능한 원하는 표현형을 보이는 특정 군체를 선택하는 단계; 및 전자기 절단선의 패턴을 사용하여 상기 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서 상기 군체를 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광열적 메커니즘을 포함한다. 일부 실시예에서 상기 광열적 메커니즘은, 예를 들어 레이저 에너지의 흡수율을 높이도록 구성되는 염료를 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광열적 메커니즘은 제자리에서 세포를 광응고하도록 구성될 수 있다. 일부 실시예에서 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광기계적 메커니즘을 포함한다. 일부 실시예에서 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광화학적 메커니즘을 포함한다. 일부 실시예에서, 광화학적 메커니즘은 레이저의 초점면에서 선택적 세포사멸을 유도하도록 UV 레이저를 사용한다.
또 다른 양태에서 세포 군체를 박막 절개하는 방법은, 예를 들어 표면상에 세포 군체를 제공하는 단계; 상기 세포 군체를 이미징하는 단계; 전자기 복사 절단선에 대한 패턴으로 이미지화된 세포 군체를 분절하는 단계; 및 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하기 위한 전자기 복사 절단선의 분리된 패턴에 의하여 상기 세포 군체에 전자기 복사를 가하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서 상기 세포 군체를 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광열적 메커니즘을 포함한다. 일부 실시예에서 상기 광열적 메커니즘은, 예를 들어 레이저 에너지의 흡수율을 높이도록 구성되는 염료를 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광열적 메커니즘은 제자리에서 세포를 광응고하도록 구성된다. 일부 실시예에서 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광기계적 메커니즘을 포함한다. 일부 실시예에서 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광화학적 메커니즘을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광화학적 메커니즘은 레이저의 초점면에서 선택적 세포사멸을 유도하도록 UV 레이저를 사용한다.
또 다른 양태에서 세포 군체를 박막 절개하는 방법은, 예를 들어 알려진 두께를 갖는 배양 플레이트상에 세포 군체를 제공하는 단계; 자동화 초점 기술을 사용하여 레이저 절단을 하기 위한 최적의 위치에 상기 배양 플레이트를 배치하는 단계; 및 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서 상기 세포 군체를 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 상기 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광열적 메커니즘을 포함한다. 일부 실시예에서 상기 광열적 메커니즘은, 예를 들어 레이저 에너지의 흡수율을 높이도록 구성되는 염료를 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광열적 메커니즘은 제자리에서 세포를 광응고하도록 구성된다. 일부 실시예에서 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광기계적 메커니즘을 포함한다. 일부 실시예에서 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계는, 예를 들어 광화학적 메커니즘을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광화학적 메커니즘은 레이저의 초점면에서 선택적 세포사멸을 유도하도록 UV 레이저를 사용한다.
일부 실시예에서 상기 방법은, 예를 들어 상기 박막 절개된 하나 이상의 조각을 제거하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서 상기 박막 절개된 하나 이상의 조각을 제거하는 단계는, 예를 들어 제 1 배양 용기의 유체 중의 현탁액으로 상기 하나 이상의 조각을 옮기는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서 상기 박막 절개된 하나 이상의 조각을 제거하는 단계는, 예를 들어 제 1 배양 용기의 유체 중의 현탁액으로 상기 하나 이상의 조각을 옮기기 이전에 효소와 같은 화학물질을 첨가하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서 상기 방법은, 예를 들어 상기 하나 이상의 조각을 제 2 배양 용기로 옮기는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서 상기 박막 절개된 하나 이상의 조각을 제거하는 단계는, 예를 들어 유체 피펫팅 기술을 포함한다. 일부 실시예에서 상기 방법은, 예를 들어 잔류 배양보조세포층을 씻어내는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시예에서 상기 세포 군체는, 살아있는 배아줄기세포 또는 유도 다분화능 줄기세포를 포함한다. 일부 실시예에서 상기 세포 군체는, 예를 들어 ES 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서 상기 세포 군체는, 예를 들어 비-ES/iPS 세포, 종양 타원체, 또는 배양체, 뉴로스피어, 배양체, 생식선 줄기세포, 태생암세포, 유방암 줄기세포, 암 줄기세포를 포함하고, 국소 영역에서 유사한 세포의 집합을 형성할 수 있는 임의의 세포 유형을 포함한다. 일부 실시예에서 패턴은, 예를 들어 격자 패턴을 포함한다. 일부 실시예에서, 전자기 복사 절단선의 패턴은 세포 군체의 경계로 제한된다. 일부 실시예에서 상기 방법은, 예를 들어 상기 군체를 박막 절개하기 이전에 이미지화된 세포 군체를 분절하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서 세포 군체를 정제하는 방법은, 예를 들어 배양조직 표면상에 살아있는 세포 군체를 제공하는 단계; 상기 배양조직의 나머지로부터 상기 세포 군체를 분리하기 위해 상기 군체의 모서리에 전자기 복사를 선택적으로 가하는 단계; 및 상기 분리된 세포 군체를 정제하기 위하여 상기 세포 군체로부터 분리되는 나머지 배양조직의 적어도 일부에 전자기 복사를 가하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 선택가능한 양태에서 상기 나머지 배양조직의 전부 또는 적어도 일부는 상기 배양조직의 나머지로부터 상기 세포 군체를 최초 분리함 없이 세포 군체로부터 분리될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 전자기 복사는 상기 나머지 배양조직의 약 50 % 내지 약 99.9 %에 가해질 수 있거나, 상기 임의의 범위로 가해질 수 있다. 일부 양태에서, 상기 전자기 복사는 세포 군체로부터 분리된 상기 나머지 배양조직 전부에 가해질 수 있다. 일부 실시예에서 상기 전자기 복사는, 예를 들어 패턴으로 가해질 수 있다. 일부 실시예에서 상기 패턴은, 예를 들어 격자 패턴일 수 있다.
또 다른 양태에서 세포 군체를 박막 절개하는 방법은, 예를 들어 배양조직 표면상에 살아있는 세포 군체를 제공하는 단계; 전자기 절단선의 패턴을 선택하는 단계; 및 전자기 복사를 사용하여 상기 살아있는 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하기 위하여 상기 세포 배양조직 표면에 상기 전자기 절단선의 패턴을 가하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서 상기 세포 군체는 단일층 세포의 일부, 예를 들어 줄기세포일 수 있다.
상기 사항은 개요이며, 따라서 필요하다면 세부사항의 단순화, 일반화 및 생략 사항을 포함한다; 따라서, 당업자는 상기 개요는 예시적인 것 일뿐이며 한정되는 의도는 아니라는 것을 알 것이다. 본 명세서에 기재된 방법, 조성 및/또는 장치 및/또는 다른 주제의 다른 양태, 특징 및 장점은 본 명세서에서 제시하는 설명에 의해 명백해질 것이다. 상기 개요는 아래 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에서 더 기술되는 개념들을 단순화한 형태로 발췌한 것을 소개하는데 제공된다. 이 개요는 청구된 주제의 중심 특징 또는 본질적인 특징을 확인하는 의도는 아니며, 청구된 주제의 범위를 결정하는 보조로서 사용되는 의도도 아니다.
본 개시물의 이전 및 다른 특징은 첨부된 도면과 연계하여 주어진, 이하 상세한 설명 및 첨부된 청구의 범위로부터 더 명백해 질 것이다. 이러한 도면은 본 개시물에 따라 일부 실시예만 묘사하며 따라서, 그 범위를 한정하는 것으로 간주해서는 안 된다는 것으로 이해되며, 본 개시물은 첨부된 도면들의 사용을 통해 더 특징적으로 그리고 상세히 기술될 것이다.
도 1은 배양보조세포 또는 세포외 기질을 둘러싸는 것으로부터 구별될 수 있는 뚜렷한 구조적 차이를 보이는 살아있는 iPS 세포 군체를 도시한다.
도 2는 세포 군체의 박막 절개 이전에 이미지 분석에 의해 식별되는 iPS 세포 군체의 모서리를 갖는 이미지를 도시한다.
도 3은 순차적인 레이저 펄스가 군체의 모서리 둘레에 전달되어, 나머지 배양조직으로부터 상기 군체가 분리된 이후에, iPS 세포 군체를 도시한다.
도 4는 레이저 절단선의 격자 패턴을 사용하여 다수의 비교적 균일한 아군체 조각으로 박막 절개된, 분리된 iPS 세포 군체를 도시한다.
도 5는 아군체 조각을 제거한 후에 여전히 온전한 배양보조세포 영역을 도시한다.
도 6은 손으로 또는 효소로 옮겨진 ES/iPS 세포 군체보다 일반적으로 더 균일한, 본 개시물의 방법을 사용하여 얻은 iPS 세포 아군체의 결과를 도시한다.
도 7은 군체의 모서리를 고려하지 않고 선택된 군체를 가로질러 배치된 레이저 절단선을 도시한다.
도 8은 군체의 모서리를 고려하지 않고 박막 절개된 배양조직으로부터 유체 압력을 분산한 후에 남은 작은 비율의 아군체 조각을 도시한다.
도 9는 특별히 세포 군체를 식별하지 않고, 임의의 군체의 모서리를 고려하지 않고 레이저 절단선으로 박막 절개된 전체 iPS 세포 배양조직을 도시한다.
도 10은 도 9에서 보여지는 상기 세포iPS 세포 배양조직을 박막 절개 하기 위하여 사용되는 전체 웰을 가로질러 배치되는 레이저 절단선의 패턴을 그림으로 나타낸 것이다. 상기 레이저 절단선(1010)은 200 μm 박편을 절단하도록 배치된다. iPS 및 ES 세포 아군체에 대한 보편적인 박편의 크기는 20 μm 내지 400 μm이다. 점(1020)은 자동 초점 조정 및 레이저 초점 조정이 수행될 웰 내부에서의 위치를 나타낸다.
도 11은 iPS 세포 배양조직을 가로질러 배치된 레이저 절단선의 패턴을 그림으로 나타낸 것이다. 도 (a)는 상기 레이저 절단선(1110)을 따라 레이저 펄스를 도시한 것이며, 이는 펄스당 1 μJ 내지 50 μJ의 레이저 에너지, 1 μm 내지 20 μm의 점 크기 반경, 및 한번 내지 다섯 번의 레이저 펄스 및/또는 반복으로 발사될 수 있다. 도 (b)는 상기 레이저 절단선(1110)을 따라 레이저 펄스간의 거리이며, 상기 거리는 보편적으로 16 μm이지만, 5 μm 내지 50 μm일 수 있다. 도 (c)는 두 개의 레이저 절단선(1110)간의 거리이며, 상기 거리는 20 μm 내지 2000 μm일 수 있다. 상기 레이저 절단선(1110)간의 거리를 변화시키는 것은 배양조직을 다양한 크기 및 형상으로 박막 절개하는 것을 가능하게 한다. 아군체의 비효소 제거를 위한 최적의 박편 크기는 20 μm 내지 300 μm이다. 줄기세포에서 성숙한 특화된 세포로의 분화에 사용하기 위한 최적의 박편 크기는 250 μm 내지 2000 μm이다. 도 (d)는 상기 세포 박편의 모서리를 느슨하게 하는 레이저 작용 때문에 상기 그림으로 나타낸 레이저 절단선보다 더 넓은 배양조직에서 실제 박막 절개선의 너비이다.
도 12는 현재 기술에 의한 군체의 균일한 박막 절개로부터 유래된 아군체 조각의 더 균일한 크기 분포를 보편적인 효소에 의한 방법(콜라게나아제 및 트립신)과 비교하여 도시한다.
도 13은 절단된 정사각형 박편의 크기 및 아군체가 전달된 후 배양조직의 하루 및 삼일 후의 크기 사이의 관계를 도시한다.
도 14a, 14b 및 14c는 현재 기술에 의해 박막 절개된 군체로부터 형성되는 더 균일하게 크기가 정해진 배양체를 콜라게나아제 처리에 의해 박막 절개된 배양체와 비교하여 도시한다.
도 15a, 15b 및 15c는 특이적으로 세포 군체를 식별하지 않고, 임의의 군체의 모서리를 고려하지 않고 가해지는 레이저 절단선(1510)으로 박막 절개되어 특정 정사각형 박편 크기인(각각 모두 250, 100, 및 1600 μm2) 전체 융합성 iPS 세포 배양조직을 도시한다.
도 16a, 16b 및 16c는 도 15a, 15b 및 도 15c에서 각각 보여지는 세 개의 크기로 박막 절개된 전체 배양조직으로부터 형성되는 특별히 크기가 정해지는 배양체를 도시한다.
도 17a는 도 17b에서 iPS 세포 배양조직을 박막 절개하기 위해 사용된 전체 웰을 가로질러 배치되는 레이저 절단선의 패턴을 그림으로 나타낸 것이다. 상기 레이저 절단선(1710)은 1000 μm의 박편을 절단하도록 배치된다. iPS 및 ES 세포로부터 EB를 생성하기 위해 사용되는 보편적인 박편의 크기는 250 μm 내지 2000 μm이다. 상기 레이저 절단선(1710)을 따라 펄스의 간격은 보편적으로 16 μm이지만, 5 μm 내지 50 μm일 수 있다. 점(1720)은 자동 초점 조정 및 레이저 초점 조정이 수행될 웰 내부의 위치를 나타낸다. 영역(1730)은, 보편적으로 25 μm 격자 간격을 사용하지만 5 μm 내지 100 μm의 레이저 격자를 사용하여 수행될 수 있는 레이저에 의해 제거되는 배양 조직에 있어서, 박편 크기가 요구되는 크기(1000 μm)보다 작은 배양조직의 영역을 정의한다. 이미지는 작은 박편을 제거한 후에 1000 μm로 박막 절개된 배양조직을 보여준다.
도 18은 본 방법에 의해 박막 절개하기 위해 사용되는 2차원 정사각형 박편 크기를 변형함으로써 지속적으로 형성되는 상이한 3차원 배양체 크기를 다양한 콜라게나아제 박막 절개와 비교하여 도시한다.
도 19는 도 15a, 15b 및 15c에서 보여지는 전체 배양조직을 박막 절개한 후 24일 째에 내배엽 세포로 iPS 세포의 분화 가능성의 결과(내배엽 특이 유전자(Sox17, FoxA2, Pdx1, Afp, 알부민)의 발현을 RT-PCR로 측정함)를 도시한다.
도 20은 도 15a, 15b 및 15c에서 보여지는 전체 배양조직을 박막 절개한 후 22일 째에 심근 세포로 iPS 세포의 분화 가능성의 결과(심근 세포 특이 유전자(Nkx2.5, Actn1, Myh6, TnnI3, NPPA)의 발현을 RT-PCR로 측정함)를 도시한다.
도 21은 도 15a, 15b 및 15c에서 보여지는 전체 배양조직을 박막 절개한 후 32일 째에 신경으로 iPS 세포의 분화 가능성의 결과(신경 특이 유전자(Pax6, 튜뷸린3, Map2)의 발현을 RT-PCR로 측정함)를 도시한다.
도 22는 핵 표지(녹색 형광 단백질로 표지된 H2B)의 가변적인 발현을 갖는 인간 ES 세포 배양조직 명시야 이미지(좌) 및 형광 이미지(우)를 도시한다. 이미지 분석은 녹색 형광 단백질의 최고 발현으로 ES 세포 군체를 식별하고, 상기 군체의 모서리를 분절하기 위하여 사용된다. 상기 이미지는 상기 세포 군체의 정제 이전에 이미지 분석에 의해 식별된 상기 군체의 모서리를 갖는 ES 세포 군체를 도시한다.
도 23은 순차적인 레이저 펄스가 군체의 모서리 주변으로 최초 전달되고(나머지 배양조직으로부터 군체가 분리됨) 이어서 격자 패턴의 레이저 펄스가 나머지 배양조직에 전달된 후에(오직 ES 군체 잔류물만 남김) 도 22의 정제된 ES 세포 군체를 도시한다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 기재된 예시적인 실시예들, 도면 및 청구항은 한정적인 것을 의미하지 않는다. 본 명세서의 교지는 예를 들면, 청구항들에 의해 정의되고 다루어지는 사항들을 포함하여 수많은 다른 방법들로 적용될 수 있다. 본 명세서의 양태들은 다양한 형태로 구체화될 수 있으며, 본 명세서에 개시된 임의의 특이적인 구조, 기능 또는 양쪽 모두가 단순히 대표적인 것이라는 사항은 명백하다. 본 명세서의 교지에 따라, 통상의 기술자는 본 명세서에 개시된 양태가 임의의 다른 양태와 독립적으로 수행될 수 있고, 이러한 양태 중 둘 이상은 다양하게 결합될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들면, 시스템 또는 장치는 구현될 수 있거나, 방법은 당업자에 의해 본 명세서에 설명된 양태를 임의로 적당한 수 만큼 또는 조합해서 사용하여 실행될 수 있다. 또한, 그러한 시스템 또는 도구는 구현될 수 있거나 그러한 방법은 본 명세서에 설명된 하나 이상의 양태 이외에, 또는 이와 달리 다른 구조, 기능성 또는 구조 및 기능성을 사용하여 실행될 수 있다. 다른 실시예가 사용될 수 있으며, 여기에 제시된 주제의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 달리 변경될 수 있다. 본 명세서에 일반적으로 설명되고 도면에 예시된 바와 같이, 본 개시물의 양태는 다양하게 다른 구성으로 배열, 치환, 조합 및 설계될 수 있으며, 이 모든 것들은 명시적으로 고려되고, 이 개시물의 일부를 이루고 있다는 것을 쉽게 알 것이다. 다른 실시예가 개시물 및 청구항 내에 속할 수 있는 것처럼, 개시된 실시예는 하기에 기재된 실시예에 한정되지 않는다는 것을 알아야 할 것이다.
발견 생물학, 약물 발견, 밀 세포 치료에서 응용을 위한 최근의 발견과 줄기세포 생물학 특히, 배아줄기세포(ES) 및 유도 다분화능 줄기세포(iPS) 생물학에 대한 금전적 지원의 상당한 증가는, 현재 가능한 규모보다 더 큰 규모로 ES/iPS 세포와 같은 줄기세포를 다루도록 상당한 중압감을 부과한다. 이러한 세포는 세포의 배양보조세포층 및/또는 복합 세포외 기질로 코팅된 표면 중 어느 하나에 단단하게 주합함으로서 성장할 수 있다. 상기 주합물(또는 세포 군체)이 특정 크기 또는 밀도에 도달하면, 줄기세포는 분화하기 시작하여서 더 이상 줄기세포, 예를 들어 ES/iPS 세포로서 유용하지 않다.
세포 군체에서 분화하지 않고 ES/iPS 세포와 같은 줄기세포를 증식시키기 위하여, ES/iPS 세포로의 증식이 지속 되도록 하기 위하여, 상기 세포 군체(아직 분화지점까지 성장하지 않음)를 더 작은 아군체 조각으로 박막 절개하기 위한 다양한 방법이 개발되어왔다. 이러한 방법의 일부는 피펫에서 액체를 상하로 흔들어서 세포 군체를 강제로 나누기 위해 피펫을 사용한다. 상기 방법의 일부는 거의 손으로 다룰 수 있는 꽤 큰 웰(예, 1, 6, 12 웰 플레이트)을 갖는 배양판 내에 바늘 또는 이와 유사한 장치를 사용하여 각각의 군체의 경계에 외접하는 수동 물리적 방법을 이용한다. 이후에, 상기 경계가 정해진 군체는 줄기세포 집단의 확장을 위한 새로운 배양 용기로 분배되기 위하여 바늘을 사용하여 작은 아군체 조각으로 나누어진다. 그 밖에 자주 사용되지 않는 방법은, 확장을 위한 새로운 배양 용기로 후속 전달('옮김')을 위해서 세포를 분리하는 효소를 처리(예, 트립신, 콜라게나아제 등)하는 것이다. 세포 군체를 나누거나 박막 절개하는 상기 방법은 보편적으로 (1) 상당한 시간, (2) 육체적 노력, (3) 제한된 확장성, 및 (4) ES/iPS 세포 배양조직을 다루는 강건하고 일상적인 고속 처리량(higher-throughput) 방법을 개발하기 어렵게 만드는 최종 군체의 넓은 크기 분포에 의해 고생한다. 또한, 이는 보편적으로 고속 처리량 생물학에서 사용되는 96 웰 및 384 웰과 같은 고밀도 다중-웰 플레이트의 사용을 일반적으로 어렵게 하며, 그 이유는 수동식 군체 조작에 대한 적합성의 부족 때문이다.
일부 실시예에서, 본 명세서에서 설명된 기술은 더 나은 생존력과 성장성을 갖는 더 균일한 크기의 군체를 야기하는 증식을 위하여, ES/iPS 세포를 거치는 개선되고, 자동화되고, 고속 처리량 및 규모를 조정할 수 있는 방법을 제공할 수 있다. 부가적으로, 상세한 설명은 표면 표지, 형태학, 및 분자로 발현된 센서 또는 리포터(reporter)와 같은 표현형 표지의 발현에 근거하여 개개의 군체를 선택할 수 있게 한다. 또한, 고속 처리량 생물학 응용에서 보편적으로 사용되는 다양한 다중-웰 플레이트의 사용을 가능하게 한다.
세포 아군체의 더 균일한 크기를 지속적으로 달성하는 능력은 전분화능(pluripotency)을 유지하는 화합물 및 물질을 검사하기 위한 더 강건한 ES/iPS 세포 배양조직의 생산을 가능하게 하고, 차후의 분화 효율 및 분화기의 유지를 개선했다. 다수의 작은 군체는 배양 조직 표면의 더 나은 적용 범위를 제공하는 다중-웰 플레이트 속으로 배치될 수 있다. 성장에 따라서, 부가적인 적용 범위를 얻을 수 있다. 이러한 적용 범위는 검사에 응용을 가능하게 하는 중요한 양태일 수 있다. 가끔, ES/iPS 세포는 나머지 군체가 분화되기 이전에 세포 군체의 하나 이상의 모서리 상에서 분화가 시작될 수 있어서, ES/iPS 세포로서 유용하지 않다. 따라서, 본 개시물의 실시예는 상기 분화된 세포로부터 유용한 ES/iPS를 분리하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 명세서에서 설명되는 기술은 특별히 요구되는 성숙한 세포 유형으로의 분화의 높은 가능성 및 효율을 갖는 특정 크기의 균일한 배양체를 생기게 하는 배양체의 직접적인 생성을 위해, 융합성 ES/iPS 세포 배양조직을 박막 절개하는, 놀랍고 예상치 못하게 개선되고, 자동화되고, 고속 처리량 및 규모를 조정할 수 있는 방법을 부가적으로 제공한다. 특정 크기의 균일한 배양체를 지속적으로 생성하는 능력은 특정 기능을 갖는 분화된 세포의 더 강건한 생산을 가능하게 한다. 바람직한 크기의 균일한 배양체 다수는 성숙한 세포 유형의 대규모 생산을 제공하는, 현탁액이 교반되는 생물 반응 장치 속으로 배치될 수 있다. 이러한 생산 능력은 임상적 응용을 위해 세포를 생성하는 중요한 양태일 수 있다.
본 개시물을 통해서, ES/iPS 세포는 지속적인 성장, 정제 또는 분화를 위해 분리가 필요할 수 있는 군체를 형성하는 세포의 예로서 사용된다. 반면에, 본 명세서에 개시된 방법은 군체를 형성하는 임의의 세포의 유형에 적용될 수 있고/있거나 박막 절개 또는 2차 배양으로 이익을 얻을 것이라는 것이 본 개시물을 고려하여 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다.
일부 실시예에서, 본 개시물의 방법(및 본 개시물의 방법을 수행하기 위한 장치)은 전자기 복사 예를 들어, 레이저를 사용하여 살아있는 세포 군체를 박막 절개하는 단계를 수반할 수 있다. 예를 들어, 세포 군체를 박막 절개하는 방법은 두께가 알려진 배양조직 표면상에 세포 군체를 제공하는 단계; 자동화 초점 기술을 사용하여 배양조직판의 바닥의 위치를 찾아내는 단계; 레이저 박막 절개를 위한 상기 배양조직판의 바닥으로부터 최적의 위치까지 초점 위치의 오프셋을 정의하는 단계; 및 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 전체 배양조직의 일부 또는 전부를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 세포 군체를 박막 절개하는 또 다른 방법은, 예를 들어 표면상에 세포 군체를 제공하는 단계; 배양 조직에 상기 세포 군체를 이미징하는 단계; 박막 절개하기 위하여 특정 표현형의 하나 이상의 군체를 선택하는 단계; 및 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 선택된 세포 군체(들)를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 군체를 박막 절개하는 또 다른 방법은, 예를 들어 표면상에 세포 군체를 제공하는 단계; 상기 세포 군체를 이미징하는 단계; 박막 절개를 위하여 표현형을 선택하는 단계; 및 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 선택된 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계를 포함한다. 세포 군체를 박막 절개하는 또 다른 방법은, 예를 들어 표면상에 세포 군체를 제공하는 단계; 상기 세포 군체를 이미징하는 단계; 박막 절개를 위하여 특정 표현형의 하나 이상의 군체를 선택하는 단계; 상기 선택된 군체(들)의 모서리를 식별하는 단계; 나머지 배양조직으로부터 상기 세포 군체를 분리하기 위해 상기 세포 군체 주변에 순차적인 레이저 펄스를 제공하는 단계; 및 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계를 포함한다.
실시예의 제한되지 않는 몇몇의 예는 하기에서 논의된다. 일부 양태에서, 각각은 복잡성을 제공하는 면 그리고 확장성 및 선택성의 가변적 수준을 용인한다는 면에서 서로 각기 다를 수 있다.
제한되지 않는 최초 실시예는 살아있는 세포 군체를 제공하는 단계; 상기 세포 군체를 이미징하는 단계; 박막 절개를 위하여 특정 표현형을 갖는 군체를 선택하는 단계; 상기 군체의 모서리의 적어도 일부를 식별하는 단계; 나머지 배양조직으로부터 상기 세포 군체를 분리하기 위하여 세포 군체의 식별된 모서리 주변에 순차적인 레이저 펄스를 제공하는 단계; 및 레이저 절단선의 패턴을 사용하여 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 살아있는 세포의 배양조직 예를 들어, ES/iPS 세포는 투과광(예를 들어, 명시야(BF), 위상차, 암시야, 미분간섭) 및/또는 형광으로 이미지화될 수 있다. 도 1에서 도시된 것과 같이, 살아있는 iPS 세포 군체는 뚜렷한 구조적 차이 또는 배양보조세포 또는 세포외 기질로부터 형광강도를 보일 수 있다.
도 2에서 도시되듯이, 이미지는 선택된 표현형을 갖는 하나 이상의 줄기세포 군체를 식별하기 위하여 박막 절개 이전에 분절될 수 있다. '분절'은 이미지 내에서 물체를 분리하기 위한 이미지 분석 과정을 포함하는 것으로 통상의 기술자에 의해 이해되는 용어이다.
도 3에서 도시되듯이, 상기 분절 과정으로부터의 조직화는 군체의 모서리를 식별하기 위해 사용될 수 있고, 군체 주변에 최적의 크기 및 에너지(레이저 절단선)로 순차적인 레이저 펄스를 배치하기 위해 사용될 수 있으며, 상기 군체는 LEAPTM Cell Processing Workstation(Cyntellect Inc., San Diego, California)과 같은 것을 포함하여, 임의의 적절한 장치를 사용하여 나머지 배양조직으로부터 분리된다.
도 4에서 도시되듯이, 단리된 군체는 이후에 레이저 절단선의 격자형 레이저 절단선을 사용하여 여러개의 비교적 균질한 조각으로 박막 절개될 수 있다. 상기 조각의 크기는 상기 레이저 절단선 간의 거리를 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 상기 조각의 형상은 수평과 수직 레이저 절단선 간의 거리를 독립적으로 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 상기 조각의 형상은 임의적일 수 있고, 상기 레이저 절단선의 패턴을 정의함으로써 제어될 수 있다.
상기 박막 절개된 군체의 조각은 이후에 임의의 적절한 기술, 예를 들어 효소와 같은 보충 화학물질을 첨가하거나, 보충하지 않는 임의의 적절한 유체 피펫팅 기술을 사용하여 상기 조각을 방출할 수 있도록 웰로부터 제거될 수 있다. 일부 실시예는 보충 화학물질을 필요로 하지 않는다. 상기 군체의 조각은, 세포 아군체를 느슨하게 하는 레이저 작용 때문에 절단 후에 배양조직 바닥에 적게 착생시킬 수 있으며, 따라서 배양용기(도 11)의 유체 중의 현탁액 속으로 상기 조각을 제거시켜 옮겨지도록 피펫팅 장치(수동 또는 동력화됨)로부터 유압의 사용을 가능하게 한다. 레이저 사출(catapulting)은 아군체 조각에 대하여 요구되지 않는다. 현탁액 상에서, 상기 조각은 후속 배양을 위해 조각을 받도록 준비된 새로운 배양용기로 유체 이동을 통해 옮겨진다. 아군체 조각의 제거 후에, 배양조직은 전혀 손상되지 않은 대부분의 비-군체 영역을 종종 가지는데 반해, 군체가 미리 점유하고 있던 영역은 비교적 깨끗하다. 도 5는 아군체 조각의 제거 후에 전혀 손상되지 않은 비-군체 영역을 도시하는 반면, 군체 영역은 깨끗하게 제거되었다. 도 6에서 도시되듯이, 조각, 및 아군체에 의존하여 조각으로부터 생성되고 이 방법의 결과로 생긴 군체는 손으로 또는 효소로 이동된 ES/iPS 세포 군체보다 일반적으로 더 균일하다. 임의의 배양보조세포가 일반적으로 증식을 하지 못하게 하기 때문에, 임의의 배양보조세포의 전달은 단순히 새로운 배양조직 중 씻겨나갈 수 있는 잔해일 것이다.
군체를 박막 절개하기 위한 레이저 매개 메커니즘은, 예를 들어 광열적, 광기계적 또는 광화학적 메커니즘 중 적절한 하나의 메커니즘일 수 있다. 바람직한 실시예는 레이저의 초점 위치에서 세포를 죽이는 선택적 광열을 사용하는 것이다. 이런 접근법은 온도를 높이고, 제자리에서 세포를 효율적으로 광응고 하게 하는 레이저 파장을 흡수하는 염료의 첨가단계를 보통 포함한다. 상기 광기계적 접근법은 배양조직에 보충물을 필요로 하지 않고, 레이저의 초점 위치에서 세포의 물리적 파괴를 수반한다. 일부 양태에서, 이런 접근법은 상당히 더 강한 레이저 파워를 사용할 수 있고, 배양조직에 약간의 부차적인 손상을 초래할 수 있다. 상기 광화학적 접근법은 레이저의 초점면에서 선택적 세포사멸을 유도하는 UV 레이저의 사용을 수반한다. 이런 접근법은 더 많은 시간을 요구할 수 있으며, 예를 들어 효과적인 박막 절개에 이르기 위해 세포가 죽기까지 이틀 내지 삼일이 걸린다.
두 번째 실시예는 군체의 모서리를 따라 특이적으로 절단하지 않고 선택된 군체를 가로질러 배치되는 레이저 절단선을 제외하고는, 첫 번째 실시예와 유사하다. 도 7은 군체의 모서리를 고려하지 않고 선택된 군체를 가로질러 배치되는 레이저 절단선을 도시한다. 상기 레이저 절단선의 제한은 식별된 군체의 경계 내로 제한되며, 유사한 효과를 가져 오지만 레이저 절단의 양이 감소 되기 때문에(모서리의 절단 없음) 고속 처리량에 이르게 한다. 도 8에서 도시되듯이, 이런 접근법은 유압 분산 후에 군체 조각의 일부의 뒤쪽에 잔류물이 있을 가능성을 가진다. 이런 낮은 효율은 특정 고속 대량에서 용인될 수 있다. 뒤쪽에 남은 세포, 예를 들어 ES/iPS 세포의 정량은 잘려진 조각의 크기와 관련이 있을 것이다.
세 번째 실시예는 도 9 및 도 10에서 도시되는 것처럼 군체의 이미지를 분절함 없이 전체 배양조직 표면을 가로질러 레이저 절단선을 배치함으로써, 추가적인 단순화를 수반한다. 따라서, 일부 양태에서, 방법은 표현형을 식별하거나, 박막 절개 이전에 표현형을 디스플레이하는 세포를 식별하는 단계 없이 수행될 수 있다. 또한, 이런 접근법은 새로운 배양조직으로 전달될 수 있는 임의의 배양보조세포층의 조각을 생성할 것이지만, 배양보조세포는 증식능력이 없어서 죽을 것이고 새로운 배양조직 중에서 어떤 방식으로든 씻어 없어지기 때문에 복잡하지 않을 것이다. 이런 접근법은 특히 고속 대량이며, 이런 고속 대량은 배양조직상에 집중하여, 레이저 절단선의 패턴을 발사하고, 아군체 조각을 유동적으로 현탁액 속으로 배출하고, 아군체 조각을 새로운 배양용기로 옮기는 능력을 매우 필요로 한다. 부착 후에, 죽은 세포로부터 유래된 잔해 및 배양보조층으로부터 전달된 조각은 씻어 없어질 수 있다. 이런 세 번째 실시예는: (1) 군체의 특정 이미지 분석의 필요성을 없애며; (2) 적은 수의 단계를 필요로 하고; (3) 작동을 수행하기 위해 더 간단한 장치를 허용한다.
제한되지 않는 네 번째 실시예는, 단일층 세포로 성장하는 군체의 전체 표면을 가로질러 레이저 절단선이 배치된다는 것을 제외하고는 세 번째 실시예와 유사하다. 일반적으로 줄기세포가 융합 점까지 성장하지 않음에도 불구하고, 이 접근법에 있어서 줄기세포의 단일층의 사용은, 균일한 세포 조각을 형성하는 효율을 극대화하는 반면에, 비-융합 배양조직의 사용은 효율을 감소시켜서, 결과적으로 더 많은 균일한 세포의 조각을 야기한다. 이런 접근법은, 신속한 확장 및/또는 도 15 및 도 16에서 도시되는 특화된 기능을 갖는 분화된 세포의 생산 목적을 위해 배양용기로 전달되는 균일한 세포의 조각을 생성한다. 많은 아군체 조각은 상기 조각의 방출을 가능하게 하는 효소의 첨가를 필요로 할 수 있다.
다섯 번째 실시예는 배양조직의 이미징을 필요로 하지 않음으로써 공정을 더 단순화한다. 최적의 레이저 파워, 점 크기 및 Z 축 위치가 군체를 박막 절개하기 위하여 일단 확인되면, 배양 플레이트 두께의 지식 및 자동화 초점 기술을 사용하여 배양 플레이트의 바닥의 위치를 찾는 능력에 기초하여 기결정된 최적의 위치에 줄기세포 배양조직을 자동적으로 위치시키는 것이 가능하다. 이 위치는 동일한 배양조직의 모든 플레이트에 대하여 일치할 것이다. 이런 접근법은 훨씬 단순한 장치를 허용하며, 즉 카메라 및 이미지화 과정 및 분석이 불필요하다. 효과적인 실시간 자동초점 메커니즘은 고 펄스 진동수 레이저와 결합하고, 광범위한 광학계는 균일한 크기의 줄기세포 군체의 생산 효율을 극대화할 수 있다.
모든 실시예는 더 신속하게 수율을 제공할 수 있고, 기존의 사용가능한 기술보다 더 균일한 줄기세포를 결과로 낳는다. 일부 실시예는 군체 표현형에 근거하여 특정 군체의 선택을 제공하며, 상기 군체 표현형은 군체 또는 세포 형태학, 군체 또는 세포 크기, 군체 또는 세포 형상, 군체 또는 세포 치밀도, 및 줄기세포 연관 표지로 라벨링된 군체 또는 세포의 형광 강도를 포함할 수 있다. 특정 군체의 선택(도 2)은 시각적 검사 또는 자동화된 이미지 분석을 통해 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 레이저 절단선은 보충물이 필요하지 않는 광기계적 접근법; 세포사멸이 적절한 레이저 파장(예, 355 nm)을 사용하여 유발되는 광화학적 접근법; 또는 레이저 광을 흡수하는 염료가 배양조직에 첨가되어 레이저 점에 의해 광응고되는 세포의 위치에서 상당한 온도의 증가를 가능하게 하는 광열적 접근법을 사용하여 생성될 수 있다. 광기계적 접근법은 원하는 세포를 더 많이 제거할 수 있는 더 넓은 레이저 절단선을 유발할 수 있다. 광열적 접근법의 이익은 감소된 레이저 파워를 필요로 하는 것이며, 이는 작은 영역의 절단을 유발하고 더 많은 세포를 보존하고 수율을 높이게 된다. Allura Red와 같은 흡수성 염료를 사용하는 것은, 상기 염료의 존재하에서 ES 및 iPS 세포가 배양되는 경우에 아무런 악영향이 없다고 관찰되었다.
선택적으로, 아군체 조각을 제거하고 교반하는 데에 사용되는 유압은 공동화 기포(cavitation bubble)의 발생 또는 레이저를 사용하여 열의 경사를 발생시킴으로써 생성되는 전단력으로 대체될 수 있고, 이에 의하여 피펫팅 메커니즘의 복잡성을 감소시키고 후속 배양용기로 표본의 전달을 단순화하도록 공정단계를 줄인다.
본 명세서에 개시된 방법은 많은 예상치 못한 그리고 놀라운 장점를 포함하여, 다양한 장점를 제공한다. 이러한 장점 중 일부는, 예를 들어 배양 규모의 증가, 새롭고 고유한 실험을 가능하게 하고, 데이터 속도, 정보 처리 상호 운용 또는 낮은 비용을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 장점은 ES/iPS 세포와 같은 줄기세포의 자동화된 박막 절개를 포함한다. 일부 실시예에서, 장점은 ES/iPS 세포와 같은 줄기의 증가된 확장성을 포함한다. 일부 실시예에서, 장점은 예를들어, ES/iPS 세포를 포함하는 더 균일한 줄기세포 군체의 고속 대량 생산을 포함한다. 일부 실시예에서, 장점은 줄기세포, 예를 들어 ES/iPS를 유지하는데에 낮은 비용이 드는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 장점은 감소된 인력과 감소된 교육의 필요성을 포함한다. 일부 실시예에서, 장점은 줄기세포에 대한 현실적인 고속 대량 생물학을 포함한다. 일부 실시예에서, 장점은 보다 효율적이고, 제어되고 균일한 분화를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 상술하듯이, ES/iPS 세포는 계속적인 성장 또는 정제과정을 위해 분리가 필요할 수 있는 군체를 형성하는 세포의 예시로서 사용된다. 본 명세서에 개시된 방법이 군체를 형성하는 임의의 유형의 세포에 적용될 수 있고, 본 명세서에 개시된 장점이 다른 유형의 줄기세포 및 줄기세포가 아닌 군체에 적용될 수 있다고, 예시적인 개시물에 의해 공지된다는 것이 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. 군체는 비-ES/iPS 세포, 종양 타원체, 뉴로스피어, 배양체, 배아생식선세포, 태생암세포, 유방암 줄기세포 및 암 줄기세포와 같은 군체에서 세포의 집합을 형성하는 임의의 세포 유형으로 형성될 수 있다.
보다 균일한 군체 크기를 갖는 iPS 세포 배양조직의 생성
이 실험은 인간 iPS 세포 군체를 LEAP 워크스테이션을 사용하여 레이저 매개 박막절개하는 것을 설명한다. 인간 iPS 세포를 보편적인 방법론(즉, 콜라게나아제 IV(Invitrogen) 효소를 사용하여 박막절개하여 96-웰 플레이트(Corning)상으로 전달함)에 의해 박막절개했다. 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터 내에서 완전 줄기세포 배지 안에 배양조직을 5일 동안 배양했다(Thomson J.A, 등. "Embryonic Stem cell lines derived from human blastocysts" (1998) Science; 282:1145-1147; 본 명세서에 전체가 참조로써 포함된다). 5일째 되는 날에, PBS(Invitrogen)로 배양조직을 한번 세척했고, 레이저 매개 광열 과정을 위해 4 mg/ml의 Allura red(Sigma)를 함유하는 신선한 줄기세포 배지를 조직 배양 웰에 첨가했다. LEAP상의 명시야 이미징(도 1)을 사용하여 배양조직을 이미지화 하였고, 형태학적으로 인간 iPS 세포 군체를 식별했고, LEAP 줄기세포 매니저 소프트웨어를 사용하여 분절했다(도 2). 이후에, 레이저 매개 박막 절개를 위해 특정 크기의 군체를 선택했다. 박막 절개할 군체의 모집단을 선택했으면, LEAP상에서 펄스당 3.25 μJ의 에너지를 갖고 6 μm의 레이저 점 반경을 갖는 레이저를 약 1 kHz로 일련의 532 nm 레이저 펄스를 사용하여 표적화했다. 각각의 군체의 모서리 주변의 선에 일련의 점을 처리하기 위해 하나의 레이저 펄스를 두 번 반복하여 사용했다(도 3). 다음으로, 펄스당 3.25 μJ의 에너지, 16 μm의 펄스 간격 및 6 μm의 레이저 점 반경을 가지는 일련의 532 nm 레이저 절단선을 사용하여 각각의 군체를 160 μm2로 박막 절개했다. 다시, 군체들을 조각으로 박막 절개하기 위하여 하나의 레이저 펄스를 두 번씩 반복하여 사용했다(도 4, 6, 9, 11). 배양조직은 펄스당 1 내지 50 μJ의 레이저 에너지, 1 내지 20 μm의 레이저 점 반경 크기, 5 내지 50 μm의 펄스 간격을 사용하여 각각의 점마다 한번 내지 다섯 번 반복 사용하여 처리될 수 있다. 적합한 아군체 크기는 군체를 20 내지 400 μm의 다양한 크기로 박막 절개함으로써 결정했다(도 13). 아군체를 손으로 피펫팅하여 제거했고, 단리되지 않고 박막 절개되지 않은 임의의 세포는 남겨두었다(도 5). 이런 방법을 사용하여 증식된 세포를 5일 넘게 관찰했고, 상기 세포는 iPS 세포의 형태학적 특징을 보유했다. 이런 방법을 사용하여 생성된 군체는 iPS 세포 배양조직의 보편적인 효소를 사용한 박막절개보다 더 균일했다(도 6). 레이저 또는 효소를 사용하는 방법(콜라게나아제, 트립신)으로 박막 절개된 배양조직을 하루가 지난 후에 Hoechst로 착색했고, 효소를 사용하는 방법과 비교할 때, 레이저로 박막절개한 배양조직이 개선된 균일성을 보여준다는 것을 증명하기 위해 군체당 착색된 세포의 수를 수동적으로 세었다(도 12). 5일 후에, 레이저 또는 콜라게나아제를 사용하여 박막 절개된 배양조직을 시험관 내에서 배양체 형성에 의한 분화 분석을 위해 주입했다. 배양체를 현탁액 배양조직에서 8일 동안 관찰했고, 각각의 배양체의 직경을 측정했다. 레이저로 박막 절개된 iPS 세포 배양조직으로부터 생성된 배양체는 콜라게나아제로 박막 절개된 배양조직보다 크기에서 더 균일했다(도 14).
이런 예는 기존의 방법을 사용하여 얻은 것보다 더 균일한 크기의 iPS 세포 군체 모집단의 신속한 자동화된 생성을 설명한다.
균일한 특정 크기를 갖는 iPS 세포 조각을 사용하여 특화된 기능을 갖는 분화된 세포의 생성
이 방법은 LEAP 워크스테이션을 사용하여 배양체(EBs)를 생성하기 위하여 특정 크기의 조각으로 인간 iPS 세포의 레이저 매개 박막 절개를 설명한다. 인간 iPS 세포는 보편적인 방법론(즉, 콜라게나아제 IV(Invitrogen) 효소를 사용하여 박막 절개하여 96-웰 플레이트(Corning)상으로 전달함)에 의해 고밀도에서 박막 절개되었다. 인간 iPS 세포 군체의 융합 단일층이 관찰될 때까지 37 ℃의 세포 배양 인큐베이터 내에서 완전 줄기세포 배지 속에서 배양조직을 배양했다. 5일째 되는 날에, 배양조직을 PBS(Invitrogen)로 한번 세척했고, 레이저 매개된 광열 박막절개를 위하여 4 mg/ml Allura Red(Sigma)를 함유하는 신선한 줄기세포 배지를 조직 배양 웰에 첨가했다. 이미지를 각각의 군체로 분절하지 않고 전체 표면을 가로질러 레이저 절단선을 배치함으로써 배양조직을 특정 크기의 인간 iPS 아군체 조각으로 박막 절개했다. 펄스당 4.5 μJ의 에너지, 5 μm의 레이저 점 반경, 및 최적의 레이저 초점면에 전달되는 16 μm의 펄스 간격으로 일련의 532 nm의 레이저 절단선을 사용하여 배양조직을 250 내지 2000 μm2로 박막 절개했다. 최적의 레이저 초점면이 불필요함에도 불구하고, 본 실험에서 하기 설명되는 신규한 접근법에 의해 이를 결정했다(도 15, 17).
최적의 레이저 초점면을 식별하기 위한 접근법에 제한되지 않는 이런 신규한 방법은: (1) 명시야 초점 위치의 선택적 자동화 결정단계, 예를 들어 가장 큰 명도 차를 갖는 z-위치를 결정하기 위한 표준 이미지 분석법; (2) 상기 명시야 초점 위치(또는 임의의 위치)보다 100 μm위로 레이저 초점을 이동시키는 단계; (3) 다섯 번의 레이저 샷(shot)의 발사단계, 이미지를 얻는 단계, 및 이미지 분석법을 사용하는 단계, 세포 이동의 양을 결정하는 단계(즉, 레이저가 발사된 영역이 세포가 없는지 여부를 결정); (4) 가장 많은 이동을 보여주는 Z 위치가 식별(레이저를 맞은 세포에 대하여 가장 큰 효과를 가지는 최적의 레이저 초점 위치)될 때까지 z-단계를 10 μm씩 증가시키며 순차적으로 발사하는 단계 및 분석(단계 3과 같음)하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 레이저 초점은 총 200 μm(100 μm에서 위로 그리고 명시야 초점 또는 임의의 위치에서 아래로)를 10 μm씩 증가시키며 조사하였다.
1 mg/ml의 콜라게나아제 IV를 함유하는 신선한 배지를 분할된 웰에 첨가했고, 1시간 후에 인간 iPS 아군체 조각을 손으로 피펫팅하여 제거했다. 인간 iPS 아군체 조각을 완전 줄기세포 분화 배지 중의 저 부착 플레이트(Corning)로 전달했다. 현탁 배양조직으로 옮긴 지 4일 후에, 인간 iPS 아군체 조각은 다양한 크기의 윤곽이 분명한 균일한 배양체를 형성했다(도 16). 이미지는 레이저와 보편적인 방법(콜라게나아제)을 사용하여 발생된 배양체 배양조직을 나타냈고, 레이저 박막 절개에 의해 발생된 배양체의 균일성을 보여주기 위해 배양체 각각의 직경을 측정했다. 배양체 형성에 사용된 인간 iPS 아군체 조각의 크기를 변경함으로써 최종 배양체의 크기를 제어하는데에 LEAP를 사용했다(도 18). 레이저 박막 절개를 사용하여 생성된 배양체는 보편적인 배양체 생성 방법(콜라게나아제, 도18)에 의할 때보다 더 균일했다. 특정 크기의 배양체의 개선된 분화 가능성을 보여주기 위하여 250 내지 2000 μm2의 인간 iPS 아군체 조각을 사용하여 생성된 배양체 배양조직을 삼배엽의 성숙된 세포 유형으로 분화되도록 유도하였다. 24일 이후에, 정량적 실시간 PCR(QRT-PCR) 분석은, 600 μm의 hiPSC 조각을 사용하여 생성된 배양체가 더 효과적으로 내배엽(간세포 유사) 세포로 분화된다는 것을 보여주었다(도 19). 22일 후에, 중배엽 분화의 QRT-PCR 분석은, 800 μm의 조각을 사용하여 생성된 배양체가 더 효과적으로 심근 세포로 분화된다는 것을 보여주었다(도 20). 32일 후에, 외배엽 분화의 QRT-PCR 분석은, 1000 μm 조각을 사용하여 생성된 배양체가 더 효과적으로 신경으로 분화된다는 것을 보여주었다(도 21). 따라서, iPS/ES 세포로부터 분화된 세포 자손의 특정 유형의 수율 및 순도는 배양체 형성을 위해 사용되는 세포 박편의 크기를 제어함으로써 증가될 수 있다.
이런 예는 특정 크기의 균일한 배양체 모집단을 사용하여 특화된 기능을 갖는 분화된 세포의 생산에 증가된 효율을 설명한다. 형성된 배양체의 크기를 제어하는데 사용되는 방법은 고도로 재현가능하고, 자동화되어서, ES/iPS 세포로부터 특정 세포 유형을 생성하는데 매우 유용하게 한다. 나아가, 박편의 특정 크기 범위 및 최종 배양체는 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 증가된 분화 가능성에 기여한다고 확인되었다.
새로운 ES 세포주를 생성하기 위한 ES 세포 군체의 분리
이 실험은 유전적으로 변형된 ES 세포주를 생성하기 위하여 LEAP 워크스테이션을 사용하는 인간 ES 세포 군체의 레이저 매개된 정제를 설명한다. 한 달 전에 핵 표지(H2B가 녹색형광단백질로 태그됨)를 포함하는 레트로바이러스로 형질전환된 인간 ES 세포를 보편적인 방법론(즉, 콜라게나아제 IV(Invitrogen) 효소를 사용하여 박막절개하여 96-웰 플레이트(Corning)상으로 전달함)으로 고 밀도에서 박막 절개했다. 배양조직을 완전 줄기세포 배지 속에서, 37 ℃의 세포 배양 인큐베이터에서 4일 동안 배양했다. 4일째 되는 날에, 배양조직을 PBS(Invitrogen)으로 한번 세척하였고, 레이저 매개된 광열 공정을 위해 4 mg/ml의 Allura Red(Sigma)를 함유하는 신선한 줄기세포 배지를 조직 배양 웰에 첨가했다. 배양조직을 LEAP 상에서 명시야 형광 이미징을 사용하여 이미지화했고(도 22), 인간 ES 세포 배양조직을 명시야 이미지를 사용하여 형태학적으로 그리고 형광 이미지를 사용하여 형광 강도로서 식별했다. 녹색형광단백질의 높은 수준을 보이는 세포들만 함유하는 새로운 세포주를 생산하기 위하여, LEAP 줄기세포 매니저 소프트웨어를 사용하여 각각의 웰 내에서 가장 높은 형광 강도를 갖는 인간 ES 세포 군체를 분절했다. 일단 단리된 군체가 선택되면, LEAP를 사용하는 신규한 접근법에 의해 결정되는 최적의 레이저 초점면으로 전달되는 펄스당 4.5 μJ의 에너지를 갖고, 6 μm의 레이저 점 반경을 갖는 일련의 532 nm 레이저 절단선을 약 1 kHz로 사용하여 상기 군체의 모서리를 표적화했다. 각각의 군체의 모서리 주변으로 16 μm의 펄스 간격을 갖는 레이저 절단선을 따라 일련의 점을 처리하기 위하여 상기 레이저 펄스를 한번 반복했다. 다음으로, 선택된 군체만을 정제하기 위하여, 25 μm의 격자 간격을 가지는 펄스당 4.5 μJ의 에너지를 갖고, 6 μm의 레이저 점 반경의 일련의 532 nm의 레이저 펄스를 배양조직을 가로지르는 격자에 사용하여 배양조직 내에 잔류 세포를 제거했다. 배양조직 내의 선택되지 않은 모든 세포를 제거하기 위하여 상기 레이저 펄스를 두 번 반복하여 사용했다(도 17, 23). 배양조직을 펄스당 1 내지 50 μJ의 레이저 에너지, 1 내지 20 μm의 레이저 점 반경 크기, 5 내지 50 μm의 펄스 간격, 5 내지 100 μm의 격자 간격을 갖는 레이저를 사용하여, 각 점당 1 내지 5번 반복하여 처리할 수 있다. 선택된 군체의 분리는 오직 군체 내의 세포가 성장할 수 있도록 하고, 따라서, 새로운 세포주가 생성된다. 배양조직을 세척했고, 신선한 비활성화된 쥣과의 배아 섬유아세포를 함유하는 신선한 줄기세포 배지를 조직 배양 웰에 첨가했다. 신선한 모체(쥣과의 배아 섬유아세포)의 첨가는 증식하기에 충분한 크기에 도달할 때까지 군체가 확장할 수 있게 하며, 이 때 새로운 세포주가 유도된다. 이 방법에 의해 발생된 새로운 인간 ES 세포주를 몇 달간 관찰했고, ES 세포의 형태학적 특징을 보유했고, 녹색형광단백질의 높은 수준을 지속적으로 보여주었다. 군체 정제 방법에 의해 발생된 인간 ES 세포주는 보편적인 방법에 의한 줄기세포주의 발생(즉, 항생제 선택의 존재하에서 줄기세포 배양조직의 효소를 이용한 경로, 도 22에 도시됨)보다 더 균일한 녹색형광단백질을 나타냈다. 새로운 줄기세포주는, 꽤 큰 웰을 갖는 배양조직 플레이트 내에서 바늘로 각각의 군체를 수동적으로 물리적 외접하는 것을 수반하는 보편적인 군체 분리 방법을 사용하는 것보다 고 수율 군체 분리의 자동화 방법을 사용하여 더 효과적으로 생산될 수 있다.
이런 예는 새로운 줄기세포주의 생산 효율을 증가시키는 인간 ES 세포 군체의 분리 및 정제를 설명한다. 줄기세포 군체를 단리 하는데 사용되는 방법은 재현가능하고 자동화되며, 유전적으로 변형된 줄기세포주를 생성하는데에 그리고 새로이 유도된 ES 및 iPS 세포주의 생산에 매우 유용할 것이다.
본 명세서에서 복수 또는 단수 용어의 사용에 대해서, 당해 기술분야의 숙련자(이하, 당업자라 함)라면 문맥상 및/또는 실제 적용시 적절하다면 복수를 단수로, 및/또는 단수를 복수로 해석할 수 있다. 본 명세서에서 명확하게 하기 위해서 다양한 단수/복수 배열이 특별히 기재될 수 있다.
통상의 기술자라면 본 명세서 및 특히 첨부된 특허청구범위(예를 들어, 첨부된 특허청구범위의 본문)에서 사용되는 용어는 일반적으로 "개방적" 용어로서 사용된다(예를 들어, "포함하는"이라는 용어는 "포함하지만 그에 국한되는 것은 아닌" 의 의미로 해석되어야 하며, "가지는"이라는 용어는 "적어도 가지는"의 의미로 해석되어야 하고, "포함한다"라는 용어는 "포함하지만 그에 국한되는 것은 아니다" 라는 의미로 해석되어야 한다)는 점을 이해할 것이다. 또한, 통상의 기술자라면 청구항에서 특정한 숫자가 기재되는 경우, 그것은 청구항에서 명백하게 그 의미를 기재하기 위한 것이며, 이러한 기재가 없는 경우는 그에 대한 상세한 설명이 필요하지 않다는 것을 의미한다는 점을 이해할 것이다. 예를 들어, 이해를 돕기 위해, 첨부되는 특허청구범위는 청구항의 기재를 도입하기 위해 도입 어구인 "적어도 하나" 및 "하나 또는 그 이상"이라는 용어를 청구항 기재에 사용할 수 있다. 그러나, 이러한 구의 사용은 부정관사에 의한 청구항 기재의 도입이 이러한 기재만을 포함하는 실시예에 대해 도입 청구항의 기재를 포함하는 특정 청구항을 한정하는 것을 의미하는 것으로 해석되어서는 안된다. 심지어 동일한 청구항이 "하나 이상" 또는 "적어도 하나" 및 부정관사(예를 들면, 부정관사는 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다)를 포함하는 경우에도 특정 항을 제한하는 것은 아니다. 청구항 기재를 도입하기 위해 정관사를 사용하는 경우에도 동일하게 유효하다. 또한, 도입 청구항 기술에 특정한 숫자가 명백하게 기재되는 경우라 할 지라도, 통상의 기술자라면 이러한 기재가 적어도 기재된 숫자 이상이라는 것을 의미하는 것으로 해석되어야 한다는 점을 인지할 것이다(예를 들어, "2개의 기재"의 노출된 의미는 다른 변경 사항이 없다면, 적어도 2개의 기재, 또는 하나 또는 그 이상의 기재를 말한다). 또한, "A, B, 및 C 등 중 적어도 하나"와 같은 통상적인 표현이 사용되는데, 통상의 기술자는 일반적으로 이러한 표현은 관례적 표현으로 이해하도록 의도된 것이라는 점을 이해할 것이다(예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나를 구비한 시스템"이라는 것은 A를 단독으로, B를 단독으로, C를 단독으로, A와 B를 함께, A와 C를 함께, B와 C를 함께, 및/또는 A와 B와 C를 함께 구비한 시스템을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다). "A, B, 또는 C 등 중 적어도 하나"와 같은 통상적인 표현이 사용되는 경우, 통상의 기술자라면 일반적으로 이러한 표현은 관례적 표현으로 이해하도록 의도된 것이라는 점을 이해할 것이다(예를 들어, "A, B 또는 C 중 적어도 하나를 구비한 시스템"이라는 것은 A를 단독으로, B를 단독으로, C를 단독으로, A와 B를 함께, A와 C를 함께, B와 C를 함께, 및/또는 A와 B와 C를 함께 구비한 시스템을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다). 또한, 통상의 기술자라면 발명의 상세한 설명, 특허청구범위, 또는 도면에서 역접 접속사 및/또는 둘 또는 그 이상의 대체 용어들을 나타내는 어구가 그 대체 용어들 중 하나, 대체 용어들 중 다른 한쪽 또는 양쪽을 포함할 가능성을 고려해야 한다는 점을 이해해야 할 것이다. 예를 들어, 어구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A와 B"일 가능성을 포함하는 것으로 이해해야 할 것이다.
본 명세서에 다양한 양태 및 실시예에 대해 기술하였으며, 다른 양태 및 실시예에 관한 것은 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 명세서에 개시된 다양한 양태 및 실시예는 설명을 하기 위한 것으로, 후술하는 특허청구범위에 의해 제시되는 진정한 범위 및 취지를 제한하기 위한 것은 아니다.

Claims (34)

  1. 배양조직에서 세포 군체를 박막 절개하는 방법에 있어서:
    배양조직에 살아있는 세포 군체를 제공하는 단계;
    상기 배양조직을 이미징하는 단계;
    상기 군체에 대하여, 이미지에 도시되는 소정의 표현형에 근거하여 박막 절개하기 위한 군체를 선택하는 단계;
    이미지에서 상기 군체의 모서리의 적어도 일부분을 식별하는 단계;
    나머지 배양조직으로부터 상기 군체를 분리하기 위하여 상기 군체의 식별된 모서리에 전자기 복사를 가하는 단계; 및
    전자기 복사를 사용하여 하나 이상의 조각으로 상기 군체를 박막 절개하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 전자기 복사를 가하는 단계는 레이저 절단선 패턴을 정의하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계는, 펄스당 약 1 μJ 내지 약 50 μJ의 레이저 에너지를 사용하여 방출될 수 있는 일련의 레이저 펄스의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계는, 펄스당 약 1 μm 내지 약 20 μm의 레이저 점(spot) 반경으로 방출될 수 있는 일련의 레이저 펄스의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계는, 한번 내지 다섯 번 반복 사용되어 방출될 수 있는 일련의 532 nm의 레이저 펄스의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계는, 한번 내지 다섯 번 반복 사용되어 방출될 수 있는 일련의 약 532 nm의 레이저 펄스의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계는, 약 5 μm 내지 약 50 μm를 간격으로 펄스를 갖는 레이저 절단선의 패턴을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계는, 약 5 μm 내지 약 100 μm를 간격으로 격자를 갖는 레이저 격자 패턴을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계는, 약 20 μm 내지 약 2000 μm로 배치되는 레이저 절단선의 정사각형 패턴을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계는, 박편의 비-효소 제거를 위해 약 20 μm 내지 약 300 μm 이격되어 배치되는 레이저 절단선의 정사각형 패턴을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계는, 성숙한 특화된 세포 유형으로의 줄기세포의 분화에 사용하기 위해 약 250 μm 내지 약 2000 μm 이격되어 배치되는 레이저 절단선의 정사각형 패턴을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 전자기 복사의 흡수율을 높이도록 구성되는 염료를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  13. 세포 군체를 박막 절개하는 방법에 있어서:
    표면상에 살아있는 세포 군체를 제공하는 단계;
    상기 표면을 이미징하는 단계;
    이미지에서 식별가능한 소정의 표현형을 보이는 특정 군체를 선택하는 단계; 및
    전자기 절단선의 패턴을 사용하여 하나 이상의 조각으로 상기 군체를 박막 절개하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 전자기 절단선의 패턴을 사용하는 것은 레이저 절단선의 패턴을 정의하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 레이저 에너지의 흡수율을 높이도록 구성되는 염료를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 패턴은 격자 패턴을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  17. 제 13 항에 있어서,
    상기 전자기 절단선의 패턴은 상기 세포 군체의 경계 내로 제한되는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  18. 상기 제 1 항 또는 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 군체를 박막 절개하기 전에 상기 이미지화된 세포 군체를 분할하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  19. 세포 군체 박막 절개 방법에 있어서,
    표면상에 세포 군체를 제공하는 단계;
    상기 세포 군체를 이미징하는 단계;
    이미지화된 세포 군체를 분할하는 단계;
    전자기 복사 절단선에 대한 패턴을 정의하는 단계; 및
    상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하기 위한 전자기 복사 절단선의 정의된 패턴에 의하여, 상기 세포 군체에 전자기 복사를 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 전자기 복사 절단선은 레이저 절단선을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  21. 제 19 항에 있어서,
    상기 레이저 에너지의 흡수율을 높이도록 구성되는 염료를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  22. 세포 군체 박막 절개 방법에 있어서,
    알려진 두께를 포함하는 배양조직상에 세포 군체를 제공하는 단계;
    레이저 절단을 위한 최적의 초점 위치(focus position)에 배양조직의 표면을 배치하는 단계; 및
    전자기 복사 절단선에 대하여, 상기 배양조직 표면을 포함하는 패턴을 정의하는 단계;
    레이저 절단선의 패턴을 이용하여, 상기 패턴에 따라 상기 배양조직의 표면에 전자기 복사를 가함으로써 상기 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 레이저 에너지의 흡수율을 높이도록 구성되는 염료를 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 박막 절개된 하나 이상의 조각을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 박막 절개된 하나 이상의 조각을 제거하는 단계는 제 1 배양 용기의 유체 중의 현탁액으로 상기 하나 이상의 조각을 옮기는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  26. 제 24 항에 있어서,
    상기 박막 절개된 하나 이상의 조각을 제거하는 단계는, 제 1 배양 용기의 유체 중의 현탁액으로 상기 하나 이상의 조각을 옮기는 단계 이전에 효소와 같은 화학 물질을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  27. 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 조각을 제 2 배양 용기로 옮기는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  28. 제 24 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 박막 절개된 하나 이상의 조각을 제거하는 단계는 유동적인 피펫팅 기술(fluid pipetting technique)을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    잔류 배양보조세포층을 씻어내는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 군체는 살아있는 배아줄기세포 또는 유도 다분화능(pluripotent) 줄기세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 군체는 비-ES/iPS 세포, 종양 타원체(tumor spheroids)를 포함하거나, 배양체, 뉴로스피어(neurosphere), 배양체, 생식선 줄기세포, 태생암세포, 유방암 줄기세포, 암 줄기세포, 및 국소 영역에서 유사한 세포들의 집합을 형성할 수 있는 임의의 세포 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
  32. 세포 군체 정제 방법에 있어서,
    배양조직 표면상에 살아있는 세포 군체를 제공하는 단계;
    세포 군체를 식별하는 단계;
    나머지 배양조직으로부터 상기 세포 군체를 단리하기 위하여 상기 군체의 모서리에 전자기 복사를 가하는 단계; 및
    단리된 세포 군체를 정제하기 위하여 상기 나머지 배양조직을 사멸시키는 전자기 복사의 패턴을 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 정제 방법.
  33. 세포 군체 정제 방법에 있어서,
    배양조직 표면상에 살아있는 세포 군체를 제공하는 단계;
    세포 군체를 식별하는 단계;
    상기 배양조직의 나머지는 사멸시키지만 상기 세포 군체는 사멸시키지 않도록, 상기 배양조직의 비-군체 영역에 전자기 복사의 패턴을 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 정제 방법.
  34. 세포 군체 박막 절개 방법에 있어서,
    배양조직 표면상에 살아있는 세포 군체를 제공하는 단계;
    절단선의 패턴을 정의하는 단계; 및
    상기 살아있는 세포 군체를 하나 이상의 조각으로 박막 절개하기 위하여 상기 배양조직 표면에 전자기 에너지를 상기 절단선의 패턴으로 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 군체 박막 절개 방법.
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