CN114002195A - 一种辅助悬浮细胞成像的系统及其使用方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了辅助悬浮细胞成像的系统及其使用方法和应用。所述辅助悬浮细胞成像的系统包括功能化标记的磁性微球、功能化标记表面的细胞载体和磁场发生装置；其中，所述细胞载体包括培养皿或载玻片；所述磁性微球的功能化标记物和所述细胞载体的功能化标记物具有特异性结合作用。本发明提供的辅助悬浮细胞成像的系统能够在悬浮细胞外形不受到破坏的前提下，将悬浮细胞固定在平面内，对其进行染色，采用共聚焦显微镜进行拍摄能够得到清晰、完整的细胞成像结果，从而获得细胞的正常生理结构，且成本低廉，步骤简便，可应用性强。
Description
技术领域
本发明属于生物成像技术和细胞生物学领域，具体涉及一种辅助悬浮细胞成像的系统及其使用方法和应用。
背景技术
激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope，CLSM)采用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。系统经一次调焦，将扫描限制在样品的一个平面内，针对不同的调焦深度，获得样品不同深度层次的图像，通过计算机分析和模拟，能够显示细胞样品的立体结构。目前，激光共聚焦扫描显微镜已经广泛应用于形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域。但由于激光共聚焦扫描显微镜是通过逐点、逐行、逐面扫描的方式来进行成像，因此必须保证成像时样品在一个平面内固定不动，使得激光共聚焦扫描显微镜无法应用于悬浮细胞或活细胞的成像。
目前，悬浮细胞成像的技术方法主要有两种：一是利用细胞涂片离心机使悬浮细胞在离心力的作用下靠近并紧贴在用明胶或者多聚赖氨酸处理的载玻片平面，但离心力的作用会使细胞形态发生改变从而影响对细胞精细结构的成像与观察。二是将悬浮细胞添加到多聚赖氨酸或者明胶包被的培养皿中，通过重力作用，待悬浮细胞沉降到培养皿底部，进行细胞成像。但该方法稳定性不佳，在移动培养皿中仍会有大量悬浮细胞脱离培养皿底部。因此，有必要找到一种固定细胞的方法，同时不破坏细胞的原始形态，从而用于细胞成像。
CN108841385A公开了一种血液系统悬浮细胞光学成像的荧光铂纳米团簇的制备方法及应用。所述制备方法充分络合铂离子前体水溶液和胺类聚合物，制备出荧光铂纳米团簇粗产物，离心及透析后，得到水溶性荧光铂纳米团簇。所述铂纳米团簇作为荧光标记物首次扩展到血液系统悬浮细胞的光学成像中，对于实现血液系统疾病的早期识别、诊断具有重大意义。但该研究并没有解决悬浮细胞成像的问题。
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基于以上研究，可以看到，目前的研究大多通过提高荧光采集效率来提高细胞成像的效果，但并不能解决活的悬浮细胞由于难以固定导致成像质量差的问题。因此，找到一种有效固定活的悬浮细胞的方法，同时保证细胞的良好的形态，对悬浮细胞和活细胞的成像具有重大的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种辅助悬浮细胞成像的系统及其使用方法和应用。所述辅助悬浮细胞成像的系统可以通过功能化标记的磁性微球标记活的悬浮细胞，随后与功能化标记表面的细胞载体进行特异性结合，从而将活的悬浮细胞快速固定在表面进行成像观察，能够保证悬浮细胞的原始形态，获得其正常生理结构。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种辅助悬浮细胞成像的系统，所述系统包括功能化标记的磁性微球、功能化标记表面的细胞载体和磁场发生装置。
其中，所述磁性微球的功能化标记物和所述细胞载体的功能化标记物具有特异性结合作用。
本发明采用功能化标记的磁性微球标记悬浮细胞，并通过特异性结合将悬浮细胞固定在细胞载体的功能化标记表面，同时为了防止成像过程中翻动细胞导致的细胞漂浮现象，采用磁场发生装置将标记悬浮细胞进一步固定在细胞载体的功能化标记表面，使得悬浮细胞固定的更加牢固，从而得到更加清晰、完整的细胞成像。
优选地，所述细胞载体包括培养皿或载玻片。
本发明中，所述磁性微球的粒径不超过2μm，例如可以是1μm、1.5μm或2μm等，但不仅限于所列举的数值，对该范围内的其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述磁性微球表面修饰有功能基团和/或无机颗粒材料。
本发明采用的磁性微球表面既可以没有进行功能基团和/或无机颗粒材料的修饰也可以被功能基团和/或无机颗粒材料修饰，但修饰后的磁性微球具有更高的比表面积，更高的生物活性，更高的细胞亲和力，能够更好的标记悬浮细胞，从而通过与细胞载体的功能化标记表面特异性结合，更好的固定在细胞载体表面，以方便后续的细胞成像。
优选地，所述功能基团包括氨基、羟基或羧基中的任意一种或至少两种的组合。所述至少两种的组合例如氨基和羟基的组合、羟基和羧基的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述无机颗粒材料包括二氧化硅、二氧化钛、二氧化锰或氧化石墨烯中的任意一种或至少两种的组合。所述至少两种的组合例如二氧化硅和二氧化钛的组合或氧化石墨烯和二氧化锰的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明中，所述磁性微球被包括生物素、链霉亲和素、色氨酸、组氨酸或含镍分子中的任意一种或至少两种的组合功能化标记，优选为生物素。所述至少两种的组合例如生物素和组氨酸的组合或组氨酸和色氨酸的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述生物素的添加质量与磁性微球质量的比例为1:(4-12)，例如可以是1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:8.8、1:9、1:9.5、1:10、1:10.5、1:11、1:11.5或1:12等，但不仅限于所列举的数值，对该范围内的其他未列举的数值同样适用。
生物素具有特异性好、分子量低的优点，生物素标记的反应简单温和，并且不会对所标记的物质的天然功能造成影响，因此本发明采用生物素标记磁性微球。
本发明中，所述装置的表面被包括生物素、链霉亲和素、色氨酸、组氨酸或含镍分子中的任意一种或至少两种的组合功能化标记，优选为链霉亲和素。所述至少两种的组合例如链霉亲和素和含镍分子的组合或链霉亲和素与组氨酸的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述链霉亲和素的添加质量与所述生物素的添加质量的比例为(3-8):1，例如可以是3:1、3.4:1、3.8:1、4:1、4.4:1、4.6:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1或8:1等，但不仅限于所列举的数值，对该范围内的其他未列举的数值同样适用。
生物素-亲和素系统是一种具有高亲和力、灵敏度强、特异性强和稳定性好的标记技术，生物素和链霉亲和素依靠接触表面均一的多层膜来维系其稳定的结合。其中，链霉亲和素具有亲和力强、特异性高的优点，因此本发明采用链霉亲和素标记细胞载体的表面。
本发明中，所述磁场发生装置包括磁铁、电磁场发生器。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的辅助悬浮细胞成像的系统的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
(1)将功能化标记的磁性微球与悬浮细胞混合，得到标记悬浮细胞；
(2)将步骤(1)中得到的标记悬浮细胞加入到功能化标记表面的细胞载体中，然后静置于磁场发生装置中，进行标记悬浮细胞的固定；
(3)利用显微镜进行悬浮细胞成像。
优选地，步骤(1)所述悬浮细胞与功能化标记的磁性微球的数量比为1:(1-20)，例如可以是1:1、1:3、1:5、1:8、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18或1:20等，但不仅限于所列举的数值，对该范围内的其他未列举的数值同样适用。
优选地，步骤(1)所述悬浮细胞的来源包括T细胞、B细胞、树突状细胞或自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)中的任意一种或至少两种的组合。所述至少两种的组合例如T细胞和B细胞的组合或T细胞和树突状细胞的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(1)所述混合的时间为20-40min，例如可以是20min、25min、30min、35min或40min等，但不仅限于所列举的数值，对该范围内的其他未列举数值同样适用；混合的温度为4-42℃，例如可以是4℃、8℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、33℃、38℃或42℃等，但不仅限于所列举的数值，对该范围内的其他未列举数值同样适用。
优选地，步骤(2)所述静置的时间为3-8min，例如可以是3min、5min或8min等，但不仅限于所列举的数值，对该范围内的其他未列举数值同样适用；静置的温度为4-37℃，例如可以是4℃、8℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、33℃、35℃或37℃等，但不仅限于所列举的数值，对该范围内的其他未列举数值同样适用。
优选地，步骤(3)所述显微镜包括激光共聚焦显微镜、荧光倒置显微镜、全内反式显微镜、结构光照明显微镜、正置显微镜或超分辨光学成像显微镜中的任意一种。
作为优选技术方案，本发明提供了一种如第一方面所述的辅助悬浮细胞成像的系统的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
(1)将功能化标记的磁性微球与悬浮细胞在4-42℃下混合20-40min，得到标记悬浮细胞；
其中，所述悬浮细胞与功能化标记的磁性微球的数量比为1:(1-20)；
(2)将步骤(1)中得到的标记悬浮细胞加入到功能化标记表面的细胞载体中，然后在磁场发生装置中于4-37℃下静置3-8min，进行标记悬浮细胞的固定；
(3)利用显微镜进行悬浮细胞成像。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的辅助悬浮细胞成像的系统在悬浮细胞成像中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种辅助悬浮细胞成像的系统，通过功能化标记的磁性微球特异性识别亲和素的作用，将悬浮细胞迅速固定在培养皿或者载玻片的表面，通过激光共聚焦扫描显微镜进行成像；
(2)所述辅助悬浮细胞成像的系统能够用于活的悬浮细胞成像，可以保证细胞的原始形态，从而获得其正常生理结构；
(3)所述辅助悬浮细胞成像的系统成本低廉，操作步骤简便，节约时间。
附图说明
图1是本发明所涉及的辅助悬浮细胞成像系统的示意图；
图2是实施例1中采用本发明所涉及的辅助悬浮细胞成像系统处理悬浮细胞后的成像结果图；
图3是实施例2中采用本发明所涉及的辅助悬浮细胞成像系统处理悬浮细胞后的成像结果图；
图4是实施例3中采用本发明所涉及的辅助悬浮细胞成像系统处理悬浮细胞后的成像结果图；
图5是实施例4中采用本发明所涉及的辅助悬浮细胞成像系统处理悬浮细胞后的成像结果图；
图6是实施例5中采用本发明所涉及的辅助悬浮细胞成像系统处理悬浮细胞后的成像结果图；
图7是实施例6中采用本发明所涉及的辅助悬浮细胞成像系统处理悬浮细胞后的成像结果图；
图8是实施例7中采用本发明所涉及的辅助悬浮细胞成像系统处理悬浮细胞后的成像结果图；
图9是对比例1中悬浮细胞的成像结果图；
图10是对比例2中悬浮细胞的成像结果图；
图11是对比例3中悬浮细胞的成像结果图；
图12是对比例4中悬浮细胞的成像结果图；
图13是对比例5中不采用本发明所涉及的辅助悬浮细胞成像系统处理悬浮细胞后的成像结果图；
图14是对比例6中不采用本发明所涉及的辅助悬浮细胞成像系统处理悬浮细胞后的成像结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所涉及的相关原料和材料的来源信息如下：
其中，生物素标记的抗CD3磁性微球由美天旎(中国)有限公司合成；链霉亲和素购自生工生物工程(上海)股份有限公司，型号为A610492-0001；T细胞来源为志愿者捐赠。其他材料或试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
本实施例采用辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理，并利用激光共聚焦显微镜进行成像观察，过程示意图如图1所示，具体包括以下步骤：
(1)37℃预热pH为7.4的磷酸盐缓冲液15min；
(2)取1μL浓度为2mg/mL的Hoechst33342细胞核染料加入到1mL预热好的磷酸盐缓冲液中，配制成染色液；
(3)取1×105T细胞，用100μL染色液重悬，并向其中加入5μL生物素标记的抗CD3四氧化三铁磁性微球；
(4)37℃避光静置30min；
(5)加入500μL pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬细胞，300g离心5min后弃去上清；
(6)加入100μL pH为7.4的磷酸盐重悬细胞；
(7)将细胞加入到链霉亲和素包被的培养皿中；
(8)将培养皿静置于磁铁上5min；
(9)吸去培养皿上的液体，期间培养皿不能离开磁铁；
(10)加入200μL 4％的多聚甲醛溶液，25℃下静置5min，固定细胞，期间培养皿不能离开磁铁；
(11)缓慢吸去培养皿上的液体，加入100μL含0.5％Triton-X100的磷酸盐缓冲液，25℃下静置5min，期间培养皿不能离开磁铁；
(12)缓慢吸去培养皿上的液体，加入200μL磷酸盐缓冲液和1μL浓度为20μM的罗丹明标记的鬼笔环肽，25℃下孵育30min，期间培养皿不能磁铁；
(13)缓慢吸去培养皿上的液体，加入200μL磷酸盐缓冲溶液，静置5min后缓慢吸去培养皿中的液体，期间培养皿不能离开磁铁；
(14)加入100μL抗淬灭的封片剂到培养皿中；
(15)取出培养皿，利用激光共聚焦显微镜进行拍摄。
结果如图2所示，可以看到，采用辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理后，在激光共聚焦显微镜下能够拍摄出活的悬浮细胞的表面形貌，且活的悬浮细胞的形态没有受到破坏。
实施例2
本实施例采用辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理，并利用激光共聚焦显微镜进行成像观察，过程示意图如图1所示，具体包括以下步骤：
(1)37℃预热pH为7.4的磷酸盐缓冲液10min；
(2)取1μL浓度为2mg/mL的Hoechst33342细胞核染料加入到1mL预热好的磷酸盐缓冲液中，配制成染色液；
(3)取1×105T细胞，用110μL染色液重悬，并向其中加入3μL生物素标记的抗CD3四氧化三铁磁性微球；
(4)37℃避光静置20min；
(5)加入400μL pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬细胞，200g离心8min后弃去上清；
(6)加入110μL pH为7.4的磷酸盐重悬细胞；
(7)将细胞加入到链霉亲和素包被的培养皿中；
(8)将培养皿静置于磁铁上3min；
(9)吸去培养皿上的液体，期间培养皿不能离开磁铁；
(10)加入220μL 4％的多聚甲醛溶液，25℃下静置3min，固定细胞，期间培养皿不能离开磁铁；
(11)缓慢吸去培养皿上的液体，加入110μL含0.5％Triton-X100的磷酸盐缓冲液，25℃下静置3min，期间培养皿不能离开磁铁；
(12)缓慢吸去培养皿上的液体，加入200μL磷酸盐缓冲液和1μL浓度为20μM的罗丹明标记的鬼笔环肽，25℃下孵育20min，期间培养皿不能离开磁铁；
(13)缓慢吸去培养皿上的液体，加入220μL磷酸盐缓冲溶液，静置3min后缓慢吸去培养皿中的液体，期间培养皿不能离开磁铁；
(14)加入110μL抗淬灭的封片剂到培养皿中；
(15)取出培养皿，利用激光共聚焦显微镜进行拍摄。
结果如图3所示，可以看到，采用辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理后，在激光共聚焦显微镜下能够拍摄出活的悬浮细胞的表面形貌，且活的悬浮细胞的形态没有受到破坏。
实施例3
本实施例采用辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理，并利用激光共聚焦显微镜进行成像观察，具体包括以下步骤：
(1)37℃预热pH为7.4的磷酸盐缓冲液15min；
(2)取1μL浓度为0.5mM的Fluo-3 AM钙离子探针和1μL浓度为2mg/mL的Hoechst33342细胞核染料加入到1mL预热好的磷酸盐缓冲液中，配制成染色液；
(3)取1×105T细胞，用100μL染色液重悬，并向其中加入5μL生物素标记的抗CD3四氧化三铁磁性微球；
(4)37℃避光静置30min；
(5)加入500μL pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬细胞，300g离心5min后弃去上清；
(6)加入100μL的T细胞培养基重悬细胞；
(7)将细胞加入到链霉亲和素包被的培养皿中；
(8)将培养皿静置于磁铁上5min；
(9)取出培养皿，利用激光共聚焦显微镜进行拍摄。
结果如图4所示，可以看到，采用辅助悬浮细胞成像的系统，在激光共聚焦显微镜下能够准确拍摄出活的悬浮细胞的表面形貌，同时活的悬浮细胞的形态没有受到破坏，且不会出现模糊不清的图像。
实施例4
本实施例采用辅助悬浮细胞成像的系统对悬浮细胞进行处理，并利用激光共聚焦显微镜进行成像观察，具体包括以下步骤：
(1)37℃预热pH为7.4的磷酸盐缓冲液10min；
(2)取1μL浓度为0.5mM的Fluo-3 AM钙离子探针和1μL浓度为2mg/mL的Hoechst33342细胞核染料加入到1mL预热好的磷酸盐缓冲液中，配制成染色液；
(3)取1×105T细胞，用110μL染色液重悬，并向其中加入3μL生物素标记的抗CD3四氧化三铁磁性微球；
(4)37℃避光静置20min；
(5)加入500μL pH为7.4磷酸盐缓冲液重悬细胞，200g离心8min后弃去上清；
(6)加入100μL的T细胞培养基重悬细胞；
(7)将细胞加入到链霉亲和素包被的培养皿中；
(8)将培养皿静置于磁铁上3min；
(9)取出培养皿，利用激光共聚焦显微镜进行拍摄。
结果如图5所示，可以看到，采用辅助悬浮细胞成像的系统，在激光共聚焦显微镜下能够准确拍摄出活的悬浮细胞的表面形貌，同时活的悬浮细胞的形态没有受到破坏，且不会出现模糊不清的图像。
实施例5
本实施例采用辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理，并利用激光共聚焦显微镜进行成像观察，与实施例1的区别仅在于，所述生物素标记的抗CD3四氧化三铁磁性微球的添加量为20μL，其余参数与实施例1保持一致。
结果如图6所示，可以看到即使添加过量的磁性微球也不会对成像质量造成影响，表明所述辅助悬浮细胞成像的系统稳定性较好。
实施例6
本实施例采用辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理，并利用激光共聚焦显微镜进行成像观察，与实施例1的区别仅在于，所述生物素的添加质量为磁性微球质量的50％，其余参数与实施例1保持一致。
结果如图7所示，可以看到即使添加大量生物素，采用所述辅助悬浮细胞成像的系统，在激光共聚焦显微镜下能够准确拍摄出活的悬浮细胞的表面形貌，同时活的悬浮细胞的形态没有受到破坏，且不会出现模糊不清的图像，表明所述辅助悬浮细胞成像的系统稳定性较好。
实施例7
本实施例采用辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理，并利用激光共聚焦显微镜进行成像观察，与实施例1的区别仅在于，所述链霉亲和素的添加质量为10μg，其余参数与实施例1保持一致。
结果如图8所示，可以看到即使添加大量链霉亲和素，采用所述辅助悬浮细胞成像的系统，在激光共聚焦显微镜下能够准确拍摄出活的悬浮细胞的表面形貌，同时活的悬浮细胞的形态没有受到破坏，且不会出现模糊不清的图像，表明所述辅助悬浮细胞成像的系统稳定性较好。
对比例1
本对比例对活的悬浮细胞进行处理，并利用激光共聚焦显微镜进行成像观察，其辅助系统与实施例1的区别仅在于，不包括磁场发生装置，其余参数与实施例1保持一致，具体包括以下步骤：
(1)37℃预热pH为7.4的磷酸盐缓冲液15min；
(2)取1μL浓度为2mg/mL的Hoechst33342细胞核染料加入到1mL预热好的磷酸盐缓冲液中，配制成染色液；
(3)取1×105T细胞，用100μL染色液重悬，并向其中加入5μL生物素标记的抗CD3四氧化三铁磁性微球；
(4)37℃避光静置30min；
(5)加入500μLpH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬细胞，300g离心5min后弃去上清；
(6)加入100μLpH为7.4的磷酸盐重悬细胞；
(7)将细胞加入到链霉亲和素包被的培养皿中；
(8)吸去培养皿上的液体，加入200μL 4％的多聚甲醛溶液，25℃下静置5min，固定细胞；
(9)缓慢吸去培养皿上的液体，加入100μL含0.5％Triton-X100的磷酸盐缓冲液，25℃下静置5min；
(10)缓慢吸去培养皿上的液体，加入200μL磷酸盐缓冲液和1μL浓度为20μM的罗丹明标记的鬼笔环肽，25℃下孵育30min；
(11)缓慢吸去培养皿上的液体，加入200μL磷酸盐缓冲溶液，静置5min后缓慢吸去培养皿中的液体；
(12)加入100μL抗淬灭的封片剂到培养皿中；
(13)取出培养皿，利用激光共聚焦显微镜进行拍摄。
结果如图9所示，当所述辅助悬浮细胞成像的系统去掉磁场发生装置后，在激光共聚焦显微镜下不能够准确拍摄出活的悬浮细胞的表面形貌，活的悬浮细胞的形态不稳定，会出现模糊不清的图像，表明所述辅助悬浮细胞成像的系统中磁场发生装置是不可或缺的。
对比例2
本对比例采用辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理，并利用激光共聚焦显微镜进行成像观察，与实施例1的区别仅在于，不采用链霉亲和素包被培养皿，其余参数与实施例1保持一致，具体包括以下步骤：
(1)37℃预热pH为7.4的磷酸盐缓冲液15min；
(2)取1μL浓度为2mg/mL的Hoechst33342细胞核染料加入到1mL预热好的磷酸盐缓冲液中，配制成染色液；
(3)取1×105T细胞，用100μL染色液重悬，并向其中加入5μL生物素标记的抗CD3四氧化三铁磁性微球；
(4)37℃避光静置30min；
(5)加入500μL pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬细胞，300g离心5min后弃去上清；
(6)加入100μL pH为7.4的磷酸盐重悬细胞；
(7)将细胞加入到无任何包被物包被的培养皿中，并置于磁铁上5min；
(8)吸去培养皿上的液体，期间培养皿不能离开磁铁；
(9)加入200μL 4％的多聚甲醛溶液，25℃下静置5min，固定细胞，期间培养皿不能离开磁铁；
(10)缓慢吸去培养皿上的液体，加入100μL含0.5％Triton-X100的磷酸盐缓冲液，25℃下静置5min，期间培养皿不能离开磁铁；
(11)缓慢吸去培养皿上的液体，加入200μL磷酸盐缓冲液和1μL浓度为20μM的罗丹明标记的鬼笔环肽，25℃下孵育30min，期间培养皿不能磁铁；
(12)缓慢吸去培养皿上的液体，加入200μL磷酸盐缓冲溶液，静置5min后缓慢吸去培养皿中的液体，期间培养皿不能离开磁铁；
(13)加入100μL抗淬灭的封片剂到培养皿中；
(14)取出培养皿，利用激光共聚焦显微镜进行拍摄。
结果如图10所示，在不采用链霉亲和素包被培养皿的情况下，采用激光共聚焦显微镜下拍摄的活的悬浮细胞的表面形貌不够清晰，表明是否采用链霉亲和素包被培养皿会影响细胞的成像质量。
对比例3
本对比例采用辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理，并利用激光共聚焦显微镜进行成像观察，与实施例3的区别仅在于，不包括磁场发生装置，其余参数与实施例3保持一致，具体包括以下步骤：
(1)37℃预热pH为7.4的磷酸盐缓冲液15min；
(2)取1μL浓度为0.5mM的Fluo-3 AM钙离子探针和1μL浓度为2mg/mL的Hoechst33342细胞核染料加入到1mL预热好的磷酸盐缓冲液中，配制成染色液；
(3)取1×105T细胞，用100μL染色液重悬，并向其中加入5μL生物素标记的抗CD3四氧化三铁磁性微球；
(4)37℃避光静置30min；
(5)加入500μL pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬细胞，300g离心5min后弃去上清；
(6)加入100μL的T细胞培养基重悬细胞；
(7)将细胞加入到链霉亲和素包被的培养皿中；
(8)取出培养皿，利用激光共聚焦显微镜进行拍摄。
结果如图11所示，当所述辅助悬浮细胞成像的系统去掉磁场发生装置后，在激光共聚焦显微镜下不能够准确拍摄出活的悬浮细胞的表面形貌，悬浮细胞的形态不稳定，会出现模糊不清的图像，表明所述辅助悬浮细胞成像的系统中磁场发生装置是不可或缺的。
对比例4
本对比例采用辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理，并利用激光共聚焦显微镜进行成像观察，与实施例3的区别仅在于，不采用链霉亲和素包被培养皿，其余参数与实施例3保持一致，具体包括以下步骤：
(1)37℃预热pH为7.4的磷酸盐缓冲液15min；
(2)取1μL浓度为0.5mM的Fluo-3 AM钙离子探针和1μL浓度为2mg/mL的Hoechst33342细胞核染料加入到1mL预热好的磷酸盐缓冲液中，配制成染色液；
(3)取1×105T细胞，用100μL染色液重悬，并向其中加入5μL生物素标记的抗CD3四氧化三铁磁性微球；
(4)37℃避光静置30min；
(5)加入500μL pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬细胞，300g离心5min后弃去上清；
(6)加入100μL的T细胞培养基重悬细胞；
(7)将细胞加入到无任何包被物包被的培养皿，并置于磁铁上5min；
(8)取出培养皿，利用激光共聚焦显微镜进行拍摄。
结果如图12所示，在不采用链霉亲和素包被培养皿的情况下，采用激光共聚焦显微镜下拍摄的活的悬浮细胞的表面形貌不够清晰，表明是否采用链霉亲和素包被培养皿会影响悬浮细胞的成像质量。
对比例5
本对比例与实施例1相比，不采用辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理，具体操作步骤如下：
(1)37℃预热pH为7.4的磷酸盐缓冲液15min；
(2)取1μL浓度为2mg/mL的Hoechst33342细胞核染料加入到1mL预热好的磷酸盐缓冲液中，配制成染色液；
(3)取1×105T细胞，用100μL染色液重悬；
(4)37℃避光静置30min；
(5)加入500μL pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬细胞，300g离心5min后弃去上清；
(6)加入100μL pH为7.4的磷酸盐重悬细胞；
(7)将细胞加入无任何包被物包被的培养皿中，静置5min；
(8)吸去培养皿上的液体；
(9)加入200μL 4％的多聚甲醛溶液，25℃下静置5min，固定细胞；
(10)缓慢吸去培养皿上的液体，加入100μL含0.5％Triton-X100的磷酸盐缓冲液，25℃下静置5min；
(11)缓慢吸去培养皿上的液体，加入200μL磷酸盐缓冲液和1μL浓度为20μM的罗丹明标记的鬼笔环肽，25℃下孵育30min；
(12)缓慢吸去培养皿上的液体，加入200μL磷酸盐缓冲溶液，静置5min后缓慢吸去培养皿中的液体；
(13)加入100μL抗淬灭的封片剂到培养皿中；
(14)取出培养皿，利用激光共聚焦显微镜进行拍摄。
结果如图13所示，可以看出成像结果中无细胞，表明不采用所述辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理，无法对活的悬浮细胞进行固定，导致无法拍摄到活的悬浮细胞的形态。
对比例6
本对比例与实施例3相比，不采用辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理，具体操作步骤如下：
(1)37℃预热pH为7.4的磷酸盐缓冲液15min；
(2)取1μL浓度为0.5mM的Fluo-3 AM钙离子探针和1μL浓度为2mg/mL的Hoechst33342细胞核染料加入到1mL预热好的磷酸盐缓冲液中，配制成染色液；
(3)取1×105T细胞，用100μL染色液重悬；
(4)37℃避光静置30min；
(5)加入500μL pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬细胞，300g离心5min后弃去上清；
(6)加入100μL的T细胞培养基重悬细胞；
(7)将细胞加入到无任何包被物包被的培养皿中，静置5min；
(8)取出培养皿，利用激光共聚焦显微镜进行拍摄。
结果如图14所示，可以看出成像结果中活的悬浮细胞的形态模糊不清，表明不采用所述辅助悬浮细胞成像的系统对活的悬浮细胞进行处理，无法对活的悬浮细胞进行很好的固定，导致拍摄到的活的悬浮细胞的形态模糊不清，从而无法得到活的悬浮细胞正常的生理结构。
综上所述，本发明采用功能化标记的磁性微球标记悬浮细胞，并通过特异性结合将悬浮细胞固定在细胞载体的功能化标记表面，同时采用磁场发生装置将标记悬浮细胞进一步固定在细胞载体的功能化标记表面。
需要说明的是，通过功能化标记的磁性微球、功能化标记表面的细胞载体及磁场发生装置三者之间的协调复配作用，在共聚焦显微镜进行细胞成像，能够得到清晰、完整的细胞成像结果，不会造成悬浮细胞形变，从而获得其正常生理结构，且成本低廉，步骤简便，可应用性强。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种辅助悬浮细胞成像的系统，其特征在于，所述系统包括功能化标记的磁性微球、功能化标记表面的细胞载体和磁场发生装置；
其中，所述磁性微球的功能化标记物和所述细胞载体的功能化标记物具有特异性结合作用。
2.根据权利要求1所述的辅助悬浮细胞成像的系统，其特征在于，所述细胞载体包括培养皿或载玻片。
3.根据权利要求1或2所述的辅助悬浮细胞成像的系统，其特征在于，所述磁性微球的粒径不超过2μm；
优选地，所述磁性微球表面修饰有功能基团和/或无机颗粒材料；
优选地，所述功能基团包括氨基、羟基或羧基中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述无机颗粒材料包括二氧化硅、二氧化钛、二氧化锰或氧化石墨烯中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的辅助悬浮细胞成像的系统，其特征在于，所述磁性微球被包括生物素、链霉亲和素、色氨酸、组氨酸或含镍分子中的任意一种或至少两种的组合功能化标记，优选为生物素；
优选地，所述生物素的添加质量与磁性微球质量的比例为1:(4-12)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的辅助悬浮细胞成像的系统，其特征在于，所述细胞载体的表面被包括链霉亲和素、生物素、色氨酸、组氨酸或含镍分子中的任意一种或至少两种的组合功能化标记，优选为链霉亲和素；
优选地，所述链霉亲和素的添加质量与所述生物素的添加质量的比例为(3-8):1。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的辅助悬浮细胞成像的系统，其特征在于，所述磁场发生装置包括磁铁、电磁场发生器。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的辅助悬浮细胞成像的系统的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：
(1)将功能化标记的磁性微球与悬浮细胞混合，得到标记悬浮细胞；
(2)将步骤(1)中得到的标记悬浮细胞加入到功能化标记表面的细胞载体中，然后静置于磁场发生装置中，进行标记悬浮细胞的物理固定；
(3)利用显微镜进行悬浮细胞成像。
8.根据权利要求7所述的辅助悬浮细胞成像的系统的使用方法，其特征在于，步骤(1)所述悬浮细胞与功能化标记的磁性微球的数量比为1:(1-20)；
优选地，步骤(1)所述悬浮细胞的来源包括T细胞、B细胞、树突状细胞或NK细胞中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(1)所述混合的时间为20-40min，混合的温度为4-42℃；
优选地，步骤(2)所述静置的时间为3-8min，静置的温度为4-37℃；
优选地，步骤(3)所述显微镜包括激光共聚焦显微镜、荧光倒置显微镜、全内反式显微镜、结构光照明显微镜、正置显微镜或超分辨光学成像显微镜中的任意一种。
9.根据权利要求7或8所述的辅助悬浮细胞成像的系统的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：
(1)将功能化标记的磁性微球与悬浮细胞在4-42℃下混合20-40min，得到标记悬浮细胞；
其中，所述悬浮细胞与功能化标记的磁性微球的数量比为1:(1-20)；
(2)将步骤(1)中得到的标记悬浮细胞加入到功能化标记表面的细胞载体中，然后在磁场发生装置中于4-37℃下静置3-8min，进行标记悬浮细胞的固定；
(3)利用显微镜进行悬浮细胞成像。
10.一种如权利要求1-6中任一项所述的辅助悬浮细胞成像的系统在悬浮细胞成像中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202111232986.1A CN114002195A (zh) | 2021-10-22 | 2021-10-22 | 一种辅助悬浮细胞成像的系统及其使用方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111232986.1A CN114002195A (zh) | 2021-10-22 | 2021-10-22 | 一种辅助悬浮细胞成像的系统及其使用方法和应用 |
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|---|---|---|---|
| CN202111232986.1A Pending CN114002195A (zh) | 2021-10-22 | 2021-10-22 | 一种辅助悬浮细胞成像的系统及其使用方法和应用 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115386595A (zh) * | 2022-09-05 | 2022-11-25 | 安徽大学 | 一种感染细胞的方法 |
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2021
- 2021-10-22 CN CN202111232986.1A patent/CN114002195A/zh active Pending
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