JPH07506898A - 分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分析方法 本発明は、回転電磁界に応答する微粒子の回転の観測に基づいた分析方法に関す るものである。

液体中の懸濁液に保持されているプラスチックビーズの形態の微粒子が、電極ア レイを通して印加された回転電界に応答して、回転しうろことが知られている。

この現象は、電気回転として知られている。同様の方法で、磁気双極子を与える 微粒子や、その内部でこうした双極子を誘起しうる微粒子が、回転磁界に応答し て回転しうろことが知られている。

印加電磁界の回転に応答する微粒子の回転は、電気的であろうと磁気的であろう と、ここては「電磁界回転」と呼ぶ。

電気回転が分析上の用途を持ちうろことが、示唆されてきた。こコテ、アーノル ドおよびジンマーマン（２ｉｍｍｅ＋ｍａｎ　）が（ｒＮＮｕ＋Ｗｉ＋＋ｅｎｓ ｃｈａＮｅ−ｎＪ　６９　：　ｌ　９８２年２９７　；　ｒ２．　Ｎ！１１１１ 　Ｆｏ＋ｓｈ、　Ｊ：Ｃ，３７，１９８２年、９０８〜９１５頁〕で示唆したと ころでは、細胞のこの電気回転を適用する可能性は、細胞膜と生態毒性物質との 間の相互作用の検出であり、この生態毒性物質は、例えば特定のイオンに対する 前記膜の透過性を変えることによって、この膜の電気的特性に影響する。ここで 、酵母細胞の電気回転特性が、重金属イオンによって影響されるのを観測できる ことが発見された。

この理由は、この細胞膜の電気的特性が１重金属イオンによって変化することに 、帰することができる。この方法は、大部分はこの細胞に対して毒性を示す種に 対してのみ、適用の可能性を有している。

本発明が基づいている観察によれば、微粒子の回転特性は、この微粒子と、分析 すべき何らかの標的とを含む複合体の生成によって変更することができ、この複 合体の識別可能な回転特性を観察することによって、この標的に関する情報が得 られる。

本発明による方法は、広範な種類の分析用途において使用できるけれども、微生 物や微小な生物学的生成物を含有するサンプルの分析に対して特に関係を有して いる。微生物自体、例えば細菌を同定する最近の方法としては、免疫学的、ＤＮ Ａ、生化学的および微生物学的技術を使用することが挙げられる。伝統的には、 特定の微生物を検出する方法としては、微生物を平板培養し、選択的培地上での 微生物の成長を観察するような、標準的な微生物学的技術が採用されてきた。更 に最近になると、問題の特定の微生物に向けられた抗体を使用し、特徴的なりＮ Ａ配列を増幅および検出する方法を含むイムノアッセイのような技術が、広範に 採用されはじめた。イムノアッセイおよびＤＮＡ検出のような方法によって得ら れる利点は、これらの方法が何らかの特異性を有していることであり、もっと伝 統的な生物学的技術を使用するよりも、常に迅速なことである。しかし、こうし た従来技術は幾つかの制限を有しており、これらの制限の中でも、従来技術はそ の感度が制限されており、幾つかの場合には非常に熟練した操作者と実験設備と が必要であり、これらの方法の性質からして非常に定量的ではない傾向があり、 伝統的な平板培養技術によってしか、生存細胞と非生存細胞とを識別することが できない。

下記の本発明による方法によれば、これらの欠点のすべてまたは幾つかに取りか かることが可能になる。

本発明が提供する分析方法は、微粒子、この微粒子に付着したリンク部分および 標的の複合体を生成させ、この複合体が、前記微粒子および付着したリンク部分 単独の電磁界回転特性とは観測上識別可能な電磁界回転特性を有しており、この 複合体の前記した識別可能な電磁界回転を観測することを含んでいる。

上記した「標的」は、標的自体がその存在、性質または量を確定した種である必 要はなく、標的の存在、性質または量が、本分析の究極の目的である。従って、 この標的は、本分析における試薬であってよく、本分析において興味の対称であ る種は、複合体の他の成分、例えばリンク部分であってよい。

背景としては、微粒子を外部の電界にさらしたときには、この粒子の表面上に電 荷が誘起されて現れ、これによって粒子が電気的双極子モーメントを獲得する。

もしこの電界が回転すると、誘起された双極子モーメントおよび電界強度に比例 した大きさのトルクがこの粒子の上に作用して、これによって粒子をスピンさせ る。回転電界を生じさせ、生体細胞を含むコロイド粒子に生じた電気回転を視覚 的に観測するための方法論は、Ｗ、　Ｍ、アーノルドおよびＮ、ジンマー７　： ／　［［静電字詰：　Ｉｏｕ＋■Ｉ　ｏｌ　Ｅｌｅｃｌ＋ｏｓｌｚｌｉｃｓ　Ｊ 　Ｖａｔ、　２１．１５１〜１９１頁、１９８８年］およびＲ，ホルツエル（Ｈ ＯＩ！！ｌ）〔［医療および生物工学およびコンピユーテイング：　Ｍｅｄｉｃ ｉｌ　ｗａｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｉｎｄ　Ｃｏｍ ｐｕｌｉｎｇＪ　Ｖｏｌ、　２８．１０２〜１゜５頁、１９８８年］に記載され ている。この粒子の回転の方向は、粒子およびこれを包囲する懸濁媒体の誘電お よび電気伝導特性に依存しており、回転電界の方向と同じ方向であってよく　（ 共電磁界回転として知られている）、またはこれと反対の意味であってよい（原 電磁界回転として知られている）。この粒子電気回転の速度は、典型的には１分 間当たり２〜６ラジアンのオーダーであり、もちろんこれは、顕微鏡で直接に電 気回転を観測するのに十分な遅さであり、この粒子の回転速度を、ある時間単位 の間における回転数を計数する観測者が、簡単に測定することができる。この現 象は、印加電界の回転の周波数に依存しており、微粒子の性質に依存しており、 １０　Ｈｚから！　００　Ｍ　Ｈｚの電磁界回転速度を採用することができこの 回転電界内で微粒子が経験するトルクは、この電界の回転と、微粒子に誘起され た双極子の回転との間の遅延の結果として、観察することができる。この微粒子 中に誘起された双極子は、最初の電磁界配向内に誘起された双極子の崩壊と、新 しい電磁界配向に整列する新しい双極子の生成とによって、粒子を回転させるこ となしに、この電界に対して再整列させることができる。この崩壊および再分極 の過程が、印加した回転電界に対して遅延している限りは、微粒子の有効双極子 モーメントが、あらゆる所与の時間で電界に整列しておらず、従ってトルクがこ の粒子に加わっている。従って、この印加電界の回転周波数に対する、観測され た電気回転現象の依存性は、次の関係として理解することができる。励起周波数 が非常に低いと、粒子中の双極子の再整列は、回転電界に対して遅れることはな く、双極子と電界との間の遅延は非常に小さく、従って回転は引き起こされない 。ある周波数の範囲内では、双極子が電界に対して遅延し、電気回転が観測され る。非常に高い周波数では、双極子が、電界とあらゆる定常的関係を維持するの に充分なほど迅速には、電界に対して追従せず、双極子が誘起されず、従って電 気回転トルクは存在しない。

我々が発見したところでは、所与の微粒子についての、所与の電磁界回転周波数 で観測される電気回転特性、例えば粒子の回転速度は、この微粒子と、微生物細 胞のような分析すべき標的種との間で複合体を生成させることによって、充分に 変更することができ、電気回転特性におけるこの変化を観測することができ、分 析方法の基礎を形成しうる。下記に示すように、この広範な概念の範囲内におい て、生存微生物細胞と生存していない微生物細胞とを識別しうる分析方法があり 、従来得られなかった程度の感度を有する分析方法がある。もし望むならば、定 量的な情報を得ることができる。

従って、好ましくは、観測される電磁界回転特性は、電気回転特性である。

微粒子に結合されるリンク部分は、標的に対して親和性を有する種である。好ま しくは、標的に対する前記の親和性は、選択的な親和性であり、これによって微 粒子と標的との間の複合体の生成が選択的となり、少なくとも標的を同定する感 度をもたらす。好ましくは、前記親和性が高度に特異的であり、従って、標的に 対して選択的な親和性をもたらす微粒子基質に結合した前記のリンク部分は、抗 体または抗体活性を有する抗体フラグメント、抗原、相補的核酸配列に対して選 択的親和性を有する核酸プローブまたは核酸類縁体プローブ、またはアビジンま たはストレプトアビジンのようなアビジン類似分子であってよい。

抗体と、抗体特性を有する抗体フラグメントとが特に好ましい。

本技術分野に習熟している者には非常に良く知られているプラスチックミクロビ ーズのような粒子の表面上に、抗体をコーティングするのに適した技術が既知で ある。抗体をコーティングした微粒子は、微生物細胞や何らかの他の標的上に存 在しつる、対応する抗原を認識し、結合する能力を有している。

また、この微粒子に対してオリゴ核酸プローブを結合させる方法も知られている 。適当な技術の例が、ＰＣＴ出願番号Ｇ　Ｂ　９２１０１５２６に記載されてい る。このリンク部分が核酸プローブまたは核酸類縁体プローブである場合には、 この微粒子は、むろん相補的核酸配列を認識し、結合するのに適しているであろ う。

更に、前記の複合体は、前記標的に結合する標識を有していてよい。この標識は 、標的と微粒子との間で複合体が生成する前が、これと同時か、またはこの後に 、前記標的に対して結合させることができる。この標識は、前記標的に対して親 和性を有する第２リンク部分と、このリンク部分に担持されている標識部分とを 有していてよい。更に再び、第２リンク部分が有している標的に対する親和性は 、選択的であることが好ましく、好ましくは高度に特異的であり、この第２リン ク部分もまた、抗体、抗体活性を有する抗体フラグメント、抗原、核酸プローブ 、核酸類縁体プローブ、アビジンまたはアビンン類似分子であってよい。微粒子 と標的との複合体が、それ自体としては充分に識別可能な電磁界回転特性を有し ていない場合には、この性質の標識を使用することを望むことができる。更に、 この電磁界回転特性を、標識を複合体内に移入することによって、変更すること ができる。この目的のために、標識中のリンク部分によって担持されている標識 部分は、微生物、金属粒子、重合体ビーズまたは磁性粒子であってよい。電気回 転の測定に関して使用するために、この標識は、誘電性を有しており、相当の表 面電荷を獲得する能力をＨしていることが好ましい。特に好ましい材料はコロイ ド状の金であり、コロイド状の金は（前記第二の種として）抗体に容易に結合し て標識を生成する。コロイド状の金（こ結合する抗体は、商業的に入手可能であ り、コロイド状の金に対して抗体を結合させる方法は、例えば、（ジオヒーガン （ＧｅｏｈｅｇＲｎ）　Ｗ、Ｄ、等、１９７８年ｒ１ｍｍｕｎｏ１．　Ｃｏｍｍ 、　Ｊ　７　ｐ　１．　］中に記載されている。しかし、他の金属粒子、例えば 銀粒子および鉄粒子を採用することができる。

上記した種類の標識を採用することは、標的と微粒子との複合体か充分に識別で きる電気回転特性を有している場合であってさえも、こうした複合体の生成を観 測可能とするために、好ましい。ある場合には、こうした複合体中に標識を使用 することによって、高いレベルの特異性を得ることができる。ここで、例えば、 第１の抗原と第２の抗原との双方を形質発現する微生物を、第１の抗原のみを形 質発現する微生物から、第１の抗原に対する抗体をリンク部分として有する微粒 子と、第２の抗原に対する抗体をその第２のリンク部分として有する標識とを使 用することによって、識別することができ、この微粒子、微生物および標識の複 合体が有する識別可能な電磁界回転特性を観測し、この微生物の電磁界回転特性 および第１の抗原のみを形質発現する微生物の電磁界回転特性から、識別する。

この標識が磁性粒子を含んでいて良く、これによって標識が磁石へと向かって誘 引され、前記標識を含有する複合体を集中させて、観測を容易にすることができ る。ある場合には、１］１１識複合体を磁石へと誘引し、標識されていないビー ズを洗浄して除去することで、リンク部分を担持するビーズの背景を除去し、し かし通常は存在しているであろう標的／標識を除去しないようにすることができ る。

この目的に適した磁性標識としては、抗体のようなリンク部分を保持する鉄微粒 子が挙げられるであろう。鉄粒子内にコーティングされたこの抗体は、商業的に 人手することができる。

通常は、ｌ　Ｑ　Ｈｚ〜１Ｍｆ（ｚの電界回転を採用することが好ましイテあろ うし、Ｌ　０ＯＨｚ　〜１０００Ｈｚ、例えば３００Ｈｚが更に好ましい。

好ましくは、１センチメートル当たり１００〜６５０ボルト、例えば２００Ｖ／ ｃｍの強度を有する回転電界を使用して、この電気回転特性を観測する。

一般的に好ましい形態の電気回転装置は、サンプル受は面の上に一組の電極が設 けられており、電気回転をその中で観測すべきサンプル分析電磁界を一組の電極 が包囲しているサンプル受は面、前記電磁界に向けられた光源、および、顕微鏡 またはカメラのような、電磁界中の粒子を観測する手段の形をとる。更に、この 装置は典型的には、これらの電極に対して、選択された周波数で選択された電圧 を印加し、回転電磁界を生じさせるための信号発生装置を備えている。

典型的には、サンプル受は面の上に印刷された電極を使用し、１００μｍから９ ．５ｍｍの範囲内へと互いに接近させることによって、電極の間に約０．０１〜 ０．３ｍｍ２、例えば０．０８ｍｍ”の面積の分析電磁界を採用することができ る。４つの直行方向から共通点に向かって接近する、矢印形状の末端を有する４ 個の電極を、使用することができる。信号発生装置からの直角出力を、これらに 対して印加することができる。

しかし、特に電極の配置（数および間隔）が適切に選択されており、より大きな 電圧を使用するときには、より大きな分析電磁界を採用することができる。

この複合体の電磁界回転特性は、顕微鏡を通して直接に観測することができ、観 測者が、顕微鏡の視野内の各粒子の回転速度を順に測定し、必要に応じて観測可 能な粒子の数を記録する。

しかし、更に好ましくは、電磁界回転特性の観測を、光学的検出技術を使用して 自動化された基礎の下で実施し、例えば、画像分析技術を使用して、装置の視野 内にある幾つかのまたはすべての複合体の各回転プロファイルを検出し、特徴付 けることができる。

使用する微粒子基質は、好ましくは重合体ビーズであり、更に好ましくはポリス チレンビーズである。この重合体ビーズを磁性とすることで、処理工程において ビーズの取扱いを助け、または後述するように電気回転を測定する際にビーズの 可視化を助けることができる。

このビーズは球状であってよいが、しかしビーズの回転の可視化を助けるために 、表面にピットまたはマークまたは非球面のような視覚的に識別できる特徴を有 しているビーズを、使用することが好ましい。

球状ビーズの回転を追跡するために観測できる特徴が欠けていることから、画像 分析を使用して球状ビーズの回転を観測することは困難なので、このビーズに必 要に応じてマークを付けることで、追跡可能な特徴を付与することができる。

好ましいマーク付与方法として挙げられるのは、染料、例えば蛍光染料によって ビーズまたは他の微粒子をコーティングし、次いで更にこの染料コーティングビ ーズを処理して、この染料のコーティングを視覚的に不均一にするこ七である。

これは、例えば、染料を変化させるために、例えば染料を漂白するためにレーザ ーを使用するような物理的処理であってよい。このビーズの一方の側面にレーザ ーを照射してこの作用を生じさせることによって、ＵＶ光の下に照射したときに 、このピースが、蛍光を発する半球と、暗い半球とを有するようにし、これによ って回転の観測を容易にすることができる。

染料、例えば蛍光染料を、ビーズまたは他の微粒子に対して付着されるリンク部 分内へと、標識として移入することができる。更に再び、視覚的に観測できる不 均一性を、レーザー先の照射によって生じさせることができる。

上記のいずれの方法においても、レーザー処理の代わりに化学的処理を使用して 、必要な不均一な染色コーティングを生じさせることができる。

または、染料をビーズに対して不均一な方法で付着させて、視覚的な不均一性を 直接に生じさせることができる。ここで染料の拡散を利用して、ビーズまたは他 の微粒子の集団の一方の側のみに染料を移動させることができる。

更に好適なアプローチでは、第１の組の微粒子の上に第１のコ−ティングを設け 、第２の組の微粒子の上に第２のコーティングを設け、第１および第２のコーテ ィングが、互いに対して親和性、例えば選択的親和性を有している。抗体／抗原 コーティングを採用することができる。これらのビーズは、混合したときには互 いに結合して、容易に観測可能な複合体微粒子を生成するであろう。

好ましくは、第１および第２の組のうち一方の組の微粒子は、他方の組内の微粒 子の径に比べて小さな径を有する粒子によって構成されている。次いでこの複合 体は、より小さな微粒子によって包囲された、より大きな微粒子の形をとる。こ のアッセイのためのリンク部分は、この小さな方の粒子内へとコーティングされ る。適当な粒径の比率は１４から１・８であり、例えば１μｍ以下である粒子と ６μｍの粒子とである。

本発明が含んでいる、電気回転による分析に使用するキットは、特定の標的種と 複合体を生成するのに適合したリンク部分を保持する微粒子と、 （ａ）　ＴＩＥ気回転アッセイにおける使用に適した分析電磁界を包囲する電極 パターンをその上に備えたサンプル受は面；または（１））前記と同し標的種と 複合体を生成するのに適合した電気回転標識 の少なくとも一方とを備えている。

このサンプル受は面は、サンプルを濾過して前記標的種を濃縮させる能力のある 透過性部材の上に設けることができる。例えば、微生物を濃縮するためには、こ れらの電極が、細孔性フィルターの表面上に、例えば、ある容量のサンプルが膜 を透過してこの膜の上に微生物を捕捉し、微粒子に対して結合させるための膜の 表面上に、存在していてよい。次いて、このキットは、前記サンプル受は面を与 える透過性部材を通しである容量の液体を透過させる手段を備えており、好まし くは前記の容量を測定する手段を備えている。

本発明の別の態様に含まれている、電気回転アッセイに使用するための細孔性フ ィルタ一部材は、サンプル受は領域を輪郭付ける電極パターンであって、電極の 上のサンプルに対して回転電界を印加する能力のある電極パターンを保持してい る。

本発明に従って採用できるようになった、広い範囲の分析技術を、本発明の範囲 内にある分析方法の多数の一般例に関する続く議論によって、例示するであろう 。

以下図面を参照して本発明の詳細な説明する。

図１は、本発明による測定装置の略側面図であり、図２は、上方から見た電気回 転測定装置の電極配置を示す略図であり、 図３は、本発明に使用される他の形態の測定装置の略側面図であり、 図４は、微粒子と細菌細胞との複合体を示す略図であり、図５は、微粒子、標的 および標識の複合体を示す略図であり、図６は、重合体ビーズに付着した捕捉プ ローブおよび標識部分を保持する検出プローブを使用した核酸標的の検出を示し ており、図７は、プライマー内に元来存在している電気回転標識を移入する核酸 増幅生成物の検出を示しており、図８は、図７に示されたものの変形法を示して おり、ここで標的は、適当な電気回転標識との反応によって検出可能な第１の標 識を含有しており、 図９は、図８に類似した装置を示しており、増幅反応の際にビオチニル化ヌクレ オチドを使用することによって、標的中へと移入される標識としてビオチンを使 用しており、および図１０は、重合体ビーズによって担持されているプローブプ ライマーをポリメラーゼ媒介によって伸長させて伸長リンカ一部分を生成させ、 これが、必要な標的として作用する電気回転標識を捕捉することができるのを示 しており、この伸長されたリンカ一部分の存在が、この分析の実際上の主題であ る。

図１１〜図１７は、実施例１〜８に詳述された電気回転の結果を示す図である。

図面と実施例との関連は以下に示す通りである。

図１１−　実施例３ 図１２−　実施例４ 図１３−　実施例５ 図１４及び１５−　実施例６ 図１６−　実施例７ 図１７−　実施例８ 図１に示されているように、本発明に使用される装置は、慣用の電磁界照射光源 １０３及びスライド台（図示せず）とともに、ＣＣ［）カメラ・アタッチメント １０２を有するレンズ１００によって概略的に示された光学的顕微鏡を備えてい る。

ＣＣＤカメラ１０２は、信号処理袋ｆｆ１１０４と、表示スクリーン１０６とに 接続される。当該装置は、図２に詳細に示されている電極パターンを支えている 顕微鏡スライド１１０上に設けられた端子に使用中接続されている周波数発生器 １０８を更に備えている。

これらの電極は、周波数発生器１０８の接続用端子に接続しているトラックとと もに、顕微鏡スライド１１０上に、例えば金でプリント、又はコーティング及び エツチングされる。対向する電極１１２と１１４との間隔、及び対向する電極１ １６と１１８との間隔を、２００〜５００μｍの範囲とすることが好ましい。以 下の実施例を参照して記載されている結果を出すのに使用される装置の場合、前 記間隔を３１５μｍとした。周波数発生器は、位相差９０度の２個のサイン波形 出力（直角位相出力）を供給する。２個のサイン波形出力の一方は、電極１１２ と１１４との間に接続され、他方は、電極１１６と１１８との間に接続される。

必要であれば、さらに多くの電極を用い、さらに均一な回転電磁界を提供するこ とができる。

周波数発生器の出力は可変であり、オペレータはサイン波形出力の周波数及びそ のピーク・トウー・ピーク電圧を設定することができる。以下の実施例に用いら れる一般的な条件を、ピーク・トウー・ピーク電圧６ボルトで、周波数３００Ｈ ｚとした。

本発明による装置の使用中にディスプレイに現れる画像は、顕微鏡の電磁界中の 多数のビーズを示している。この顕微鏡の電磁界は、順次に観察者が各ビーズを 見ることによって、３０秒程度の時間内に回転数を直接数えることができる程十 分ゆっくりと回転している。

以下に示す特定の実施例で証明されるように、上記装置は有効な結果を出すのに 十分なものであるが、一般的に、人間の観察者が通常直接的に処理できるよりも 多くのビーズについて回転速度測定が行われることが好ましい。このためには、 当該装置では画像処理技術を用いて、ビーズの回転を検出及び測定することが望 ましい。ＣＯＤカメラ・アタッチメントから、多数の回転ビーズを有する視界の 画像を得ることができる。このような一連の画像、またはフレームは、コンピュ ータ内のフレーム捜査回路によって捕獲され、当該一連の画像は画像処理ソフト ウェアによって分析される。

このため、閾値処理を用い、カメラから供給されるグレースケー小画像を２進数 画像に変換することができる。これとは別の閾値処理を行い、暗すぎると考えら れる画像領域を識別することができる。

これらの領域は、ビーズの２進数画像から除去される。この画像の残部から、画 像中に残存する形状を分離し、領域などの多数の特徴的な特性の一つをテストし 、ビーズを示していると思われるものを選択する。その後、集団の中心及び方向 を決定し、各形状を識別する。連続するフレームにおいて、中心の位置を比較し 、】フレーム内の各ビーズが次のフレーム内に位置するようにすることができる 。

ビーズが２つのフレーム内に存在すれば、ビーズの方向の差は、直接的に回転量 を提供し、この回転量から、ビーズの回転速度を計算し、数対のフレームにわた って平均値を計算できる。このような自動化された技術によって、多数の電磁界 回転周波数を選択的に使用して、任意の瞬時における視界内のすべてのビーズの 回転速度を計算し、ビーズの回転特性に関する統計上の画像が提供される。

サンプル内の任意の磁気ビーズを顕微鏡の視界内に引き込むことができる位置に 位置決めされた磁石、好適には電磁石を設けることによって、本発明による装置 をさらに変更することができる。その後、ビーズの回転特性の測定後、磁石を取 り除き、スイッチをオフする。

人間が理解することのできる視覚的な画像が本発明による装置によって供給され ることは本質的なことではない。図３に示されているように、本発明に使用され る装置はレーザ光源３０３を備え、好適な光学系を介してサンプルスライドを照 射し、光検出装置上に画像を生成する。当該画像は、信号分析回路３０４に供給 され、回転電磁界が電極３１２を介して周波数発生器３０８から供給される時に 観察される回転特性に関する数値出力を提供する。スライドは、カバースリップ ３２０を支持する。

図４に示すように、微粒子は、プラスチックビーズがリンク部分としての１以上 の抗体分子１４に結合した、プラスチックビーズ１２からなっていてよい。この 図面は共通の縮尺で製図したものではなく、通常は現実にはこのプラスチックビ ーズが、多数の抗体分子によってコーティングされるであろうことに、注意すべ きである。

この微粒子を、結合抗体と反応性である表面抗原を保持する微生物細胞１６に対 してさらすことで、微粒子とこの細胞との間で複合体１０を生成することができ る。この微生物細胞は、例えば、水中に存在している大腸菌または大腸菌群であ ってよく、またはリステリアまたはサルモネラのような、食品中に存在している 病原性微生物であってよい。この微粒子／微生物細胞複合体の回転速度が、適切 に選択された条件の下では、微粒子を単独で使用して得られた回転速度と識別可 能であることを発見し、更に、微粒子と生存微生物細胞との複合体について得ら れた回転速度が、同様の非生存細胞と微粒子との間で得られた回転速度から、識 別可能であることを発見した。

図５に示したように、３要素からなる複合体１０は、上記した図４で示した種類 の微粒子１２、抗原１８および標識２０の間で生成させることができ、標識２０ は標識部分２２と第２抗体２４とを含んでおり、第２抗体２４は抗体１４と同じ であってよく、異なっていても良い。この型の３要素複合体は、抗体１８が、微 粒子１０の回転特性に影響を与えるのに充分な誘電性の点で小さすぎるかまたは これを欠いている場合や、または一度の分析において２種類の異なる抗体を使用 することによって、高いレベルの特異性を得ることが望まれる場合に、採用する ことができる。この抗体は、例えば、食品中に汚染物として存在している毒素で あってよい。

図６〜図１１は、核酸および、特にＰＣＲＳＬＣＲおよび３ＳＲ技術のような増 幅方法の生成物として生じた核酸配列を検出する方法を示している。核酸増幅方 法の生成物を検出する既知の方法は、これらの生成物を分析する前に、これらの 生成物が、何らかの形の精製および／または分離方法を受けることに依存してい る。通常使用される方法の１つは、アガロースゲル電気泳動法によってこれらの 生成物を分析することを含んでいる。これは、増幅されたＤＮＡフラグメントと 、あらゆる残留オリゴヌクレオチドプライマーとを、大きさに基づいて分離する 。大きさのみに基づいて生成物を分離しても、必要な塩基配列を有するＩ’ＣＲ 生成物と、はぼこれと同じ長さを有する増幅された汚染物とを、識別することは できない。更にＰＣＲ生成物を同定するためには、このゲル電気泳動法に１つの 工程を加えて、この生成物を更にサンプルスライドに供することができ、ササン プロット技術においては、分離されたフラグメントを、このゲルから膜へと、ゲ ル上での各フラグメントの相対的位置に直接的に対応するように、移動させる。

次いて、目的とする配列に対して相補的な塩基配列を有する標識一本鎖ＤＮΔプ ローブを使用して、これらのフラグメントを検査する。このプローブのために使 用する標識は、通常はビオチンや、３２Ｐのような放射性同位体である。サザン ブロソト法は、比較的に労力を要する方法であり、ある程度の実験技術たけてな く、ある程度の実験装置および設備を必要とする。これは、多数のサンプルを迅 速にスクリーニングしたり、実験室の外でサンプルをスクリーニングしたりする 用途には、適していない。ササンプロット法のアガロースゲル分離工程を省略し たドツトプロット法は、幾分かは迅速であるけれども、しカル基本的にサザンブ ロット法と同じ欠点を有している。

図６に示したように、本発明による方法においては、ミクロスフイアは、オリゴ ヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチド類縁体を、捕捉プローブ２６（リン ク部分）として含んで０てよく、捕捉プローブ２６（リンク部分）が重合体ビー ズの表面に結合されており、予期される増幅方法の生成物２８のものに対して相 補的な配列を有している。使用した標識３０は、上記したように電気回転標識部 分３２を有しており、電気回転標識部分３２が、標的核酸配列の第２領域に対し て相補的な第２オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類縁体配列３４に 結合している。この微粒子および標識を、この増幅反応の生成物に対して、反応 生成物を処理して増幅生成物を分離するあらゆる処理の前または後に、加えるこ とができる。

次いて、この微粒子／増幅生成物／標識からなる３要素複合体の電気回転特性を 観測し、微粒子単独の電気回転特性から識別することができる。この方法の変更 例を図７に示しており、ここでは増幅方法で使用したプライマーの１つが、適当 な電気回転標識部分３２によって標識されており、これによって増幅方法の核酸 生成物中へと共有的に移入されはじめている。次いで２要素の複合体が、捕捉プ ローブ２６を保持する微粒子と増幅生成物との間で生成し、この複合体の電気回 転特性を観測する。

池の変更例を図８に示しており、ここでは増幅方法でプライマー中へと移入され る標識が、それ自体では電気回転標識部分てはなく、その代わりに上記したよう に電気回転標識の第２リンク部分と親和性を有するように選択された標識３６で あり、それ自体が電気回転標識部分３２を移入している。この標識３６は、例え ば、標識部分３２に結合した抗体と反応性であってよく、または標識部分３２に 結合したアビジンまたはアビジン類似分子と反応性のビオチン標識であってよい 。この方法の変更例においては、標識部分３２に結合している抗体は、増幅生成 物内に存在するあらゆる核酸配列に対して引き起こされたものであってよい。図 ９に示すこの方法の変更例においては、プライマー中へと標識を移入させるより も、この標識は、増幅方法で使用する幾つかのまたはすべてのヌクレオチド中へ と移入されていてよく、例えば、ビオチニル化ヌクレオチド４０を使用すること ができる。次いで、アビジン、またはストレプトアビシンのようなアビジン類似 分子に対して結合した電気回転標識部分を有する標識を使用することができる。

図１０８および１０ｂに示ず方法においては、最初に、標的配列２８ａを、微粒 子基質に付着した捕捉プローブ２６ａに対してハイブリッド形成させ、本増幅方 法を継続させ、または新しい増幅方法を開始して、ポリメラーゼおよび標識ヌク レオチド、例えばビオチニル化ヌクレオチドを使用することによって、微粒子の 捕捉プローブを伸長させる。次いて、この標的配列を微粒子から脱ハイブリダイ ゼーションさせ、微粒子基質に結合した標識伸長プローブ２６ｂを残す。次いで 、このプローブ上の標識を、電気回転標識部分３２と、標識プローブと反応性の 種、例えばアビジンとを有する電気回転標識と反応させることができる。これに よって、リンク部分としてこの伸長捕捉プローブ２６ｂを保持する微粒子と、電 気回転アッセイの標的として作用する標識部分３２を移入する標識との複合体が 生成する。

または、この伸長捕捉プローブは、いかなる標識も移入する必要はない。その代 わりに、この標識部分３２は、この伸長捕捉プローブに対して相捕的な核酸類縁 体上のオリゴヌクレオチドに付着されていてよい。

ある場合には、この捕捉プローブの伸長によってもたらされる電界回転特性の変 化を、更なる標識を使用することなしに、観測することでさえも可能である。こ のような場合には、この捕捉プローブの伸長が、標的種を構成しており、微粒子 （ビーズ）およびリンク部分（捕捉プローブ）を有する複合体が、この標的種と 共に生成されるものと言うことができる。

本方法によって検出される核酸体は、図６〜１０を参照しつつ例示されており、 特に図６および図１０に示したものに例示されているが、増幅方法の生成物であ る必要はないことを、理解することができるであろう。

次の特定の実施例によって、本発明を更に説明するであろう。

実施例１ 抗体コーティング重合体ビーズの調製 径６μｍのポリスチレン微粒子（ポリサイエンス　リミテッド）を、Ｌｍｌ当た り２．ｌＸ１０３個のビーズを含有するストック懸濁液として使用した。５００ μ【のこのビーズストックを、エッペンドルフ遠心分離装置内で、１分間、６０ ００ｒｐｍで遠心分離した。この上澄み液を廃棄し、このビーズを１ｍｌのＰＢ Ｓ　（リン酸緩衝液）中に再懸濁させた。この工程を３回繰り返し、ビーズを洗 浄した。最終的な再懸濁液は、ＰＢＳ中に１００μｇ／ｍｌまたは３００μｇ／ ｍｌで抗体を含有していた。このビーズを環状振とう装置中に配置し、終夜室温 で抗体の受動性結合を生じさせた。この後、この懸濁液を回転させ、上澄み液を 廃棄した。これらのビーズを、１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ１ｍｌ 中に、再懸濁した。室温で３０分間振とうした後に、上記した方法によって、Ｐ ＢＳ中でビーズを洗浄した。

得られた抗体コーティングビーズの各々は、その表面上；こコーティングされた 多数の抗体分子を有している。

実施例２ 抗体をコーティングしたビーズと大腸菌との複合体の生成１００μ■当たり約１ ０７個の大腸菌微生物を含むスト・ツク溶液を使用した。存在している微生物の 濃度は、標準的技術によって検このストック溶液の希釈を、ｉｏ　、ｉｏ’、１ ０−４．１０−７お＝１ よび、０−１０の各係数によって行った。

このストック溶液と各希釈液とを、バイオジエネシス　リミテ・ソドが供給する 抗体を使用して、実施例１におけるように調製した抗体をコーティングしたビー ズと、別々に複合化させた。この抗体コーティングビーズを懸濁液から回転させ 、大腸菌を含むＩ’ＢＳの懸濁液中に、１ｍｌ当たり３００マイクログラムのビ ーズ濃度で、毎回再懸濁させた。これらのビーズの細菌への結合を、回転測定に 先立って３７℃で一時間連続して行った。

実施例３ 抗体をコーティングしたポリスチレンビーズと大腸菌との複合体の電気回転 実施例２て調製した複合体の各懸濁液の１５μｍのサンプルを、図２を参照しつ つ上記したスライドの電極アレイの中心上に配置し、カバースリップによって被 覆した。このスライドを、図１を参照しつつ記載した装置の顕微鏡のプラットフ ォームの上に配置し、６ｖピークからピーク３００　Ｈｚの電界を使用して、ビ ーズを電気回転させた。これらの回転中のビーズを、テレビジョンスクリーンに 結合されたＣＣＤカメラを使用して可視化し、３０秒間に各ビーズが行う回転数 を、目とストップウォッチとによって測定した。これらの結果を図１１に示す。

この図中の各点は、顕微鏡の下で特定の各ビーズについて観測された回転速度を 示している。対照例のビーズ（大腸菌を存在させずに培養した、抗体をコーティ ングしたビーズ）に対して回転速度の拡大が観測されているが、しかし１０−１ および１０−３の希釈液においては、相当に早く回転するビーズを観測できたこ とを、理解することができる。この１０−３の希釈液は、使用した１００μ■の サンプル全部の中に約１００００個の大腸菌微生物がいることに相当している。

１０−１の希釈液で観測した回転速度が、１０−３の希釈液で観測した回転速度 よりも幾らか小さいことを、観測することができる。これは、より多くの大腸菌 微生物が、次いで観測される各ビーズに対して結合しているからであろう。これ は、複合体が単一のビーズと単一の微生物とからなっている場合に比べて、その 誘電特性における非対称性が本質的に少ない複合体を、生しさせるのかもしれな い。

実施例４ 生存大腸菌と生存していない大腸菌との電気回転特性の比較上記した生存大腸菌 のストック懸濁液（１００μ■当たり１０７個の微生物）を、漂白で処理するこ とによって、生存していない大腸菌微生物の懸濁液を製造し、漂白処理の後に微 生物が生存していないことを、適当な成長培地上で平板培養することによって、 検査した。実施例３で上記したように、抗体でコーティングしたビーズと大腸菌 微生物との複合体が生成した後に、この生存ストック懸濁液と漂白処理したスト ック懸濁液との電気回転特性を比較し、この方法を、生存および漂白処理したス トック懸濁液の１０−１希釈液をも使用して実施した。これらの結果を表１２に 示す。生存していない漂白処理微生物が、対照例よりもごく僅かに低い速度の電 気回転を生じさせている一方、生存している微生物は、顕著に高い速度で生存し ていない大腸菌とを、本電気回転アッセイによって識別しうろことを示している 。

実施例５ 抗体をコーティングしたポリスチレンビーズとＩｇＧ金との接合体の電気回転分 析 金粒子（径１０ｎｍ）１つ当たり約４個のＩｇＧ抗体分子と複合化している商業 的に入手可能な金粒子を使用して、実施例１に記載したようにして調製した抗１ ｇＧ抗体コーティングビーズとの複合体を生成させた。１００μｍ当たり１０１ ３〜１０１５個の金粒子れた複合体を、実施例３で上記したようにして電気回転 分析に供した。これらの結果を図１３に示す。対照例は、このＩｇＧ金接合接合 体、単一のＩｇＧ金粒子のみが複合化しているビーズの回転を観測しているのが 有望なものである。

実施例６ 鉄流体（鉄粒子抗体複合体）の電気回転の分析ＩｇＧ金複金体合体わりに、多数 の抗体分子と複合化している鉄からなる粒子（径約１６ｎｍ）を使用して、前述 した実施例を繰り返した。また再び、１００μｍ当たり約１０１３個の鉄粒子を 含有するストック懸濁液の希釈液を、１０　から１０−２１倍まで変動さ＝１ せて使用した。異なる希釈液についての結果を、図１４および図１５に示す。

実施例７ ポリスチレンビーズー抗ビオチン複合体およびストレプトアビジン−西洋ワサビ ペルオキシダーゼ接合体を使用した、ビオチンの電気回転アッセイ １００μｌ当たり約２．４Ｘ１０”個のビオチン分子を含有する（ストック濃度 ）ストック溶液およびこのある範囲の希釈液を、抗ビオチンコーティングしたポ リスチレンミクロビーズおよびストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダー ゼ（ＩＩＲＰ）接合体の懸濁液と共に培養し、抗体を介してビオチンに結合され ている微粒子からなる電気回転複合体を生成させ、またこのビオチンに対して実 施例８ ポリスチレンビーズ−オリゴヌクレオチド捕捉プローブ−ＰＣＲ生成物複合体の 電気回転の分析 ビーズへの捕捉プローブの付着 リステリア　モノシトゲン（Ｌｉｓｌｅ＋ｉｘ　Ｍｏｎｏｃ７１ｏｇｅｎｅ　） 中のｈｌｙＡ遺伝子からの暗号配列からの２　Ｑ　ｂ　ｐ　［（ｌＡｅｎｇｉｏ ｄ等、１９８６年）による塩基８５８から８７７に至る配列の補体〕を認識する 、３９ｂｐの長さの捕捉プローブを合成した。次いで、このオリゴヌクレオチド を、〔マニアティス（Ｍｘｎｉａｔｉｓ）等、１９９１年〕に従って、ＡＴＰお よび商業的に供給された緩衝液の存在下に、２時間３７℃で、Ｔ４ポリヌクレオ チドキナーゼで培養することによって、５−プライム（５°）リン酸化した。

このリン酸化されたオリゴヌクレオチドを、０．１Ｍのイミダゾール緩衝液ｐ　 Ｈ７および０．１Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カル ボジイミド〔ルンド（Ｌｕｎｄ）等、１９８８年〕中で終夜培養することによっ て、ポリスチレンミクロスフイアへと、表面アミノ基（重合体ビーズアミノミク ロスフイア、径６μｍ１ポリサイエンス　インコーホレーテッド）によって、付 着させた。

捕捉反応 捕捉反応に先立って、標的ＤＮＡ　（前記のｈｌｙＡ遺伝子中のプライマー側面 に位置する塩基７５７〜９０１を使用して、ＰＣＲ法によって製造した１４４ｂ ｐの二本鎖ビオチン標識ＤＮＡフラグメント（Ｍｅｎｇａｕｄ等、１９８６年） 〕を、図１７に示すように、１゜Ｏμｌのサンプル当たり、ある範囲の濃度で、 ５分間９５℃で変性させた。この反応は、標的ＤＮＡ、捕捉プローブを有するポ リスチレンビーズ、およびＰＣＲＩＩ衝液を含んでいる。この標的配列のアニー リングを、捕捉プローブと共に、５５℃で１５分間行い、続いて５０℃で洗浄工 程を行い、更に室温で２ＸＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳの中で３回洗浄した。

これらのビーズを、ＰＢＳ溶液内の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で３０ 分間室温で培養することによってブロックし、続いてＰＢＳ中で洗浄し、０．０ ５％のツイーン２０　（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、 これらのビーズを、ヤギ（シグマ）中で発生した抗ビオチン抗体と、３０分間室 温で反応させた。これに続いて、ＰＢＳＴ中で４回洗浄し、金に接合された抗ヤ ギ抗体に対して３０分間室温で第２の反応をさせた。Ｉ’ＢＳＴ中で４回洗浄し た後、無菌水中で更に４回洗浄し、これらのビーズを、先の実施例に記載したよ うに電気回転によって顕微鏡下に分析した。

図１７から理解できるように、このＰＣＲ法の生成物を、０．５ｐｇ／１００μ ｇまで検出することができる。

実施例９ 生ｑおよび死亡したクリプトスポリジウム卵母細胞の識別クリプトスポリジウム （Ｃ＋！ｐｔｏｓｐｏ＋ｉｄｉｕｍ　）は、牧畜動物の腸管に感染する寄生虫で あり、しばしば未処理水中に発見されており、飲料水中にもときどき発見されて いる。

我々は、生存したおよび死亡したクリプトスポリジウム卵母細胞（ｏｏｃｙｌｅ ）を識別するために、電気回転アッセイを適用した。抗りリプトスポリジウム抗 体をコーティングしたプラスチックミクロスフイアを、生存および死亡したクリ プトスポリジウムを含有するサンプルと混合する。微粒子−微生物複合体の生成 は、このクリプトスポリジウムの存在を示している。この複合体を１００Ｈｚで 電気回転に供すると、死亡した微生物の複合体は反電界回転を引き起こした一方 で、生存している微生物の複合体は引き起こさない。ＩＭＨｚにおいては、生存 および死亡複合体の双方の共電界回転が観測される。

同様のアプローチを、広い範囲の他の微生物、例えば、シアルシア、酵母、細菌 、ウィルス感染細胞、例えばＨＩ　Ｖ感染白血球および白血病細胞に対して、適 用することかできる。

図　１ 図６ 誘電体粒子で標識したオリゴプライマーを用いた増幅反応の生成物 ミクロスフィア 図９ 図１０Ａ 図１０８ 姪 屈 ■ ＝為巨○回− ＝　烏　巨　Ｃ回　謬 翼、ｔ１巨Ｏ回書 鵞命巨Ｑ回禦 藁コ匡Ｃ回四 ＝コ巨Ｃ回− フロントページの続き （３１）優先権主張番号　９２１２Ｌ７８．９（３２）優先日　１９９２年６月 ９日 （３３）優先権主張国　イギリス（ＧＢ）（３１）優先権主張番号　９２２３７ ９５−７（３２）優先日　１９９２年１１月１３日（３３）優先権主張国　イギ リス（ＧＢ）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ、ＫＲ，ＮＺ、ＵＳ （７２）発明者　パート、ジュリアン イギリス国、エルエル５７４エルエヌ　ギンド、パンゴール、カーナーフォン　 ロード　１２９

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．微粒子、この微粒子に付着したリンク部分および標的の複合体を生成させる ことを含む分析方法であって、この複合体が、前記徴粒子および付着したリンク 部分単独の電磁界回転特性と観測上識別可能な電磁界回転特性を有しており、こ の複合体の前記した識別可能な電磁界回転特性を観測する、分析方法。
2. ２．観測される電磁界回転特性が電気回転特性である、請求項１記載の分析方法 。
3. ３．前記リンク部分が、抗体または抗体活性を有する抗体フラグメント、抗原、 相補的核酸配列に対して選択的親和性を有する核酸プローブまたは核酸類縁体プ ローブ、またはアビジンまたはアビジン類似分子である、請求項１または２記載 の分析方法。
4. ４．前記複合体が更に前記標的に結合した標識を有している、請求項１〜３のい ずれか一つの項に記載の分析方法。
5. ５．前記標識が、前記標的に対して親和性を有する第２リンク部分および前記リ ンク部分に担持されている標識部分を有している、請求項４記載の分析方法。
6. ６．前記リンク部分が、抗体、抗体活性を有する抗体フラグメント、抗原、核酸 プローブ、核酸類縁体プローブ、アビジンまたはアビジン類似分子である、請求 項５記載の分析方法。
7. ７．前記標識中の前記リンク部分によって担持されている標識部分が、微生物、 金属粒子、重合体ビーズまたは磁性粒子である、請求項５または６記載の分析方 法。
8. ８．前記標的に結合した前記標識が磁性粒子を含んでいる、請求項４〜７のいず れか一つの項に記載の分析方法。
9. ９．１００Ｈｚ〜１０００Ｈｚで回転する電界を使用して電気回転を観測する、 請求項１〜８のいずれか一つの項に記載の分析方法。
10. １０．前記の回転電界が、１センチメートル当たり５０〜５００ボルトの強度を 有している、請求項９記載の分析方法。
11. １１．電気回転による分析に使用するキットであって、特定の標的種と複合体を 生成するのに適合したリンク部分を保持する微粒子と、（ａ）電気回転アッセイ における使用に適した分析電磁界を包囲する電極パターンをその上に備えたサン プル受け面；または（ｂ）前記と同じ標的種と複合体を生成するのに適合した電 気回転標識 の少なくとも一方とを備えている、キット。
12. １２．前記サンプル受け面が、サンプルを濾過して前記標的種を濃縮させる能力 のある透過性部材の上に設けられている、請求項１１記載のキット。
13. １３．前記サンプル受け面を備えており、前記電極が細孔性フィルターの表面上 に存在しており、ある容量のサンプルが細孔性フィルターを透過してこの膜の上 に微生物を捕捉し、微粒子に対して結合させる、請求項１２記載のキット。
14. １４．前記サンプル受け面を与える前記細孔性フィルターを通してある容量の液 体を透過させる手段を備えている、請求項１３記載のキット。
15. １５．電気回転を受けうる微粒子であって、特定の標的種と複合体を生成するの に適合したりンク部分を、これと同じ標的種と複合体を生成するのに適合した標 識と共に保持しており、前記微粒子と前記標的種との複合体の電気回転特性を変 更する能力を有する微粒子。
16. １６．請求項１５に記載した微粒子、前記標的種、および請求項１５に記載した 標識の間に生成した３要素複合体。
17. １７．電気回転アッセイ用の細孔性フィルター部材であって、サンプル受け領域 を輪郭付け、電極パターンの上のサンプルに対して回転電界を印加する能力を有 する電極パターンを保持している、細孔性フィルター部材。