JPH06113897A

JPH06113897A - 核酸の測定方法

Info

Publication number: JPH06113897A
Application number: JP27012592A
Authority: JP
Inventors: Kyoko Imai; 恭子今井; Kazunari Imai; 一成今井; Yasushi Nomura; 靖野村
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1992-10-08
Filing date: 1992-10-08
Publication date: 1994-04-26

Abstract

(57)【要約】【目的】試料中に含まれる核酸分析物の興味あるオリゴ
ヌクレオチド配列の簡便、かつ、高感度な測定方法の提
供。【構成】核酸試料中に存在する核酸分析物の興味あるオ
リゴヌクレオチド配列の量を検出する核酸の測定方法で
あって、前記核酸試料と粒子支持体に結合された１種以
上のポリヌクレオチド試薬とをハイブリダイゼーション
条件下で混合し、前記核酸分析物と前記ポリヌクレオチ
ド試薬とのハイブリダイゼーションによって形成した二
本鎖を選択可能な切断部位で切断する工程と、切断によ
り遊離する粒子支持体を検出する工程を含むことを特徴
とする核酸の測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸試料中に存在する
核酸分析物のオリゴヌクレオチド（特定塩基）配列の有
無の検出に係り、特に、感染性細菌の検出に有効で、感
染症の診断ならびにスクリーニングに用いる核酸の測定
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】感染症の診断には、病原微生物の検出同
定が必須である。特定の病原微生物又はその特異抗原に
対する患者血清の抗体価上昇を証明することは、感染症
の影を見ているに過ぎず、その本態を確認するものでは
ない。感染症の原因微生物を培養によって検出同定する
には時間がかかり、疾病の診断と治療が間に合わないと
云うことはたびたび指摘されてきた。

【０００３】試料核酸中の特定塩基配列の有無を調べる
ことにより、感染症の病因菌の特定ならびに、感染症の
発症前の診断が可能になってきた。すなわち、ＤＮＡプ
ローブを用いる方法である。

【０００４】検出対象とする核酸の塩基配列に相補的な
配列を有する一本鎖ＤＮＡ（これをＤＮＡプローブと呼
ぶ）を、特異的な反応試薬として利用する。試料中にＤ
ＮＡプローブの塩基配列と相補的な塩基配列の有無を検
出することにより、目的病原菌の有無を判断することが
できる。具体的な方法としては、日本臨床：４７巻，７
３７−７５４（１９８９）等に紹介されている。

【０００５】その一例として、ドットハイブリダイゼイ
ションと呼ばれる方法がある。これは、試料を変性処理
して得た一本鎖ＤＮＡ（ＳＳ−ＤＮＡ）を固相に結合さ
せ、この固相にラジオアイソトープを標識したＳＳ−Ｄ
ＮＡを作用させて、上記固相のＳＳ−ＤＮＡとハイブリ
ッドを形成させてから、未反応の標識ＳＳ−ＤＮＡを除
去し、固相の放射線を測定する方法である。

【０００６】また、この方法の変形法として、サンドイ
ッチハイブリダイゼイションがある。これは、吸着によ
るバックグラウンドを下げることができ、不純なサンプ
ルを用いる場合に特に有効である。この方法では、識別
しようとする標的核酸に由来するＤＮＡフラグメントを
少なくとも２つ使用する。一方のＤＮＡフラグメントは
固相に結合させて、捕獲試薬として使用する。もう一方
のフラグメントは検出用試薬として標識し、ハイブリダ
イゼイション溶液に可溶化した標本サンプルと一緒に加
える。標本サンプル中に、両方の試薬に相同的な塩基配
列が存在している場合には、その配列は、捕獲試薬にも
検出用試薬にもハイブリダイズする筈である。ハイブリ
ダイズしたか否かは、固相への標識を介して知ることが
できる。

【０００７】前記２つの方法では、特に、検出対象核酸
の量が少ない場合に問題がある。また、測定の際に数多
くの作業工程を必要とし、特に、試料の固定化に長時間
を要することから操作上の労力と時間を要すると云う問
題がある。

【０００８】これを解決する方法として、例えば、特公
平３−７８１２０号公報（特願昭５８−１９９７０２
号）に提案される制限酵素を用いる方法である。この方
法では、測定対象である一本鎖ポリヌクレオチドを、標
識物が結合され、かつ、測定対象一本鎖ポリヌクレオチ
ドと二本鎖ポリヌクレオチドを形成し得るポリヌクレオ
チドを結合した固相と、溶液中で接触させ、二本鎖ポリ
ヌクレオチドを形成し、該二本鎖ポリヌクレオチドに制
限酵素を作用させてこの二本鎖を切断し、溶液又は固相
の標識物を測定する。

【０００９】同様に制限酵素又は選択可能な切断部位を
導入した試薬を用いる方法が特開平２−９２３００号公
報に示されている。また、酵素標識を用いる方法が特公
平３−６４１１９号にに示されている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】前記のように核酸の測
定は、その目的から迅速に測定できることが必要である
が、従来技術では、反応時間についての配慮がなされて
おらず、特に、試料ＤＮＡ又はＲＮＡの反応に時間を要
していた。これは、いずれの技術においてもＤＮＡプロ
ーブを固相に固定化して用いているためである。ＤＮＡ
は比較的高分子であり、その拡散速度が小さく固相−液
相の反応では一般に時間を要する。感染症の診断という
目的に十分対応するには、もっと迅速性が要求さる。

【００１１】また、検出感度につても従来技術では不十
分であった。すなわち、感染症の初期診断においては、
外来の病原性細菌を少ない量で検出できることが必要で
ある。しかし、従来技術ではこれに応えることができ
ず、病気が発症した後など体内の病原菌量が増加した段
階でしか検出できない。これを補う方法として、試料Ｄ
ＮＡ断片を増幅する方法があるが、時間を要すること、
サンプリングエラーやコンタミネイション等があり実用
的ではない。

【００１２】前記標識として、放射性同位元素や酵素を
用いて、化学的に増幅する方法が提案されているが、放
射性同位元素の検出はコストが高く経済的に問題があ
り、かつ、安全性や廃棄上の問題も考慮しなければなら
ない。また、半減期の問題がありプローブを保存してお
けない。

【００１３】酵素反応による化学増幅は、モル濃度に換
算して１０Ｍが限界であり、基質の分解等の影響により
低濃度での測定値が信頼性に欠ける。また、増幅率は反
応条件に依存し易く、共存物の影響を受け不安定であ
る。更にまた、特定の反応（ハイブリダイゼイション）
以外の吸着によって、固相の表面に付着した標識物によ
る非特異反応も増幅し、Ｓ／Ｎが低い。

【００１４】これらの検出における問題は、従来の検出
手段がいずれも濃度測定を行なうことにある。

【００１５】本発明の目的は、前記課題を解決し、迅速
な反応が可能で、極低濃度での検出が可能な核酸の測定
方法を提供することにある。

【００１６】また、同時に放射性同位元素等を用いない
取扱性の優れたな核酸の測定方法を提供することにあ
る。

【００１７】

【課題を解決するための手段】発明者らは、前記課題を
解決すべく検討を重ねた結果、少なくとも１つの粒子支
持体と試料が関係するハイブリダイゼーションを用い、
粒子支持体を検出することによって、核酸試料中に存在
する核酸の特定のオリゴヌクレオチド配列を検出できる
ことが分かり、本発明に到達した。

【００１８】本発明の特徴は、ＤＮＡプローブを微粒子
支持体に担持させ、これを液相中で浮遊状態で反応さ
せ、検出には最終的に濃度測定を行なうのではなく、反
応に関与した微粒子の数を計数するようにした点にあ
る。

【００１９】ここで用いる微粒子としては、特に、蛍光
性色素を含む直径１０μｍ以下の粒子が望ましい。

【００２０】粒子に結合させたプローブと核酸試料中に
存在する核酸分析物のオリゴヌクレオチド配列とはハイ
ブリダイズして二本鎖を形成する。形成した二本鎖部位
は、切断部位又は選択的な切断部位あるいは解離部位を
与える。ハイプリダイズ産物の一本鎖部位においても切
断部位を与えることができる。

【００２１】次いで、該切断あるいは解離部位は、切断
あるいは解離されて、粒子支持体の分離を生じる。粒子
の有無の検出は、従来技術により行うことができる。

【００２２】本発明では、粒子は興味ある分析物が存在
する場合にのみ検出される。ある好ましい一例では、試
料と１つ又はそれ以上の粒子プローブとの間に二本鎖を
形成することによって、切断部位を導入することにより
行われる。この切断部位は、制限エンドヌクレアーゼ切
断部位、あるいは多数の種類の化学的に分解可能な部位
（例えば、ジスルフィド結合または過ヨウ素酸分解可能
な１,２−ジオール等）でもあり得る。すなわち、（１）核酸試料中に存在する核酸分析物の特定のオリゴ
ヌクレオチド配列を検出する本発明の方法は、核酸試料
をハイブリダイゼーションの条件下でポリヌクレオチド
試薬と混合する工程を含み、該試薬の成分は粒子支持体
に結合し、分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブ
リダイゼーションによって形成した二本鎖を切断する工
程、該切断により遊離する粒子支持体を検出する工程を
含む。

【００２３】（２）核酸試料中に存在する核酸分析物の
興味あるオリゴヌクレオチド配列の存在を検出する本発
明の他の方法は、核酸試料をハイブリダイゼーション条
件下でポリヌクレオチド試薬と混合する工程を含み、該
試料成分は支持体に結合し、該試薬の成分は粒子支持体
に結合し、核酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハ
イブリダイゼーションによって形成した二本鎖を切断す
る工程、該切断により遊離する粒子支持体を検出する工
程を含む。

【００２４】（３）更に、上記オリゴヌクレオチド配列
の存在を検出する他の方法は、核酸試料をハイブリダイ
ゼーション条件下でポリヌクレオチド試薬と混合する工
程を含み、該試薬の成分は支持体及び粒子支持体に結合
し、核酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリ
ダイゼーションによって形成した二本鎖を切断する工
程、該切断により遊離する粒子支持体を検出する工程を
含む。

【００２５】（４）更にまた、上記オリゴヌクレオチド
配列の存在を検出する他の方法は、核酸試料をハイブリ
ダイゼーション条件下で複数種のポリヌクレオチド試薬
と混合する工程を含み、該試薬の成分は複数種の粒子支
持体に結合し、核酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬と
のハイブリダイゼーション生成物を未反応の粒子支持体
から分離させる工程、核酸分析物と該ポリヌクレオチド
試薬とのハイブリダイゼーションによって形成した二本
鎖を切断する工程、切断により遊離する粒子支持体を検
出する工程を含む。

【００２６】（５）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオ
チド試薬と混合する工程を含み、該試薬の成分は粒子支
持体に結合し、核酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬と
のハイブリダイゼーションによって形成した二本鎖を選
択可能な切断部位で切断する工程、切断により遊離する
粒子支持体を検出する工程を含む。

【００２７】（６）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオ
チド試薬と混合する工程を含み、試料成分は支持体に結
合し、該試薬の成分は粒子支持体に結合し、核酸分析物
と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーション
によって形成した二本鎖を選択可能な切断部位で切断す
る工程、該切断により遊離する粒子支持体を検出する工
程を含む。

【００２８】（７）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオ
チド試薬と混合する工程を含み、試薬成分は支持体及び
粒子支持体に結合し、核酸分析物と該ポリヌクレオチド
試薬とのハイブリダイゼーションによって形成した二本
鎖を選択可能な切断部位で切断する工程、該切断により
遊離する粒子支持体を検出する工程を含有する。

【００２９】（８）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下で複数種のポリ
ヌクレオチド試薬と混合する工程を含み、該複数種試薬
の成分は複数種の粒子支持体に結合し、核酸分析物と該
ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーション生成
物を未反応の粒子支持体から分離させる工程、核酸分析
物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーショ
ンによって形成した二本鎖を選択可能な切断部位で切断
する工程、該切断により遊離する粒子支持体を検出する
工程を含む。

【００３０】（９）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオ
チド試薬と混合する工程を含み、該試薬の成分は粒子支
持体に結合し、核酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬と
のハイブリダイゼーションによって形成した二本鎖を解
離する工程、該解離により遊離する粒子支持体を検出す
る工程を含有する。

【００３１】（10）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオ
チド試薬と混合する工程を含み、試料成分は支持体に結
合し、試薬の成分は粒子支持体に結合し、核酸分析物と
該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーションに
よって形成した二本鎖を解離する工程、該解離により遊
離する粒子支持体を検出する工程を含む。

【００３２】（11）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオ
チド試薬と混合する工程を含み、該試薬の成分は支持体
及び粒子支持体に結合し、核酸分析物と該ポリヌクレオ
チド試薬とのハイブリダイゼーションによって形成した
二本鎖を解離する工程、該解離により遊離する粒子支持
体を検出する工程を含む。

【００３３】（12）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下で複数種のポリ
ヌクレオチド試薬と混合する工程を含み、該複数種試薬
の成分は複数種の粒子支持体に結合し、核酸分析物と該
ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーション生成
物を未反応の粒子支持体から分離させる工程、核酸分析
物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーショ
ンによって形成した二本鎖を解離する工程、該解離によ
り遊離する粒子支持体を検出する工程を含む。

【００３４】（13）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオ
チド試薬と混合する工程を含み、該試薬成分は粒子支持
体に結合し、核酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬との
ハイブリダイゼーションを形成させる工程、ハイブリダ
イゼーション生成物の一本鎖部位を切断する工程、該切
断により遊離する粒子支持体を検出する工程を含む。

【００３５】（14）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオ
チド試薬と混合する工程を含み、該試料成分は支持体に
結合し、該試薬成分は粒子支持体に結合し、核酸分析物
と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーション
を形成させる工程、ハイブリダイゼーション生成物の一
本鎖部位を切断する工程、該切断により遊離する粒子支
持体を検出する工程を含む。

【００３６】（15）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオ
チド試薬と混合する工程を含み、該試薬成分は支持体及
び粒子支持体に結合し、核酸分析物と該ポリヌクレオチ
ド試薬とのハイブリダイゼーションを形成させる工程、
ハイブリダイゼーション生成物の一本鎖部位を切断する
工程、該切断により遊離する粒子支持体を検出する工程
を含む。

【００３７】（16）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下で複数種のポリ
ヌクレオチド試薬と混合する工程を含み、該複数種の試
薬の成分は複数種の粒子支持体に結合し、核酸分析物と
該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーション生
成物を未反応の粒子支持体から分離させる工程、核酸分
析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーシ
ョンを形成させる工程、ハイブリダイゼーション生成物
の一本鎖部位を切断する工程、該切断により遊離する粒
子支持体を検出する工程を含む。

【００３８】（17）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下で複数種類のポ
リヌクレオチド試薬と混合する工程を含み、該複数のポ
リヌクレオチド試薬の成分は複数種の粒子径の異なる粒
子支持体に結合し、核酸分析物と該ポリヌクレオチド試
薬とのハイブリダイゼーション生成物を未反応の粒子支
持体からフィルタ−で分離させる工程、核酸分析物と該
ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーションによ
って形成した二本鎖を切断する工程、あるいは核酸分析
物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーショ
ンによって形成した二本鎖を選択可能な切断部位で切断
する工程、あるいは核酸分析物と該ポリヌクレオチド試
薬とのハイブリダイゼーションによって形成した二本鎖
を解離する工程、あるいはハイブリダイゼーション生成
物の一本鎖部分を切断する工程、該切断により遊離する
粒子支持体を検出する工程を含む。

【００３９】（18）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下で複数種のポリ
ヌクレオチド試薬と混合する工程を含み、該複数種のポ
リヌクレオチド試薬を結合させる複数種の粒子支持体の
うち一種類が磁性体粒子から成り、核酸分析物と該ポリ
ヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーション生成物を
未反応の粒子支持体から磁石で分離させる工程、核酸分
析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーシ
ョンによって形成した二本鎖を切断する工程、あるいは
核酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイ
ゼーションによって形成した二本鎖を選択可能な切断部
位で切断する工程、あるいは核酸分析物と該ポリヌクレ
オチド試薬とのハイブリダイゼーションによって形成し
た二本鎖を解離する工程、あるいはハイブリダイゼーシ
ョン生成物の一本鎖部分を切断する工程、該切断により
遊離する粒子支持体を検出する工程を含む。

【００４０】（19）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下で複数種のポリ
ヌクレオチド試薬と混合する工程を含み、該複数種のポ
リヌクレオチド試薬の成分は複数種の比重の異なる粒子
支持体に結合し、核酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬
とのハイブリダイゼーション生成物を未反応の粒子支持
体から遠心分離させる工程、核酸分析物と該ポリヌクレ
オチド試薬とのハイブリダイゼーションによって形成し
た二本鎖を切断する工程、あるいは核酸分析物と該ポリ
ヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーションによって
形成した二本鎖を選択可能な切断部位で切断する工程、
あるいは核酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイ
ブリダイゼーションによって形成した二本鎖を解離する
工程、あるいはハイブリダイゼーション生成物の一本鎖
部分を切断する工程、該切断により遊離する粒子支持体
を検出する工程を含む。

【００４１】（20）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下で複数種のポリ
ヌクレオチド試薬と混合する工程を含み、該複数種の試
薬の成分は複数種の粒子支持体に結合し、該複数種の粒
子支持体は蛍光標識粒子であり、核酸分析物と該ポリヌ
クレオチド試薬とのハイブリダイゼーション生成物と未
反応の粒子支持体が混在する状態の試料を用いて、粒子
支持体の蛍光強度を測定する工程を含む。

【００４２】（21）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下で複数種のポリ
ヌクレオチド試薬と混合する工程を含み、該複数種の試
薬の成分は複数種の粒子支持体に結合し、該粒子支持体
の一方は蛍光標識粒子であり、該粒子支持体の他方は蛍
光標識していない粒子であり、核酸分析物と該ポリヌク
レオチド試薬とのハイブリダイゼーション生成物と未反
応の粒子支持体が混在する状態の試料を用いて、粒子支
持体の蛍光強度および散乱強度を測定する工程を含む。

【００４３】（22）更にまた、本発明の他の方法は、核
酸試料をハイブリダイゼーション条件下で複数種のポリ
ヌクレオチド試薬と混合する工程を含み、該複数種の試
薬の成分は複数種の粒子支持体に結合し、核酸分析物と
該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーション生
成物と未反応の粒子支持体が混在する状態の試料を用い
て、粒子支持体の散乱強度を測定する工程を含む。

【００４４】特定の配列の検出はハイブリダイゼーショ
ンを用いて行われる。本発明の好ましい方法では、試料
の核酸は溶液中に遊離した状態にあるが、支持体に結合
していてもよい。この方法は試料中の核酸と粒子結合プ
ローブとの間で核酸の二本鎖を形成することも含む。

【００４５】プローブに結合している粒子は、核酸の二
本鎖あるいは一本鎖部位の切断または解離により液中に
遊離する。従って、液中に遊離する粒子の量は核酸の試
料中における興味ある配列の量に比例する。粒子には、
蛍光標識が付されていてもよい。遊離した粒子は、検出
可能な信号または検出可能な信号を得るための手段を提
供し得るので、従来知られた方法によって測定すること
ができる。

【００４６】試薬としては、核酸分析物にハイブリダイ
ズする興味あるオリゴヌクレオチド配列を有するポリヌ
クレオチド配列を含むものを使用する。

【００４７】本明細書中においては、用いている用語の
意味は下記のとおりである。

【００４８】核酸試料：興味あるオリゴヌクレオチド配
列を有する核酸配列を含むと思われる試料。

【００４９】核酸分析物：興味あるオリゴヌクレオチド
配列を有する前記核酸試料中のＤＮＡまたはＲＮＡ。

【００５０】興味あるオリゴヌクレオチド配列：ヌクレ
オチド鎖の全体または一部であり、普通には少なくとも
６〜１０塩基、好ましくは少なくとも１６塩基、そして
５ｋｂまたはそれ以上でもあり得るが、通常０.２ｋｂ
を超えないＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列。該ＤＮＡ配列
またはＲＮＡ配列は検出すべき特性に特徴的である。該
特性は遺伝的特性や病原体などに特徴的な遺伝子または
配列である。

【００５１】ポリヌクレオチド配列（プローブ）：興味
あるオリゴヌクレオチド配列の検出用試薬として用いら
れるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を云う。該ポリヌクレ
オチド配列は、標識しても標識しなくてもよいが、粒子
支持体に結合させて用いる。そして興味あるオリゴヌク
レオチド配列に相補的な配列を含む。該配列には選択的
に切断可能な部位を有する場合もあり得る。

【００５２】選択的に切断可能な部位：選択的に切断す
ることができる制限酵素部位、リン酸エステル、プリ
ン、ペプチド結合などを含有する１つの官能基または複
数の官能基である。

【００５３】本発明の方法は、様々な場合におけるオリ
ゴヌクレオチド配列、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡの検
出に利用し得る。興味ある第一の分野は、特定の宿主に
感染し得る病原体、ウィルスなどの検出である。興味あ
る第二の分野は、羊水穿刺に伴うような宿主のゲノムに
存在する遺伝子の変異、または障害の検出あるいは遺伝
的カウンセリングである。

【００５４】ポリヌクレオチド試薬または試料核酸は、
共有結合的にまたは非共有結合的に支持体に結合あるい
は吸着させる。

【００５５】ポリヌクレオチド試薬の成分を支持体に結
合させるための支持体としては粒子がある。その材質と
しては、ポリスチレン、ポリアクリル酸、およびこれら
の誘導体（例えば、ポリアクリルアミド）、ガラス、セ
ラミック、金属などが用いられる。これらは、共有結合
又は非共有結合かによって、官能基化又は非官能基化さ
せることができる。ポリヌクレオチド試薬成分を支持体
に結合させるには、従来技術が用いられる。例えば、支
持体を活性アミノ基を修飾して官能基化することができ
る。この官能基化は、支持体へのアルキルアミン、ヒド
ラジン、又はチオセミカルバジドを結合させることによ
り行われる。また、支持体を活性カルボキシル基で修飾
して官能基化することもできる。

【００５６】前記粒子支持体の粒子径は、平均粒径で
０.０１〜１０μｍ、特に、０.０１〜１μｍが好まし
い。

【００５７】ポリヌクレオチドの大きさは、普通は約１
５塩基を下回らず、５０塩基又はそれ以上である。通
常、核酸試料中の配列と相同性を有するポリヌクレオチ
ド試薬成分中の領域が存在し、通常興味ある該配列は６
塩基以上を有し、ハイブリダイゼーションのための領域
は１６塩基以上で、通常約１ｋｂｐを越えない。完全な
相同性は必要ではなく、少なくとも約５０％、より好ま
しくは８０％の相同性があれば充分である。

【００５８】

【作用】本発明の方法によれば、ハイブリダイゼーショ
ン条件下においてポリヌクレオチド試薬成分を結合させ
た粒子支持体と核酸試料とを反応させる。この際、該試
料と複数種の粒子支持体に結合させた該ポリヌクレオチ
ド試薬とのハイブリダイゼーション生成物を、未反応の
粒子支持体から分離させる工程を経た後に、粒子支持体
を検出するよう分析方法を組立ることもできる。あるい
は、該試料と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイ
ゼーション生成物と未反応の粒子支持体が混在する状態
の試料を用いて、粒子支持体を検出するように分析方法
を組立ることもできる。

【００５９】前者の場合において、ハイブリダイゼーシ
ョン生成物と未反応の粒子支持体を分離する方法として
は種々の方法が考えられる。

【００６０】第一の例としてフィルターを用いる方法で
は、未反応の粒子支持体はフィルターを自由に通過する
が、ハイブリダイゼーション生成物はフィルター上にト
ラップされるよう、フィルターの孔径および粒子支持体
の粒子径を設定する。その後にフィルター上にトラップ
されたハイブリダイゼーション生成物に結合している粒
子支持体を検出することによって、核酸試料中に存在す
る核酸分析物の興味あるオリゴヌクレオチド配列を検出
することができる。

【００６１】第二の例として磁石を用いる方法では、粒
子支持体の一方に磁性体粒子を使用し、未反応の一方の
粒子支持体は溶液中に遊離するが、ハイブリダイゼーシ
ョン生成物は磁石にトラップされるようにする。トラッ
プされたハイブリダイゼーション生成物に結合している
粒子支持体を検出することによって、核酸試料中に存在
する核酸分析物の興味あるオリゴヌクレオチド配列を検
出することができる。

【００６２】第三の例として遠心分離を使用する方法で
は、未反応の一方の粒子支持体は溶液中に遊離するが、
ハイブリダイゼーション生成物は遠心によって集められ
るように、粒子支持体および溶液の比重を設定する。集
められたハイブリダイゼーション生成物に結合している
粒子支持体を検出することによって、核酸試料中に存在
する核酸分析物の興味あるオリゴヌクレオチド配列を検
出することができる。

【００６３】また、ハイブリダイゼーション生成物と未
反応の粒子支持体が混在する状態の試料で、粒子支持体
を検出する方法としては種々の方法が考えられる。特
に、フローセル中に反応液を流し、そこに光を照射して
その応答を検出することにより、粒子塊ごとに結合状態
を識別する検出方法が有効である。具体的には、フロー
サイトメータを利用するのがよい。

【００６４】第一の例として、ポリヌクレオチド試薬を
結合させた複数種の粒子支持体がいずれも螢光標識粒子
（螢光性色素を含有させた粒子）である場合は、検出さ
れる螢光強度が結合により増強されることを利用して識
別する。結合、非結合に相当するそれぞれの相対螢光強
度において、粒子数あるいは粒子数の比を検出すること
により試料中の目的成分を検出することができる。

【００６５】第二の例として、一方が螢光性色素を含有
させた粒子、他方が螢光性色素を含有させない粒子であ
る場合には、粒子塊ごとに螢光強度と散乱強度を同時に
計測して、粒子／粒子結合時の条件に合致する信号を検
出することによって、試料中の目的成分を検出すること
ができる。

【００６６】第三の例として、いずれの粒子にも螢光性
色素を含有させない場合は、粒子塊ごとの散乱強度から
結合状態を識別する。結合、非結合に相当するそれぞれ
の相対散乱強度において、粒子数あるいは粒子数の比を
検出し、試料中の目的成分を検出することができる。

【００６７】なお、散乱計測に用いる粒子が極微小なと
きは、浮遊塵埃等の外来粒子による信号が与えられる可
能性があるので、浮遊塵埃等にも注意が肝要である。

【００６８】

【実施例】本発明を実施例に基づき説明する。

【００６９】〔実施例１〕本発明の方法によって、ハイ
ブリダイゼーション条件下においてポリヌクレオチド試
薬成分を結合させた粒子支持体と核酸試料とを反応させ
た。該試料と複数の種類の粒子支持体に結合させたポリ
ヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーション生成物
と、未反応の粒子支持体とを分離する工程を経た後、粒
子支持体を検出した。すなわち、市販のフローサイトメ
ータ装置を用いて、フローセル中に反応液を流し、これ
に光を照射してその応答を検出した。粒子支持体として
は、螢光性色素を含有したものを用いた。結果を図１に
示す。

【００７０】図１に示しすように、ハイブリダイゼーシ
ョンを反映するピークが得られた。

【００７１】〔実施例２〕次に、核酸試料と該ポリヌク
レオチド試薬とのハイブリダイゼーション生成物と、未
反応の粒子支持体が混在する状態の試料を用いて粒子支
持体を検出した。ポリヌクレオチド試薬を結合させた複
数種の粒子支持体として、いずれも螢光性色素を含有さ
せた粒子を使用した。これを市販のフローサイトメータ
装置を用いて、フローセル中に反応液を流し、これに光
を照射してその応答を検出した。すなわち、ハイブリダ
イゼーションの結果として粒子が結合しているかどうか
を、結合により増強される螢光強度を検出して、粒子塊
ごとの結合状態を識別した。結果を図２に示す。

【００７２】図２に示しすように、ハイブリダイゼーシ
ョンの結果として粒子が結合した状態を反映するピーク
と、非結合の状態を反映するピークの２種類のピークが
得られた。

【００７３】〔実施例３〕１ｍｇ／ｍｌの二本鎖ＤＮＡ
を含む試料を０.１４ＭＮａＣｌに溶解させた液を１０
分間沸騰させた後、氷冷して一本鎖ＤＮＡとした。得ら
れた一本鎖ＤＮＡ溶液をハイブリダイゼーション緩衝液
で希釈して検量線作成のための試料とした。ハイブリダ
イゼーション緩衝液としては、５×ＳＳＣ、０.５％Ｂ
ＳＡ，０.５％ＰＶＡ，１％ＳＤＳを用いた。

【００７４】リン酸緩衝液（ＰＢＳ：０.１４ＭＮａＣ
ｌ，０.０１％リン酸緩衝液：ｐＨ７.２）に溶解した２
００μｇ／ｍｌの第一の一本鎖ＤＮＡプローブを、螢光
色素を含有する０.１％ポリスチレンラテックス粒子溶
液（粒径０.２μｍ）に加えて、３７℃で２時間保温し
た。これを試薬Ａとする。

【００７５】同様にして、第二の一本鎖ＤＮＡプローブ
を、螢光色素を含有しない０.１％ポリスチレンラテッ
クス粒子溶液（粒径０.７μｍ）に加えて、３７℃で２
時間保温した。これを試薬Ｂとする。

【００７６】次に、ＰＢＳを用いて一本鎖ＤＮＡプロー
ブを吸着させた二種類のラテックス試薬Ａおよび試薬Ｂ
を遠心洗浄した。

【００７７】検量線作成のための試料と、ラテックス試
薬Ａおよび試薬Ｂを混合して、６５℃に４時間保温し、
ハイブリダイゼーションを行なった。反応液を孔径０.
４５μｍのフィルターでろ過し、試料とハイブリダイズ
しなかった遊離の状態のラテックス試薬Ａを除いた。

【００７８】最後に、フィルター上にトラップしたハイ
ブリダイゼーション生成物について、二本鎖部位を認識
して切断する作用を有する酵素を作用させて、試料とハ
イブリダイズした状態のラテックス粒子Ａを液中に遊離
させた。

【００７９】遊離させた螢光色素を含有するラテックス
粒子Ａを、市販のフローサイトメータ装置を用いて計数
した。結果を表１に示す。

【００８０】

【表１】

【００８１】

【発明の効果】本発明によれば、分析試料中に含まれる
核酸の興味あるオリゴヌクレオチド配列の量を簡便、か
つ、高感度に測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１におけるハイブリダイゼーションを反
映する粒子計測のパターンを示すグラフである。

【図２】実施例２におけるハイブリダイゼーションを反
映する粒子計測のパターンを示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸試料中に存在する核酸分析物の興味
あるオリゴヌクレオチド配列の量を検出する核酸の測定
方法であって、前記核酸試料と粒子支持体に結合された
１種以上のポリヌクレオチド試薬とをハイブリダイゼー
ション条件下で混合し、前記核酸分析物と前記ポリヌク
レオチド試薬とのハイブリダイゼーションによって形成
した二本鎖を選択可能な切断部位で切断する工程と、切
断により遊離する粒子支持体を検出する工程を含むこと
を特徴とする核酸の測定方法。
【請求項２】核酸試料中に存在する核酸分析物の興味
あるオリゴヌクレオチド配列の量を検出する核酸の測定
方法であって、前記核酸試料をハイブリダイゼーション
条件下で１種以上のポリヌクレオチド試薬と混合する工
程を含み、試料成分は支持体に結合し、試薬成分は粒子
支持体に結合し、前記核酸分析物と該ポリヌクレオチド
試薬とのハイブリダイゼーションによって形成した二本
鎖を選択可能な切断部位で切断する工程と、切断により
遊離する粒子支持体を検出する工程を含むことを特徴と
する核酸の測定方法。
【請求項３】核酸試料中に存在する核酸分析物の興味
あるオリゴヌクレオチド配列の量を検出する核酸の測定
方法であって、前記核酸試料をハイブリダイゼーション
条件下で１種以上のポリヌクレオチド試薬と混合する工
程を含み、該試薬の成分は支持体及び粒子支持体に結合
し、前記核酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイ
ブリダイゼーションによって形成した二本鎖を選択可能
な切断部位で切断する工程、該切断により遊離する粒子
支持体を検出する工程を含むことを特徴とする核酸の測
定方法。
【請求項４】核酸試料中に存在する核酸分析物の興味
あるオリゴヌクレオチド配列の量を検出する核酸の測定
方法であって、前記核酸試料をハイブリダイゼーション
条件下で１種以上のポリヌクレオチド試薬と混合する工
程を含み、該試薬の成分は粒子支持体に結合し、前記核
酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼ
ーションによって形成した二本鎖を解離する工程、該解
離により遊離する粒子支持体を検出する工程を含むこと
を特徴とする核酸の測定方法。
【請求項５】核酸試料中に存在する核酸分析物の興味
あるオリゴヌクレオチド配列の量を検出する核酸の測定
方法であって、前記核酸試料をハイブリダイゼーション
条件下で１種以上のポリヌクレオチド試薬と混合する工
程を含み、該試料成分は支持体に結合し、該試薬の成分
は粒子支持体に結合し、前記核酸分析物と該ポリヌクレ
オチド試薬とのハイブリダイゼーションによって形成し
た二本鎖を解離する工程、該解離により遊離する粒子支
持体を検出する工程を含むことを特徴とする核酸の測定
方法。
【請求項６】核酸試料中に存在する核酸分析物の興味
あるオリゴヌクレオチド配列の量を検出する核酸の測定
方法であって、前記核酸試料をハイブリダイゼーション
条件下で１種以上のポリヌクレオチド試薬と混合する工
程を含み、該試薬の成分は支持体及び粒子支持体に結合
し、前記核酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイ
ブリダイゼーションによって形成した二本鎖を解離する
工程、該解離により遊離する粒子支持体を検出する工程
を含むことを特徴とする核酸の測定方法。
【請求項７】核酸試料中に存在する核酸分析物の興味
あるオリゴヌクレオチド配列の量を検出する核酸の測定
方法であって、前記核酸試料をハイブリダイゼーション
条件下で１種以上のポリヌクレオチド試薬と混合する工
程を含み、該試薬の成分は粒子支持体に結合し、前記核
酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼ
ーションを形成させる工程、ハイブリダイゼーション生
成物の一本鎖部位を切断する工程、該切断により遊離す
る粒子支持体を検出する工程を含むことを特徴とする核
酸の測定方法。
【請求項８】核酸試料中に存在する核酸分析物の興味
あるオリゴヌクレオチド配列の量を検出する核酸の測定
方法であって、前記核酸試料をハイブリダイゼーション
条件下で１種以上のポリヌクレオチド試薬と混合する工
程を含み、該試料成分は支持体に結合し、該試薬の成分
は粒子支持体に結合し、前記核酸分析物と該ポリヌクレ
オチド試薬とのハイブリダイゼーションを形成させる工
程、ハイブリダイゼーション生成物の一本鎖部位を切断
する工程、該切断により遊離する粒子支持体を検出する
工程を含むことを特徴とする核酸の測定方法。
【請求項９】核酸試料中に存在する核酸分析物の興味
あるオリゴヌクレオチド配列の量を検出する核酸の測定
方法であって、前記核酸試料をハイブリダイゼーション
条件下で１種以上のポリヌクレオチド試薬と混合する工
程を含み、該試薬の成分は支持体及び粒子支持体に結合
し、前記核酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイ
ブリダイゼーションを形成させる工程、ハイブリダイゼ
ーション生成物の一本鎖部位を切断する工程、該切断に
より遊離する粒子支持体を検出する工程を含むことを特
徴とする核酸の測定方法。
【請求項１０】１種以上のポリヌクレオチド試薬成分
を粒子径の異なる粒子支持体に結合させ、核酸試料中に
存在する核酸分析物と該試薬とのハイブリダイゼーショ
ン生成物と、未反応の粒子支持体とをフィルターで分離
させる請求項１〜９のいずれかに記載の核酸の測定方
法。
【請求項１１】１種以上のポリヌクレオチド試薬成分
を結合させる粒子支持体の一種が磁性体粒子から成り、
核酸試料中に存在する核酸分析物と該試薬とのハイブリ
ダイゼーション生成物と、未反応の粒子支持体とを磁石
で分離させる請求項１〜９のいずれかに記載の核酸の測
定方法。
【請求項１２】１種以上のポリヌクレオチド試薬成分
を比重の異なる粒子支持体に結合させ、核酸試料中に存
在する核酸分析物と該試薬とのハイブリダイゼーション
生成物と、未反応の粒子支持体とを遠心分離させる請求
項１〜９のいずれかに記載の核酸の測定方法。
【請求項１３】核酸試料中に存在する核酸分析物の興
味あるオリゴヌクレオチド配列の量を検出する核酸の測
定方法であって、前記核酸試料をハイブリダイゼーショ
ン条件下で複数種のポリヌクレオチド試薬と混合する工
程を含み、該複数種の試薬成分は複数種の粒子支持体に
結合し、該複数種の粒子支持体は蛍光標識粒子であり、
前記核酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリ
ダイゼーション生成物と未反応の粒子支持体が混在する
状態の試料を用いて、粒子支持体の蛍光強度を測定する
工程を含むことを特徴とする核酸の測定方法。
【請求項１４】核酸試料中に存在する核酸分析物の興
味あるオリゴヌクレオチド配列の量を検出する核酸の測
定方法であって、前記核酸試料をハイブリダイゼーショ
ン条件下で１種以上のポリヌクレオチド試薬と混合する
工程を含み、該試薬成分は粒子支持体に結合し、前記核
酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼ
ーション生成物と、未反応の粒子支持体が混在する状態
の試料を用いて、粒子支持体の散乱強度を測定する工程
を含むことを特徴とする核酸の測定方法。
【請求項１５】核酸試料中に存在する核酸分析物の興
味あるオリゴヌクレオチド配列の量を検出する核酸の測
定方法であって、前記核酸試料をハイブリダイゼーショ
ン条件下で１種以上のポリヌクレオチド試薬と混合する
工程を含み、該試薬成分は粒子支持体に結合し、該粒子
支持体が蛍光標識粒子と蛍光標識していない粒子とから
なり、前記核酸分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハ
イブリダイゼーション生成物と、未反応の粒子支持体が
混在した状態の試料を用いて、粒子支持体の蛍光強度お
よび散乱強度を測定する工程を含むことを特徴とする核
酸の測定方法。