JPH0560761A - 重合体の分析方法 - Google Patents
重合体の分析方法Info
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- JPH0560761A JPH0560761A JP3300002A JP30000291A JPH0560761A JP H0560761 A JPH0560761 A JP H0560761A JP 3300002 A JP3300002 A JP 3300002A JP 30000291 A JP30000291 A JP 30000291A JP H0560761 A JPH0560761 A JP H0560761A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
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- C12Q1/6813—Hybridisation assays
Abstract
(57)【要約】
【目的】 非結合の標識された低分子と標識された分析
対象物質を簡易な方法で短時間に分離し、それを分析す
ること。 【構成】 重合体を結合させた不溶性担体により、試料
中の低分子物質を吸着させ分析対象物質である非吸着の
重合体を分離しその重合体を分析する。
対象物質を簡易な方法で短時間に分離し、それを分析す
ること。 【構成】 重合体を結合させた不溶性担体により、試料
中の低分子物質を吸着させ分析対象物質である非吸着の
重合体を分離しその重合体を分析する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は分子遺伝学、生化学及び
免疫化学の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、
重合体を結合させた不溶性担体による分析対象の重合体
の分離及びその分析方法に関する。
免疫化学の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、
重合体を結合させた不溶性担体による分析対象の重合体
の分離及びその分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般に核酸類の塩基配列の相同性を調べ
るためにハイブリダイゼーションが行われる。ハイブリ
ダイゼーションは相補的塩基対形成に基づいているた
め、適切な条件下ではＤＮＡの点突然変異、挿入又は欠
失などの存在をみつけることが可能である。このこと
は、遺伝子病を診断するのに非常に重要である。核酸ハ
イブリッド形成を検出する方法として電子顕微鏡による
観察、固体支持体を使用した方法、電気泳動法及び濾過
法などがある。
るためにハイブリダイゼーションが行われる。ハイブリ
ダイゼーションは相補的塩基対形成に基づいているた
め、適切な条件下ではＤＮＡの点突然変異、挿入又は欠
失などの存在をみつけることが可能である。このこと
は、遺伝子病を診断するのに非常に重要である。核酸ハ
イブリッド形成を検出する方法として電子顕微鏡による
観察、固体支持体を使用した方法、電気泳動法及び濾過
法などがある。
【０００３】又、抗原抗体反応を定量的に測定するのに
は、数多くの方法が開発されている。例えば、免疫拡散
法、レーザーネフェロメトリー法、特に高感度の標識免
疫測定法などがある。
は、数多くの方法が開発されている。例えば、免疫拡散
法、レーザーネフェロメトリー法、特に高感度の標識免
疫測定法などがある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ＤＮＡ上に相同な配
列、異なる配列などを位置づけるために、ヘテロ２本鎖
ＤＮＡ形成法を用いた電子顕微鏡による観察は、試料の
調節など特殊な技術を必要とするため一般的ではなく、
また点突然変異の検出は極めて難しい。
列、異なる配列などを位置づけるために、ヘテロ２本鎖
ＤＮＡ形成法を用いた電子顕微鏡による観察は、試料の
調節など特殊な技術を必要とするため一般的ではなく、
また点突然変異の検出は極めて難しい。
【０００５】標的核酸をニトロセルロース膜、ナイロン
膜などの固体支持体に固定し、適切な標識プローブとハ
イブリダイゼーションする方法は、固相と液相上での反
応であるため長時間反応させる必要があることと非特異
的結合を除去するために注意深く未反応のプローブを洗
浄する必要性があり、多大の労力と時間がかかるなどの
問題点が有る。
膜などの固体支持体に固定し、適切な標識プローブとハ
イブリダイゼーションする方法は、固相と液相上での反
応であるため長時間反応させる必要があることと非特異
的結合を除去するために注意深く未反応のプローブを洗
浄する必要性があり、多大の労力と時間がかかるなどの
問題点が有る。
【０００６】核酸ハイブリッド形成物と未反応の標識プ
ローブとの分離は、分子ふるい効果のある電気泳動法、
ゲル濾過法などで容易に行えるが、時間がかかるため多
数検体のスクリーニングは難しく自動分析化が困難であ
る。
ローブとの分離は、分子ふるい効果のある電気泳動法、
ゲル濾過法などで容易に行えるが、時間がかかるため多
数検体のスクリーニングは難しく自動分析化が困難であ
る。
【０００７】抗原抗体反応においては、免疫拡散法、レ
ーザーネフェロメトリー法は、複合体の沈殿物を測定す
るため感度や便利さに限界がある。
ーザーネフェロメトリー法は、複合体の沈殿物を測定す
るため感度や便利さに限界がある。
【０００８】又、高感度な標識免疫測定法は標識として
赤血球、放射性同位元素、酵素、蛍光物質又は金属など
が利用されているが、標識した抗原（又は抗体）と抗体
（又は抗原）との結合した複合体と非結合標識抗原（又
は抗体）とを分離しなければならない。その際、極めて
微量な物質を定量する場合に超高感度な酵素免疫測定法
が用いられるが、分離の時に非特異的な吸着が大きな問
題となる。
赤血球、放射性同位元素、酵素、蛍光物質又は金属など
が利用されているが、標識した抗原（又は抗体）と抗体
（又は抗原）との結合した複合体と非結合標識抗原（又
は抗体）とを分離しなければならない。その際、極めて
微量な物質を定量する場合に超高感度な酵素免疫測定法
が用いられるが、分離の時に非特異的な吸着が大きな問
題となる。
【０００９】本発明は、核酸、抗原抗体反応、酵素、ア
イソザイムの分別定量などの分析において、夾雑物の除
去、時間の短縮、分析操作の簡便化、非特異的な吸着を
無くすこと、定量性、高感度、低価格を実現し、マス・
スクリーニング及び自動分析を可能にすることなどを目
的としている。
イソザイムの分別定量などの分析において、夾雑物の除
去、時間の短縮、分析操作の簡便化、非特異的な吸着を
無くすこと、定量性、高感度、低価格を実現し、マス・
スクリーニング及び自動分析を可能にすることなどを目
的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成するために鋭意研究の結果、予め不溶性担体に重合
体を飽和状態になるように結合させておくことにより、
試料中の低分子はその影響を受けずに吸着するが分析対
象物質の重合体は吸着しなくなることを見出し、本発明
を完成するに至った。
達成するために鋭意研究の結果、予め不溶性担体に重合
体を飽和状態になるように結合させておくことにより、
試料中の低分子はその影響を受けずに吸着するが分析対
象物質の重合体は吸着しなくなることを見出し、本発明
を完成するに至った。
【００１１】即ち本発明は、予め重合体を結合させた不
溶性担体により、試料中の低分子物質を吸着させ分析対
象物質である非吸着の重合体を分離することを特徴とす
る重合体の分析方法に関するものである。
溶性担体により、試料中の低分子物質を吸着させ分析対
象物質である非吸着の重合体を分離することを特徴とす
る重合体の分析方法に関するものである。
【００１２】以下に、本発明を詳述する。不溶性担体に
結合させる重合体は、オリゴマー又は高重合体でも良
く、具体的には天然ポリマーとしてセルロース、デンプ
ン、蛋白質、核酸、又はこれらの化学修飾した天然ポリ
マー等がある。更に、化学合成物として合成繊維、合成
樹脂などがある。核酸はコスト面から大量に存在するも
のが望ましく、鮭や鰊などのような精子由来のもの、培
養可能な細菌類由来、ファージ又はウイルス等精製過程
での機械的切断がわりと少ないものがよい。
結合させる重合体は、オリゴマー又は高重合体でも良
く、具体的には天然ポリマーとしてセルロース、デンプ
ン、蛋白質、核酸、又はこれらの化学修飾した天然ポリ
マー等がある。更に、化学合成物として合成繊維、合成
樹脂などがある。核酸はコスト面から大量に存在するも
のが望ましく、鮭や鰊などのような精子由来のもの、培
養可能な細菌類由来、ファージ又はウイルス等精製過程
での機械的切断がわりと少ないものがよい。
【００１３】該重合体の重合度は、試料中の吸着させよ
うとする低分子物質の分子量又は偏比容により異なり特
に立体構造の影響を受けるためその限界は明確ではない
が、該重合体の分子全体の大きさが該低分子の分子全体
の大きさよりも大きいことが最低必要条件となる。即
ち、該重合体の重合度は２個以上、望ましくは５０００
個以上であるが、試料中の低分子物質の種類によりすべ
て違う。
うとする低分子物質の分子量又は偏比容により異なり特
に立体構造の影響を受けるためその限界は明確ではない
が、該重合体の分子全体の大きさが該低分子の分子全体
の大きさよりも大きいことが最低必要条件となる。即
ち、該重合体の重合度は２個以上、望ましくは５０００
個以上であるが、試料中の低分子物質の種類によりすべ
て違う。
【００１４】重合体を不溶性担体に結合させる結合方法
には、共有結合又は水素結合、疎水性相互作用、イオン
結合、ファン・デル・ワールス相互作用などの非共有結
合による物理的吸着があるが、いずれの結合方法でもよ
い。
には、共有結合又は水素結合、疎水性相互作用、イオン
結合、ファン・デル・ワールス相互作用などの非共有結
合による物理的吸着があるが、いずれの結合方法でもよ
い。
【００１５】不溶性担体としては、ポリスチレン、ポリ
エチレン、ニトロセルロース、ナイロンなどの合成樹
脂、リポソーム類、リン脂質粒子などの天然物、又はガ
ラス、シリカゲル、磁性体、セラミクス、セライト、活
性アルミナ、活性炭素などの無機材質の吸着剤がある
が、これらに限定されるものではない。又、不溶性担体
は少なくともこれらの吸着剤を含むことが好ましい。
エチレン、ニトロセルロース、ナイロンなどの合成樹
脂、リポソーム類、リン脂質粒子などの天然物、又はガ
ラス、シリカゲル、磁性体、セラミクス、セライト、活
性アルミナ、活性炭素などの無機材質の吸着剤がある
が、これらに限定されるものではない。又、不溶性担体
は少なくともこれらの吸着剤を含むことが好ましい。
【００１６】試料中の低分子物質は、不溶性担体に結合
させる重合体又は分析対象物質よりも分子量が小さく、
又は有機物質であることが望ましい。特に、該低分子物
質は一般的には標識物質を含むものであるが、ただ単に
夾雑物質だけでも何等問題は無い。低分子物質としては
オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、蛋白質、又は
標識化するための標識物質としては放射性同位元素、蛍
光性物質、発光物質、色素、酵素、酵素阻害剤、ハプテ
ン、酵素サイクリング反応が可能な基質又は補酵素など
が挙げられる。より具体的には、オリゴヌクレオチドと
して数十塩基ぐらいの特定配列のプローブ等、蛋白質と
しては標識抗体、標識抗原、標識受容体等、酵素類など
がある。次に標識物質となる蛍光性物質としては、エチ
ジウムブロマイド、フルオレセイン、ローダミン、ウン
ベリフェロン等があり、標識酵素としては、トリオ−ス
ホスフェートイソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカ
リ性フォスファターゼ、酸性フォスファターゼ、グルコ
ースオキシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ等がある。
させる重合体又は分析対象物質よりも分子量が小さく、
又は有機物質であることが望ましい。特に、該低分子物
質は一般的には標識物質を含むものであるが、ただ単に
夾雑物質だけでも何等問題は無い。低分子物質としては
オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、蛋白質、又は
標識化するための標識物質としては放射性同位元素、蛍
光性物質、発光物質、色素、酵素、酵素阻害剤、ハプテ
ン、酵素サイクリング反応が可能な基質又は補酵素など
が挙げられる。より具体的には、オリゴヌクレオチドと
して数十塩基ぐらいの特定配列のプローブ等、蛋白質と
しては標識抗体、標識抗原、標識受容体等、酵素類など
がある。次に標識物質となる蛍光性物質としては、エチ
ジウムブロマイド、フルオレセイン、ローダミン、ウン
ベリフェロン等があり、標識酵素としては、トリオ−ス
ホスフェートイソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカ
リ性フォスファターゼ、酸性フォスファターゼ、グルコ
ースオキシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ等がある。
【００１７】試料中の分析対象物質である非吸着の重合
体は、不溶性担体に結合させる重合体と同じ種類でも異
なる種類でもどちらでも良く、非吸着の重合体の方の分
子量はより大きいことが好ましい。具体的には、該重合
体としてはセルロース、デンプン、蛋白質、核酸、可溶
性の合成繊維又は合成樹脂などがあるが、ここでは主に
核酸に関して重点的に詳述する。
体は、不溶性担体に結合させる重合体と同じ種類でも異
なる種類でもどちらでも良く、非吸着の重合体の方の分
子量はより大きいことが好ましい。具体的には、該重合
体としてはセルロース、デンプン、蛋白質、核酸、可溶
性の合成繊維又は合成樹脂などがあるが、ここでは主に
核酸に関して重点的に詳述する。
【００１８】試料中の核酸は天然、合成或いは修飾され
たＤＮＡ又はＲＮＡであり、一本鎖又は２本鎖いずれで
も良い。該核酸の塩基数は１万以上が好ましい。一般に
該核酸は適当な検出システムにより分析されるが、多く
の場合、標識プローブが用いられる。それ故、核酸の標
的ヌクレオチド配列と標識プローブは適切な温度下でハ
イブリダイゼーションが行われる。検出に用いられるプ
ローブはビオチンで標識されたものが望ましい。ビオチ
ン標識プローブとハイブリッドを形成した核酸は、酵素
標識したアビジンと更に複合体を作るが、それらは重合
体を結合した不溶性担体には吸着しないため分析可能と
なる。
たＤＮＡ又はＲＮＡであり、一本鎖又は２本鎖いずれで
も良い。該核酸の塩基数は１万以上が好ましい。一般に
該核酸は適当な検出システムにより分析されるが、多く
の場合、標識プローブが用いられる。それ故、核酸の標
的ヌクレオチド配列と標識プローブは適切な温度下でハ
イブリダイゼーションが行われる。検出に用いられるプ
ローブはビオチンで標識されたものが望ましい。ビオチ
ン標識プローブとハイブリッドを形成した核酸は、酵素
標識したアビジンと更に複合体を作るが、それらは重合
体を結合した不溶性担体には吸着しないため分析可能と
なる。
【００１９】核酸は、該核酸に直接的に又は間接的に抗
原またはリガンド等を結合させ、抗体又は受容体を定量
することも可能である。この場合には、検出系として２
番目の標識抗体を用い、サンドイッチ法的に分析する必
要がある。又同様な系を利用して、抗原を結合した核酸
と標識抗体を競合させることにより非標識抗原量を分析
することもできる。リガンドの場合も前記と同様であ
る。定量できる抗原又はリガンドとしては甲状腺刺激ホ
ルモン、サイロキシン、成長ホルモン、インスリン、胎
盤性ゴナドトロピン、ステロイドホルモン、薬物類など
の代表例がある。
原またはリガンド等を結合させ、抗体又は受容体を定量
することも可能である。この場合には、検出系として２
番目の標識抗体を用い、サンドイッチ法的に分析する必
要がある。又同様な系を利用して、抗原を結合した核酸
と標識抗体を競合させることにより非標識抗原量を分析
することもできる。リガンドの場合も前記と同様であ
る。定量できる抗原又はリガンドとしては甲状腺刺激ホ
ルモン、サイロキシン、成長ホルモン、インスリン、胎
盤性ゴナドトロピン、ステロイドホルモン、薬物類など
の代表例がある。
【００２０】核酸を基質又は鋳型にする酵素には、ＤＮ
Ａポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ターミナルトラ
ンスフェラーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ヌクレア
ーゼＳ１、リガーゼ又は制限酵素などがある。これらの
酵素およびＤＮＡ結合タンパク質は核酸と結合できるた
め、前記と同様に分析することができる。例えば、ター
ミナルトランスフェラーゼ活性測定の場合には、天然の
ＤＮＡを基質として、３′側にビオチンを結合させたデ
オキシヌクレオチド３リン酸を酵素作用により結合さ
せ、その時の結合したビオチンを定量すれば良い。
Ａポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ターミナルトラ
ンスフェラーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ヌクレア
ーゼＳ１、リガーゼ又は制限酵素などがある。これらの
酵素およびＤＮＡ結合タンパク質は核酸と結合できるた
め、前記と同様に分析することができる。例えば、ター
ミナルトランスフェラーゼ活性測定の場合には、天然の
ＤＮＡを基質として、３′側にビオチンを結合させたデ
オキシヌクレオチド３リン酸を酵素作用により結合さ
せ、その時の結合したビオチンを定量すれば良い。
【００２１】分析対象物質の非吸着の重合体に結合した
標識物質と不溶性担体との分離手段は遠心分離、カラム
又はフィルター等がある。
標識物質と不溶性担体との分離手段は遠心分離、カラム
又はフィルター等がある。
【００２２】
【作用】低分子物質と分析対象物質の標識された重合体
を含む混合物が試料となる場合において、この試料を重
合体を結合させた不溶性担体に加えると低分子物質がこ
の担体に吸着され標識された重合体だけが分離される。
その後、これを適切な検出システムを用いて分析する。
を含む混合物が試料となる場合において、この試料を重
合体を結合させた不溶性担体に加えると低分子物質がこ
の担体に吸着され標識された重合体だけが分離される。
その後、これを適切な検出システムを用いて分析する。
【００２３】
【実施例１】 （ＤＮＡ結合担体の調製）クロマトグラフィ用活性炭素
（和光純薬）１００ｇに１ｍｇ／ｍｌの鮭のＤＮＡを２
００ｍｌ加えた。室温で１昼夜おいた後、０．５Ｍ硫酸
アンモニウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．２溶液で
洗浄した。この様に処理された活性炭をベッド体積が２
ｃｃになるようにカラムに詰めた。
（和光純薬）１００ｇに１ｍｇ／ｍｌの鮭のＤＮＡを２
００ｍｌ加えた。室温で１昼夜おいた後、０．５Ｍ硫酸
アンモニウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．２溶液で
洗浄した。この様に処理された活性炭をベッド体積が２
ｃｃになるようにカラムに詰めた。
【００２４】（点突然変異を検出するためのプローブ）
下記の７種類のプローブは宝酒造から購入したもので、
ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の１２番目のアミノ酸コドンに
点突然変異をもつ。 ５′−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３′ （Ｇｌｙ） ５′−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３′ （Ａｒｇ） ５′−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３′ （Ｃｙｓ） ５′−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＡＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３′ （Ｓｅｒ） ５′−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３′ （Ａｌａ） ５′−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３′ （Ａｓｐ） ５′−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３′ （Ｖａｌ）
下記の７種類のプローブは宝酒造から購入したもので、
ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の１２番目のアミノ酸コドンに
点突然変異をもつ。 ５′−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３′ （Ｇｌｙ） ５′−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３′ （Ａｒｇ） ５′−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３′ （Ｃｙｓ） ５′−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＡＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３′ （Ｓｅｒ） ５′−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３′ （Ａｌａ） ５′−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３′ （Ａｓｐ） ５′−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３′ （Ｖａｌ）
【００２５】（末端ビオチン化プローブの調製）前記の
プローブは終濃度０．２Ｍカコジル酸カリウムｐＨ６．
６、１０μＭプローブ、２．５ｍＭ塩化コバルト、５０
０Ｕ／ｍｌターミナルトランスフェラーゼ、３０μＭビ
オチン−１６−ｄＵＴＰ、３７度１０時間反応の条件下
で末端をビオチン化された。
プローブは終濃度０．２Ｍカコジル酸カリウムｐＨ６．
６、１０μＭプローブ、２．５ｍＭ塩化コバルト、５０
０Ｕ／ｍｌターミナルトランスフェラーゼ、３０μＭビ
オチン−１６−ｄＵＴＰ、３７度１０時間反応の条件下
で末端をビオチン化された。
【００２６】（ハイブリダイゼーションおよび検出）
０．５ｍｇ／ｍｌ鮭ＤＮＡ、８０ｍＭ塩化ナトリウム、
２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１０ｎＭ末端ビ
オチン化プローブ混合液をエッペンドルフチューブに入
れ、沸騰水で５分間加熱し室温に放置した。室温５分後
にペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（アマシャ
ム）を１０００倍希釈になるように添加した。３０分後
に試料１００μｌを活性炭素カラムに加え２ｃｃの０．
５Ｍ硫酸アンモニウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．
２溶液で溶出した。溶出時間は５分以内に終わる。この
溶出液に更に発色剤（２ｍＭ ＴＭＢＺ、１０ｍＭ過酸
化水素、クエン酸／リン酸塩緩衝液ｐＨ４．６）を２ｃ
ｃ加えて２０分後に比色計（６５０ｎｍにて）で測定
し、下記の表１の結果が得られた。
０．５ｍｇ／ｍｌ鮭ＤＮＡ、８０ｍＭ塩化ナトリウム、
２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１０ｎＭ末端ビ
オチン化プローブ混合液をエッペンドルフチューブに入
れ、沸騰水で５分間加熱し室温に放置した。室温５分後
にペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（アマシャ
ム）を１０００倍希釈になるように添加した。３０分後
に試料１００μｌを活性炭素カラムに加え２ｃｃの０．
５Ｍ硫酸アンモニウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．
２溶液で溶出した。溶出時間は５分以内に終わる。この
溶出液に更に発色剤（２ｍＭ ＴＭＢＺ、１０ｍＭ過酸
化水素、クエン酸／リン酸塩緩衝液ｐＨ４．６）を２ｃ
ｃ加えて２０分後に比色計（６５０ｎｍにて）で測定
し、下記の表１の結果が得られた。
【００２７】
【表１】
【００２８】上記の結果からわかるように、本方法はゲ
ノムＤＮＡの点突然変異に関して、非常に特異的で感度
の高いアッセイ系である。又、操作が非常に簡単であ
り、自動分析が可能である。
ノムＤＮＡの点突然変異に関して、非常に特異的で感度
の高いアッセイ系である。又、操作が非常に簡単であ
り、自動分析が可能である。
【００２９】
【実施例２】０．５ｍｇ／ｍｌ鰊ＤＮＡ、８０ｍＭ塩化
ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１
０ｎＭ末端ビオチン化オリゴデオキシシチジル酸（２４
〜３６個重合）混合液をエッペンドルフチューブに入
れ、沸騰水で１５分間加熱し室温に放置した。室温２０
分後にペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（アマ
シャム）を１０００倍、２０００倍、４０００倍、８０
００倍希釈になるように添加した。２０分後に試料１０
０μｌを活性炭素カラムに加え２ｃｃの０．５Ｍ硫酸ア
ンモニウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．２溶液で溶
出した。この溶出液に更に発色剤（２ｍＭ ＴＭＢＺ、
１０ｍＭ過酸化水素、クエン酸／リン酸塩緩衝液ｐＨ
４．６）を２ｃｃ加えて１５分後に比色計（６５０ｎｍ
にて）で測定し、下記の表２の結果が得られた。
ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１
０ｎＭ末端ビオチン化オリゴデオキシシチジル酸（２４
〜３６個重合）混合液をエッペンドルフチューブに入
れ、沸騰水で１５分間加熱し室温に放置した。室温２０
分後にペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（アマ
シャム）を１０００倍、２０００倍、４０００倍、８０
００倍希釈になるように添加した。２０分後に試料１０
０μｌを活性炭素カラムに加え２ｃｃの０．５Ｍ硫酸ア
ンモニウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．２溶液で溶
出した。この溶出液に更に発色剤（２ｍＭ ＴＭＢＺ、
１０ｍＭ過酸化水素、クエン酸／リン酸塩緩衝液ｐＨ
４．６）を２ｃｃ加えて１５分後に比色計（６５０ｎｍ
にて）で測定し、下記の表２の結果が得られた。
【００３０】
【表２】
【００３１】この結果は加えた酵素濃度に比例してお
り、本発明においては良好な定量性があることがわか
る。この実施例では、ビオチンをリガンド又はハプテン
の代わりに、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン
を受容体又は抗体の代表例として使用しただけである。
故に、本発明は抗原抗体反応、リガンドと受容体との結
合だけでなく核酸に結合するタンパク質や核酸解析に必
要な酵素および血液凝固に関与する酵素の分析など、広
範囲に亘って適用できることは言うまでもない。
り、本発明においては良好な定量性があることがわか
る。この実施例では、ビオチンをリガンド又はハプテン
の代わりに、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン
を受容体又は抗体の代表例として使用しただけである。
故に、本発明は抗原抗体反応、リガンドと受容体との結
合だけでなく核酸に結合するタンパク質や核酸解析に必
要な酵素および血液凝固に関与する酵素の分析など、広
範囲に亘って適用できることは言うまでもない。
【００３２】
【発明の効果】上記実施例から明らかなように、本発明
は試料を溶液中で調製できるだけでなく、その試料を重
合体で結合させた不溶性担体を詰めたカラムに入れて溶
出させるだけで短時間で分析できるなど極めて簡易な優
れた方法である。この事が多くの検体数の測定を可能に
し、従来難しかったマス・スクリーニングと自動分析へ
の適用を可能にした。
は試料を溶液中で調製できるだけでなく、その試料を重
合体で結合させた不溶性担体を詰めたカラムに入れて溶
出させるだけで短時間で分析できるなど極めて簡易な優
れた方法である。この事が多くの検体数の測定を可能に
し、従来難しかったマス・スクリーニングと自動分析へ
の適用を可能にした。
【００３３】本発明の最も特徴的なのは、非結合の標識
化された低分子物質、標識化された分析対象物と検出の
際に干渉する夾雑物質を含む試料において、重合体で結
合させた不溶性担体（特にＤＮＡ結合活性炭素）は低分
子物質と夾雑物質を特異的に吸着するため、バックグラ
ンドが少なくなるだけでなく、高感度測定が可能となる
ことである。特に、本発明における標識化された低分子
物質とは数十万前後の分子量を有する標識酵素なども含
むものである。
化された低分子物質、標識化された分析対象物と検出の
際に干渉する夾雑物質を含む試料において、重合体で結
合させた不溶性担体（特にＤＮＡ結合活性炭素）は低分
子物質と夾雑物質を特異的に吸着するため、バックグラ
ンドが少なくなるだけでなく、高感度測定が可能となる
ことである。特に、本発明における標識化された低分子
物質とは数十万前後の分子量を有する標識酵素なども含
むものである。
【００３４】又、本発明において用いられる不溶性担体
は無機材質の吸着剤を利用できるため、コストの面が非
常に安くなる。
は無機材質の吸着剤を利用できるため、コストの面が非
常に安くなる。
【００３５】以上の効果を有する本発明は、極めて画期
的な酵素活性測定法、酵素免疫測定法及び遺伝子分析法
である。
的な酵素活性測定法、酵素免疫測定法及び遺伝子分析法
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/543 Ｚ 7906−2Ｊ
Claims (20)
- 【請求項１】 重合体を結合させた不溶性担体により、
試料中の低分子物質を吸着させ分析対象物質である非吸
着の重合体を分離することを特徴とする重合体の分析方
法。 - 【請求項２】 不溶性担体に結合する重合体が、生体高
分子又は、化学合成物であることを特徴とする請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３】 生体高分子が核酸であることを特徴とす
る請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 核酸がＤＮＡであることを特徴とする請
求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 不溶性担体が吸着剤であることを特徴と
する請求項１から請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 吸着剤が活性アルミナ又は活性炭素を含
むことを特徴とする請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 試料中の低分子物質が分析対象物質より
低分子量であること又は偏比容が大きいことを特徴とす
る請求項１から請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 低分子物質として少なくともオリゴヌク
レオチド、ポリヌクレオチド又は蛋白質が含まれること
を特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 蛋白質が標識抗体であることを特徴とす
る請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 オリゴヌクレオチド或いはポリヌクレ
オチドがハイブリダイゼイションするための標識プロー
ブであることを特徴とする請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 分析対象物質である非吸着の重合体が
核酸であることを特徴とする請求項１から請求項１０に
記載の方法。 - 【請求項１２】 核酸が標的ヌクレオチド配列と標識プ
ローブとがハイブリッドを形成したものであることを特
徴とする請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 核酸が抗原またはリガンドを結合した
ものであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１４】 抗原抗体反応において、抗原を結合し
た核酸と標識抗体を競合させることにより非標識抗原量
を分析することを特徴とする請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 抗原がハプテンであることを特徴とす
る請求項１３又は請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 標識化するための標識物質は、直接的
または間接的に結合させた酵素、蛍光性物質、発光物
質、色素、補酵素、ハプテン、放射性同位元素又は酵素
サイクリング反応が可能な基質であることを特徴とする
請求項９、請求項１０、請求項１２又は請求項１４に記
載の方法。 - 【請求項１７】 酵素がトリオ−スホスフェートイソメ
ラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性フォスファター
ゼ、酸性フォスファターゼ、及びβ−ガラクトシダーゼ
から選ばれることを特徴とする請求項１６に記載の方
法。 - 【請求項１８】 核酸が酵素の基質又は鋳型となること
を特徴とする請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１９】 酵素がＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポ
リメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、ポリヌク
レオチドキナーゼ、ヌクレアーゼＳ１又はリガーゼから
選ばれることを特徴とする請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 核酸の塩基数が１万塩基以上であるこ
とを特徴とする請求項１１から請求項１９に記載の方
法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3300002A JPH0560761A (ja) | 1991-08-30 | 1991-08-30 | 重合体の分析方法 |
| AU21214/92A AU2121492A (en) | 1991-08-30 | 1992-08-21 | Analytical method of polymer |
| CA002077157A CA2077157A1 (en) | 1991-08-30 | 1992-08-28 | Analytical method of polymer |
| KR1019920015529A KR930004763A (ko) | 1991-08-30 | 1992-08-28 | 중합체 분석방법 |
| EP92114724A EP0535376A1 (en) | 1991-08-30 | 1992-08-28 | Analytical method of polymer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3300002A JPH0560761A (ja) | 1991-08-30 | 1991-08-30 | 重合体の分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0560761A true JPH0560761A (ja) | 1993-03-12 |
Family
ID=17879550
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3300002A Pending JPH0560761A (ja) | 1991-08-30 | 1991-08-30 | 重合体の分析方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0535376A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0560761A (ja) |
| KR (1) | KR930004763A (ja) |
| AU (1) | AU2121492A (ja) |
| CA (1) | CA2077157A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE378422T1 (de) * | 1996-08-26 | 2007-11-15 | Invitek Biotechnik & Biodesign | Verfahren zum nachweis klinisch relevanter veränderungen der dns-sequenz des ki-ras-onkogens,seine verwendung und testkit zur früherkennung von tumoren |
| EP1469067A4 (en) * | 2002-01-25 | 2007-05-23 | Olympus Corp | METHOD AND SYSTEM FOR DETECTING DATA RELATING TO A NUCLEIC ACID |
| US20060243658A1 (en) * | 2002-11-08 | 2006-11-02 | Zubov Vitali P | Sorbent material having a covalently attached perfluorinated surface with functional groups |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3442819A (en) * | 1965-03-26 | 1969-05-06 | Mount Sinai Hospital Research | Molecular sieve coated particulate adsorbent and processes using same |
| US3958944A (en) * | 1974-07-15 | 1976-05-25 | Wong Johnson N S | Vial assembly |
| US4348374A (en) * | 1977-09-16 | 1982-09-07 | Abbott Laboratories | Charcoal coated adsorbent device |
| IL70765A (en) * | 1983-01-27 | 1988-07-31 | Enzo Biochem Inc | Substrates containing non-radioactive chemically-labeled polynucleotides and methods using them |
| ZA877772B (en) * | 1986-10-23 | 1988-04-20 | Amoco Corporation | Target and background capture methods and apparatus for affinity assays |
| AU619170B2 (en) * | 1987-01-09 | 1992-01-23 | Abbott Laboratories | Diagnostic assays using nucleic acid probes |
| AU5126890A (en) * | 1989-04-03 | 1990-10-04 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Metal oxide supports for nucleic acids |
-
1991
- 1991-08-30 JP JP3300002A patent/JPH0560761A/ja active Pending
-
1992
- 1992-08-21 AU AU21214/92A patent/AU2121492A/en not_active Abandoned
- 1992-08-28 KR KR1019920015529A patent/KR930004763A/ko not_active Application Discontinuation
- 1992-08-28 EP EP92114724A patent/EP0535376A1/en not_active Withdrawn
- 1992-08-28 CA CA002077157A patent/CA2077157A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0535376A1 (en) | 1993-04-07 |
| CA2077157A1 (en) | 1993-03-01 |
| AU2121492A (en) | 1993-03-04 |
| KR930004763A (ko) | 1993-03-23 |
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