JPH03130098A - 核酸の検出法及びび検出試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は核酸の検出法及び試薬に関する。

［従来の技術］ 最近遺伝子工学の進歩に伴い、特定の塩基配列を持つ核
酸の検出を行な一５頻度が増加している。

従来の核酸の検出法は、核酸を制限酵素で切断し、寒天
或はポリアクリルアミドのゲルを用いた電気泳動で分画
し、これをニトロセルロース等の吸着膜に物理的又は電
気的に転写し、かかる転写物を一本鎖に変性して、放射
性同位元素で標識された一本鎖核酸と交雑させ、これを
オートラジオグラフィーにて検出する方法が知られてい
る。或は、核酸に対する抗体による免疫学的検出法等が
知られている。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら従来の検出法は試料核酸の膜への吸着、ゲ
ルの調製、電気泳動、膜への転写及びオートラジオグラ
フィー等の操作が煩雑且つ時間がかかり、自動化に不適
であり、安全性の点でも問題がある。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは上記問題点に鑑みて、交雑させた核酸を極
めて迅速、安全且つ特異的に検出でき、自動化が可能な
方法及び試薬を開発すべく鋭意検討した結果、本発明に
到達した。即ち本発明は一本鎖核酸と、試料中の相補的
な一本鎖核酸を交雑し、特定の核酸を検出する方法にお
いて、−末鎖核酸を支持体に固定化し、交雑して二本鎖
となった核酸を、標識物質で標識された結合性物質を用
いて検出することを特徴とする核酸の検出法及び支持体
に固定化した一本鎖核酸及び交雑して二本鎖となった核
酸と特異的に反応する、標識物質で５識された結合性物
質を含有してなる請求項１〜６項のいずれかに記載の検
出法に使用される核酸の検出試薬。

この明細書において使用する「核酸」なる語は一本鎖及
び二本鎖の両方を指すものとし、必要な場合はそのどち
らかを明記するものとする。またこの「核酸」なる語は
塩基数の大小は問わず、１以上の塩基数を有する核酸を
全て含むものとする。

更にここで使用した「核酸」の中には核酸の単位成分で
あるヌクレオチドが天然に存在するものの他人工的に修
飾されたものも含むものとする。

また「−末鎖核酸」なる語は文字通り一本鎖核酸そのも
のと鎖長の異なる一本鎖核酸同士が交雑してできた一本
鎖核酸部分を含むものとする。

本発明における一本鎖核酸としては測定しようとする特
定の核酸の塩基配列と相補の配列を持つ核酸が挙げられ
る。

デオキンリボ核酸（ＤＮＡ）の場合、天然の二本鎖核酸
を一本鎖に分離・精製してもよく、又化学的方法、即ち
アデニン、グアニン、ントシン及びチミンの４種のヌク
レオチドを順番に結合してぃく方法で合成してもよい。

好ましくは純度及び大量生産が容易であることから化学
的方法での調製である。

又リボ核酸（ＲＮＡ）の場合は一本鎖核酸をそのまま使
用できる。

一本鎖核酸の塩基数は、通常１〜１００００であり、精
度及び感度の点で長い方が好ましいが、一定の塩基数、
例えば約５００塩基以上では余り変化がない。

好ましくは相補鎖が認識でき、且つ精度及び感度を確保
できる５〜＋００塩基である。

又、−末鎖核酸は、予め支持体に固定させて使用される
。支持体としては、ケイ酸質無機担体［ガラス（ポーラ
ス、ツヤ２肖しガラス等）、シリカゲル、ベントナイト
等］、磁性体、及び有機担体にトロセルロース、ナイロ
ン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポ
リ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、シリコーン、ポ
リウレタン等の合成樹脂、デキストラン、濾紙等）が挙
げられる。好ましくは保持能力の点でガラス、ニトロセ
ルロース、ポリフッ化ビニリデン、ナイロンである。特
に調製のしやすさ及び価格の点でガラスである。ガラス
を支持体として用いる場合、ガラス表面の面積が大きい
方が一本鎖核酸の固定化率をより高める事が出来ること
から、ガラス表面をサンドブラスト等の処理で凹凸をつ
けることが好ましい。

固定化方法としては物理吸着による方法及び化学結合に
よる方法が挙げられる。物理吸着による方法としては、
具体的には吸着させようとする一本鎖核酸を含む溶液（
例えば、１０μｇ／ｍｌの核酸を含むリン酸緩衝液等）
を所定の支持体と接触させることが挙げられる。必要に
応じて、反応後吸着を、より強固なものにするために支
持体を加熱（例えば、８０’ＣＸ１２０分等）しても構
わない。又一方、化学結合による方法としては、具体的
にはアミノ基やカルボキシル基のような官能基が予め導
入された支持体及び−末鎖核酸とを二官能性架橋剤（例
えば、グルタルアルデヒド等）又は二官能性活性化剤（
例えば、水溶性カルボジイミド、カルボジイミダゾール
、Ｎ−ヒドロキシサクンニミド、ビス（スルフォサクシ
ニミヂル）サブストレート、ジスルフィドサクシニミヂ
ルタータレート等）により共有結合させる方法が挙げら
れる。これらのうち好ましくは、−末鎖核酸の結合強度
及び安定性が高まること及びハイブリダイゼーション時
の反応性が良くなることから化学結合による方法である
。

又、共有結合に際して、支持体表面と一本鎖核酸の結合
部位（末端塩基）迄の距離はある程度保つ方がハイブリ
ダイゼーション時の反応性が良好となり、結果的には感
度アップにつながることから好ましい。即ち、架橋剤又
は活性化剤を用いて支持体と一本鎖核酸を結合する場合
、支持体の表面及び−末鎖核酸の結合部位の少なくとも
いずれか一方に予め導入された官能基部分が、ある程度
の分子長（例えば、ｌｎｍ等）以上をもつように化合物
（例えば、炭素数３以上のポリメチレン基、炭素数４以
上のポリエーテル基等）が挿入されていることが好まし
い。

また、ここでいう−末鎖核酸の種類は一つの対象物を検
出するために一種類でもよく、また複数の対象物を同時
に検出するために二種類以上であってもよい。例えば細
菌、ウィルス、リケッチア、原虫、スピロヘータ等の外
来性の病原性物質に起因する疾病及び／又は核酸の塩基
配列の変異、即ち塩基の置換、挿入、欠落、転位等に起
因する遺伝性疾病に特異的な一本鎖核酸の中で任意の対
象物を数種選択することができる。さらに同一種の疾病
であっても数種類の異なる塩基配列が存在する場合、即
ち細菌やウィルスの変異株等もその対象物とすることが
できる。具体的には、病原性物質として赤痢菌、ジフテ
リア菌、ボツリヌス菌、サルモネラ菌等の細菌類、アデ
ノウィルス科ヒトアデノウィルス種、オルトミクンウィ
ルス科インフルエンザウィルス種、バボーバウィルス科
ヒトパピローマウィルス種等のウィルス類が、又遺伝性
疾病として家族性高コレステロール血症、■型高脂血症
、サラセミア、血友病、糖尿病、癌等が夫々挙げられる
がこれらに限られるものではない。

試料中の相補的な一本鎖核酸において核酸としては天然
に存在する二本鎖核酸に関連し、微生物、ウィルス、魚
類、鳥類、植物、動物、特に哺乳動物（ヒトを含む）に
由来する核酸が挙げられる。

ウィルスには一本鎖核酸からなるウィルスと二本鎖核酸
からなるウィルスがあり、これらは混在していてもよく
、各々単独に存在していても良い。

ここで用いる試料には種々の検体が存在することから、
−末鎖核酸と相補的な核酸以外に相補的でない核酸も含
まれる。また相補的でない核酸以外は存在しない場合も
ある。

これらの核酸は通常、細胞から抽出し、制限酵素（例え
ば、ＥｃｏＲｌ、旧ｎｄＩＩｒ　、ＰｓｔＩ　、Ｂｇｌ
　Ｉ等）での化学的手段又は超音波等の物理的手段によ
って処理することで核酸を断片化する。制限酵素による
調製法は通常０〜Ｉ　、　ＯＭ　−ＮａＣｌを含む１０
０ＩＩＭ１００ＩＩ緩衝液（ｐＨ７，５）に核酸試料０
．１〜１００μｇ及び制限酵素０．１−　＋００ｕｎｌ
ｔｓを加え、２（１〜４５℃、１０−１２０分で加温振
盪することで行うことができる。これらの方法は、例え
ばトム・マニアチス著、モレキュラー・クローニング、
コールド・スフリング・ハーバ一番ラボラトリ−（Ｔｏ
ｍ　Ｎａｎ１ａｔｌｓ　、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮ
ＩＮＧ、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ｐ＋０４，１９８２に詳述し
である。また天然の核酸の量が少ない場合には種々の核
酸合成酵素を用い、試験管内で予め核酸量を検出に耐え
る迄増幅させておくこともできる。

相補的な一本鎖核酸を調製する方法としては断片化され
た核酸を加熱またはアルカリで変性させることが挙げら
れる。具体的には加熱の場合は約１１ｉ０−１５０℃、
約１〜３０分、好ましくは約８０〜＋００’Ｃ。

約１０〜２０分で、アルカリ変性の場合は水酸化ナトリ
ウムを含む水溶液等を適量添加し、常温で約１〜３０分
程度放置し、最後に中性に戻す方法が挙げられるが、こ
れらに限定されるものではない。

交雑させる方法としては、上記試料と一本鎖核酸と混合
し、通常２５〜８０°Ｃ程度で約１０９〜１０時間、振
盪する方法が挙げられる。又、これらの方法は市販され
ている試薬キット（ラビッド　ハイブリダイゼーション
　システム「マルチプライム」アマ−ジャム・ジャパン
製）を用いて行なえば更に容易である。

交雑して二本鎖となった核酸と反応する結合性物質とし
ては交雑物の分子内、特に水素結合で結合した鏡開に特
異的に取り込まれる物質、例えば臭化エチジウム、二沃
化プロピジウム等の化学試薬又は蛋白、例えば抗体、二
本鎖核酸結合蛋白等が挙げられる。好ましくは物質の安
全性、生成した化合物の安定性の点で蛋白で、特に好ま
しくは抗体である。系内にある余分な核酸は分解等の処
理を経ずに直接抗体と反応させることから本抗体は交雑
物に対して特異性が高い必要がある。従って抗体として
はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が挙げら
れるが、この点で好ましくはモノクローナル抗体である
。

モノクローナル抗体は通常の方法で以て調製される。即
ち、まずモノクローナル抗体を産生ずる融合細胞を調製
する。免疫動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）
の腹腔内に天然または合成の核酸を注入して感作し、約
１〜２月後膵臓細胞またはリンパ節細胞を調製し、これ
と骨髄腫細胞とをＰＥＧ−４０００等の融合促進剤の存
在下混合し、数分間室温放置する。次にこれらの細胞か
ら融合細胞のみをＩＩＡＴ培地で選択し、選択された細
胞を限界希釈法で単一化してモノクローナル抗体を産生
ずる融合細胞を得る。続いてこの融合細胞を培養し、上
浦液から通常の方法で精製するか、またはこの融合細胞
をマウスの腹腔内に投与し、腹水腫瘍として成長させた
後、腹水を採取し、精製することにより目的とするモノ
クローナル抗体を得る。精製は市販の調製済みカラムを
用いて容易に行うことができる。これらの方法は、例え
ば日本生化学全編「続生化学実験講座５−免疫生化学研
究法」１〜８４、東京化学同人に詳述されている。

抗体を標識する標識物質としては放射性同位元素、蛍光
物質、発光物質、酵素及びこれらを間接的に結合しうる
化合物からなる群より選ばれた物質が挙げられる。具体
的な標識物質としては放射性同位元素として［３２Ｐコ
、［３６Ｓコ、［３Ｈ］及び［”Ｃ］等、蛍光物質とし
てフルオレセインインチオシアネー）　（ＦＩＴＣ）、
テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ
：）、アクリジンオレンジ、フルオレセイン及びエチジ
ウムブロマイド等、発光物質としてルミノール及びルシ
フェリン等、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフ
ォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びグルコース
オキシダーゼ等、そして間接的に結合し得る化合物とし
てビオチン（アビジンが結合し得る）及び抗体（抗原及
び２次抗体が結合し得る）等がそれぞれ挙げられるがこ
れらに限られるものではない。好ましくは安全性の点で
放射性同位元素を除く標識物質である。

標識化の方法は、例えば日本生化学全編「続生化学実験
講座５−免疫生化学研究法」１０２〜１１２、東京化学
同人に記載の方法で容易に行われる。

核酸に対する結合性物質で検出する方法としては通常の
免疫測定法（エンザイムイムノアツセイまたはラジオイ
ムノアッセイ）と同様の方法が挙げられる。即ち交雑す
る核酸に対して予め標識された抗体で検出する方法、ま
たは核酸と結合した抗体に対する標識二次抗体で検出す
る方法等が挙げられる。例えば特願昭Ｅｉ３−２６２４
７９号、特願昭６３２８Ｈ７１号、特願平１−０２［１
３７９号各公報に詳述された方法である。

本発明の検出試薬は必須構成成分以外に、この検出試薬
の使用を便ならしめるために、種々の補助剤を包含させ
ることができる。例えば、固体を溶解させる溶解剤、反
応途中で不用な構成成分を除去するための洗浄剤、標準
物質が酵素である場合には、その酵素活性を測定するた
めの基質及び酵素反応を停止するための反応停止剤等を
任意の組合せで包含させることができる。

［実施例］ 以下実施例及び比較例により本発明を更に説明するが本
発明はこれに限定されるものではない。

実施例１　特定の核酸の検出 ｌ）試料中の相補的な一本鎖核酸の調製市販のｐＢＲ３
２２（宝酒造製）と制限酵素Ｂｇｌ　ＩＴＯＹＯＢＯ製
、　ｐＢＲ３２２を３断片に切断する）（ とからメーカー推薦の反応条件で完全消化し、フェノー
ル抽出、エタノール沈殿等の通常の操作を経て精製し、
更に精製したものを１００℃、１０分で熱変性し、濃度
を１００μｇ／ｉｆに調整したものを核酸試薬（Ａ）と
して以下の検討に用いた。

２）固定化した一本鎖核酸の調製 一本鎖核酸は市販のｐＢＲ３２２ＰｒｉｍｅｒＨ（宝酒
造製、塩基数１６でｐＢＲ３２２と相補な塩基配列をも
つ）を用いた。０．１Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９，８）に
溶解した０、１μｇ／ｍｌ−Ｐｒ１ｍｅｒＨ３００μｍ
をガラスビーズと混合し、２時間室温で振盪した。次に
０．０１％Ｔｗｅｅｎ含有０．０２Ｍ燐酸緩衝液（ｐｉ
（７，５）　　（０，０１％Ｔｖｅｅｎ−ＰＢＳ）の５
００μｌで２回洗浄し、ＰＢＳに溶解したＩ％ＢＳＡを
加え、３７°Ｃ，１０分加温振盪したものを固定化した
一本鎖核酸試薬（Ｂ）として以下の検出に用いた。

３）抗核酸モノクローナル抗体の調製 核酸に対するモノクローナル抗体は文献［オスカー・ニ
ス・フランクフルト；　エクスペリメンタル　セル　リ
サーチ（Ｏｓｋａｒ　Ｓ、　Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ；Ｅｘ
ｐｅｒｔｍｅｎｔａｌ　　　Ｃｅ１ｌ　　　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ）Ｖｏｌ、１７０，３６９−３８０．１９８７コ
に記載の方法を改良して調製した。

簡単には、牛胸腺ＤＮＡ　（タイプ１１　　シグマケミ
カル社製）をＳｌヌクレース（宝酒造製）で消化し、メ
チル化牛血清アルブミンと結合し、これを免疫物質とし
た。この２００μｇをフロイントの完全アジュバントと
ともにＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に投与し免疫した。

３，５．７週後に同量の免疫物質をそれぞれ再度腹腔内
に投与し、更に２週後同量の免疫物質で強化免疫した。

３日後に膵臓を摘出し、牌細胞を採取した。ＲＰＭＩ培
地にて洗浄したのち、牌細胞全量を２ＸＩＯ？個のマウ
スミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４．１）と
混ぜ、３７°Ｃの４２．５％のポリエチレングリコール
１５４０及び７，５％ジメチルスルフオキシドを含むＲ
ＰＭ１１１７４０培地１ｍｌ中で１培地１含ｌ中た。融
合細胞を洗浄し、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノ
プテリン、チミジン、１０％牛脂児血清（ＢＳＡ）を含
むＲＰＭｌ＋６４０培地）で懸濁させ、マイクロプレー
ト上に分注し、２週間培養した。増殖した細胞の抗体活
性を測定し、目的のＩｇＧクラスの抗体活性を示す細胞
を２個得、これらの細胞をそれぞれマウスの腹腔内に投
与し、腹水を採取した。更にアフィ・ゲル。プロティン
Ａ　ＭＡＰＳキット（バイオラッド社製）を用いて精製
単離し、抗体ＮＯ，Ｉ、　　ＮＯ，２として以下の検討
に用いた。

４）標識抗体の調製 上記抗体ＮＯ，ｌを文献［ニス・ヨシタケ、エム・イマ
ガワ、イー・イシカワ、エトール；　ジェイ・バイオケ
ム（Ｓ、ＹＯ５ＩＴＡＫＥ、Ｍ、ＩＭＡＧＡＷＡ、Ｅ、
ｌ５ＩＫＡ１ｆＡ　ｅｔａｌ：　　Ｊ、Ｂｌｏｃｈｅｍ
、）、ｖｏｌ、９２（＋９８２）　　　１４１３−１４
２４コ　に記載の方法によってペルオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ’）と結合し、標識抗体を得た。これを１％牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）含有緩衝液でＩＯμｇ／ｌｌ１ｌに
希釈したものを標識抗体試薬（Ｃ）として以下に使用し
た。

５）交雑 予め、９５℃、５分で加熱し、直ちに氷上で冷却た（Ａ
）の０．５．１０及び２０μＩを含むＰＢＳ５００μｍ
と（Ｂ）を混合し、６０°Ｃ×２時間加温振盪で交雑さ
せ、次いで０．０１％ｔｖｅｅｎ−ＰＢＳ　（ｓｏｏμ
ｌＸ２回）でガラスビーズを洗浄した。

Ｂ）検出 ５）で得た反応物に（Ｃ）を１００μｌ及びＰＢＳ４０
０μｍを添加し、３７’ＣＸ６０分加温振盪した後、生
理食塩水にて洗浄した。これに基質溶液（過酸化水素含
有オルトフェニレンジアミン溶液）５００μｌを加え、
３７°Ｃ×３０分加温振盪した後、３ｍｌの１．５Ｎ硫
酸で反応を停止した。この液の４９２ｒ＋ｍの吸光度を
測定し、ガラスビーズに結合した酵素の活性を測定した
。

第一図に本検出法による核酸の検出結果を示した。

比較例１ 実施例１の標識抗体を調製する方法において抗体が市販
の抗核酸抗体（ケミコン・インターナショナル社製）で
あること以外は実施例１と同様に行ない、検出した。

第一図に比較例１による検出結果を示した。

この結果、交雑した核酸のみが特異的、安全且つ迅速に
検出されることがわかる。

実施例２ 本発明の検出試薬は以下の試薬を別々の容器に充填した
後密栓して製造した。

■）核酸試薬（Ａ）　　　　　　　　　　１．２ａ１２
）固定化した一本鎖核酸試薬（Ｂ）　　１００個３）標
識抗体試薬（Ｃ）　　　　　　　　１２ｎ＋１４　ＰＢ
Ｓ　　　　　　　　　　　　　　１２ｈ１５０．０１％
Ｔｖｅｅｎ−ＰＢＳ　　　　　　　　１２ｈ１８生理食
塩水　　　　　　　　　１００ｈ１３基質溶液　　　　
　　　　　　　ＧＯ＋ａ１１０硫酸（１，５Ｎ）　　　
　　　　　　　　３５ｈｌ実施例３　複数の特定の核酸
の検出 ｌ）試料中の相補的な一本鎖核酸の調製市販のｐＢＲ３
２２ＤＮＡ及びＭ１３！１１）１９ＲＦＤＮＡ　（いず
れも宝酒造製）を夫々制限酵素ＨｌｎｄＩＩＩ　（宝酒
造製）でメーカー推薦の反応条件で完全消化し、フェノ
ール抽出、エタノール沈殿等の通常の操作を経て精製し
、更に精製したものを１００℃、１０分で熱変性し、各
試料を混合し、最終的に夫々の濃度を１００μｇ／＋ａ
ｌに調整したものを核酸試薬（Ｅ）として以下の検討に
用いた。

２）固定化した一本鎖核酸の調製 一本鎖核酸は市販のｐＢＲ３２２Ｐｒｌｍｅｒ［Ｉ　（
’宝酒造製、塩基数ＩＢでｐＢＲ３２２と相補な塩基配
列をもつ）及びＭ１３ｐＰｒ１ｍｅｒＭ３　（宝酒造製
、塩基数！７でＭ１３ｍｐ１９ＲＦＤＮＡと相補な塩基
配列をもつ）を用いた。０．１Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９
，８）に溶解したそれぞれのＰｒｌｍｅｒを各０．１μ
ｇ／ｍ　ｌになるよう混合し、その３００μｍをガラス
ビーズと混合し、２時間室温で振盪した。次に０．０１
％Ｔｖｅｅｎ含有０．０２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）
　　（０，０１％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）のｓｏｏμｌで
２回洗浄し、ＰＢＳに溶解した１％ＢＳＡを加え、３７
℃、１０分加温振盪したものを固定化した一本鎖核酸試
薬（Ｆ）として以下の検出に用いた。

又実施例１で使用した（Ｂ）も併用して用いた。

３）抗咳酸モノクローナル抗体の調製 実施例１に同じ。

４）標識抗体の調製 実施例１に同じ。

５）交雑 予め、３５℃、５分で加熱し、直ちに氷上で冷却した（
Ｅ）の０．５．１０及び２０μｌを含むＰＢＳ５００μ
ｌと（Ｂ）又は（Ｆ）とを混合し、６０℃×２時間加温
ＦＭ盪で交雑させ、次いで０．Ｏ１％ｔｖｅｅｎ−ＰＢ
Ｓ　（５００ｕ　Ｉ　Ｘ　２回）でガラスビーズを洗浄
した。

６）検出 実施例１に同じ。

第二図に本検出法による核酸の検出結果を示した。

比較例２ 実施例３の標識抗体を調製する方法において抗体が市販
の抗咳酸抗体（ケミコン・インターナショナル社製）で
あること以外は実施例３と同様に行ない、検出した。

第二図に比較例２による検出結果を示した。

この結果、交雑した核酸のみが特異的、安全且つ迅速に
検出されることがわかる。

実施例４ 本発明の検出試薬は以下の試薬を別々の容器に充填した
後密栓して製造した。

ｌ核酸試薬（Ｅ）　　　　　　　　　　２．４ｍ１２）
固定化した一本鎖核酸試薬（Ｆ）　　ｒｏｏ個３固定化
した一本鎖核酸試薬（Ｂ）　　＋ｏｏ個４標識抗体試薬
（Ｃ）　　　　　　　　２４ｍ１Ｓ　ＰＢＳ　　　　　
　　　　　　　　　２４０ｍ１６０．０１％Ｔｗｅｅｎ
−ＰＢＳ　　　　　　　　２４０Ｉ１１１７生理食塩水
　　　　　　　　　２０００ｍ１８）基質溶液　　　　
　　　　　　　１２０ｍ１９）硫酸（１，５Ｎ）　　　
　　　　　　　　７０ｈｌ実施例５　特定の核酸の検出 ｌ）試料中の相補的な一本鎖核酸の調製実施例１に同じ
。

２）固定化した一本鎖核酸の調製 まず、−木調核酸は市販のｐＢＲ３２２Ｐｒｌｍｅｒｌ
ｌと同様の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５″
末端ヒドロキシル基をカルボジイミダゾール及びヘキサ
メチレンジアミンにてアミノアルキルたものを入手した
。又、支持体としてはγ−アミノプロピルシランにて予
め表面上をアミノ化処理した外径Ｇｍｍのスリガラスビ
ーズを使用し、これとジサクシニミジルサブストレー）
（ＤＳＳ）及び上記のアミノアルキル化ヌクレオチドを
混合し、室温、２４時間反応させた。次にこの反応物の
ヌクレオチド濃度を０．１Ｎｇ／ｍｌに調節し、実施例
１同様の処理をしたものを固定化した一本鎖核酸試薬（
Ｇ）とし、以下の検出に用いた。

３）抗咳酸モノクローナル抗体の調製 実施例１に同じ。

４）標識抗体の調製 実施例１に同じ。

５）交雑 予め、９５°Ｃ，５分で加熱し、直ちに氷上で冷却した
（Ａ）の０．５．１０及び２０μｌを含むＰＢＳ５００
μＩと（Ｇ）とを脛合し、６０°ＣＸ２時間加温振盪で
交雑させ、次いで０．ＯＩ％ｔｖｅｅｎ−ＰＢＳ　（５
００μｍ×２回）でガラスビーズを洗浄した。

６）検出 ５）で得た反応物に（Ｃ）を１００μ■及びＰＢＳ４０
０μｍを添加し、３７”ＣＸ６０分加温振盪した後、生
理食塩水にて洗浄した。これに基質溶液（過酸化水素含
有オルトフェニレンジアミン溶液）５００μｌを加え、
３７’ＣＸ３０分加温振盪した後、３Ｉｌｌの１．５Ｎ
硫酸で反応を停止した。この液の４９２ｎｍの吸光度を
測定し、ガラスビーズに結合した酵素の活性を測定した
。

第三図に本検出法による核酸の検出結果を示した。

比較例３ 実施例５の標識抗体を調製する方法において抗体が市販
の抗咳酸抗体（ケミコン・インターナショナル社製）で
あること以外は実施例５と同様に行ない、検出した。

第三図に比較例１による検出結果を示した。

この結果支持体及び−末鎖核酸間に一定の分子長がある
ことで感度良く、且つ酵素処理により一本鎖核酸と相補
な核酸のみが特異的、安全且つ迅速に検出されることが
わかる。

実施例６ 本発明の検出試薬は以下の試薬を別々の容器に充填した
後密栓して製造した。

Ｉ）核酸試薬（Ａ）　　　　　　　　　　１．２１１１
２）固定化した一本鎖核酸試薬（Ｇ）　　１００個３標
識抗体試薬（Ｃ）　　　　　　　　１２１１４　ＰＢＳ
　　　　　　　　　　　　　１２０ｍ１５０．０１％Ｔ
ｗｅｅｎ−ＰＢＳ　　　　　　　　１２ｈ１８生理食塩
水　　　　　　　　　１０００ｍ１９基質溶岐　　　　
　　　　　　　６０ｍ１１０硫酸（１，５Ｎ）　　　　
　　　　　　３５０ｍ１［発明の効果］ 本発明の検出法及び検出試薬によれば、従来の検出法に
比べ特異性が高く、迅速で且つ安全な測定が可能となる
。

従来の検出法においては対象とする核酸を固定し、−木
調核酸を３２ｐのような放射性同位元素を標識物質とし
て用いる場合、検出感度としては大変高感度であるが、
操作上の手間及び安全性の点では問題が多い。本発明は
これらの欠点を大きく改良するための方法を提供するも
のである。

また−木調核酸を複数使用する場合には変異株を持つウ
ィルスや細菌を同一検査試薬で測定できることや、多種
の疾病の同時検出を可能にした点が特徴である。一般に
ウィルスや細菌は種々の外的要因により容易に変異株を
形成し、しばしばその診断・治療を困難にする。例えば
パピローマウィルス或はインフルエンザウィルスは多種
の変異株を有し、後者は特に毎年その採種を替え、流行
す る。従って一種の核酸しか検出出来ない試薬の場合、そ
の診断を誤ることにも成りかねない。本発明の検査法に
よるとこの誤りを無くすことができ、マススクリーニン
グに大変都合がよい。

以上の点から、本発明は特に高感度、高精度の測定が要
求される血清またはその他の体液中に極＠量存在する目
的の核酸又は食品中の生物汚染に由来する核酸を特異的
に検出でき、且つこれらの検出時間を著しく短縮できる
ものである。本発明の主用途である臨床検査及び食品製
造への適用にほこの点特に好ましい。

【図面の簡単な説明】

第一図は実施例１及び比較例１の核酸の検出結果を、第
二図は実施例３及び比較例２の核酸の検出結果を、第三
図は実施例５及び比較例３の核酸の検出結果を夫々示し
たグラフである。 図面 （Ａ）μｍ 第二図 ロー０　： 比較ｇ１１２で（Ｂ）を用いた場合 第三図 （Ａ）μｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一本鎖核酸と、試料中の相補的な一本鎖核酸を交雑
   し、特定の核酸を検出する方法において、一本鎖核酸を
   支持体に固定化し、交雑して二本鎖となった核酸を、標
   識物質で標識された結合性物質を用いて検出することを
   特徴とする核酸の検出法。 ２、支持体がガラスビーズである請求項１記載の検出法
   。 ３、結合性物質が交雑物に特異的な蛋白である請求項１
   または２記載の検出法。 ４、蛋白が抗体である請求項３記載の検出法。 ５、抗体がＩｇＧである請求項４記載の検出法。 ６、標識物質が酵素である請求項１〜５項のいずれか記
   載の検出法。 ７、支持体に固定化した一本鎖核酸及び交雑して二本鎖
   となった核酸と反応する、標識物質で標識された結合性
   物質を含有してなる請求項１〜６項のいずれかに記載の
   検出法に使用される核酸の検出試薬。