JPS6072828A - Ｄｎａの二本鎖構造に特異的なモノクロ−ナル抗体及び該抗体を使用する測定方法 - Google Patents

Ｄｎａの二本鎖構造に特異的なモノクロ−ナル抗体及び該抗体を使用する測定方法

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JPS6072828A
JPS6072828A JP59171012A JP17101284A JPS6072828A JP S6072828 A JPS6072828 A JP S6072828A JP 59171012 A JP59171012 A JP 59171012A JP 17101284 A JP17101284 A JP 17101284A JP S6072828 A JPS6072828 A JP S6072828A
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SHITASU PARO ARUTO CORP
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、免疫化学、核酸化学、及び免疫診断の分野
に関する。
（従来の技術） 多くの生化学的研究及び組換ＤＮＡ技法において社、特
定のＤＮＡ分子を固定するために単鎖ＤＮＡ（ａｍ　Ｄ
ＮＡ　）プ四−プが使用される。このグローブのヌクレ
オチド配列は、同定されるべきＤＮＡ分子の１つの鎖の
ヌクレオ配列の部分又は全体に対して相補的であり、そ
してこの方法においては同定されるべきＤＮＡの変性さ
れた（単鎖にされた）形とグローブとのバイブリド形成
（アニーリング）が用いられる。生成するデュグレック
スは、それ自体検出可能なプローブの反応性成分（例え
ば放射性同位元素）を介して直接的に検出され、又は検
出可能な誘導体を形成する反応性成分（例えば、ビオチ
ン又はその誘導体）を介して間接的に検出される。この
ような方法の例祉米国特許第４．３５８，５３５号、及
びヨーロッパ特許出願第８２３０１８０４．９号（公開
第００６３８７９号）に記載されている。このＤＮＡプ
ローブ技法の主要な実際的問題点は、相補的ｍ５ＤＮＡ
プローブへの放射性同位元素又は−オチンのごとき成分
の導入が困難であυ、そして高価であることである。
（発明が解決しようとする問題点） この発明の主たる目的は、この問題点全回避し、そして
前記の成分金相補的ｓａ　ＤＮＡプローブに含有せしめ
ることな（ＤＮＡデープレックスを検出するための技法
全提供することである。
（問題点全解決するための手段） この発明は、天然（ｎａｔｉｖｅ　）　ＤＮＡデュプレ
ックスの二本鎖性を特異的に認識する免疫化学物質、す
なわち天然の（ｎａｔｉｖｅ　）二本鎖ＤＮＡ　（ｄｓ
　ＤＮＡ　）について構造依存特異性（ｃｏｎｆｏｒｍ
ａｔｉｏｎ　−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　５ｐｅｃｉｆｉｃ
ｉｔｙ　）　ｆ有するモノクローナル抗体全提供する。
ＤＮＡグローブ技法においてこの抗体を使用することに
より、ゾロープＤＮＡ自体が添加された検出成分金含有
するという要請か除去される。プローブＤＮＡの唯一の
条件は同定されるべきＤＮＡに相補的であることのみで
ある。従って、この発明の主要な特徴は、Ｍ１３のごと
きベクター金剛いる単鎖ＤＮＡ　（ｓｓ　ＤＮＡ　）の
クローニングによりグローブＤＮＡの製造が可能になる
ことである。単鎖ファージベクターを用いてプローブを
クローニングすることによって過剰のプロー７”ｉｉ使
用することが可能となり、これによってデュプレックス
の検出感度が上昇する。
この発明のモノクローナル抗体に関しては、天然ＤＮＡ
に対するネズミ類モノクローナル抗体についての多くの
先行報告が存在する。Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ９３−９７を
参照のこと。これらの抗体は、入手可能なネズミ類形質
細胞腫と正常に高力価の抗ｄａ　ＤＮＡ抗体を産生ずる
マウス（例えば、Ｆ、雑種Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　Ｂ
ｌａｅｋ／Ｗｈｉｔｅマウス）からの肺臓細胞との融合
によって作られたハイプルドーマによって生産された。
これらの先行技術のＤＮＡモノクローナル抗体のすべて
は好んでｍｓ　ＤＮＡと結合し、又はｓａ　ＤＮＡ及び
ｄｓ　ＤＮＡの両者と結合した。これらの先行技術の抗
体はｄａ　ＤＮＡに対して排他的に特異的ではないから
、上記のＤＮＡ　ｆローブ技法においてデュプレックス
を検出するためには不適当である。
ＤＮＡの２形に対するポリクローナル抗体及びモノクロ
ーナル抗体が報告されている。ＰＮＡＳ（問題点を解決
するための手段） この発明の１つの観点は、天然ＤＮＡの二本鎖構造に対
して排他的特異性を有するモノクローナル抗体でおる。
この発明の他の観点は、天然ＤＮＡの二本鎖構造に対し
て排他的特異性を有するモノクローナル（ＩｇＭライト
鎖）抗体を生産するハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ　８３
２９である。
この発明の他の観点は、ｄｇ　ＤＮＡに結合した上記の
モノクローナル抗体から成る免疫複合体である。
このような複合体の具体例は、ｄｓ　ＤＮＡとモノクロ
ーナル抗体のラベルされた接合体との二要素複合体、並
びにｄ＊ＤＮＡ、モノクローナル抗体及び該モノクロー
ナル抗体に対する抗体であってラベルされたものの三要
素複合体である。
種々の免疫診断法かこの発明の他の観点である。
これらの方法における共通の段階は（１）モノクローナ
ル抗体とｄａ　ＤＮＡとの結合、及び（２）こうして生
成した複合体の、モノクローナル抗体に接合したラベル
を介しての検出、又はモノクローナル抗体に直接的もし
くは間接的に結合した免疫化学物質に接合したラベルを
介しての検出である。サンプル中の所与のＤＮＡ配列、
例えば遺伝的不調、病原的疾患又は他の医学的状態を検
出するためにＤＮＡ技法を使用する場合、結合反応〔上
記の段階（１）の反応〕に先立って、サンプルを処理し
てその中に含有されているすべてのｄｉ　ＤＮＡ　ｆ変
性し、そして変性された（単鎖にされた）ＤＮＡ’ｉ、
所与のＤＮＡ配列に対して実質上相補的であるヌクレオ
チド配列ヲ有スるｍ５ＤＮＡゾローブと、バイブリド形
成条件下でバイブリド形成せしめる。
この発明はまた、このような免疫診断法を実施するだめ
のキットに関する。
変性後にｄｓ　ＤＮＡ分子、例えばプラスミドを分離し
そして／又は同定するための方法及びキットもまたこの
発明の部分である。
この発明の抗体は天然ＤＮＡの二本鎖構造ｆ　ｄａＤＮ
Ａ分子の免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ　ｆ
ｅａｔｕｒｅ　）として認識する。言い換えれば、抗体
が認識する決定因子の特異性は、ヌクレオチドの配列に
よってではなく、むしろ天然ｄｓ　ＤＮＡの二本鎖構造
によって指示される。抗体は、ＤＮＡの種類に無関係に
天然ＤＮＡ　７”ニブレックスを認識する。この明細書
において使用する「天然（ｎａｔｉｖｅ　）　Ｊなる語
は天然に存在するｄｓ　ＤＮＡに関連し、そして微生物
、ウィルス、植物、魚、鳥類及び哺乳動物に由来するｄ
ｇＤＮＡ。
並びに天然に存在するｄｓ　ＤＮＡに相同な、又は実質
上相同か合成りＮＡ　、例えばＤＮＡプローブ技法にお
けるデュプレックスが含まれるが、これらに限定されな
い。抗体は、ＤＮＡの相補的ホモポリマー鎖から作られ
た幾つかの合成りＮＡと結合し々い。
ことに特に記載するモノクローナル抗体はネズミＩｇＭ
であるが、この発明は免疫グロブリンの特定のスペーシ
ス、クラス又はサブクラスに限定されない。マウス、ラ
ット、及びヒト由来のモノクローナル抗体が最近好まれ
る。抗体を生産するノ１イプリドーマを作るために適当
なマウス、ラット及びヒトの細胞系を使用することがで
きるからである。ここで特に例示したネズミＩｇＭと機
能的に同等な同じクラス又は異るクラスのモノクローナ
ル抗体、例えばＩｇＧ　（ＩｇＧ１　、　ＩｇＧ２　Ａ
　、　ＩｇＧ３等のＩｇＧのサブクラスを含む）、Ｉｇ
Ａ、及びＩｇＤを、この明細書に記載した／％イブリド
ーマ合成及びスクリーニング技法に従って作り、そして
同定することができる。この明細書において使用する「
機能的に同等な」なる語は、例示したネズξＩｇＭとは
異るが天然ｄｓ　ＤＮＡ　Ｋ’Ｐ！！異的なモノクロー
ナル抗体を意味する。好ましい機能的同等物は、同じ決
定基金認識し、そして例示したネズミＩｇＭをクロス−
ブロックする。
所望により、モノクローナル抗体は、常用のう（１１） ベル剤及びラベル方法を用いて誘導体にする（ラベルす
る）ことができる。この明細書において使用するラベル
々る語は、直接検出され得る成分、例えば放射性同位元
素又はフルオロクローム、及び検出可能な生成物を生成
する反応を介して間接的に検出される反応性成分、例え
ば基質と反応して分光光度法によって検出され得る生成
物を生成せしめる酵素、の両者を意味する。
抗体はまた、クロマトグラフィー支持体（例えばチュー
ブもしくはプレートの表面、又はビーズのごとき粒状体
の表面）に、入手し得る二官能性カップリング剤、例え
ばカルがジイミドを用いて共有結合的に結合せしめて、
ｄａ　ＤＮＡ　ｋアフィニティーｎ製するための効果的
な吸着剤を調製することができる。このような吸着剤は
、次の様にしてプラスミドを分離するために使用するこ
とができる。目的とするプラスミドを含有する細菌を溶
解し、そしてそれらのＤＮＡ　’ｉ変性する。溶解と変
性は、細胞を高−１例えば１２．５の緩衝液中に懸濁す
ることにより一段階で行うことができる。次に（１２） 得られた溶液を、ｐＨ７〜７，５の冷緩衝液を加えるこ
とにより中和する。これによりＤＮＡデュグレックスが
再生するであろう。次に濾過又は遠心分離により溶液か
ら細胞破片を除去する。次にろ液又は上清液を、支持体
に固定されたモノクローナル抗体全収容するカラムに通
す。デュゾレックスプラスミドＤＮＡはカラムにより保
持され、そして適当な溶離剤によりカラムから溶出され
るであろう。
プラスミドＤＮＡ　’ｌ（分離するためのキットは、支
持体に接合されたモノクローナル抗体、細菌細胞を溶解
しそしてＤＮＡ　？変性するための緩衝剤、中和緩衝剤
、及び溶離剤を包含するであろう。
この発明のモノクローナル抗体は、最近にＫｏｈｌ＠ｒ
　Ｇ、及びＭｉ１ｓｔ＠ｉｎ　Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ　（
１９７５）２５６：７４９５−４９７によシ記載された
体細胞ハイブリダイゼーシ胃ン法を用いて製造すること
ができる。この方法において使用される腫瘍細胞、試薬
、及び条件は良く知られており、そして文献中Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　（１９８０）プ
レナムプレス〕。基本的には、この方法においては、適
当な腫瘍細胞系を、ポリエチレングリコールのごとき融
合剤を用いて、目的とする抗体を産生ずる細胞（典型的
には肺臓細胞）と融合せしめる。抗体産生細胞は典型的
には注目の免疫原によシ宿主全免疫することによって作
られる。これに関して、抗ＤＮＡ抗体の一般的な分離原
は、全身性細斑性狼癒（ＳＬＥ　）又はこれに類似する
疾患を有する又は有しやすい動物である。このような動
物はＤＮＡに対する抗体を自発的に産生ずる。ＤＮＡで
免疫された正常動物は一般に、抗ＤＮＡ抗体産生細胞の
良好な分離原であるとは考えられない。しかしながら、
この明細書に特に例示するネズミＩｇＭの製造において
は、合成ポリヌクレオチドホモポリマー〔例えば、ポリ
（ｂＡ−ｄＴ）・ポリ（ｄＡ−ｄＴ）、ポリ（ｄＩ　−
ｄＣ）・ポリ（ｄＩ・ｄＣ）、及びポリ（ｄＧ　−ｄＣ
）・ポリ（ｄＧ　−ｄＣ）により免疫され、そして外来
性天然ＤＮＡにより追加免疫された正常マウスを抗ＤＮ
Ａ抗体産生肺臓細胞の分離原とじて使用することができ
る。これらの肺臓細胞を、高い融合頻度をもたらす適合
性骨髄腫系、例えば系ＦＯ［Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔ
ｌｏｎ　Ｐｒｏｅ、　（１９８０）　Ｖｏｌ　Ｘｌｌ　
。
Ｎｏ　３　：　４４７−４５０］と融合せしめる。この
融合の後、常法に従って選択増殖培地、例えばＨＡＴ培
地中で融合生成物を増殖せしめることによシ未融合の骨
髄腫細胞及び肺臓細胞を除去する。所望の特異性を有す
るクローン金、ハイブリドーマ培地全ｄａ　ＤＮＡ及び
ａｓ　ＤＮＡに結合する能力について測定することによ
り同定する。ｄｓ　ＤＮＡ　十／　ｍｓ　ＤＮＡ　−ク
ローンを、さらに特異性試験することによりさらに特徴
付ける。ｄｓ　ＤＮＡに対して構造依存特異性を有する
抗体を産生ずるハイプリドーマを限界希釈法、より、−
メ夛′リー＝７．．−いそＬ−Ｃ培地中。
試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）増殖せしめ、あるいは
宿主動物に注射し、そして生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）
増殖せしめる。常用の抗体画分法、例えば硫酸アンモニ
ウム沈澱、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー等により、得られた培
地又は体液から抗体を分離する。所望に（ＩＩ）ノ より、限外濾過及び微細濾過（ｍ１ａｒｏｆｌｌｔｒａ
ｔｉｏｎ）により抗体をさらに精製する。
上記の抗ｄｓＤＮＡモノクローナル抗体の主な用途は、
米国特許第４，３５８，５３５号に記載されているのと
同様な診断的バイブリド形成試験におけるＤＮＡデュプ
レックス形成を検出することである。
これらの方法は、医学的診断の分野において、病原性細
菌、糸状菌、酵母もしくはウィルスのごとき特定の生物
、又は錐状赤血球貧血もしくは地中海貧血のごとき遺伝
性疾患を特徴付けるサンプル中の特定のＤＮＡ分子の存
在又は量を決定するために使用される。これらの決定は
、サンプルが採取された患者の疾患、感染又は不調の診
断全可能にする。これらはまた、細菌をスクリーニング
して抗生物質耐性を決定するため、及び遺伝子地図の作
成においても使用される。
これらのバイブリド形成においては、注目するＤＮＡ　
（例えば、生物、疾患、状態等全特徴付は又は区別する
ＤＮＡ　）の１つの鎖に相補正な単鎖ポリヌクレオチド
プローブが調製される。次に、これ（１６） らのＩリヌクレオチドプロープは、バイブリド形成条件
下で、注目のＤＮＡ′ｌｋ含有すると予想されるサンプ
ルに適用される。このＤＮＡは、サンプル中のｄｓ　Ｄ
ＮＡ　ｆ変性し、そして得られたｓａ　ＤＮＡ　ｉ固定
化するためにあらかじめ処理されている。固定化は一般
に、ＤＮＡに関して高い親和性を有する不溶性材料、例
えばニトロセルロースＦ紙又は他の同様に不活性々多孔
性支持体にサンプルを適用することにより達成される。
上記の方法に代えて、相補的ｓｓ　ＤＮＡプローブを固
定化し、固定化されたグローブに変性されたサンプルを
適用することができる。支持体に他の試薬が非特異的に
結合するのを回避するため不活性（非バッテン性）物質
、例えばアルブミンにより表面を後被覆（ｐｏｓｔ　ｃ
ｏａｔ　）することができる。次に、バイブリド形成し
なかった物質を除去し、そしてバイブリド形成体を核酸
デュプレックスの存在について測定する。デュプレック
スの不存在は注目するＤＮＡの不存在を示し、デ≧ゾレ
ックスの陽性検出は注目の核酸配列の存在を示す。定量
的バイブリド形成技法においては、デュプレックス形成
の量が決定され、そしてこの量がサンプル中の注目のＤ
ＮＡの量に比例する。
使用される具体的なバイブリド形成技法はこの発明に特
徴的ではない。最近の技法の例としては、ＰＮＡＳ　（
ＵＳＡ）（１９７５）７２：３９６１−３９６５　：Ｐ
ＮＡＳ　（ＵＳＡ）（１９６９）６３：３７８−３８３
　：Ｎａｔｕｒｅ　（１９６９）２２３：　５８２−５
８７　：及び従来技術の項に前記した特許文献が挙げら
れる。この発明は、これらの方法、及び存在する他のバ
イブリド形成方法、並びに将来開発されるバイブリド形
成方法と共に用いることができる。
従来技術のＤＮＡバイブリド形成法においては、デュプ
レックスの検出は、放射性同位元素又はビオチンのごと
き検出可能な成分金相補的ポリヌクレオチドグローブに
導入することによって行われた。この発明のモノクロー
ナル抗体は、検出可能な成分金相補的ポリヌクレオチド
プローブに導入することを回避することを可能にする。
同時に、この発明のモノクローナル抗体は、ポリヌクレ
オチドプローブを、単鎖７アージベクター、例えばＦｆ
群（例えば、Ｍ１３、ｔａ、　ｔｌ）及びＩＸ　１７４
のバクテリオファージ、並びにこれらの誘導体を用いる
クローニングによって製造することを可能にする。Ｍ１
３又は他の単鎖ファージベクターを用いるクローニング
は、大量（少なくとも０．５１９’を培地）且つ高品質
〔中断（ｂｒｅａｋ　）及び終点（ｅｎｄ　）　ｋ伴わ
ない純度〕のポリヌクレオチドグローブを提供する。バ
イブリド形成において高濃度のグローブを使用すること
によりデュプレックスの検出感度が増加する。このクロ
ーニング法ハ、ＤＮＡ配列決定のＳａｎｇ＠ｒのチェイ
ンーターミネーシ習ン法において使用するためのａｓ　
ＤＮＡ　ｆ製造するために一般に使用される。これらの
ベクター、及びこれらを用いるＤＮＡクローニング法は
Ｓｉｎｇｌｅ−８ｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　Ｐｈａｇｅ
ｓ　（１９７８）　Ｃｏ１ｄ　：ＳｐｒｌｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されている。相補
的プローブを得るための他の方法を用いることができる
が、これらは単鎖ファージベクターを用いるクローニン
グ程効率的ではない。例えば、適当な配列のｄ８ＤＮＡ
　ｋあらかじめ又はその場で変性し、次に必要であれば
制限処理（ｒａａｔｒｉｃｔｉｏｎ　）　Ｌ、そしてバ
イブリド形成において使用することができる。
ＤＮＡバイブリド形成試験の検出段階でモノクローナル
抗体を使用することにより、この段階か免疫測定（ｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ　）と同等のものとなる。この場合
、デュプレックスが検出されるべき抗原である。従って
、種々の常用の免疫測定法か用いられる。デュプレック
スは典型的には固体不溶性支持体上に固定化されている
ので、抗体をこの支持体に適用し、該抗体と支持体上に
固定されたデュプレックスとの間の免疫複合体の形成を
可能にする条件下でインキュベートし、そして支持体を
洗浄して未結合抗体を除去する。温度、声、及び時間が
インキニペーシ璽ンにおける最も重要な条件である。温
度は通常５℃〜４０℃の範囲であり、−は通常ｄ〜９の
範囲であり′、そして結合反応は一般に約１〜１８時間
で平衡に達する。抗体は通常は過剰に使用される。抗体
が直接ラベルされる場合、免疫複合体は抗体上のラベル
を介して検出することができる。さらに一般的なそして
好ましい方法は、非ラベルモノクローナル抗体を使用し
、そして固定化されたｄｓ　ＤＮＡ−モノクローナル抗
体複合体を該モノクローナル抗体に対する酵素接合抗体
と共にインキ−ベートする方法である。最初のインキュ
ベージ四ンにおいて使用したのと同一の条件全使用する
ことができよう。生成した三要素複合体を基質により処
理し、そして酵素−基質反応を介して分光光度法によシ
検出することができる。検出手段が、免疫化学物質の１
又は複数の層を介してｄｓ　ＤＮＡ−モノクローナル抗
体に間接的に結合する常法を用いることにより、検出シ
グナルを増幅し、この方法の感度又は検出限界を改良す
るとと〃ｉできる。
上記の好ましいバイブリド形成試験を実施するためのキ
ットは通常、ＤＮＡ固定化材料、米国特許第４．３５８
．５３５号のカラム５．８〜２４行目に記載されている
ようなバイブリド形成溶液、１ｌＩＤＮＡプローブ（前
記固定化材料と分離されており、又は該固定化材料にゾ
レコードされている）、モノクローナル抗体、該モノク
ローナル抗体に対する酵素接合抗体、及び適当な基質を
包含する。キットはさらに、稀釈及び洗浄のための適当
な緩衝剤、希水酸化ナトリウム水溶液のとときｄｓ　Ｄ
ＮＡ変性剤、ウシ血清アルブミンのごとき後被覆剤、及
び試験を行うための説明書全包含することができる。こ
れらの構成物は常法に従って包装し、そして貯蔵するこ
とができる。
次の例は、この発明の種々の観点を例示する。
これらの例は、この発明の範囲を限定することを倉図す
るものではない。
モノクローナル抗体の調製 生後９週間の雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスを次のように免疫
した。
以下全白 日　接種物（１，ｐ、投与） ０　１００μ、！ｉｌポリ（ｄＡ−ｄＴ）＋１００μ、
！ｉ’ｍＢｓＡ（ＣＦＡ中）１４　１００μ、ｊ９ポリ
（ｄＩ−ｄｃ）＋１００μｇｍＢＳＡ（ＩＣＥ７１Ｆｌ
：Ｉ）２３５０μｇポリ（ａＡ−ａＴ）−Ｈｏμｇ旦口
ＲＩ消化ｐＢＲ３２２＋１００μｇｍＢｓＡ（ＰＢＳ中
）３７５０μｇポリ（ｄＡ−ｄＴ）＋５０μｇ工践ＲＩ
消化ｐＢＲ３２２＋１００μｇｍＢｓＡ（ＰＢＳ中）ｍ
ＢｓＡ　：メチル化つシ血清アルブミンＣＦＡ　：完全
フロインドアジュバントＩＣＦＡ　：不完全フロインド
アジュバントＰＢＳ　：燐酸緩衝化塩溶液（０，１４Ｍ
ＮａＣ１。
１０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐ１７．０）接種において使
用したすべてのポリヌクレオチドはＰ、Ｌ、バイオケミ
カルス社、ミルウオーキー、ライスコンシンから購入し
た。
マウスの肺臓細胞全４０日月に摘出した。肺臓細胞（１
，１２Ｘ１０８）’ｅ、最初にＳ　、　Ｆａｚｅｋａｓ
　ｄａＳｔ、　Ｇｒｏｔｈ　、　Ｂａ５ｅｌ　Ｉｎ５ｔ
ｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙから得られ
たＦＯネズミ骨髄腫細胞（１，１２Ｘ　１０８）と、Ｏ
ｌ及びＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ　、　５ｅｌｅｃｔｅｄ　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ　、　３５１−３７２頁に記載されている融合
及び選択方法を用いて融合せしめた。
生存細胞を含有するウェルからの培養土清液を、ｓｓ　
ＤＮＡ及びｄｓ　ＤＮＡへの結合を評価するために設計
された固相エンザイムーリンクドイムノソルペントアッ
セイ［ｅｎｚｙｍｅ−１量ｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏ
ｒｂａｎｔａｓｌｓａｙ　（ＥＬＩＳＡ　）　〕Ｙ用い
て、ｄａ　ＤＮＡに対して構造特異性を有する抗体につ
いてスクリーニングした。ｄｓ　ＤＮＡとしてＥｅｏ　
ＲＩで制限された（　ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　）　ｐＢ
Ｒ３２２’ｆｆ：使用し、そしてｓａ　ＤＮＡとしてＭ
１３単鎖ファーゾＤＮＡ　ｉ使用した。
０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，８）中これらのＤＮＡの
溶液（１０ｆｉｌｌ／ｍｌ）　１００　ｔｔｔ’ｆｒニ
イムｏ　ｙ　（Ｉｍｍｕｌｏｎ）ミクロタイタープレー
トに加え、この中で室温において１〜２時間インキュベ
ートした。プレートを空にし、そして０．０５％のトゥ
イーン界面活性剤を含有するＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎ　）　（３Ｘ２００μ７）で洗浄し、そしてＰＢＳ
中ＢＳＡ　１％溶液によ゛り後被覆（ｐｏｓｔ　−ｃｏ
ａｔ　）　した。１００μｔのハイプリドーマ培養上清
を各ウェルに加え、そして室温にて１時間インキュベー
トした。プレートラ空にし、そしてＰＢＳ　−Ｔｗｅｅ
ｎ　（３Ｘ２００μｔ）によシ洗浄し、そしてアルカリ
ホスファターゼ（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
　、南すンフランシスコ、カリホルニア）に接合したヤ
ギ抗マウスＩｇ　１００μを７各ウェルに加えた。室温
にて１時間置いた後、ウェル全学にし、そして１０％の
ジェタノールアミン緩衝液中１ｍｙ／ａｔのｐ−ニトロ
フェニルホスフェート１００μｔ’ｉ加えた。プレート
を３７℃にて約１時間インキ−ベートした。４０５ｎｔ
ｎＪＦおける吸収（光学濃度ｏｎ）Ｔｈミ゛クロタイタ
ーリーダー（Ｍｉｃｒ。
ＥＬＩＳＡ　Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ　Ｄｙｎａｔｅｅｈ
）　ｆ用いて読み取った。対照読値（培養上清を伴わな
い媒体）より５倍以上高いＯＤ読値を陽性とする。
１４９５個の培養上清液を上記の方法によυスクリーニ
ングした−１つのウェルからの上清液（ＣＨ２６−１３
５２と称する）がｄｓ　ＤＮＡと反応するがｓａ　ＤＮ
Ａとは反応しなかった。細胞を拡げ、そして限界稀釈法
によりサブクローニングシタ。ハイブリドーマＣＨ２６
−１３５２のクローニングサングルは、アメリカン・タ
イプ・カルチュア・コレクシ冒ン、１２３０１パークラ
ウンドライブ、ロックビレ、メイランド２０８５２　（
米国）に１９８３年８月２日付で寄託され、受託番号Ａ
ＴＣＣＮｏ　ＨＢ８３２９が付与された。ハイプリドー
マＣＨ２６−１３５２により生産されたモノクローナル
抗体のアイソタイプ分析により、この抗体がＩｇＭであ
ることが示された。
ＣＨ２６−１３５２細胞を、Ｐｒ１ａｔａｎｅ　−ｐｒ
ｉｍｅｄＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔内注射した。５〜１
ｏ日後、これらのマウスから腹水を採取した。腹水由来
の精製抗体及び培養上清液由来の精製抗体の両者を、下
記する特異性試験において使用した。抗体は、腹水又は
上清液全蒸留水に対して透析し、次に遠心分離すること
によシ精製した。
ＤＮＡの２本鎖構造に対するモノクローナル抗体ＣＨ２
６−１３５２の特異性を、他の単鎖ファージＤＮＡ　（
φＸ　１７４　、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｌｏｌ
ａｂ　）、並びに次のｄａ　ＤＮＡ　、すなわち複製型
（ｒｅｐｒｉｃａｔｉｖｅｆｏｒｍ）　（ＲＦ　）　Ｉ
φＸ１７４　、　ＲＦＩＩφＸ１７４、子ウシ胸腺ＤＮ
Ａ、ＲＦＭ１３．及びｐＢＥＵ２７を用いて、前記のＥ
ＬＩＳＡにおいて該抗原を試験することにより確認した
。抗体は８ＢφＸ１７４には結合しなかったが、５種類
のｄａ　ＤＮＡすべてに結合した。
（ＲＩＡ）） モノクローナル抗体ＣＨ２６−１３５２の特異性を証明
するために阻止ＲＩＡ　’ｅ実施した。弾性ポリ塩化ビ
ニルミクロタイタープレートウェルに、炭酸緩衝液（０
，１Ｍ、ｐ）（９，８）中２５μυ包精製モノクローナ
ル抗体溶液５０μｔ’２入れ、そして室温にて２時間イ
ンキュベートした。次にウェルから上記の溶液を吸引除
去し、ウェル′（ｉ−ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎで洗浄（２
Ｘ２００μｔ）し、そしてＰＢＳ中１％ＢＳＡ（以下、
ＲＩＡ緩衝液と称する）により１０分間後被覆（ｐｏｓ
ｔ　ｃｏａｔ　）　Ｌ、た。ＲＩＡ緩衝液中逐次的に稀
釈したＤＮＡ試験サンプル〔Ｅｃｏ　ＲＩ消化ｐＢＲ３
２２；　ｐＢＥＵ２７　：史Ｉ消化ＲＥＭ１３；Ｍ１３
；φＸ１７４：ＲＦφＸＩ　７４　：λＤＮＡ：ｌｋｂ
のｐＢＲ３２２挿入部を含有するＭｌ　３　：　２．５
ｋｂのクラミゾイア（ｃｈｌａｍｙｄｌａ　）挿入部を
含有するＭｌ３；Ｅ、コ’）　ＲＮＡ　；子ウシ胸腺Ｄ
ＮＡ　；及びサケ精巣ＤＮＡ　）　２５μｔ２ウエルに
加え、そしてプレートを約１分間振とうした。ニックト
ランスレージ璽ンによシ調製した２５μｔの３２ｐ−ラ
ベルｐＢＲ３２２をウェルに加え、そして内容物を室温
にて１時間インキュベートした。次にウェルを空にし、
ＰＢＳ−Ｔｗｓ＠ｎで洗浄（３Ｘ２００＃ｔ）した。ウ
ェルを切り取り、そしてシンチレーシ四ンカウンターに
より読取った。結合（％　）　？、次の式を用いてｅｐ
ｍの読値から計算した。
第１Ａ図及び第１Ｂ図は、これらのＲＩＡの結果のグラ
フ〔結合（４）：稀釈〕である。表に示されるように、
１ｓＤＮＡ及びＲＮＡサンプルによる３２Ｐ−ラベルｐ
ＢＲ３２２の有意な阻止は観察されなかった。すべての
ｄｓ　ＤＮＡサンプルについて阻止か観察された。
阻止ＲＩＡはまた、上記の方法を用いて熱変性ｄｓ　Ｄ
ＮＡ及び未変性ｄｓ　ＤＮＡについても行った。変性ｄ
ａ　ＤＮＡは、ＰＢＳ中ｄａ　ＤＮＡの４０μｇ／−溶
液全１００℃にて１５分間煮沸することにより調製した
。煮沸したＤＮＡを急激に氷水中で冷却し、そして冷Ｒ
ＩＡ緩衝液により１／２ずつに稀釈した。上記のように
して、変性ＤＮＡの逐次的稀釈を行った。
ＤＮＡサンプルとして、Ｋｅｏ　ＲＩ消化ｐＢＲ３２２
（煮沸）；−４王ＲＩ消化ｐＢＲ３２２（未煮沸）；湛
呪ＲＩ消化ｐＢＥＵ　２７　（煮沸）　：　Ｅｃｏ　Ｒ
Ｉ消化ｐＢＥＵ　２７（未煮沸）；Ｍ１３０１３：及び
Ｍ１３０１１を使用した。これらの試験の結果全第２図
に示す。
上記の方法を用いる阻止ＲＩＡ’ｔ、サンプルとして種
々の合成核酸ポリマーを用いて行った。次のポリマーは
　Ｐ−ラベルｐＢＲ３２２の結合を阻止しなかった。
フ１１＋会と ポリ（ｄＡ−ｄ’ｒ　）・ポリ（ｄＡ−ｄＴ　）　ポリ
（ｄＧ）ポリ（ｄＡ−ｄＵ　）・ポリ（ｄＡ−ｄＵ）　
ポリ（ｄｃ）ポリ（ｄＩ−ｄＣ）・ポリ（ｔＨ−ｄＣ）
　ポリ（Ｉ）ポリ　（ｄＡ）・ポリ（ｄＴ）　ポリ（ｄ
Ａ）ポリ（ｄＡ）・ポリ（ｄＵ）　ポリ（ｄＴ）ポリ（
ｄＩ）・ポリ（ｄＣ） 陽性反応がポリ（ｄＧ）・ポリ（ｄＣ）、ポリ（Ｉ）・
ポリ（ｄＣ）、及びポリ（ｒＧ）・ポリ（ｄＣ）　によ
り示され、そして弱陽性反応がポＩＪ　（ｄＡ−ｄＣ）
・ポリ（ａＴ−ｄＧ）により示された。
プローブとしてｐＢＲ３２２、及びλＤＮＡの断片を含
有するＭ１３’ｉ使用した。これらのグローブは、　Ｂ
ＲＬ　Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ
　Ｍｌ３　Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ｄｉｄｅｏｒｙ　５ｅｑｕ
ｅｎｃｅｓに記載されている「シ田ットガン」Ｍ１３ク
ローニング法により調製した。
さらに、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）　（１９７７）　７４　
：　３６４２−３６４６　：及びＮａｔｕｒｅ　（Ｌｏ
ｎｄｏｎ　）　（１９７８）　２７２：３７５−３７７
に参照のこと。この方法においては１、ＢＲ３２２及び
λＴ）ＮＡを、ｍｐ９（Ｍｌ３の誘導体）の１ａａＺ遺
伝子中に制限部位を有する制限酵素を用いて制限処理す
る。ＲＦＭ　１３を同じ酵素で制限処理し、ｐＢＲ３２
２断片及びλＤＮＡ断片中に形成された末端と適合する
末端をＲＦ’Ｍ　１３に形成する。
フェノール、フェノール／　ＣＨＣＬ、、及びｃｎｃｚ
。
抽出を行い、次にエタノール沈澱を行うことにより制限
処理されたＤＮＡを消化物から分離し、そして連結する
。挿入部の存在に基（１ａａＺ遺伝子の挿入失活（ｉｎ
＋１ｅｒｔｉｏｎ　１ｎａｅｔｌｖａｔ％ｏｎ）により
１組換Ｔ）ＮＡを再環化したＲＦＭ１３から区別する。
イソプロピル−β−Ｄ−チオがラクトｆラノシドの存在
において、再環化したＲＦＭ　１３はＸ　ｇａｌ寒天を
含有するインディケータ−プレート上で青色のプラーク
を形成し、他方挿入部を含有するＭｌ３は白色（無色）
プラークを形成する。次のＭ１３プローブを作った：約
１　ｋｂのＪｈｍ　Ｈｌ−Ｐｔ竺ＩｐＢＲ３２２断片を
含有するＭ　１３　［Ｍｌ３（ｐＢＲ３２２）］：５６
５ｂｐの旦窃ａｌＩ［λ断片を含有するＭｌ　３　［Ｍ
ｌ　３　（λ＋２）〕；及び２３２２　ｂｐ（３１） のＩ（ｉｎｄ　［１λ断片を含有する［：Ｍｌ３（λす
７）〕。
挿入部を有しないＭｌ３も対照として使用した。
イムロンミクロタイタープレートウェルに、０．１Ｍ炭
酸緩衝液に稀釈したＭ１３ゾローブ（１０μ、９／ｄ）
１００μノを入れ、そして室温にて２時間インキュベー
トした。Ｍ１３’ｉ入れたウェルを対照として使用した
。ウェルを空にし、そしてＰＢＳ−Ｔｗａｓｎ（２Ｘ２
００μりで洗浄し、そして３７℃にて５分間ずつ２回、
２００μｌずつのＲＩＡ緩衝液を用いて後被覆した。ｐ
ＢＲ３２２ＤＮＡ及びλＤＮＡをそれぞれＨｅａ　ｍ及
びＨｌｎｃ　ｍで消化し、そして４３　Ｘ　Ｓａｃバイ
ブリド形成緩衝液（ｓｘｓｆｆｃ＝０．０２俤のＦｌａ
ｏｌ　、０．０２　％のポリビニルピロリドン。
０．１０％のＢＳＡ　、及び０．２５％のドデシル硫酸
ナトリウム）中に１０μ９／ｗｔｌの濃度で稀釈した。
この消化されたＤＮＡｌｌＯ分間煮沸し、そして熱（約
９０℃）　６　Ｘ　ＳＳｅ緩衝液にＩＡずつに稀釈した
。熱変性ｐＢＲ３２２サンプル及びλＤＮＡサンプルの
逐次稀釈物（１００μりをウェルに加え、グレートを密
閉し、密閉されたプレートを６８℃に（３２） て−夜インキ、ベートした。次に、ウェルを空にし、そ
してＰＨ１−Ｔｗｓａｍで洗浄（３Ｘ２００μＪ）した
。ハイブリドーマＣＨ２６−１３５２からの培養上清液
１００μｊを各ウェルに加え、そして室海にて１時間イ
ンキュベートした。ウェルを空にし、そしてＰＢＳ−Ｔ
ｗａｉｎ　（３Ｘ　２００１１１　）で洗浄した。各ウ
ェルに、アルカリホスファターゼに接合したヤギ抗マウ
スＩｇｌｏｏμ！を加え、そして１時間インキーヘート
シた。次に、１０チのジェタノールアミン含有燐酸緩衝
液中１０％のｐ−ニトロフェニルホスフェ−）１００μ
ｌを加え、そしてウェルの内容物を３７℃にて１．５時
間インキ−ベートした。
前記の方法によ、９４０５１ｍにおける吸収を読み取っ
た。
変性λＤＮＡとＭｌ３（λす２）グローブとの間の特異
的バイブリド形成は１５．６　ｎｇ／ｍ以上の変性ＤＮ
Ａにおいて観察された。変性λＤＮＡとＭｌ３（λ＋７
）との間の特異的バイブリド形成は、３．９ｎｌ／ｍ１
以上の変性ＤＮＡにおいて観察された。Ｍｌ３（λす７
）グローブにおいて観察される高い感度は、このプロー
ブの挿入部がＭｌ３（λ≠２）の挿入部よシ大きいこと
に起因すると信じられる。Ｍｌ３（ｐＢＲ３２２）プロ
ーブと変性ｐＢＲ３２２ＤＮＡとの間の−・イブリド形
成は約３．９　ｎｇ　／ｍｌ　以上の変性ＤＮＡにおい
て観察された。Ｍｌ３（ｐＢＲ３２２）と変性λＤＮＡ
との間のバイブリド形成は観察されなかった。Ｍｌ３（
λ）グローブと変性ｐＢＲ３２２ＤＮＡとの間に幾らか
の非特異的結合が生じたが、これらのプローブと変性λ
ＤＮＡとの間の吸収の読みはこれらのグローブと変性ｐ
ＢＲ３２２ＤＮＡとの間の読みよりも有意に高かった。
Ｍ１３プローブと変性ｐＢＲ３２２との間に幾らかの非
特異的結合が観察されたが、この場合もＭｌ　３　（ｐ
ＢＲ３２２）プローブとの結合の方が有意に高かった。
Ｍ１３プローブとλＤＮＡの間の非特異的バイブリド形
成は観察され々かった。
次のハイブリドーマは、特許手続のための微生物の寄託
の国際的承認に関するブタペスト条件に基いて、アメリ
カン・タイプカルチュア・コレクシ、ン、ロックビレ、
メリーランド（米ｉ１　）（ＡＴＣＣ）に寄託されてお
り、そして維持されており、そしてブタペスト条約に従
って入手可能にされている。このノ・イブリドーマの入
手可能性を、いずれかの政府の権威のもとに当該国の特
許法に従って認められた権利に反して、発明を実施する
ための許可であると解してはならない。
寄託された−・イブリドーマにはＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ
８３２９が与えられている。
【図面の簡単な説明】
第１Ａ図、１８図、及び２図はいずれも、例に記載した
阻止放射免疫測定試験の結果を示すグラフである。 以下余白 ＦＩＧ、　ＩＡ ＦＩＧ、　ＩＢ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号＠発明者
　スタンレイ　ノーマン　アメリカ合衆国。 コヘン　−、ガバーダ　ウ ＝２６５− カリフォルニア　９４０２５．ボートラバレエイ　２７
１ 手続補正帯（自発） 昭和５９年１０月ノ左目 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示 昭和５９年　特許願　第１７１０１２　号２、発明の名
称 ＤＮＡの二本鎖構造に特異的なモノクローナル抗体及び
該抗体を使用する測定方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　シタス　パロ　アルド　コーポレイション４、代
理人 （外　４　名） ５、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６、補正の内容 （１）明細書第９頁第１５〜１６行目［モノクローナル
（ＩｇＭライト鎖）抗体」　を「モノクローナル抗体（
ＩｇＭ）ライト鎖」に補正する。 （２）同第２３頁第１４行目、及び第２７頁第１０行目
ｒ　ＢＡＬＢ／（シ」をＦ　Ｂａ１ｂ　／　ｃ　Ｊに補
正する。 （３）同第３１頁第１５〜１６行目「Ｃｌｏｎｉｎｇ　
／Ｄｉｄｅｏｒｙ　Ｊを「ｃｌｏｎｉｎｇ　／　ｄｉｄ
ｅｏｘｙ　Ｊに補正する。 （２）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、天然ＤＮＡの二本鎖構造に対して排他的特異性を有
    すること全特徴とするモノクローナル抗体。 ２、ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ　８３２９から得られ
    ること全特徴とする特許請求の範囲第１項記載のモノク
    ローナル抗体、及びこの抗体の機能的同等物。 ３、　ハイツリドーマＡＴＣＣＨＢ　８３２９゜４、天
    然ＤＮＡの二本鎖構造に対して排他的特異性を有するモ
    ノクローナル抗体と二本鎖ＤＮＡとの免疫複合体。 ５、サンプル中の二本鎖ＤＮＡ分子の存在を検出する方
    法であって、該サンプルを、天然ＤＮＡの二本鎖構造に
    対して排他的特異性を有するモノクローナル抗体であっ
    てラベルに接合したものと共にインキエヘートし、そし
    てインキュベーション生（１’）　、、。 酸物中のラベルされた免疫複合体の存在を検出すること
    を特徴とする方法。 ６、ＤＮＡ配列を含有することが予想されるサンプル中
    の該ＤＮＡ配列の存在を検出する方法であって、 （、）　前記サンプルを処理することによってその中に
    含有されるＤＮＡ　′ｆ単鎖ＤＮＡに変性し；（ｂ）　
    前記の変性されたサンプル會、前記ＤＮＡ配列に対して
    実質上相補的なヌクレオチド配列を有する単鎖ＤＮＡグ
    ローブと、バイブリド形成条件下で接触せしめ： （Ｃ）得られたバイブリド形成物を、天然ＤＮＡの二本
    鎖構造に対して排他的特異性を有するモノクローナル抗
    体であってラベルに接合したものと接触せしめ；そして （ｄ）　前記ＤＮＡグローブと変性ＤＮＡ配列とのデュ
    プレックスであって前記モノクローナル抗体と結合した
    ものを含んで成る免疫複合体の段階（、）の生成物中で
    の存在を、モノクローナル抗体上のラベルを介して検出
    する； （２） こと全特徴とする方法。 ７．　ＤＮＡ配列全含有することが予想されるサンプル
    中の該ＤＮＡ配列の存在を検出する方法であって、 （、）　前記サンプルを処理することによってその中に
    含有されるＤＮＡ　’ｉ単鎖ＤＮＡに変性し；（ｂ）　
    前記の変性されたサンプルを、前記ＤＮＡ配列に対して
    実質上相補的なヌクレオ配列を有する単鎖ＤＮＡグロー
    ブと、バイブリド形成条件下で接触せしめ； （、）　得られたバイブリド形成物を、天然ＤＮＡの二
    本鎖構造に対して排他的特異性含有するモノクローナル
    抗体と接触せしめ； （ｄ）　段階（ｃ）の生成物を、前記モノクローナル抗
    体に対する抗体であってラベルされているものと接触せ
    しめ；そして （、）　前記ＤＮＡプローブと変性ＤＮＡ配列とのデー
    プレックス、該デープレックスに結合したモノクローナ
    ル抗体、及び該モノクローナル抗体に結合した該抗体に
    対する抗体であってラベルされているものを含んで成る
    免疫複合体の段階（ｄ）の生成物中での存在を、該ラベ
    ルを介して検出する；ことを特徴とする方法。 ８、二本鎖ＤＮＡ　’に含有する溶液から該二本鎖ＤＮ
    Ａ　’ｉ分離する方法であって、 （ａ）　前記溶液を、天然ＤＮＡの二本鎖構造に対して
    排他的特異性を有するモノクローナル抗体であってクロ
    マトグラフィー支持体と接合したものと接触せしめ； （ｂ）　次に前記溶液をモノクローナル抗体から分離し
    ；そして （、）　前記モノクローナル抗体から二本鎖ＤＮＡ　ｉ
    溶出する； ことを含んで成る方法。 ９、ＤＮＡ配列を含有することか予想されるサンプル中
    の該ＤＮＡ配列の存在を検出するためのキットであって
    、 （ａ）　前記ＤＮＡ配列に対して実質上相補的であるヌ
    クレオ配列を有する単鎖ＤＮＡ　グローブ；（ｂ）　天
    然ＤＮＡの二本鎖構造に対して排他的特異性を有するモ
    ノクローナル抗体；及び、（ｃ）前記モノクローナル抗
    体に対する抗体であってラベルされたもの； 全含んで成るキット。 １０、プラスミドＤＮＡ　全細菌細胞から分離するため
    のキット、であって、 （、）　前記細胞を溶解しそして該細胞中に含有されて
    いるＤＮＡ　’に変性するための緩衝剤；（ｂ）　（ａ
    ）の変性物から二本鎖ＤＮＡ　全再構成するための緩衝
    剤； （ｃ）　天然ＤＮＡの二本鎖構造に対して排他的特異性
    を有するモノクローナル抗体であってクロマトグラフィ
    ー支持体に接合したもの；及び（ｄ）　前記モノクロー
    ナル抗体から二本鎖ＤＮＡ　’ｉ溶出するための溶離剤
    ； を含むキット。
JP59171012A 1983-08-19 1984-08-18 Ｄｎａの二本鎖構造に特異的なモノクロ−ナル抗体及び該抗体を使用する測定方法 Pending JPS6072828A (ja)

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