JPH02231097A - 炭水化物含量を変化させた抗体及びその製造及び使用方法 - Google Patents
炭水化物含量を変化させた抗体及びその製造及び使用方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
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- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明の一部は、米国厚生省（Ｕ． Ｓ． Ｄｅｐａｒ
ｔｍｅｎｔｏｒ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ
Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ）の研
究補助金＾Ｉ１９０４２、Ｃ＾１６８５８、Ｃ＾２２７
３６及びＣ＾１３６９６を受けた研究の成果に負う．従
ってアメリカ合衆国政府は本発明に対してある程度の権
利をもつ。
ｔｍｅｎｔｏｒ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ
Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ）の研
究補助金＾Ｉ１９０４２、Ｃ＾１６８５８、Ｃ＾２２７
３６及びＣ＾１３６９６を受けた研究の成果に負う．従
ってアメリカ合衆国政府は本発明に対してある程度の権
利をもつ。
１哩ゑ１遣
本明細書においては、種々の参考文献をアラビア数字に
よる参照番号で本文中に挿入し、これらの参考文献の一
覧を明細書の末尾に添付した。本発明が属する分野にお
ける技術の現状を十分に説明するために、これらの刊行
物の記載内容全体が本明細書に含まれるものとする． α（１→６）デキストランに対する抗体の免疫化学的特
性が決定されたことによって、抗体結合部位の大きさ及
び形状並びに抗体と抗原との間の相互作用の性質が明ら
かになった．このためには、抗デキストラン抗体の免疫
化学的性質とそれらの一次構造とを相関させるのが有効
であった．このような研究中に、３つのモノクローナル
抗α（１→６）デキストランハイブリドーマ細胞系、１
４．６ｂ．１、５．５４．４．２４．１及び１９．２２
．１由来のｃＤＮ＾がクローニングされ（１）、Ｈ Ｍ
（Ｖ．）及びＬ鎖（ｖＬ）ノ可変部ノヌクレオチド配
列が決定されたく２）（明細書の表Ｉ参照）。
よる参照番号で本文中に挿入し、これらの参考文献の一
覧を明細書の末尾に添付した。本発明が属する分野にお
ける技術の現状を十分に説明するために、これらの刊行
物の記載内容全体が本明細書に含まれるものとする． α（１→６）デキストランに対する抗体の免疫化学的特
性が決定されたことによって、抗体結合部位の大きさ及
び形状並びに抗体と抗原との間の相互作用の性質が明ら
かになった．このためには、抗デキストラン抗体の免疫
化学的性質とそれらの一次構造とを相関させるのが有効
であった．このような研究中に、３つのモノクローナル
抗α（１→６）デキストランハイブリドーマ細胞系、１
４．６ｂ．１、５．５４．４．２４．１及び１９．２２
．１由来のｃＤＮ＾がクローニングされ（１）、Ｈ Ｍ
（Ｖ．）及びＬ鎖（ｖＬ）ノ可変部ノヌクレオチド配
列が決定されたく２）（明細書の表Ｉ参照）。
ｌｉｎｅ）遺伝子（３）をもつ同一のカッパＬ鎖を合成
し、またＨｇはそれらの相補性決定領域（．Ｃ Ｄ Ｒ
ｓ ）において１つまたは２つのアミノ酸だけが違っ
ていた．１４．６ｂ．１と比較したときに、５．５４．
４．２４．１及び１９．２２．１はＨＭの可変部（■８
）の６０位に同一のＴｈｒ→＾ｓｎアミノ酸変換を有し
ていた．５．５４．４．２４．１は更に相補性決定領域
１（ＣＤＲ１）内の３１位にもアミノ酸変換（Ｓｅｒ＝
Ｇ ｌ ｙ ）を有している．Ｈ鎖配列のアミノ酸変
換の結果として、５．５４．４．２４．１及び１９．２
２．１は、１４．６ｂ．１に比較して高分子デキストラ
ン及びイソマル■）． ５．５４．４．２４．１及び１９．２２．１のＴｈｒ−
＾ｓｎ変換によって、１４．６ｂ．１中に存在する潜在
的Ｎ一結合グリコシレーション部位（＾ｓｎ５８−Ｔｙ
ｒ５９−Ｔｈｒ６０）が欠失する．この研究及び本発明
の目的の１つは、この潜在的Ｎ結合グリコシレーション
部位がグリコシル化されるか否かを判断し、またグリコ
シルされている場合には、相補性決定領域２（ＣＤＲ２
）に対する炭水化物の付加がデキストランに対する結合
定数に影響を与えるか否かを判断することである， Ｖ
Ｈのグリコシレーションを直接証明することは難しい。
し、またＨｇはそれらの相補性決定領域（．Ｃ Ｄ Ｒ
ｓ ）において１つまたは２つのアミノ酸だけが違っ
ていた．１４．６ｂ．１と比較したときに、５．５４．
４．２４．１及び１９．２２．１はＨＭの可変部（■８
）の６０位に同一のＴｈｒ→＾ｓｎアミノ酸変換を有し
ていた．５．５４．４．２４．１は更に相補性決定領域
１（ＣＤＲ１）内の３１位にもアミノ酸変換（Ｓｅｒ＝
Ｇ ｌ ｙ ）を有している．Ｈ鎖配列のアミノ酸変
換の結果として、５．５４．４．２４．１及び１９．２
２．１は、１４．６ｂ．１に比較して高分子デキストラ
ン及びイソマル■）． ５．５４．４．２４．１及び１９．２２．１のＴｈｒ−
＾ｓｎ変換によって、１４．６ｂ．１中に存在する潜在
的Ｎ一結合グリコシレーション部位（＾ｓｎ５８−Ｔｙ
ｒ５９−Ｔｈｒ６０）が欠失する．この研究及び本発明
の目的の１つは、この潜在的Ｎ結合グリコシレーション
部位がグリコシル化されるか否かを判断し、またグリコ
シルされている場合には、相補性決定領域２（ＣＤＲ２
）に対する炭水化物の付加がデキストランに対する結合
定数に影響を与えるか否かを判断することである， Ｖ
Ｈのグリコシレーションを直接証明することは難しい。
その理由は、免疫グロブリン＾（ｈ＾）イソタイプと免
疫グロブリンＭ（ＩｙＭ）イソタイプとはいずれも夫々
のＣ．１ドメイン内部でグリコシル化され、Ｆｄ中に存
在する炭水化物がｖＨまたはＨＭの不変部（Ｃ．）に結
合するからである， Ｆｄは該抗体の化学的または酵素
的な開裂によって得られる生成物であり、抗体の可変部
のＨＭと不変部のＨ鎖とを含む。従って、３つのｖ８領
域が、ＣＨ１ドメインに炭水化物を含まないヒトＩｙＧ
４不変部に転移している．本発明においては、炭水化物
の存在が、１４．６ｂ．１のｖ，Ｉ内部で証明される。
疫グロブリンＭ（ＩｙＭ）イソタイプとはいずれも夫々
のＣ．１ドメイン内部でグリコシル化され、Ｆｄ中に存
在する炭水化物がｖＨまたはＨＭの不変部（Ｃ．）に結
合するからである， Ｆｄは該抗体の化学的または酵素
的な開裂によって得られる生成物であり、抗体の可変部
のＨＭと不変部のＨ鎖とを含む。従って、３つのｖ８領
域が、ＣＨ１ドメインに炭水化物を含まないヒトＩｙＧ
４不変部に転移している．本発明においては、炭水化物
の存在が、１４．６ｂ．１のｖ，Ｉ内部で証明される。
非グリコシル化抗体、ツニカマイシン処理した抗体及び
非処理抗体の会合定数の比較によれば、炭水化物の存在
はデキストランに対する１４．６ｂ．１の見掛け会合定
数（ａＫａ）を増加させることが判明した， Ｃ．２か
らの炭水化物の欠如は？キストランに対するａＫａを変
化させないので、結合に対して影響を与えるのはＶ■に
存在する炭水化物だけである． 炭水化物と結合する炭水化物認識部位を抗体に導入する
ことによって抗体の精製を増進し得る．その理由は、炭
水化物が抗体の外部に結合するために、レクチンによる
結合（精製）を容易に受容するからである． 本発明においては、抗体の不変部に炭水化物認識部位を
付加するかまたは欠失させることによって抗体の炭水化
物含量（ｃｏｎｔｅｎｔ）を変化させ得る．またその結
果として抗体のエフェクター機能を改質し得る．不変部
の炭水化物認識部位はまた、標識部位、例えば１２５Ｉ
のごとき放射性核種の標識部位として機能し得る． 見肌五且１ 本発明は、炭水化物が抗体の可変部の炭水化物認識部位
に結合し従って抗体に結合するような条件下に、抗体の
可変部に炭水化物認識部位を導入することを特徴とする
対応抗原に対する抗体の親和性を変える方法に係る。
非処理抗体の会合定数の比較によれば、炭水化物の存在
はデキストランに対する１４．６ｂ．１の見掛け会合定
数（ａＫａ）を増加させることが判明した， Ｃ．２か
らの炭水化物の欠如は？キストランに対するａＫａを変
化させないので、結合に対して影響を与えるのはＶ■に
存在する炭水化物だけである． 炭水化物と結合する炭水化物認識部位を抗体に導入する
ことによって抗体の精製を増進し得る．その理由は、炭
水化物が抗体の外部に結合するために、レクチンによる
結合（精製）を容易に受容するからである． 本発明においては、抗体の不変部に炭水化物認識部位を
付加するかまたは欠失させることによって抗体の炭水化
物含量（ｃｏｎｔｅｎｔ）を変化させ得る．またその結
果として抗体のエフェクター機能を改質し得る．不変部
の炭水化物認識部位はまた、標識部位、例えば１２５Ｉ
のごとき放射性核種の標識部位として機能し得る． 見肌五且１ 本発明は、炭水化物が抗体の可変部の炭水化物認識部位
に結合し従って抗体に結合するような条件下に、抗体の
可変部に炭水化物認識部位を導入することを特徴とする
対応抗原に対する抗体の親和性を変える方法に係る。
本発明はまた、炭水化物が抗体の炭水化物認識部位に結
合し従って抗体に結合するような条件下に、抗体の可変
部に炭水化物認識部位を導入することを特徴とする回収
または精製が容易な抗体の産生方法に係る． 本発明は更に、天然には可変部に炭水化物認識部位を含
まない抗体の該可変部に遺伝子操作を実施して形成され
た炭水化物認識部一位を含む天然に産生じない抗体を提
供する． 更に本発明は、抗体の不変部に天然に存在する炭水化物
認識部位を抗体の該不変部から欠失させることを特徴と
する抗体の炭水化物含量を変化させる方法を提供する． 本発明はまた、抗体の不変部に天然には存在しない炭水
化物認識部位を抗体の該不変部に付加することを特徴と
する抗体の炭水化物含量を変化させる方法を提供する． 本発明は更に、天然には不変部に炭水化物認識部位を含
む抗体の該不変部に炭水化物認識部位が存在しないこと
を特徴とする天然に産生じないヒト抗体に係る。
合し従って抗体に結合するような条件下に、抗体の可変
部に炭水化物認識部位を導入することを特徴とする回収
または精製が容易な抗体の産生方法に係る． 本発明は更に、天然には可変部に炭水化物認識部位を含
まない抗体の該可変部に遺伝子操作を実施して形成され
た炭水化物認識部一位を含む天然に産生じない抗体を提
供する． 更に本発明は、抗体の不変部に天然に存在する炭水化物
認識部位を抗体の該不変部から欠失させることを特徴と
する抗体の炭水化物含量を変化させる方法を提供する． 本発明はまた、抗体の不変部に天然には存在しない炭水
化物認識部位を抗体の該不変部に付加することを特徴と
する抗体の炭水化物含量を変化させる方法を提供する． 本発明は更に、天然には不変部に炭水化物認識部位を含
む抗体の該不変部に炭水化物認識部位が存在しないこと
を特徴とする天然に産生じないヒト抗体に係る。
更に本発明は、天然には不変部に炭水化物認識部位を含
まない抗体の該不変部に炭水化物認識部位が存在するこ
とを特徴とする天然に産生じないヒト抗体を提供する． 最後に本発明は、本発明の抗体に由来する治療剤、本発
明の抗体をコードするＤＮＡ、並びに、サンプル中の物
質の存在を検出する高感度検出方法、物質含有サンプル
から該物質を回収する方法及びかかる物質を精製する方
法、並びに、診断用検査キットを提供する． ［１へｉ基ｌユ朋 第１図は、ゲノムｖ８領域のＶ． ｃＤＮＡ４こよる置
換及びイソタイプ交換を示す。ＭＰＣＩＩ Ｈｌプロモ
ーターとリーダー配列と組換えＶ領域と■２エンハンサ
ーとを含むゲノムＥｃｏＲ Ｉフラグメント（２２）を
、ヌクレオチド２０６５〜２９の欠失したｐＢＲ３２２
誘導体のＥｃｏＲ １部位にクローニングした。抗α（
１→６）デキストランハイブリドーマ（２）から産生じ
たｃＤＮ＾を用い、Ｐｖｕ Ｉｆ −Ｐｓｔ Ｉ ｃ
ＤＮ＾フラグメントを、ＰｖｕＩＩ−Ｐｓｔｉによって
開裂した１４ＰＣ１１に挿入することによって、ＭＰＣ
ＩＩのＶ領域を抗デキストランＶ領域で置換した．最初
の４つのＶ，アミノ酸はＭＰＣＩＩに由来するが、これ
らは３種のｃＤＮ＾（２２）中で見出だされたアミノ酸
と同一である。デキストランｖ，Ｉを含むＥｃｏＲ Ｉ
７ ラグメントヲ、ｐｓＶ２−ｙｐｔ発現ベクター（
２３．４）内部のヒトｔ，，Ｃ，不変部に結合した．Ｍ
ＰＣＩＩのコード配列及びｃＤＮ＾遺伝子は夫々黒色部
分及び斜線部分で示されている．点描部分はヒトｒ，，
ｃ，不変部のコード配列を示す．但し、制限地図は実際
の縮尺ではない． 第２図は、（＾）［”Ｓ］−Ｎｅｔまたは（Ｂ）［”Ｃ
コーグルコサミン標識分泌■タのパパイン分解後に得ら
れた免疫沈降物のＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＯＳ−ＰＡＧＥ）分析ヲ示ス。１５ｕＣｉ／ｚ
１（７） ［”Ｓ］−Ｎｅｔまたは１０ｈＣｉ／ｘｉ’
の［＋４（：］−［１−グルコサミン塩酸塩（２４）の
存在下に標識した細胞の分泌物を、酵素：タンパク質比
１ ： １００のパバイン（ＳｉＨａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌＣｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｎｏ）で３７℃で４
時間分解した。ヨードアセトアミドを０．０３Ｍまで添
加することによって反応を停止させた， ＩｇＧ Ｓｏ
ｒｂ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｌｄｅｎ，
Ｍ＾》と共にインキユベーションすることによってＦｃ
分画と非分解抗体タンパク質とを沈降させた．ウサギ抗
ヒトＦａｂを用いるかまたは不溶化デキストラン（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ（登録商標） Ｇ７５）によって、上清か
ら抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）を沈降させた．サ
ンプルをβ−メルカプトエタノール（０．１５Ｍ）で還
元し、５％ＳＯＳ−ＰＡＧＥ（１６）で分析した．トラ
ンスフェクタント細胞系によって以下のＨｊｌＩが産生
され７’，−．Ｔ［｛Ｖ８、Ｖ．１９．２２．１ ：Ｔ
ＪＣ８．５、Ｖ． ５．で ５４．４．２４．１；ＴＫＣ３．２、Ｖ．１４．６ｂ．
１， 全ｓノ｝ −７ ンスフェクタントがα（１→６
）デキストラン特異的Ｌｇを合成する− ［”Ｓ］−Ｎ
ｅｔで標識し還元したＩ，をマ一カーとして使用しな。
まない抗体の該不変部に炭水化物認識部位が存在するこ
とを特徴とする天然に産生じないヒト抗体を提供する． 最後に本発明は、本発明の抗体に由来する治療剤、本発
明の抗体をコードするＤＮＡ、並びに、サンプル中の物
質の存在を検出する高感度検出方法、物質含有サンプル
から該物質を回収する方法及びかかる物質を精製する方
法、並びに、診断用検査キットを提供する． ［１へｉ基ｌユ朋 第１図は、ゲノムｖ８領域のＶ． ｃＤＮＡ４こよる置
換及びイソタイプ交換を示す。ＭＰＣＩＩ Ｈｌプロモ
ーターとリーダー配列と組換えＶ領域と■２エンハンサ
ーとを含むゲノムＥｃｏＲ Ｉフラグメント（２２）を
、ヌクレオチド２０６５〜２９の欠失したｐＢＲ３２２
誘導体のＥｃｏＲ １部位にクローニングした。抗α（
１→６）デキストランハイブリドーマ（２）から産生じ
たｃＤＮ＾を用い、Ｐｖｕ Ｉｆ −Ｐｓｔ Ｉ ｃ
ＤＮ＾フラグメントを、ＰｖｕＩＩ−Ｐｓｔｉによって
開裂した１４ＰＣ１１に挿入することによって、ＭＰＣ
ＩＩのＶ領域を抗デキストランＶ領域で置換した．最初
の４つのＶ，アミノ酸はＭＰＣＩＩに由来するが、これ
らは３種のｃＤＮ＾（２２）中で見出だされたアミノ酸
と同一である。デキストランｖ，Ｉを含むＥｃｏＲ Ｉ
７ ラグメントヲ、ｐｓＶ２−ｙｐｔ発現ベクター（
２３．４）内部のヒトｔ，，Ｃ，不変部に結合した．Ｍ
ＰＣＩＩのコード配列及びｃＤＮ＾遺伝子は夫々黒色部
分及び斜線部分で示されている．点描部分はヒトｒ，，
ｃ，不変部のコード配列を示す．但し、制限地図は実際
の縮尺ではない． 第２図は、（＾）［”Ｓ］−Ｎｅｔまたは（Ｂ）［”Ｃ
コーグルコサミン標識分泌■タのパパイン分解後に得ら
れた免疫沈降物のＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＯＳ−ＰＡＧＥ）分析ヲ示ス。１５ｕＣｉ／ｚ
１（７） ［”Ｓ］−Ｎｅｔまたは１０ｈＣｉ／ｘｉ’
の［＋４（：］−［１−グルコサミン塩酸塩（２４）の
存在下に標識した細胞の分泌物を、酵素：タンパク質比
１ ： １００のパバイン（ＳｉＨａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌＣｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｎｏ）で３７℃で４
時間分解した。ヨードアセトアミドを０．０３Ｍまで添
加することによって反応を停止させた， ＩｇＧ Ｓｏ
ｒｂ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｌｄｅｎ，
Ｍ＾》と共にインキユベーションすることによってＦｃ
分画と非分解抗体タンパク質とを沈降させた．ウサギ抗
ヒトＦａｂを用いるかまたは不溶化デキストラン（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ（登録商標） Ｇ７５）によって、上清か
ら抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）を沈降させた．サ
ンプルをβ−メルカプトエタノール（０．１５Ｍ）で還
元し、５％ＳＯＳ−ＰＡＧＥ（１６）で分析した．トラ
ンスフェクタント細胞系によって以下のＨｊｌＩが産生
され７’，−．Ｔ［｛Ｖ８、Ｖ．１９．２２．１ ：Ｔ
ＪＣ８．５、Ｖ． ５．で ５４．４．２４．１；ＴＫＣ３．２、Ｖ．１４．６ｂ．
１， 全ｓノ｝ −７ ンスフェクタントがα（１→６
）デキストラン特異的Ｌｇを合成する− ［”Ｓ］−Ｎ
ｅｔで標識し還元したＩ，をマ一カーとして使用しな。
第２Ａ図においてＴＫＣ３．２（Ｆａｂ）及Ｕ ＴＫＣ
３ ．２（７） ”ｆ ’，／ ７ ルヲ別ｆ） ＳＯ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルで分析した． 第３図は、（図示のごとき）コンカナバリン＾（Ｃｏｎ
＾》吸着及び／またはツニカマイシン処理後のウサギ抗
ヒトＩｇフラグメント不変部（Ｆｃ）抗血清で免疫沈降
した［”Ｓ］−Ｎｅｔ標識トランスフェクトーマ培養上
清の１２．５％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＯＳ−ＰＡＧＥ分
析を示す．濃度８Ｈｇ／ｘｉのツニカマイシン（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ， Ｗｅｓｔ Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）を使用し、Ｎ一結合グリコレーションを阻害
した．ツニカマイシンの存在下に［３ＳＳｌ−Ｎｅｔで
細胞を生合成的に３時間標識し、培養上清中に分泌され
たｒｙを廃棄し、ｌｐｃｏ改質Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（
ＩＮＤＨ）で細胞を２回洗浄し、新しいツニカマイシン
と［”Ｓ］−Ｎｅｔとを添加し、処理を３７℃で１晩継
続した，ＳＯＳ−ＰＡＧＥの前にサンプルを０，１５Ｎ
のβ−メルカプトエタノールで還元した．ＨＭ及びＬｉ
ｉ［の位置を示す． 第３Ａ図は分泌トランスフェクトーマ１，のＣｏｎ＾ー
セファロース吸着を示している。レーン１及び６は、そ
れソレ未処Ｆｌ’）ＴＫＣ３．２（Ｖ． １４．６ｂ．
１１びＴＨＶ８．３（Ｖ． １９．２２．１）分泌免ｊ
ｉ クロフリ７ ヲ示Ｌ、レーン２及び４は、それぞれ
非結合のＴＫＣ３．２及び結合してＣｏｎＡから溶出さ
れたＴＫ３．２を示し、レーン３及び５は、それぞれ非
結合のＴＨＶ８．２及び結合してＣｏｎ＾セファロース
から溶出されたＴＨＶ８．２を示す． 第３Ｂ図は、Ｃｏｎ＾−セファロース吸着を用いた場合
及び用いない場合のツニカマイシン処理細胞の上清を示
す．レーン１及び２は、それぞれツニ力マイシン処理ノ
前及び後ノＴＫＣ３．２（Ｖ． １４．６ｂ．１）を示
し、レーン３及び４は、それぞれツニカマイシン処理ｃ
Ｑ前及びｆ＆（７）ＴＨＶ８．３（Ｖ． １９．２２．
１）を示し、レーン５及び６は、それぞれツニカマイシ
ン処理したＴＫＣ３．２ Ｃｏｎ＾上清及び溶出液を示
し、レーン７及び８は、それぞれツニカマイシン処理し
たＴＨＶ８．３ Ｃｏｎ＾上清及び溶出液を示す．第４
図は、可溶性デキストランによるデキストラン被覆ＥＬ
ＩＩＳ＾プレートに対する抗体結合の阻害を示す．抗体
結合の％（縦軸）をデキストランインヒビター濃度（横
軸》に対してプロットする．プレートを２０１ｇ／ｗｌ
のデキストランで被覆する．天然抗体及びツニカマイシ
ン処理によって非グリコシル化した抗体を使用した。ツ
ニカマイシン処理したＴκＣ３．２中に存在する微量の
グリコシル化ＩｇをＣｏｎ＾セファロースに吸着させる
ことによって除去した． Ｎｉｅｔｏ等（２５）の方法を用いて見掛け結合定数を
決定した。要約すると、抗体に対する会゜合定数は抗体
結合部位の１７２を占拠するのに必要な遊離リガンド濃
度の逆数として定義される．固相抗原で被覆されたプレ
ート上で一定量の抗体＾ｂが増加量の遊離リガンドと反
応するとき、プレートに対する結合の５０％阻害を生起
する遊離リガンド濃度の逆数は固有Ｋａ、即ち見掛け親
和性定数（ａＫａ）の関数である． 定数の計算は、５０％結合点の近傍で直線であると仮定
した阻害曲線を内挿することによって行なう， ａＫａ
値を測定するために以下の実験条件を使用した， Ｃｏ
ｒｎｉｎｇマイクロタイタープレートを０．５１Ｊｇ／
ＩＩ１または２０ＩＪｇ７ｍｌのデキストランＢ５１２
（夫々高親和性及び低親和性アッセイ条件）で被覆した
。
３ ．２（７） ”ｆ ’，／ ７ ルヲ別ｆ） ＳＯ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルで分析した． 第３図は、（図示のごとき）コンカナバリン＾（Ｃｏｎ
＾》吸着及び／またはツニカマイシン処理後のウサギ抗
ヒトＩｇフラグメント不変部（Ｆｃ）抗血清で免疫沈降
した［”Ｓ］−Ｎｅｔ標識トランスフェクトーマ培養上
清の１２．５％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＯＳ−ＰＡＧＥ分
析を示す．濃度８Ｈｇ／ｘｉのツニカマイシン（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ， Ｗｅｓｔ Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）を使用し、Ｎ一結合グリコレーションを阻害
した．ツニカマイシンの存在下に［３ＳＳｌ−Ｎｅｔで
細胞を生合成的に３時間標識し、培養上清中に分泌され
たｒｙを廃棄し、ｌｐｃｏ改質Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（
ＩＮＤＨ）で細胞を２回洗浄し、新しいツニカマイシン
と［”Ｓ］−Ｎｅｔとを添加し、処理を３７℃で１晩継
続した，ＳＯＳ−ＰＡＧＥの前にサンプルを０，１５Ｎ
のβ−メルカプトエタノールで還元した．ＨＭ及びＬｉ
ｉ［の位置を示す． 第３Ａ図は分泌トランスフェクトーマ１，のＣｏｎ＾ー
セファロース吸着を示している。レーン１及び６は、そ
れソレ未処Ｆｌ’）ＴＫＣ３．２（Ｖ． １４．６ｂ．
１１びＴＨＶ８．３（Ｖ． １９．２２．１）分泌免ｊ
ｉ クロフリ７ ヲ示Ｌ、レーン２及び４は、それぞれ
非結合のＴＫＣ３．２及び結合してＣｏｎＡから溶出さ
れたＴＫ３．２を示し、レーン３及び５は、それぞれ非
結合のＴＨＶ８．２及び結合してＣｏｎ＾セファロース
から溶出されたＴＨＶ８．２を示す． 第３Ｂ図は、Ｃｏｎ＾−セファロース吸着を用いた場合
及び用いない場合のツニカマイシン処理細胞の上清を示
す．レーン１及び２は、それぞれツニ力マイシン処理ノ
前及び後ノＴＫＣ３．２（Ｖ． １４．６ｂ．１）を示
し、レーン３及び４は、それぞれツニカマイシン処理ｃ
Ｑ前及びｆ＆（７）ＴＨＶ８．３（Ｖ． １９．２２．
１）を示し、レーン５及び６は、それぞれツニカマイシ
ン処理したＴＫＣ３．２ Ｃｏｎ＾上清及び溶出液を示
し、レーン７及び８は、それぞれツニカマイシン処理し
たＴＨＶ８．３ Ｃｏｎ＾上清及び溶出液を示す．第４
図は、可溶性デキストランによるデキストラン被覆ＥＬ
ＩＩＳ＾プレートに対する抗体結合の阻害を示す．抗体
結合の％（縦軸）をデキストランインヒビター濃度（横
軸》に対してプロットする．プレートを２０１ｇ／ｗｌ
のデキストランで被覆する．天然抗体及びツニカマイシ
ン処理によって非グリコシル化した抗体を使用した。ツ
ニカマイシン処理したＴκＣ３．２中に存在する微量の
グリコシル化ＩｇをＣｏｎ＾セファロースに吸着させる
ことによって除去した． Ｎｉｅｔｏ等（２５）の方法を用いて見掛け結合定数を
決定した。要約すると、抗体に対する会゜合定数は抗体
結合部位の１７２を占拠するのに必要な遊離リガンド濃
度の逆数として定義される．固相抗原で被覆されたプレ
ート上で一定量の抗体＾ｂが増加量の遊離リガンドと反
応するとき、プレートに対する結合の５０％阻害を生起
する遊離リガンド濃度の逆数は固有Ｋａ、即ち見掛け親
和性定数（ａＫａ）の関数である． 定数の計算は、５０％結合点の近傍で直線であると仮定
した阻害曲線を内挿することによって行なう， ａＫａ
値を測定するために以下の実験条件を使用した， Ｃｏ
ｒｎｉｎｇマイクロタイタープレートを０．５１Ｊｇ／
ＩＩ１または２０ＩＪｇ７ｍｌのデキストランＢ５１２
（夫々高親和性及び低親和性アッセイ条件）で被覆した
。
西洋ワサビベルオキシダーゼで標識した抗ヒトｈＧを用
い、結合した免疫グロブリンＩ，を定量した．第５図は
、２つの１ライマーの特定部位の突然変異誘発の概略全
体図である， ｔｇｃ不変部エキソンを含むＳａｌ Ｉ
−ＢａｍＨ Ｉフラグメントを８１３ファージＭ１３
ｍｐｌ９のポリリンカ一部位にクローニングする．組換
えファージのポジティブストランドＤＮＡ鋳型を標準ポ
リエチレングリコール法で調製する．突然変異を誘発す
るために２つのプライマー、即ち８１３配列決定ブライ
マーとコンセンサスグリコシレーション配列中に１つの
不適正ヌクレオチドをもつ５゛一末端リン酸化突然変異
誘発プライマーとを使用する。両方のプライマーを同時
に鋳型にアニーリングする。プライマーの伸長及び結合
の後で突然変異体／野性型のギャップを有する（ｇａｐ
ｐｅｄ）へテロ二重鎖を用いて大腸菌宿主ＪＭ１０９を
形質転換する． １且ｌ且』 本発明は、炭水化物が抗体の炭水化物認識部位に結合す
る従って抗体に結合するような条件下に、１つ以上の炭
水化物認識部位を抗体の可変部に導入することを特徴と
する対応抗原に対する抗体の親和性を変える方法に係る
． 本明細書における「抗体』なる用語は、ヒト抗体及びヒ
ト以外の抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体及びポ
リクローナル抗体のごときすべてのタイプの抗体、並び
にＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉｇ＾、ＩｇＤ及びＩｇＥのごとき
主要クラスのヒト体液性免疫グロブリンを含むすべての
抗体アイソタイプを意味する。本発明の１つの実施態様
においては、抗体がモノクローナル抗体であり、別の実
施態様においては、抗体がヒト抗体である． 対応抗原に対する抗体の親和性は当業者に公知の方法で
測定できる．抗体の親和性即ち結合を測定し得る方法の
いくつかの例を以下に示す．抗体の会合定数は、抗体結
合部位の１７２を占拠するために必要な遊離リガンド濃
度の逆数として定義されている．固相抗原で被覆された
プレート上で一定量の抗体が増加量の遊離リガンドと反
応するとき、プレートに対する結合の５０％阻害を生起
する遊離リガンド濃度の逆数が固有のＫａ、即ち見掛け
の親和性定数（ａＫａ）の関数である．定数の計算は、
５０％結合点の近傍で直線であると仮定した阻害曲線を
内拝することによって行なわれる．本文中で使用される
炭水化物認識部位なる表現は、炭水化物を抗体に特異的
に結合させるような抗体中の特異的アミノ酸配列を意味
する．現在最もよく知られており本発明の教示において
最も有用なかかる炭水化物認識部位は、アミノ酸配列：
＾ｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ 〔式中、Ｘは任意のアミノ酸、Ｔｈｒ／Ｓｅｒはトレオ
ニンまたはセリン〕である，１つまたは複数のかかる部
位は、本発明が属する分野で当業者に公知の方法を用い
て、抗体の可変部に導入され得る．例えば、ｒｌｎ Ｖ
ｉ工ｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔ ＤＮ＾：＾Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ＋Ｊ．
Ｄ． Ｗａｔｓｏｎ等、Ｌ Ｉ｛．Ｆｒｅｅｍａｎａ
ｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８
３、ｃｈａｐｔｅｒ８、ｐｐ．１０６〜１１６を参照す
るとよい．同じく当業者に公知の特に有用な形態のｉｎ
ｖｉｔｒｏ突然変異誘発は、特定部位の突然変異誘発
である．これに関してはＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮ
＾：＾Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅに記載されており、後
出の実験の詳細な説明の項でいくつかの実施例を記載す
る． 従って、炭水化物認識部位は、所望の＾ｓｎ−Ｘ−Ｔｈ
ｒ／Ｓｅｒ配列が得られるようにアミノ酸配列を修正ま
たは突然変異させることによって抗体に導入され得る。
い、結合した免疫グロブリンＩ，を定量した．第５図は
、２つの１ライマーの特定部位の突然変異誘発の概略全
体図である， ｔｇｃ不変部エキソンを含むＳａｌ Ｉ
−ＢａｍＨ Ｉフラグメントを８１３ファージＭ１３
ｍｐｌ９のポリリンカ一部位にクローニングする．組換
えファージのポジティブストランドＤＮＡ鋳型を標準ポ
リエチレングリコール法で調製する．突然変異を誘発す
るために２つのプライマー、即ち８１３配列決定ブライ
マーとコンセンサスグリコシレーション配列中に１つの
不適正ヌクレオチドをもつ５゛一末端リン酸化突然変異
誘発プライマーとを使用する。両方のプライマーを同時
に鋳型にアニーリングする。プライマーの伸長及び結合
の後で突然変異体／野性型のギャップを有する（ｇａｐ
ｐｅｄ）へテロ二重鎖を用いて大腸菌宿主ＪＭ１０９を
形質転換する． １且ｌ且』 本発明は、炭水化物が抗体の炭水化物認識部位に結合す
る従って抗体に結合するような条件下に、１つ以上の炭
水化物認識部位を抗体の可変部に導入することを特徴と
する対応抗原に対する抗体の親和性を変える方法に係る
． 本明細書における「抗体』なる用語は、ヒト抗体及びヒ
ト以外の抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体及びポ
リクローナル抗体のごときすべてのタイプの抗体、並び
にＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉｇ＾、ＩｇＤ及びＩｇＥのごとき
主要クラスのヒト体液性免疫グロブリンを含むすべての
抗体アイソタイプを意味する。本発明の１つの実施態様
においては、抗体がモノクローナル抗体であり、別の実
施態様においては、抗体がヒト抗体である． 対応抗原に対する抗体の親和性は当業者に公知の方法で
測定できる．抗体の親和性即ち結合を測定し得る方法の
いくつかの例を以下に示す．抗体の会合定数は、抗体結
合部位の１７２を占拠するために必要な遊離リガンド濃
度の逆数として定義されている．固相抗原で被覆された
プレート上で一定量の抗体が増加量の遊離リガンドと反
応するとき、プレートに対する結合の５０％阻害を生起
する遊離リガンド濃度の逆数が固有のＫａ、即ち見掛け
の親和性定数（ａＫａ）の関数である．定数の計算は、
５０％結合点の近傍で直線であると仮定した阻害曲線を
内拝することによって行なわれる．本文中で使用される
炭水化物認識部位なる表現は、炭水化物を抗体に特異的
に結合させるような抗体中の特異的アミノ酸配列を意味
する．現在最もよく知られており本発明の教示において
最も有用なかかる炭水化物認識部位は、アミノ酸配列：
＾ｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ 〔式中、Ｘは任意のアミノ酸、Ｔｈｒ／Ｓｅｒはトレオ
ニンまたはセリン〕である，１つまたは複数のかかる部
位は、本発明が属する分野で当業者に公知の方法を用い
て、抗体の可変部に導入され得る．例えば、ｒｌｎ Ｖ
ｉ工ｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔ ＤＮ＾：＾Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ＋Ｊ．
Ｄ． Ｗａｔｓｏｎ等、Ｌ Ｉ｛．Ｆｒｅｅｍａｎａ
ｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８
３、ｃｈａｐｔｅｒ８、ｐｐ．１０６〜１１６を参照す
るとよい．同じく当業者に公知の特に有用な形態のｉｎ
ｖｉｔｒｏ突然変異誘発は、特定部位の突然変異誘発
である．これに関してはＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮ
＾：＾Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅに記載されており、後
出の実験の詳細な説明の項でいくつかの実施例を記載す
る． 従って、炭水化物認識部位は、所望の＾ｓｎ−Ｘ−Ｔｈ
ｒ／Ｓｅｒ配列が得られるようにアミノ酸配列を修正ま
たは突然変異させることによって抗体に導入され得る。
配列がアスパラギンまたはトレオニンもしくはセリンを
有するときは、直後の位置の２つのアミノ酸を除去し、
所望の＾ｓｎ − Ｘ − Ｔｈｒ／Ｓｅｒを得るため
の対応するトレオニンもしくはセリンまたはアスパラギ
ンを夫々導入すると、炭水化物を抗体に結合させ得るよ
うな抗体が得られる．炭水化物認識部位は抗体の可変部
のいかなる場所に導入されてもよいが、その導入が抗体
の抗原結合能を破壊しないという条件を充たす必要があ
る．現在では、炭水化物認識部位が第２超可変部または
相補性決定領域（ＣＤＲ２）として知られる可変領域の
部分に導入されるのが好ましい。従って本発明は、抗体
の第２超可変部に炭水化物認識部位を導入することによ
って対応抗原に対する抗体の親和性を変える方法を提供
する。別の実施態様によれば本発明方法は、炭水化物認
識部位を通常は含まない抗体の可変部に炭水化物認識部
位を導入することによって抗体の親和性を変える。炭水
化物認識部位を抗体に導入する多数の方法が存在してお
り、これらの方法は本発明が属する分野の当業者に公知
である．例えば、抗体の可変部をコードするＯＮ八の特
定部位の突然変異誘発によって炭水化物認識部位を抗体
の可変部に導入し得る．本発明はまた、炭水化物が抗体
の炭水化物認識部位に結合しその結果としてマウスまた
はヒトのモノクローナルまたはポリクローナル抗体のご
とき抗体に結合するような条件下に抗体の可変部に炭水
化物認識部位を導入することを特徴とする回収または精
製容易な抗体の産生方法を提供する．この場合にも、炭
水化物認識部位は、通常は炭水化物認識部位を含まない
抗体の可変部、特に抗体の第２超可変部に導入されるの
が好ましい。得られる抗体に炭水化物が結合するような
条件下での上記のごとき導入は、当業者に公知の方法を
用いて行なうことができる。本発明のこの実施Ｒ様にお
いては現状では好ましくは、抗体の可変部をコードする
ＤＮＡの特定部位の突然変異誘発によって炭水化物認識
部位が抗体の可変部に導入される。
有するときは、直後の位置の２つのアミノ酸を除去し、
所望の＾ｓｎ − Ｘ − Ｔｈｒ／Ｓｅｒを得るため
の対応するトレオニンもしくはセリンまたはアスパラギ
ンを夫々導入すると、炭水化物を抗体に結合させ得るよ
うな抗体が得られる．炭水化物認識部位は抗体の可変部
のいかなる場所に導入されてもよいが、その導入が抗体
の抗原結合能を破壊しないという条件を充たす必要があ
る．現在では、炭水化物認識部位が第２超可変部または
相補性決定領域（ＣＤＲ２）として知られる可変領域の
部分に導入されるのが好ましい。従って本発明は、抗体
の第２超可変部に炭水化物認識部位を導入することによ
って対応抗原に対する抗体の親和性を変える方法を提供
する。別の実施態様によれば本発明方法は、炭水化物認
識部位を通常は含まない抗体の可変部に炭水化物認識部
位を導入することによって抗体の親和性を変える。炭水
化物認識部位を抗体に導入する多数の方法が存在してお
り、これらの方法は本発明が属する分野の当業者に公知
である．例えば、抗体の可変部をコードするＯＮ八の特
定部位の突然変異誘発によって炭水化物認識部位を抗体
の可変部に導入し得る．本発明はまた、炭水化物が抗体
の炭水化物認識部位に結合しその結果としてマウスまた
はヒトのモノクローナルまたはポリクローナル抗体のご
とき抗体に結合するような条件下に抗体の可変部に炭水
化物認識部位を導入することを特徴とする回収または精
製容易な抗体の産生方法を提供する．この場合にも、炭
水化物認識部位は、通常は炭水化物認識部位を含まない
抗体の可変部、特に抗体の第２超可変部に導入されるの
が好ましい。得られる抗体に炭水化物が結合するような
条件下での上記のごとき導入は、当業者に公知の方法を
用いて行なうことができる。本発明のこの実施Ｒ様にお
いては現状では好ましくは、抗体の可変部をコードする
ＤＮＡの特定部位の突然変異誘発によって炭水化物認識
部位が抗体の可変部に導入される。
抗体、特にモノクローナル抗体の使用に関連した制約の
１つは、抗体を変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）させずに
高収率及び高純度で抗体を回収できる技術にある．抗体
の露出した可変部に炭水化物を導入することができれば
、例えばレクチンを用いた吸着クロマトグラフィーが使
用できるので、かかる回収が極めて容易になるであろう
． 本発明は、天然には可変部に炭水化物認識部位を含まな
い抗体の可変部に遺伝子操作を実施して形成された炭水
化物認識部位が含まれることを特徴とする天然には産生
じない抗体、例えばマウスもしくはヒトのモノクローナ
ル抗体またはヒトのポリクローナル抗体に係る．１つの
実施態様において抗体は、対応抗原に対する親和性が増
強されていることを特徴とする．抗体は更に、抗体の可
変部例えば抗体の第２超可変部に導入されるかまたは遺
伝子操作を実施して形成された炭水化物認識部位に結合
した炭水化物を含んでもよい．本発明はまた、検出可能
なマーカーによって標識された本発明の抗体に係る．例
えば抗体は、その構造を含む１つ以上のアミノ酸または
炭水化物に結合または組み込まれた検出可能マーカーを
有してもよい．かかるマーカーは発色団、蛍光団、また
は放射性部分例えば１２５１のごとき任意の検出可能な
分子または試薬であってもよい．検出可能なマーカーは
また、検出可能な生成物を生成する反応を触媒する酵素
、化学発光性触媒、ビオチンでもよく、または核磁気共
鳴によって検出され得る金属イオンでもよい．別の適当
な検出可能なマーカーは、酵素例えば西洋ワサビペルオ
キシダーゼでＩＫｉ！した特異的タンパク質に結合し得
るリガンドである．適当なリガンドの１つの例は、アビ
ジンまたはストレプトアビジンに結合するビオチンであ
る．別の適当なリガンドはカタラーゼのアボ酵素部分に
結合するヘミン分子である。かかる検出可能なマーカー
を抗体に結合または導入しその結果として標識された抗
体を使用する方法は当業者に公知である． 更に別の実施態様によれば本発明は、本発明の抗体が結
合した固体担体を提供する．固体担体は、クロマトグラ
フイー分離力ラムの形態でもよく、または診断用ベッド
またはプレート等でもよい．固体担体は例えば珪質材料
、セルロース性材料、プラスチック材料、調整多孔ガラ
ス、セファロース、プロムシアンーもしくはＤＢＨによ
り活性化された紙、またはニトロセルロースから成る．
別の特徴によれば本発明は、抗体の可変部に１つ以上の
炭水化物認識部位を炭水化物が部位に結合し従って抗体
に結合するような条件下に導入する。本発明は更に、か
かる抗体をコードするデオキシリボ核酸、ＤＮＡに係る
．特異的抗体、即ち特異的アミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡの決定及び産生方法は当業界で公知である。
１つは、抗体を変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）させずに
高収率及び高純度で抗体を回収できる技術にある．抗体
の露出した可変部に炭水化物を導入することができれば
、例えばレクチンを用いた吸着クロマトグラフィーが使
用できるので、かかる回収が極めて容易になるであろう
． 本発明は、天然には可変部に炭水化物認識部位を含まな
い抗体の可変部に遺伝子操作を実施して形成された炭水
化物認識部位が含まれることを特徴とする天然には産生
じない抗体、例えばマウスもしくはヒトのモノクローナ
ル抗体またはヒトのポリクローナル抗体に係る．１つの
実施態様において抗体は、対応抗原に対する親和性が増
強されていることを特徴とする．抗体は更に、抗体の可
変部例えば抗体の第２超可変部に導入されるかまたは遺
伝子操作を実施して形成された炭水化物認識部位に結合
した炭水化物を含んでもよい．本発明はまた、検出可能
なマーカーによって標識された本発明の抗体に係る．例
えば抗体は、その構造を含む１つ以上のアミノ酸または
炭水化物に結合または組み込まれた検出可能マーカーを
有してもよい．かかるマーカーは発色団、蛍光団、また
は放射性部分例えば１２５１のごとき任意の検出可能な
分子または試薬であってもよい．検出可能なマーカーは
また、検出可能な生成物を生成する反応を触媒する酵素
、化学発光性触媒、ビオチンでもよく、または核磁気共
鳴によって検出され得る金属イオンでもよい．別の適当
な検出可能なマーカーは、酵素例えば西洋ワサビペルオ
キシダーゼでＩＫｉ！した特異的タンパク質に結合し得
るリガンドである．適当なリガンドの１つの例は、アビ
ジンまたはストレプトアビジンに結合するビオチンであ
る．別の適当なリガンドはカタラーゼのアボ酵素部分に
結合するヘミン分子である。かかる検出可能なマーカー
を抗体に結合または導入しその結果として標識された抗
体を使用する方法は当業者に公知である． 更に別の実施態様によれば本発明は、本発明の抗体が結
合した固体担体を提供する．固体担体は、クロマトグラ
フイー分離力ラムの形態でもよく、または診断用ベッド
またはプレート等でもよい．固体担体は例えば珪質材料
、セルロース性材料、プラスチック材料、調整多孔ガラ
ス、セファロース、プロムシアンーもしくはＤＢＨによ
り活性化された紙、またはニトロセルロースから成る．
別の特徴によれば本発明は、抗体の可変部に１つ以上の
炭水化物認識部位を炭水化物が部位に結合し従って抗体
に結合するような条件下に導入する。本発明は更に、か
かる抗体をコードするデオキシリボ核酸、ＤＮＡに係る
．特異的抗体、即ち特異的アミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡの決定及び産生方法は当業界で公知である。
本発明はまた、抗体、例えばマウスもしくはヒトのモノ
クローナルまたはポリクローナル抗体の炭水化物含量を
変化させる方法を提供する．この方法は、抗体の不変部
に天然に存在する１つまたは複数の炭水化物認識部位を
抗体の該不変部から欠失させることを含む。前記のごと
く本発明で有用な炭水化物認識部位はアミノ酸配列 ＾ｓｎ − Ｘ − Ｔｈｒ／Ｓｅｒ 〔Ｘは任意のアミノ酸でよ（ Ｔｈｒ／Ｓｅｒはトレオ
ニンまたはセリンを示す〕を有する。
クローナルまたはポリクローナル抗体の炭水化物含量を
変化させる方法を提供する．この方法は、抗体の不変部
に天然に存在する１つまたは複数の炭水化物認識部位を
抗体の該不変部から欠失させることを含む。前記のごと
く本発明で有用な炭水化物認識部位はアミノ酸配列 ＾ｓｎ − Ｘ − Ｔｈｒ／Ｓｅｒ 〔Ｘは任意のアミノ酸でよ（ Ｔｈｒ／Ｓｅｒはトレオ
ニンまたはセリンを示す〕を有する。
かかる部位の欠失は、当業界で公知の方法、例えば、抗
体のかかる不変部をコードするＤＮＡの特定部位の突然
変異誘発によって生起され、アスパラギンまたはトレオ
ニンもしくはセリンを別のアミノ酸で置換して、炭水化
物認識部位を欠失し、抗体に対する炭水化物の結合を阻
害する。
体のかかる不変部をコードするＤＮＡの特定部位の突然
変異誘発によって生起され、アスパラギンまたはトレオ
ニンもしくはセリンを別のアミノ酸で置換して、炭水化
物認識部位を欠失し、抗体に対する炭水化物の結合を阻
害する。
本発明は、抗体の不変部に天然には存在しない炭水化物
認識部位を抗体の該不変部に付加することを特徴とする
炭水化物含量を変化させる方法を提供する．本発明はま
た、このようにして産生された改質抗体を提供する。抗
体に対する炭水化物認識部位の付加も、抗体の該不変部
をコードするＤＮＡの特定部位の突然変異誘発によって
行なわれる． 本発明は更に、抗体の生物学的エフェクター機能を改質
する方法を提供する。この方法では、抗体の不変部に天
然には存在しない１つまたは複数の炭水化物認識部位を
抗体の該不変部から欠失させることによって抗体の炭水
化物含量を変化させクター機能は、Ｆｃレセプターに対
する結合能及び補体活性化能のごとき機能である． 本発明によって炭水化物認識部位を抗体の特定領域例え
ば可変部または不変部に導入または欠失させる場合、完
全抗体遺伝子を構築するために改質ＤＮＡまたは遺伝子
操作を実施して形成されたＤＮＡを使用する。次に、遺
伝子即ちＤＮＡ配列を発現ベクターに導入し、適当な細
胞環境で発現させる．炭水化物を含有する抗体分子の場
合には真核細胞が好ましい．炭水化物の欠如した抗体分
子の場合には真核細胞または原核細胞のいずれを使用し
てもよい．本発明に関心をもつ当業者は、かかるＤＮＡ
配列または遺伝子を楕築するための公知の技術、発現ベ
クターに導入する方法、有用なベクターの種類、適当な
細胞環境における発現の条件及び手順を容易に選択でき
よう． 本発明はまた、天然には不変部に炭水化物認識部位を含
む抗体の該不変部に炭水化物認識部位が存在しないこと
を特徴とする天然に産生しないヒト抗体、例えばヒトモ
ノクローナル抗体に係る．本発明は更に、かかる抗体を
コードするＤＮＡを提供する． 本発明はまた、天然には不変部に炭水化物認識部位を含
まない抗体の該不変部に炭水化物認識部位が存在してい
ることを特徴とする天然に産生じないヒト抗体、例えば
ヒトモノクローナル抗体に係る．本発明は更に、かかる
抗体をコードするＤＮＡを提供する． ヒト抗体、例えばヒトモノクローナル抗体は、かかる炭
水化物認識部位に結合した炭水化物を含んでいてもよく
、本発明の１つの実施態様においては、例えばリジンＡ
頒、＋２５７のごとき放射性核種、等の抗癌剤のごとき
治療用リガンド、またはその他の治療剤がかかる抗体に
結合したががる炭水化物に結合しているときに治療剤と
して使用され得る．かかる治療剤は、例えば免疫系異常
またはその他の疾病状態を治療するために使用され得る
．また別の実施悪様においては、このヒト抗体を標識し
てもよい、即ち抗体に結合したががる炭水化物に検出可
能マーカーのごときラベルを結合してもよい． 本発明は、抗体の不変部に天然には存在する炭水化物認
識部位を抗体の不変部がら欠失させることによって抗体
の炭水化物含量を変化させる本発明の方法によって調製
された改質抗体及びかかる抗体をコードするＤＮＡに係
る． 本発明はまた、ヒトの生物学的体液サンプルのごときサ
ンプル中の物質または分析物（ａｎａｌｙｔｅ）の存在
を検出するための、サンプルと該物質に対する抗体とを
接触させる高感度検出方法を提供する．抗体は検出可能
マーカー、例えば発色団、蛍光団または放射性部分によ
って標識されてもよい．抗体は前記のごとく、天然には
可変部に炭水化物認識部位を含まない抗体の該可変部に
遺伝子操作を実施して形成された炭水化物認識部位を含
む天然には産生じない抗体である．この方法においては
、サンプル中に存在する物質または分析物と抗体とが検
出可能な複合体を形成するような条件下に該物質と該抗
体とを接触させ、次いで複合体の存在を検出し、これに
基づいて物質の存在を検出する．１つの実施態様におい
ては、このように使用される抗体が前記タイプの固体担
体に結合されている． サンプル中の物質または分析物の量または濃度を検定す
るためには、形成された複合体の量を測定し、この量に
基づいて物質または分析物の量または濃度を測定し、例
えば既知量の物質または分析物と比較する．サンプル中
の物質と該物質に対する抗体とによって形成された複合
体の量または濃度を定量的に測定するためには、検出可
能部分の同定に基づく公知技術の方法を使用し得る．例
えば、検出可能部分（ｍｏｉｅｔｙ）が放射性のとき、
リガンドシンチレーションカウンターを使用し得る．検
出可能部分が標準アッセイにおける西洋ワサビペルオキ
シダーゼのごとき酵素のとき、分光光度計を使用し得る
．検出可能部分が蛍光性のとき、蛍光定量計を使用し得
る．特に有用な方法は、蛍光物質で賦活した細胞を選別
する方法である．この方法は便利、迅速及び正確である
． 本発明はまた、物質含有サンプルから該物質を回収する
ための、サンプルと該物質に対する抗体とを接触させる
ことを特徴とする物質回収方法を提供する．抗体は前記
のごとく、天然には可変部に炭水化物認識部位を含まな
い抗体の可変部に遺伝子操作を実施して形成された炭水
化物認識部位を含む天然には産生じない抗体である．サ
ンプル中の物質と抗体とが複合体を形成するような適当
な条件下に該物質と該抗体とを接触させる。次いで得ら
れた複合体から物質を回収する．別の見方をすればかか
る方法は、カラムに充填された固体担体に抗体を結合す
るクロマトグラフィー法である． 本発明はまた、物質が精製形態で回収される条件下に前
記方法を用いて該物質含有サンプルから物質を回収する
ことを特徴とする物質の精製方法を提供する． 本発明は更に、前記のごとき抗体、即ち、天然には可変
部に炭水化物認識部位を含まない抗体の該可変部に遺伝
子操作を実施して形成された炭水化物認識部位を含む天
然に産生じない抗体を含む診断用キットに係る．更に本
発明は、例えば発色団、蛍光団または放射性部分のごと
き検出可能マーカーによって標識された前記のごとき抗
体を含む診断用キットを提供する．本発明の新規な抗体
と物質との複合体形成に基づいて、サンプル中の該物質
の存在を検出する種々の方法及び該物質含有サンプルか
ら物質を回収する種々の方法を詳細に後述する． 本発明で提供される方法に有用なアッセイのタイプは本
発明が属する分野の当業者には公知である．かかるアッ
セイとして例えば、ラジオイムノアッセイのごとき液相
アッセイ、ＥＬＩＳ＾（Ｅｎｚｙ＋＊ｅＬｉｎｋｅｄ
Ｉｍｍｕｎｏｓｏｂｅｒｔ Ａｓｓａｙｓ）、サンドイ
ッチアッセイまたはＩＲＭ屓１ｓ＋ｍｕｎｏ Ｒａｄｉ
ｏ−Ｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ）のごとき固相アッセイ
がある．後者のアッセイに関しては、特に有用なイムノ
メトリックアッセイは、Ｄａｖｉｄ等の米国特許第４，
３７６，１１０号に開示された「２部位」またはｒサン
ドイッチ」イムノメトリックアッセイ法である。該特許
の記載内容は本明細書に含まれるものとする．アッセイ
時間、ｐＨ、温度、アッセイのイオン強度のごときアッ
セイ条件も当業者に公知である．公知のアッセイ及びそ
の条件に関する概要は、Ｌａｂｏｒａ’Ｌｏｒ Ｔｅ
ｃｈｎｉ ｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
，ｖｏｌ．１３、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＾ｎｔｉ
ｂｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ 、＾． Ｈ． Ｃ
ａｍｐｂｅｌｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．．Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ， １９８６、ｃｈａｐｔｅｒ２、“＾ｓｓａｙＴ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ， ｐｐ．３３〜６５に記載され
ている。
認識部位を抗体の該不変部に付加することを特徴とする
炭水化物含量を変化させる方法を提供する．本発明はま
た、このようにして産生された改質抗体を提供する。抗
体に対する炭水化物認識部位の付加も、抗体の該不変部
をコードするＤＮＡの特定部位の突然変異誘発によって
行なわれる． 本発明は更に、抗体の生物学的エフェクター機能を改質
する方法を提供する。この方法では、抗体の不変部に天
然には存在しない１つまたは複数の炭水化物認識部位を
抗体の該不変部から欠失させることによって抗体の炭水
化物含量を変化させクター機能は、Ｆｃレセプターに対
する結合能及び補体活性化能のごとき機能である． 本発明によって炭水化物認識部位を抗体の特定領域例え
ば可変部または不変部に導入または欠失させる場合、完
全抗体遺伝子を構築するために改質ＤＮＡまたは遺伝子
操作を実施して形成されたＤＮＡを使用する。次に、遺
伝子即ちＤＮＡ配列を発現ベクターに導入し、適当な細
胞環境で発現させる．炭水化物を含有する抗体分子の場
合には真核細胞が好ましい．炭水化物の欠如した抗体分
子の場合には真核細胞または原核細胞のいずれを使用し
てもよい．本発明に関心をもつ当業者は、かかるＤＮＡ
配列または遺伝子を楕築するための公知の技術、発現ベ
クターに導入する方法、有用なベクターの種類、適当な
細胞環境における発現の条件及び手順を容易に選択でき
よう． 本発明はまた、天然には不変部に炭水化物認識部位を含
む抗体の該不変部に炭水化物認識部位が存在しないこと
を特徴とする天然に産生しないヒト抗体、例えばヒトモ
ノクローナル抗体に係る．本発明は更に、かかる抗体を
コードするＤＮＡを提供する． 本発明はまた、天然には不変部に炭水化物認識部位を含
まない抗体の該不変部に炭水化物認識部位が存在してい
ることを特徴とする天然に産生じないヒト抗体、例えば
ヒトモノクローナル抗体に係る．本発明は更に、かかる
抗体をコードするＤＮＡを提供する． ヒト抗体、例えばヒトモノクローナル抗体は、かかる炭
水化物認識部位に結合した炭水化物を含んでいてもよく
、本発明の１つの実施態様においては、例えばリジンＡ
頒、＋２５７のごとき放射性核種、等の抗癌剤のごとき
治療用リガンド、またはその他の治療剤がかかる抗体に
結合したががる炭水化物に結合しているときに治療剤と
して使用され得る．かかる治療剤は、例えば免疫系異常
またはその他の疾病状態を治療するために使用され得る
．また別の実施悪様においては、このヒト抗体を標識し
てもよい、即ち抗体に結合したががる炭水化物に検出可
能マーカーのごときラベルを結合してもよい． 本発明は、抗体の不変部に天然には存在する炭水化物認
識部位を抗体の不変部がら欠失させることによって抗体
の炭水化物含量を変化させる本発明の方法によって調製
された改質抗体及びかかる抗体をコードするＤＮＡに係
る． 本発明はまた、ヒトの生物学的体液サンプルのごときサ
ンプル中の物質または分析物（ａｎａｌｙｔｅ）の存在
を検出するための、サンプルと該物質に対する抗体とを
接触させる高感度検出方法を提供する．抗体は検出可能
マーカー、例えば発色団、蛍光団または放射性部分によ
って標識されてもよい．抗体は前記のごとく、天然には
可変部に炭水化物認識部位を含まない抗体の該可変部に
遺伝子操作を実施して形成された炭水化物認識部位を含
む天然には産生じない抗体である．この方法においては
、サンプル中に存在する物質または分析物と抗体とが検
出可能な複合体を形成するような条件下に該物質と該抗
体とを接触させ、次いで複合体の存在を検出し、これに
基づいて物質の存在を検出する．１つの実施態様におい
ては、このように使用される抗体が前記タイプの固体担
体に結合されている． サンプル中の物質または分析物の量または濃度を検定す
るためには、形成された複合体の量を測定し、この量に
基づいて物質または分析物の量または濃度を測定し、例
えば既知量の物質または分析物と比較する．サンプル中
の物質と該物質に対する抗体とによって形成された複合
体の量または濃度を定量的に測定するためには、検出可
能部分の同定に基づく公知技術の方法を使用し得る．例
えば、検出可能部分（ｍｏｉｅｔｙ）が放射性のとき、
リガンドシンチレーションカウンターを使用し得る．検
出可能部分が標準アッセイにおける西洋ワサビペルオキ
シダーゼのごとき酵素のとき、分光光度計を使用し得る
．検出可能部分が蛍光性のとき、蛍光定量計を使用し得
る．特に有用な方法は、蛍光物質で賦活した細胞を選別
する方法である．この方法は便利、迅速及び正確である
． 本発明はまた、物質含有サンプルから該物質を回収する
ための、サンプルと該物質に対する抗体とを接触させる
ことを特徴とする物質回収方法を提供する．抗体は前記
のごとく、天然には可変部に炭水化物認識部位を含まな
い抗体の可変部に遺伝子操作を実施して形成された炭水
化物認識部位を含む天然には産生じない抗体である．サ
ンプル中の物質と抗体とが複合体を形成するような適当
な条件下に該物質と該抗体とを接触させる。次いで得ら
れた複合体から物質を回収する．別の見方をすればかか
る方法は、カラムに充填された固体担体に抗体を結合す
るクロマトグラフィー法である． 本発明はまた、物質が精製形態で回収される条件下に前
記方法を用いて該物質含有サンプルから物質を回収する
ことを特徴とする物質の精製方法を提供する． 本発明は更に、前記のごとき抗体、即ち、天然には可変
部に炭水化物認識部位を含まない抗体の該可変部に遺伝
子操作を実施して形成された炭水化物認識部位を含む天
然に産生じない抗体を含む診断用キットに係る．更に本
発明は、例えば発色団、蛍光団または放射性部分のごと
き検出可能マーカーによって標識された前記のごとき抗
体を含む診断用キットを提供する．本発明の新規な抗体
と物質との複合体形成に基づいて、サンプル中の該物質
の存在を検出する種々の方法及び該物質含有サンプルか
ら物質を回収する種々の方法を詳細に後述する． 本発明で提供される方法に有用なアッセイのタイプは本
発明が属する分野の当業者には公知である．かかるアッ
セイとして例えば、ラジオイムノアッセイのごとき液相
アッセイ、ＥＬＩＳ＾（Ｅｎｚｙ＋＊ｅＬｉｎｋｅｄ
Ｉｍｍｕｎｏｓｏｂｅｒｔ Ａｓｓａｙｓ）、サンドイ
ッチアッセイまたはＩＲＭ屓１ｓ＋ｍｕｎｏ Ｒａｄｉ
ｏ−Ｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ）のごとき固相アッセイ
がある．後者のアッセイに関しては、特に有用なイムノ
メトリックアッセイは、Ｄａｖｉｄ等の米国特許第４，
３７６，１１０号に開示された「２部位」またはｒサン
ドイッチ」イムノメトリックアッセイ法である。該特許
の記載内容は本明細書に含まれるものとする．アッセイ
時間、ｐＨ、温度、アッセイのイオン強度のごときアッ
セイ条件も当業者に公知である．公知のアッセイ及びそ
の条件に関する概要は、Ｌａｂｏｒａ’Ｌｏｒ Ｔｅ
ｃｈｎｉ ｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
，ｖｏｌ．１３、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＾ｎｔｉ
ｂｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ 、＾． Ｈ． Ｃ
ａｍｐｂｅｌｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．．Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ， １９８６、ｃｈａｐｔｅｒ２、“＾ｓｓａｙＴ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ， ｐｐ．３３〜６５に記載され
ている。
以下の実験の詳細な説明の項で本発明を実施例に基づい
て説明する．これらの項は本発明の理解を助けるために
提示されたものであり、特許請求の範囲に開示された本
発明の範囲が以下の記載に限定されると解釈されてはな
らない． α（１→６）デキストランに対する３つのハイブリドー
マ抗体に由来の発現ｖＨ領域は、ヒト■ｇＧ．不変部遺
伝子に結合しく第１図）、Ｄ，、即ちハイブリド一マ特
異的し鎖だけを産生ずる細胞系（４．５）のトランスフ
ェクション後に内因性ＬＭと結合して分泌されるＨ鎖の
発現に向けられたく結果を示さず）．Ｈ鎖（Ｖ．）及び
Ｌ鎖（ｖＬ．）の可変部のヌクレオチド配列を決定した
（２）《表１）． ？４．６ｂ．１キメラ抗体が■■に炭水化物を含むか否
かを決定するために、該抗体分子をパパイン分解によっ
てＦａｂとＦｃとに分別し、β−メルカブトエタノール
で還元し、５％ＳＤＳ−ＰＡ（；Ｅゲルで分析した．タ
ンパク質を［”Ｓ］−Ｎｅｔで標識し、特異的抗Ｆａｂ
抗血清を用いてＦａｂを沈降させたく第２八図）． ５
．５４．４．２４．１及び１９．２２．１ ｃＤＮ＾ク
ローン（夫々ＴＪＣ８及びＴＨＶ８》に由来のｖ，Ｉを
含むトランスフエクトーマ抗体は、そのＦｄ及びカッパ
Ｌ鎖の同時移動（ｃｏ＋ｓｉｇｒａｔｉｏｎ）を示した
．対照的に、１４．６ｂ．１（ＴＫＣ３．２）に由来の
Ｈ鎖可変部を含むトランスフェクトーマ抗体においては
、Ｆｄ部分はし鎖よりもゆっくりと移動する。
て説明する．これらの項は本発明の理解を助けるために
提示されたものであり、特許請求の範囲に開示された本
発明の範囲が以下の記載に限定されると解釈されてはな
らない． α（１→６）デキストランに対する３つのハイブリドー
マ抗体に由来の発現ｖＨ領域は、ヒト■ｇＧ．不変部遺
伝子に結合しく第１図）、Ｄ，、即ちハイブリド一マ特
異的し鎖だけを産生ずる細胞系（４．５）のトランスフ
ェクション後に内因性ＬＭと結合して分泌されるＨ鎖の
発現に向けられたく結果を示さず）．Ｈ鎖（Ｖ．）及び
Ｌ鎖（ｖＬ．）の可変部のヌクレオチド配列を決定した
（２）《表１）． ？４．６ｂ．１キメラ抗体が■■に炭水化物を含むか否
かを決定するために、該抗体分子をパパイン分解によっ
てＦａｂとＦｃとに分別し、β−メルカブトエタノール
で還元し、５％ＳＤＳ−ＰＡ（；Ｅゲルで分析した．タ
ンパク質を［”Ｓ］−Ｎｅｔで標識し、特異的抗Ｆａｂ
抗血清を用いてＦａｂを沈降させたく第２八図）． ５
．５４．４．２４．１及び１９．２２．１ ｃＤＮ＾ク
ローン（夫々ＴＪＣ８及びＴＨＶ８》に由来のｖ，Ｉを
含むトランスフエクトーマ抗体は、そのＦｄ及びカッパ
Ｌ鎖の同時移動（ｃｏ＋ｓｉｇｒａｔｉｏｎ）を示した
．対照的に、１４．６ｂ．１（ＴＫＣ３．２）に由来の
Ｈ鎖可変部を含むトランスフェクトーマ抗体においては
、Ｆｄ部分はし鎖よりもゆっくりと移動する。
１４．６ｂ．Ｉ Ｆｃｌフラグメントの移動度の低下は
その■■のグリコシレーションと合致する。
その■■のグリコシレーションと合致する。
１４．６ｂ．１のｖ，Ｉ中の炭水化物の存在を確認する
ために、分泌された免疫グロブリンを［１Ｃ］一グルコ
サミンで標識し、Ｆａｂ及びＦｃ分画を調製し、産生物
をＳＯＳ−ＰＡＧＥで分析した（第２Ｂ図）。予想した
通り、カッパＬ鎖は炭水化物を含有せず、従ってバンド
が存在しない， Ｃ．２ドメイン内部にＮ一結合炭水化
物を含むヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメントの［＋４（：］
−グルコサミン標識が観察された（６）．Ｌかしながら
、１４．ｅｂ．ｔ ｖ．から得られたＦｄを含むＴＫＣ
３．２（Ｆａｂ）だけがグルコサミン標識を示す。Ｆｃ
に比較してＦｄバンドの強度が小さい理由は多分、グリ
コシレーションが不完全なためではな（ Ｆａｂフラグ
メントの回収がよくないためであろう（７），Ｏ、１ま
たは２個の炭水化物基（ｍｏｉｅｔｙ）を含むＨ鎖だけ
を分割できるＳＯＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて（第３八図
）、ＴＫＣ３．２に関しては１つのＨ鎖バンドだけが観
察された．にお番る の 抗原結合における炭水化物゛の役割を調べるために、ツ
ニカマイシン処理した非グリコシル化及び非処理の天然
抗デキストラントランスフェクトーマ抗体の会合定数を
測定した．ツニカマイシンはＮ一結合グリコシレーショ
ンの有力なインヒビターであるが（８）、グリコシル化
種を全く含まないタンパク質を産生ずることは難しい．
再構築実験からは、微量の高親和性抗体の混入が低親和
性抗体のデキストランに対する見掛け結合定数を劇的に
増加させることが明らかになった（データを示さず）．
これを避けるために、高マンノース及びパイアンテナ性
複合体オリゴ糖（９）に結合するＣｏｎ＾・を使用し、
非グリコシル化免疫グロブリンをグリコシル化免疫グロ
ブリンから分離した．吸着実験によれば、ＴＨＶ８．３
抗体（Ｖ． １４．６ｂ．１）中の炭水化物はＣｏｎ＾
セファロースに吸着されなかった（第３八図、レーン２
及び４），Ｃｏｎ＾上清中に認められる残留ＴＫＣ３．
２抗体（レーン２）は、培養流体からＣａｎ＾スラリー
を完全には分離できないことを反映している． ＴＫＣ３．２及びＴＨＶ８．３抗体のツニカマイシン処
理の結果、Ｈ鎖からの炭水化物の消失と合致して電気泳
動移動度が変化したく第３Ｂ図、レーン１〜４）．２、
１またはＯ個のＮ結合炭水化物基を含むＨ鎖く夫々レー
ン１、３及び２または４）が分割された。
ために、分泌された免疫グロブリンを［１Ｃ］一グルコ
サミンで標識し、Ｆａｂ及びＦｃ分画を調製し、産生物
をＳＯＳ−ＰＡＧＥで分析した（第２Ｂ図）。予想した
通り、カッパＬ鎖は炭水化物を含有せず、従ってバンド
が存在しない， Ｃ．２ドメイン内部にＮ一結合炭水化
物を含むヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメントの［＋４（：］
−グルコサミン標識が観察された（６）．Ｌかしながら
、１４．ｅｂ．ｔ ｖ．から得られたＦｄを含むＴＫＣ
３．２（Ｆａｂ）だけがグルコサミン標識を示す。Ｆｃ
に比較してＦｄバンドの強度が小さい理由は多分、グリ
コシレーションが不完全なためではな（ Ｆａｂフラグ
メントの回収がよくないためであろう（７），Ｏ、１ま
たは２個の炭水化物基（ｍｏｉｅｔｙ）を含むＨ鎖だけ
を分割できるＳＯＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて（第３八図
）、ＴＫＣ３．２に関しては１つのＨ鎖バンドだけが観
察された．にお番る の 抗原結合における炭水化物゛の役割を調べるために、ツ
ニカマイシン処理した非グリコシル化及び非処理の天然
抗デキストラントランスフェクトーマ抗体の会合定数を
測定した．ツニカマイシンはＮ一結合グリコシレーショ
ンの有力なインヒビターであるが（８）、グリコシル化
種を全く含まないタンパク質を産生ずることは難しい．
再構築実験からは、微量の高親和性抗体の混入が低親和
性抗体のデキストランに対する見掛け結合定数を劇的に
増加させることが明らかになった（データを示さず）．
これを避けるために、高マンノース及びパイアンテナ性
複合体オリゴ糖（９）に結合するＣｏｎ＾・を使用し、
非グリコシル化免疫グロブリンをグリコシル化免疫グロ
ブリンから分離した．吸着実験によれば、ＴＨＶ８．３
抗体（Ｖ． １４．６ｂ．１）中の炭水化物はＣｏｎ＾
セファロースに吸着されなかった（第３八図、レーン２
及び４），Ｃｏｎ＾上清中に認められる残留ＴＫＣ３．
２抗体（レーン２）は、培養流体からＣａｎ＾スラリー
を完全には分離できないことを反映している． ＴＫＣ３．２及びＴＨＶ８．３抗体のツニカマイシン処
理の結果、Ｈ鎖からの炭水化物の消失と合致して電気泳
動移動度が変化したく第３Ｂ図、レーン１〜４）．２、
１またはＯ個のＮ結合炭水化物基を含むＨ鎖く夫々レー
ン１、３及び２または４）が分割された。
非処理サンプルのＨＭバンド（レーン１及び３）は均質
（ｈｏ慣ｏｇｅｎｅｏｕｓ）であり、これは全部のＨ鎖
が均等にグリコシル化されたことを示唆する。レーン２
、４及び６に視認できるグリコシル化Ｈｊｌバンドが存
在しないので、ツニカマイシン処理の結果免疫グロブリ
ンの９７％を゜工回る脱グリコシル化が生じたと推定で
きる。レーン５〜８は、ツニカマイシン処理した免疫グ
ロブリンのＣｏｎ＾吸着から得られた結果を示す， Ｔ
ＫＣ３．２（Ｖ． １４．６ｂ．１）及７，１’ＴＨＶ
８．３（Ｖ． １９．２２．１）ノ非グリコシル化抗体
は共にＣｏｎ＾に結合しなかったくレーン５及び７）。
（ｈｏ慣ｏｇｅｎｅｏｕｓ）であり、これは全部のＨ鎖
が均等にグリコシル化されたことを示唆する。レーン２
、４及び６に視認できるグリコシル化Ｈｊｌバンドが存
在しないので、ツニカマイシン処理の結果免疫グロブリ
ンの９７％を゜工回る脱グリコシル化が生じたと推定で
きる。レーン５〜８は、ツニカマイシン処理した免疫グ
ロブリンのＣｏｎ＾吸着から得られた結果を示す， Ｔ
ＫＣ３．２（Ｖ． １４．６ｂ．１）及７，１’ＴＨＶ
８．３（Ｖ． １９．２２．１）ノ非グリコシル化抗体
は共にＣｏｎ＾に結合しなかったくレーン５及び７）。
Ｃｏｎ＾吸着によって、ＴＫＣ３．２ツニカマイシン処
理調製物からグリコシル化混入物を除去できることを確
認し、次にＣｏｎ＾吸着材料をデキストラン結合試験に
使用した。典型的な１つの実験から得られた結果を第４
図のグラフに示す。天然ＴＫＣ３．２？体（Ｖ． １４
．６ｂ．１）の場合、０．５１Ｉｇ／ｘｆｌまたは２０
同／Ｉ１ｌのデキストランで被覆されたＥＬＩＳ＾プレ
ートに対する５０％結合阻害は、１．２Ｈｇ／ｘｌのデ
キストランインヒビターを添加したときに得られた。炭
水化物欠失ＴＫＣ３．２抗体（■■１４．６ｂ．１）は
、０．５μ２／ｌ１のデキストラン被覆プレートに結合
できなかったくデータを示さず）．低親和性結合条件（
２０μｇ／ｚｌのデキストランで被覆したマイクロタイ
ターウエル）を使用すると、非グリコシル化ＴＫＣ３．
２（Ｖ． １４．６ｂ．１）抗体及び天然Ｔ１１Ｖ８．
３抗体は、１８〜２４向７ｍｌのデキストランＢ５１２
インヒビターを添加したときに最大結合の５０％を示し
た。
理調製物からグリコシル化混入物を除去できることを確
認し、次にＣｏｎ＾吸着材料をデキストラン結合試験に
使用した。典型的な１つの実験から得られた結果を第４
図のグラフに示す。天然ＴＫＣ３．２？体（Ｖ． １４
．６ｂ．１）の場合、０．５１Ｉｇ／ｘｆｌまたは２０
同／Ｉ１ｌのデキストランで被覆されたＥＬＩＳ＾プレ
ートに対する５０％結合阻害は、１．２Ｈｇ／ｘｌのデ
キストランインヒビターを添加したときに得られた。炭
水化物欠失ＴＫＣ３．２抗体（■■１４．６ｂ．１）は
、０．５μ２／ｌ１のデキストラン被覆プレートに結合
できなかったくデータを示さず）．低親和性結合条件（
２０μｇ／ｚｌのデキストランで被覆したマイクロタイ
ターウエル）を使用すると、非グリコシル化ＴＫＣ３．
２（Ｖ． １４．６ｂ．１）抗体及び天然Ｔ１１Ｖ８．
３抗体は、１８〜２４向７ｍｌのデキストランＢ５１２
インヒビターを添加したときに最大結合の５０％を示し
た。
ツニカマイシン処理した非グリコシル化及び非処理の天
然抗デキストラン抗体の見掛け会合定数を表Ｈにまとめ
る。
然抗デキストラン抗体の見掛け会合定数を表Ｈにまとめ
る。
表■ −キストランＢ５１２に対 る け ムハイブ
リドーマまたは ａＫａ（ｚｆ／ＦＩ）” ａＫ
ａ（ｘｉ’／ｙ）トーンスフエクトーマ ΩＶΣ力
藷迂Ｗ肋Ｅ１団旺１４．６ｂ．ｉ
ｎ．ｄ．ｂ２．３０＋０．１ｘｌＯ’ （４） ’（
４．４３×１０５）’ １９．２２．Ｉ ｎ．ｄ．
ｎ．ｄ。
リドーマまたは ａＫａ（ｚｆ／ＦＩ）” ａＫ
ａ（ｘｉ’／ｙ）トーンスフエクトーマ ΩＶΣ力
藷迂Ｗ肋Ｅ１団旺１４．６ｂ．ｉ
ｎ．ｄ．ｂ２．３０＋０．１ｘｌＯ’ （４） ’（
４．４３×１０５）’ １９．２２．Ｉ ｎ．ｄ．
ｎ．ｄ。
（８．８７Ｘ１０’）’
ＴＫＣ３．２（一Ｔ蛸） １．７×１
０＠ １．６８±ｏ．ｅｘｔｏ’（ａ）”（２．１
０±０．３ｘｌＯａ’（５） ＴＫＣ３ ．２ （＋Ｔｍ）Ｃｏｎ＾吸着 １．１
×１０５１．１８ｔ０．０４ｘｌＯ’（５）ＴＨＶ８．
３（−Ｔｍ） １．０±１０’
８．２２±３．６×１０’（１０）’（６．５±０．３
×１０’）”（６） Ｔｔ｛Ｖ８．３（＋Ｔ＋＊）ＣｏｎＡ吸着 ８．３
Ｘ１０’ １．０９ｊ０．４×１０’（４）ａ デ
キストラン被覆プレートに対する抗体の最大結合の５０
％阻害に必要なデキストランＢ５１２の濃度の逆数から
計算した．デキストランインヒビターと抗体とをモル比
１：１でマイクロタイターウエルに添加したので、１／
［Ｄｅｘ］，−。濃度に係数２を乗算して最終ａＫａ値
を与えた。
０＠ １．６８±ｏ．ｅｘｔｏ’（ａ）”（２．１
０±０．３ｘｌＯａ’（５） ＴＫＣ３ ．２ （＋Ｔｍ）Ｃｏｎ＾吸着 １．１
×１０５１．１８ｔ０．０４ｘｌＯ’（５）ＴＨＶ８．
３（−Ｔｍ） １．０±１０’
８．２２±３．６×１０’（１０）’（６．５±０．３
×１０’）”（６） Ｔｔ｛Ｖ８．３（＋Ｔ＋＊）ＣｏｎＡ吸着 ８．３
Ｘ１０’ １．０９ｊ０．４×１０’（４）ａ デ
キストラン被覆プレートに対する抗体の最大結合の５０
％阻害に必要なデキストランＢ５１２の濃度の逆数から
計算した．デキストランインヒビターと抗体とをモル比
１：１でマイクロタイターウエルに添加したので、１／
［Ｄｅｘ］，−。濃度に係数２を乗算して最終ａＫａ値
を与えた。
ｂ 非測定
ｃ ａＫａ値は括弧内に示す実験回数の平均から得
られた値を示す。合計値の誤差は第１標準偏差で示す． ｄ アフィニティゲル電気泳動法によって測定した。
られた値を示す。合計値の誤差は第１標準偏差で示す． ｄ アフィニティゲル電気泳動法によって測定した。
ｅＪ 抗体濃度は夫々０．８μｇ／ｚｌ及び０．３１
１ｇ／ｘｉであった。
１ｇ／ｘｉであった。
２ 培養上清はツニカマイシン実験から得たものでな
い．抗体濃度はＬｕｇｈｌであった。
い．抗体濃度はＬｕｇｈｌであった。
抗体濃度を測定するために、ＰＢＳ（０．０２Ｍホウ酸
塩１ｇ街０．７５％生理食塩水、ｐＨ８．３）に希釈し
た培養上清をボリスチレンマイクロタイターウェル（Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ， Ｎ．Ｙ．）に３７℃で３時間結合した
。未反応部位を１％ウシ血清アルブミン／０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ （登録商標）２０ ＰＢＳ（ＰＢＳ Ｔ Ｓ
）で室温で１時間ブロツクし， ＥＬＩＳ＾（Ｅｎｚｙ
ｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａ
ｓａｙ）プレートをＰＢＳ／０ ．５％Ｔｗｅｅｎで３
回、ＰＢＳで１回洗浄し、結合したＩｇを西洋ワサビベ
ルオキシダーゼ標識抗ヒト■ｇＧ抗体と反応させ、既知
の濃度のヒトＩｇＧ標準と比較して定量した。アッセイ
結果を少なくとも３回再現した． 炭水化物が欠失したＴＫＣ３．２抗体（Ｖ，ｌ１４，６
ｂ．１）の結合定数は天然抗体の１７１４〜１／１５で
あった。対照的に、ＴＨＶ８．３（Ｖ． １９．２２．
１）のＦｃから除去された炭水化物は抗体の抗原結合能
に影響を与えなかった．特に注釈のない限り実験はすべ
て抗体濃度１ｐｙ／ｚｆｆｉで行なったものである。見
掛けａＫａ値に対して抗体濃度のわずかな影響が観察さ
れた．阻害ＥＬＩＳ＾を用いて定量されたａＫａ値は概
して、アフイニテイゲル電気泳動で得られた値の３〜５
倍であったが、抗体間の結合強度の差は２つのアツセイ
で同じであッタ， ＴＫＣ３．２（Ｖ． １４．６ｂ．
１）抗体トＴＨＶ８．３（Ｖ． １９．２２．１）抗体
との間の結合親和性の差は３２倍であった．これに対し
て、これまでに報告された１４．６ｂ．１と１９．２２
．１との差は５０倍である（１０） ，要約すると、抗
デキストランＶエ領域内部の炭水化物の存在がその抗原
親和性に有意な影響を与えることは明らかであるが、変
換アミノ酸が結合差に対して更に寄与していることも否
定できない． Ｈ の の ゛１最後に、グリコ
ヒドロラーゼ（ｇｌｙｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）Ｅｎｄ
ｏ Ｈを使用してｖ，Ｉオリゴ糖の構造を研究した。
塩１ｇ街０．７５％生理食塩水、ｐＨ８．３）に希釈し
た培養上清をボリスチレンマイクロタイターウェル（Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ， Ｎ．Ｙ．）に３７℃で３時間結合した
。未反応部位を１％ウシ血清アルブミン／０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ （登録商標）２０ ＰＢＳ（ＰＢＳ Ｔ Ｓ
）で室温で１時間ブロツクし， ＥＬＩＳ＾（Ｅｎｚｙ
ｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａ
ｓａｙ）プレートをＰＢＳ／０ ．５％Ｔｗｅｅｎで３
回、ＰＢＳで１回洗浄し、結合したＩｇを西洋ワサビベ
ルオキシダーゼ標識抗ヒト■ｇＧ抗体と反応させ、既知
の濃度のヒトＩｇＧ標準と比較して定量した。アッセイ
結果を少なくとも３回再現した． 炭水化物が欠失したＴＫＣ３．２抗体（Ｖ，ｌ１４，６
ｂ．１）の結合定数は天然抗体の１７１４〜１／１５で
あった。対照的に、ＴＨＶ８．３（Ｖ． １９．２２．
１）のＦｃから除去された炭水化物は抗体の抗原結合能
に影響を与えなかった．特に注釈のない限り実験はすべ
て抗体濃度１ｐｙ／ｚｆｆｉで行なったものである。見
掛けａＫａ値に対して抗体濃度のわずかな影響が観察さ
れた．阻害ＥＬＩＳ＾を用いて定量されたａＫａ値は概
して、アフイニテイゲル電気泳動で得られた値の３〜５
倍であったが、抗体間の結合強度の差は２つのアツセイ
で同じであッタ， ＴＫＣ３．２（Ｖ． １４．６ｂ．
１）抗体トＴＨＶ８．３（Ｖ． １９．２２．１）抗体
との間の結合親和性の差は３２倍であった．これに対し
て、これまでに報告された１４．６ｂ．１と１９．２２
．１との差は５０倍である（１０） ，要約すると、抗
デキストランＶエ領域内部の炭水化物の存在がその抗原
親和性に有意な影響を与えることは明らかであるが、変
換アミノ酸が結合差に対して更に寄与していることも否
定できない． Ｈ の の ゛１最後に、グリコ
ヒドロラーゼ（ｇｌｙｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）Ｅｎｄ
ｏ Ｈを使用してｖ，Ｉオリゴ糖の構造を研究した。
新たに合成されたＩｇＧＨＭ上で見いだされた高マンノ
ースコアオリゴ糖のジーＮ−アセチルキトビオース（ｄ
ｉ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ）結合はＥ
ｎｄｏ ＩｌｒＭ裂を生じ易いが＜１１）、加工した複
合体炭水化物はＥｎｄｏ Ｈ開裂に耐性である．細胞の
細胞質から得られたＨ鎖はＥｎｄｏ Ｈによって加水分
解されたくデータを示さず）。対照的に、Ｔ１１Ｖ８．
３及びＴＫＣ３．２の双方の分泌物から得られたＨ鎖は
Ｅｎｄｏ Ｈ処理によって変化しなかった． にお る の 抗体は全てのＨ鎖が少なくとも１つしばしば複数のＮ一
結合炭水化物残基を含む糖タンパク質である（１２）．
Ｈ鎖不変部に存在する炭水化物の役割は、Ｈ鎖を可溶化
し、細胞下の（ｓｕｂｃｅｌｌａｒ）輸送及び分泌を容
易にし、組立（ａｓｓｅｍｂｌｙ）を促進し、エフェク
ター機能に貢献する免疫グロブリンのコンホーメーショ
ンの特徴を維持することであると推定される。炭水化物
はまた、抗体分子のＶ領域内部にも存在する．ヒト骨髄
腫し鎖の１５％がその可変部に炭水化物を含む（１４）
。７６体のヒトｉｇＧ骨髄腫タンパク質の研究によれば
、約２５％がＦａｂフラグメントに炭水化物部分を含む
ことが判明した（１５） ．炭水化物はＬ鎖またはＦｄ
フラグメントに結合しており、両方に結合している場合
も少数観察された．の ラ 、 本発明においては、■．のＣＤＲ２中の炭水化物の存在
が高分子α（１→６）一デキストランに特異的なモノク
ローナル抗体の高親和性結合に決定的に重要であること
が直接証明され、これに基づいて炭水化物が１８７に対
する親和性増加にも寄与すると推定できる．可変部の特
異的アミノ酸配列だけでな゛くその炭水化物基が、抗原
一抗体相互作用の特異性及び重要性（ｍａｇｎｉｔｕｄ
ｅ）を決定し得る．早い時期の研究でＭａｔｓｕｕｃｈ
ｉ等（１６）は、高分子デキストランとの反応性が減少
した骨髄腫Ｊ５５８（Ｉｙ＾、λ、抗α（１→３）一デ
キストラン）の自然発生突然変異体を単離しその特性を
決定した．この突然変異体と野性型との違いは、突然変
異体のＦａｂ領域の炭水化物に増加量のシアル酸が含ま
れていることである， Ｊ５５８の可変部は標準の（ｃ
ａｎｏｎ ｉｃａ Ｉ ）炭水化物付加配列を含まない
ので、改変された炭水化物はＣ．１ドメインに存在する
可能性が大きい。
ースコアオリゴ糖のジーＮ−アセチルキトビオース（ｄ
ｉ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ）結合はＥ
ｎｄｏ ＩｌｒＭ裂を生じ易いが＜１１）、加工した複
合体炭水化物はＥｎｄｏ Ｈ開裂に耐性である．細胞の
細胞質から得られたＨ鎖はＥｎｄｏ Ｈによって加水分
解されたくデータを示さず）。対照的に、Ｔ１１Ｖ８．
３及びＴＫＣ３．２の双方の分泌物から得られたＨ鎖は
Ｅｎｄｏ Ｈ処理によって変化しなかった． にお る の 抗体は全てのＨ鎖が少なくとも１つしばしば複数のＮ一
結合炭水化物残基を含む糖タンパク質である（１２）．
Ｈ鎖不変部に存在する炭水化物の役割は、Ｈ鎖を可溶化
し、細胞下の（ｓｕｂｃｅｌｌａｒ）輸送及び分泌を容
易にし、組立（ａｓｓｅｍｂｌｙ）を促進し、エフェク
ター機能に貢献する免疫グロブリンのコンホーメーショ
ンの特徴を維持することであると推定される。炭水化物
はまた、抗体分子のＶ領域内部にも存在する．ヒト骨髄
腫し鎖の１５％がその可変部に炭水化物を含む（１４）
。７６体のヒトｉｇＧ骨髄腫タンパク質の研究によれば
、約２５％がＦａｂフラグメントに炭水化物部分を含む
ことが判明した（１５） ．炭水化物はＬ鎖またはＦｄ
フラグメントに結合しており、両方に結合している場合
も少数観察された．の ラ 、 本発明においては、■．のＣＤＲ２中の炭水化物の存在
が高分子α（１→６）一デキストランに特異的なモノク
ローナル抗体の高親和性結合に決定的に重要であること
が直接証明され、これに基づいて炭水化物が１８７に対
する親和性増加にも寄与すると推定できる．可変部の特
異的アミノ酸配列だけでな゛くその炭水化物基が、抗原
一抗体相互作用の特異性及び重要性（ｍａｇｎｉｔｕｄ
ｅ）を決定し得る．早い時期の研究でＭａｔｓｕｕｃｈ
ｉ等（１６）は、高分子デキストランとの反応性が減少
した骨髄腫Ｊ５５８（Ｉｙ＾、λ、抗α（１→３）一デ
キストラン）の自然発生突然変異体を単離しその特性を
決定した．この突然変異体と野性型との違いは、突然変
異体のＦａｂ領域の炭水化物に増加量のシアル酸が含ま
れていることである， Ｊ５５８の可変部は標準の（ｃ
ａｎｏｎ ｉｃａ Ｉ ）炭水化物付加配列を含まない
ので、改変された炭水化物はＣ．１ドメインに存在する
可能性が大きい。
炭水化物含量の変化は、グリコシレーションに関与した
細胞酵素の有効性が変化した結果として生したものであ
る。
細胞酵素の有効性が変化した結果として生したものであ
る。
Ｌａｂｅｔａ等は、ハプテンＤＮＰ−ＧＡＢ＾一ＢＳ＾
に対する抗ＤＮＰ抗体の親和性は、Ｆａｂ炭氷化物のＥ
ｎｄｏ Ｈ開裂後に有意に増加することを報告した（１
７），対照的に本発明では、α（１→６）一デキストラ
ンに対する抗体の抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）か
ら炭水化物が欠如することによって抗原に対する抗体の
親和性が減少した。
に対する抗ＤＮＰ抗体の親和性は、Ｆａｂ炭氷化物のＥ
ｎｄｏ Ｈ開裂後に有意に増加することを報告した（１
７），対照的に本発明では、α（１→６）一デキストラ
ンに対する抗体の抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）か
ら炭水化物が欠如することによって抗原に対する抗体の
親和性が減少した。
抗体１４．６ｂ．１の結合部位のアミノ酸に結合したオ
リゴ糖の存在が、高分子デキストラン及び１８７の両方
に対するＫａを増加させるメカニズムは極めて重要であ
る， Ｖｌｌ中の炭水化物と結合した残基が超可変ルー
プに露出することを予測した非関連抗体のＸ線結晶学的
研究と本発明のＣｏｎ＾吸着実験との比較によって、Ｖ
ｎオリゴ糖が比較的露出し■２の表面に位置することが
示唆される．不変部のＣ．２の２つのオリゴ糖間の糖一
糖接触は文献に報告されているが（１８）、高分子デキ
ストランと部位を占有するオリゴ糖１８７とに関して直
接相互作用がどのように生じるかを知るのは難しい． グリコシレーションの効果に関しては、アミノ酸５８に
結合した炭水化物によってその結合部位のコンホーメー
ションが変えられると解釈するのが正しいかもしれない
。かかる変化は１４．６ｂ．Ｉ Ｖ．の６０位のトレオ
ニン残基のアクセシビリティを増すので抗体をより密接
に接触させる。実際、Ｆｅｌｄｍａｎと彼の共同研究者
達は、ガラクタン結合骨髄腫１，Ｊ５３９の■領域の仮
想的空間占有モデルから、Ｈｌの５６位のＴｈｒ残基が
ガラクタンと接触するであろうと予想した（ｌ９）。１
４．６ｂ．Ｉ ＦａｂのＸ線結晶学的構造は、炭水化物
の存在が結合部位のトボロジー一に与える影響を理解す
る助けとなるであろう。
リゴ糖の存在が、高分子デキストラン及び１８７の両方
に対するＫａを増加させるメカニズムは極めて重要であ
る， Ｖｌｌ中の炭水化物と結合した残基が超可変ルー
プに露出することを予測した非関連抗体のＸ線結晶学的
研究と本発明のＣｏｎ＾吸着実験との比較によって、Ｖ
ｎオリゴ糖が比較的露出し■２の表面に位置することが
示唆される．不変部のＣ．２の２つのオリゴ糖間の糖一
糖接触は文献に報告されているが（１８）、高分子デキ
ストランと部位を占有するオリゴ糖１８７とに関して直
接相互作用がどのように生じるかを知るのは難しい． グリコシレーションの効果に関しては、アミノ酸５８に
結合した炭水化物によってその結合部位のコンホーメー
ションが変えられると解釈するのが正しいかもしれない
。かかる変化は１４．６ｂ．Ｉ Ｖ．の６０位のトレオ
ニン残基のアクセシビリティを増すので抗体をより密接
に接触させる。実際、Ｆｅｌｄｍａｎと彼の共同研究者
達は、ガラクタン結合骨髄腫１，Ｊ５３９の■領域の仮
想的空間占有モデルから、Ｈｌの５６位のＴｈｒ残基が
ガラクタンと接触するであろうと予想した（ｌ９）。１
４．６ｂ．Ｉ ＦａｂのＸ線結晶学的構造は、炭水化物
の存在が結合部位のトボロジー一に与える影響を理解す
る助けとなるであろう。
４つのヒトＩｇＧサブクラスはいずれも、Ｃイ２ドメイ
ンにコンセンサスグリコシレーション配列＾ｓｎ− Ｘ
− Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（Ｘ一任意のアミノ酸》を含む。
ンにコンセンサスグリコシレーション配列＾ｓｎ− Ｘ
− Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（Ｘ一任意のアミノ酸》を含む。
幾つかの文献は、この炭水化物側鎖が、Ｆｃレセプター
結合及び補体活性化のごとき免疫グロブリンのエフェク
ター機能に重要であることを報告している（２２．２３
），特定部位の突然変異誘発を使用してＣ８２ドメイン
からこの炭水化物付加シグナルを除去し、生物学的機能
における炭水化物の役割を評価するために使用できる炭
水化物欠失分子を作製した。
結合及び補体活性化のごとき免疫グロブリンのエフェク
ター機能に重要であることを報告している（２２．２３
），特定部位の突然変異誘発を使用してＣ８２ドメイン
からこの炭水化物付加シグナルを除去し、生物学的機能
における炭水化物の役割を評価するために使用できる炭
水化物欠失分子を作製した。
このために研究者等はこれまで、Ｎ一結合グリコシレー
ションのインヒビターであるツニカマイシンの存在下に
増殖された細胞によって産生された免疫グロブリンを使
用していた。しかしながら、該方法を使用した場合、タ
ンパク質の産生量が少なく、また得られたタンパク質か
ら炭水化物が完全に欠失しているか否かを確認すること
が難しがった． 特定部位の突然変異を誘発させる方法は数多く存在する
．本発明で使用した１つの方法を第５図に示す（２４）
．ＩｇＣ不変部エキソンを含むＳａｔ Ｉ −ＢａｎＩ
ＩＩフラグメントを、旧３ファージＭ１３ｍｐｌ９のポ
リリンカ一部位にクローニングする。標準ポリエチレン
グリコール法によって組換えファージのポジティブスト
ランド［ｌＮ＾鋳型を調製する．２つのブライマー、即
ち旧３配列決定プライマーとコンセンサスグリコシレー
ション配列に１つの不適正ヌクレオチドをもつ５′末端
リン酸化突然変異誘発ブライマーとを使用して突然変異
を誘発する．両方のプライマーを同時に鋳型にアニーリ
ングする．プライマーの伸長及び結合の後で突然変異体
／野性型のギャップを有するヘテロ二重鎖を使用して大
腸菌宿主ＪＭ１０９を形質転換する．野性型ファージク
ローンと突然変異体とを判別するために、コロニーハイ
ブリダイゼーションを使用する。低緊縮性のハイブリイ
ゼーション条件下に突然変異体及び野性型ファージとを
突然変異誘発オリゴマーとハイブリダイズする。ハイブ
リイゼーション条件の緊縮性を高くしたとき、例えば、
ハイブリダイズしたファージプラークをより高温の洗浄
温度で洗浄するとき、標識された突然変異誘発オリゴマ
ーは突然変異ファージＤＨ八とハイブリダイズした状態
を維持するが、非突然変異ファージＤＮＡからは解離す
る。最後に、免疫グロブリンＨ鎖に導入されたヌクレオ
チドの変化をＤＮＡ配列決定によって正確に確認する必
要がある。これはジデオキシ配列決定法を使用して行な
う（２５．２６） ．次に、突然変異を誘発した遺伝子
を発現ベクターに移入すると、該遺伝子は該ベクター中
で改質タンパク質の合成を命令する。この一般方法は、
抗体分子の任意の場所に変化を導入するために使用でき
、変＄ｓ”ｅ−／１づこ舊Φ？１７ 日パ系汎４Ｆ叫ｌ
１； ク１ノ司 ざ払１； ６ りＴ゛述る性イディオ
タイプの抗体分子の産生に特に適している． この項に記載の方法を使用し、不変部の炭水化物が欠失
した抗体を産生じた．これらの抗体は改質されたエフェ
クター機能を有する、即ちＦｃレセプターに対する結合
能及び補体活性化能の減少を示す．１つ（ｒ，》はマウ
スの血清半減期の短縮を示すが、２つめ（ｒ＋）の半減
期は変わらない．この方法は不変部に付加的炭水化物分
子を導入するためにも使用され得る。これはリガンドが
炭水化物を介して抗体に結合するときに有用であろう． エｍｍｕｎｏｌ．ｌ １９， ３１＋９， （１９
８２１．ｋ田旦匹味．上とし ４４７２， （１９１
１７１Ｇ． Ｍ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｃ．
Ｂ＠ｒ＠ｋ， Ｍ． Ｋａａｒｔｌｎｅｎ，Ｍ
ｉｌｓｔｓｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎｌ
３１２， ２７１， （１９８４）．Ｖ． Ｔ．
Ｏｆ， Ｓ． Ｌ． Ｈｏｒｒｌｓｏｎ，
Ｌ． ＾． ｌｌａｒｚｅｎｂ＠ｒｇ ａｎｄ
Ｐ．Ｂ＠ｒｇ， Ｐｒｏｃ． Ｈａｔλ． Δ９Δ
仝、 Ｓｅｔ． ！！４−Δ． 且！２， ８２５
（１９８コ）．Ｌ． Ｋ． Ｔａｎ， Ｖ． Ｔ．
ＯＬ， ａｎｄ Ｓ． Ｌ． Ｈｏｒｒｉｓｏｎ，シ
． Ｉｎｕｕｕｎａｌ．．１１互， コ５６４， （
１９８５）．Ｅ． Ｗ． ｓＬ１ｖ＊ｒｔｏｎ， Ｍ．
λ． ＮａｖＬｈ， ｈｎ６ Ｄ． Ｒ． Ｄａｖｉｓ
， Ｐｒｏｃ．血只・届・ジ牡・見・旦・Δ． ７４，
５１４０， （１９７７）．ｒ３．Ｒ．劫ｄ＠Ｔ：
＊６ｎ， Ｐ− Ｓａｍａｒａｗａｅｒａ， ａ
ｎｄ Ｗ− ｊ− Ｃｒｉｍｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ
． 以ｚナｕ−シｒｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １１６，
７７１， （１９１１１）．Ａ． Ｄ． Ｅｌｂｓｉ
ｎ， Ｔｒａｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃａｓ ５， ２１９（１９１１１１． ０． Ｒ． ｌｎｄａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｗ． Ｊ．
Ｇｒｉｍｅｓ， ３−． ＢＬｏｌ， Ｃｈｅｗ． ２
５７．１４８５１１ （１９ｇ２）． １０．’Ｊ．Ｓｈａｒｏｎ， Ｅ． 入．Ｘａｂａ
ｔ ａｎｄ Ｓ． Ｌ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｍ
ｏｌｅｃ．工ｎｖｎｕｎｏｌ． ’ＬＪ ８）ｌ，
（１９８１１．１１ Ｐ． Ｗ． Ｒｏｂｂｉｎ
ｓ， ５． Ｃ． Ｈｕｂｂａｒｄ， ５． Ｊ．
Ｔｕｒｃａ ａｎｄ Ｄ． Ｆ．Ｍｉｒｔｈ， Ｃｅ
ｌｌ １２， ８９３ （１９７７１．１２． Ｃ．
５ｉｄｍａｎ， ２． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５
６． ９３７４ （１９８１）２４． Ｓ． Ｌ． Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎ， Ｊ． Ｉ＋ｕｍｕｎｏｌ． １３，
７９３ （１９７９１．１コ． Ａ． Ｓｈｉ
ｍＬｚｕ， Ｆ． Ｗ． Ｐｕセｎａｍ， Ｃ
． Ｐａｕｌ， Ｊ． Ｒ． Ｃｌａｍｐ．
ａｎｄＸ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅ
ｗ ｍ ２３＞， ７３ （１９７１） ．２５． 入
． Ｎｉｅｔｏ， Ａ． Ｇａｙａ， Ｍ．
Ｊａｎｇａ，Ｉｎｕｔ＋ｕｎｏｌ． ２１， ５
３７ （１９８４）．ａｎｄ Ｊ． Ｖｉｖｅｓ， Ｍｏｌｅｃ． ｌ４． Ｈ． Ｓ． Ｓｏｘ， Ｊｒ． ａ
ｎｄ Ｌ． Ｈｏｏｄ，！！４．ｊ． ６６， ９７
５， （１９７０）．Ｌ匹匹・ 虫式↓．と邊多 ≦
江． １５．Ｈ．Ｌ．Ｓｐｉｅｇ＠ｌｂａｒｇ，Ｃ． 入．
４人ｂ＠ｌ，Ｂ．Ｇ．Ｆｉｓｈｋｉｎ，ａｎｄ Ｈ．Ｍ
． Ｇｒｅｙ， Ｂｊ説就速ｍｌ誰貼エ２， ４２１７
（１９７０） ．１６． Ｌ． Ｍａｔｓｕｕｃｈｉ， Ｌ． ＾． Ｗ
ｉｎｓ ａｎｄ Ｓ．竺二國！りヱ匹， ４８２７，
（１９１１１）．Ｌ． Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｂｉｏ− １７． Ｍ． Ｏ． Ｌａｂａｔａ， Ｒ．
入． Ｍａｒｑｎｉ， Ｊ． Ｌｅｏｎｉ，Ｂ
ｌｎａｇｈｉ， ハ＝想魅ｚ■５７， ３１１ （１９
８６）．ａｎｄ １８． Ｂ． ：Ｉ． Ｓｕｔｔｏｎ ａｎｄ Ｄ．
Ｃ．Ｔｒａｎｓ． ｌλ， １コＯ （１９８コ
》．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９． Ｒ． Ｊ． Ｆｅｌｄｍａｎｎ， Ｈ
． Ｐｏｔｔｅｒ， ａｎｄ Ｃ．Ｍｏｌｅｃ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． ’旦， ６８３ （１９８１）
．ｐ．ｙ，（；ＩＢｕｄｅｍａｎｓ， ２０．Ｂ． 入．Ｎ＠ｗｍａｎ ａｎｄ Ｅ．Ａ
．Ｋａｂａｔ，Ｊ． 工ｍｍｕｎＯｌ− １１（（
１９８５）． ２１． Ｋ． Ｔａｋｅｏ ａｎｄ１９７Ｂ． 入． Ｋａｂａｔ， Ｊ． エｍｍｕｎｏｌ． １２１， ２コ０５， ２２． Ｓ． Ｌ．．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｌ．
入． ＷｉＩＩＩｓ， Ｓ． Ｃ． Ｗａ
ｌｌｉｃｋ， Ｌ． Ｋ． Ｔａｎａｎｄ Ｖ．
Ｔ． Ｏｉ， Ａｎｎａｌｓ ！！． Ｘ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． （ｉｎ ｐｒｅｓｓ）．２コ．
Ｊ． Ｄａｎｇｙｌ， Ｔ． Ｗｅｎｓｅｌ，
Ｌ． ＳＬｒｙｅｒ， Ｓ． Ｌ． ｝Ｉｏ
ｒｒｉｓｏｎ，入．＋ｌｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，ａｎｄ
Ｖ． 丁．０１，ｉｎ ｐｒｅｓｓ及びイソタイプ交
換を示す． 第２Ａ図は、［３ＳＳ］−Ｎｅｔ標識分泌Ｉｆのバパイ
ン分解後に得られた免疫沈降物のＳＯＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動分析を示す。
ションのインヒビターであるツニカマイシンの存在下に
増殖された細胞によって産生された免疫グロブリンを使
用していた。しかしながら、該方法を使用した場合、タ
ンパク質の産生量が少なく、また得られたタンパク質か
ら炭水化物が完全に欠失しているか否かを確認すること
が難しがった． 特定部位の突然変異を誘発させる方法は数多く存在する
．本発明で使用した１つの方法を第５図に示す（２４）
．ＩｇＣ不変部エキソンを含むＳａｔ Ｉ −ＢａｎＩ
ＩＩフラグメントを、旧３ファージＭ１３ｍｐｌ９のポ
リリンカ一部位にクローニングする。標準ポリエチレン
グリコール法によって組換えファージのポジティブスト
ランド［ｌＮ＾鋳型を調製する．２つのブライマー、即
ち旧３配列決定プライマーとコンセンサスグリコシレー
ション配列に１つの不適正ヌクレオチドをもつ５′末端
リン酸化突然変異誘発ブライマーとを使用して突然変異
を誘発する．両方のプライマーを同時に鋳型にアニーリ
ングする．プライマーの伸長及び結合の後で突然変異体
／野性型のギャップを有するヘテロ二重鎖を使用して大
腸菌宿主ＪＭ１０９を形質転換する．野性型ファージク
ローンと突然変異体とを判別するために、コロニーハイ
ブリダイゼーションを使用する。低緊縮性のハイブリイ
ゼーション条件下に突然変異体及び野性型ファージとを
突然変異誘発オリゴマーとハイブリダイズする。ハイブ
リイゼーション条件の緊縮性を高くしたとき、例えば、
ハイブリダイズしたファージプラークをより高温の洗浄
温度で洗浄するとき、標識された突然変異誘発オリゴマ
ーは突然変異ファージＤＨ八とハイブリダイズした状態
を維持するが、非突然変異ファージＤＮＡからは解離す
る。最後に、免疫グロブリンＨ鎖に導入されたヌクレオ
チドの変化をＤＮＡ配列決定によって正確に確認する必
要がある。これはジデオキシ配列決定法を使用して行な
う（２５．２６） ．次に、突然変異を誘発した遺伝子
を発現ベクターに移入すると、該遺伝子は該ベクター中
で改質タンパク質の合成を命令する。この一般方法は、
抗体分子の任意の場所に変化を導入するために使用でき
、変＄ｓ”ｅ−／１づこ舊Φ？１７ 日パ系汎４Ｆ叫ｌ
１； ク１ノ司 ざ払１； ６ りＴ゛述る性イディオ
タイプの抗体分子の産生に特に適している． この項に記載の方法を使用し、不変部の炭水化物が欠失
した抗体を産生じた．これらの抗体は改質されたエフェ
クター機能を有する、即ちＦｃレセプターに対する結合
能及び補体活性化能の減少を示す．１つ（ｒ，》はマウ
スの血清半減期の短縮を示すが、２つめ（ｒ＋）の半減
期は変わらない．この方法は不変部に付加的炭水化物分
子を導入するためにも使用され得る。これはリガンドが
炭水化物を介して抗体に結合するときに有用であろう． エｍｍｕｎｏｌ．ｌ １９， ３１＋９， （１９
８２１．ｋ田旦匹味．上とし ４４７２， （１９１
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ｎｄ Ｌ． Ｈｏｏｄ，！！４．ｊ． ６６， ９７
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江． １５．Ｈ．Ｌ．Ｓｐｉｅｇ＠ｌｂａｒｇ，Ｃ． 入．
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ｉｎｓ ａｎｄ Ｓ．竺二國！りヱ匹， ４８２７，
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入． Ｍａｒｑｎｉ， Ｊ． Ｌｅｏｎｉ，Ｂ
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８６）．ａｎｄ １８． Ｂ． ：Ｉ． Ｓｕｔｔｏｎ ａｎｄ Ｄ．
Ｃ．Ｔｒａｎｓ． ｌλ， １コＯ （１９８コ
》．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９． Ｒ． Ｊ． Ｆｅｌｄｍａｎｎ， Ｈ
． Ｐｏｔｔｅｒ， ａｎｄ Ｃ．Ｍｏｌｅｃ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． ’旦， ６８３ （１９８１）
．ｐ．ｙ，（；ＩＢｕｄｅｍａｎｓ， ２０．Ｂ． 入．Ｎ＠ｗｍａｎ ａｎｄ Ｅ．Ａ
．Ｋａｂａｔ，Ｊ． 工ｍｍｕｎＯｌ− １１（（
１９８５）． ２１． Ｋ． Ｔａｋｅｏ ａｎｄ１９７Ｂ． 入． Ｋａｂａｔ， Ｊ． エｍｍｕｎｏｌ． １２１， ２コ０５， ２２． Ｓ． Ｌ．．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｌ．
入． ＷｉＩＩＩｓ， Ｓ． Ｃ． Ｗａ
ｌｌｉｃｋ， Ｌ． Ｋ． Ｔａｎａｎｄ Ｖ．
Ｔ． Ｏｉ， Ａｎｎａｌｓ ！！． Ｘ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． （ｉｎ ｐｒｅｓｓ）．２コ．
Ｊ． Ｄａｎｇｙｌ， Ｔ． Ｗｅｎｓｅｌ，
Ｌ． ＳＬｒｙｅｒ， Ｓ． Ｌ． ｝Ｉｏ
ｒｒｉｓｏｎ，入．＋ｌｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，ａｎｄ
Ｖ． 丁．０１，ｉｎ ｐｒｅｓｓ及びイソタイプ交
換を示す． 第２Ａ図は、［３ＳＳ］−Ｎｅｔ標識分泌Ｉｆのバパイ
ン分解後に得られた免疫沈降物のＳＯＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動分析を示す。
第２Ｂ図は、［”Ｃ］一グルコサミン標識分泌Ｉ３のバ
パイン分解後に得られた免疫沈降物のＳＯＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を示す． 第３図は、コンカナバリン＾（Ｃｏｎ＾）吸着及び／ま
たはツニカマイシン処理後のウサギ抗ヒｌｌｙフラグメ
ント不変部（Ｆｃ）抗血清で免疫沈降した［３ＳＳ］−
Ｎｅｔ標識トランスフェク１・−マ培養上清の１２．５
％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＯＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動の分析を示す．第３八図は、分泌トランスフェクト
ーマＩｇのＣｏｎ＾−セファロース吸着を示し、また第
３Ｂ図は、Ｃｏｎ＾−セファロース吸着を用いた場合及
び用いない場合のツニ力マイシン処理細胞の上清を示す
。
パイン分解後に得られた免疫沈降物のＳＯＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を示す． 第３図は、コンカナバリン＾（Ｃｏｎ＾）吸着及び／ま
たはツニカマイシン処理後のウサギ抗ヒｌｌｙフラグメ
ント不変部（Ｆｃ）抗血清で免疫沈降した［３ＳＳ］−
Ｎｅｔ標識トランスフェク１・−マ培養上清の１２．５
％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＯＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動の分析を示す．第３八図は、分泌トランスフェクト
ーマＩｇのＣｏｎ＾−セファロース吸着を示し、また第
３Ｂ図は、Ｃｏｎ＾−セファロース吸着を用いた場合及
び用いない場合のツニ力マイシン処理細胞の上清を示す
。
第４図は、可溶性デキストランによるデキストラン被覆
ＥＬＩＳ＾プレートに対する抗体結合の阻害を示す． 第５図は、２つのブライマーの特定部位の突然変異誘発
の概略全体図を示す．
ＥＬＩＳ＾プレートに対する抗体結合の阻害を示す． 第５図は、２つのブライマーの特定部位の突然変異誘発
の概略全体図を示す．
Claims (49)
- （１）炭水化物が抗体の可変部の炭水化物認識部位に結
合し従って該抗体に結合するような条件下に、抗体の可
変部に炭水化物認識部位を導入することを特徴とする対
応抗原に対する抗体の親和性を変える方法。 - （２）抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とす
る請求項１に記載の方法。 - （３）抗体がヒト抗体であることを特徴とする請求項１
に記載の方法。 - （４）炭水化物認識部位が抗体の第２超可変部に導入さ
れることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - （５）炭水化物認識部位が、炭水化物認識部位を通常は
含まない抗体の可変部に導入されることを特徴とする請
求項１に記載の方法。 - （６）炭水化物認識部位が、抗体の可変部をコードする
ＤＮＡの特定部位の突然変異誘発によつて抗体の可変部
に導入されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - （７）炭水化物が抗体の可変部の炭水化物認識部位に結
合し従って抗体に結合するような条件下に、抗体の可変
部に炭水化物認識部位を導入することを特徴とする回収
または精製容易な抗体の産生方法。 - （８）抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とす
る請求項７に記載の方法。 - （９）抗体がヒト抗体であることを特徴とする請求項７
に記載の方法。 - （１０）炭水化物認識部位が抗体の第２超可変部に導入
されることを特徴とする請求項７に記載の方法。 - （１１）炭水化物認識部位が、炭水化物認識部位を通常
は含まない抗体の可変部に導入されることを特徴とする
請求項７に記載の方法。 - （１２）炭水化物認識部位が、抗体の可変部をコードす
るＤＮＡの特定部位の突然変異誘発によって抗体の可変
部に導入されることを特徴とする請求項５に記載の方法
。 - （１３）天然には可変部に炭水化物認識部位を含まない
抗体の該可変部に遺伝子操作を実施して形成された炭水
化物認識部位を含むことを特徴とする天然に産生されな
い抗体。 - （１４）請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
- （１５）請求項１３に記載のヒト抗体。
- （１６）対応抗原に対する親和性が増強されていること
を特徴とする請求項１３に記載の抗体。 - （１７）検出可能なマーカーで標識されていることを特
徴とする請求項１３に記載の抗体。 - （１８）検出可能なマーカーが発色団、蛍光団または放
射性物質であることを特徴とする請求項１７に記載の抗
体。 - （１９）請求項１６の抗体が結合した固体担体。
- （２０）請求項１の方法によって調製された改質抗体。
- （２１）更に、抗体の可変部に遺伝子操作を実施して形
成された炭水化物認識部位に結合した炭水化物を含むこ
とを特徴とする請求項１３に記載の抗体。 - （２２）可変部が抗体の第２超可変部であることを特徴
とする請求項１３に記載の抗体。 - （２３）請求項２１の抗体をコードするＤＮＡ。
- （２４）抗体の不変部に天然に存在する炭水化物認識部
位を抗体の不変部から欠失させることを特徴とする抗体
の炭水化物含量を変化させる方法。 - （２５）抗体がモノクローナル抗体であることを特徴と
する請求項２４に記載の方法。 - （２６）抗体がヒト抗体であることを特徴とする請求項
２４に記載の方法。 - （２７）抗体の不変部から炭水化物認識部位を欠失させ
るために、抗体の該不変部をコードするＤＮＡの特定部
位の突然変異誘発を行なわせることを特徴とする請求項
２４に記載の方法。 - （２８）抗体の不変部に天然に存在しない炭水化物認識
部位を抗体の該不変部に付加することを特徴とする抗体
の炭水化物含量を変化させる方法。 - （２９）抗体に炭水化物認識部位を付加するために、抗
体の不変部をコードするＤＮＡの特定部位の突然変異誘
発を行なわせることを特徴とする請求項２８に記載の方
法。 - （３０）請求項２４の方法を使用して抗体の炭水化物含
量を変化させることを特徴とする抗体の生物学的エフェ
クター機能を変える方法。 - （３１）天然には不変部に炭水化物認識部位を含む抗体
の該不変部に炭水化物認識部位が存在しないことを特徴
とする天然に産生されないヒト抗体。 - （３２）請求項３１に記載のヒトモノクローナル抗体。
- （３３）天然には不変部に炭水化物認識部位を含まない
抗体の該不変部に炭水化物認識部位が存在することを特
徴とする天然に産生されないヒト抗体。 - （３４）請求項３３に記載のヒトモノクローナル抗体。
- （３５）炭水化物認識部位に結合した炭水化物を含むこ
とを特徴とする請求項３３に記載のヒト抗体。 - （３６）前記炭水化物に標識が結合されていることを特
徴とする請求項３５に記載の標識抗体。 - （３７）請求項３５の抗体と治療用リガンドとを含み、
前記リガンドが前記抗体に結合した炭水化物に結合して
いることを特徴とする請求項３５に記載の治療剤。 - （３８）請求項２４の方法によって調製された改質抗体
。 - （３９）請求項２８の方法によって調製された改質抗体
。 - （４０）請求項３１の抗体をコードするＤＮＡ。
- （４１）請求項３３の抗体をコードするＤＮＡ。
- （４２）サンプル中の物質が抗体との検出可能な複合体
を形成するような条件下に、サンプルと前記物質に対す
る請求項１７の抗体とを接触させ、複合体を検出し、こ
れに基づいて物質を検出することを特徴とするサンプル
中の物質の存在の高感度検出方法。 - （４３）抗体が固体担体に結合されていることを特徴と
する請求項４２に記載の方法。 - （４４）形成された複合体の量を測定し、これに基づい
てサンプル中に存在する物質の量を測定することを特徴
とする請求項４２に記載の方法。 - （４５）サンプル中の物質が抗体との複合体を形成する
条件下に、サンプルと前記物質に対する請求項１３の抗
体とを接触させ、得られた複合体から前記物質を回収す
ることを特徴とする物質含有サンプルからの物質の回収
方法。 - （４６）抗体が固体担体に結合されていることを特徴と
する請求項４５に記載のクロマトグラフィー方法。 - （４７）物質が精製形態で回収される条件下に、請求項
４５の方法でサンプルから該物質を回収することを特徴
とする物質の精製方法。 - （４８）請求項１３の抗体を含む診断用検査キット。
- （４９）請求項１７の抗体を含む診断用検査キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US24474488A | 1988-09-15 | 1988-09-15 | |
| US244744 | 1988-09-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02231097A true JPH02231097A (ja) | 1990-09-13 |
Family
ID=22923952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1239736A Pending JPH02231097A (ja) | 1988-09-15 | 1989-09-14 | 炭水化物含量を変化させた抗体及びその製造及び使用方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6218149B1 (ja) |
| EP (1) | EP0359096B1 (ja) |
| JP (1) | JPH02231097A (ja) |
| AT (1) | ATE159982T1 (ja) |
| DE (1) | DE68928427T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013051294A1 (ja) * | 2011-10-05 | 2013-04-11 | 中外製薬株式会社 | 糖鎖受容体結合ドメインを含む抗原の血漿中からの消失を促進する抗原結合分子 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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