MXPA06011796A

MXPA06011796A - Anticuerpos especificos de fc(riib y metodos para el uso de los mismos.

Info

Publication number: MXPA06011796A
Application number: MXPA06011796A
Authority: MX
Inventors: Scott Koenig; Maria Concetta Veri; Nadine Tauillon; Ezio Bonvini; Jeffrey Stavenhagen; Christopher Rankin
Original assignee: Macrogenics Inc
Priority date: 2004-04-16
Filing date: 2005-04-15
Publication date: 2007-05-07
Also published as: IL178593A0; CA2563314A1; JP5367982B2; WO2005115452A3; SG173322A1; KR20070038453A; JP2007532139A; IL178593A; WO2005115452A9; US20050260213A1; AU2005247301A1; AU2005247301B2; WO2005115452A2; EP1747237A2; EP1747237A4

Abstract

La presente invencion se relaciona a anticuerpos o fragmentos de los mismos que unen especificamente Fc(RIIB, particularmente Fc(RIIB humano, con mayor afinidad que los anticuerpos o fragmentos de los mismos unen Fc(RIIA, particularmente Fc(RIIA humano. La presente invencion tambien proporciona el uso de un anticuerpo anti- Fc(RIIB o un fragmento que une antigeno del mismo, como una terapia de agente unico para el tratamiento, prevencion, manejo o disminucion de cancer, de preferencia una malignidad de celulas B o linfoma no Hodgkiniano, un trastorno autoinmune, un trastorno inflamatorio, un trastorno alergico mediado por IgE, o uno o mas sintomas de los mismos. La invencion proporciona metodos para mejorar el efecto terapeutico de anticuerpos terapeuticos administrando los anticuerpos de la invencion para mejorar la funcion efectora de los anticuerpos terapeuticos. La invencion tambien proporciona metodos para mejorar la eficiencia de una composicion de vacuna administrando los anticuerpos de la invencion.

Description

ANTICUERPOS ESPECÍFICOS DE Fc?RIIB Y MÉTODOS PARA EL USO DE LOS MISMOS 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a anticuerpos o fragmentos de los mismos que enlazan específicamente Fc?RIIB, particularmente Fc?RIIB humano, con mayor afinidad que los anticuerpos o fragmentos de los mismos enlazan Fc?RIIA, particularmente Fc?RIIA humano. La presente invención abarca también el uso de un anticuerpo anti-Fc?RIIB o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, como una terapia de agente sencillo para el tratamiento, la prevención, el manejo o el progreso de un cáncer, de preferencia, una malignidad de célula B, particularmente, leucemia linfocítica crónica de célula B o linfoma no Hodgkin, un trastorno autoinmune, un trastorno inflamatorio, un trastorno alérgico mediado por IgE, o uno o más síntomas de los mismos. La presente invención abarca también el uso de un anticuerpo anti-Fc?RIIB o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, en combinación con otras terapias de cáncer. La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-Fc?RIIB o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, en cantidades efectivas para prevenir, tratar, manejar o mejorar un cáncer, tal como una malignidad de célula B, un trastorno autoinmune, un trastornos inflamatorio, un trastorno alérgico mediado por IgE, o uno o más síntomas de los mismos. La invención proporciona además métodos para mejorar el efecto terapéutico de anticuerpos terapéuticos al administrar los anticuerpos de la invención para mejorar la función efectora de los anticuerpos terapéuticos. La invención proporciona también métodos para mejorar la eficacia de una composición de vacuna al administrar los anticuerpos de la invención con una composición de vacuna. 2. ANTECEDENTES DE LA INV?NCIÓN 2.1 RECEPTORES Fc Y SUS PAPELES EN EL SISTEMA INMUNE La interacción de los complejos de anticuerpo-antígeno con las células del sistema inmune resulta en una amplia gama de respuestas, variando desde las funciones efectoras tales como citotoxicidad dependiente de anticuerpos, desgranulación de mastocitos y fagocitosis a señales inmunomoduladoras tales como al regular la proliferación de linfocitos y la secreción de anticuerpos.

Todas estas interacciones se inician mediante el enlace del dominio de Fc de anticuerpos o complejos inmunes a receptores de superficie celular especializados en células hematopoyéticas. La diversidad de respuestas celulares accionadas por anticuerpos y complejos inmunes resulta a partir de la heterogeneidad estructural de los receptores Fc. Los receptores Fc comparten estructuralmente dominios de enlace de ligandos relacionados los cuales median presumiblemente la señalización intracelular. Los receptores Fc, miembros de la superfamilia de gen inmunoglobulina de proteínas, son glicoproteínas de superficie que pueden enlazar la porción Fc de moléculas de inmunoglobulina. Cada miembro de la familia reconoce inmunoglobulinas de uno o más isotipos a través de un dominio de reconocimiento en la cadena del receptor Fc. Los receptores Fc se definen por su especificidad para subtipos de inmunoglobulina. Receptores Fc para IgG se refieren como Fc?R para IgE como FceR, y para IgA como FcaR. Diferentes células accesorias soportan receptores Fc para anticuerpos de diferentes isotipos, y el isotipo del anticuerpo determina cuáles células accesorias se activarán en una respuesta dada (revisada por Ravetch J. V. et al . 1991, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92; Gerber J. S. et al . 2001 Mirobes and Infection, 3: 131-139; Billadeau D.D. et al . 2002, The Journal of Clinical Investigation, 2(109): 161-1681; Ravetch J.V. et al . 2000, Science, 290: 84-89; Ravetch J.V. et al . r 2001 Annu. Rev. Immunol. 19:275-90; Ravetch J.V. 1994, Cell, 78(4): 553-60). Los diferentes receptores Fc, las células que los expresan, y su especificidad de isotipo se resumen en la Tabla 1 (adaptada a partir de Immunobiology: The I mune System in Health and Disease, 4a edición, 1999; Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New York) . Receptores Fc? Cada miembro de esta familia es una glicoproteína de membrana integral, que posee dominios extracelulares relacionados a un conjunto C2 de dominios relacionados con inmunoglobulinas, un dominio de intervalo de membrana sencilla y un dominio intracitoplásmico de longitud variable. Existen tres Fc?Rs conocidos, denominados Fc?RI(CD64), Fc?RII(CD32) y Fc?RIII (CD16) . Los tres receptores se codifican por distintos genes; sin embargo, la amplia homología entre los tres miembros familiares sugiere que se originan desde un progenitor común quizás por duplicación genética. Esta invención se enfoca específicamente en Fc?RII(CD32) . Fc?RII (CD32) Proteínas Fc?RII son glicoproteínas de membrana integral 40KDa las cuales enlazan sólo la IgG compleja debida a una baja afinidad para Ig monomérica (106 M_1) . Este receptor es Fc?R más ampliamente expresado, presente en todas las células hematopoyéticas, incluyendo monocitos, macrófagos, células B, células NK, neutrófilos, mastocitos y plaquetas. Fc?RII tiene sólo dos regiones similares a inmunoglobulina en su cadena de enlace de inmunoglobulina y por lo tanto una afinidad mucho más baja para IgG que Fc?RI .

Existen tres genes Fc?RII humanos (Fc?RII-A, Fc?RII-B, Fc?RII-C) , todos los cuales enlazan IgG en agregados o complejos inmunes . Distintas diferencias dentro de los dominios citoplásmicos de Fc?RII-A (CD32A) y Fc?RII-B (CD32B) crean dos respuestas funcionalmente heterogéneas a ligación de receptor. La diferencia fundamental es que la isoforma A inicia señalización intracelular que conduce a la activación celular tal como fagocitosis y estallido respiratorio, mientras que la isoforma B inicia señales inhibidoras, por ejemplo, inhibiendo activación de célula B. Señalización mediante Fc?Rs Tanto señales de activación como inhibidoras se transducen a través de Fc?Rs después de la ligación. Estas funciones diametralmente opuestas resultan desde diferencias estructurales entre las diferentes isoformas receptoras. Dos distintos dominios dentro de los dominios de señalización citoplásmica del receptor llamados motivos de activación con base en inmunoreceptor tirosina (ITAMs) o motivos inhibidores basados en el inmunoreceptor tirosina (ITIMS) constituye las diferentes respuestas. El reclutamiento de diferentes enzimas citoplásmicas a estas estructuras estipula el resultado de respuestas celulares mediadas por Fc?R. Los complejos de Fc?R que contienen ITA incluyen Fc?RI, Fc?RIIA, Fc?RIIIA, mientras que complejos que contienen ITIM sólo incluyen Fc?RIIB.

Los neutrófilos humanos expresan el gen Fc?RIIA. El grupo de Fc?RIIA mediante complejos inmunes o reticulación de anticuerpo específico sirven para agregar ITAMs junto con las cinasas asociadas a receptores las cuales facilitan la fosforilación de I AM. La fosforilación de ITAM sirve como un sitio de acoplamiento para la cinasa Syk, la activación de cuyos resultados en activación de sustratos corriente abajo (por ejemplo, PI3K) . La activación celular conduce a la liberación de mediadores pro-inflamatorios. El gen Fc?RIIB se expresa en linfocitos B; su dominio extracelular es 96% idéntico a Fc?RIIA y enlaza los complejos IgG en una manera indistinguible. La presencia de ITIM en el dominio citoplásmico de Fc?RIIB define esta subclase inhibidora de Fc?R. Recientemente, la base molecular de esta inhibición se estableció. Cuando se coligan junto con un Fc?R de activación, el ITIM en Fc?RIIB llega a fosforilarse y atraen el dominio SH2 de la inositol polifosfato 5' -fosfatasa (SHIP) , la cual hidroliza mensajeros fosfoinositol liberado como una consecuencia de activación de tirosina cinasa mediada por Fc?R que contiene ITAM, evitando consecuentemente el influjo de Ca++ intracelular. De este modo, la reticulación de Fc?RIIB desestimula la respuesta de activación a ligación Fc?R e inhibe la sensibilidad celular. La activación de célula B, proliferación de célula B y secreción de anticuerpo se cancela de este modo.

TABLA 1. Receptores para las Regiones Fc de Isotipos de Inmunoglobulina 15 2.2 ENFERMEDADES DE RELEVANCIA 2.2.1 CÁNCER Un neoplasma, o tumor, es una masa neoplástica que resulta a partir del crecimiento celular no controlado anormal el cual puede ser benigno o maligno. Los tumores benignos persisten generalmente localizados. Los tumores malignos se denominan conjuntamente cánceres. El término "maligno" generalmente significa que el tumor puede invadir y destruir estructuras corporales adyacentes y se dispersan a distintos sitios para provocar muerte (para revisión, véase Robbins y Angelí, 1976, Basic Pathology, 2a. edición, W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-122). El cáncer puede originarse en muchos sitios del cuerpo y comportarse de forma diferente dependiendo de su origen. Las células cancerosas destruyen la parte del cuerpo en la cual se originan y luego se dispersan la o las otras partes del cuerpo en donde inicia el nuevo crecimiento y provoca más destrucción. Más de 1.2 millones de americanos desarrollan cáncer cada año. El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos y si las tendencias actuales continúan, se espera que el cáncer sea la causa principal de muerte para el año 2010. El cáncer de pulmón y de próstata son los máximos exterminadores cancerígenos para hombres en los Estados Unidos . El cáncer de pulmón y de mama son los máximos exterminadores cancerígenos para mujeres en los Estados Unidos. Uno de dos hombres en los Estados Unidos será diagnosticado con cáncer en algún momento durante su vida. Una de tres mujeres en los Estados Unidos será diagnosticada con cáncer en algún momento durante su vida. Una cura para el cáncer tiene aún que encontrarse. Opciones de tratamiento actuales, tales como cirugía, quimioterapia y tratamiento por radiación, a menudo son ya sea inefectivas o presentan efectos secundarios serios. 2.2.1.1 MALIGNIDADES DE CÉLULA B Las malignidades de célula B, incluyendo, pero sin limitarse a linfomas de célula B y leucemias, son enfermedades neoplásticas con incidencia significativa en los Estados Unidos. Existen aproximadamente 55,000 nuevos casos de linfomas por año en los Estados Unidos (datos 1998), con un estimado de 25,000 muertes por año. Esto representa 4% de incidencia de cáncer y 4% de todas las muertes relacionadas con cáncer en la población norteamericana. La clasificación europea-americana revisada de neoplasmas linfoides (clasificación 1994 REAL, modificada 1999) linfomas agrupados con base en su origen como cualquier linfoma de linaje de célula B, linfoma de linaje de célula T, o linfoma Hodgkin. El linfoma del linaje de célula B es el tipo más común de linfoma sin Hodgkin (NHL) diagnosticado en los Estados Unidos (Williams, Hematology 6a. edición (Beutler et al . Ed. ) , McGraw Hill 2001) . La leucemia linfocítica crónica (CLL) es una enfermedad neoplástica caracterizada por la acumulación de pequeños linfocitos que parecen maduros en la sangre, la médula ósea y los tejidos linfoides. La CLL tiene una incidencia de 2.7 casos por 100,000 en los Estados Unidos. El riesgo se incrementa progresivamente con la edad, particularmente en los hombres. Esto representa 0.8% de todos los cánceres y es la leucemia adulta más común, responsable del 30% de todas las leucemias. En casi todos los casos (>98%) las células enfermas pertenecen al linaje de linfocito B. Un linfoma linfocítico pequeño de variante no leucémico, constituye 5-10% de todos los linfomas, tiene características histológicas, morfológicas e inmunológicas indistinguibles desde aquel de los nodulos linfáticos implicados en pacientes con B-CLL (Williams, 2001) . La historia natural de la leucemia linfocítica crónica incide en varias fases. En la fase temprana, la leucemia linfocítica crónica es una enfermedad indolora, caracterizada por la acumulación de células B malignas funcionalmente incompetentes, maduras, pequeñas que tienen una vida útil prolongada. Eventualmente, el tiempo de duplicación de las células B malignas disminuye y los pacientes llegan a ser incrementadamente sintomáticos. Aunque el tratamiento con agentes quimioterapéuticos puede proporcionar alivio sintomático, la supervivencia total de los pacientes se extiende sólo al mínimo. Las últimas fases de leucemia linfocítica crónica se caracterizan por anemia significativa y/o trombocitopenia. En este punto, la supervivencia media es menor de dos años (Foon et al . , 1990, Annals Int. Medicine 113:525). Debido a la velocidad muy baja de proliferación celular, la leucemia linfocítica crónica es resistente al tratamiento con agentes quimioterapéuticos. Recientemente, estudios de expresión genética han identificado varios genes que pueden sobre-regularse en trastornos linfoproliferativos . Una molécula pensada para sobre-expresarse en pacientes con leucemia linfocítica crónica de célula B (B-CLL) y en una gran fracción de pacientes de linfoma sin Hodking es CD32B (Alizadeh et al . , 2000, Nature 403:503-511; Rosenwald et al . , 2001, J. Exp. Med. 184:1639-1647). Sin embargo, el papel de CD32B es B-CLL es incierto ya que un reporte demuestra que CD32B se expresa en un porcentaje bajo de células B-CLL y a una baja densidad (Damle et al . , 2002, Blood 99:4087-4093). CD32B es un antígeno de superficie de linaje de célula B, cuya sobre-expresión en la neoplasia de célula B hace un objetivo adecuado para anticuerpos terapéuticos. Además, CD32B pertenece a la categoría de receptores inhibidores, cuya ligación transmite una señal negativa. Por lo tanto, los anticuerpos dirigidos contra CD32B podrían funcionar para eliminar células tumorales por mecanismos que incluyen citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) , citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , pero también acciona una señal apoptótica. La homología elevada de CD32B con su contraparte, CD32A, un receptor Fc? de activación, ha dificultado hasta el momento la generación de anticuerpos que reconocen selectivamente una, pero no la otra forma de la molécula. 2.2.1.2 Terapia de Cáncer Actualmente, la terapia de cáncer puede implicar cirugía, quimioterapia, terapia hormonal y/o tratamiento de radiación para erradicar células neoplásticas en un paciente (Véase por ejemplo, Stockdale, 1998, "Principies of Cáncer Patient Management", en Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein y Federman, eds., Capítulo 12, Sección IV). Recientemente, la terapia de cáncer podría también implicar terapia biológica o inmunoterapia. Todos estos métodos poseen desventajas notables para el paciente. La cirugía, por ejemplo puede contraindicarse debido a la salud del paciente o puede ser inaceptable para el paciente. Adicionalmente, la cirugía no puede remover completamente el tejido neoplástico. La terapia por radiación es sólo efectiva cuando el tejido neoplástico exhibe una sensibilidad más elevada a la radiación que el tejido normal, y la terapia por radiación puede también con frecuencia producir efectos secundarios serios. La terapia hormonal se imparte raramente como un solo agente y aunque puede ser efectiva, se utiliza con frecuencia para prevenir o retardar la reincidencia de cáncer después que otros tratamientos han removido la mayoría de las células cancerígenas. Terapias biológica/inmunoterapias se limitan en número y pueden producir efectos secundarios tales como sarpullido o abultamientos, síntomas similares a gripe, incluyendo fiebre, escalofríos y fatiga, problemas de tracto digestivo o reacciones alérgicas. Con respecto a la quimioterapia, existe una variedad de agentes quimioterapéuticos disponibles para el tratamiento de cáncer. Una mejoría notable de quimioterapéuticos cancerígenos actúa inhibiendo la síntesis de ADN, ya sea directa o indirectamente, inhibiendo la biosíntesis de los precursores de desoxiribonucleótido trifosfato, que evitan la replicación de ADN y la división celular simultánea (Véase, por ejemplo, Gilman, et al . , Goodman y Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, octava edición (Pergamom Press, New York, 1990) ) . Estos agentes, los cuales incluyen agentes de alquilación, tales como nitrosourea, anti-metabolitos, tales como metotrexato e hidroxiurea, y otros agentes,, tales como etoposidas, canfotecinas, bleomicina, doxorubicina, daunorubicina, etc., aunque no necesariamente linfocitos citolíticos específicos del ciclo celular durante la fase S debido a su efecto en la replicación de ADN. Otros agentes, específicamente colquicina y los vinca-alcaloides, tales como vinblastina y vincristina, interfieren con ensamble de microtúbulo que resultan en detención mitótica. Los protocolos de quimioterapia generalmente implican la administración de una combinación de agentes quimioterapéuticos para incrementar la eficacia de tratamiento. A pesar de la disponibilidad de una variedad de agentes quimioterapéuticos, la quimioterapia tiene muchas desventajas (Véase, por ejemplo, Stockdale, 1998, "Principies Of Cáncer Patient Management" en Scientific American Medicine, vol. 3, Rubenstein y Federman, eds., capítulo 12, sección 10) . Casi todos los agentes quimioterapéuticos son tóxicos y la quimioterapia provoca efectos secundarios, notables y con frecuencia peligrosos, incluyendo náusea severa, depresión de la médula ósea, inmunosupresión, etc. Además, incluso con la administración de combinaciones de agentes quimioterapéuticos, muchas células tumorales son resistentes o desarrollan resistencia a los agentes quimioterapéuticos. De hecho, aquellas células resistentes a los agentes quimioterapéuticos particulares utilizados en el protocolo de tratamiento con frecuencia resultan ser resistentes a otros fármacos, incluso aquellos agentes que actúan por diferentes mecanismos a partir de los mecanismos de acción de los fármacos utilizados en el tratamiento específico; este fenómeno se llama fármaco pleiotrópico o resistencia a fármacos múltiples. De este modo, debido a la resistencia de los fármacos, muchos cánceres son resistentes a protocolos de tratamiento quimioterapéutico estándar. La malignidad de célula B se trata generalmente con quimioterapia de agente sencillo, quimioterapia por combinación y/o terapia por radiación. Estos tratamientos pueden reducir la morbilidad y/o mejoran la supervivencia, a pesar de que portan efectos secundarios notables. La respuesta de las malignidades de célula B a varias formas de tratamiento se mezcla. Por ejemplo, en casos en los cuales la etapa clínica adecuada de linfoma no Hodgkin es posible, la terapia por radiación de campo puede proporcionar tratamiento satisfactorio. Ciertos pacientes, sin embargo, no responden y la recurrencia de la enfermedad con la resistencia al tratamiento se presenta con el tiempo, particularmente con las variantes más agresivas de la enfermedad. Alrededor de la mitad de los pacientes mueren por la enfermedad (Devesa et al . , 1987, Nat'l Cáncer Inst . 79:701). Terapias de investigación para el tratamiento de neoplasia de células B resistentes incluyen transplante de célula madre o de médula ósea antologa y alogénica y terapias genéticas. Recientemente, la inmunoterapia que utiliza anticuerpos monoclonales a antígenos específicos de célula B objetivo se ha introducido en el tratamiento de neoplasia de célula B. El uso de anticuerpos monoclonales que dirigen radionúclidos, toxinas u otros agentes terapéuticos ofrecen la posibilidad que tales agentes puedan suministrarse selectivamente a sitios de tumor, limitando de este modo la toxicidad a tejidos normales. Existe una necesidad notable para tratamientos de cáncer alternativos, particularmente para tratamiento de cáncer que ha demostrado ser resistente a tratamientos de cáncer estándar, tales como cirugía, terapia por radiación, quimioterapia y terapia hormonal . Una alternativa prometedora es la inmunoterapia, en la cual las células cancerígenas se dirigen específicamente por anticuerpos específicos de antígeno de cáncer. Mayores esfuerzos se han dirigido para controlar la especificidad de la respuesta inmune, por ejemplo, tecnología de hibridoma ha permitido el desarrollo de anticuerpos monoclonales selectivos de tumor (Véase Green M.C. et al . , 2000 Cáncer Treta Rev., 26: 269-286; Weiner LM, 1999 Semin Oncol. 26 (suppl. 14):43-51), y en años anteriores, la Administración de Alimentos y Fármacos ha aprobado los primeros MAbs para terapia de cáncer: Rituxin (anti-CD20) para linfoma sin Hodgkin, Campath (anti-CD52) para leucemia linfocítica crónica de célula B (B-CLL) y Herceptin [anti-(c-erb-/ER-2) ] para cáncer de mama metastático (Suzanne A. Eccles, 2001, Breast Cáncer Res., 3: 86-90). NHL y B-CLL son dos de las formas más comunes de neoplasia de célula B. Estos anticuerpos han demostrado eficacia clínica, pero su uso no es sin efectos secundarios. La potencia de la función efectora de anticuerpo, por ejemplo, para mediar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos ("ADCC") en un obstáculo a tal tratamiento. Además, con Rituxan y Campath, al menos la mitad de los pacientes no responden y una fracción de encuestados puede ser resistente a tratamientos subsecuentes. Existe una necesidad para terapia alternativas para cáncer, particularmente, malignidades de célula B, especialmente para pacientes que son resistentes para tratamientos de cáncer estándares y nuevas inmunoterapias tales como Rituxan. 2.2.2 ENFERMEDADES INFLAMATORIAS Y ENFERMEDADES AUTOINMUNES La inflamación es un proceso por el cual los glóbulos blancos del cuerpo y los químicos protegen nuestro cuerpo a partir de infección por sustancias extrañas, tales como bacterias y virus. Ésta se caracteriza usualmente por dolor, hinchazón, temperatura, inflamación del área afectada. Los químicos conocidos como citoquinas y prostaglandinas controlan este proceso, y se liberan en una cascada ordenada y auto-limitante dentro de la sangre o tejidos afectados.

Esta liberación de químicos incrementa el flujo sanguíneo al área del daño o afección, y puede resultar en la inflamación y temperatura. Algunos de los químicos provocan una fuga de fluido dentro de tejidos, resultando en hinchazón. Este proceso protector puede estimular nervios y provoca dolor. Estos cambios, cuando ocurren durante un periodo limitado en el área relevante, trabaja para sacar provecho del cuerpo. En trastornos autoinmunes y/o inflamatorios, el sistema inmune acciona una respuesta inflamatoria cuando no existen sustancias extrañas para combatir y el sistema inmune normalmente protector del cuerpo provoca daño a sus propios tejidos atacándolo equivocadamente. Existen muchos diferentes trastornos autoinmunes los cuales afectan el cuerpo en diferentes formas. Por ejemplo, el cerebro se afecta en individuos con esclerosis múltiple, el intestino se afecta en individuos con enfermedad de Crohn, y el sinovio, hueso y cartílago de varias articulaciones se afectan en individuos con artritis reumatoide. Cuando los trastornos autoinmunes desarrollan la destrucción de uno o más tipos de tejidos corporales, el crecimiento anormal de un órgano, o los cambios en la función del órgano puede resultar. El trastorno autoinmune puede afectar sólo un tipo de órgano o tejido o puede afectar múltiples órganos y tejidos. Los órganos y tejidos comúnmente afectados por trastornos autoinmunes incluyen glóbulos rojos, vasos sanguíneos, tejidos conjuntivos, glándulas endocrinas (por ejemplo, la tiroides o el páncreas), músculos, articulaciones y piel. Ejemplos de trastornos autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, tiroiditis de Hashimoto, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, diabetes del tipo 1, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, dermatomiositis, síndrome de Sjogren, dermatomiositis, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, miastenia gravis de enfermedad de oído interno autoinmune, síndrome de Reiter, enfermedad de Graves, hepatitis autoinmune, poliposis adenomatoso familiar y colitis ulcerativa. La artritis reumatoide (RA) y la artritis reumatoide juvenil son tipos de artritis inflamatoria. La artritis es un término general que describe la inflamación en las articulaciones. Algunos, pero no todos los tipos de artritis son el resultado de inflamación mal orientada. Además de artritis reumatoide, otros tipos de artritis asociados con la inflamación incluyen lo siguiente: artritis psoriática, síndrome de Reiter, artritis de espondilitis anquilosante y artritis gotosa. La artritis reumatoide es un tipo de artritis crónica que ocurre en articulaciones en ambos lados del cuerpo (tales como ambas manos, muñeca o rodilla) . Esta simetría ayuda a distinguir artritis reumatoide de otros tipos de artritis. Además de afectar las articulaciones, la artritis reumatoide puede afectar ocasionalmente la piel, los ojos, los pulmones, el corazón, la sangre o los nervios. La artritis reumatoide afecta aproximadamente 1% de la población mundial y se desactiva potencialmente. Existen aproximadamente 2.9 millones de incidencia de artritis reumatoide en los Estados Unidos. Dos de tres veces más mujeres son afectadas que hombres. La edad típica en que ocurre la artritis reumatoide está entre 25 y 50. La artritis reumatoide juvenil afecta 71,000 jóvenes americanos (dieciocho años o menos de edad) , afectando seis veces tantas mujeres como hombres. La artritis reumatoide es un trastorno autoinmune en donde el sistema inmune del cuerpo identifica inapropiadamente las membranas sinoviales que secretan el fluido de lubricación en las articulaciones como extrañas. La inflamación resulta, y el cartílago y los tejidos en y alrededor de las articulaciones se dañan o destruyen. En casos severos, esta inflamación se extiende a otros tejidos de articulaciones y rodea el cartílago, en donde puede deteriorar o destruir hueso y cartílago y conduje a deformidades de articulaciones. El cuerpo reemplaza el tejido dañado con tejido conectivo, provocado los espacios normales dentro de las articulaciones para hacerse estrecho y los huesos para fusionarse juntos. La artritis reumatoide crea rigidez, hinchazón, fatiga, anemia, pérdida de peso, fiebre y con frecuencia dolor devastador. Algunos síntomas comunes de artritis reumatoide incluyen rigidez de articulaciones al despertar que dura una hora o más; hinchazón en un dedo específico o las articulaciones de la muñeca; hinchazón en el tejido suave alrededor de las articulaciones; e hinchazón en ambos lados de la articulación. La hinchazón puede ocurrir con o sin dolor, y puede empeorar progresivamente o persisten igual por años antes del progreso. El diagnóstico de artritis reumatoide se basa en una combinación de factores, incluyendo: la ubicación específica y la simetría de articulaciones dolorosas, la presencia de rigidez de articulaciones en la mañana, la presencia de protuberancias y nodulos bajo la piel (nodulos reumatoides) , resulta de pruebas de rayos X que sugieren artritis reumatoide y/o resultados positivos de una prueba sanguínea llamada el factor reumatoide. Mucha, pero no toda la gente con artritis reumatoide tiene el anticuerpo del factor reumatoide en su sangre. El factor reumatoide puede presentarse en gente quien no tiene artritis reumatoide. Otras enfermedades pueden provocar el factor reumatoide que se produce en la sangre. Es decir que el diagnóstico de artritis reumatoide se basa en una combinación de varios factores y no sólo la presencia del factor reumatoide en la sangre. El curso típico de la enfermedad es una de persistencia, pero fluctuando síntomas de articulaciones, y después de aproximadamente 10 años, 90% de los pacientes mostrarán daño estructural al hueso y al cartílago. Un pequeño porcentaje tendrá una dolencia corta que se despeja completamente, y otro pequeño porcentaje tendrá una enfermedad muy severa con muchas deformidades de articulaciones, y ocasionalmente otras manifestaciones de la enfermedad. El proceso inflamatorio provoco erosión o destrucción de hueso y cartílago en las articulaciones. En artritis reumatoide, existe un ciclo autoinmune de presentación de antígeno persistente, estimulación de célula T, secreción de citoquina, activación de célula sinovial y destrucción de articulaciones. La enfermedad tiene un impacto mayor tanto en el individuo como en la sociedad, provocando dolor notable, función deteriorada e invalidez, así como un costo de millones de dólares en gastos de asistencia médica y sueldos perdidos. (Véase por ejemplo, el sito web NIH y el sitio web NIAID) . La terapia actualmente disponible para artritis se enfoca en reducir la inflamación de las articulaciones con medicamentos anti-inflamatorios o inmunosupresivos. La primera línea de tratamiento de cualquier artritis es usualmente anti-inflamatorios, tales como aspirina, ibuprofeno e inhibidores de Cox-2 tales como celecoxib y rofecoxib. La "segunda línea de fármacos" incluye oro, metotrexato y esteroides. Aunque estos son tratamientos bien establecidos para artritis, muy pocos pacientes remiten en estas líneas de tratamiento solos. Avances recientes en el entendimiento de la patogénesis de artritis reumatoide ha conducido al uso de metotrexato en combinación con anticuerpos a citoquinas o receptores solubles recombinantes. Por ejemplo, los receptores solubles recombinantes para el factor de necrosis tumorales (TNF)-a han sido utilizados en combinación con metotrexato en el tratamiento de artritis. Sin embargo, sólo aproximadamente 50% de los pacientes tratados con una combinación de metotrexato y agentes anti-TNF-a tales como receptores solubles recombinantes para TNF-a muestran una mejora clínicamente notable. Muchos pacientes son resistentes a pesar del tratamiento. Inconvenientes difíciles al tratamiento persisten aún para pacientes con artritis reumatoide. Muchos tratamientos actuales tienen una alta incidencia de efectos secundarios o no pueden prevenir completamente el progreso de la enfermedad. Hasta ahora, ningún tratamiento es ideal, y no existe cura. Agentes terapéuticos novedosos son necesarios para tratar más efectivamente artritis reumatoide y otros trastornos autoinmunes . 2.2.3 ALERGIA Las reacciones alérgicas mediadas inmunes (hipersensibilidad) se clasifican en cuatro tipos (I-IV) de acuerdo a - los mecanismos subyacentes que conducen a la expresión de los síntomas alérgicos. Las reacciones alérgicas del tipo I se caracterizan por la liberación mediada por IgE de sustancias vasoactivas tales como histamina a partir de los mastocitos y los basófilos . La liberación de estas sustancias y la subsecuente manifestación de síntomas alérgicos se inician por la reticulación de IgE de enlace a alérgenos a su receptor en la superficie de los mastocitos y los basófilos. En individuos que sufren de reacciones alérgicas del tipo I, la exposición a un alérgeno para una segunda ocasión conduce a la producción de niveles elevados de anticuerpos IgE específicos para el alérgeno como un resultado de la implicación de memoria B y células T en la interacción de células 3 requeridas para la producción de IgE. Los niveles elevados de anticuerpos IgE producidos provoca un incremento en la reticulación de los receptores de IgE en mastocitos y basófilos por IgE enlazados por alérgenos, los cuales a su vez conduce a la activación de estas células y la liberación de mediadores farmacológicos que son responsables de las manifestaciones clínicas de enfermedades alérgicas del tipo I. Dos receptores con diferentes afinidades para IgE han sido identificados y caracterizados. El receptor de afinidad elevada (FceRI) se expresa en muchos tipos de células incluyendo células B, células T, macrófagos, eosinófilos y células Langerhan. El receptor IgE de alta afinidad consiste de tres subuhidades (cadenas alfa, beta y gamma) . Varios estudios han demostrado que sólo la cadena alfa está implicada en el enlace de IgE, mientras que las cadenas beta y gamma (las cuales son proteínas de transmembrana o citoplásmicas) se requieren para eventos de transducción de señal. La identificación de las estructuras IgE requerida para IgE para enlazarse a FceRI en mastocitos o basófilos es de importancia superior para desviar estrategias para el tratamiento o la prevención de alergias mediadas por IgE. Por ejemplo, el esclarecimiento del sitio de enlace del receptor IgE podría conducir a la identificación de péptidos o moléculas pequeñas que bloquean el enlace de IgE a células que soportan receptores in vivo. Actualmente, las reacciones alérgicas mediadas por IgE se tratan con fármacos tales como antihistaminas y corticoesteroides los cuales intentan aliviar los síntomas asociados con reacciones alérgicas al contrarrestar los efectos de las sustancias vasoactivas liberadas a partir de los mastocitos y basófilos. Altas dosis de antihistaminas y corticoesteroides tienen efectos secundarios nocivos (por ejemplo, alteración del sistema nervioso central, constipación, etc.). De este modo, otros métodos para tratar reacciones alérgicas del tipo I, son necesarios.

Un enfoque para el tratamiento de trastornos alérgicos del tipo I ha sido la producción de anticuerpos monoclonales los cuales reaccionan con IgE soluble (libre) en suero, IgE en bloque a partir del enlace a su receptor en mastocitos y basófilos, y sin enlace a IgE enlazado al receptor (es decir, no son anafilactogénicos) . Dos anticuerpos monoclonales están en etapas avanzadas de desarrollo clínico para el tratamiento de reacciones alérgicas mediadas por IgE (véase por ejemplo, Chang, T.W., 2000, Nature Biotechnology 18: 157-62). Uno de los tratamientos más prometedores para reacciones alérgicas mediadas por IgE es la inmunización activa contra epítopes no anafilactogénicos apropiados en IgE endógeno. Stanworth et al . (Patente Norteamericana No. 5,601,821) describe una estrategia que implica el uso de un péptido derivado a partir del dominio CeH4 del IgE humano acoplado a una proteína portadora heteróloga como una vacuna de alergia. Sin embargo, este péptido ha demostrado que no induce la producción de anticuerpos que reaccionan con IgE soluble nativo. Además, Hellman (Patente Norteamericana No. ,653,980) propone composiciones de vacuna anti-IgE basadas en la fusión de dominios CeH2-CeH3 de longitud total (aproximadamente 220 aminoácidos de largo) a una proteína portadora extraña. Sin embargo, los anticuerpos inducidos por composiciones de vacuna anti-IgE propuestos en Hellman resultarán probablemente en anafilaxis ya que los anticuerpos contra algunas porciones de los dominios de CeH2 y CeH3 de la molécula IgE han demostrado que reticulan el receptor IgE en la superficie del mastocito y los basófilos y conduce a la producción de mediadores de anafilaxis (Véase por ejemplo, Stadler et al . , 1993, Int. Arch. Allergy and Immunology 102:121-126). Por lo tanto, persiste una necesidad para el tratamiento de reacciones alérgicas mediadas por IgE las cuales no inducen anticuerpos anafilácticos . El problema notable sobre la inducción de anafilaxis ha resultado en el desarrollo de otro método para el tratamiento de trastornos alérgicos del tipo I que consiste de mimótopos que podrían inducir a la producción de anticuerpos policlonales anti-IgE cuando se administran a animales (Véase por ejemplo, Rudolf, et al . , 1998, Journal of Immunology 160:3315-3321). Kricek et al . (Publicación Internacional No. WO 97/31948) seleccionó bibliotecas de despliegue de fago con el anticuerpo monoclonal BSW17 para identificar mimótopos de péptido que podrían imitar la conformación del enlace del receptor IgE. Estos mimótopos podrían presumiblemente utilizarse para inducir anticuerpos policlonales que reaccionan con IgE nativos libres, pero no con IgE de enlace de receptor así como IgE de bloqueo a partir del enlace a su receptor. Kriek et al . describen mimótopos de péptido que no son homólogos a ninguna parte de la molécula de IgE y son de este modo diferentes a partir de péptidos descritos en la presente invención. Como se evidencia por un estudio de la técnica, persiste una necesidad para mejorar la eficacia terapéutica de métodos actuales para tratar o prevenir trastornos tales como cáncer, enfermedad autoinmune, trastorno inflamatorio o alergia. En particular, existe una necesidad para mejorar la función efectora, particularmente el efecto citotóxico de anticuerpos terapéuticos utilizados en el tratamiento de cáncer. El estado actual de la técnica está también carente para tratar o prevenir trastornos alérgicos (por ejemplo, ya sea por terapia de anticuerpos o terapia de vacunas) . 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Los dominios extracelulares de Fc?RIIA y Fc?RIIB son 95% idénticos y de este modo comparten numerosos epítopes. Sin embargo, Fc?RIIA y Fc?RIIB exhiben actividades muy diferentes. La diferencia fundamental es que el Fc?RIIA inicia la señalización intracelular que conduce a la activación celular tal como fagocitosis y estallido respiratorio, mientras que Fc?RIIB inicia la señalización inhibidora. Antes de esta invención, al conocimiento de los inventores, los anticuerpos conocidos para distinguirse entre el Fc?RIIA humano nativo y el Fc?RIIB humano nativo no se han identificado; en vista de sus distintas actividades y el papel para modular respuestas inmunes, tales anticuerpos que reconocen Fc?RIIB nativos, y Fc?RIIA no nativos son necesarios. La presente invención se basa, en parte en el descubrimiento de tales anticuerpos específicos de Fc?RIIB. La invención se relaciona a un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que enlaza específicamente Fc?RIIB, particularmente Fc?RIIB humano, más particularmente Fc?RIIB humano nativo, con una afinidad mayor que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA, particularmente Fc?RIIA humano, más particularmente Fc?RIIA humano nativo. De preferencia los anticuerpos de la invención enlazan el dominio extracelular de Fc?RIIB humano nativo. En ciertas modalidades de la invención, el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIB con al menos 2 veces mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA. En otras modalidades de la invención, el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIB con al menos 4 veces, al menos 6 veces, al menos 8 veces, al menos 10 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces, al menos 104, al menos 105, al menos 106, al menos 107, o al menos 108 veces mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA. En una modalidad preferida, el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIB con 100 veces, 1000 veces, 104 veces, 105 veces, 10d veces, 107 veces o 108 veces mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA. De preferencia, estas afinidades de enlace se determinan con la IgG monomérica, y no la IgG agregada, y el enlace es a través del dominio variable (por ejemplo, fragmentos Fab de los anticuerpos tienen una característica de enlace similar a la molécula de inmunoglobulina total) . En una modalidad, el anticuerpo específico de Fc?RIIB de acuerdo con la invención no es el anticuerpo monoclonal designado KB61, como se describe en Pulford et al . , 1986 (Immunology, 57: 71-76) o el anticuerpo monoclonal designado MAbII8D2 como se describen Weinrich et al . , 1996 (Hybridoma, 15 (2) : 109-6) . En una modalidad específica, el anticuerpo específico de Fc?RIIB de la invención no se enlaza al mismo epítope y/o no compite para el enlace con el anticuerpo monoclonal KB61 o el anticuerpo monoclonal MAbII8D2. De preferencia, el anticuerpo específico de Fc?RIIB de la invención no enlaza la secuencia de aminoácidos Ser-Asp-Pr.o-Asn-Phe-Ser-Ile que corresponde a las posiciones 135-141 de aminoácidos de la isoforma Fc?RIIb2. La invención se relaciona a un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que enlaza específicamente Fc?RIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlazan Fc?RIIA, como se determina por cualquier método estándar conocido en la técnica para evaluar especificidades. La invención se relaciona a un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que enlazan específicamente Fc?RIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA, como se determina, por ejemplo, por transferencia western, BIAcore o radioinmunoensayo. La invención se relaciona a un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que enlaza específicamente Fc?RIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA, como se determina en un ensayo ELISA, en el rango lineal para el enlace de Fc?RIIB. En una modalidad de la invención, la invención se relaciona a un anticuerpo aislado, o un fragmento del mismo que enlaza específicamente Fc?RIIB, producido en un sistema de mamífero, con una afinidad mayor que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA, como se determina por un ensayo ELISA. En una modalidad particular, la invención se relaciona a un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que enlaza específicamente Fc?RIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA, y el dominio constante del anticuerpo además tiene una afinidad mejorada para al menos uno o más receptores de activación Fc. En aún otra modalidad específica, el receptor de activación Fc es Fc?RIII. En una modalidad de la invención, el anticuerpo o un fragmento del mismo bloquean el sitio de enlace IgG de Fc?RIIB y bloquea el enlace de IgGs etiquetadas agregadas a Fc?RIIB en por ejemplo, un ensayo ELISA de bloqueo. En una modalidad particular, el anticuerpo o un fragmento del mismo bloquean el enlace de IgGs etiquetadas agregadas en un ensayo de bloqueo ELISA por al menos -50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ó 99.9%. En aún otra modalidad particular, el anticuerpo o un fragmento del mismo bloquea completamente el enlace de la IgG etiquetada agregada en el ensayo ELISA. En otra modalidad de la invención, el anticuerpo o un fragmento del mismo bloquean el sitio de enlace IgG de Fc?RIIB y bloquean el enlace de IgG etiquetado agregado a Fc?RIIB, como se determina por un ensayo FACS de doble tinción. La invención abarca el uso de anticuerpos que modulan (es decir agonizan o antagonizan) la actividad de Fc?RIIB. En una modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención agonizan al menos una actividad de Fc?RIIB, es decir, producen señalización. Aunque no se pretende estar unido a ningún mecanismo de acción, los anticuerpos agonísticos de la invención pueden imitar el agrupamiento de Fc?RIIB que conducen a supresión de la respuesta de activación a ligación e inhibición de Fc?R de sensibilidad celular. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención antagonizan al menos una actividad de Fc?RIIB, es decir, bloquean la señalización. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención bloquean el enlace de IgGs agregadas a Fc?RIIB. La invención proporciona anticuerpos que inhiben la activación de mastocitos inducidos por FceRI. La invención proporciona además anticuerpos anti- Fc?RIIB que inhiben la activación de macrófagos mediados por Fc?RIIA en células monocíticas. La invención proporciona también anticuerpos anti-Fc?RIIB que inhiben la señalización mediada por el receptor de células B. En una modalidad particular, los anticuerpos anti-Fc?RIIB bloquean el sitio de enlace de ligando de Fc?RIIB. En una modalidad específica adicional, la actividad de bloqueo puede bloquear la regulación negativa de la activación accionada compleja y mejorar consecuentemente la respuesta inmune. En una modalidad específica adicional, la respuesta inmune mejorada es un incremento en la respuesta celular dependiente de anticuerpos. En otra modalidad específica, los anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención bloquean la reticulación de receptores Fc?RIIB a célula B y/o receptores Fc, conduciendo a activación de célula B, mastocito, célula dendrítica o macrófagos. La presente invención abarca métodos para la producción de anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos, particularmente para la producción de anticuerpos monoclonales novedosos con especificidades para Fc?RIIB relativas a Fc?RIIA. Los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos pueden producirse por cualquier método conocido en la técnica para la producción de anticuerpos, en particular, por la secreción a partir de células hibridomas cultivadas, síntesis química o por técnicas de expresión recombinantes conocidas el arte. En una modalidad específica, la invención se relaciona a un método para producir recombinantemente un anticuerpo específico de Fc?RIIB, el método comprende: (i) cultivar bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo en un medio, una célula huésped que contiene una primera molécula de ácido nucleico, unida operablemente a un promotor heterólogo y un segundo ácido nucleico unido operablemente al mismo o diferente promotor heterólogo, el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico que codifican una cadena pesada y una cadena ligera, respectivamente, de un anticuerpo o un fragmento del mismo que enlaza específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA; y (ii) recuperar del anticuerpo a partir del medio. En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir anticuerpos monoclonales Fc?RIIB que enlazan específicamente Fc?RIIA, particularmente Fc?RIIB humano, con una mayor afinidad que los anticuerpos monoclonales que enlazan Fc?RIIA, particularmente Fc?RIIA humano, el método comprende: (a) inmunizar uno o más ratones transgénicos Fc?RIIA con Fc?RIIB purificado o un fragmento inmunogénico de los mismos; (b) producir líneas celulares de hibridoma a partir de células del bazo de uno o más ratones; (c) seleccionar las líneas de células de hibridoma para una o más líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos que enlazan específicamente Fc?RIIB con una mayor afinidad que los anticuerpos enlazan Fc?RIIA. La invención abarca cualquier anticuerpo producido por el método. En una modalidad específica, la invención proporciona un método para producir anticuerpos monoclonales Fc?RIIB que enlazan específicamente Fc?RIIA, particularmente Fc?RIIA humano, con una afinidad mayor que los anticuerpos monoclonales que enlazan Fc?RIIA, particularmente Fc?RIIA humano, el método comprende: (a) inmunizar uno o más ratones transgénicos Fc?RIIA con Fc?RIIB purificado o un fragmento inmunogénico del mismo; (b) inmunizar por refuerzo a ratones durante un tiempo suficiente para producir una respuesta inmune; (c) producir líneas celulares de hibridoma a partir de células del bazo de uno o más ratones ; (d) seleccionar las líneas celulares de hibridoma para una o más líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos que enlazan específicamente Fc?RIIB con una mayor afinidad que los anticuerpos enlazan Fc?RIIA. En una modalidad preferida, los ratones se inmunizan por refuerzo al menos cuatro veces durante un periodo de cuatro meses. En una modalidad de la invención, los ratones se inmunizan con Fc?RIIB purificado, el cual se ha mezclado con adyuvantes conocidos en la técnica para mejorar respuesta inmune en el ratón. En una modalidad particular de la invención, el fragmento inmunogénico es el dominio extracelular soluble de Fc?RIIB. Las líneas celulares de hibridoma pueden seleccionarse utilizando técnicas estándares conocidas en el arte (por ejemplo, ELISA) . En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos anti-Fc?RIIB son anticuerpos monoclonales, anticuerpos sintéticos, anticuerpos recombinantemente producidos, anticuerpos multiespecífieos, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos camelizados, Fvs de cadena sencilla (scFv) , anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab fragmentos F(ab'), Fvs enlazados con disulfuro (sdFv) , intracuerpos, o fragmentos de enlace de epítopes de cualquiera de los anteriores. De preferencia, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales, y más preferiblemente, anticuerpos humanizados o humanos. En una modalidad preferida específica, los anticuerpos de la invención se enlazan al dominio extracelular de Fc?RIIB humano, particularmente Fc?RIIB humano nativo. En otra modalidad específica, los anticuerpos de la invención reconocen específica o selectivamente uno o más epítopes de Fc?RIIB, particularmente Fc?RIIB humanos nativos . Otra modalidad de la invención abarca el uso de tecnología de despliegue de fago para incrementar la afinidad de los anticuerpos de la invención para Fc?RIIB. Cualquier método de selección conocido en la técnica puede utilizarse para identificar anticuerpos mutantes con avidez incrementada para Fc?RIIB (por ejemplo, ELISA) . En otra modalidad específica, los anticuerpos de la invención se seleccionan utilizando ensayos de selección de anticuerpos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, ensayo BIACORE) para identificar anticuerpos con índice Koff de menos de 3xl0~3 s"1. En una modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal producido por el clon 2B6 o 3H7, que tiene números de acceso ATCC PTA-4691 y PTA-4592, respectivamente, o versiones quiméricas, humanizadas u otras versiones diseñadas del mismo. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal producido por el clon 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 y 1F2 que tiene números de acceso ATCC PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente, o versiones quiméricas, humanizadas u otras versiones diseñadas del mismo. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que compite para el enlace con el anticuerpo monoclonal producido por el clon 2B6 ó 3H7 y enlaza Fc?RIIB, de preferencia Fc?RIIB humano nativo con una mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA, de preferencia Fc?RIIA humano nativo y/o se enlaza al mismo epítope de Fc?RIIB como el anticuerpo monoclonal producido a partir del clon 2B6 ó 3H7 y enlaza Fc?RIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA. Además, la invención proporciona una línea celular de hibridoma 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2 que tiene números de acceso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente. En una modalidad específica, la invención proporciona el uso de un anticuerpo 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2 o versiones quiméricas, humanizadas u otras versiones diseñadas del mismo, para prevenir, tratar, manejar o mejorar una malignidad de células B, o uno o más síntomas de la misma. En una modalidad particular, una versión diseñada comprende una o más mutaciones en la región Fc. Una o más mutaciones en la región Fc pueden resultar en un anticuerpo con una función efectora mediada por anticuerpos alterada, un enlace alterado a otros receptores Fc (por ejemplo, receptores de activación de Fc) , una actividad de ADCC alterada, o una actividad de enlace Clq alterada, o una actividad de citotoxicidad dependiente de complemento alterada, o cualquier combinación de las mismas. En una modalidad preferida, un 2B6 humanizado comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC de IDENT NO: 24 y u dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC de IDENT NO: 18, SEC de IDENT. NO: 20, o la SEC de IDENT. NO: 22. En otra modalidad preferida, el dominio Fc de la cadena pesada del anticuerpo 2B6 humanizado o 3H7 humanizado se diseña para comprender al menos una sustitución de aminoácidos en la posición 240, 243, 247, 255, 270, 292, 300, 316, 370, 392, 396, 416, 419 ó 421 con otro aminoácido en esa posición. En una modalidad preferida, el dominio Fc de la cadena pesada del 2B6 humanizado tiene una leucina en la posición 247, una lisina en la posición 421 y un ácido glutámico en la posición 270; una treonina en la posición 392, una leucina en la posición 396, y un ácido glutámico en la posición 270; o un ácido glutámico en la posición 270, un ácido aspártico en la posición 316, y una glicina en la posición 416. En ciertas modalidades de la invención, el anticuerpo no es un anticuerpo monoclonal producido por el clon 2B6 o 3H7, o las versiones quiméricas, humanizadas u otras versiones diseñadas del mismo. En ciertas modalidades de la invención, se proporcionan anticuerpos 2B6 humanizados, los anticuerpos 2B6 humanizados comprenden un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC de IDENT. NO: 24 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC de IDENT. NO: 20, en donde el dominio Fc de la cadena pesada del 2B6 humanizado tiene una leucina en la posición 247, una lisina en la posición 421 y un ácido glutámico en la posición 270; o un ácido glutámico en la posición 270, un ácido aspártico en la posición 316, y una glicina en la posición 416. La invención abarca también polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención. En una modalidad, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento del mismo que enlaza específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA. La invención se relaciona también a un vector que comprende el ácido nucleico. La invención proporciona además un vector que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una cadena ligera, la cadena pesada y la cadena ligera son de un anticuerpo o un fragmento del mismo que enlaza específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA. En una modalidad específica, el vector es un vector de expresión. La invención proporciona además células huésped que contienen los vectores de, o polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención. De preferencia, la invención abarca polinucleótidos que codifican cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos producidos por los clones de hibridomas depositados, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2 teniendo números de acceso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente o porciones de los mismos, por ejemplo, CDRs, dominios variables, etc., y versiones humanizadas de los mismos. Los receptores Fc inhibidores o de activación, por ejemplo, Fc?RIIA y Fc?RIIB, son críticos para la función equilibrada de estos receptores y las respuestas inmunes celulares apropiadas. La invención abarca el uso de anticuerpos de la invención para el tratamiento de cualquier enfermedad relacionada a la pérdida de tal equilibrio y el control regulado en la trayectoria de señalización del receptor Fc. De este modo, los anticuerpos Fc?RIIB de la invención tienen usos en regular la respuesta inmune, por ejemplo, al inhibir la respuesta inmune junto con la enfermedad autoinmune o inflamatoria, o la respuesta alérgica. Los anticuerpos Fc?RIIB de la invención pueden utilizarse también para alterar ciertas funciones efectoras para mejorar, por ejemplo, la citotoxicidad mediada por anticuerpos terapéuticos. Los anticuerpos de la invención son útiles para la prevención o el tratamiento de cáncer, por ejemplo, en una modalidad, como una terapia de un solo agente. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención se utilizan para el tratamiento y/o la prevención de melanoma. En otra modalidad, los anticuerpos son útiles para la prevención o el tratamiento de cáncer, particularmente para potencializar la actividad citotóxica de anticuerpos terapéuticos específicos de antígenos cancerígenos con la actividad citotóxica para mejorar la exterminación de células tumorales y/o mejorar la actividad celular citotóxica dependiente de anticuerpos ("ADCC") , la actividad citotóxica dependiente de complementos ("CDC") , o fagocitosis de los anticuerpos terapéuticos. La invención proporciona un método para tratar cáncer en un paciente que tiene un cáncer caracterizado por un antígeno cancerígeno, el método comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un primer anticuerpo o un fragmento del mismo que enlaza específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA, y un segundo anticuerpo que enlaza específicamente el antígeno cancerígeno y es citotóxico. La invención proporciona también un método para tratar cáncer en un paciente que tiene un cáncer caracterizado por un antígeno cancerígeno, el método comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o un fragmento del mismo que enlaza específicamente Fc?RIIB, particularmente Fc?RIIB humano nativo con mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA, de preferencia Fc?RIIA humano nativo, y el dominio constante el cual tiene además una afinidad incrementada de uno o más receptores de activación Fc, cuando el anticuerpo es monomérico, tal como Fc?RIIIA, y un anticuerpo que enlaza específicamente el antígeno cancerígeno y es citotóxico. En una modalidad particular, el receptor de activación Fc es Fc?RIIIA En las modalidades particulares, el anticuerpo de la invención se administra en una dosis de manera que el anticuerpo no se enlaza detectablemente a los neutrófilos. En otra modalidad preferida de la invención, los anticuerpos de la invención son útiles para la prevención o el tratamiento de malignidades de células B, particularmente linfoma no Hodgkin o leucemia linfocítica crónica. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para tratar, manejar, prevenir o mejorar una malignidad de células B administrando ya sea solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos, anticuerpos que enlazan específicamente Fc?RIIB, y de preferencia, no enlaza específicamente Fc?RIIA, así como derivados, análogos y fragmentos de enlace de antígeno de tales anticuerpos. En modalidades particulares, el cáncer del sujeto no responde a una o más terapias estándares o experimentales, particularmente a tratamiento con Rituxan. Los métodos de la invención pueden utilizarse para el tratamiento, manejo, prevención o mejora de enfermedades de células B, tales como leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL) , linfoma no Hodgkin, linfoma de célula B grande difuso, linfoma folicular con áreas de linfoma de célula B grande difuso, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de célula protectora, y linfoma de célula desdoblado pequeño difuso. En otra modalidad, la invención proporciona el uso de un anticuerpo específico de Fc?RIIB conjugado a un agente terapéutico o fármaco. Ejemplos de agentes terapéuticos los cuales pueden conjugarse a un anticuerpo anti-Fc?RIIB o un fragmento de enlace de antígenos del mismo incluyen, pero no se limitan a citoquinas, toxinas, elementos radioactivos y anti-metabolitos . En una modalidad, la invención proporciona el uso de un anticuerpo específico de Fc?RIIB en combinación con un régimen de tratamiento estándar o experimental para malignidades de células B (por ejemplo, quimioterapia, radioinmunoterapia o radioterapia) . Tal terapia de combinación puede mejorar la eficacia de tratamiento estándar o experimental. Ejemplos de agentes terapéuticos que son particularmente útiles en combinación con un anticuerpo específico de Fc?RIIB o un fragmento de enlace de antígenos del mismo, para la prevención, tratamiento, manejo o mejora de malignidades de células B, incluyen, pero no se limitan a Rituxan, interferón-alfa, y agentes anti-cáncer. Los agentes quimioterapéuticos que pueden utilizarse en combinación con un anticuerpo específico de Fc?RIIB o un fragmento de enlace de antígenos del mismo, incluye, pero no se limita a agentes de alquilación, antimetabolitos, productos naturales y hormonas. Las terapias de combinación de la invención permiten dosis inferiores de un anticuerpo anti-Fc?RIIB o un fragmento de enlace de antígenos del mismo y/o la administración menos frecuente de un anticuerpo anti-Fc?RIIB o un fragmento de enlace de antígenos del mismo a un sujeto con una malignidad de células B, para conseguir un efecto terapéutico o profiláctico. En otra modalidad, el uso de un anticuerpo anti-Fc?RIIB o un fragmento de enlace de antígeno del mismo prolonga la supervivencia de un sujeto diagnosticado con una malignidad de células B. En otra modalidad, la invención proporciona un método para mejorar un efecto citotóxico mediado con anticuerpos en un sujeto que se trata con un anticuerpo citotóxico, el método comprende administrar al paciente un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo, en una cantidad suficiente para mejorar el efecto citotóxico de tal anticuerpo citotóxico. En aún otra modalidad, la invención proporciona un método para mejorar un efecto citotóxico mediado por anticuerpos en un sujeto que se trata con un anticuerpo citotóxico, el método comprende administrar al paciente un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo, teniendo además una afinidad mejorada para un receptor de activación Fc, cuando es monomérico en una cantidad suficiente que mejora el efecto citotóxico del anticuerpo citotóxico. En aún otra modalidad, la invención proporciona un método que comprende además la administración de una o más terapias de cáncer adicionales. La invención abarca el uso de anticuerpos de la invención • en la combinación con cualquier anticuerpo terapéutico que median su efecto terapéutico a través de la exterminación celular para potencializar la actividad terapéutica del anticuerpo. En una modalidad particular, los anticuerpos de la invención potencializan la actividad terapéutica del anticuerpo mejorando la función efectora mediada por anticuerpos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención potencializan la actividad terapéutica del anticuerpo citotóxico mejorando fagocitosis y la opsonización de las células tumorales objetivo. En aún otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención potencializan la actividad terapéutica del anticuerpo mejorando la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos ("ADCC") en la destrucción de las células tumorales objetivo. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se utilizan en combinación con proteínas de fusión Fc que mejoran la ADCC. En algunas modalidades, la invención abarca el uso de anticuerpos de la invención en combinación con un anticuerpo terapéutico que no media su efecto terapéutico mediante la exterminación celular para potencializar la actividad terapéutica del anticuerpo. En una modalidad específica, la invención abarca el uso de los anticuerpos de la invención en combinación con una apoptosis terapéutica que induce el anticuerpo con actividad agonística, por ejemplo, anticuerpo antí-Fas. Los anticuerpos que inducen apoptosis terapéutica pueden ser específicos para cualquier receptor de muerte conocido en la técnica para la modulación de trayectoria apoptótica, por ejemplo, miembro de la familia del receptor TNFR o un miembro de la familia TRAIL. La invención abarca el uso de anticuerpos de la invención para bloquear el progreso de células tumorales mediadas por macrófagos y metástasis. Los anticuerpos de la invención son particularmente útiles en el tratamiento de tumores sólidos, en donde ocurre la filtración de macrófagos. Los anticuerpos antagonísticos de la invención son particularmente útiles para controlar, por ejemplo, reducir o eliminar, metástasis de células tumorales, reduciendo o eliminando la población de macrófagos que se localizan en el sitio del tumor. La invención abarca además anticuerpos que reducen o eliminan efectivamente células efectoras inmunes diferentes de los macrófagos que expresan Fc?RIIB, por ejemplo, células dendríticas. La reducción o eliminación efectiva de células efectoras inmunes que utilizan los anticuerpos de la invención puede variar desde una reducción en la población de las células efectoras por 50%, 60%, 70%, 80%, de preferencia 90% y más preferiblemente 99%. En las modalidades particulares, el anticuerpo de la invención se administra en una dosis de manera que el anticuerpo no se enlaza detectablemente a neutrófilos. En algunas modalidades, los anticuerpos agonísticos de la invención son particularmente útiles para el tratamiento de tumores de origen no hematopoyético, incluyendo tumores de células de melanoma. En algunas modalidades, la invención abarca el uso de anticuerpos de la invención en combinación con anticuerpos terapéuticos que se enlazan inmunoespecíficamente a antígenos tumorales que no se expresan en las células tumorales mismas, sino más bien en células no malignas, reactivas circundantes y de mantenimiento de tumor, que comprenden el estroma de tumor. En una modalidad preferida, un anticuerpo de la invención se utiliza en combinación con un anticuerpo que enlaza inmunoespecíficamente un antígeno tumoral en una célula de fibroblasto, por ejemplo, una proteína de activación de fibroblasto (FAP) . La invención proporciona un método para tratar un trastorno autoinmune en un paciente con necesidad del mismo, el método comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más anticuerpos de la invención. La invención proporciona también un método para tratar un trastorno autoinmune en un paciente con necesidad del mismo, el método comprende además administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes anti-inflamatorios y/o uno o más agentes inmunomoduladores. La invención proporciona también un método para tratar un trastorno inflamatorio en un paciente con necesidad del mismo, el método comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más anticuerpos de la invención. La invención proporciona también un método para tratar un trastorno inflamatorio en un paciente con necesidad del mismo, el método comprende además administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes anti-inflamatorios y/o uno o más agentes inmunomoduladores . La invención proporciona un método para mejorar una respuesta inmune a una composición de vacuna en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígenos del mismo que enlaza específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA, y una composición de vacuna, de manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se administra en una cantidad efectiva para mejorar la respuesta inmune a la composición de vacuna en el sujeto. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para mejorar la respuesta mediada por células y/o humoral contra el o los antígenos de la composición de vacuna. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en combinación con cualesquiera vacunas conocidas en la técnica. La invención abarca el uso de los anticuerpos de la invención ya sea para prevenir o tratar un trastorno particular, en donde una respuesta inmune mejorada contra un antígeno particular o antígenos es efectiva para tratar o prevenir la enfermedad o el trastorno. La invención proporciona además un método para tratar o prevenir un trastorno alérgico mediado por IgE en un paciente con necesidad del mismo, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de los anticuerpos agonísticos de la invención. La invención también proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno alérgico mediado por IgE en un paciente con necesidad del mismo, que comprende administrar al paciente los anticuerpos de la invención en combinación con otros anticuerpos terapéuticos o composiciones de vacuna utilizadas para el tratamiento o la prevención de trastornos alérgicos mediados por IgE. La invención proporciona también un método para mejorar terapia inmune para un agente infeccioso en donde los anticuerpos de la invención se administran a un paciente que está ya infectado por un patógeno, tal como VIH, VHC o VHS, para mejorar la opsonización y fagocitosis de células infectadas . La invención proporciona un método para tratar enfermedades con señalización mediada apoptótica deteriorada, por ejemplo, cáncer, enfermedad autoinmune. En una modalidad específica, la invención abarca un método para tratar una enfermedad con apoptosis mediada por Fas deficiente, el método comprende administrar un anticuerpo de la invención en combinación con un anticuerpo anti-Fas . La invención abarca el uso de los anticuerpos de la invención para detectar la presencia de Fc?RIIB específicamente (es decir, Fc?RIIB y no Fc?RIIA) en una muestra biológica. En otra modalidad, la invención proporciona un método de diagnóstico de una enfermedad autoinmune en un sujeto, que comprende: (i) poner en contacto una muestra biológica a partir del sujeto con una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención; e (ii) detectar el enlace del anticuerpo o un fragmento del mismo, en donde la detección del marcador detectable sobre un nivel de fondo o estándar indica que el sujeto tiene una enfermedad autoinmune. La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende (i) una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o un fragmento del mismo que enlaza específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA; e (ii) un portador farmacéuticamente aceptable. La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende (i) una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o fragmento de la misma que enlaza específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que el anticuerpo o fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA; (ii) un anticuerpo citotóxico que enlaza específicamente un antígeno cancerígeno; e (iii) un portador farmacéuticamente aceptable . En ciertas modalidades de la invención, las composiciones farmacéuticas se proporcionan para el uso de acuerdo con los métodos de la invención, las composiciones farmacéuticas comprenden un anticuerpo anti-Fc?RIIB o un fragmento de enlace de antígenos del mismo, en una cantidad efectiva para prevenir, tratar, manejar o mejorar la malignidad de células B, o uno o más síntomas del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable. La invención proporciona también composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con los métodos de la invención, las composiciones farmacéuticas comprenden un anticuerpo anti-Fc?RIIB o un fragmento de enlace de antígenos del mismo, un agente profiláctico o terapéutico diferente del antagonista Fc?RIIB y un portador farmacéuticamente aceptable. 3.1 DEFINICIONES Como se utiliza en la presente, el término "enlaza específicamente a Fc?RIIB" y términos análogos se refieren a anticuerpos o fragmentos de los mismos (o cualesquiera otras moléculas de enlace Fc?RIIB) que se enlazan específicamente a Fc?RIIB o un fragmento de los mismos y no se enlazan específicamente a otros receptores Fc, en particular a Fc?RIIA. Además, se entiende por un experto en la técnica, que un anticuerpo que se enlaza específicamente a Fc?RIIB, puede enlazarse a través del dominio variable o el dominio constante del anticuerpo. Si el anticuerpo que se enlaza específicamente a Fc?RIIB se enlaza a través de su dominio variable, se entiende por un experto en la técnica que no se agrega, es decir, es monomérico. Un anticuerpo que se enlaza específicamente a Fc?RIIB puede enlazarse a otros péptidos o polipéptidos con afinidad inferior como se determina por ejemplo por inmunoensayos, BIAcore, u otros ensayos conocidos en la técnica. De preferencia, los anticuerpos o fragmentos que se enlazan específicamente a Fc?RIIB o un fragmento de los mismos no reaccionan cruzados con otros antígenos. Los anticuerpos o fragmentos que se enlazan específicamente a Fc?RIIB pueden identificarse, por ejemplo, por inmunoensayos, BIAcore, u otras técnicas conocidas por aquellos expertos en el arte. Un anticuerpo o fragmento de los mismos se enlaza específicamente a un Fc?RIIB cuando se enlazan a Fc?RIIB con mayor afinidad que a cualquier antígeno reactivo cruzado como se determina utilizando técnicas experimentales, tales como transferencias western, radioinmunoensayos (RÍA) y enzi oinmunoanálisis absorbente (ELISA) . Véase por ejemplo, Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven, Press, New York en las páginas 332-336 para una discusión con respecto a la especificidad del anticuerpo. Como se utiliza en la presente/ el término "Fc?RIIB nativo" se refiere a Fc?RIIB el cual se expresa endógenamente y se presenta en la superficie de una célula. En algunas modalidades, "Fc?RIIB nativo" abarca una proteína que se expresa recombinantemente en una célula de mamífero. De preferencia, el Fc?RIIB nativo no se expresa en una célula bacteriana, es decir, E. coli. Más preferiblemente, el Fc?RIIB nativo no se desnaturaliza, es decir, está en su conformación biológicamente activa. Como se utiliza en la presente, el término "Fc?RIIA nativo" se refiere a Fc?RIIA el cual se expresa endógenamente y se presenta en la superficie de una célula. En algunas modalidades, "Fc?RIIA nativo" abarca una proteína que se expresa recombinantemente en una célula de mamífero. De preferencia el Fc?RIIA nativo no se expresa en una célula bacteriana, es decir, E. coli. Más preferiblemente el Fc?RIIA nativo no se desnaturaliza, es decir, está en su conformación biológicamente - activa . Como se utiliza en la presente, el término "análogo" en el contexto de los agentes proteínicos (por ejemplo, proteínas, polipéptidos y anticuerpos) se refiere a un agente proteínico que posee una función similar o idéntica como un segundo agente proteínico que posee una secuencia de aminoácidos similar o idéntica del segundo agente proteínico, o posee una estructura similar o idéntica del segundo agente proteínico. Un agente proteínico que tiene una secuencia de aminoácidos similar se refiere a un segundo agente proteínico que satisface al menos uno de lo siguiente: (a) un agente proteínico que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un segundo agente proteínico; (b) un agente proteínico codificado por una secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones severas a una secuencia de nucleótido que codifica un segundo agente proteínico de al menos 5 residuos de aminoácidos contiguo, al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 80 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, o al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos; y (c) un agente proteínico codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos que codifica un segundo agente proteínico. Un agente proteínico con similar estructura y un segundo agente proteínico se refieren a un agente proteínico que tiene una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria similar al segundo agente proteínico. La estructura de un polipéptido puede determinarse por métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a secuenciación de péptidos, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear, dicroísmo circular y microscopía de electrones cristalográfica . Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, las aberturas pueden introducirse en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico) . Los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes o las posiciones de nucleótidos se comparan entonces. Cuando una posición en la primera secuencia se ocupa por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones traslapantes idénticas/número total de posiciones x 100%) . En una modalidad, las dos secuencias son de la misma longitud. La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse también utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. Ü.S.A. 90:5873-5877. Tal algoritmo se incorpora dentro de los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al . , 1990, J. Mol. Biol. 215:430. Las investigaciones del nucleótido BLAST pueden realizarse con el conjunto de parámetros del programa de nucleótido NBLAST por ejemplo para clasificación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótido homologas a una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Las investigaciones de proteína BLAST pueden realizarse con el conjunto de parámetros del programa XBLAST por ejemplo, para clasificar-50, longitud de palabra=3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una molécula de proteína de la presente invención. Para obtener alineaciones de abertura para propósitos de comparación, Gapped BLAST puede utilizarse como se describe en Altschul et al . , 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, PSI-BLAST puede utilizarse para realizar una investigación iterativa la cual detecta relaciones distantes entre las moléculas (Id.). Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) pueden utilizarse (véase por ejemplo, el sitio web NCBI) . Otro ejemplo no limitante, preferido de un algoritmo matemático utilizado para la compasión de secuencias es el algoritmo de Myers y millar, 1988, CABIOS 4:11-17. Tal algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) el cual es parte del paquete de software de alineación de secuencia GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, una tabla de residuo de peso PAM120, una penalidad de longitud de abertura de 12 y una penalidad de abertura de 4 puede utilizarse . El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse utilizando técnicas similares a aquellas descritas anteriormente, con o sin permitir aberturas. En cualquier porcentaje de identidad, normalmente sólo se cuentan similitudes exactas. Como se utiliza en la presente, el término "análogo" en el contexto de un agente no proteínico se refiere a una segunda molécula orgánica o inorgánica la cual posee una función similar o idéntica como una primera molécula orgánica o inorgánica y es estructuralmente similar a la primera molécula orgánica o inorgánica. Como se utiliza en la presente, los términos "antagonista" y "antagonistas" se refieren a cualquier proteína, polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, molécula grande o pequeña molécula (menos de 10 kD) que bloquea, inhibe, reduce o neutraliza una función, actividad y/o expresión de otra molécula, tal como aquella de Fc?RIIB. En varias modalidades, un antagonista reduce una función, actividad y/o expresión de otra molécula por al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% con relación a un control tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) . Como se utiliza en la presente los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" se refieren a anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecífieos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos camelizados, Fvs de cadena sencilla (scFv) , anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs enlazado con disulfuro (sdFv) , intracuerpos, y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-id) (incluyendo por ejemplo anticuerpos anti-Id y anti-anti-Id a anticuerpos de la invención) , y fragmentos de enlace de epítopes de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de enlace de antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , clase (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2) o subclase. Como se utiliza en la presente, los términos "malignidades de células B" y "malignidad de célula B" se refieren a cualquier trastorno linfoproliferativo de células B. Las malignidades de células B incluyen tumores de origen de células B. Las malignidades de células B incluyen, pero no se limitan a linfomas, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin y no Hodgkin, linfoma de célula grande difuso, linfoma folicular con áreas de linfoma de célula B grande difuso, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de célula protectora y linfoma de célula desdoblada pequeño difuso. Como se utiliza en la presente, el término "cáncer" se refiere a un neoplasma o tumor que resulta de crecimiento no controlado anormal de células. Como se utiliza en la presente, el cáncer incluye explícitamente, leucemias y linfomas. El término "cáncer" se refiere a una enfermedad que implica células que tienen el potencial para convertir en metástasis a sitios distales y exhiben rasgos fenotípicos que difieren de aquellas células no cancerígenas, por ejemplo, la formación de colonias en un sustrato tridimensional tal como agar suave o la formación de redes tubulares o matrices similares a redes en una membrana de base tridimensional o la preparación de matriz extracelular. Células no cancerígenas no forman colonias en agar suave y forman distintas estructuras similares a esferas en membrana de base tridimensional o preparaciones de matriz extracelular. Las células cancerígenas adquieren un conjunto de características de capacidades funcionales durante su desarrollo, aunque a través de varios mecanismos. Tales capacidades incluyen evasión de apoptosis, auto-suficiencia en las señales de crecimiento, insensibilidad a señales de anti-crecimiento, potencial explicativo ilimitado de invasión/metástasis y angiogénesis sostenida. El término "célula cancerígena" quiere decir que abarca tanto células cancerígenas pre-malignas como malignas. En algunas modalidades, el cáncer se refiere a un tumor benigno, el cual ha permanecido localizado. En otras modalidades, el cáncer se refiere a un tumor maligno, el cual ha invadido y destruido estructuras corporales adyacentes y se dispersa a sitios distantes. En aún otras modalidades, el cáncer se asocia con un antígeno de cáncer específico. Como se utiliza en la presente, el término "derivado" en el contexto de los polipéptidos o proteínas, incluyendo anticuerpos, se refiere a un polipéptido o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos la cual ha sido alterada por la introducción de sustituciones, eliminación o adiciones de residuos de aminoácidos. El término "derivado" como se utiliza en la presente se refiere también a un polipéptido o proteína la cual se ha modificado, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido o proteína. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, un anticuerpo puede modificarse, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos de protección/bloqueo conocidos, desdoblamiento proteolítico, conexión a un ligando celular u otra proteína, etc. Un polipéptido o proteína derivado puede producirse por modificaciones químicas utilizando técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a desdoblamiento químico específico, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un polipéptido derivado o derivado de proteína posee una función similar o idéntica como el polipéptido o proteína a partir de la cual se derivó. El término "derivado" como se utiliza en la presente junto con Fc?RIIB se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido Fc?RIIB, un fragmento de un polipéptido Fc?RIIB, un anticuerpo que se enlaza inmunoespecíficamente a un polipéptido Fc?RIIB, o un fragmento de anticuerpo que se enlaza inmunoespecíficamente a un polipéptido Fc?RIIB, que se ha alterado por la introducción de sustituciones, eliminaciones o adiciones de residuos de aminoácidos (es decir, mutaciones) . En algunas modalidades un derivado de anticuerpos o fragmento del mismo comprende sustituciones, eliminaciones o adiciones de residuos de aminoácidos en una o más CDR. El derivado de anticuerpo puede tener sustancialmente el mismo enlace, mejor enlace o peor enlace cuando se compara a un anticuerpo no derivado. En las modalidades específicas, uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos de aminoácidos de la CDR han sido sustituidos, eliminados o agregados (es decir, mutados) . El término "derivado" como se utiliza en la presente junto con Fc?RIIB se refiere también a un polipéptido Fc?RIIB, un fragmento de un polipéptido Fc?RIIB, un anticuerpo que se enlaza inmunoespecíficamente a un polipéptido Fc?RIIB, o un fragmento de anticuerpos que se enlaza inmunoespecíficamente a un polipéptido FcvRIIB el cual se ha modificado, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, un polipéptido Fc?RIIB, un fragmento de un polipéptido Fc?RIIB, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo puede modificarse, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos de protección/bloqueo conocidos, desdoblamiento proteolítico, conexión a un ligando celular u otra proteína, etc. Un derivado de un polipéptido Fc?RIIB, un fragmento de un polipéptido Fc?RIIB, un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo pueden modificarse por modificaciones químicas utilizando técnica conocidas por aquellos de experiencia en el arte, incluyendo, pero sin limitarse a desdoblamiento químico específico, acetilación, formulación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un derivado de un polipéptido Fc?RIIB, un fragmento de un polipéptido Fc?RIIB, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. En una modalidad, un derivado de anticuerpos posee una función similar o idéntica como el anticuerpo progenitor. En otra modalidad, un derivado de un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo tiene una actividad alterada cuando se compara a un anticuerpo no alterado. Por ejemplo, un anticuerpo derivado o fragmento del mismo puede enlazarse a su epítope más estrechamente o ser más resistente a proteólisis. Como se utiliza en la presente, los términos "trastorno" y "enfermedad" se utilizan intercambiablemente para referirse a una condición en un sujeto. En particular, el término "enfermedad autoinmune" se utiliza intercambiablemente con el término "trastorno autoinmune" para referirse a una condición en un sujeto caracterizada por daño de tejido celular y/u órgano provocado por una reacción inmunológica del sujeto a sus propias células, tejidos y/u órganos. El término "enfermedad inflamatoria" se utiliza intercambiablemente con el término "trastorno inflamatorio" para referirse a una condición en un sujeto caracterizada por inflamación, de preferencia inflamación crónica. Los trastornos autoinmunes pueden o no asociarse con la inflamación. Además, la inflamación puede o no provocarse por un trastorno autoinmune. De este modo, ciertos trastornos pueden caracterizarse tanto como trastornos autoinmunes como inflamatorios . Como se utiliza en la presente, el término "epítope" se refiere a una región en una molécula de antígeno a la cual se une específicamente un anticuerpo. Como se utiliza en la presente, el término "fragmento" se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido de al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 80 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, o al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos; al menos 175 residuos de aminoácidos contiguo, al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido. En una modalidad específica, un fragmento de un polipéptido retiene al menos una función del polipéptido. Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpo son fragmentos de enlace de epítope. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a una inmunoglobulina que comprende una región de esquema humano y uno o más CRD a partir de una inmunoglobulina no humana (usualmente un ratón o rata) . La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se llama el "donador" y la inmunoglobulina humana que proporciona el esquema se llama el "aceptor". Las regiones constantes no necesitan estar presentes, pero si lo están, deben ser sustancialmente idénticas a regiones constantes de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente 85-90%, de preferencia aproximadamente 95% o más idénticas. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de secuencias de inmunoglobulina humana natural. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una cadena ligera humanizada y una inmunoglobulina de cadena pesada humanizada. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado no abarcaría un anticuerpo quimérico típico, debido a que por ejemplo, la región variable completa de un anticuerpo quimérico es no humana. Se dice que el anticuerpo donador se ha "humanizado" por el proceso de "humanización", debido a que se espera que el anticuerpo humanizado resultante se una al mismo antígeno como el anticuerpo donador que proporciona las CDR. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de región hipervariable a partir de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como de ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la Región de Esquema (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos los cuales no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen además para refinar el rendimiento de anticuerpos. En general, en anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y normalmente dos dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todos las FRs son aquellas de la secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , normalmente aquella de una inmunoglobulina humana que se enlaza inmunoespecíficamente a un polipéptido Fc?RIIB, que se ha alterado por la introducción de sustituciones, eliminaciones o adiciones de residuos de aminoácidos (es decir, mutaciones) . En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado es un derivado. Tal anticuerpo humanizado comprende sustituciones, eliminaciones o adiciones de residuos de aminoácidos en uno o más CDR no humanos. El derivado de anticuerpos humanizados puede tener sustancialmente el mismo enlace, mejor enlace o peor enlace cuando se compara a un anticuerpo humanizado no derivado. En las modalidades específicas, uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos de aminoácidos de la CDR han sido sustituidos, eliminados o agregados (es decir, mutados) . Para detalles adicionales en anticuerpos humanizados, véanse las Patentes Europeas Nos. EP 239,400, EP 592,106 y EP 519,596; Publicaciones Internacionales Nos. WO 91/09967 y WO 93/17105; Patentes Norteamericanas Nos. 5,225,539; 5,530,101, 5,565,332, 5,585,089, 5,766,886 y 6,407,213; y Padlan, 1991, Molecular I munology 28 (4/5) : 489-498; Studnicka et al . , 1994, Protein Engineering 7 (6) : 805-815; Roguska et al . , 1994, Proc Nati Acad Sci USA 91:969-973; Tan et al . , 2002, J. Immunol . 169:1119-25; Caldas et al . , 2000, Protein Eng. 13:353-60; Morea et al . , 2000, Methods 20:267-79; Baca et al . , 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84; Roguska et al . , 1996, Protein Eng. 9:895-904; Couto et al . , 1995, Cáncer Res. 55 (23 Supp) :5973s-5977s; Couto et al . , 1995, Cáncer Res. 55:1717-22; Sandhu, 1994, Gene 150:409-10; Pedersen et al . , 1994, J. Mol. Biol. 235-959-73; Jones et al . , 1986; Nature 321:522-525; Reichman et al . , 1988, Nature 332-323-329; y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596. Como se utiliza en la presente, el término "región hipervariable" se refiere a residuos de aminoácidos de un anticuerpo los cuales son responsables para enlace de antígenos. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos a partir de una "Región de Determinación de Complementariedad" o "CDR" (es decir, residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ) y/o aquellos residuos a partir de un "bucle hipervariable" (es decir, residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917). Los residuos de CDR para Eph099B-208.261 y Eph099B-233.152 se listan en la Tabla 1. Residuos de la "Región de Esquema" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de región hipervariable como se define en la presente. Como se utiliza en la presente, el término "agente inmunomodulador" y variaciones del mismo incluyendo, pero sin limitarse a, agentes inmunomoduladores, se refieren a un agente que modula un sistema inmune del huésped. En ciertas modalidades, un agente inmunomodulador es un agente inmunosupresivo. En ciertas modalidades distintas, un agente inmunomodulador es un agente inmunoestimulador. Los agentes inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a moléculas pequeñas, péptidos, polipéptidos, proteínas de fusión, anticuerpos, moléculas inorgánicas, agentes miméticos y moléculas orgánicas. Como se utiliza en la presente, los términos "manejar", "que maneja" y "manejo" se refiere a los efectos benéficos que se derivan de un sujeto a partir de la administración de un agente profiláctico o terapéutico, el cual no resulta en una cura de la enfermedad. En ciertas modalidades, se le administra a un sujeto uno o más agentes profilácticos o terapéuticos para "manejar" una enfermedad de manera que se evita el progreso o agravamiento de la enfermedad. Como se utiliza en la presente, los términos "ácidos nucleicos" y "secuencias de nucleótido" incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico), moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) , combinaciones de moléculas de ADN y ARN o moléculas de ADN/ARN híbridas, y análogos de moléculas de ADN o ARN. Tales análogos pueden generarse al utilizar por ejemplo, análogos de nucleótido, los cuales incluyen, pero no se limitan a inocina o bases tritiladas. Tales análogos pueden también comprender moléculas de ADN o ARN que comprenden esquemas modificados que conducen a atributos benéficos a las moléculas tales como por ejemplo, resistencia a la nucleasa o una capacidad incrementada a membranas celulares cruzadas . Los ácidos nucleicos o secuencias de nucleótido pueden ser de una sola hebra, de doble hebra, pueden contener tanto porciones de una sola hebra como de doble hebra, y pueden contener porciones de triple hebra, pero de preferencia es un ADN de doble hebra. Como se utiliza en la presente, los términos "prevenir", "que previene" y "prevención" se refieren a la prevención de la aparición y/o la recurrencia o inicio de uno o más síntomas de un trastorno en un sujeto que resulta a partir de la administración de un agente profiláctico o terapéutico. Como se utiliza en la presente, los términos "agente profiláctico" y "agentes profilácticos" se refieren a cualquier o cualesquiera agentes los cuales pueden utilizarse en la prevención de un trastornos, o la prevención de la recurrencia o propagación de un trastorno. Una cantidad profilácticamente efectiva puede referirse a la cantidad del agente profiláctico suficiente para prevenir la recurrencia o propagación de la enfermedad hiperproliferativa, particularmente cáncer, o la aparición de tal en un paciente, incluyendo, pero sin limitarse a aquella enfermedad predispuesta a hiperproliferativa, por ejemplo, aquellas genéticamente predispuestas al cáncer o expuestas previamente a carcinógenos . Una cantidad profilácticamente efectiva puede referirse también a la cantidad del agente profiláctico que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de la enfermedad. Además, una cantidad profilácticamente efectiva con respecto al agente profiláctico de la invención significa aquella cantidad del agente profiláctico solo, o en combinación con otros agentes, que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de la enfermedad. Utilizado junto con una cantidad de un anticuerpo Fc?RIIB de la invención, el término puede abarcar una cantidad que mejora la profilaxis total o mejora la eficacia profiláctica de o sinergias con otro agente profiláctico, tal como, pero sin limitarse a un anticuerpo terapéutico. En ciertas modalidades, el término "agente profiláctico" se refiere a un anticuerpo específico de Fc?RIIB agonístico. EN otras modalidades, el término "agente profiláctico" se refiere a un anticuerpo específico de Fc?RIIB antagonístico. En ciertas otras modalidades, el término "agente profiláctico" se refiere a quimioterapéuticos de cáncer, terapia por radiación, terapia hormonal, terapia biológica (por ejemplo, inmunoterapia) y/o anticuerpos Fc?RIIB de la invención. En otras modalidades, más de un agente profiláctico puede administrarse en combinación. Como se utiliza en la presente, la frase "efectos secundarios" abarca efectos indeseados y adversos de un agente profiláctico o terapéutico. Efectos adversos son siempre indeseados, pero efectos indeseados no son necesariamente adversos. Un efecto adverso a partir de un agente profiláctico o terapéutico podría ser peligroso o inconfortable o riesgoso. Efectos secundarios a partir de quimioterapia, incluyen, pero no se limitan a, toxicidad gastrointestinal tal como, pero sin limitarse a diarrea de formación temprana y tardía y flatulencias, náusea, vómito, anorexia, leucopenia, anemia, neutropenia, astenia, calambres abdominales, fiebre, dolor, pérdida de peso corporal, deshidratación, alopecia, disnea, insomnio, vértigo, mucositis, sequedad de la boca, y falla renal, así como constipación, efectos nerviosos y musculares, daño temporal o permanente a riñones y vejiga, síntomas similares a gripe, retención de fluidos, e infertilidad temporal o permanente. Efectos secundarios a partir de terapia por radiación incluyen, pero no se limitan a fatiga, boca seca, y pérdida de apetito. Efectos secundarios a partir de terapias biológicas/inmunoterapias incluyen, pero no se limitan a sarpullido o hinchazones en el sitio de administración, síntomas similares a gripe tales como fiebre, escalofríos y fatiga, problemas del tracto digestivo y reacciones alérgicas. Efectos secundarios a partir de terapias hormonales incluyen, pero no se limitan a náusea, problemas de fertilidad, depresión, pérdida de apetito, problemas oculares, dolor de cabeza, y fluctuación de peso. Efectos indeseados adicionales experimentados normalmente por pacientes son numerosos y conocidos en la técnica, véase por ejemplo, the Physicians' Desk Reference (56a edición, 2002), la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Como se utiliza en la presente, los términos "Fv de cadena sencilla" o "scFv" se refieren a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios se presentan en una cadena sencilla polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL los cuales permiten el scFv para formar la estructura deseada para enlace de antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-316 (1994) . En las modalidades específicas, scFvs incluye scFvs bi-específicos y scFvs humanizados. Como se utiliza en la presente, los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan intercambiablemente. Como se utiliza en la presente, un sujeto es de preferencia un mamífero tal como un no primate (por ejemplo, vacas, puercos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) y un primate (por ejemplo, un mono y un ser humano), más preferiblemente un ser humano . Como se utiliza en la presente, una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a aquella cantidad del agente terapéutico suficiente para tratar o manejar una enfermedad o un trastorno asociado con Fc?RIIB y cualquier enfermedad relacionada a la pérdida de regulación en la trayectoria de señalización del receptor Fc o para mejorar la eficacia terapéutica de otra terapia, por ejemplo, anticuerpo terapéutico, terapia de vacunas o profilaxis, etc. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede referirse a la cantidad del agente terapéutico suficiente para retardar o minimizar el inicio de la enfermedad, por ejemplo, retardar o minimizar la propagación del cáncer. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede referirse también a la cantidad del agente terapéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o el manejo de una enfermedad. Además, una cantidad terapéuticamente efectiva con respecto al agente terapéutico de la invención significa que la cantidad del agente terapéutico solo, o en combinación con otras terapias que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de una enfermedad, por ejemplo, suficiente para mejorar la eficacia terapéutica de un anticuerpo terapéutico suficiente para tratar o manejar una enfermedad. Utilizado junto con una cantidad del anticuerpo Fc?RIIB de la invención, el término puede abarcar una cantidad que mejora la terapia completa, reduce o evita efectos indeseados, o mejora la eficacia terapéutica de o las sinergias con otro agente terapéutico. Como se utiliza en la presente, los términos "tratar", "que se trata" y "tratamiento" se refieren a la erradicación, reducción o mejora de síntomas de una enfermedad o trastorno relacionado a la pérdida de regulación en la trayectoria de señalización del receptor Fc o para mejorar la eficacia terapéutica de otra terapia, por ejemplo, un anticuerpo terapéutico, terapia de vacuna o profilaxis. En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a la erradicación, remoción, modificación o control de tejido de cáncer primario, regional o metastático que resulta a partir de la administración de uno o más agentes terapéuticos. En ciertas modalidades, tales términos se refieren a minimizar o retardar la propagación de cáncer que resulta a partir de la administración de uno o más agentes terapéuticos a un sujeto con tal enfermedad. En otras modalidades, tales términos se refieren a la eliminación de células que provocan la enfermedad. Como se utiliza en la presente, el término "en combinación" se refiere al uso de más de un agente profiláctico y/o terapéutico. El uso del término "en combinación" no restringe el orden en el cual los agentes profilácticos y/o terapéuticos se administran a un sujeto con un trastorno, por ejemplo, trastorno celular hiperproliferativo, especialmente cáncer. Un primer agente profiláctico o terapéutico puede administrarse antes de (por ejemplo, 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 hors, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas anteriores) , al mismo tiempo con, o subsecuente a (por ejemplo, 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ó 12 semanas después) la administración de un segundo agente profiláctico o terapéutico a un sujeto el cual tuvo, tiene o es susceptible a un trastorno. Los agentes profilácticos o terapéuticos se administran a un sujeto en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo de manera que el agente de la invención puede actuar junto con el otro agente para proporcionar un beneficio incrementado que si se administraran de otro modo. Cualquier agente profiláctico o terapéutico adicional puede administrarse en cualquier orden con los otros agentes profilácticos o terapéuticos adicionales . 4. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las FIGURAS ÍA y B: El enlace directo del anticuerpo producido a partir del clon 3H7 a Fc?RIIB y Fc?RIIA. (A) el enlace directo de anticuerpos a partir de algunos de los cultivos de hibridomas a los Fc?RII se compararon a un anticuerpo anti-Fc?RII comercialmente disponible en un ensayo de ELISA en donde la placa se recubrió con los receptores. Diluciones diferentes (1:10) de los sobrenadantes se incubaron en la placa. Los anticuerpos enlazados se detectaron con un anticuerpo conjungado HRP anti-ratón de cabra y la absorbancia se verificó a 650 nm. (B) . El enlace directo del anticuerpo a partir del cultivo de hibridoma 3H7 (sobrenadante n. 7 de la Figura ÍA) , en forma sin purificar (panel izquierdo) y purificada (panel derecho) a Fc?RIIA y Fc?RIIB, se compararon al utilizar el mismo ensayo ELISA como en 1A. FIGURA 2. La competición en el enlace a Fc?RIIB del anticuerpo producido a partir del hibridoma 3H/7 y la IgG humana biotinilada agregada. La capacidad del anticuerpo 3H7 para competir con IgG humana biotinilada agregada para el enlace a Fc?RIIB se midió utilizando un experimento ELISA de bloqueo. La placa ELISA recubierta con Fc?RIIB se incubó con el sobrenadante conteniendo el anticuerpo 3H7 y con un sobrenadante a partir de las mismas células de hibridoma pero no conteniendo anticuerpo (control negativo) . Diferentes diluciones (1:3) a partir de 200 ng/pozo, de IgG humana bionitilada agregada se agregaron entonces a la placa y los agregados enlazados se detectaron con Streptavidina-Peroxidasa de rábano conjugado, la reacción se desarrolló con TMB y la absorbancia se verificó a 650 nm.

La FIGURA 3. La comparación del enlace directo del anticuerpo 3H7 a Fc?RIIB se produjo en un sistema bacterial o de mamífero. El enlace directo del anticuerpo 3H7 a Fc?RIIB se midió utilizando un ensayo de ELISA. El enlace al Fc?RIIB bacteriano y de mamífero se comparó. La titulación de anticuerpo inició a partir del sobrenadante directo seguido por 1:10 diluciones. El anticuerpo enlazado se detectó con un anticuerpo conjugado HRP anti-ratón de cabra, la reacción se desarrolló con TMB y la absorbancia se verificó a 650 nm. La FIGURA 4. El enlace directo del anticuerpo 3H7 a Fc?RIIA, Fc?RIIB y Fc?RIIIA. El enlace directo del anticuerpo 3H7 purificado a Fc?RIIA, Fc?RIIB y Fc?RIIIA expresado en un sistema de mamífero se compararon utilizando el ensayo ELISA. La placa de ELISA se recubrió con tres receptores (100 ng/pozo) . Diferentes diluciones de anticuerpo 3H7 purificado se incubaron en la placa recubierta. Un anticuerpo conjugado HRP anti-ratón de cabra se utilizó para la detección del anticuerpo específico enlazado, la reacción se desarrolló con TMB y la absorbancia se verificó a 650 nm. La FIGURA 5: La comparación de la capacidad de enlace directo a Fc?RIIA y Fc?RIIB del anticuerpo purificado a partir del clon 2B6 comparado a los otros tres anticuerpos monoclonales comercialmente disponibles contra Fc?RII. El enlace del anticuerpo 2B6 a Fc?RIIA (panel derecho superior) y Fc?RIIB (panel izquierdo superior) se compara a aquel de los tres anticuerpos comercialmente disponibles elevados contra Fc?RII. El formato de ELISA utilizado es el mismo descrito en la FIGURA 4. Las FIGURAS 6 A y B: La competición en el enlace del anticuerpo producido a partir del clon 2B6 e IgG humana biotinilada agregada a Fc?RIIB. A: La capacidad del anticuerpo presente en el sobrenadante a partir del clon 2B6 para competir para el enlace a Fc?RIIB con IgG humana biotinilada agregada se midió utilizando un experimento ELISA de bloqueo. Se comparó la capacidad de competición de anticuerpo 2B6 con aquel de un sobrenadante negativo a partir de hibridoma y con aquel del anticuerpo 3H7. La placa de ELISA recubierta con Fc?Rllb se incubó con diferentes diluciones (1:10) de los sobrenadantes. Después de los lavados, la placa se incubó con una cantidad fija de IgG humana biotinilada agregada (1 mg/pozo) y los agregados enlazados se detectaron con Estreptavidina-HRP conjugado. La reacción se desarrolló con TMB y la absorbancia se verificó a 650 nm. B: El mismo ELISA de bloqueo descrito en panel A se realizó con el anticuerpo 2B6 purificado y los datos a partir de una concentración del anticuerpo de bloqueo utilizado (4 mg/pozo) se representaron en un diagrama de barras. La capacidad 2B6 para bloquear el enlace de IgG humana agregada a Fc?RIIB se comparó a aquella de un control de isotipo IgGl de ratón.

Las FIGURAS 7 A-C: La competición del anticuerpo 2B6 y la IgG humana biotinilada agregada en el enlace a Fc?RIIB utilizando un ensayo FACS de doble tinción. Un ensayo FACS de doble tinción se realizó para caracterizar el anticuerpo 2B6 utilizando células CHO-Kl que habían sido establemente transfectantes con Fc?RIIB de mamífero de longitud total. A: Las células transfectadas se tiñeron con isotipo igGl de ratón control seguido por un anticuerpo conjugado FITC anti-ratón de cabra y estreptavidina PE. B. Las células transfectantes se tiñeron con IgG humana biotinilada agregada después de teñirse con isotipo IgGl de ratón control y etiquetado con un anticuerpo conjugado FITC anti-ratón de cabra para detectar el anticuerpo monoclonal enlazado y con Estreptavidina-PE conjugada para detectar los agregados enlazados. C: Las células se tiñeron con anticuerpo 2B6, el anticuerpo se removió por lavados y las células se incubaron con IgG humana biotinilada agregada. Las células se lavaron y se etiquetaron con un anticuerpo conjugado FITC anti-ratón de cabra para detectar el anticuerpo monoclonal enlazado y con Estreptavidina-PE conjugado para detectar los agregados enlazados. Las FIGURAS 8 A-C: Análisis Biacore de enlace de anticuerpo 2B6 y KB6.1 a CD32B enlazado a superficie (Panel A), CD32A (H131) (Panel B) y CD32A (R131) (Panel C) . Las FIGURAS 9 A-C: Los anticuerpos anti Fc?RIIB monoclonales y co-tinción CD20 de linfocitos B humanos. Las células a partir de sangre humana ("capa de leucocitos") se tiñeron con anticuerpo conjugado FITC anti-CD20, para seleccionar la población de linfocitos B, así como 3H7 y 2B6. Se detectaron anticuerpos anti- Fc?RIIB enlazados con un anticuerpo conjugado PE anti-ratón de cabra. A. Se co-tiñeron las células con anticuerpo FITC anti-CD20 e isotipo IgGl de ratón control. B. Las células se co-tiñeron con anticuerpo FITC anti-CD20 y anticuerpo 3H7. C. Las células se co-tiñeron con anticuerpo FITC anti-CD20 y anticuerpo 2B6. Las FIGURAS 10 A y B: La tinción de células CHO que expresan Fc?RIIB. A. Se tiñeron células CHO/IIB con isotipo IgGl de ratón control (panel izquierdo) y el anticuerpo 3H7 (panel derecho). B. Se tiñeron las células CHO/IIB con isotipo de IgGl de ratón control (panel izquierdo) y anticuerpo 2B6 (panel derecho) . Se etiquetaron anticuerpos enlazados con células con un anticuerpo conjugado PE antiratón. La FIGURA 11. La tinción de células CHO que expresan Fc?RIlB. Las células CHO que expresan huFc?RIIB se incubaron con anticuerpos anti-CD32B, indicados en la parte superior de cada panel. Las células se lavaron y 9 µg/ml de IgG humana agregada se agregaron a las células en hielo. Se detectaron IgG agregados humanos con el conjugado FITC de IgG anti-humano de cabra. Las muestras se analizaron por isotipo FACS control + FITC de IgG anti-humana de cabra, control de isotipo + IgG de humana agregada + FITC de IgG anti-humano de cabra, - anticuerpo anti-CD32B + IgG humana agregada + FITC de IgG anti-humana de cabra. La cantidad de cada anticuerpo enlazado al receptor en las células se detectó también (inserción) en un conjunto separado de muestras utilizando un anticuerpo conjugado PE anti-ratón de cabra. Las FIGURAS 12 A-J: Análisis de citometría de flujo de la expresión de CD32B en líneas celulares transformadas utilizando anticuerpo específico CD32B, anticuerpo reactivo 2B6 y CD32A/B, FLI8.26. Líneas celulares: células 293H transfectadas que expresan CD32A (A, B) o CD32B (C, D) , líneas de células de linfoma de Burkitt, Daudi (E, F) y Raji (G, H) y la línea celular monocítica, THP-1 (I, J) . La FIGURA 13. Tinción de las PBMC Humanas con anticuerpos 2B6, 3H7 e IV.3. Se tiñeron las PBMC Humanas con anticuerpos 2B6, 3H7 e IV.3, como se indica en el lado derecho del panel, seguidas por un anticuerpo conjugado de cianina-anti-ratón (Cy5) de cabra; dos tinciones de color que utilizan FITC conjugado anti-CD20 para linfocitos B, anti-CD14-PE conjugado para monocitos anti-CD56-PE conjugado para células NK y anti-CD16-PE conjugado para granulocitos. Las FIGURAS 14 A y B: Ensayo de Liberación de ß-Hexaminidasa. A. Una representación esquemática del ensayo de liberación de ß-hexaminidasa. Los transfectantes que expresan Fc?RIIB humano se sensibilizaron con IgE de ratón y se provocaron con fragmentos F(ab')2 de una IgG anti-ratón de cabra policlonal para agregar Fc?RI . La reticulación ocurre debido a la capacidad del anticuerpo policlonal para reconocer la cadena ligera del anticuerpo de IgE de murino enlazada a Fc?RI . Los transfectantes se sensibilizaron con IgE de murino y se pre-incubaron con anticuerpo 2B6 se provocaron también con fragmentos F(ab')2 de una IgG anti-ratón de cabra policlonal par reticular Fc?RI a Fc?RIIB. B. la liberación de ß-hexosaminidasa inducida por el fragmento F(ab)2 anti-ratón de cabra (GAM F(ab)2) en células RBL-2H3 que expresan huFc?RIIB. Las células se estimularon con varias concentraciones de GAM F(ab)2 (0.03 µg/ml a 30 µg/ml) después de la sensibilización con IgE de ratón (0.01 µg/ml) e IgGl o con panel de anticuerpo 2B6 purificado (3 µg/ml) . Después de 1 hora a 37 °C, se recolectó el sobrenadante y las células se disolvieron con lisina. La actividad de la ß-hexosaminidasa liberada en el sobrenadante y dentro de las células se determinó por un ensayo colorimétrico utilizando p-nitrofenilo N-acetil-ß-D-glucosamínida. Se expresó la actividad de la ß-hexosaminidasa liberada como un porcentaje de la actividad liberada con relación a la actividad total. Las FIGURAS 15 A-C: 2B6 es capaz de bloquear funcionalmente el sitio de enlace Fc de CD32B y prevenir la co-ligación de los receptores de activación e inhibidores. A. Representación esquemática del modelo experimental. B y C. Se estimularon células RBL-2H3/CD32B con complejo BSA-DNP-FITC en la presencia de IgGl humana, con BSA-DNP-FITC combinadas con D265A-4-20 quiméricas en la presencia o sin 3 µg/ml de fragmentos F(ab)2 de 2B6 (B) . Las células se estimularon también con el complejo BSA-DNP-FITC en la presencia de IgGl humana, con BSA-DNP-FITC combinadas con 4-4-20 quimérico en la presencia o sin 3 µg/ml de fragmentos F(ab)2 de 2B6 (C) . Después de 30 minutos el sobrenadante se recolectó y las células se disolvieron con lisina. La actividad de la ß-hexosaminidasa liberada en el sobrenadante y dentro de las células se determinó por un ensayo colorimétrico utilizando p-nitrofenilo N-acetil-ß-D-glucosaminida. Se expresó Ja actividad de la ß-hexosaminidasa liberada como un porcentaje de la actividad liberada con relación a la actividad total. Las FIGURAS 16 A-C: Las líneas celulares de carcinoma de ovario y de seno expresan Her2/neu a niveles variables. Tinción de A: IGROV-1 de ovario con ch4D5 purificado; B. OVCAR-8 de ovario con anticuerpo 4D5 purificado, y C: células SKBR-3 de cáncer de mama con ch4D5 purificado seguido por conjugado anti-humano de cabra a ficoeritrina (PE) . El control de isotipo relevante IgGl se indica en la izquierda de la tinción con el anticuerpo anti-Her2neu.

Las FIGURAS 17 A-C: Monocitos Lavados expresan todos Fc?Rs: A.MDM obtenido a partir del donador 1; B. MDM obtenido a partir del donador 2; propagado en suero humano o suero humano y GMCSF; C. Monocitos descongelados y teñidos inmediatamente. Se tiñeron macrófagos derivados de monocitos con anticuerpos específicos para el receptor Fc?R humano. El histograma sólido en cada esquema representa la tinción de fondo. El histograma claro dentro de cada panel representa la tinción con anticuerpos Fc?R anti-humanos . Las FIGURAS 18 A y B: Ch4D5 media ADCC efectivo con líneas celulares cancerígenas de ovario y de seno utilizando PBMC. La lisis específica sustraída a partir de la lisis independiente de anticuerpos es muestra para A. La línea celular de tumor de ovario, IGROV-1 en un efector: relación objetivo de 75:1, y para B. línea celular de tumor de seno SKBR-3 en un efector: relación objetivo de 50:1 con diferente concentración de ch4D5 como se indica. Las FIGURAS 19 A-C: La tinción histoquímica de ascitis de ovario humano muestra células tumorales y otras células inflamatorias. A. La tinción H & E de ascitis de un paciente con tumor de ovario. Tres células neoplásicas pueden identificarse por el tamaño y forma irregular, el citoplasma esparcido, y el núcleo denso irregular. B. Tinción Giemsa de ascitis no procesada a partir de un paciente con tumor seroso del ovario muestra dos células mesoteliales colocadas una tras otra indicada por flechas cortas. También se muestra un grupo de cinco células epiteliales malignas indicadas por la flecha larga. Los eritrocitos son visibles en el fondo. C. Tinción Giemsa de otro paciente con tumor seroso del ovario que indica un grupo de células compuestos de células mesoteliales, linfocitos y células neoplásicas epiteliales (flecha) . La FIGURA 20: Ensayo ADCC in vitro de ch2B6 y ch2B6 aglicosilado en células Daudi. Anticuerpo ch2B6 media ADCC in vitro en células daudi que expresan CD32B. La FIGURA 21. Ensayo ADCC in vitro de ch2B6 y ch2B6 aglicosilado en células Raji. Los anticuerpos ch2B6 median ADCC in vi tro en CD32B que expresan células Raji. La FIGURA 22. Actividad ADCC in vitro de anticuerpos 2B6 quiméricos y humanizados en células Daudi. Se opsonizaron células Daudi etiquetadas con indio-111 con: ch2b6, ch2B6 N297Q, hu2B6 o hu2B6YA. La FIGURA 23: Tamaño de tumor estimado en ratones individuales. Se indican los días de inyección por flechas. Las FIGURAS 24A-G. Efecto de Rituxan y variantes 2B6 en el crecimiento de tumor en ratones. A: Rituximab. B: ch2B6, ch2B6 N297Q, h2B6 y h2B6YA. C: h2B6YA. D: h2B6YA 31/60. E: h2B6YA 38/60. F:h2B6YA 55/60. G. h2B6YA 71. Las FIGURAS 25 A-I: Tinción ex vivo de Daudi para CD20 y CD32B. Tumores Daudi se recolectaron a partir de ratones tratados con h2B6 (B, E, H) o h2B6YA (C, F, I) . La expresión de CD20 (G, H, I) y CD32B (D, E, F) se comparó con aquellas células Daudi expandidas in vi tro (A, D, G) . La FIGURA 26. La expresión de los marcadores de membrana superficial en células B-CLL a partir de cinco diferentes pacientes. Las PBMC a partir de pacientes diagnosticados con B-CLL se aislaron utilizando centrifugación de gradiente de densidad Ficoll-Paque y se analizaron para expresión de CD32B junto con CD3, CD19, CD20 o CD5 (últimos tres pacientes) . Se tiñeron las células utilizando el anticuerpo 2B6 para detectar CD32B seguido por fragmentos F(ab)'2 de IgG anti-ratón de cabra etiquetado con Cy5, y CD3 y contra-teñidos con FITC directamente o anticuerpos de ratón etiquetados con PE contra CD19, CD20 o CD5. Las células teñidas se analizaron por FACSCalibur (Becton Dickinson) . Las FIGURAS 27 A-B: Tinción inmunohistoquímica de Células B Daudi. A: anticuerpo anti-CD32B; amplificación 40x. B. Anticuerpo anti-CD20; ampliación 40x. Las FIGURAS 28 A-C: Tinción inmunohistoquímica de tejido de amígdala normal. A: tinción H-E; ampliación lOx. Una porción de una cripta (flecha pequeña) y los nodulos linfáticos con centros germinales (flecha larga) se observó. B: Anti-CD32B; ampliación 40x. Las células positivas en los folículos que rodean a los centros germinales. C: Anti-CD20; ampliación 40x. Los folículos linfáticos mostraron centros germinales que reaccionan con anti-CD20. Las FIGURAS 29 A-C. Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos normales. A: tinción H-E; ampliación 4x. Se observaron algunos folículos linfáticos con centros germinales. B: Anti-CD32B; ampliación 4x. Los centros germinales se circunscribieron por un anillo de células positivas para CD32B. C: Anti-CD20; ampliación ' 4x. Las células en los centros germinales reaccionaron con anti-CD20. Las FIGURAS 30 A-C: Tinción histoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 1 (MG04-CHTN-19) . Se observó la evidencia de un proceso maligno con un tipo difuso de infiltración cambiando la arquitectura de un nodulo linfático normal. Este proceso resultó en láminas de células irregulares grandes con núcleo hipercromático y citoplasma de barrido. A. Tinción H&E; ampliación 4x.B: Tinción H&E; ampliación lOx. C. Tinción H&E; ampliación 4x. B: Tinción H&E; ampliación lOx. C. Tinción H&E; ampliación 20x. Las FIGURAS 31 A-B: Tinción Inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 1 (MG04-CHTN-19) . Secciones seriales a ampliación 4x mostraron diferencias en el patrón de distribución de las células que expresan CD32B (A: anticuerpo anti-CD32B) y CD20 (B: anticuerpo anti-CD20) Las FIGURAS 32 A-D: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 1 (MG04-CHTN-19) .

Controles de isotipo están a la izquierda de cada anticuerpo de prueba. A. Iso-control (IgGl) ; ampliación lOx. B.

Anticuerpo anti-CD32B (m2B6) ; ampliación lOx. C. Iso-control (IgG2a) ; ampliación lOx. D. anticuerpo anti-CD20 (1F5) ; ampliación lOx. Las FIGURAS 33 A-C: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 2 (MG04-CHTN-22) . Las células malignas se infiltraron y expandieron hacia áreas en donde el tejido del nodulo linfático normal (flecha) se presentó aún. No se observaron folículos linfáticos. A. Tinción A&E; ampliación 4x. B: Tinción H&E; ampliación lOx. C. Tinción H&E; ampliación 20x. Las FIGURAS 34 A-B: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 2 (MG04-CHTN-22) . Se observaron las diferencias en la distribución celular y el número de células que expresan CD32B y CD20. A: anticuerpo anti-CD32B; ampliación 4x. B. anticuerpo anti-CD20; ampliación 4x. Las FIGURAS 35 A-D: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 2 (MG04-CHTN-22) . Controles isotipo y sus anticuerpos de prueba correspondientes a la derecha. A. Iso-control (IgGl) ; ampliación lOx. B. anticuerpo anti-CD32B (m2B6) : ampliación lOx. C. Iso-control (IgG2a) ; ampliación lOx. D. anticuerpo anti-CD20 (1F5) ; ampliación lOx.

Las FIGURAS 36 A-C: Tinción Inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 3 (MG04-CHTN-26) . Se distribuyeron las células neoplásicas en un patrón folicular e histológico difuso. En una vista de alta potencia, las células grandes con núcleo irregular e hipercromático se presentaron. A. Tinción H&E; ampliación 4x; B. Tinción H&E; ampliación lOx. C. Tinción H&E; ampliación 20x. Las FIGURAS 37 A-B: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 3 (MG04-CHTN-26) . Más células neoplásicas reaccionan a anti-CD20 (B) que a anti-CD32b (A) . A: Anti-CD32B; ampliación 4x. B. Anti-CD20; ampliación 4x. Las FIGURAS 38 A-D: Tinción Inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 3 (MG04-CHTN-26) . El control de isotipo a la izquierda de cada anticuerpo de prueba. A. Iso-control (IgGl) ; ampliación lOx.B. Anticuerpo anti-CD32B (m2B6) ; ampliación lOx. C. Iso-control (IgG2a) ; ampliación lOx. D. Anticuerpo anti-CD20 (1F5) ; ampliación lOx. Las FIGURAS 39 A-C: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 4 (MG04-CHTN-27) . Se observó el reemplazo del nodulo linfático normal por una proliferación difusa de células grandes en tamaño con el núcleo hipercromático. A. tinción H&E; ampliación 4x. B: tinción H&E; ampliación lOx. C. Tinción H&E; ampliación 20x.

Las FIGURAS 40 A-B: Tinción Inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 4 (MG04-CHTN-27) .

Las células neoplásicas tienen más afinidad para anti-CD32B.

A: Anticuerpo anti-CD32B; ampliación 4x. B. Anticuerpo anti-CD20; ampliación 4x. Las FIGURAS 41 A-D: Tinción Inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 4 (MG04-CHTN-27) . A.

Iso-control (IgGl) ; ampliación lOx. B. Anticuerpo anti-CD32B (m2B6) ; ampliación lOx. C. Iso-control (IgG2a) ; ampliación lOx. D. Anticuerpo anti-CD20 (1F5) ; ampliación lOx. Las FIGURAS 42 A-C: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 5 (MG05-CHTN-03) . Este tumor se organizó en un patrón difuso y se compuso de un intermediario a células grandes con el núcleo hipercromático. A. Tinción H&E; ampliación 4x. B: Tinción H&E; ampliación lOx. C. Tinción H&E; ampliación 20x. Las FIGURAS 43 A-B: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 5 (MG05-CHTN-03) .

Las células tumorales reaccionan fuertemente con anti-CD32B (A) . A: Anticuerpo anti-CD32B; ampliación 4x. B. Anticuerpo anti-CD20; ampliación 4x. Las FIGURAS 44 A-D: Tinción Inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 5 (MG05-CHTN-03) . A.

Iso-control (IgGl) ; ampliación lOx. B. Anticuerpo anti-CD32B (m2B6) ; ampliación lOx. C. Iso-control (IgG2a) ; ampliación lOx. D. Anticuerpo anti-Cd20 (1F5) ; ampliación lOx. Las FIGURAS 45 A-C: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 6 (MG05-CHTN-05) . Se observó un infiltrado predominantemente difuso de este nodulo linfático secundario a una proliferación de células grandes con núcleo redondo intermezclado con linfocitos pequeños y normales dispersados. A. Tinción H&E; ampliación 4x. B: Tinción H&E; ampliación lOx. C. Tinción H&E; ampliación 20x. Las FIGURAS 46 A-B: Tinción Inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 6 (MG05-CHTN-05) .

Anti-CD20 se enlaza fuertemente a las células en este caso de linfoma (B) , mientras algunas células reaccionan a anti-CD32B (A) . A: Anticuerpo anti-CD32B; ampliación 4x. B. Anticuerpo anti-CD20; ampliación 4x. Las FIGURAS 47 A-D: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 6 (MG05-CHTN-05) . A.

Iso-control (IgGl) ; ampliación lOx. B. Anticuerpo anti-CD32B (m2B6) ; ampliación lOx. C. Iso-control (IgG2a) ; ampliación lOx. D. Anticuerpo anti-CD20 (1F5) ; ampliación lOx. Las FIGURAS 48 A-C: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 7 (MG04-CHTN-30) . Se observó el nodulo linfático con una infiltración difusa por linfocitos pequeños con núcleo redondo y basofílico y citoplasma escaso. La atipia citológica no se presentó. A. Tinción H&E; ampliación 4x; B. Tinción H&E; ampliación lOx.C.

Tinción H&E; ampliación 20x. Las FIGURAS 49 A-D: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 7 (MG04-CHTN-30) .

Los controles de isotipo y sus anticuerpos de prueba correspondientes a la derecha. A. Iso-control (IgGl) ; ampliación lOx. B. anticuerpo anti-CD32B (m2B6) ; ampliación lOx. C. Iso-control (IgG2a) ; ampliación lOx. D. Anticuerpo anti-CD20 (1F5) ; ampliación lOx. Las FIGURAS 50 A-C: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 8 (MG04-CHTN-31) . Se observó el nodulo linfático con reemplazo completo de su arquitectura normal por células grandes a intermedias con núcleo redondo y citoplasma escaso. A. Tinción H&E; ampliación 4x. B: Tinción H&E; ampliación lOx. C. Tinción H&E; ampliación 20x. Las FIGURAS 51 A-D. Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 8 (MG04-CHTN-31) .

Controles de isotipo y sus anticuerpos de prueba correspondientes a la derecha. A. Iso-control (IgGl) ; ampliación lOx, B. Anticuerpo anti-CD32B (m2B6) ; ampliación lOx. C. Iso-control (IgG2a) ; ampliación lOx. D. Anticuerpo anti-CD20 (1F5) ; ampliación lOx. Las FIGURAS 52 A-C: Tinción inmunohistoquímica del bazo a partir del paciente 9 (Mg04-CHTN-36) . Este bazo mostró una implicación masiva de la pulpa roja. En la vista de potencia alta, se observaron las células malignas grandes a intermedias con citoplasma escaso. A. Tinción H&E; ampliación 4x. B: Tinción H&E; ampliación lOx. C. Tinción H&E; ampliación 20x. Las FIGURAS 53 A-D: Tinción inmunohistoquímica del bazo a partir del paciente 9 (MG04-CHTN-36) . Iso-control (IgGl) ; ampliación lOx. B. Anticuerpo anti-CD32B (m2B6) ; ampliación lOx. C. Iso-control (IgG2a) ; ampliación lOx. D.

Anticuerpo anti-CD20 (1F5) ; ampliación lOx. Las FIGURAS 54 A-C: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 10 (MG04-CHTN-41) .

Aunque este nodulo linfático presentó pocas estructuras sugiriendo la formación de nodulos, esto fue predominantemente difuso. En vista a alta potencia, estas células fueron pequeñas con un núcleo ligeramente irregular.

A. Tinción H&E; ampliación 4x. B. Tinción H&E; ampliación lOx. C. tinción H&E; ampliación 20x. Las FIGURAS 55 A-D: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 10 (MG04-CHTN-41) . A. Iso-control (IgGl) ; ampliación lOx.B. Anticuerpo anti- CD32B (m2B6) ; ampliación lOx. C. Iso-control (IgG2a) ; ampliación lOx.D. Anticuerpo anti-CD20 (1F5) ; ampliación lOx. Las FIGURAS 56 A-C: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 11 (MG04-CHTN-05) . Este nodulo linfático se caracterizó por un linfoma maligno del tipo de célula grande. El tumor tuvo proliferación monótona de células grandes distribuidas en un patrón difuso. A. Tinción H&E; ampliación 4x. B: Tinción H&E; ampliación lOx. C. Tinción H&E; ampliación 20x. Las FIGURAS 57 A-D: Tinción inmunohistoquímica de nodulos linfáticos a partir del paciente 11 (MG04-CHTN-05) . A. Iso-control (IgGl) ; ampliación lOx. B. Anticuerpo anti-CD32B (m2B6) ; ampliación lOx. C. Iso-control (IgG2a) ; ampliación lOx. D. Anticuerpo anti-CD20 (1F5) ; ampliación lOx.

. DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS .1 ANTICUERPOS ESPECÍFICOS DE Fc?RIIB La presente invención abarca anticuerpos (de preferencia anticuerpos monoclonales) o fragmentos de los mismos que enlazan específicamente Fc?RIIB, de preferencia Fc?RIIB humano, más preferiblemente Fc?RIIB humano nativo con una mayor afinidad que los anticuerpos o fragmentos de los mismos enlazan Fc?RIIA, de preferencia Fc?RIIA humano, más preferiblemente Fc?RIIA humano nativo. Se describen anticuerpos representativos en la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana No. 2004/0185045 y la Solicitud Provisional Norteamericana No. de Serie 60/569,882, incorporada expresamente en la presente para referencia en su totalidad. La presente invención abarca el uso de un anticuerpo específico de Fc?RIIB, un análogo, un derivado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo (por ejemplo, una o más regiones complementariamente determinantes (las "CDR") de un anticuerpo específico de Fc?RIIB) en la prevención, tratamiento, manejo o mejora de una enfermedad, tal como cáncer, en particular, una malignidad de célula B o uno o más síntomas de la misma. De preferencia, los anticuerpos de la invención enlazan el dominio extracelular de Fc?RIIB humano nativo. En ciertas modalidades, los anticuerpos o fragmentos del mismo enlazan a Fc?RIIB con una mayor afinidad de dos veces, cuatro veces, 6 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 1000 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces, 107 veces ó 108 veces que los anticuerpos o fragmentos del mismo enlazan Fc?RIIA. En aún otras modalidades, la invención abarca el uso de anticuerpos Fc?RIIB que enlazan exclusivamente a Fc?RIIB y no tienen afinidad para Fc?RIIA utilizando métodos estándares conocidos en la técnica y se describen en la presente. En una modalidad preferida, los anticuerpos son humanos o humanizados. En aún otra modalidad preferida, los anticuerpos de la invención no enlazan además receptores de activación Fc, por ejemplo, Fc?lIIA, Fc?lIIB, etc. En una modalidad, el anticuerpo específico de Fc?RIIB de acuerdo con la invención no es el anticuerpo monoclonal designado KB61, como se describe en Pulford et al . , 1986 (Immunology, 57: 71-76) o el anticuerpo monoclonal designado MAbII8D2 como se describe en Weinrich et al . , 1996 (Hybridoma, 15 (2) : 109-6) . En una modalidad específica, el anticuerpo específico de Fc?RIIB de la invención no se enlaza al mismo epítope y/o no compite con el enlace con el anticuerpo monoclonal KB61 ó II8D2. De preferencia, el anticuerpo específico Fc?RIIB de la invención no enlaza la secuencia de aminoácidos SDPNFSI que corresponde a las posiciones 135-141 de la isoforma Fc?RIIb2. En una modalidad particular, los anticuerpos de la invención, o fragmentos de los mismos agonizan al menos una actividad de Fc?RIIB. En una modalidad de la invención, tal actividad es la inhibición de la señalización mediada por el receptor de célula B. En otra modalidad, los anticuerpos agonísticos de la invención inhiben la actividad de las células B, la proliferación de la célula B, la producción de anticuerpos, la entrada de calcio intracelular de células B, el progreso de ciclo celular, o la actividad de una o más moléculas de señalización corriente abajo en la trayectoria de transducción de señal Fc?RIIB. En aún otra modalidad, los anticuerpos agonísticos de la invención mejoran la fosforilación de Fc?RIIB o reclutamiento de SHIP. En una modalidad adicional de la invención, los anticuerpos agonísticos inhiben la actividad de la MAP cinasa o reclutamiento de Akt en la trayectoria de señalización mediada por el receptor de célula B. En otra modalidad, los anticuerpos agonísticos de la invención agonizan la inhibición mediada por Fc?RIIB de la señalización de FceRI . En una modalidad particular, tales anticuerpos inhiben activación de mastocito inducida por FceRI, movilización de calcio, desgranulación, producción de citoquina, o liberación de serotonina. En otra modalidad, los anticuerpos agonísticos de la invención estimulan fosforilación de Fc?RIIB, estimulan el reclutamiento de SHIP, estimula la fosforilación de SHIP y su asociación con Shc, o inhiben la activación de los miembros de la familia de MAP cinasa (por ejemplo, Erkl, Erk2, JNK, p38, etc.). En aún otra modalidad, los anticuerpos agonísticos de la invención mejoran la fosforilación de la tirosina de p62dok y su asociación con SHIHP y rasGAP. En otra modalidad, los anticuerpos agonísticos de la invención inhiben fagocitosis mediada por Fc?R en monocitos o macrófagos . En otra modalidad, los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos antagonizan al menos una actividad de Fc?RIIB. En una modalidad, la actividad es la activación de señalización mediada por el receptor celular B. En una modalidad particular, los anticuerpos antagonísticos de la invención mejoran la actividad de la célula B, la proliferación celular, la producción de anticuerpos, la entrada de calcio intracelular, o la actividad de una o más moléculas de señalización corriente abajo en la trayectoria de transducción de señal Fc?RIIB. En aún otra modalidad particular, los anticuerpos antagonísticos de la invención disminuyen la fosforilación de Fc?RIIB o reclutamiento SHIP. En una modalidad adicional de la invención, los anticuerpos antagonísticos mejoran la actividad de la MAP cinasa o el reclutamiento Akt en la trayectoria de señalización mediada por el receptor de célula B. En otra modalidad, los anticuerpos antagonísticos de la invención antagonizan la inhibición mediada por Fc?RIIB de señalización FceRI . En una modalidad particular, los anticuerpos antagonísticos de la invención mejoran la activación de mastocitos inducidas por FceRI, la movilización del calcio, desgranulación, producción de citoquina, o liberación de serotonina. En otra modalidad, los anticuerpos antagonísticos de la invención inhiben la fosforilación de Fc?RIIB, inhiben el reclutamiento de SHIP; inhiben la fosforilación SHIP y su asociación con Shc, mejoran la activación de los miembros de la familia de MAP cinasa (por ejemplo, Erkl, Erk2, JNK, p38, etc.). En aún otra modalidad, los anticuerpos antagonísticos de la invención inhiben la fosforilación de la tirosina de p62dok y su asociación con SHIP y rasGAP. En otra modalidad, los anticuerpos antagonísticos de la invención mejoran fagocitosis mediada por Fc?R en monocitos o macrófagos. En otra modalidad, los anticuerpos antagonísticos de la invención previenen fagocitosis, suprime de partículas opsonizadas por macrófagos esplénicos. En otras modalidades, los anticuerpos de la invención, o fragmentos de los mismos pueden utilizarse para dirigir una población de células, pero no otras. Sin unirse por ninguna teoría, la presente invención ha descubierto que Fc?RIIB no se expresa altamente en neutrófilos, como se pensó previamente. Altas concentraciones de un anticuerpo anti-Fc?RIIB reaccionan con neutrófilos. Sin embargo, la reactividad neutrofílica desaparece rápidamente con concentraciones disminuidas de anti-Fc?RIIB. A bajas concentraciones de anticuerpo anti-Fc?RIIB, se conservó la reactividad con células CD20+B. De este modo, la reactividad de un anticuerpo de la invención con neutrófilos puede reducirse de manera que no afectan las poblaciones irrelevantes, tales como neutrófilos o plaquetas. Por consiguiente, en ciertas" modalidades de la invención, un anticuerpo de la invención se emplea a niveles que reconocen totalmente sus poblaciones objetivo, pero no otras células. Los anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a anticuerpos monoclonales, anticuerpos sintéticos, anticuerpos recombinantemente producidos, anticuerpos multiespecífieos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos camelizados, Fvs de cadena sencilla (scFv) , anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs enlazados con disulfuro (sdFv) , intracuerpos, y fragmentos de enlace de epítope o cualquiera de lo anterior. En particular, los anticuerpos utilizados en los métodos de la presente invención incluyen moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir moléculas que contienen un sitio de enlace antigénico que se enlaza inmunoespecíficamente a Fc?RIIB con mayor afinidad que la molécula de inmunoglobulina enlaza Fc?RIIA. Los análogos de anticuerpo pueden incluir también receptores de célula T específicos de Fc?RIIB, por ejemplo, receptores de células T quiméricas (véase por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2004/0043401), un receptor de célula T de cadena sencilla enlazado a un anticuerpo de cadena sencilla (véase por ejemplo, Patente Norteamericana No. 6,534,633) y andamios de proteínas (véase por ejemplo, Patente Norteamericana No. 6,818,418). En ciertas modalidades, un análogo de anticuerpos de la invención no es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos utilizados en los métodos de la invención pueden ser desde cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos (por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, murinos, burros, ovejas, conejos, cabras, cobayos, camellos, caballos o pollos) . De preferencia, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Como se utiliza en la presente, anticuerpos "humanos" incluye anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácido de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados a partir de las bibliotecas de inmunoglobulina humana o bibliotecas de secuencias de codificación de inmunoglobulina humana sintética o desde ratones que expresan anticuerpos a partir de genes humanos . Los anticuerpos utilizados en los métodos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos pueden enlazarse inmunoespecíficamente a diferentes epítopes de Fc?RIIB o se enlazan inmunoespecíficamente tanto a un epítope de Fc?RIIB así como un epítope heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Véase por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Nos. WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360 y WO 92/05793; Tutt, et al . , 1991, J. Immunol. 147:60-69; Patentes Norteamericanas Nos. 4,474,893, 4,714,681, 4,925,648, 5,573,920 y 5,601,819; y Kostelny et al . , 1992, J. Immunol . 148:1547-1553; Todorovska et al . , 2001 Journal of Immunological Methods, 248:47-66. En las modalidades particulares, los anticuerpos de la invención son multiespecíficos con especificidades para Fc?RIIB y para un antígeno cancerígeno o cualquier otro marcador de superficie celular específico para una célula (por ejemplo, una célula inmune tal como una célula T o una célula B) diseñada para ser eliminada, por ejemplo, para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno particular, o para otros receptores Fc, por ejemplo, Fc?RIIIA, Fc?RIIIB, etc. En una modalidad particular, el anticuerpo se deriva de un anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6 ó 3H7, que tiene números de acceso ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente. Los anticuerpos 2B6 y 3H7 de producción de hibridomas se han depositado con the American Type Culture Collection (10801 University BIvd., Manassas, VA. 20110-2209) el 13 de agosto del 2002 bajo las provisiones de the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedures, y los números de acceso asignados PTA-4591 (para producción de hibridoma 2B6) y PTA-4592 (para producción de hibridoma 3H7), respectivamente, y se incorporan en la presente para referencia. En una modalidad específica, la invención abarca un anticuerpo con una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC de ID NO: 28 y la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC de ID NO: 26. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención son humanos o se han humanizado, de preferencia una versión humanizada del anticuerpo producida por el clon 3H7 ó 2B6.

La invención abarca también el uso de otros anticuerpos, 'de preferencia anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos que enlazan específicamente Fc?RIIB, de preferencia Fc?RIIB humanos, más preferiblemente Fc?RIIB humanos nativos, que se derivan desde los clones que incluyen, pero no se limitan a 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 y 1F2 que tienen números de Acceso ATCC, PTA-5958, PTA-5961, PTa-5962, PTa-5960, y PTA-5959, respectivamente. Los hibridomas que producen los clones identificados anteriormente se depositaron bajo provisiones de the Budapest Treaty con the American Type Culture Collection (10801 University BIvd., Manassas, VA. 20110-2209) el 7 de mayo de 2004, y se incorporan en la presente para referencia. En las modalidades preferidas, los anticuerpos descritos anteriormente se quimerizan o humanizan. En una modalidad específica, un anticuerpo utilizado en los métodos de la presente invención es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígenos del mismo (por ejemplo, que comprende una o más regiones complementariamente determinantes (las CDR) , de preferencia todas las 6 CDR) del anticuerpo producido por el clon 2B6 o 3H7 con los números de acceso ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente (por ejemplo, la cadena pesada CDR3) . En una modalidad específica, un anticuerpo utilizado en los métodos de la presente invención es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígenos del mismo (por ejemplo que comprende una o más regiones complementariamente determinantes (las CDR) , de preferencia todas las 6 CDR) del anticuerpo producido por el clon 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 y 1F2 que tiene los números de acceso ATCC, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente (por ejemplo, la cadena pesada CDR3) . En otra modalidad, un anticuerpo utilizado en los métodos de la presente invención se enlaza al mismo epítope como el anticuerpo monoclonal de ratón producido a partir del clon 2B6 ó 3H7 con números de acceso ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente y/o compite con el anticuerpo monoclonal de ratón producido a partir del clon 2B6 o 3H7 con números de acceso ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente como se determina, por ejemplo, en un ensayo ELISA u otro inmunoensayo competitivo apropiado, y también enlaza Fc?RIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA. En otra modalidad, un anticuerpo utilizado en los métodos de la presente invención enlaza al mismo epítope como el anticuerpo monoclonal de ratón producido a partir del clon 1D5, '2E1, 2H9, 2D11 y 1F2 que tiene números de acceso ATCC, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente, y/o compite con el anticuerpo monoclonal de ratón producido a partir del clon 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 y 1F2 que tiene números de acceso ATCC PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente, como se determina por ejemplo, en un ensayo ELISA u otro inmunoensayo competitivo apropiado y también enlaza Fc?RIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA. La presente invención abarca también anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprende una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada variable y/o cadena ligera variable que es al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable y/o la cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 ó 1F2 que tiene números de acceso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente. La presente invención abarca además anticuerpos o fragmentos de los mismos que enlazan específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que el anticuerpo o fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA, los anticuerpos o fragmentos del anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de una o más CDR que es al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una o más CDR del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 ó 1F2 que tiene números de acceso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente. La determinación de porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por cualquier método conocido por un experto en la técnica, incluyendo investigaciones de proteína BLAST. La presente invención abarca también el uso de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que enlazan específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que tales anticuerpos o fragmentos de los mismos enlazan Fc?RIIA, en donde los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se codifican por una secuencia de nucleótido que hibridiza la secuencia de nucleótido del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 ó 1F2 que tiene números de acceso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente, bajo condiciones severas. En una modalidad preferida, la invención proporciona anticuerpos o fragmentos de los mismos que enlazan específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que los anticuerpos o fragmentos de los mismos que enlazan Fc?RIIA, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que comprenden una cadena ligera variable y/o una cadena pesada variable codificada por una secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones severas a la secuencia de nucleótido de la cadena ligera variable y/o cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 ó 1F2 que tiene números de acceso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente, bajo condiciones severas. En otra modalidad preferida, la invención proporciona anticuerpos o fragmentos de los mismos que enlazan específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que los anticuerpos o fragmentos de los mismos enlazan Fc?RIIA, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos comprenden una o más CDR codificada por una secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones severas a la secuencia de nucleótido de una o más CDR del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 ó 1F2 que tiene números de acceso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente. Las condiciones de hibridización severas incluyen, pero no se limitan a hibridización a ADN de enlace de filtro en cloruro de sodio 6X/citrato de sodio (SSC) aproximadamente 45 °C seguido por uno o más lavados en 0.2X SSC/0.1% de SDS a aproximadamente 50-65 °C, condiciones altamente severas tales como hibridización a ADN enlazado con filtro en 6X SSC a aproximadamente 45 °C seguido por uno o más lavados en 0. IX SSC/0.2% de SDS a aproximadamente 60 °C o cualesquiera otras condiciones de hibridización severas conocidas por aquellos expertos en la técnica (véase por ejemplo, Ausubel, F.M., et al . , eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley and Sons, Inc., NY en las páginas 6.3.1 a 6.3.6 y 2.10.3, incorporada en la presente para referencia) . Los dominios constantes de los anticuerpos pueden seleccionarse con respecto a la función propuesta del anticuerpo, en particular con respecto a la función efectora la cual puede requerirse. En algunas modalidades, los dominios constantes de los anticuerpos son dominios IgA, IgE, Igg o IgM humanos. Los anticuerpos utilizados en los métodos de la invención incluyen derivados que se modifican, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo tal como la unión covalente. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados de anticuerpos, incluyen anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos de protección/bloqueo conocidos, desdoblamiento proteolítico, conexión a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las modificaciones químicas numerosas puede llevarse a cabo por técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a desdoblamiento químico específico, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. Además, los anticuerpos de la invención pueden, a su vez, utilizarse para generar anticuerpos anti-idiotipo al utilizar técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. (Véase por ejemplo, Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7:437-444; y Nissinoff, 1991, J. Immunol . 147:2429-2438). La invención proporciona métodos que emplean el uso de polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo. La presente invención abarca anticuerpos de un solo dominio, incluyendo anticuerpos de un solo dominio camelizados (Véase por ejemplo, Muyldermans et al . , 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttall et al . , 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253; Reichmann y Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231-25; Publicaciones Internacionales Nos. WO 94/04678 y WO 94/25591; Patente Norteamericana No. 6,005,079; las cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades) . En una modalidad, la presente invención proporciona anticuerpos de un solo dominio que comprende dos dominios VH con modificaciones de manera que se forman los anticuerpos de un solo dominio. Los métodos de la presente invención abarcan también el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos que tienen vidas promedio (por ejemplo vidas promedio en suero) en un mamífero, de preferencia un ser humano, de más de 15 días, de preferencia más de 20 días, más de 25 días, más de 30 días, más de 35 días, más de 40 días, más de 45 días, más de 2 meses, más de 3 meses, más de 4 meses o más de 5 meses. Las vidas promedio incrementadas de los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos en un mamífero, de preferencia un ser humano, resulta en una cantidad de suero más elevada de tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en el mamífero, y de este modo, reduce la frecuencia de la administración de tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y/o reduce la concentración de tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se administran. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos que tienen vidas promedio ín vivo incrementadas pueden generarse por técnicas conocidas por aquellos de experiencia en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de los mismos con vidas promedio in vivo incrementadas pueden generarse para modificar (por ejemplo, sustituir, eliminar o agregar) residuos de aminoácidos identificado como implicados en la interacción entre el dominio Fc y el receptor FcRn. Los anticuerpos de la invención pueden diseñarse por métodos descritos en Ward et al . , para incrementar la vida promedio biológica (Véase la Patente Norteamericana No. 6,277,375 Bl) . Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden diseñarse en el dominio de pivoteo Fc que tiene vidas promedio en suero in vivo incrementadas . Los anticuerpos o fragmentos de los mismos con vidas promedio in vivo incrementadas pueden generarse al unir a tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpos moléculas poliméricas tales como polietilenglicol (PEG) de peso molecular elevado. El PEG puede unirse a tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con o sin un enlazador multifuncional ya sea a través de conjugación de sitio específica del PEG al término N o C de tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpos o a través de grupos epsilón-amino presentes en residuos lisina. La derivatización de polímero lineal o ramificado que resulta en la pérdida mínima de actividad biológica será utilizada. El grado de conjugación se verificará estrechamente por SDS-PAGE y espectrometría de masa para asegurar la conjugación apropiada de moléculas PEG a los anticuerpos. El PEG no reactivo puede separarse a partir de conjugados de PEG de anticuerpo por ejemplo, por exclusión de tamaño o cromatografía de intercambio de ion. Los anticuerpos de la invención pueden modificarse por los métodos y agentes de acoplamiento descritos por Davis et al . (Véase la Patente Norteamericana No. 4,179,337) con el fin de proporcionar composiciones que puedan inyectarse en el sistema circulatorio del mamífero con sustancialmente ninguna respuesta inmunogénica. La presente invención abarca también el uso de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los anticuerpos de la invención con mutaciones (por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos) en el esquema o las regiones de CDR. De preferencia, las mutaciones en estos anticuerpos mantienen o mejoran la avidez y/o afinidad de los anticuerpos para Fc?RIIIB al cual se enlazan inmunoespecíficamente. Las técnicas estándares conocidas para aquellos expertos en la técnica (por ejemplo, inmunoensayos) pueden utilizarse para evaluar la afinidad de un anticuerpo para un antígeno particular. La invención abarca también métodos para modificar una función efectora de un anticuerpo de la invención, en donde el método comprende modificar el contenido de carbohidratos del anticuerpo utilizando los métodos descritos en la presente o conocidos en la técnica. Técnicas estándares conocidas por aquellos expertos en la técnica pueden utilizarse para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótido que codifica un anticuerpo, o fragmento del mismo, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis de sitio-dirigida y mutagénesis mediada por PCR, la cual resulta en sustituciones de aminoácidos. De preferencia, los derivados incluyen menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con relación al anticuerpo original o fragmento del mismo. En una modalidad preferida, los derivados tienen sustituciones de aminoácidos moderadas hechas en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales previstos . Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en humanos y ensayos de detección in vitro, puede ser preferible utilizar anticuerpos humanos, quiméricos o humanizados. Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Los anticuerpos humanos pueden hacerse por una variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de despliegue de fago descritos anteriormente utilizando bibliotecas de anticuerpos derivadas a partir de secuencias de inmunoglobulina humana. Véase también las Patentes Norteamericanas Nos. 4,444,887 y 4,716,111; y las Publicaciones Internacionales Nos. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741; cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. .1.1 Anticuerpos humanizados En las modalidades preferidas, los anticuerpos son anticuerpos humanizados. Un anticuerpo humanizado, es un anticuerpo, una variante o un fragmento de la misma, el cual es capaz de enlazarse a un antígeno predeterminado y el cual comprende una región de esquema que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una CDR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo específico de Fc?RIIB humanizado puede comprender sustancialmente todo de al menos uno, y normalmente dos dominios variables en el cual todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donador) y todas o sustancialmente todas las regiones de esquema son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. De preferencia, un anticuerpo humanizado de la invención comprende también al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , normalmente aquella de una inmunoglobulina humana. Los dominios constantes de los anticuerpos humanizados de la invención pueden seleccionarse con respecto a la función propuesta del anticuerpo, en particular la función efectora, la cual puede requerirse. En algunas modalidades, los dominios constantes de los anticuerpos humanizados de la invención son dominios IgA, IgE, IgG o IgM humanos. En una modalidad específica, los dominios constantes IgG humanos, especialmente de los isotipos IgGl e IgG3 se utilizan, cuando los anticuerpos humanizados de la invención se pretenden para usos terapéuticos y se necesitan las funciones efectoras de anticuerpo. En modalidades alternativas, isotipos Ig2 e IgG4 se utilizan cuando el anticuerpo humanizado de la invención se pretende para propósitos terapéuticos y la función efectora de anticuerpo no se requiere. Los anticuerpos específicos de Fc?RIIB humanizados se describen en las Solicitudes Norteamericanas Nos. de Serie 60/569,882 y 60/582,043, presentadas el 10 de mayo de 2004, y el 21 de junio de 2004, respectivamente. En algunas modalidades, el anticuerpo contiene tanto cadenas ligeras así como al menos el dominio variable de una cadena pesada. En otras modalidades, el anticuerpo puede contener además una o más regiones CH1, de pivoteo, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. El anticuerpo humanizado puede seleccionarse a partir de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgGi, IgG2, IgG3 e IgG . En algunas modalidades, el dominio constante es un dominio constante de fijación de complemento en donde se desea que el anticuerpo humanizado exhiba actividad citotóxica, y la clase es normalmente IgG?. En otras modalidades, en donde tal actividad citotóxica no es deseable, el dominio constante puede ser de la clase IgG2. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias a partir de más de una clase o isotipo, y seleccionar los dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas está dentro de la experiencia ordinaria en la técnica. El esquema y las regiones de CDR de un anticuerpo humanizado no necesitan corresponder precisamente a las secuencias parentales, por ejemplo, CDR donadora o el esquema consenso puede mutagenizarse por sustitución, inserción o eliminación de al menos un residuo de manera que la CDR o residuo de esquema en ese sitio no corresponde a ninguno del consenso o el anticuerpo donador. Tales mutaciones, sin embargo, son de preferencia no extensivas. Usualmente, al menos 75% de los residuos de anticuerpos humanizados corresponderá a aquellos de la región de esquema parental (FR) y secuencias CDR, más frecuentemente 90%, y más preferiblemente mayor de 95%. Los anticuerpos humanizados pueden producirse utilizando una variedad de técnicas conocidas en el arte, incluyendo, pero sin limitarse a, injerto de CDR (Patente Europea No. EP 239,400; Publicación Internacional No. WO 91/09967; y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,225,539, 5,530,101 y 5,585,089), enchapado o recubrimiento (Patentes Europeas Nos. EP 592,106 y EP 519,596, Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5) : 489-498; Studnicka et al . , 1994, Protein Engineering 7 (6) : 805-814; y Roguska et al . , 1994, Proc Nati Acad Sci USA 91:969-973), cadena pesada (Patente Norteamericana No. 5,565,332) y técnicas descritas en por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 6,407,213, 5,766,886, 5,585,089, Publicación Internacional No. WO 9317105, Tan et al . , 2002, J. Immunol. 169:1119-25, Caldas et al . , 2000, Protein Eng. 13:353-60, Morea, et al . , 2000, Methods 20:267-79, Baca et al . , 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84, Roguska et al . , 1996, Protein Eng. 9:895-904, Couto et al . , 1995, Cáncer Res. 55 (23 Supp) :5973s-5977s, Couto et al . , 1995, Cáncer Res. 55:1717-22, Sandhu, 1994, Gene 150:409-10, Pedersen et al . , 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73, Jones et al . , 1986, Nature 321:522-525, Riechmann et al . , 1988, Nature 332:323, y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596. Con frecuencia, los residuos del esquema en las regiones de esquema se sustituirán con el residuo correspondiente a partir del anticuerpo donador de CDR para alterar, de preferencia mejorar el enlace de antígenos. Estas sustituciones de esquema son idénticas por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, al modelar las interacciones de la CDR y los residuos de esquema para identificar residuos de esquema importantes para el enlace de antígenos y la comparación de secuencia para identificar residuos de esquema inusuales en posiciones particulares. (Véase por ejemplo, Queen et al . , Patente Norteamericana No. 5,585,089; Publicaciones Norteamericanas Nos. 2004/0049014 y 2003/0229208; Patentes Norteamericanas Nos. 6,350,861; 6,180,370; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089 y 5,530,101 y Riechmann et al . , 1988, Nature 332:323, todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades) . La presente invención proporciona para el uso de moléculas de anticuerpo humanizadas específicas para Fc?RIIB en donde una o más regiones de una o más CDR de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo humano (el anticuerpo receptor) se han sustituido por partes análogas de una o más CDR de un anticuerpo monoclonal donador el cual enlaza específicamente Fc?RIIB, con una mayor afinidad que Fc?RIIA, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal producido por el clon 2B6 o 3H7, que tiene números de acceso ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente. En otras modalidades, los anticuerpos humanizados se enlazan al mismo epítope como 2B6 o 3H7. En una modalidad más preferida, el anticuerpo humanizado específicamente se enlaza al mismo epítope como el anticuerpo murino donador. Se apreciará por un experto en la técnica que la invención abarca injerto de CDR de anticuerpos en general. De este modo, los anticuerpos donadores y aceptores pueden derivarse de animales de la misma especie e incluso la misma clase o sub-clase de anticuerpos. Más usualmente, sin embargo, los anticuerpos donadores y aceptores se derivan de animales de diferentes especies. Normalmente, el anticuerpo donador es un anticuerpo no humano, tal como un MAb de roedor, y el anticuerpo aceptor es un anticuerpo humano. En algunas modalidades, al menos una CDR del anticuerpo donador se injerta sobre el anticuerpo humano. En otras modalidades, al menos dos y de preferencia tres CDR de cada una de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera se injertan sobre el anticuerpo humano. Las CDR pueden comprender las CDR Kabat, las CDR de bucle estructural o una combinación de las mismas. En algunas modalidades, la invención abarca un anticuerpo Fc?RIIB humanizado que comprende al menos una cadena pesada injertada con CDR y al menos una cadena ligera injertada con CDR. En una modalidad preferida, las regiones de CDR del anticuerpo específico de Fc?RIIB humanizado se derivan a partir de un anticuerpo de murino específico para Fc?RIIB. En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados descritos en la presente comprenden alteraciones, incluyendo, pero sin limitarse a eliminaciones, inserciones, modificaciones de aminoácidos del anticuerpo aceptor, es decir, regiones de esquema de dominio variable de cadena pesada y/o ligera que son necesarias para retener especificidad de enlace del anticuerpo monoclonal donador. En algunas modalidades, las regiones de esquema de los anticuerpos humanizados descritas en la presente no consisten necesariamente de la secuencia de aminoácido precisa de la región de esquema de una región variable del anticuerpo humano de origen natural, pero contiene varias alteraciones, incluyendo, pero sin limitarse a eliminaciones, inserciones, modificaciones de aminoácidos que alteran la propiedad del anticuerpo humanizado, por ejemplo, mejora las propiedades de enlace de una región de anticuerpo humanizada que es específica para el mismo objetivo como el anticuerpo específico Fc?RIIB de murino. En las modalidades más preferidas, un número mínimo de alteraciones puede hacerse a la región de esquema con el fin de prevenir introducciones a gran escala de residuos de esquema no humanos y para asegurar inmunogenicidad mínima del anticuerpo humanizado en seres humanos. El anticuerpo monoclonal donador es de preferencia un anticuerpo monoclonal producido por clones 2B6 y 3H7 (que tiene números de acceso ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente), los cuales enlazan Fc?RIIB. En una modalidad específica, la invención abarca el uso de un anticuerpo injertado con CDR el cual enlaza específicamente Fc?RIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo enlaza Fc?RIIA, en donde el anticuerpo injertado con CDR comprende un dominio de región variable de cadena pesada que comprende residuos de esquema del anticuerpo receptor y residuos a partir del anticuerpo monoclonal donador, el cual enlaza específicamente Fc?RIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo enlaza Fc?RIIA, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal producido a partir de los clones 2B6 y 3H7. En otra modalidad específica, la invención abarca el uso de anticuerpo injertado con CDR el cual enlaza específicamente Fc?RIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo enlaza Fc?RIIA, en donde el anticuerpo injertado con CDR comprende un dominio de región variable de cadena ligera que comprende residuos de esquema del anticuerpo receptor y residuos a partir del anticuerpo monoclonal donador, el cual enlaza específicamente Fc?RIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo enlaza Fc?RIIA, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal producido a partir de clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 ó 1F2. De preferencia, los anticuerpos humanizados enlazan el dominio extracelular de Fc?RIIB humano nativo. Los anticuerpos anti-Fc?RIIB humanizados de la invención pueden tener una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR 1 (SEC de IDENT. NO: 1 o la SEC de IDENT. NO: 29) y/o CDR (SEC de IDENT. NO: 2 o la SEC de IDENT. NO: 30) y/o CD3 (SEC de IDENT. NO: 3 o la SEC de IDENT. NO: 31) y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de CDRl (SEC de IDENT. NO: 8 o SEC de IDENT. NO: 38) y/o una CDR2 (SEC de IDENT. NO: 9, SEC de IDENT. NO: 10, SEC de IDENT. NO: 11 o SEC de IDENT. NO: 39) y/o CDR3 (SEC de IDENT. NO: 12 o SEC de IDENT. NO: 40) . En una modalidad específica, la invención abarca el uso de un anticuerpo humanizado que comprende las CDR de 2B6 o de 3H7 en la prevención, tratamiento, manejo o mejora de una malignidad de célula B, o uno o más síntomas de la misma. En particular, un anticuerpo con un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC DE IDENT. NO: 24 y el dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC DE IDENT. NO: 18, SEC DE IDENT. NO: 20 o la SEC DE IDENT. NO: 22 se utiliza en la prevención, tratamiento, manejo o mejora de una malignidad de célula B, o uno o más síntomas de la misma. En una modalidad específica, la invención abarca el uso de un anticuerpo humanizado con el dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC DE IDENT. NO: 37 y el dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC DE IDENT. NO: 46, en la prevención, tratamiento, manejo o mejora de una malignidad de célula B, o uno o más síntomas de la misma. En aún otra modalidad preferida, los anticuerpos humanizados no se enlazan además a receptores de activación Fc, por ejemplo, Fc?lIIA, Fc?lIIB, etc . En una modalidad específica, se proporciona un anticuerpo 2B6 humanizado, en donde la región VH consiste de los fragmentos FR a partir del segmento VH de línea germinal humana VHl-18 (Matsuda et al . , 1998, J. Exp. Med. 188:2151062) y JH6 (Ravetch et al . , 1981, Cell 27(3 Pt.2): 583-91) , y una o más regiones CDR de 2B6 VH, que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC DE IDENT. NO: 1, SEC DE IDENT. NO: 2 o la SEC de ID No. 3. En una modalidad, 2B6 VH tiene la secuencia de aminoácido de la SEC DE IDENT. NO: 24. En otra modalidad específica, el anticuerpo 2B6 humanizado comprende además una región VL, la cual consiste de los segmentos FR del segmento VL de línea germinal humano VK-A26 (Lautner-Rieske et al . , 1992, Eur. J. Immunol . 22:1023-1029) y JK4 (Hieter et al . , 1982, J. Biol. Chem. 257:1516-22) y una o más regiones CDR de 2B6VL, que tienen la secuencia de aminoácido de la SEC DE IDENT. NO: 8, SEC DE IDENT. NO: 9, SEC de ID NO. 10, SEC DE IDENT. NO: 11 y SEC DE IDENT. NO: 12. En una modalidad, la 2B6 VL tiene la secuencia de aminoácido de la SEC DE IDENT. NO: 18, SEC DE IDENT. NO: 20, o la SEC DE IDENT. NO: 22. En otra modalidad específica, se proporciona un anticuerpo 3H7 humanizado, en donde la región VH consiste de los segmentos FR a partir de un segmento VH de línea germinal humana y las regiones de CDR de la 3H7 VH, que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC DE IDENT. NO: 37. En otra modalidad específica, el anticuerpo 3H7 humanizado comprende además regiones VL, las cuales consisten de los segmentos FR de un segmento VL de línea germinal humana y las regiones CDR de 3H7VL, que tienen la secuencia de aminoácido de la SEC DE IDENT. NO: 46.

Se proporciona en particular, un anticuerpo humani zado , que enlaza inmunoespecíficamente al dominio extracelular de Fc?RIIB humano nativo , el anticuerpo comprende ( o alternativamente , consiste de ) secuencias CDR de 2B6 o 3H7 , en cualquiera de las siguientes combinaciones : una VH CDRl y una VL CDRl; una VH CDRl y una VL CDR2; una VH CDRl y una VL CDR3; una VH CDR2 y una VL CDRl; VH CDR2 y VL CDR2; una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR3 y una VH una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDR3 y una VL CDR3; una VH1 CDRl, una VH CDR2 y una VL CDRl; una VH CDRl, una VH CDR2 y una VL CDR2; una VH CDRl, una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDRl, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDR2, una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDRl, una VL CDRl y una VL CDR2; una VH CDRl, una VL CDRl y una VL CDR3; una VH CDR2, una VL CDRl y una VL CDR2; una VH CDR2, una VL CDRl y una VL CDR3-; una VH CDR3, una VL CDRl y una VL CDR2; una VH CDR3, una VL CDRl y una VL CDR3; una VH CDRl, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDRl; una VH CDRl, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDRl, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR3; una VH CDRl, una VH CDR2, una VL CDRl y una VL CDR2; una VH CDRl, una VH CDR2, una VL CDRl y una VL CDR3; una VH CDRl, una VH CDR3, una VL CDRl y una VL CDR2; una VH CDRl, una VH CDR3, una VL CDRl y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDRl y una VL una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDRl y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR2 y una VL CDR3; una VH CDRl, una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDRl y una VL CDR2; una VH CDRl, una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDRl y una VL CDR3; una VH CDRl, una VH CDR2, una VL CDRl, una VL CDR2, y una VL CDR3; una VH CDRl, una VH CDR3, una VL CDRl, una VL CDR2, y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDRl, una VL CDR2, y una VL CDR3; o cualquier combinación de las mismas de las CDR VH y las CDR VL descritas en la presente. .1.2 Anticuerpos humanos Los anticuerpos humanos pueden producirse también utilizando ratones transgénicos los cuales son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero los cuales pueden expresar genes de inmunoglobulina humanos. Por ejemplo, los complejos genéticos de inmunoglobulina de cadena pesada y cadena ligera humanos pueden introducirse aleatoriamente o por recombinación homogénea dentro de células germinales embriónicas de ratón. Alternativamente, la región variable humana, la región constante y la región de diversidad pueden introducirse dentro de células germinales embriónicas de ratón además de los genes de cadena ligera y cadena pesada humanos. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón pueden suministrarse de modo separado o al mismo tiempo no funcionales con la introducción del lugar de inmunoglobulina humana por recombinación homologa. En particular, la eliminación homocigosa de la región JH evita la producción de anticuerpos endógenos. Las células germinales embriónicas modificadas se expanden y micro-inyectan dentro de blastocitos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos se reproducen entonces para producir descendencia homocigosa la cual expresa anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan utilizando metodologías convencionales con un antígeno seleccionado, por ejemplo, toda o una porción de un polipéptido de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden obtenerse a partir de ratones transgénicos inmunizados utilizando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humanos albergados por los ratones transgénicos se reajustan durante la diferenciación de células B y experimentan subsecuentemente alternación de clase y mutación somática. De este modo, al utilizar tal técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad) . Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, véase por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Nos. WO 98/24893, WO 96/34096 y WO 96/33735; y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,413,923, 5,625,126, 5,633,425, 5,569,825, 5,661,016, 5,545,806, 5,814,318 y 5,939,598, las cuales se incorporan para referencia en la presente en su totalidad. Además, las compañías tales como Abgenix, Ing. (Freemont, CA) y Medarex (Princeton, NJ) pueden acoplarse para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando tecnología similar a aquella descrita anteriormente. .1.3 Anticuerpos quiméricos Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones del anticuerpo se derivan a partir de diferentes moléculas de inmunoglobulina tales como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo no humano y una región constante de inmunoglobulina humana. La presente invención proporciona anticuerpos quiméricos de 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2 que tienen números de acceso ATCC PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica. Véase por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al . , 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al . , 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; y Patentes Norteamericanas Nos. 6,311,415, 5,807,715, 4,816,567 y 4,816,397, las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. Los anticuerpos quiméricos que comprenden una o más CDR a partir de una especie no humana y de regiones de esquema a partir de una molécula de inmunoglobulina humano pueden producirse utilizando una variedad de técnicas conocidas en el arte incluyendo por ejemplo, injerto de CDR (EP 239,400; Publicación Internacional No. WO 91/09967; y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,225,539, 5,30,101 y 5,585,089), enchapando o revistiendo (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28/4/5) : 489-498; Studnicka et al . , 1994, Protein Engineering 7:805; y Roguska et al . , 1994, PNAS 91:969), y la redistribución de cadena (Patente Norteamericana No. 5,565,332). Cada una de las referencias identificadas anteriormente se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Con frecuencia, los residuos de esquema en las regiones de esquema se sustituirán con el residuo correspondiente a partir del anticuerpo donador de CDR para alterar, de preferencia mejorar, enlace de antígenos. Estas sustituciones de esquema se identifican por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, modelando las interacciones de la CDR y los residuos de esquema para identificar residuos de esquema importantes para enlace de antígenos y comparación de secuencias para identificar residuos de esquema inusuales en posiciones particulares (Véase por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,585,089; y Riechmann et ai., 1988, Nature 332:323, las cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades) . .1.4 Modificaciones de Región Fc La invención abarca anticuerpos con dominios constantes Fc que comprenden una o más modificaciones de aminoácido las cuales alteran las funciones efectoras del anticuerpo tales como aquellas descritas en las Publicaciones de Solicitud de Patente Norteamericanas Nos. US. 2005/0037000 y 2005/0064514; Patentes Norteamericanas Nos. 5,624,821 y 5,648,260 y la Patente Europea No. EP 0 307 434; todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades. Estos anticuerpos pueden exhibir actividad de ADCC mejorada (por ejemplo, 2 veces, 10 veces, 100 veces, 500 veces, etc.) comparada a anticuerpos comparables sin modificación de aminoácidos . La presente invención abarca anticuerpos que comprenden modificaciones de preferencia, en la región Fc que modifican la afinidad de enlace del anticuerpo a uno o más Fc?R. Los métodos para modificar anticuerpos con enlace modificado a uno o más Fc?R se conocen en la técnica, véase por ejemplo, las Publicaciones PCT Nos. WO 04/029207, WO 04/029092, WO 04/028564, WO 99/58572, WO 99/51642, WO 98/23289, WO 89/07142, WO 88/07089 y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,843,597 y 5,642,821, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la invención abarca anticuerpos que tienen afinidad alterada para un Fc?R de activación, por ejemplo Fc?RIIIA. De preferencia tales modificaciones tienen también una función efectora mediada por Fc alterada. Las modificaciones que afectan la función efectora mediada por Fc se conocen en la técnica (Véase la Patente Norteamericana No. 6,194,551, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad) . Los aminoácidos que pueden modificarse de acuerdo con el método de la invención incluyen, pero no se limitan a Prolina 329, Prolina 331 y Lisina 322. La prolina 329, la Prolina 331 y la Lisina 322 se reemplazan de preferencia con alanina, sin embargo, la sustitución con cualquier otro aminoácido se contempla. Véase la Publicación Internacional No. WO 00/42072 y la Patente Norteamericana No. 6,194,551 las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. En una modalidad particular, la modificación de la región Fc comprende una o más mutaciones en la región Fc. Una o más mutaciones en la región Fc pueden resultar en un anticuerpo con una función efectora mediada por el anticuerpo alterado, un enlace alterado a otros receptores Fc (por ejemplo, receptores de activación Fc) , una actividad de ADCC alterada, o una actividad de enlace Clq alterada, o una actividad de citotoxicidad dependiente de complemento alterado, o cualquier combinación de las mismas. En algunas modalidades, la invención abarca moléculas que comprenden una región Fc variante que tiene una modificación de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 119, 125, 132, 133, 141, 142, 147, 149, 162, 166, 185, 192, 202, 205, 210, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 227, 229, 231, 232, 233, 235, 240, 241, 242, 243, 244, 246, 247, 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 258, 261, 262, 263, 268, 269, 270, 272, 274, 275, 276, 279, 280, 281, 282, 284, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 295, 298, 301, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 323, 326, 327, 328, 330, 333, 334, 335, 337, 339, 340, 343, 344, 345, 347, 348, 352, 353, 354, 355, 358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, 367, 369, 370, 371, 372, 375, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 404, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 414, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 427, 428, 431, 433, 435, 436, 438, 440, 441, 442, 443, 446, ó 447. De preferencia, el diseño de la porción Fc resulta en exterminación mediada por células incrementadas y/o exterminación mediada por complemento de las células tumorales. La invención abarca moléculas que comprenden regiones Fc variantes que consisten de o comprenden cualquiera de las mutaciones listadas en la tabla en lo siguiente en la Tabla 2 En aún otras modalidades, la invención abarca moléculas que comprenden regiones Fc variantes que tienen más de dos modificaciones de aminoácido. Un ejemplo no limitante de tales variantes se lista en la tabla siguiente (Tabla 3) . La invención abarca mutaciones listadas en la Tabla 3 las cuales comprenden además una o más modificaciones de aminoácido tales como aquellas descritas en la presente.

TABLA 3.VARIANTES DE COMBINACIÓN EJEMPLAR En las modalidades específicas, la región Fc variante tiene una leucina en la posición 247, una lisina en la posición 421 y un ácido glutámico en la posición 270 (MgFc31/60) ; una treonina en la posición 392, una leucina en la posición 396, y un ácido glutámico en la posición 270 (MgFc38/60); una treonina en la posición 392, una leucina en la posición 396, un ácido glutámico en la posición 270, y una leucina en la posición 243 (MgFc38/60/F243L) ; una histidina en la posición 419, una leucina en la posición 396 y un ácido glutámico en la posición 270 (MGFc51/60) ; una histidina en la posición 419, una leucina en la posición 396, un ácido glutámico en la posición 270, y una leucina en la posición 243 (MGFc51/60/F243L) ; una lisina en la posición 255 y una leucina en la posición 396 (MgFc55) ; una lisina en la posición 255, una leucina en la posición 396, y un ácido glutámico en la posición 270 (MGFc55/60) ; una lisina en la posición 255, una leucina en la posición 396, un ácido glutámico en la posición 270, y una lisina en la posición 300 (MGFc55/60/Y300L) ; una lisina en la posición 255, una leucina en la posición 396, un ácido glutámico en la posición 270, y una leucina en la posición 243 (MgFc55/60/F243L) ; un ácido glutámico en la posición 370, una leucina en la posición 396, y un ácido glutámico en la posición 270 (MGFc59/60) ; un ácido glutámico en la posición 270, un ácido aspártico en la posición 316 y una glicina en la posición 416 (MgFc71) ; una leucina en la posición 243, una prolina en la posición 292, una isoleucina en la posición 305, y una leucina en la posición 396 (MGFc74/P396L) ; una glutamina en la posición 297, o cualquier combinación de las sustituciones individuales . .1.5 Modificaciones de Carbohidratos La invención proporciona también anticuerpos con contenido de oligosacáridos alterados. Los oligosacáridos como se utiliza en la presente se refieren a carbohidratos que contienen dos o más azúcares simples y los dos términos pueden utilizarse intercambiablemente en la presente. Las porciones de carbohidratos de la presente invención se describirán con referencia a la nomenclatura utilizada comúnmente en la técnica. Para una revisión de la química de carbohidratos, véase por ejemplo, Hubbard et al . , 1981 Ann. Rev. Biochem., 50:555-583, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Esta nomenclatura incluye por ejemplo, Man la cual representa mañosa; GlcNAc la cual representa 2-N-acetilglucosamina; Gal la cual representa galactosa; Fue para fucosa y Glc para glucosa. Los ácidos siálicos se describen por la anotación de abreviatura NeuNAc para ácido 5-N-acetilneuramínico, y NeuNGc para 5-glicolneuramínico . En general, los anticuerpos contienen porciones de carbohidratos en posiciones conservadas en la región constante de la cadena pesada, y hasta 30% de IgGs humanas tienen una región Fab glicosilada. IgG tiene una estructura de carbohidrato bi-antenaria N-enlazada sencilla en Asn 297 la cual reside en el dominio CH2 (Jefferis et al . , 1998, Immunol. Rev. 163: 59-76, Wright et al . , 1997, rends Biotech 15: 26-32). La IgG humana tiene normalmente un carbohidrato de la siguiente estructura; GlcNAc (Fucosa) -GlcNAc-Man-(ManGlicNAc) 2. Sin embargo las variaciones entre las IgG en contenido de carbohidratos no ocurre lo cual conduce a la función alterada, véase por ejemplo, Jassal et al . , 2001 Biochem. Biophys. Res. Commun. 288:243-9; Groenink et al . , 1996 J. Immunol. 26: 1404-7; Boyd et al . , 1995 Mol. I munol. 32: 1311-8; Kumpel et ai., 1994, Human Antibody Hybridomas, 5: 143-51. La invención abarca anticuerpos que comprenden una variación en la porción de carbohidratos que se une a Asn 297. En una modalidad, la porción de carbohidratos tiene una galactosa y/o ácido galactosa-siálico en una o ambas de las GlcNAc terminales y/o una tercera rama GlcNac (bisectando GlcNAc) . En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención están sustancialmente libres de uno o más grupos de azúcar seleccionados, por ejemplo, uno o más residuos de ácido siálico, uno o más residuos de galactosa, uno o más residuos de fucosa. Un anticuerpo que está sustancialmente libre de uno o más grupos de azúcar seleccionados pueden prepararse utilizando métodos comunes conocidos por un experto en la técnica, incluyendo por ejemplo, producir recombinantemente un anticuerpo de la invención en una célula huésped que es defectuosa en la adición del o los grupos de azúcar seleccionados a la porción carbohidrato del anticuerpo, de manera que aproximadamente 90-100% del anticuerpo en la composición carece del o los grupos de azúcar seleccionados unidos a la porción de carbohidrato. Métodos alternativos para preparar tales anticuerpos incluyen por ejemplo, cultivar células bajo condiciones las cuales evitan o reducen la adición de uno o más grupos de azúcar seleccionados, o la remoción de post-traducción de uno o más grupos de azúcar seleccionados. En una modalidad específica, la invención abarca un método para producir una preparación de anticuerpo sustancialmente homogénea, en donde aproximadamente 80-100% del anticuerpo en la composición carece de una fucosa en su porción de carbohidrato, por ejemplo, el carbohidrato unido a Asn 297. El anticuerpo puede prepararse por ejemplo por (a) el uso de una célula huésped diseñada que es deficiente en metabolismo de fucosa de manera que tiene una capacidad reducida a proteínas fucosilato expresadas en la presente; (b) cultivar células bajo condiciones las cuales evitan o reducen la fucosilación; (c) remoción de post-traducción de fucosa, por ejemplo, con una enzima fucosidasa; o (d) purificación del anticuerpo de manera que se selecciona para el producto el cual no se fucosila. Más preferiblemente, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo deseado se expresa en una célula huésped que tiene una capacidad reducida a fucosilato el anticuerpo expresado en la presente. De preferencia, la célula huésped es una dihidrofolato reductasa deficiente de la célula de ovario de hámster chino (CHO) , por ejemplo una célula Lee 13 CHO (línea celular mutante de CHO resistente a lectina; Ribka & Stanley, 1986, Somatic Cell & Molec. Gen. 12(1): 51-62; Ripka etal . , 1986 Arch. Biochem. Biophys, 249(2): 533-45); CHO-Kl, DUX-B11, CHO-DP12 o CHO-DG44, la cual se ha modificado de manera que el anticuerpo no se fucosila sustancialmente. De este modo, la célula puede desplegar expresión alterada y/o actividad para la enzima fucosiltransferasa, u otra enzima o sustrato implicado en agregar fucosa al oligosacárido N-enlazado, de manera que la enzima tiene un nivel de actividad disminuida y/o de expresión reducida en la célula. Para los métodos para producir anticuerpos con contenido de fucosa alterada, véase por ejemplo, WO 03/035835 y Shields et al . , 2002, J. Biol.

Chem. 277(30): 26733-40; ambos de los cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. En algunas modalidades, las modificaciones de carbohidrato alteradas modulan uno o más de lo siguiente: solubilización del anticuerpo, facilitación de transporte sub-celular y secreción del anticuerpo, promoción del ensamble del anticuerpo, integridad conformacional, y función efectora mediada por anticuerpos. En una modalidad específica de las modificaciones de carbohidrato alteradas mejoran la función efectora mediada por anticuerpos con relación al anticuerpo que carece de la modificación de carbohidratos. Las modificaciones de carbohidratos que conduce a la función efectora mediada por anticuerpos alterados se conocen bien en la técnica (por ejemplo, véase Shields R.L. et al . , 2001, J. Biol. Chem. 277(30): 26733-40; Davies J. et ai., 2001, Biotechnology & Bioengineering, 74(4): 288-294). En otra modalidad específica, las modificaciones de carbohidratos alteradas mejoran el enlace de anticuerpos de la invención al receptor Fc?RIIB. Alterar las modificaciones de carbohidratos de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, por ejemplo, incrementar el contenido de carbohidratos del anticuerpo o disminuir el contenido de carbohidratos del anticuerpo. Los métodos para alterar los contenidos de carbohidratos se conocen por aquellos expertos en la técnica, véase por ejemplo, Wallick et al . , 1988, .Journal of Exp. Med. 168(3): 1099-1109; Tao et al . , 1989 Journal of Immunology, 143(8): 2595-2601; Routledge et al . , 1995 Transplantation, 60(8): 847-53; Elliot et al . , 2003; Nature Biotechnology, 21: 414-21; Shields et ai., 2002 Journal of Biological Chemistry, 277 (30) : 26733-40; todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la invención abarca anticuerpos que comprenden uno o más sitios de glicosilación, de manera que una o más porciones de carbohidratos se unen covalentemente al anticuerpo. En otras modalidades, la invención abarca anticuerpos que comprenden uno o más sitios de glicosilación y una o más modificaciones en la región Fc, tal como aquellas descritas supra y aquellas conocidas por un experto en la técnica. En las modalidades preferidas, una o más modificaciones en la región Fc mejoran la afinidad del anticuerpo para un Fc?R de activación, por ejemplo, Fc?RIIIA, con relación al anticuerpo que comprende las regiones Fc de tipo silvestre. Los anticuerpos de la invención con uno o más sitios de glicosilación y/o una o más modificaciones en la región Fc tienen una función efectora mediada por anticuerpos mejorados, por ejemplo, actividad ADCC mejorada. En algunas modalidades, la invención comprende además anticuerpos que comprenden una o más modificaciones de aminoácidos que se conocen directa o indirectamente para interactuar con una porción de carbohidratos del anticuerpo, incluyendo pero sin limitarse a aminoácidos en las posiciones 241, 243,244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265,296, 299 y 301. Los aminoácidos que interactúan directa o indirectamente con una porción de carbohidratos de un anticuerpo se conocen en la técnica, véase por ejemplo, Jefferis et al . , 1995 Immunology Letters, 44: 111-7, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. La invención abarca anticuerpos que han sido modificados al introducir uno o más sitios de glicosilación en uno o más sitios de los anticuerpos, de preferencia sin alterar la funcionalidad del anticuerpo, por ejemplo, actividad de enlace a Fc?RIIB. Los sitios de glicosilación pueden introducirse en la región variable y/o constante de los anticuerpos de la invención. Como se utiliza en la presente, "sitios de glicosilación" incluyen cualquier secuencia de aminoácidos específicos en un anticuerpo al cual un oligosacárido (es decir, carbohidratos que contienen dos o más simples azúcares unidos juntos) se unirá específica y covalentemente. Las cadenas laterales de oligosacárido se unen típicamente al esquema de un anticuerpo a través de cualesquiera conexiones N u O. La glicosilación N enlazada se refiere a la unión de una porción de oligosacárido a la cadena lateral de un residuo de asparagina. La glicosilación O enlazada se refiere a la unión de una porción de oligosacárido a un ácido de hidroxiamino, por ejemplo, serina, treonina. Los anticuerpos de la invención pueden comprender uno o más sitios de glicosilación, incluyendo sitios de glicosilación N enlazados y 0 enlazados. Cualquier sitio de glicosilación para glicosilación N enlazada u 0 enlazada conocidos en la técnica pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención. Un sitio de glicosilación N enlazado ejemplar que es útil de acuerdo con los métodos de la presente invención, es la secuencia de aminoácido: Asn-X-Thr/Ser, en donde X puede ser cualquier aminoácido y Thr/Ser indica una treonina o una serina. Tal sitio o sitios pueden introducirse dentro de un anticuerpo de la invención utilizando métodos bien conocidos en la técnica al cual esta invención pertenece. Véase por ejemplo, "Jn vitro Mutagénesis," Recombinant DNA: A Short Course, J.D. Watson, et al . , W. H. Freeman and Company, New York, 1983, capítulo 8, pp. 106-115, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Un método ejemplar para introducir un sitio de glicosilación dentro de un anticuerpo de la invención puede comprender: modificar o mutar una secuencia de aminoácidos del anticuerpo de manera que se obtiene la secuencia Asn-X-Thr/Ser deseada. En algunas modalidades, la invención abarca métodos para modificar el contenido de carbohidratos de un anticuerpo de la invención agregando o eliminando un sitio de glicosilación. Los métodos para modificar el contenido de carbohidratos de anticuerpos son bien conocidos en la técnica y están abarcados dentro de la invención, véase por ejemplo, Patente Norteamericana No. 6,218,149; EP 0 359 096 Bl; Publicación Norteamericana No. US 2002/0028486; WO 03/035835; Publicación Norteamericana No. 2003/0115614; Patente Norteamericana No. 6,218,149; Patente Norteamericana No. 6,472,511; todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. En otras modalidades, la invención abarca métodos para modificar el contenido de carbohidratos de un anticuerpo de la invención eliminando una o más porciones de carbohidrato endógenas del anticuerpo. En algunas modalidades específicas, la invención abarca el uso de anticuerpos Fc?RIIB modificados en donde el sitio consenso N-glicosilación Asn50-Val-Ser de la región CDR2 se ha modificado, de manera que el sitio de glicosilación en la posición 50 se elimina. Aunque no se pretende unirse por un mecanismo particular de acción, la remoción del sitio de glicosilación puede limitar la variación potencial en la producción del anticuerpo así como la inmunogenicidad potencial en una aplicación farmacéutica. En una modalidad específica, la invención abarca el uso de un anticuerpo Fc?RIIB humanizado en donde el aminoácido en la posición 50 ha sido modificado, por ejemplo, eliminado o sustituido. En otra modalidad específica, la invención abarca además el uso de un anticuerpo con una modificación de aminoácido, por ejemplo, eliminación o sustitución, en la posición 51. En una modalidad específica, la invención abarca el uso de un anticuerpo Fc?RIIB humanizado en donde el aminoácido en la posición 50 ha sido reemplazado con tirosina. En otra modalidad más específica, la invención abarca el uso de un anticuerpo Fc?RIIB en donde el aminoácido en la posición 50 ha sido reemplazado con tirosina y el aminoácido en la posición 51 ha sido reemplazado con alanina. .1.6 AGONISTAS Y ANTAGONISTAS Fc?RIIB Además del uso de un anticuerpo específico de Fc?RIIB, un análogo, derivado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo en los métodos y las composiciones de la invención, otros agonistas y antagonistas de Fc?RIIB pueden utilizarse de acuerdo con los métodos de la invención. Los agonistas y antagonistas Fc?RIIB incluyen, pero no se limitan a moléculas proteínicas (por ejemplo, proteínas, polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos Fc?RIIB solubles), péptidos, proteínas de fusión (por ejemplo, polipéptidos Fc?RIIB solubles conjugados a una porción terapéutica) , moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico antisentido Fc?RIIB, hélices triples, ARNds que median ARNi, o moléculas de ácido nucleico que codifican moléculas proteínicas) , moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas pequeñas, fármacos y moléculas inorgánicas pequeñas que bloquean, inhiben reducen o neutralizan una función, una actividad y/o la expresión del polipéptido Fc?RIIB, expresado por una célula inmune, de preferencia una célula B. En algunas modalidades, un agonista o antagonistas Fc?RIIB utilizado de acuerdo con los métodos de la invención no es una molécula orgánica pequeña, un fármaco o una molécula antisentido. Los agonistas y antagonistas Fc?RIIB pueden identificarse utilizando técnicas bien conocidos en el arte o descritas en la presente. Los compuestos profilácticos y terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, moléculas proteínicas, incluyendo, pero sin limitarse a péptidos, polipéptidos, proteínas, incluyendo proteínas modificadas post-traduccionalmente, anticuerpos, etc.; moléculas pequeñas (menos de 1000 daltons) , compuestos inorgánicos u orgánicos; moléculas de ácido nucleico que incluyen, pero no se limitan a ADN de doble hebra o de hebra sencilla, ARN de doble hebra o de hebra sencilla, así como moléculas de ácido nucleico de triple hélice. Los compuestos profilácticos y terapéuticos pueden derivarse desde cualquier organismo conocido (incluyendo, pero sin limitarse a animales, plantas, bacterias, hongos y organismos unicelulares o virus) o desde una biblioteca de moléculas sintéticas . En ciertas modalidades, los agonistas Fc?RIIB reducen una función, actividad y/o expresión de un polipéptido Fc?RIIB en un sujeto con una malignidad de célula B. En otras modalidades, los antagonistas Fc?RIIB se enlazan directamente a un polipéptido Fc?RIIB y directa o indirectamente modulan una actividad y/o función de B-linfocitos. En las modalidades particulares, los antagonistas Fc?RIIB inhiben o reducen la proliferación de célula B en un sujeto con una malignidad de célula B como se determina por ensayos in vivo y/o in vitro estándares descritos en la presente o bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad específica, los antagonistas Fc?RIIB median la reducción de linfocitos, en particular células B sanguíneas periféricas, en un sujeto con una malignidad de células B como se determina por ensayos in vivo y/o in vitro estándares descritos en la presente o bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. En otra modalidad, los antagonistas Fc?RIIB modulan directa o indirectamente una actividad y/o función de linfocitos B utilizando citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) . En una modalidad preferida, las proteínas, polipéptidos o péptidos (incluyendo anticuerpos y proteínas de fusión) que se utilizan como antagonistas Fc?RIIB se derivan a partir de la misma especie como el receptor de las proteínas, polipéptidos o péptidos de manera que se reduce la probabilidad de una respuesta inmune a aquellas proteínas, polipéptidos o péptidos. En otra modalidad preferida, cuando el sujeto es un ser humano, las proteínas, polipéptidos o péptidos que se utilizan como antagonistas Fc?RIIB son humanos o humanizados. Las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas, polipéptidos o péptidos que funcionan como antagonistas Fc?RIIB pueden administrarse a un sujeto con una malignidad de células B, de acuerdo con los métodos de la invención. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican derivados, análogos, fragmentos o variantes de proteínas, polipéptidos o péptidos que funcionan como antagonistas de Fc?RIIB pueden administrarse a un sujeto con malignidad de células B de acuerdo con los métodos de la invención. De preferencia, tales derivados, análogos, variantes y fragmentos retienen la actividad antagonista Fc?RIIB de la proteína, polipéptido o péptido de tipo silvestre de longitud total. .2 CONJUGADOS DE ANTICUERPOS La presente invención abarca anticuerpos recombinantemente combinados o químicamente conjugados (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) a polipéptidos heterólogos (es decir, un polipéptido no relacionado; o una porción del mismo, de preferencia al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, o al menos 100 aminoácidos del polipéptido) para generar proteínas de fusión. La función no necesita necesariamente dirigirse, pero puede ocurrir a través de secuencias enlazadoras. Los anticuerpos pueden utilizarse por ejemplo, para dirigir polipéptidos heterólogos a tipos celulares particulares, ya sea in vitro o in vivo, al combinar o conjugar los anticuerpos a anticuerpos específicos para receptores de superficie celular particular. Los anticuerpos combinados o conjugados a polipéptidos heterólogos pueden también utilizarse en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, la Publicación PCT No. WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al . , 1994, Immunol . Lett., 39:91-99; Patente Norteamericana No. 5,474,981; Gillies et al . , 1992, Proc Nati Acad Sci, 89:1428-1432; y Fell et al . , 1991, J. Immunol., 146:2446-2452, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en sus totalidades. Además, un anticuerpo puede conjugarse a un agente terapéutico o porción de fármaco que modifican una respuesta biológica dada. Los agentes terapéuticos o porciones de fármaco no van a interpretarse como limitados a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, seudomonas exotoxina (es decir, PE-40) o toxina de difteria, ricina, gelonina y proteína antiviral de fitolaca, una proteína tal como un factor de necrosis tumoral, interferones que incluyen, pero no se limitan a a-interferón (IFN-a) , ß-interferón (IFN-ß) , factor de crecimiento nervioso (NGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , activador de plasminógeno de tejido (TPA) , un agente apoptótico (por ejemplo, TNF-a, TNF-ß, AIM I como se describe en la Publicación de PCT No. WO 97/33899), AIM II (véase por ejemplo, Publicación de PCT No. WO 97/34911), Ligando Fas (Takahashi et al . , 1994 J. Immunol . , 6:1567-1574), y VEGI (Publicación PCT No. WO 99/23105), un agente trombótico o un agente anti-angiogénico (por ejemplo, angiostatina o endostatina) , o un modificador de respuesta biológica tal como por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina-1 ("IL-1") , interleucina-2 ("IL-2") , interleucina-6 ("IL-6") , factor que estimula la colonia de macrófagos de granulocitos ("GM-CSF") , y factor que estimula la colonia de granulocitos ("G-CSF") ) , factor que estimula la colonia de macrófagos, "M-CSF") o un factor de crecimiento (por ejemplo hormona de crecimiento ("GH") ; una proteasa, o una ribonucleasa. Los anticuerpos pueden combinarse a secuencias marcadoras, como un péptido, para facilitar la purificación. En las modalidades preferidas, la secuencia de aminoácido marcadora es un péptido hexa-histidina, tal como la etiqueta provista en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) , entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz et al . , 1989 Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86:821-824, por ejemplo, hexa-histidina provista para purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas de péptido útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta hemaglutinina "HA", la cual corresponde a un epítope derivado de la proteína de influenza hemaglutinina (Wilson et ai., 1984 Cell, 37:767) y la etiqueta "flag" (Knappik et al . , 1994 Biotechniques, 17(4) :754-761) . La presente invención incluye además el uso de composiciones que comprenden polipéptido heterólogos combinados o conjugados a fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, los polipéptidos heterólogos pueden combinarse o conjugarse a un fragmento Fab, Fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)2 o porción de los mismos. Los métodos para combinar o conjugar polipéptidos a porciones de anticuerpos se conocen en la técnica. Véase por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851 y 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; Publicaciones Internacionales Nos. WO 96/04338 y WO 91/06570; Ashkenazi et ai., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al . , 1995, J. Immunol . 154:5590-5600; y Vil et al . , 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:11337-11341 (tales referencias incorporadas para referencia en sus totalidades) . Las proteínas de fusión adicionales pueden generarse mediante técnicas de redistribución de gen, redistribución de diseño, redistribución de exón y/o redistribución de codón (referidas colectivamente como "redistribución de ADN") . La redistribución de ADN puede emplearse para alterar las actividades de anticuerpos de la invención o fragmentos de la misma (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de la misma con afinidades más elevadas y velocidades de disociación inferiores) . Véase generalmente, Patentes Norteamericanas Nos. 5,605,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,834,252; y 5,837,458, y Patten et ai., 1997, Curr. Opinión Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76; Hansson, et al . , 1999, j.Mol. Biol. 287:265; y Lorenzo and Blasco, 1998, BioTechniques 24:308 (cada una de estas patentes y publicaciones se incorporan en la presente para referencia en su totalidad) . Los anticuerpos o fragmentos de los mismos, o los anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos, pueden alterarse al someterse a mutagénesis aleatoria por PCR propenso a error, inserción de nucleótido aleatorio u otros métodos anteriores a la recombinación. Una o más porciones de un polinucléotido que codifica un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, cuyas porciones se enlazan específicamente a Fc?RIIB pueden recombinarse con uno o más componentes, diseños, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de una o más moléculas heterólogas . La presente invención abarca también anticuerpos conjugados a un agente de diagnóstico o terapéutico o cualquier otra molécula para la cual la vida promedio del suero se desea incrementarse. Los anticuerpos pueden utilizarse diagnósticamente para, por ejemplo verificar el desarrollo o el progreso de una enfermedad, trastorno o infección como parte de un procedimiento de prueba clínico, para por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse al acoplar el anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, metales que emiten positrón, e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse ya sea directamente al anticuerpo o indirectamente, a través de un intermediario (tal como por ejemplo, un enlazador conocido en la técnica) utilizando técnicas conocidas en el arte. Véase por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,741,900 para iones metálicos los cuales pueden conjugarse a anticuerpos para uso como diagnósticos de acuerdo a la presente invención. Tales diagnósticos y detección pueden lograrse al anticuerpo para sustancias detectables incluyendo, pero sin limitarse a varias enzimas, enzimas incluyendo, pero sin limitarse a, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; complejos del grupo prostético tales como, pero sin limitarse a estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes tales como, pero sin limitarse a umbeliferota, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; material luminiscente tal como, pero sin limitarse a, luminol; materiales bioluminiscentes tales como, pero sin limitarse a luciferasa, luciferina y aequorina; material radioactivo tal como, pero sin limitarse a bismuto (213Bi) , carbono (14C) , cromo (51Cr) , cobalto (57Co), flúor (18F) , gadolinio (153Gd, 159Gd) , galio (68Ga,67Ga), germanio (68Ge) , holmio (166Ho) , indio (115In, 113In, 112ln, llxln), yodo (131I, 125I, 123I, 121I) , lantanio (140La) , lutetio (177Lu) , manganeso (5Mn) , molibdeno (99Mo) , paladio (103Pd) , fósforo (32P) , praseodinio (42Pr) , prometió (149Pm) , renio (186Re, 188Re) , rodio (105Rh) , rutemio (97Ru) , samario (153Rm) , escandio (47Sc) , selenio (75Se) , estroncio (85Sr) , azufre (35S) , tecnetio (99Tc) , talio (201Ti) , estaño (113Sn, 117Sn) , tritio (3H), xenón (133Xe) , iterbio (169Yb, 175Yb) , itrio (90Y) , zinc (65Zn) ; metales que emiten positrón utilizando varias tomografías de emisión de positrón e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. Un anticuerpo puede conjugarse a una porción terapéutica tal como una citotoxina (por ejemplo, un agente citostático o citocidal) un agente terapéutico o un elemento radioactivo (por ejemplo, emisores alfa, emisores gamma, etc.). Las citotoxinas o agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina) , agentes de alquilación (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estretozotocina, mitomicina C, y platina de cisdiclorodiamina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) ) , y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) . Además, un anticuerpo puede conjugarse a porciones terapéuticas tales como materiales radioativos o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos (véase anteriormente para ejemplos de materiales radiactivos) . En ciertas modalidades, el quelante macrocílico es ácido 1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecan-N,N' ,N",N"-tetraacético (DOTA) el cual puede unirse al anticuerpo a través de una molécula enlazadora. Tales moléculas enlazadores se conocen comúnmente en la técnica y se describen en Denardo et al . , 1998, Clin Cáncer Res. 4:2483-90; Peterson et al . , 1999, Bioconjug. Chem. 10:553, y Zimmerman et al . , 1999, Nucí. Med. Biol .26: 943-50 cada una incorporada para referencia en sus totalidades . Las técnicas para conjugar tales porciones terapéuticas a anticuerpos son bien conocidos; véase por ejemplo, Arnon et al . , "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antiboides And Cáncer Therapy, Reisfeld et al . , (eds.9 1985, pp.243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al . , "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a. edición), Robinson et ai., (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy; A Review", en Monoclonal Antiboides ' 84 : Biological And Clinical Applications, Pinchera et al . (eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al . , (eds.), 1985, pp.303- 16, Academic Press; y Thorpe et ai., Immunol. Rev., 62:119- 58, 1982. Un anticuerpo o fragmento del mismo, con o sin una porción terapéutica conjugada a éste, administrado solo o en combinación con el o los factores citotóxicos y/o la o las citoquinas pueden utilizarse como un agente terapéutico. Alternativamente, un anticuerpo puede conjugarse a un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado como se describe por Segal en la Patente Norteamericana No. 4,676,980 la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Los anticuerpos pueden unirse también a soportes sólidos, los cuales son particularmente útiles para inmunoensayos o para purificación del antígeno objetivo.

Tales soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o poilipropileno. .3 PREPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en el arte incluyendo el uso de tecnologías de despliegue de fago recombinantes, de hibridoma, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando técnicas de hibridoma incluyendo aquellas conocidas en el arte y enseñadas por ejemplo, en Harlow et ai., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a. edición, 1988); Hammerling, et al . , en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (ambos de los cuales se incorporan para referencia en sus totalidades) . El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente no se limita a anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva desde un clon sencillo, incluyendo cualquier clon eucariótico, procariótico o de fago, y no el método por el cual se produce. Los métodos para producir y seleccionar anticuerpos específicos utilizando tecnología de hibridoma son de rutina y se conocen bien en la técnica. En un ejemplo no limitante, los ratones pueden inmunizarse con un antígeno de interés o una célula que expresa tal antígeno. Una vez que se detecta una respuesta inmune, por ejemplo, anticuerpos específicos para el antígeno se detectan en el suero de ratón, el bazo de ratón se cosecha y se aislan los esplenocitos. Los esplenocitos se combinan entonces por técnicas bien conocidas a cualesquiera células de mieloma adecuadas. Los hibridomas se seleccionan y clonan por dilución limitante. Los clones de hibridoma se evalúan entonces por métodos conocidos en la técnica para células que secretan anticuerpos capaces de enlazar el antígeno. El fluido de ascitis, el cual contiene generalmente niveles elevados de anticuerpos, pueden generarse inoculando ratones intraperitonealmente con clones de hibridoma positivos. En una modalidad particular, la invención proporciona un método para producir anticuerpos monoclonales que enlazan específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que los anticuerpos monoclonales enlazan Fc?RIIA que comprenden: inmunizar uno o más ratones transgénicos Fc?RIIA (Véase la Patente Norteamericana 5,877,396 y U.S. 5,824,487) con el dominio extracelular purificado de Fc?RIIB humano, los aminoácidos 1-180; que producen líneas celulares de hibridoma a partir de células bazales de tales ratones, seleccionando las líneas celulares de hibridoma para una o más líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos que enlazan específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que los anticuerpos enlazan Fc?RIIA. En otra modalidad específica, la invención proporciona un método para producir anticuerpos Fc?RIIB monoclonal que enlazan específicamente Fc?RIIB, particularmente Fc?RIIB humano, con una mayor afinidad que los anticuerpos monoclonales enlazan Fc?RIIA, el método comprende además: inmunizar uno o más ratones transgénicos Fc?RIIA con Fc?RIIB purificado o un fragmento inmunogénico del mismo, inmunizar con inyección un número suficiente de veces ratones para producir una respuesta inmune, produciendo líneas celulares de hibridoma a partir de células básales de uno o más ratones, seleccionando líneas celulares de hibridoma para una o más líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos que enlazan específicamente Fc?RIIB con una mayor afinidad que los anticuerpos enlazan Fc?RIIA. En una modalidad de la invención, tales ratones se inmunizan con Fc?RIIB purificado el cual se ha mezclado con cualquier adyuvante conocido en la técnica para mejorar la respuesta inmune. Los adyuvantes que pueden utilizarse en los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a adyuvantes de proteínas; adyuvantes bacterianos, por ejemplo, bacterias completas (BCG, Corynebacterium parvum, Salmonella minnesota) y componentes bacterianos que incluyen la estructura de la pared celular, dimicolato trehalosa, lípido A de monofosforilo, residuo extraíble de metanol (MER) de tubercle bacillus, adyuvante de Freund completo o incompleto; adyuvantes virales; adyuvantes químicos, por ejemplo, hidróxido de aluminio, yodoacetato y hemisuccinador de colesterilo; adyuvantes desnudos de ADN. Otros adyuvantes que pueden utilizarse en los métodos de la invención incluyen, toxina de colera, proteínas paropox, MF-59 (Chiron Corporation; Véase también Bieg et al . , 1999, Autoimmunity, 31(1): 15-24, la cual se incorpora en la presente para referencia) , MPL® (Corixa Corporation, Véase también Lodmell D.I. et ai., 2000 VAccine, 18: 1059-1066; Ulrico et al . , 2000, Methods in Molecular Medicine, 273-282; Johnson et ai., 1999, Journal of Medicinal Chemisty, 42: 4640-4649; Baldridge et al . , 1999 Methods, 19: 103-107, todos los cuales se incorporan en la presente para referencia) , adyuvante RC-529 (Corixa Corporation; the lead compound from Corixa' s aminoalkyl glucosaminide 4-phosphate (AGP) chemical library, véase también www.corixa.com), y adyuvante DETOX™ (Corixa Corproation; adyuvante DETOX™ incluye adyuvante MPL® (monofosforil lípido A) y estructura de pared celular micobacteriana; Véase también Eton et ai., 1998, Clin. Cáncer Res, 4 (3): 619-27; Y Gubta R. et ai., 1995, Vaccine, 13 (14) : 1263-76 ambos de los cuales se incorporan en la presente para referencia) . Los fragmentos de anticuerpo los cuales reconocen epítopes específicos pueden generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, Los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden producirse por desdoblamiento proteolítico de moléculas inmunoglobulina, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la cadena ligera completa, y la región variable, la región CHl y al menos una porción de la región de pivoteo de la cadena pesada. Por ejemplo, los anticuerpos pueden generarse utilizando varios métodos de despliegue de fago conocidos en la técnica. En los métodos de despliegue de fago, los dominios de anticuerpos funcionales se despliegan en la superficie de partículas de fago las cuales transportan las secuencias de polinucléotido que las codifica. En una modalidad particular, tal fago puede utilizarse para desplegar dominios de enlace de antígeno, tales como Fab y Fv o Fv estabilizado con enlace de disulfuro, expresado a partir de un repertorio o biblioteca de anticuerpo combinatorial (por ejemplo, de humano o ratón) . El fago que expresa un dominio de enlace de antígeno que enlaza el antígeno de interés puede seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo, utilizando antígeno etiquetado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o una perla. El fago utilizado en estos métodos es normalmente fago filamentoso, incluyendo fd y M13. Los dominios de enlace de antígeno se expresan como una proteína recombinantemente combinada a cualquier proteína de gen III o gen VIII de fago. Los ejemplos de métodos de despliegue de fago que pueden utilizarse para hacer las inmunoglobulinas, o fragmentos de los mismos, de la presente invención incluyendo aquellos descritos en Brinkman et al . , J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995; Ames et al . , J. Immunol . Methods, 184:177-186, 1995; Kettleborough et al . , Eur. J. Immunol. 24:952-958, 1994; Persia et ai., Gene, 187:9-18, 1997; Burton et ai., Advances in Immunology, 57:191-280, 1994; Solicitud de PCT No. PCT/GB91/01134; Publicaciones de PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11235; WO 95/15982; WO 95/20401; y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,70,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108; cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fago, el anticuerpo que codifica regiones a partir del fago pueden aislarse y utilizarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualesquiera otros fragmentos deseados, y expresados en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células de plantas, levaduras y bacterias, por ejemplo, como se describe en detalle posteriormente. Por ejemplo, las técnicas para producir recombinantemente Fab, Fab' y F(ab')2 pueden también emplearse utilizando métodos conocidos en la técnica tales como aquellos descritos en la Publicación de PCT WO 92/22324; Mullinax et ai., BioTechniques, 12 ( 6) : 864-869, 1992; y Sawai et ai., AJRI, 34:26-34, 1995; y Better et ai., Science, 240:1041-1043, 1988 (cada una de las cuales se incorpora para referencia en su totalidad) . Ejemplos de técnicas que pueden utilizarse para producir Fvs de cadena sencilla y anticuerpos incluyen aquellos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et ai., Methods in Enzymology, 203:46-88, 1991; Shu et ai., Proc Nati Acad Sci USA, 90:7995-7999, 1993; y Skerra et ai., Science, 240:1038-1040, 1988. La tecnología de despliegue de fago puede utilizarse para incrementar la afinidad de un anticuerpo de la invención para Fc?RIIB. Esta técnica sería útil para obtener anticuerpos de afinidad elevada que podrían utilizarse en los métodos combinatoriales de la invención. La tecnología, referida como maduración de afinidad, emplea mutagénesis de transición de CDR y la re-selección utilizando Fc?RIIB o un fragmento antigénico del mismo para identificar anticuerpos que se enlazan con afinidad elevada al antígeno cuando se comparan con el anticuerpo inicial o parental (Véase por ejemplo, Glaser et ai., 1992, J. Immunology 149:3903). Mutagenizar los codones completos en lugar de nucleótidos sencillos resulta en un repertorio semi-aleatorizado de mutaciones de aminoácidos. Las bibliotecas pueden construirse consistiendo de un grupo de clones variantes cada uno de los cuales difiere por una alteración de aminoácido sencilla en una CDR sencilla y las cuales contienen variantes que representan cada posible sustitución de aminoácidos para cada residuo de CDR. Los mutantes con afinidad de enlace incrementada para el antígeno pueden seleccionarse al poner en contacto los mutantes inmovilizados con antígeno etiquetado. Cualquier método seleccionado conocido en la técnica puede utilizarse para identificar anticuerpos mutantes con avidez incrementada al antígeno (por ejemplo, ELISA) (véase Wu et ai., 1998, Proc. Nati. Acad Sci. USA 95:6037; Yelton, et ai., 1995, J. Immunology 155:1994). La transición de CDR la cual aleatoriza la cadena ligera es también posible (Véase Schier et ai., 1996, J. Mol. Biol. 263:551) . Los anticuerpos de la invención pueden caracterizarse además por mapeo de epítope, de manera que los anticuerpos pueden seleccionarse de manera que tienen la mayor especificidad para Fc?RIIB comparada a Fc?RIIA. Los métodos de mapeo de epítope de anticuerpos se conocen bien en la técnica y están abarcados dentro de los métodos de la invención. En ciertas modalidades las proteínas de fusión que comprenden una o más regiones de Fc?RIIB pueden utilizarse para mapear el epítope de un anticuerpo de la invención. En una modalidad específica, la proteína de fusión contiene la secuencia de aminoácido de una región de un Fc?RIIB combinada a la porción Fc de la IgG2 humana. Cada proteína de fusión puede comprender además sustituciones y/o reemplazos de aminoácidos de ciertas regiones del receptor con la región correspondiente a partir de un receptor homólogo, por ejemplo, Fc?RIIA, como se muestra en la Tabla 4 posteriormente. pMGXl25 y pMGX132 contiene el sitio de enlace IgG del receptor Fc?RIIB, el formador con el término C de Fc?RIIB y el último con el término C de Fc?RIIA y puede utilizarse para diferenciar el enlace de término C. Los otros tienen sustituciones de Fc?RIIA en el sitio de enlace IgG y ya sea el término N de Fc?lIA o Fc?lIB. Estas moléculas pueden ayudar a determinar la parte de la molécula receptora en donde se enlazan los anticuerpos. Tabla 4. Lista de las proteínas de fusión que pueden utilizarse para investigar el epítope de los anticuerpos anti-Fc?RIIB monoclonales. Los residuos 172 a 180 pertenecen al sitio de enlace IgG de Fc?RIIA y B. Los aminoácidos específicos a partir de la secuencia Fc?RIIA están en negritas-. La secuencia APSS del término C es la SEC DE IDENT. NO: 57 y la secuencia del término C VPSMGSSS es la SEC DE IDENT. NO: 58.

Las proteínas de fusión pueden utilizarse en cualquier ensayo bioquímico para la determinación de enlace a un anticuerpo Fc?RIIB de la invención, por ejemplo, un ELISA. En otras modalidades, la confirmación adicional de la especificidad de epítope puede hacerse utilizando péptidos con residuos específicos reemplazados con aquellos de la secuencia de Fc?RIIA. Los anticuerpos de la invención pueden caracterizarse por enlace específico a Fc?RIIB utilizando cualquier método basado inmunológico o bioquímico conocido en la técnica para caracterizar incluyendo cuantificación, la interacción del anticuerpo a Fc?RIIB. El enlace específico de un anticuerpo de la invención a Fc?RIIB puede determinarse por ejemplo utilizando los métodos con base inmunológica o bioquímica incluyendo, pero sin limitarse a, ensayo de ELISA, ensayos de resonancia . de plasmón superficial, ensayo de inmunoprecipitación, cromatografía de afinidad, y diálisis en equilibrio. Los inmunoensayos los cuales pueden utilizarse para analizar el enlace inmunoespecífico y la reactividad cruzada de los anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a sistemas de ensayo copetitivo y no competitivo utilizando técnicas tales como transferencias western, radioinmunoensayos, ELISA (enzimoinmunoanálisis absorbente) , inmunoensayos "intercalados", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos inmuno-radiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína a, por señalar unos pocos. Tales ensayos son de rutina y se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et ai., eds., 1994, Current Protocols in molecular Biology, Vol. 1 John Wiley & Sons, Inc., New York, la cual se incorpora para referencia en su totalidad) . Los anticuerpos de la invención pueden evaluarse utilizando cualquier resonancia de plásmido de superficie con base en los ensayos conocidos en la técnica para caracterizar los parámetros cinéticos de la interacción del anticuerpo con Fc?RIIB. Cualquier instrumento de SPR comercialmente disponible incluye, pero no se limita a BIAcore Instruments, disponible de Biacore AB (Uppsala, Sweden) ; IAsys instruments disponible de Affinity Sensors (Frankiin, MA. ) ; IBIS system disponible de Windsor Scientific Limited (Berks, UK) , SPR-CELLIA systems disponible de Nipón Láser and Electronics Lab (Hokkaido, Japan) y SPR Detector Spreeta disponible de Texas Instruments (Dallas, TX) puede utilizarse en la presente invención. Para una revisión de tecnología basada en SPR, véase Mollet et ai., 2000, Methods 22: 77-91; Dong et al . , 2002, Revisado en Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash et ai., 1998, Current Opinión in Biotechnology 9: 97-101;Rich et ai., 2000, Current Opinión in Biotechnology 11: 54-61; todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. Además, cualquiera de los instrumentos de SPR y métodos basados en SPR para medir interacciones de proteína descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,373,577; 6,289,286; 5,322,798; 5,341,215; 6,268,125 se contemplan en los métodos de la invención, todos los cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. Brevemente, ensayos basados en SPR implican inmovilizar un miembro de un par de enlace en una superficie, y verificar su interacción con el otro miembro del par de unión en solución en tiempo real. SPR se basa en medir el cambio en el índice refractivo del solvente cerca de la superficie que ocurre en la formación compleja o disociación. La superficie sobre la cual la inmovilización ocurre es el chip sensor, el cual está en el corazón de la tecnología de SPR; éste consiste de una superficie vitrea recubierta con una capa delgada de oro y forma la base para un rango de superficies especializadas diseñadas para optimizar el enlace de una ^molécula a la superficie. Una variedad de chips sensores están comercialmente disponibles desde la lista de compañías supra, todas las cuales pueden utilizarse en los métodos de la invención. Ejemplos de chips sensibles incluyen aquellos disponibles de BIAcore AB, Inc., por ejemplo, Sensor Chip CM5, SA, NTA y HPA. Un molécula de la invención puede inmovilizarse sobre la superficie de un chip sensor utilizando cualquiera de los métodos de inmovilización y las químicas conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a acoplamiento covalente directo a través de grupos amina, acoplamiento covalente directo a través de grupos sulfihidrilo, unión de biotina a superficie recubierta de avidita, acoplamiento de aldehido a grupos carbohidrato, y unión a través de etiqueta de histidina con chips de NTA. La invención abarca la caracterización de anticuerpos producidos por los métodos de la invención utilizando ciertos ensayos de caracterización para identificar la función de los anticuerpos de la invención, particularmente la actividad para modular señalización de Fc?RIIB. Por ejemplo, los ensayos de caracterización de la invención pueden medir fosforilación de residuos tirosina en el diseño de ITIM de Fc?RIIB, o mide la inhibición de la movilización de calcio generada por el receptor de célula B. Los ensayos de caracterización de la invención pueden ser ensayos basados en células o libres de células. Se ha establecido también en la técnica en la coagregación de mastocitos de Fc?RIIB con el receptor de IgE de alta afinidad, FceRI, conduce a inhibición de desgranulación inducida por antígenos, movilización de calcio y producción de citoquina (Metcalfe D.D. et ai. 1997, Physiol. Rev. 77:1033; Long E.O. 1999 Annu Rev. Immunol 17:875). Los detalles moleculares de esta trayectoria de señalización se han producido recientemente (Ott V. L., 2002, J. Immunol. 162 (9) : 4430-9) . Una vez co-agregados con FceRI, Fc?RIIB se fosforila rápidamente en tirosina en su diseño ITIM, y luego recluta inositol-5-fosfatasa que contiene Src de homología 2 (SHIP) , una inosital polifosfato 5-fosfatasa que contiene el dominio SH2, el cual a su vez fosforila y se asocia con Shc y p62dok (p62dok es el prototipo de una familia de moléculas adaptadoras, las cuales incluyen dominios de señal tales como un dominio de homología de pleckstrina de amino terminal (dominio PH) , un dominio PTB y una región terminal carboxi que contiene diseños PXXP y numerosos sitios de fosforilación (Carpino et ai., 1997 Cell, 88:197; Yamanshi et ai., 1997, Cell, 88:205) . La invención abarca caracterizar los anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención al modular una o más respuestas mediadas por IgE. De preferencia, las líneas celulares co-expresar el receptor de afinidad elevada para IgE y el receptor de baja afinidad para Fc?RIIB se utilizará para caracterizar los anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención para modular respuestas mediadas por IgE. En una modalidad específica, las células a partir de la línea celular de leucemia basofílica de rata (RBL-H23; Barsumian E.L. et ai., 1981 Eur. J. Immunol. 11:317, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad) transfectada con Fc?RIIB humano de longitud total se utilizará en los métodos de la invención. RBL-2H3 es una línea celular de rata bien caracterizada que se ha utilizado extensamente para estudiar los mecanismos de señalización seguidos por la activación de células mediada por IgE. Cuando se expresa en células RBL-2H3 y se co-agregada con FceRI, Fc?RIIB inhibe la movilización de calcio inducida por FceRI, la desgranulación y la producción de citoquina (Malbec et ai., 1998, J. Immunol. 160:1647, Daeron et ai., 1995 J. Clin. Invest. 95:577; Ott et ai., 2002 J. of Immunol. 168:4430-4439). En algunas modalidades, la invención abarca caracterizar los anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención para la inhibición de activación de mastocitos inducidos por FceRI. Por ejemplo, las células de una línea celular de leucemia basofílica de ratas (RBL-H23; Barsumian E.L., et ai. 1981 Eur. J. Immunol . 11:317) que se ha transfectado con Fc?RIIB se sensibiliza con IgE y estimula ya sea con fragmentos F(ab')2 de IgG anti-ratón de conejo, para agregar FceRI solo, o con una IgG anti-ratón de conejo completa para co-agregar Fc?RIIB y FeRI . En este sistema, la modulación indirecta de las moléculas de señalización corriente abajo pueden evaluarse en la adición de anticuerpos de la invención a las células sensibilizadas y estimuladas. Por ejemplo, la fosforilación de tirosina de Fc?RIIB y el reclutamiento y fosforilación de SHIP, la activación de los miembros de la familia de la MAP quinasa, incluyendo pero sin limitarse a Erkl, Erk2, JNK o p38; y la fosforilación de tirosina p62dok y su asociación con SHIP y RasGAP puede evaluarse. Un ensayo ejemplar para determinar la inhibición de activación de mastocitos inducidos por FceRI por los anticuerpos de la invención puede comprender lo siguiente: transfectar células RBL-H23 con Fc?RIIB humano; sensibilizar las células RBL-H23 con IgE; estimular células RBL-H23 con ya sea F(ab')2 de IgG anti-ratón de conejo (para agregar FceRI solo y producir señalización mediada por FceRI como un control) o estimular células RBL-H23 con IgG anti-ratón de conejo completa (para co-agregar Fc?RIIB y FceRI, resultando en inhibición de señalización mediada por. FceRI) . Las células que se han estimulado con anticuerpos IgG anti-ratón de conejo completos pueden pre-incubarse además con los anticuerpos de la invención. Al medir la activación dependiente de FceRI de las células que se han pre-incubado con los anticuerpos de la invención y las células que no se han pre-incubado con los anticuerpos de la invención, y comparar niveles de actividad dependiente de FceRI en estas células, se indicaría una modulación de la actividad dependiente de FceRI por los anticuerpos de la invención. El ensayo ejemplar descrito anteriormente puede por ejemplo, utilizarse para identificar anticuerpos que bloquean el enlace de ligandos (IgG) al receptor Fc?RIIB y antagonizan inhibición mediada por Fc?RIIB de la señalización de FceRI al prevenir la co-agregación de Fc?RIIB y FceRI . Este ensayo de igual modo identifica anticuerpos que mejora la co-agregación de Fc?RIIB y FceRI y agonizar inhibición mediada de Fc?RIIB de señalización de FceRI al promover la co-agregación de Fc?RIIB y FceRI. En una modalidad preferida, la actividad dependiente de FceRI es al menos uno o más de lo siguiente: modulación de moléculas de señalización corriente abajo (por ejemplo, modulación del estado de fosforilación de Fc?RIIB, modulación del reclutamiento de SHIP, modulación de la actividad de la MAK quinasa, modulación del estado de fosforilación de SHIP, modulación de SHIP y asociación SHIP de Shc, y Shc, modulación del estado de fosforilación de p62dok, modulación de p62dok y asociación de SHIP, modulación de p62do y asociación de RasGAP, modulación de movilización de calcio, modulación de desgranulación y modulación de producción de citoquina. En aún otra modalidad preferida, la actividad dependiente de FceRI es la liberación de serotonina y/o influjo de Ca++ extracelular y/o la activación de mastocitos dependientes de IgE. Se conoce por alguien con experiencia en la técnica que la co-agregación de Fc?RIIB y FceRI estimula la fosforilación de tirosina de Fc?RIIB, estimula el reclutamiento de SHIP, estimula la fosforilación de tirosina SHIP y la asociación con Shc, e inhibe la activación de los miembros de la familia de MAP quinasa incluyendo, pero sin limitarse a Erkl, Erk2, JNK, p38. Se conoce también por aquellos expertos en la técnica que la coagregación de Fc?RIIB y FceRI estimula la fosforilación de tirosina mejorada de p62dok y su asociación con SHIP y RasGAP. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención se caracterizan por su capacidad para modular la respuesta mediada por IgE al verificar y/o medir la desgranulación de mastocitos o basófilos, de preferencia en un ensayo basado en células. De preferencia, los mastocitos o basófilos para uso en tales ensayos han sido diseñadas para contener Fc?RIIB humano utilizando métodos recombinantes estándares conocidos por alguien con experiencia en la técnica. En una modalidad específica los anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención se caracterizan por su capacidad para modular una respuesta mediada por IgE en un ensayo de liberación de ß-hexosaminidasa basada en células (enzima contenida en los granulos) . La liberación de ß-hexosaminidasa a partir de mastocitos y basófilos es un evento principal en una condición alérgica e inflamatoria aguda (Aketani et ai., 2001 Immunol. Lett. 75:185-9; Aketani et al., 2000 Anal. Chem. 72:2653-8). La liberación de otros mediadores inflamatorios incluyendo, pero sin limitarse a serotonina e histamina pueden evaluarse para medir una respuesta mediada por IgE de acuerdo con los métodos de la invención. Aunque no se pretende estar unido por un mecanismo particular de acción, la liberación de granulos tales como aquellos que contiene ß-hexosaminidasa a partir de mastocitos y basófilos es un proceso dependiente de concentración de calcio intracelular que se inicia por la reticulación de los Fc?RI con antígeno multivalente. Un ensayo ejemplar para caracterizar los anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención para mediar una respuesta mediada por IgE es un ensayo de liberación de ß-hexosaminidasa que comprende lo siguiente: transfectar células RBL-H23 con Fc?RIIB humano; sensibilizar las células con IgE de ratón sola o con IgE de ratón y un anticuerpo anti-Fc?RIIB de la invención; estimular las células con varias concentraciones de F(ab)2 anti-ratón de cabra, de preferencia en un rango de 0.03 µg/ml a 30 µg/ml durante aproximadamente 1 hora, recolectar el sobrenadante; desintegrar por medio de lisina las células; y medir la actividad de la ß-hexosaminidasa liberada en el sobrenadante por un ensayo colorimétrico, por ejemplo, utilizando p-nitrofenil N-acetil-ß-D-glucosaminida. La actividad de ß-hexosaminidasa liberada se expresa como un porcentaje de la actividad liberada a la actividad total. La actividad de ß-hexosaminidasa liberada se medirá y comparará en las células tratadas con antígeno solo; IgE sola; IgE y un anticuerpo anti-Fc?RIIB de la invención. Aunque no se pretende unirse por un mecanismo particular de acción, una vez que las células se sensibilizan con IgE de ratón sola y se emplazan con fragmentos F(ab)2 de una IgG de anti-ratón de cabra policlonal, la agregación y la reticulación de Fc?RI ocurre ya que el anticuerpo policlonal reconoce la cadena ligera de la IgE de murino enlazada a la Fc?RI; la cual a su vez conduce a la activación de mastocitos y la desgranulación. Por otro lado, cuando las células se sensibilizan con IgE de ratón y un anticuerpo anti-Fc?RIIB de la invención y se emplaza con fragmentos F(ab)2 de una IgG anti-ratón de cabra policlonal; reticular de Fc?RI y Fc?RIIB ocurre, resultando en inhibición de desgranulación inducida por Fc?RI . En cualquier caso, F(ab)2 anti-ratón de cabra, induce una liberación de ß-hexoaminidasa dependiente de dosis. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-Fc?RIIB enlazados al receptor Fc?RIIB y reticulado a Fc?RI no afecta la activación de la trayectoria inhibidora, es decir, no existe alteración en el nivel de desgranulación en la presencia de un anticuerpo anti-Fc?RIIB. En otras modalidades, los anticuerpos anti-Fc?RIIB median una activación más fuerte del receptor inhibidor, Fc?RIIB, cuando se enlaza al anticuerpo anti-Fc?RIIB, permitiendo la reticulación efectiva a Fc?RI y la activación de la trayectoria inhibidora de Fc?RIIB homo-agregado. La invención abarca también caracterizar el efecto de anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención en la respuesta celular mediada por IgE utilizando ensayos de movilización de calcio utilizando metodologías conocidas por alguien con experiencia en la técnica. Un ensayo de movilización de calcio ejemplar puede comprender lo siguiente: cebar basófilos o mastocitos con IgE; incubar las células con un indicador de calcio, por ejemplo, Fura 2; estimular células como se describe supra; y monitorea y/o cuantificar la concentración de calcio intracelular por ejemplo utilizando citometría de flujo. La invención abarca monitorear y/o cuantificar la concentración de calcio intracelular por cualquier método conocido por un experto en la técnica, véase por ejemplo, Immunology Letters, 2001, 75 : 185-9;British J. of Pharm, 2002, 136:837-45; J. of Immunology, 168:4430-9 y J. of Cell Biol., 153 (2) : 339-49; todos los cuales se incorporan en la presente para referencia. En las modalidades preferidas, los anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención inhiben activación de células mediadas por IgE. En otras modalidades, los anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención bloquean las trayectorias inhibidoras reguladas por Fc?RIIB o bloquean el sitio de enlace de ligando en Fc?Rllb y mejora así la respuesta inmune. La capacidad para estudiar mastocitos humanas se ha limitado por la ausencia de cultivos de mastocitos humanas a largo plazo adecuadas. Recientemente, dos líneas de mastocitos humanas dependientes del factor de células germinales novedosas, denominadas LAD1 y LAD2, se establecieron a partir de los fluidos extraídos de la médula espilan a partir de un paciente con un sarcoma/leucemia de mastocitos (Kirshenbaum et ai., 2003, Leucemia research, 27:677-82, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad) . Ambas líneas celulares se han descrito para expresar FceRI y varios marcadores de mastocitos humanos. La invención abarca utilizar células LAD 1 y 2 en los métodos de la invención para evaluar el efecto de los anticuerpos de la invención en respuestas mediadas por IgE. En una modalidad específica, los ensayos de liberación de ß-hexosaminidasa basados en células tales como aquellos descritos supra pueden utilizarse en células LAD para determinar cualquier odulación de la respuesta mediada por IgE por los anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención. En un ensayo ejemplar, los mastocitos humanos, por ejemplo LAD 1, se ceban con anti-nitrofenol de IgE humana quimérica (NP) y se emplazó con BSA-NP, el antígeno polivalente, y la desgranulación celular se monitorea al medir la ß-hexosaminidasa liberada en el sobrenadante (Kirshenbaum et ai., 2003, Leucemia research, 27:677-682, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad) . En algunas modalidades, si los mastocitos humanos tienen una expresión baja de Fc?RIIB endógena, como se determina utilizando métodos estándares conocidos en la técnica, por ejemplo, tinciones de FACS, puede ser difícil monitorear y/o detectar las diferencias en la activación de la trayectoria inhibidora mediada por los anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención. La invención abarca así métodos alternativos, por lo que la expresión de Fc?RIIB puede sobre-regularse utilizando citoquinas y condiciones de crecimiento particulares. Fc?RIIB se ha descrito para sobre-regularse altamente en líneas de células de monocitos humanos, por ejemplo, THPl y U937, (Tridandapani et ai., 2002, J. Biol. Chem., 277 (7) : 5082-5089) y en monocitos humanos primarios (Pricop et al . , 2001, J. of Inmuno1., 166:531-537) por IL4. La diferenciación de células U937 con AMP cíclico de dibutirilo se ha descrito para incrementar la expresión de Fc?RII (Cameron et ai., 2002 Immunology Letters 83, 171-179). De este modo, la expresión de Fc?RIIB endógeno en mastocitos humanos para uso en los métodos de la invención pueden sobre-regularse utilizando citoquinas, por ejemplo, IL-4, IL-13, con el fin de mejorar la sensibilidad de detección. La invención abarca también caracterizar los anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención para inhibición de señalización mediada por receptor de células B (BCR) . La señalización mediada por BCR puede incluir al menos una o más respuestas biológicas corriente abajo, tales como activación y proliferación de células B, producción de anticuerpos, etc. La co-agregación de Fc?RIIB y BCR conduce a la inhibición del progreso del ciclo celular y la supervivencia celular. Además, la co-agregación de Fc?RIIB y BCR conduce a la inhibición de señalización mediada por BCR. Específicamente, la señalización mediada por BCR comprende al menos uno o más de lo siguiente: modulación de moléculas de señalización corriente abajo (por ejemplo, estado de fosforilación de Fc?RIIB, reclutamiento de SHIP, localización de Btk y/o PLC?, actividad de MAP quinasa, reclutamiento de Akt (señal anti-apoptótica) , movilización de calcio, progreso de ciclo celular y proliferación celular. Aunque numerosas funciones efectoras de inhibición mediada por Fc?RIIB de señalización de BCR se median a través de SHIP, recientemente, se ha demostrado que las células B activadas por lipopolisacáridos (LPS) , a partir de ratones deficientes de SHIP exhiben inhibición mediada por Fc?RIIB significativa de movilización de calcio, producción de Ins (1,4,5)P3, y fosforilación de Erk y Akt (Brauweiler A. et ai., 2001, Journal of Immunology, 167 (1) : 204-211) . Por consiguiente, células B ex vivo a partir de ratones deficientes de SHIP pueden utilizarse para caracterizar los anticuerpos de la invención. Un ensayo ejemplar para determinar la inhibición mediada por Fc?RIIB de señalización de BCR por los anticuerpos de la invención puede comprender lo siguiente: aislar células B esplénicas a partir de ratones deficientes de SHIP, activar las células con lipopolisacárido, y estimular células con anti-IgM F(ab')2 para agregar BCR o con anti-IgM para co-agregar BCR con Fc?RIIB. Las células que han sido estimuladas con anti-IgM intacta para co-agregar BCR con Fc?Rllb puede pre-incubarse además con los anticuerpos de la invención. La actividad dependiente de Fc?RIIB de células puede medirse por técnicas estándar conocidas en el arte. Comparar el nivel de actividad dependiente de Fc?RIIB en células que se han pre-incubado con los anticuerpos de la invención y las células que no se han pre-incubado, y comparando los niveles indicaría una modulación de actividad dependiente de Fc?RIIB por los anticuerpos de la invención. Medir la actividad dependiente de Fc?RIIB puede incluir, por ejemplo, medir movilización de calcio intracelular por citometría de flujo, medir la fosforilación de Akt y/o Erk, midiendo la acumulación mediada por BCR de PI(3,4,5)P3 o midiendo células B de proliferación mediada por Fc?RIIB. Los ensayos pueden utilizarse por ejemplo, para identificar anticuerpos que modulan inhibición mediada por Fc?RIIB de señalización BCR al bloquear el sitio de enlace de ligando (IgG) al receptor Fc?RIIB y antagonizar inhibición mediada por Fc?RIIB de señalización de BCR al prevenir coagregación de Fc?RIIB y BCR. Los ensayos pueden utilizarse para identificar anticuerpos que mejoran la co-agregación de Fc?RIIB y BCR y agonizan la inhibición mediada por Fc?RIIB de señalización de BCR. La invención se relaciona para caracterizar los anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención para señalización mediada por Fc?RII en monocitos/macrófagos humanos. La coagregación de Fc?RIIB con un receptor que soporta el diseño de activación basada en tirosina inmunoreceptora (ITAM) actúa para desregular fagocitosis mediada por Fc?R utilizando SHIP como su efector (Tridandapani et ai., 2002, J. Biol. Chem. 277 (7) :5082-9) . La co-agregación de Fc?RIIA con Fc?RIIB resulta en fosforilación rápida del residuo de tirosina en el diseño de ITIM de Fc?RIIB, conduciendo a un mejoramiento en la fosforilación de SHIP, la asociación de SHIP con Shc, y fosforilación de proteínas que tiene el peso molecular de 120 y 60-65 kDa. Además, la co-agregación de Fc?RIIA con Fc?RIIB resulta en la desregulación de fosforilación de Akt, la cual es una serina-treonina quinasa que está implicada en la regulación celular y sirve para suprimir la apoptosis. La invención abarca además caracterizar los anticuerpos anti-Fc?RIIB de la invención para su inhibición de fagocitosis mediada por Fc?R en monocitos/macrófagos humanos. Por ejemplo, las células a partir de una línea de célula monolítica humana, THP-1 puede estimularse ya sea con fragmentos Fab de anticuerpo IV.3 monoclonal de ratón contra Fc?RII y anticuerpo anti-ratón de cabra (para agregar Fc?RIIA solo) o con anticuerpo monoclonal de ratón IV.3 completo y anticuerpo anti-ratón de cabra (para co-agregar Fc?RIIA y Fc?RIIB) . En este sistema, la modulación de las moléculas de señalización corriente abajo, tal como fosforilación de tirosina de Fc?RIIB, fosforilación de SHIP, asociación de SHIP con Shc, fosforilación de Akt y fosforilación de proteínas que tienen el peso molecular de 120 y 60-65 kDa puede evaluarse en la adición de anticuerpos de la invención a las células estimuladas. Además, eficiencia fagocítica dependiente de Fc?RIIB de la línea celular monocita pueden medirse directamente en la presencia y la ausencia de los anticuerpos de la invención. Otro ensayo ejemplar para determinar la inhibición de fagocitosis mediada por Fc?R en monocitos/macrófagos humanos por los anticuerpos de la invención puede comprender lo siguiente: estimular células THP-1 con Fab de anticuerpo anti-Fc?RII de ratón IV.3 y anticuerpo anti-ratón de cabra (para agregar Fc?RIIA solo y producir señalización mediada por Fc?RIIA) ; o con anticuerpo anti-Fc?RII de ratón y anticuerpo anti-ratón de cabra (para co-agregar Fc?RIIA y Fc?RIIB e inhibir señalización mediada por Fc?RIIA. Las células que se han estimulado con anticuerpo Fc?RII de ratón y anticuerpo anti-ratón de cabra pueden pre-incubarse además con los anticuerpos de la invención. Medir la actividad dependiente de Fc?RIIa de células estimuladas que han sido pre-incubadas con anticuerpos de la invención y las células que no se han pre-incubado con los anticuerpos de la invención y comparar los niveles de la actividad dependiente de Fc?RIIA en estas células indicaría una modulación de actividad dependiente de Fc?RIIA por los anticuerpos de la invención. El ensayo ejemplar descrito puede utilizarse por ejemplo, para identificar anticuerpos que bloquean el enlace de ligando del receptor Fc?RIIB y antagonizan la inhibición mediada por Fc?RIIB de señalización de Fc?RIIA al prevenir la co-agregación de Fc?RIIB y Fc?RIIA. Este ensayo así mismo identifica anticuerpos que mejoran la co-agregación de Fc?RIIB y Fc?RIIA y agonizan la inhibición mediada por Fc?RIIB de la señalización de Fc?RIIA. En otra modalidad de la invención, la invención se relaciona para caracterizar la función de los anticuerpos de la invención midiendo la capacidad de células THP-1 para fagocitar células de glóbulos rojos de oveja (SRBC) opsonizados con IgG de fluoresceína por métodos previamente descritos (Tridandapani et al . , 2000, J. Biol. Chem. 275:20480-7). Por ejemplo, un ensayo ejemplar para medir fagocitosis comprende: tratar células THP-1 con los anticuerpos de la invención o con un anticuerpo control que no se enlaza a Fc?RII, comparando los niveles de actividad de las células, en donde una diferencia en las actividades de las células (por ejemplo, actividad de re-ajuste (el número de células THP-1 que enlazan SRBC recubiertos con IgG) , actividad de adherencia (el número total de SRBC enlazados a células THP-1) e índice fagocítico) indicaría una modulación de actividad dependiente de Fc?RIIA por los anticuerpos de la invención. Este ensayo puede utilizarse para identificar, por ejemplo, anticuerpos que bloquean el enlace de ligando del receptor Fc?RIIB y antagonizan la inhibición mediada por Fc?RIIB de fagocitosis. Este ensayo puede identificar también anticuerpos que mejoran la inhibición mediada por Fc?RIIB de señalización de Fc?RIIA. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención modulan la actividad dependiente de Fc?RIIB en monocitos/macrófagos humanos en al menos uno o más de los siguientes modos: modulación de moléculas de señalización corriente abajo (por ejemplo, modulación de estado de fosforilación de Fc?RIIB, modulación de fosforilación de SHIP, modulación de SHIP y asociación de Shc, modulación de fosforilación de Akt, modulación de fosforilación de proteínas adicionales alrededor de 120 y 60-65 kDa) y modulación de fagocitosis. La invención abarca la caracterización de los anticuerpos de la invención utilizando ensayos conocidos por aquellos expertos en la técnica para identificar el efecto de los anticuerpos en la función celular efectora de anticuerpos terapéuticos, por ejemplo, su capacidad para mejorar actividad de ADCC específica de tumor de anticuerpos terapéuticos. Los anticuerpos terapéuticos que pueden utilizarse de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a anticuerpos anti-tumor, anticuerpos anti-viral, anticuerpos anti-microbianos (por ejemplo, bacterias y parásitos unicelulares), ejemplos de los cuales se describen en la presente (Sección 5.4.6). En particular, la invención abarca caracterizar los anticuerpos de la invención para su efecto en la función celular efectora mediada por Fc?R de anticuerpos terapéuticos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales específicos de tumor. Ejemplos de funciones de células efectoras que pueden evaluarse de acuerdo con la invención, incluyen, pero no se limitan a citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, fagocitosis, opsonización, opsonofagocitosis, enlace de Clq y citotoxicidad mediada por célula dependiente de complemento.

Cualquier ensayo basado en células o libre de células conocido por aquellos expertos en la técnica para determinar la actividad de función celular efectora puede utilizarse (Para ensayos de célula efectora, véase Perussia et ai., 2000, Methods Mol. Biol. 121:179.92; Baggiolini et ai., 1998 Experientia 44(10): 841-8, Lehmann et ai., 2000 J. Immunol. Methods, 243(1-2): 229-42; Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol. 45: 147-64; Munn et ai., 1990 J. Exp. Med. 172: 231-237, Abdul-Majid et ai., 2002 Scand. J. Immunol . 55: 70-81; Ding et al . , 1998, Immunity 8:403-411, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad) . Los anticuerpos de la invención pueden evaluarse para su efecto en actividad de ADCC mediada por Fc?R de anticuerpos terapéuticos en células efectoras, por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales, utilizando cualquiera de los métodos estándares conocidos por aquellos expertos en la técnica (Véase por ejemplo, Perussia et al . , 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92) . "Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo" y "ADCC" como se utiliza en la presente portan su significado ordinario y usual en la técnica y se refiere a una reacción mediada por células in vitro en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan Fc?Rs (por ejemplo, células monocíticas tales como linfocitos citolíticos naturales (NK) y macrófagos) reconocen el anticuerpo enlazado en una célula objetivo y subsecuentemente provocan lisis de la célula objetivo. En principio, cualquier célula efectora con un Fc?R de activación puede accionarse para mediar ADCC. Las células principales para mediar ADCC son linfocitos NK los cuales expresan sólo Fc?RIII, mientras que los monocitos, dependiendo de su estado de activación, localización o diferenciación, pueden expresar Fc?RI, Fc?RII y Fc?RIII. Para una revisión de expresión Fc?R en células hematopoyéticas, véase por ejemplo, Ravetch et ai., 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Las células efectoras son leucocitos los cuales expresan uno o más Fc?Rs y realizan las funciones efectoras. De preferencia, las células expresan al menos Fc?RIII y realizan función efectora de ADCC. Las células efectoras pueden utilizarse en los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a células mononucleares de sangre periférica (PBMC), linfocitos citolíticos naturales (NK) , monocitos y neutrófilos; con las PBMC y se prefieren linfocitos NK. Las células efectoras pueden aislarse a partir de una fuente nativa de las mismas, a partir de sangre o las PBMC como se describe en la presente. De preferencia, las células efectoras utilizadas en los ensayos de ADCC de la invención son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que se purifican de preferencia a partir de la sangre humana normal, utilizando métodos estándares conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, utilizando centrifugación de gradiente de densidad de Ficoll-Paque. Por ejemplo, las PBMC pueden aislarse al estratificar la sangre completa sobre Ficoll-Hypaque y hacer girar las células a 500 g a temperatura ambiente durante 30 minutos. La capa de leucocito puede cosecharse como células efectoras. Otras células efectoras que pueden utilizarse en los ensayos de ADCC de la invención incluyen pero no se limitan a macrófagos derivados de monocitos (los MDM) . Los MDM que se utilizan como células efectoras en los métodos de la invención, se obtienen de preferencia como sustancias congeladas o utilizadas frescas (por ejemplo, de Advanced Biotechnologies, MD) . En las modalidades más preferidas, los monocitos humanos destilados se utilizan como células efectoras en los métodos de la invención. Los monocitos humanos destilados expresan receptores de activación, Fc?RIIIA y Fc?RIIA y el receptor inhibidor, Fc?RIIB. Los monocitos humanos están comercialmente disponibles y pueden obtenerse como sustancias congeladas, descongeladas en un medio basal que contiene 10% de suero AB humano o en un medio basal con suero humano que contiene citoquinas. Los niveles de expresión de Fc?Rs en las células pueden determinarse directamente; por ejemplo, utilizando análisis FACS. Alternativamente, las células pueden permitirse madurar también a macrófagos en cultivo. El nivel de expresión de Fc?RIIB puede incrementarse en macrófagos. Los anticuerpos que pueden utilizarse para determinar el nivel de expresión de Fc?Rs incluyen, pero no se limitan a anticuerpos Fc?RIIA anti-humano , por ejemplo, IV.3-FITC; anticuerpos anti-Fc?RI, por ejemplo, 32.2 FITC; y anticuerpos anti-Fc?RIIIA, por ejemplo 3G8-PE. Las células objetivo utilizadas en los ensayos ADCC de la invención incluyen, pero no se limitan a líneas celulares de cáncer de mama, por ejemplo, SK-BR-3 con número de acceso ATCC HTB-30 (véase por ejemplo, Tremp et ai., 1976, Cáncer Res. 33-41); linfocitos B; células derivadas a partir de linfoma Burkitts, por ejemplo, células Raji con número de acceso ATCC CCL-86 (véase por ejemplo, Epstein et ai., 1965, J. Nati. Cáncer Inst . 34: 231-240); células Daudi con número de acceso ATCC CCL-213 (véase por ejemplo, Klein et al . , 1968, Cáncer Res. 28: 1300-10); líneas celulares de carcinoma de ovario, por ejemplo, OVCAR-3 con número de acceso ATCC HTB-161 (véase por ejemplo, Hamilton, Young et ai., 1983); SK-OV-3, PA-1, CAOV3, OV-90 e IGROV-1 (disponible de NCI repository Benard et ai., 1985, Cáncer Research, 45:4970-9; la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Las células objetivo deben reconocerse por el sitio de enlace de antígeno del anticuerpo que se evalúa. Las células objetivo para uso en los métodos de la invención pueden tener nivel de expresión baja, media o elevada de un antígeno cancerígeno. Los niveles de expresión del antígeno cancerígeno pueden determinarse utilizando métodos comunes conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, análisis FACS. Por ejemplo, la invención abarca el uso de células cancerígenas de ovario tales como IGROV-1, en donde Her2/neu se expresa en diferentes niveles, u OV-CAR-3 (número de acceso ATCC HTB-161; caracterizado por una expresión inferior de Her2/neu que SK-BR-3, la línea celular de carcinoma de mama) . Otras líneas celulares de carcinoma de ovario que pueden utilizarse como células objetivo en los métodos de la invención incluyen OVCAR-8 (Hamilton et ai., 1983, Cáncer Res. 43:5379-89, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad) ; SK-OV-3 (Número de acceso ATCC HTB-77); Caov-3 (Número de Acceso ATCC HTB-75) ; PA-1 (Número de Acceso ATCC CRL-1572) ; OV-90 (Número de acceso ATCC CRL-11732); y OVCAR-4. Otras líneas de células de cáncer de mama que pueden utilizarse en los métodos de la invención incluyen BT-549 (Número de Acceso ATCC HTB-122) , MCF7 (Número de Acceso ATCC HTB-22), y Hs578T (Número de Acceso ATCC HTB-126) , todas de las cuales están disponibles del depositario NCI y ATCC y se incorporan en la presente para referencia.

Otras líneas celulares que pueden utilizarse en los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a CCRF-CEM (leucemia) ; HL-60 (TB, leucemia) ; MOLT-4 (leucemia) ; RPMI-8226 (leucemia) ; SR (leucemia) ; A549 (célula no pequeña de pulmón) ; EKVX (célula no pequeña de pulmón) ; HOP-62 (célula no pequeña de pulmón) ; HOP-92 (célula no pequeña de pulmón) ; NCI-H226 (célula no pequeña de pulmón) ; NCI-H23 (célula no pequeña de pulmón) ; NCI-H322M (célula no pequeña de pulmón) ; NCI-H460 (célula no pequeña de pulmón) ; NCI-H522 (célula no pequeña de pulmón) ; COLO205 (Colon) ; HCC-2998 (Colon) ; HCT-116 (Colon) ; HCT-15 (Colon) ; HT29 (Colon) ; KM12 (Colon) ; SW-620 (Colon); SF-268 (SNC); SF-295 (SNC); SF-539 (SNC); SNB-19 (SNC); SNB-75 (SNC); U251 (SNC) ; LOX 1MV1 (Melanoma); MALME-3M (Melanoma) ; M14 (Melanoma) ; SK-MEL-2 (Melanoma) ; SK-MEL-28 (Melanoma) ; SK-MEL-5 (Melanoma) ; UACC-257 (Melanoma) ; UACC-62 (Melanoma); IGR-OVl (Ovario); OVCAR-3, 4, 5, 8 (Ovario); SK-OV-3 (Ovario); 786-0 (Renal); A498 (Renal); ACHN (Renal); CAK1-1 (Renal); SN12C (Renal); TK-10 (Renal); UO-31 (Renal); PC-3C (Próstata); DÜ-145 (Próstata); NCI/ADR-RES (Mama); MDA-MB-231/ATCC (Mama) ; MDA-MB-435 (Mama) ; DMS 114 (célula pequeña de pulmón) y SHP-77 (célula pequeña de pulmón) ; todas las cuales están disponibles desde NCI y se incorporan en la presente para referencia. Un ensayo ejemplar para determinar el efecto de los anticuerpos de la invención en la actividad de ADCC de anticuerpos terapéuticos se basa en un ensayo de liberación de 51Cr que comprende: etiquetar células objetivo con [51Cr] Na2Cr04 (esta molécula permeable de membrana celular se utiliza comúnmente para etiquetado ya sea enlaza proteínas citoplásmicas y aunque se libera espontáneamente a partir de las células con cinéticas lentas, se libera masivamente siguiendo la lisis celular objetivo) ; de preferencia, las células objetivo expresan uno o más antígenos de tumor, opsonizan las células objetivo con uno o más anticuerpos que enlazan inmunoespecíficamente los antígenos tumorales expresados en la superficie celular de las células objetivo, en la presencia y ausencia de un anticuerpo de la invención, por ejemplo, 2B6,3H7, combinando las células objetivo radioetiquetadas opsonizadas con células efectoras en una placa microtituladora en una relación apropiada de células objetivo a células efectoras; incubando la mezcla de células de preferencia durante 16-18 horas, de preferencia a 37 °C; recolectando sobrenadantes, y analizando la radioactividad en las muestras de sobrenadante. La citotoxicidad de los anticuerpos terapéuticos en la presencia y la ausencia de los anticuerpos de la invención pueden determinarse por ejemplo, utilizando la siguiente fórmula: Por ciento de lisis específica = (lisis experimental-lisis independiente de anticuerpos/lisis máxima - lisis independiente de anticuerpos) x 100%. Una gráfica puede generarse al variar ya sea el objetivo: la relación de célula efectora o concentración de anticuerpo. En aún otra modalidad, los anticuerpos de la invención se caracterizan por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de acuerdo con el método descrito anteriormente, véase por ejemplo, Ding et ai., Immunity, 1998, 8:403-11; el cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la invención abarca caracterizar la función de los anticuerpos de la invención al mejorar la actividad de ADCC de anticuerpos terapéuticos en un ensayo basado in vitro y/o en un modelo animal. En una modalidad específica, la invención abarca determinar la función de los anticuerpos de la invención al mejorar la ADCC específica de tumor utilizando un modelo de cáncer de ovario y/o un modelo de cáncer de mama. De preferencia, los ensayos de ADCC de la invención se hacen al utilizar más de una línea celular cancerígena, caracterizados por la expresión de al menos un antígeno cancerígeno, en donde el nivel de expresión del antígeno cancerígeno se varía entre las líneas celulares cancerígenas utilizadas. Aunque no se pretende unirse por un mecanismo particular de acción, realizando ensayos de ADCC en más de una línea celular en donde el nivel de expresión del antígeno cancerígeno se varía, permitirá la determinación de restricción de depuración de tumor de los anticuerpos de la invención. En una modalidad, los ensayos de ADCC de la invención se hacen utilizando líneas celulares cancerígenas con diferentes niveles de expresión de un antígeno cancerígeno. En un ensayo ejemplar, OVCAR3, una línea celular de carcinoma de ovario puede servir como el objetivo de tumor que expresa los antígenos de tumor, Her2/neu y TAG-72; monocitos humanos, que expresan Fc?RIIIA y Fc?RIIA de activación y Fc?RIIB inhibidor, pueden utilizarse como efectoras; y anticuerpos murinos específicos de tumor, ch4D5 y ChCC49, pueden utilizarse como los anticuerpos específicos de tumor. Las células OVCAR-3 están disponibles de ATCC (Número de Acceso HTB-161) . De preferencia, las células OVCAR-3 se propagan en un medio suplementado con 0.01 mg/ml de insulina de bovino. Las células OVCAR-3 viables 5 x 106 pueden inyectarse subcutáneamente (s.c.) dentro de ratones atímicos desnudos compaginados en edad y peso con Matrigel (Becton Dickinson) . El peso estimado del tumor puede calcularse por la fórmula: longitud- (ancho) 2/2, y de preferencia no excede 3 gramos . El tumor dependiente de anclaje puede aislarse después de 6-8 semanas, y las células pueden disociarse agregando 1 µg de Collagenase (Sigma) por gramo de tumor y 5 mg/mL de ARNasa, pasados a través de un tamiz de célula y malla de nylon a células aisladas. Las células pueden congelarse entonces para almacenamiento a largo plazo para inyección s.c. para establecimiento del modelo de xenoinjerto. Los hibridomas que secretan anticuerpos CC49 y 4D5 están disponibles con Números de Acceso ATCC HB-9459 y CRL-3D463 y las secuencias de nucleótido de cadena ligera y cadena pesada están en el dominio público (Murria et ai., 1994 Cáncer 73 (35) : 1057-66, Yamamoto et ai., 1986 Nature, 319:230-4; ambas de las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad) . De preferencia, los anticuerpos 4D5 y CC49 se quimerizan utilizando métodos estándares conocidos por un experto en la técnica de manera que la secuencia Fc humana, por ejemplo, la región constante humana de IgGl, se injerta sobre la región variable de los anticuerpos de murino con el fin de proporcionar la función efectora. Los anticuerpos 4D5 y CC49 quiméricos se enlazan a través de su región variable a las líneas de células objetivo y a través de su región Fc a Fc?Rs expresados en células efectoras humanas. CC49 se dirige a TAG-72; una mucina de peso molecular elevado que se expresa altamente en muchas células de adenocarcinoma y carcinoma de ovario (Lottich et ai., 1985 Breast Cáncer Res. Teat. 6(l):49-56; Mansi et al . , 1989 Int. J. Rad. ppl. Instrum B. 16 (2) : 127-35; Colcher et al . , 1991- Int. J. Rad. Appl. Instrum B. 18:395-41; todos los cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad) . 4D5 se dirige a un receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (Cárter et ai., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285-9 la cual se incorpora en la presente para referencia) . Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse entonces para investigar el mejoramiento de actividad de ADCC de los anticuerpos específicos de tumor, al bloquear el Fc?RIIB inhibidor. Aunque no se pretende unirse por un mecanismo particular de acción, en la activación de las células efectoras que expresan al menos un Fc?R de activación, por ejemplo, Fc?RIIA, la expresión del receptor inhibidor (Fc?RIIB) se mejora y éste limita la depuración de tumores cuando la actividad de ADCC de Fc?RIIA se suprime. Sin embargo, los anticuerpos de la invención pueden servir como un anticuerpo de bloqueo, es decir, un anticuerpo que evitará la señal de inhibición a partir de activarse y de este modo la señal de activación, por ejemplo, actividad de ADCC, se mantendrá durante un periodo más prolongado y puede resultar en una depuración potente de tumor. De preferencia, los anticuerpos de la invención para uso en el mejoramiento de actividad de ADCC se han modificado para comprender al menos una modificación de aminoácidos, de manera que su enlace a Fc?R se ha disminuido, más preferiblemente se ha suprimido. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se han modificado para comprender al menos una modificación de aminoácidos la cual reduce el enlace del dominio constante a un Fc?R de activación, por ejemplo, Fc?RIIIA, Fc?RIIA, cuando se compara al anticuerpo de tipo silvestre de la invención mientras se retiene la actividad de bloqueo de Fc?RIIB máxima. Los anticuerpos de la invención pueden modificarse de acuerdo con cualquier método conocido por un experto en la técnica o se describen en la presente. Cualquier modificación de aminoácidos la cual se conoce que afecta la función efectora puede utilizarse de acuerdo con los métodos de la invención tales como aquellos descritos en las Solicitudes de Patente Norteamericanas Nos. 60/439,498 (presentada el 9 de enero de 2003); y 60/456,041 (presentada el 19 de marzo de 2003); ambas de las cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se modifican de manera que la posición 265 se modifica, por ejemplo, la posición 265 se sustituye con alanina. En las modalidades preferidas, la región constante de murino de un anticuerpo de la invención se alternan con la región constante humana correspondiente que comprende una sustitución del aminoácido en la posición 265 con alanina, de manera que la función efectora se depura mientras la actividad de bloqueo de Fc?RIIB se mantiene. Un cambio de aminoácido sencillo en la posición 265 de cadena pesada de IgGl ha demostrado que reduce significativamente el enlace a Fc?R con base en el análisis de ELISA; Sheilds et ai., 2001, J. Biol. Chem., 276 (9) : 6591-604; la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad y ha resultado en reducción de masa de tumor. En otras modalidades, los anticuerpos de la invención se modifican de manera que la posición 297 se modifica, por ejemplo, la posición 297 se sustituye con glutamina, de manera que el sitio de glicosilación N-enlazado se elimina (véase por ejemplo, Jefferies et al . , 1995, Immunol. Lett 44:111-7; Lund et ai., 1996, J. Immunol; 157:4963-69; Wright et ai., 1994 J. Exp. Med. 180:1087-96; White et ai., 1997; J. Immunol . 158:426-35; todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades. La modificación en este sitio se ha reportado que suprime toda la interacción con Fc?Rs. En las modalidades preferidas, la región constante de murino de un anticuerpo de la invención se alterna con la región constante humana correspondiente que comprende una sustitución del aminoácido en la posición 265 y/o 297, de manera que la función efectora se suprime mientras la actividad de bloqueo de Fc?RIIB se mantiene. Un ensayo ejemplar para determinar la actividad de ADCC de los anticuerpos específicos de tumor en la presencia y ausencia de los anticuerpos de la invención es un ensayo fluorescente basado en europio no radioactivo (BATDA, Perkin Elmer) y puede comprender lo siguiente: etiquetar las células objetivo con un acetoxilmetiléster del éster que mejora la fluorescencia que forma un ligando hidrofílico (TDA) con la membrana de células por hidrólisis de los esteres; este complejo es incapaz de dejar la célula y se liberan solamente en lisis por los efectores; agregar los objetivos etiquetados a las células efectoras en presencia de anticuerpos antitumor y un anticuerpo de la invención; incubar la mezcla del objetivo y las células efectoras durante 6 a 16 horas, de preferencia a 37 °C. El grado de actividad de ADCC puede evaluarse al medir la cantidad de ligando que se libera e interactúa con europio (reactivo DELFIA; PerkinElmer) . El ligando y el europio forman un quelato muy estable y altamente fluorescente (EuTDA) y la fluorescencia medida es proporcional directamente al número de células disueltas por medio de lisina. El por ciento de lisis específico puede calcularse utilizando la fórmula: (lisis experimental-lisis independiente de anticuerpos/lisis máxima-lisis independiente de anticuerpos xl00%) . En algunas modalidades si la sensibilidad del ensayo de ADCC basado en fluorescencia es demasiada baja para detectar la actividad de ADCC de los anticuerpos terapéuticos, la invención abarca ensayos de ADCC basados radioactivos, tales como ensayo de liberación de 51Cr. Los ensayos basados radioactivos pueden hacerse en lugar de o en combinación con ensayos de ADCC basados fluorescentes. Un ensayo de liberación de 51Cr ejemplar para caracterizar los anticuerpos de la invención puede comprender lo siguiente: etiquetar células objetivo l-2xl06 tales como células OVCAR-3 con 51Cr; opsonizar las células objetivo con anticuerpos 4D5 y CC49 en la presencia y ausencia de un anticuerpo de la invención y agregar 5 x 103 células a placas de 96 pozos. De preferencia, 4D5 y CC49 están en una concentración que varía desde 1-15 µg/mL; agregar las células objetivo opsonizadas a macrófagos derivados de monocitos (MDM) (células efectoras) ; de preferencia en una relación que varía desde 10:1 a 100:1; incubar la mezcla de células durante 16-18 horas a 37 °C, recolectar sobrenadantes; y analizar la radioactividad en el sobrenadante. La citotoxicidad de 4D5 y CC49 en la presencia y ausencia de un anticuerpo de la invención puede entonces determinarse, por ejemplo, utilizando la siguiente fórmula de por ciento de lisis específico = (lisis experimental - lisis independiente de anticuerpos/lisis máxima - lisis independiente de anticuerpos) x 100%. Én algunas modalidades, la actividad in vivo de los anticuerpos Fc?RIIB de la invención se determina en modelos de tumor humanos de xenoinjerto. Los tumores pueden establecerse utilizando cualquiera de las líneas celulares cancerígenas descritas supra. En algunas modalidades, los tumores se establecerán con dos líneas de células cancerígenas, en donde la primera línea de células cancerígenas se caracteriza por una expresión baja de un antígeno cancerígeno y una segunda línea de células cancerígenas, en donde la segunda línea de células cancerígenas se caracteriza por una expresión elevada del mismo antígeno cancerígeno. La depuración de tumor puede determinarse entonces utilizando métodos conocidos por un experto en la técnica, utilizando un anticuerpo anti-tumor el cual enlaza inmunoespecíficamente el antígeno cancerígeno en la primera y la segunda línea de célula cancerígena, y un modelo de ratón apropiado, por ejemplo, un modelo de ratón desnudo Balb/c (por ejemplo, Jackson Laboratorios, Taconic) , con monocitos humanos trasferidos por adopción y los MDM como células efectoras. Cualquiera de los anticuerpos descritos supra pueden probarse entonces en este modelo animal para evaluar el papel de anticuerpo anti-Fc?RIIB de la invención en la depuración de tumores. Los ratones que pueden utilizarse en la invención incluyen por ejemplo, Fc?RIII-/- (en donde Fc?RIIIA se desactiva) ; ratones Fc?-/-desnudos (en donde Fc?RI y Fc?RIIIA se desactivan) ; o en ratones desactivados Fc?RIIB humanos o ratones desactivados transgénicos, en donde el lugar de ratón fcgr2 y fcgr3 en el cromosoma 1 se inactivan y los ratones expresan Fc?RIIA humano, Fc?RIIA humano, Fc?RIIB humano, Fc?RIIC humano, Fc?RIIIA humano y Fc?RIIIB humano. Un método ejemplar para probar la actividad in vivo de un anticuerpo de la invención puede comprender lo siguiente: establecer un modelo de murino de xenoinjerto utilizando una línea de célula cancerígena caracterizada por la expresión de un antígeno cancerígeno y determinar el efecto de un anticuerpo de la invención o un anticuerpo específico para el antígeno cancerígeno expresado en la línea celular cancerígena para mediar la depuración del tumor. De preferencia, la actividad in vivo se prueba en paralelo utilizando dos líneas de células cancerígenas, en donde la primera línea cancerígena se caracteriza por un primer antígeno cancerígeno expresado a bajos niveles y una segunda línea de células cancerígenas, caracterizada por el mismo antígeno de cáncer expresado en un nivel más elevado con relación a la primera línea de célula cancerígena. Estos experimentos incrementarán de este modo la restricción de la evaluación del papel de un anticuerpo de la invención en la depuración de tumores. Por ejemplo, los tumores pueden establecerse con la línea de células IGROV-1 y el efecto de un anticuerpo anti-Fc?RIIB de la invención en la depuración de tumores de un anticuerpo específico de Her2/neu puede evaluarse. Con el fin de establecer los modelos de tumor de xenoinjerto, pueden inyectarse células viables 5 x 106, por ejemplo, IGROV-1, SKBR3, por ejemplo, s.c. en ratones, por ejemplo ratones atímicos desnudos hembra igualados en peso y 8 de edad utilizando por ejemplo, Matrigel (Becton Dickinson) . El peso estimado del tumor puede determinarse por la fórmula: longitud x (ancho) 2/2; y de preferencia no excede 3 gramos. La inyección de células IGROV-1, s.c. da lugar a tumores de crecimiento rápido mientras que la ruta i.p. induce una carcinomatosis peritoneal la cual elimina ratones en 2 meses (Benard et ai., 1985, Cáncer Res.. 45:4970-9). Ya que las células IGROV-1 forman tumores en el curso de 5 semanas, en el día 1 después de la inyección de células tumorales, monocitos como efectores se co-inyectan i.p. junto con un específico de anticuerpo terapéutico para Her2/neu, por ejemplo, Ch4D5, y un anticuerpo de la invención; por ejemplo, 2B6 o 3H7 quimérica como se describe supra. De preferencia, los anticuerpos se inyectan a 4Dg cada uno por gramo del peso del cuerpo de ratón (mbw) . La inyección seguirá por inyecciones semanales de anticuerpos durante 4-6 semanas más adelante a 2 µg/semana. Las células efectoras humanas se reabastecen una vez en 2 semanas. Un grupo de ratones no recibirá el anticuerpo terapéutico pero se inyectará con una 4D5 quimérica que comprende una mutación N297A e IgGl humana como anticuerpos control de isotipo para los anticuerpos anti-tumor y anti-Fc?RIIB, respectivamente. Los ratones pueden colocarse en grupos de 4 y monitorearse tres veces semanalmente. La Tabla 5 siguiente es una activación ejemplar para estudios de depuración de tumor de acuerdo con la invención. Como se muestra en la Tabla 5, seis grupos de 8 ratones cada uno será necesario para probar el papel de un anticuerpo de la invención en depuración de tumores, en donde se utiliza una combinación de células objetivo y efectora y en donde dos diferentes combinaciones de la concentración de anticuerpo se utilizan. En el grupo A, sólo se inyectan células tumorales; en el grupo B se inyectan células tumorales y monocitos; en el grupo C, se inyectan células tumorales, monocitos, un anticuerpo anti-tumor (Ch4D5) ) ; en el grupo D, se inyectan células tumorales, monocitos, anticuerpo anti-tumor, y un anticuerpo anti-Fc?RII; en el grupo E, se inyectan células tumorales, monocitos y un anticuerpo anti-Fc?RIIB; en el grupo F, se inyectan células tumorales, monocitos, Ch4D5 (N297Q) , e IgGl humanas. Se apreciará por un experto en la técnica que varias concentraciones de anticuerpo de varias combinaciones de anticuerpo pueden probarse en los modelos tumorales descritos. De preferencia, los estudios que utilizan una línea de célula cancerígena de mama, por ejemplo, SKBR3, se lleva a cabo en paralelo al experimento descrito anteriormente .

TABLA 5 ACTIVACIÓN EXPERIMENTAL EJEMPLAR EN RATONES El punto final de los modelos de tumor de xenoinjerto se determina con base en el tamaño de los tumores, el peso de ratones, el tiempo de sobrevivencia y la examinación histoquímica e histopatológica del cáncer, utilizando métodos conocidos por un experto en la técnica. Cada uno de los grupos de ratones en la Tabla 5 se evaluará. Los ratones se monitorean de preferencia tres veces a la semana. El criterio para crecimiento tumoral puede ser distensión abdominal, la presencia de masa palpable en la cavidad peritoneal. De preferencia, los cálculos de peso tumoral contra días después de la inoculación se calcularán. Una comparación del criterio antes mencionado de ratones en el Grupo D comparado a aquellos en otros grupos definirá el papel de un anticuerpo de la invención en el mejoramiento de depuración de tumores. De preferencia, los animales tratados con anticuerpos estarán bajo observación durante 2 meses adicionales después del grupo control. En las modalidades alternativas, los ratones "desactivados" con Fc?RIIB que expresan Fc?RIIB humano en células efectoras de murino pueden utilizarse para establecer la actividad in vivo de los anticuerpos de la invención, en lugar de células efectoras transferidas en adopción. Los ratones fundadores que expresan el Fc?RIIB humano pueden generarse al "desactivar" el Fc?RIIB humano sobre el sitio Fc?RIIB de ratón. Los fundadores pueden entonces retro-cruzarse sobre el antecedente desnudo y expresarán el receptor Fc?RIIB humano. Las células efectoras de murino resultantes expresarán Fc?RI y Fc?RIIIA de activación endógena y receptores Fc?RIIB humanos inhibidores. La actividad in vivo de los anticuerpos de la invención pueden probarse además en un modelo de murino de xenoinjerto con células derivadas de tumor primario humano, tales como las células derivadas de ovario humano primario y carcinoma de seno. Las muestras de ascitis y efusión pleural a partir de pacientes con cáncer pueden probarse para expresión de Her2/neu, utilizando métodos conocidos por un experto en la técnica. Las muestras a partir de pacientes de carcinoma de ovario pueden procesarse al hacer girar a la ascitis a 6370 g durante 20 minutos a 4°C, disolviendo por medio de lisina los glóbulos rojos, y lavando las células con PBS. Una vez que la expresión de Her2/neu en células tumorales se determina, dos muestras, un expresor medio y elevado puede seleccionarse para inoculación s.c. para establecer el modelo de tumor de xenoinjerto. Las células tumorales aisladas se inyectarán entonces i.p. en ratones para expandir las células. Aproximadamente 10 ratones pueden inyectarse i.p. y cada ascitis de ratón pasa además en dos ratones para obtener ascitis a partir de un total de 20 ratones los cuales pueden utilizarse para inyectar un grupo de 80 ratones. Las muestras de efusión pleural pueden procesarse utilizando un método similar a ascitis. Las células de tumor Her2/neu+ a partir de muestras de efusión pleural pueden inyectarse a almohadillas mamarias derechas e izquierdas superiores de los ratones. En algunas modalidades, si el porcentaje de las células neoplásicas en la ascitis o muestras de efusión pleural se compara bajamente a otros subconjuntos celulares, las células neoplásicas pueden expandirse in vitro. En otras modalidades, las células tumorales pueden purificarse utilizando anticuerpo CC49 perlas magnéticas recubiertas (anti-TAG-72) como se describe previamente, véase por ejemplo, Barker et ai., 2001, Gynecol. Oncol. 82:57, 63, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Brevemente, las perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo CC49 pueden utilizarse para separar las células tumorales de ovario que se desprenderán a partir de las perlas por una incubación durante la noche a 37 °C. En algunas modalidades, si las células tumorales carecen del antígeno TAG-72, la eliminación negativa utilizando un cóctel de anticuerpos, tales como aquellos provistos por Stem Cell Technologies, Inc., Canadá, puede utilizarse para enriquecer las células tumorales. En otras modalidades, otros marcadores de tumores además de Her2/neu pueden utilizarse para separar células tumorales obtenidas a partir de ascitis y las muestras de efusión pleural a partir de células no tumorales. En el caso de la efusión pleural o tejido de seno, se ha reportado recientemente que CD44 (una molécula de adhesión) , B38.1 (un marcador específico de cáncer de mama/ovario) , CD24 (una molécula de adhesión) puede utilizarse como marcadores, véase por ejemplo, Al Hajj, et ai., 2003, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100:3983, 8; la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Una vez que las células tumorales se purifican, pueden inyectarse s.c. en ratones para expansión. De preferencia, la inmunohistoquímica y la histoquímica se realizan en ascitis y efusión pleural de pacientes para analizar características estructurales de neoplasia. Tales métodos se conocen por un experto en la técnica y están abarcados dentro de la invención. Los marcadores que pueden monitorearse incluyen por ejemplo, citoqueratina (para identificar células neoplásica y mesoteliales de ovario a partir de células inflamatorias y mesenquimales) , calretinina (para separar el mesotelio a partir de las células neoplásicas positivas Her2neu) ; y CD45 (para separar células inflamatorias a partir del resto de la población celular en las muestras) . Los marcadores adicionales que pueden seguirse incluyen CD3 (células T) , CD20 (células B) , CD56 (linfocitos NK) , CD14 (monocitos). Se apreciará por un experto en la técnica que los métodos de inmunohistoquímica e histoquímica descritos supra, se aplican de modo análogo a cualquier célula tumoral para uso en los métodos de la invención. Después la inoculación s.c. de células tumorales, los ratones continúan los cambios clínicos y anatómicos. Cuando se necesite, los ratones pueden examinarse para correlacionar la carga de tumor total con localización de órgano específico. En una modalidad específica, los tumores se establecen utilizando líneas celulares de carcinoma tales como células IGROV-1, OVCAR-8, SK-B y OVCAR-3 y ascitis de carcinoma de ovario humano y efusión pleural a partir de pacientes de cáncer de mama. La ascitis de preferencia contiene tanto los efectores como los objetivos tumorales para los anticuerpos que se prueban. Los monocitos humanos se transferirán como efectores. La actividad in vivo de los anticuerpos de la invención pueden probarse también en un modelo animal, por ejemplo, ratones desnudos Balb/c, inyectados con células que expresan Fc?RIIB, incluyendo pero sin limitarse a SK-BR-3 con número de acceso ATCC HTB-30 (véase por ejemplo, Tremp et ai., 1976, Cáncer Res. 33-41); linfocitos B; células derivadas a partir de linfoma Burkitts, por ejemplo, células Raji con número de acceso ATCC CCL-86 (véase por ejemplo, Epstein et ai., 1965, J. Nati. Cáncer Inst . 34: 231-240), células Daudi con número de acceso ATCC CCL-213 (véase por ejemplo, Klein et al . , 1968, Cáncer Res. 28:1300-10); líneas celulares de carcinoma de ovario, por ejemplo, OVCAR-3 con número de acceso ATCC HTB-161 (véase por ejemplo, Hamilton, Young et ai., 1983); SK-OV-3, PA-1, CAOV3, OV-90 e IGROV-1 (disponibles de NCI repository Benard et ai., 1985, Cáncer Research, 45:4970-9; la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Un ensayo ejemplar para medir la actividad in vivo de los anticuerpos de la invención puede comprender lo siguiente: ratones hembra Desnudos Balb/c (Taconic, MD) se inyectan en el día 0 con células que expresan Fc?RIIB tales como células Daudi 5xl06 por ejemplo por la ruta subcutánea. Los ratones (por ejemplo, 5 ratones por grupo) también reciben inyección i.p. de PBS (control negativo), ch 4.4.20 (anticuerpo anti-FITC) como un control negativo, y como un control positivo, otro anticuerpo de cáncer terapéutico tal como aquellos descritos en la presente, por ejemplo, Rituxan (por ejemplo, a 10 µg/g) o 10 µg/g ch2B6 una vez a la semana iniciando en el día 0. Se observan ratones, por ejemplo, dos veces a la semana después de la inyección, y el tamaño de tumor (longitud y ancho) se determina utilizando por ejemplo, un calibrador. El peso del tumor en mg se estima utilizando la fórmula: (longitud x ancho2) /2. De preferencia, los anticuerpos de la invención tienen una eficacia mejorada al disminuir el tumor con relación a un anticuerpo terapéutico cancerígeno cuando se administra a la misma dosis, por ejemplo, 10 µg/g, durante un periodo de tiempo de al menos 14 días, al menos 21 días, al menos 28 días, o al menos 35 días. En las modalidades más preferidas, los anticuerpos de la invención reducen el tamaño del tumor por al menos 10 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces con relación a la administración de un anticuerpo terapéutico cancerígeno a la misma dosis. En aún otra modalidad preferida, los anticuerpos de la invención suprimen completamente el tumor. .3.1 POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN UN ANTICUERPO La presente invención incluye también polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención (por ejemplo, anticuerpo monoclonal de ratón producido a partir del clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 ó 1F2 que tiene números de acceso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente) u otros anticuerpos monoclonales producidos por métodos de inmunización de la invención, y versiones humanizadas de los mismos, y métodos para producir los mismos. La presente invención abarca el polinucléotido que codifica la cadena pesada del anticuerpo 2B6, con el número de acceso ATCC PTA-4591, como se describe en la SEC de IDENT. NO: 27. La presente invención abarca también el polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo 2B6 con número de acceso ATCC PTA-4591, como se describe en la SEC de IDENT NO: 25. Los métodos de la invención abarcan también polinucleótidos que hibridizan bajo varias condiciones de restricción, por ejemplo, restricción elevada, restricción intermedia o baja, a polinucleótidos que codifican un anticuerpo de la invención. La hibridización puede realizarse bajo varias condiciones de restricción. A modo de ejemplo y sin limitación, los procedimientos utilizando condiciones de baja restricción son como sigue (véase también Shilo y Weinberg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78, 6789-6792). Los filtros que contienen ADN se pre-tratan durante 6 horas a 40 °C en una solución que contiene 35% de formamida, 5X SSC, 50 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM de EDTA, 0.1% de PVP, 0.1% de Ficoll, 1% de BSA y 500 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizada. Las hibridizaciones se llevan a cabo en la misma solución con las siguientes modificaciones: se utiliza la sonda etiquetada 32P con 0.02% de PVP, 0.02% de Ficoll, 0.2% de BSA, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón, 10% (peso/volumen) de sulfato de dextrano, y 5-20 X 106 cpm. Los filtros se incuban en mezcla de hibridización durante 18-20 horas a 40°C, y luego se lava durante 1.5 horas a 55°C en una solución que contiene 2X SSC, 25 mM de Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM de EDTA y 0.1% de SDS. La solución lavada se reemplaza con una solución fresca y se incuba durante 1.5 horas adicionales a 60 °C. Los filtros se secan con papel secante y se exponen para autoradiografía. Si es necesario, los filtros se lavan una tercera vez a 65-68 °C y se vuelven a exponer a película. Otras condiciones de restricción baja las cuales pueden utilizarse se conocen bien en la técnica (por ejemplo, como se emplea para hibridizaciones de especie cruzada) . A modo de ejemplo y sin limitación, los procedimientos utilizando condiciones de restricción elevada son como sigue. La pre-hibridización de filtros que contienen ADN se lleva a cabo durante 8 horas durante la noche a 65 °C en tampón compuesto de 6X SSC, 50 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 1 M de EDTA, 0.02% de PVP, 0.02% de Ficoll, 0.02% de BSA y 500 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridizan durante 48 horas a 65 °C en mezcla de pre-hibridización que contiene 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 X 106 cpm de sonda etiquetada 32P. El lavado de filtros se hace a 37 °C durante 1 hora en una solución que contiene 2X SSC, 0.01% de PVP, 0.01% de Ficoll y 0.01% de BSA. Esto se sigue por un lavado en 0. IX SSC a 50 °C durante 45 minutos antes de la autoradiografía. Otras condiciones de restricción elevada las cuales pueden utilizarse son bien conocidas en la técnica. La selección de condiciones apropiadas para tales restricciones se conoce bien en la técnica (véase por ejemplo, Sambrook et al . , 1989, molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; véase también, Ausubel et ai., eds., en the Current Protocols in Molecular Biology serie de manuales de técnica de laboratorio, © 1987-1997, Current Protocols, © 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.; véase especialmente, Dyson, 1991, "Immobilization of nucleic acids and hybridization análisis" en: Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Vol. 2, T.A. Brown, ed. , pp. 111-156, IRL Press a Oxford University Press, Oxford, UK) . Los polinucleótidos pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótido de los polinucleótidos determinados, por cualquier método conocido en- la técnica.

Un polinucléotido que codifica un anticuerpo puede generarse a partir del ácido nucleico a partir de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, de preferencia poli A+ ARN, aislado a partir de, cualquier tejido o células que expresan el anticuerpo, tal como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo de la invención, por ejemplo, 2B6 o 3H7) por hibridización con sondas específicas de Ig y/o amplificación de PCR utilizando cebadores sintéticos hibridizables a los extremos 3' y 5' de la secuencia o clonando utilizando una sonda de oligonucleótido específica para la secuencia de gen particular para identificar, por ejemplo, un clon de ADNc a partir de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden clonarse entonces en vectores de clonación replicables utilizando cualquier método bien conocido en la técnica. Una vez que la secuencia de nucleótidos del anticuerpo se determina, la secuencia de nucleótidos del anticuerpo puede manipularse utilizando métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis sitio dirigida, PCR, etc. (véase por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et ai., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY y Ausubel et ai., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, las cuales se incorporan para referencia en sus totalidades) para generar anticuerpos que tienen diferentes secuencias de aminoácido, por ejemplo para crear sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos. En una modalidad específica, una o más de las CDR se insertan dentro de las regiones de esquema utilizando técnicas de ADN recombinantes de rutina. Las regiones de esquema pueden ser de origen natural o regiones de esquema consenso, y de preferencia regiones de esquema humano (véase, por ejemplo, Chothia et ai., 1998, J. Mol. Biol. 278:457-479 para una lista de regiones de esquema humano) . De preferencia, el polinucléotido generado por la combinación de las regiones de esquema y las CDR codifica un anticuerpo que enlaza específicamente a Fc?RIIB con mayor afinidad que el anticuerpo enlaza Fc?RIIA. De preferencia, como se discute supra, una o más sustituciones de aminoácido pueden hacerse dentro de las regiones de esquema, y de preferencia, las sustituciones de aminoácido mejoran el enlace de los anticuerpos de la invención a Fc?RIIB. Los plásmidos representativo, pMGx608 (pCI-neo [Invitrogen, Inc.] que contiene una cadena pesada 2B6 humanizada con secuencias de línea germinal VHl-18 y JH6 humanas como esquemas, región constante de Fc de IgGi humana y las CDR de ratón 2B6) y pMGx611 (pCI-neo que contiene una cadena ligera 2B6 humanizada con VK-A26 y JK4 humana como esquemas, kappa humana como región constante, y las CDR de cadena ligera 2B6 de ratón con N50 — Y y V5i —» A en CDR2), que tiene los números de acceso ATCC PTa-5963 y PTa-5964, respectivamente, se depositaron bajo las condiciones de the Budapest Treaty con the American Type Culture Collection (10801 University BIvd.., Manassas, VA. 20110-2209) el 7 de mayo de 2004, respectivamente, y se incorporan en la presente para referencia. El anticuerpo formado por estas cadenas pesadas y ligeras se designa h2B6YA. En otra modalidad, las bibliotecas humanas o cualesquiera otras bibliotecas disponibles en la técnica, pueden seleccionarse por técnicas estándares conocidas en el arte, para clonar los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención. .3.2 EXPRESIÓN RECOMBINANTE DE ANTICUERPOS Una vez que la secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la invención se ha obtenido, el vector para la producción del anticuerpo puede producirse por tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Los métodos los cuales son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica pueden utilizarse para construcción de vectores de expresión que contienen el anticuerpo que codifica secuencias y señales control transcripcionales y de traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinantes in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo (Véase por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et ai., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY y Ausubel et ai., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY) . Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótido de un anticuerpo puede transferirse a una célula huésped por técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación, transfección liposomal, y precipitación de fosfato de calcio) y células transfectadas se cultivan entonces por técnicas convencionales para producir el anticuerpo de la invención. En las modalidades específicas, la expresión del anticuerpo se regula por un promotor específico constitutivo, inducible o de tejido. Las células huéspedes utilizadas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención pueden ser ya sea células bacterianas tales como Escherichia coli, o de preferencia células eucarióticas, especialmente para la expresión de molécula de inmunoglobulina recombinante completa. En particular, las células de mamíferos tales como células de ovario de hámster chino (CHO) , junto con un vector tal como el elemento de promotor de gen anterior intermediario mayor a partir de citomegalovirus humano es un sistema de expresión efectivo para inmunoglobulinas (Foecking et ai., 1998, Gene 45:101; Cockett et ai., 1990, Bio/Technology 8:2). Una variedad de sistemas de vector de expresión de huésped puede utilizarse para expresar los anticuerpos de la invención. Tales sistemas de expresión huéspedes representan vehículos por la cual las secuencias de codificación de los anticuerpos pueden producirse y purificarse subsecuentemente, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias de codificación de nucleótido apropiadas, expresan los anticuerpos de la invención in situ. Éstas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen secuencias de codificación de inmunoglobulina; levadura (por ejemplo, Saccharomyces Pichia) transformadas con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen secuencias de codificación de inmunoglobulina; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias de codificación de inmunoglobulina; sistemas celulares de plantas infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus de mosaico de coliflor (CaMV) y virus de mosaico de tabaco (TMV) ) o se transforma con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias de codificación de inmunoglobulina; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3, células linfocíticas (véase U.S. 5,807,715), células Per C.6 (células retínales de rata desarrolladas por Crucell) ) que hospedan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados a partir del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneina) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia) . En sistemas bacterianos, un número de vectores de expresión pueden seleccionarse ventajosamente dependiente del uso pretendido para el anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando una gran cantidad de tal proteína va a producirse, por la generación de composiciones farmacéuticas de un anticuerpo, los vectores los cuales dirigen la expresión de niveles elevados de los productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente pueden ser deseables. Tales vectores incluyen, pero no se limitan al vector pUR278 de expresión de E.coli (Ruther et al . , 1983, EMBO J. 2:1791), en el cual la secuencia de codificación de anticuerpos puede ligarse individualmente en el vector en la estructura con la región de codificación lac Z de manera que una proteína de fusión se produce; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX pueden utilizarse también para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST) . En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden fácilmente purificarse a partir de células disueltas por lisina por la adsorción y enlace a perlas de una matriz de glutatión-agarosa seguida por la elusión en la presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir trombina o sitios de desdoblamiento de proteasa del factor Xa de manera que el producto genético objetivo clonado puede liberarse a partir de la porción GST. En un sistema de insectos, el virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se utiliza como un vector para expresar genes extraños. El virus crece en las células Spodoptera frugiperda. La secuencia de codificación de anticuerpos puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor del AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina) . En las células huéspedes de mamífero, un número de sistemas de expresión basados en virus pueden utilizarse. En casos en donde un adenovirus se utiliza como un vector de expresión, la secuencia de codificación de anticuerpos de interés puede ligarse a un complejo control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse entonces en el genoma de adenovirus por recombinación in vitro o in vivo . La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región El o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de inmunoglobulina en huéspedes infectados (por ejemplo, véase Logan & Shenk, 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:355-359). Las señales de inhibición específicas pueden requerirse también para traducción eficiente de secuencias de codificación de anticuerpo insertado. Estas señales incluyen el codón de iniciación de ATG y las secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación de estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control de traducción exógena y los codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de expresión puede mejorarse por la inclusión de elementos mejoradores de transcripción apropiada, terminadores de transcripción, etc. (véase Bittner et al . , 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544).

Además, puede elegirse una cepa de célula huésped la cual modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto genético en la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, desdoblamiento) de los productos de proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células huéspedes tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento pos-traslacional y la modificación de proteínas y productos genéticos. Las líneas celulares apropiadas o sistemas huéspedes pueden elegirse para asegurar la modificación correcta y el procesamiento de la proteína extraña expresada. Para este fin, las células huéspedes eucarióticas las cuales poseen la maquinaria celular para procesamiento apropiado de la transcripción primaria, glicosilación y fosforilación del producto genético pueden utilizarse. Tales células huéspedes de mamíferos incluyen, pero no se limitan a CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7030 y Hs578Bst. Para la producción de rendimiento elevado, a largo plazo de proteínas recombinantes, la expresión estable se prefiere. Por ejemplo, las líneas celulares las cuales expresan establemente un anticuerpo de la invención pueden diseñarse. En lugar de utilizar vectores de expresión los cuales contienen orígenes virales de replicación, las células huéspedes pueden transformarse con ADN controlado por los elementos de control de expresión apropiada (por ejemplo, promotor, mejorador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, las células diseñadas pueden permitirse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego intercambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar establemente el plásmido dentro de sus cromosomas y desarrollarse para formar un foco el cual a su vez puede clonarse y expandirse dentro de las líneas celulares. Este método puede utilizarse ventajosamente para diseñar líneas celulares las cuales expresan los anticuerpos de la invención. Tales líneas celulares diseñadas pueden ser particularmente útiles para selección y evaluación de compuestos que interactúan directa o indirectamente con los anticuerpos de la invención. Un número de sistemas de selección puede utilizarse, incluyendo pero sin limitarse a la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et ai., 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 48:202.), y genes de adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et ai., 1980, Cell 22:817) pueden emplearse en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. También, la resistencia a metabolitos puede utilizarse como la base de selección para los siguientes genes: dhfr, el cual confiere resistencia a metotrexato (Wigler et ai., 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al . , 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, el cual confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, el cual confiere resistencia al aminoglicósido G-418 Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1991, 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11 (5) : 155-215) . Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de AND recombinante los cuales pueden utilizarse se describen en Ausubel et al . , (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et ai. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY; Colberre-Garapin et ai., 1981, J. Mol. Biol. 150:1; e hygro, el cual confiere resistencia a higromicina (Santerre et ai., 1984, Gene 30:147) . Los niveles de expresión de un anticuerpo de la invención pueden incrementarse por amplificación de vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, El uso de vectores basados en amplificación genética para la expresión de genes clonados en células de mamífero en clonación de ADN, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema vector que expresa un anticuerpo es amplificable, el incremento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de . la célula huésped incrementará el número de copias del gen marcador. Ya que la región amplificada se asocia con la secuencia de nucleótido del anticuerpo, la producción del anticuerpo también se incrementará (Crouse et ai., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257). La célula huésped puede co-transfectarse con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de cadena pesada y el segundo vector codificando un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos los cuales permiten igual expresión de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, un vector sencillo puede utilizarse, el cual codifica tanto los polipéptidos de cadena pesada como ligera. En tales situaciones, la cadena ligera debe colocarse antes de la cadena pesada para prevenir un exceso de cadena pesada libre de tóxicos (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:2197). Las secuencias de codificación para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genómico. Una vez que el anticuerpo de la invención se ha expresado recombinantemente, éste puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de un anticuerpo, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad para el antígeno específico después de la Proteína A, y medición de cromatografía de columna) , centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. .4 MÉTODOS PROFILÁCTICO Y TERAPÉUTICO La presente invención abarca terapias basadas en anticuerpos las cuales implican administrar uno o más de los anticuerpos de la invención a un animal, de preferencia un mamífero, y más preferiblemente un ser humano, para prevenir, tratar o mejorar síntomas asociados con una enfermedad trastorno o infección, asociado con niveles aberrantes o actividad de Fc?RIIB y/o tratables al alterar la función inmune asociada con actividad de Fc?RIIB o mejorando la actividad citotóxica de un segundo anticuerpo terapéutico o mejorando la eficacia de una composición de vacuna. En algunas modalidades, la terapia por administración de uno o más anticuerpos de la invención se combina con la administración de una o más terapias tales como, pero sin limitarse a quimioterapias, terapias por radiación, terapias hormonales y/o terapias/inmunoterapias biológicas. Pueden proporcionarse anticuerpos en composiciones farmacéuticamente aceptables como se sabe en la técnica o como se describe en la presente. Como se detalla posteriormente, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en los métodos para .tratar cáncer (particularmente para mejorar la inmunoterapia pasiva o eficacia de una vacuna contra cáncer) , enfermedad autoinmune, trastornos inflamatorios o alergias (por ejemplo, para mejorar la eficacia de una vacuna para el tratamiento de alergia) . Se ha encontrado que Fc?RIIB (CD32B) se expresa en los siguientes tipos de tejido: adiposo, de célula b, de hueso, de cerebro, de cartílago, de colon, endocrino, del ojo, de feto, de tracto gastrointestinal, genitourinario, de célula germinal, de cabeza y de cuello, de riñon, de pulmón, de nodulo linfático, linforeticular, de glándula mamaria, de músculo, nervioso, . de ovario, de páncreas, de isleta pancreática, de glándula pituitaria, de placenta, de retina, de piel, tejido suave, sinovio y de útero (datos recolectados de the Cáncer Genome Anatomy Project of the National Cáncer Institute) . De este modo, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para agonizar o antagonizar la actividad de Fc?RIIB en cualquiera de estos tejidos. Por ejemplo, Fc?RIIB se expresa en la placenta y puede jugar un papel en el transporte de IgG al feto y también en desechar complejos inmunes (Lyden et ai., 2001, J. Immunol . 166:3882-3889). En ciertas modalidades de la invención, un anticuerpo anti-Fc?RIIB puede utilizarse como un abortivo. La presente invención ha encontrado que los neutrófilos sorprendentemente no expresan niveles significativos de FC?RIIB. Por consiguiente, la invención proporciona métodos y composiciones farmacéuticas para uso en estos métodos, comprendiendo una cantidad de anticuerpo específico de CD32 que se enlaza a, y tiene una actividad en células tumorales o tipos de células sin neutrófilos, tales como macrófagos, pero no se enlazan detectablemente o tienen actividad detectable en neutrófilos. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para eliminar células CD32B+, tales como macrófagos o células tumorales que expresan CD32B. Los anticuerpos de la presente invención que funcionan como profiláctico y, o agente terapéutico de una enfermedad trastorno o infección pueden administrarse a un animal, de preferencia un mamífero, y más preferiblemente un ser humano, para tratar, prevenir o mejorar uno o más síntomas asociados con la enfermedad, trastorno o infección. Los anticuerpos de la invención pueden administrarse en combinación con uno o más agentes profilácticos y/o terapéuticos útiles en el tratamiento, prevención o manejo de una enfermedad, trastorno o infección asociado con niveles aberrantes o actividad de Fc?RIIB y/o tratables al alterar la función inmune asociada con actividad de Fc?RIIB. En ciertas modalidades, uno o más anticuerpos de la invención se administran a un mamífero, de preferencia un ser humano, al mismo tiempo con uno o más diferentes agentes terapéuticos útiles para el tratamiento de cáncer. El término "al mismo tiempo" no se limita a la administración de agentes profilácticos o terapéuticos a exactamente el mismo tiempo, sino más bien significa que los anticuerpos de la invención y el otro agente se administran a un sujeto en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo de manera que los anticuerpos de la invención puedan actuar juntos con el otro agente para proporcionar un beneficio incrementado que si se administraran de otro modo. Por ejemplo, cada agente profiláctico o terapéutico puede administrarse al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden en diferentes puntos de tiempo; sin embargo, si no se administran al mismo tiempo, estos deben administrarse lo suficientemente cerca en tiempo de manera que se proporcione el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Cada agente terapéutico puede administrase de forma separada, en cualquier forma apropiada y por cualquier ruta adecuada. En varias modalidades, los agentes profiláctico o terapéutico se administran con menos de 1 hora de diferencia, en aproximadamente 1 hora de diferencia, en aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas de diferencia, en aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de diferencia, en aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de diferencia, en aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de diferencia, en aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de diferencia, en aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de diferencia, en aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de diferencia, en aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de diferencia, en aproximadamente 8 horas a aproximadamente 10 horas de diferencia, en aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas de diferencia, en aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas de diferencia, no más de 24 horas de diferencia o no más de 48 horas de diferencia. En las modalidades preferidas, dos o más componentes se administran dentro de la misma visita del paciente. Las cantidades de dosis y frecuencias de administración provistas en la presente están abarcadas por los términos terapéuticamente efectivo y profilácticamente efectivo. La dosis y frecuencia variarán además normalmente de acuerdo a factores específicos para cada paciente dependiendo de los agentes terapéuticos o profilácticos específicos administrados, la severidad y el tipo de cáncer, la ruta de administración, así como la edad, el peso corporal, la respuesta y la historia clínica pasada del paciente. Los regímenes adecuados pueden seleccionarse por un experto en la técnica al considerar tales factores y siguiendo por ejemplo, las dosis reportadas en la literatura y recomendadas en the Physician's Desk Reference (56a ed. , 2002) . Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse también ventajosamente en combinación con otros anticuerpos monoclonales o quiméricos, proteínas de fusión Fc, o con linfocinas, citocinas o factores de crecimiento hematopoyéticos (tales como por ejemplo, IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-10 y TGF-ß) , los cuales mejoran Fc?RIIB, por ejemplo sirven para incrementar el número de actividad de células efectoras las cuales interactúan con los anticuerpos e incrementan la respuesta inmune. En ciertas modalidades, una citoquina se conjuga a un anticuerpo anti-Fc?RIIB. Los anticuerpos de esta invención pueden utilizarse también ventajosamente en combinación con uno o más fármacos utilizados para tratar una enfermedad, trastorno o infección tal como por ejemplo, agentes anti-cáncer, agentes antiinflamatorios o agentes anti-virales, por ejemplo, como se detalle en las secciones 5.4.6 y 5.4.5 posteriormente. .4.1 CANCERES Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse solos o en combinación con otros anticuerpos terapéuticos conocidos en la técnica para prevenir, inhibir o reducir el crecimiento de tumores primarios o metástasis de células cancerosas. En una modalidad, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en combinación con los anticuerpos utilizados en inmunoterapia de cáncer. La invención abarca el uso de los anticuerpos de la invención en combinación con otro anticuerpo terapéutico para mejorar la eficacia de tal inmunoterapia incrementando la potencia de la función efectora del anticuerpo terapéutico, por ejemplo, ADCC, CDC, fagocitosis, opsonización, etc. Aunque no se pretende estar unido por un mecanismo particular de acción, los anticuerpos de la invención bloquean Fc?RIIB, de preferencia en monocitos y macrófagos y de este modo mejoran los beneficios terapéuticos de una eficacia clínica de anticuerpos específicos de tumor, por ejemplo, mejorando la eliminación de tumores mediada al activar Fc?Rs. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para prevenir o tratar cáncer, caracterizados por un antígeno cancerígeno, cuando se administra en combinación con otro anticuerpo que enlaza específicamente un antígeno cancerígeno y es citotóxico. Los anticuerpos de la invención son útiles para la prevención o el tratamiento de cáncer, particularmente al potencializar la actividad citotóxica de anticuerpos terapéuticos específicos de antígenos cancerígenos con actividad citotóxica para mejorar la exterminación de células tumorales por los anticuerpos de la invención y/o mejorando por ejemplo, la actividad de ADCC o actividad de CDC de los anticuerpos terapéuticos. En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos de la invención se administran con proteínas de fusión Fc. En una modalidad específica, un anticuerpo de la invención, cuando se administra solo o en combinación con un anticuerpo terapéutico citotóxico inhibe o reduce el crecimiento de tumor primario o metástasis de células cancerosas por al menos 99%, al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 35%, al menos 30%, al menos 25%, al menos 20% o al menos 10% con relación al crecimiento de tumor primario o metástasis en ausencia del anticuerpo de la invención. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención en combinación con un anticuerpo terapéutico citotóxico inhiben o reducen el crecimiento de tumor primario o metástasis de cáncer por al menos 99%, al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 35%, al menos 30%, al menos 25%, al menos 20%, o al menos 10% con relación al crecimiento o metástasis en ausencia de tales anticuerpos. La transición a partir de un estado normal a maligno es un proceso de etapas múltiples que implica cambios genéticos y epigenéticos . De hecho, ocurren numerosas alteraciones en los circuitos regulatorios celulares que facilitan este progreso lo cual permite a las células tumorales evadir el propósito para diferenciación terminal y latencia que regula normalmente la homeostasis de tejido. Ciertos genes se han implicado en la invasión y potencial metastático de células cancerígenas tales como CSF-1 (factor 1 que estimula la colonia o factor que estimula la colonia de macrófagos) . Aunque no se pretende estar unido por un mecanismo particular de acción, CSF-1 puede medir el progreso tumoral y metástasis reclutando macrófagos al sitio de tumor en donde estos promueven el progreso de tumor. Se cree que los macrófagos tienen un papel trófico para medir el progreso del tumor y la metástasis quizás por la secreción de factores angiogénicos, por ejemplo, timidina fosforilasa, factor de crecimiento derivado endotelial vascular; secreción de factores de crecimiento tales como factor de crecimiento epidérmico que podría actuar como un factor de paracrina en células tumorales, y promoviendo así la migración de células tumorales y la invasión en vasos sanguíneos (Véase por ejemplo, Lin et ai., 2001, J. Exp. Med. 193(6): 727-739; Lin et ai., 2002, Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasm 7(2): 147-162; Scholl et al . , 1993, Molecular Carcinogenesis, 7: 207-11; Clynes et ai., 200, Nature Medicine, 6(4): 443-446; Fidler et ai., 1985, Cáncer Research, 45: 4714-26). La invención abarca utilizar los anticuerpos de la invención para bloquear el progreso de células tumorales mediadas por macrófagos y metástasis. Los anticuerpos de la invención son particularmente útiles en el tratamiento de tumores sólidos, en donde ocurre la infiltración de macrófagos. Los anticuerpos agonísticos de la invención son particularmente útiles para controlar por ejemplo, reducir o eliminar, metástasis de células tumorales, reduciendo o eliminando la población de macrófagos que se ubican en el sitio de tumor. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se utilizan solos para controlar metástasis de células tumorales. Aunque no se pretende estar unido por un mecanismo particular de acción de los anticuerpos antagonísticos de la invención, cuando se administran solos enlazan el Fc?RIIB inhibidor en macrófagos y reducen efectivamente la población de macrófagos y de este modo restringen el progreso de células tumorales. Los anticuerpos antagonísticos de la invención reducen o de preferencia eliminan macrófagos que se ubican en el sitio del tumor, ya que Fc?RIIB se expresa de preferencia en monocitos y macrófagos activados incluyendo macrófagos de infiltración de tumor. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se utilizan en el tratamiento de cánceres que se caracterizan por la sobre-expresión de CSF-1, incluyendo, pero sin limitarse a cánceres de mama, uterino y de ovario. La invención abarca además anticuerpos que reducen o eliminan efectivamente células inmunes diferentes de macrófagos que expresan Fc?RIIB, por ejemplo, células dendríticas y células B. La reducción o eliminación efectiva de células inmunes utilizando los anticuerpos de la invención puede variar desde una reducción en la población de las células inmunes por 50%, 60%, 70%, 80%, de preferencia 90% y más preferiblemente 99%. De este modo, los anticuerpos de la invención tienen eficacia terapéutica mejorada ya sea solos o en combinación con un segundo anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo terapéutico tal como anticuerpos anti-tumorales, anticuerpos anti-virales y anticuerpos anti-microbiales . En algunas modalidades, los anticuerpos terapéuticos tienen especificidad para una célula cancerígena o una célula inflamatoria. En otras modalidades, el segundo anticuerpo enlaza una célula normal. Aunque no se pretende estar unido por un mecanismo particular de acción, cuando los anticuerpos de la invención se utilizan solos para reducir Fc?RIIB que expresa células inmunes, la población de células se redistribuye de manera que efectivamente las células que siguen ahí tienen los receptores Fc de activación y de este modo la supresión por Fc?RIIB se suaviza. Cuando se utiliza en combinación un segundo anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo terapéutico la eficacia del segundo anticuerpo se mejora incrementando la función efectora mediada por Fc del anticuerpo. Los cánceres y trastornos relacionados que pueden tratarse o prevenirse por métodos y composiciones de la presente invención incluyen, pero no se limitan a los siguientes: Leucemias incluyendo, pero sin limitarse a leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemias mielocíticas agudas, tales como leucemias mieloblásticas, promielocíticas, mielomonocíticas, monolíticas, de eritroleucemia y síndrome mielodisplásico, leucemias crónicas tales como, pero sin limitarse a leucemia mielocítica crónica (granulocítica) , leucemia linfocítica crónica, leucemia de célula por tricoleucitos; policitemia vera; linfomas tales como, pero sin limitarse a enfermedad de Hodgkin, enfermedad no Hodgkin; mielomas múltiples tales como, pero sin limitarse a mieloma múltiple abrasador, mieloma no secretorio, mieloma osteoesclerótico, leucemia de célula de plasma, plasmacitoma solitario y plasmacitoma extramedular; macroglulinemia de Waldenstrom; gamopatía monoclonal de significado indeterminado; gamopatía monoclonal benigno; enfermedad de cadena pesada; sarcomas de hueso y de tejido conectivo tales como, pero sin limitarse a sarcoma de hueso, osteosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, tumor celular gigante maligno, fibrosarcoma de hueso, chordoma, sarcoma periosteal, sarcomas de tejido suave, angiosarcoma (hemangiosarcoma) , fibrosarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, neurilemoma, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial; tumores cerebrales incluyendo pero sin limitarse a, glioma, astrocitoma, glioma de tronco encefálico, ependimoma, oligodendroglioma, tumor no glial, neurinoma acústico, craniofaringioma, meduloblastoma, meningioma, pineocitoma, pineoblastoma, linfoma cerebral primario; cáncer de mama incluyendo, pero sin limitarse a adenocarcinoma, carcinoma lobular (célula pequeña) , carcinoma intraductal, cáncer de mama medular, cáncer de mama mucoso, cáncer de mama tubular, cáncer de mama papilar, enfermedad de Paget, y cáncer de mama inflamatorio; cáncer adrenal, incluyendo, pero sin limitarse a, carcinoma feocromocitoma y adrenocortical; cáncer de la tiroides tal como, pero sin limitarse a cáncer de la tiroides papilar y folicular, cáncer de la tiroides medular y cáncer de la tiroides anaplásico; cáncer pancreático, incluyendo, pero sin limitarse a insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, vipoma, tumor que secreta somatostatina, y carcinoide o tumor celular de isleta; cánceres de la pituitaria incluyendo pero sin limitarse a enfermedad de Cushing, tumor que secreta prolactina, acromegalia, y diabetes insípida; cánceres de ojos incluyendo pero sin limitarse a melanoma ocular tal como melanoma de iris, melanoma coroidal y melanoma de cuerpo ciliar y retinoblastoma; cánceres vaginales, incluyendo, pero sin limitarse a, carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma y melamona; cáncer vulvar, incluyendo pero sin limitarse a carcinoma de célula escamosa, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma de célula basal, sarcoma y enfermedad de Pager; cánceres cervicales incluyendo, pero sin limitarse a, carcinoma de célula escamosa y adenocarcinoma; cánceres uterinos incluyendo, pero sin limitarse a carcinoma endometrial y sarcoma uterino; cánceres de ovario incluyendo, pero sin limitarse a carcinoma epitelial de ovario, tumor dudoso, tumor de célula germinal y tumor estromal; cánceres esofágicos incluyendo, pero sin limitarse a cáncer escamoso, adenocarcinoma carcinoma cístico adenoide, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma adenoescamoso, sarcoma, melanoma, plasmacitoma, carcinoma verrugoso, y carcinoma de células en granos de avena (célula pequeña) ; cánceres de estómago incluyendo, pero sin limitarse a adenocarcinoma, tumor fungoso (polipoide) , ulceración, dispersión superficial, dispersión dilatada, linfoma maligno, liposarcoma, fibrosarcoma y carcinosarcoma; cánceres de colon; cánceres rectales; cánceres hepáticos incluyendo, pero sin limitarse a carcinoma hepatocelular y hepatoblastoma, cánceres de vesícula biliar incluyendo, pero sin limitarse a adenocarcinoma; colangiocarcinomas incluyendo, pero sin limitarse a papilar, nodular y difuso; cánceres de pulmón incluyendo, pero sin limitarse a cáncer de pulmón de célula no pequeña, carcinoma de célula escamosa (carcinoma epidermoide) , adenocarcinoma, carcinoma de célula grande y cáncer de pulmón de célula pequeña; cánceres testiculares incluyendo, pero sin limitarse a tumor germinal, seminoma, anaplástico, clásico (típico) , espermatocítico, no seminoma, carcinoma embrional, carcinoma de teratoma, coriocarcinoma (tumor de saco vitelino) , cánceres de próstata incluyendo, pero sin limitarse a adenocarcinoma, leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma; cánceres de pene; cánceres orales incluyendo pero sin limitarse a carcinoma celular escamoso; cánceres básales; cánceres de glándula salival incluyendo, pero sin limitarse a adenocarcinoma, carcinoma mucoepidermoide, y carcinoma adenoide cístico; cánceres de la faringe incluyendo, pero sin limitarse a cáncer celular escamoso, y verrugoso; cánceres de piel incluyendo pero sin limitarse a, carcinoma de célula basal, carcinoma de célula escamosa y melanoma, melanoma de dispersión superficial, melanoma nodular, melanoma maligno de lunar, melanoma lentigoso acral; cánceres de riñon incluyendo pero sin limitarse a cáncer de célula renal, adenocarcinoma, hipernefroma, fibrosarcoma, cáncer de célula transitoria (pelvis renal y/o útero) ; tumor de Wilm; cánceres de vejiga incluyendo, pero sin limitarse a carcinoma de célula transitoria, cáncer de célula escamosa, adenocarcinoma, carcinosarcoma. Además, los cánceres incluyen mixosarcoma, sarcoma osteogénico, endoteliosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, mesotelioma, sinovioma, hemangioblastoma, carcinoma epitelial, cistadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma de glándulas de transpiración, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar y adenocarcinomas papilares (para una revisión de tales trastornos, véase Fishman et al . , 1985, Medicine, 2a edición, J.B. Lippincott Co., Philadelphia y Murphy et al . , 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cáncer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America). Por consiguiente, los métodos y composiciones de la invención son también útiles en el tratamiento o prevención de una variedad de cánceres u otras enfermedades proliferativas anormales, incluyendo (pero sin limitarse a) lo siguiente: carcinoma, incluyendo aquel de la vejiga, mama, colon, riñon, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cerviz, tiroides y piel; incluyendo carcinoma de célula escamosa; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma de Berketts; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluyendo leucemias mielógenas aguda y crónica y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; otros tumores, incluyendo melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwanomas; tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, y osteosarcoma; y otros tumores, incluyendo melanoma, xenoderma pigmentoso, queratoactantorna, seminoma, cáncer folicular de la tiroides y teratocarcinoma. Se contempla también que los cánceres provocados por aberraciones en apóptosis se tratarían también por los métodos y composiciones de la invención. Tales cánceres pueden incluir, pero sin limitarse a linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones p53, tumores dependientes de hormonas de la mama, próstata y ovario y lesiones pre-cancerosas tales como poliposis adenomatoso familiar y síndromes mielodisplásicos . En modalidades específicas, los cambios malignos o disproliferativos (tales como metaplasias y displasias) , o trastornos hiperproliferativos, se tratan o evitan por los métodos y composiciones de la invención en el ovario, vejiga, mama, colon, pulmón, piel, páncreas o útero. En otras modalidades específicas, sarcoma, melanoma o leucemia se trata o evitan por los métodos y composiciones de la invención. Los cánceres asociados con los antígenos cancerígenos pueden tratarse o prevenirse por la administración de los anticuerpos de la invención en combinación con un anticuerpo que enlaza el antígeno cancerígeno y es citotóxico. En una modalidad particular, los anticuerpos de la invención mejoran el efecto citotóxico mediado por anticuerpos del anticuerpo dirigido en el antígeno cancerígeno particular. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los cánceres asociados con el siguiente antígeno cancerígeno pueden tratarse o prevenirse por los métodos y composiciones de la invención. Antígeno pan-carcinoma KS (Pérez y Walter, 1990, J. Immunol. 142:32-37; Bumal, 1988, Hybridoma 7 (4) : 407-415) , antígeno de carcinomas de ovario (CA125) (Yu et ai., 1991, Cáncer Res. 51(2) : 48- 475), fosfato de ácido prostático (Taylor et ai., 1990, Nucí.

Acids Res. 18(1):4928), antígeno específico de próstata (Henttu y Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 10 (2) : 903-910; Israeli et ai., 1993, Cáncer Res. 53:227-230), antígeno p97 asociado con melanoma (Estin et ai., 1989, J.

Nati. Cáncer Instit. 81 (6) : 445-44) , antígeno gp75 de melanoma (Vijayasardhl et ai., 1990, J. Exp. Med. 171 (4) : 1375-1380) , antígeno de melanoma de peso molecular elevado (HMW-MAA) (Natali et ai., 1987, Cáncer 59:55-3; Mittelman et ai., 1990, J. Clin. Invest. 86:2136-2144)), antígeno de membrana específica de próstata, antígeno carcinoembriónico (CEA) (Foon et al . , 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13:294), antígeno de mucina epitelial polimórfico, antígeno de glóbulo humano de grasa láctea, antígenos asociados con tumor coló-rectal tales como: CEA, TAG-72 (Yokata et ai., 1992, Cáncer Res. 52:3402-3408), C017-1A (Ragnhammar et ai., 1993, Int. J. Cáncer 53:751-758); GICA 19-9 (Herlyn et ai., 1982, J. Clin. Immunol. 2:135), CTA-1 y LEA, antígeno-38.13 de linfoma de Burkitt, CD19 (Ghetie et ai., 1994, Blood 83:1329-1336), antígeno CD20 de linfoma B humano (Ref. et ai., 1994, Blood 83:435-445), CD33 (Sgouros et al . , 1993, J. Nucí. Med. 34:422-430), antígenos específicos de melanoma tales como gangliosida GD2 (Saleh et ai., 1993, J. Immunol . , 151, 3390-3398), gangliosida GD3 (Shitara et ai., 1993, Cáncer Immunol . Immunother, 36:373-380), gangligosida GM2 (Livingston et al . , 1994, J. Clin. Oncol. 12:1036-1044), gangliosida GM3 (Hoon et ai., 1993, Cáncer Res. 53:5244-5250), tipo de transplante específico de tumor de antígeno de superficie celular (TSTA) tal como antígenos de tumor viralmente inducidos incluyendo virus de tumor de ADN de antígeno T y antígenos envolventes de virus de tumor de ARN, antígeno-alfa-fetoproteína oncofetal tal como CEA de colon, antígeno oncofetal de tumor de vejiga (Hellstrom et al . , 1985, Cáncer, Res. 45:2210-2188), antígeno de diferenciación tal como antígeno L6, L20 de carcinoma de pulmón humano (Hellstrom et al . , 1985, Cáncer Res. 46:3917-3923), antígenos de fibrosarcoma, antígeno-Gp37 de célula T de leucemia humana (Bhattacharya-Chatterjee et ai., 1988, J. of Immun. 141:1398-1403), neoglicoproteína, esfingolípidos, antígeno de cáncer de mama tal como EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) , antígeno HER2 (pl85HER2) , mucina epitelial polimórfica (PEM) (Hilkens et ai., 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359), antígeno-APO-1 de linfocito humano maligno (Bernhard et ai., 1989, Science 245:301-304), antígeno de diferenciación (Feizi, 1985, Nature 314:53-57) tal como antígeno I encontrado en eritrocitos fetales y endodermo primario, I (Ma) encontrado en adenocarcinomas gástricos, M18 y M39 encontrado en epitelio de seno, SSEA-1 encontrado en células de mieloma, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5 y Dj.56-22 encontrado en cáncer de colesterol. TRA-1-85 (grupo sanguíneo H) , C14 encontrado en adenocarcinoma colónico, F3 encontrado en adenocarcinoma de pulmón, AH6 encontrado en cáncer gástrico, hapteno Y, Le? encontrado en células de carcinoma embrional, TL5 (grupo A sanguíneo) , receptor de EGF encontrado en células A431, serie Ei (grupo B sanguíneo) encontrado en cáncer pancreático, FC10.2 encontrado en células carcinomas embrionales, adenocarcinoma gástrico, CO-514 (grupo Le sanguíneo) , encontrado en adenocarcinoma, NS-10 encontrado en adenocarcinomas, CO-43 (grupo Leb sanguíneo) , G49, receptor EGF (grupo Aleb/Le? sanguíneo) encontrado en adenocarcinoma colónico, 19.9 encontrado en cáncer de colon, mucinas del cáncer gástrico, Ts 7 encontrado en células mieloides, R24 encontrado en melanoma, 4.2, GD3, Dl.l, OFA-1, GM2,OFA-2, GD2, Ml:22:25:8 encontrado en células de carcinoma embrional y SSEA-3, SSEA-4 encontrados en embriones en periodo de 4-8 células. En otra modalidad, el antígeno es un receptor de célula T derivado de péptido a partir de un linfoma de célula T cutánea (véase Edelson, 1998, The Cáncer Journal 4:62). Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en combinación con cualesquiera anticuerpos de cáncer terapéutico conocidos en la técnica para mejorar la eficacia de tratamiento. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse con cualquiera de los anticuerpos en la Tabla 7, que han demostrado utilidad terapéutica en tratamiento de cáncer. Los anticuerpos de la invención mejoran la eficacia de tratamiento de los anticuerpos cancerígenos terapéuticos mejorando al menos una función efectora mediada por anticuerpos de los anticuerpos cancerígenos terapéuticos. En una modalidad particular, los anticuerpos mejoran la eficacia de tratamiento mejorando la cascada dependiente de complemento de los anticuerpos cancerígenos terapéuticos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención mejoran la eficacia del tratamiento al mejorar la fagocitosis y opsonización de las células tumorales objetivo. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención mejoran la eficacia de tratamiento al mejorar citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos ("ADCC") en la destrucción de las células tumorales objetivo.

Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en combinación con dinucleótidos de productos basados en citosina-guanina ("CpG") que se han desarrollado (Coley Pharmaceuticals) o están siendo actualmente desarrollados como activadores de respuestas innatas e inmunoadquiridas . Por ejemplo, la invención abarca el uso de CpG 7090, CpG 8916, CpG 8954 (Coley Pharmaceuticals) en los métodos y composiciones de la invención para el tratamiento y/o la prevención de cáncer (Véase también Warren et ai., 2002, Semen Oncol., 29(1 Suppl 2):93-7; Warren et ai., 2000, Clin Lymphoma, 1(1): 57-61, los cuales se incorporan en la presente para referencia) . Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en combinación con un anticuerpo terapéutico que no media su efecto terapéutico a través de exterminio celular para potencializar la actividad terapéutico del anticuerpo. En una modalidad especifica, la invención abarca el uso de los anticuerpos de la invención en combinación con una apoptosis terapéutica que induce anticuerpo con actividad agonística, por ejemplo, un anticuerpo anti-Fas. Los anticuerpos anti-Fas se conocen en la técnica e incluyen por ejemplo, Jo2 (Ogasawara et al . , 1993, Nature 364: 806) y HFE7 (Ichikawa et ai., 2000, Int. Immunol. 12:555). Aunque no se pretende estar unido por un mecanismo particular de acción, Fc?RIIB ha sido implicado en promover apoptosis mediada por anti-Fas, véase por ejemplo, Xu et ai., 2003, Journal of Immunology, 171:562-568. De hecho, el dominio extracelular de Fc?RIIB puede servir como un agente de reticulación para receptores Fas, conduciendo a un complejo funcional y promoviendo apoptosis dependiente de Fas. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención bloquean la interacción de anticuerpos anti-Fas y Fc?RIIB, conduciendo a una reducción en actividad apoptótica mediada por Fas. Los anticuerpos de la invención que resultan en una reducción en actividad apoptótica mediada por Fas son particularmente útiles en combinación con anticuerpos anti-Fas que tienen efectos secundarios indeseables, por ejemplo, hepatotoxicidad. En otras modalidades, los anticuerpos de la invención mejoran la interacción de anticuerpos anti-Fas y Fc?RIIB, conduciendo a un mejoramiento de actividad apoptótica mediada por Fas. La combinación de los anticuerpos de la invención con apoptosis terapéutica induciendo anticuerpos con actividad agonística tiene una eficacia terapéutica mejorada. Los anticuerpos que inducen apóptosis terapéutica en los métodos de la invención pueden ser específicos para cualquier receptor de muerte conocido en la técnica para la modulación de trayectoria apoptótica, por ejemplo, la familia del receptor TNFR. La invención proporciona un método para tratar enfermedades con señalización mediada apoptótica deteriorada, por ejemplo, cáncer, enfermedad autoinmune. En una modalidad específica, la invención abarca un método para tratar una enfermedad con apoptosis mediada por Fas deficiente, el método comprende administrar un anticuerpo de la invención en combinación con un anticuerpo anti-Fas. En algunas modalidades, los anticuerpos agonísticos de la invención son particularmente útiles para el tratamiento de tumores de origen no hematopoyético, incluyendo tumores de células de melanoma. Aunque no se pretende estar unido por un mecanismo particular de acción, la eficiencia de los anticuerpos agonísticos de la invención se debe, en parte, a la activación de trayectoria inhibidora Fc?RIIB, como tumores de origen no hematopoyético, incluyendo tumores de Fc?RIIB que expresan células de melanona. Los experimentos recientes han mostrado de hecho que la expresión de Fc?RIIB en células de melanoma modula el crecimiento tumoral por interacción directa con anticuerpos anti-tumor (por ejemplo, enlazando la región Fc de los anticuerpos antitumor) en una manera dependiente intracitoplásmica (Cassard et ai., 2002, Journal of Clinical Investigation, 110(10): 1549-1557) . En algunas modalidades, la invención abarca el uso de los anticuerpos de la invención en combinación con anticuerpos terapéuticos que se enlazan inmunoespecíficamente a antígenos tumorales que no se expresan en las células tumorales mismas, sino más bien en el reactivo circundante y el soporte de tumor, células no malignas que comprenden el estroma de tumor. El estroma de tumor comprende células endoteliales que forman nuevos vasos sanguíneos y fibroblastos estromales que corean la vasculatura tumoral. En una modalidad específica, un anticuerpo de la invención se utiliza en combinación con un anticuerpo que enlaza inmunoespecíficamente un antígeno tumoral en una célula endotelial. En una modalidad preferida, un anticuerpo de la invención se utiliza en combinación con un anticuerpo que enlaza inmunoespecíficamente un antígeno tumoral en una célula de fibroblastos, por ejemplo, proteína de activación de fibroblasto (FAP) . FAP es una glicoproteína del tipo II homodimérico de 95 KDa la cual se expresa altamente en fibroblastos estromales de muchos tumores sólidos, incluyendo, pero sin limitarse a carcinomas pulmonares, de mama y colo-rectales (Véase por ejemplo, Scanlan et ai., 1994; Proc. Nati. Acad. USA, 91: 5657-61; Park et ai., 1999, J. Biol. Chem. 274: 36505-12; Retting et ai., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:3110-3114; Garin-Chesea et ai., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 7235-7239). Los anticuerpos que enlazan inmunoespecíficamente FAP se conocen en la técnica y están abarcados dentro de la invención, véase por ejemplo, Wuest et ai., 2001, Journal of Biotechnology, 159-168; Mersmann et ai., 2001, Int. J. Cáncer, 92: 240-248; Patente Norteamericana No. 6,455,677; todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades. Recientemente, las IgE han estado implicadas como mediadores de crecimiento tumoral y de hecho la hipersensibilidad inmediata objetivo de IgE y las reacciones de inflamación alérgica se han propuesto como posibles mecanismos naturales implicados en respuestas anti-tumor (Para una revisión véase por ejemplo, Mills et ai., 1992. Am.

Journal of Epidemiol. 122: 66-74; Eriksson et ai., 1995, Allergy 50: 718-722). De hecho un estudio reciente ha demostrado que cargar células tumorales con IgEs reduce el crecimiento tumoral, conduciendo en algunos casos a rechazo de tumor. De acuerdo al estudio, las células tumorales cargadas a IgE no sólo poseen un potencial terapéutico, sino también confieren inmunidad antitumor a largo plazo, incluyendo activación de mecanismo efector de inmunidad innata y respuesta inmune adaptiva mediada por células T, véase Reali et ai., 2001, Cáncer res. 61:5516-22; la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Los anticuerpos antagonísticos de la invención pueden utilizarse en el tratamiento y/o la prevención de cáncer en combinación con la administración de IgEs con el fin de mejorar la eficacia de terapia cancerígena mediada por IgE. Aunque no se pretende estar unido por un mecanismo particular de acción, los anticuerpos de la invención mejoran la eficacia terapéutica del tratamiento de IgE de tumores, bloqueando la trayectoria inhibidora. Los anticuerpos antagonísticos de la invención pueden mejorar la eficacia terapéutica de terapia de cáncer mediada por IgE (i) mejorando el retardo de crecimiento tumoral; (ii) mejorando la disminución en la velocidad de progreso de tumor; (iii) mejorando rechazo de tumor; o (iv) mejorando la protección inmune con relación al tratamiento de cáncer con IgE solo. Las terapias de cáncer y sus dosis, rutas de administración y uso recomendado se conocen en la técnica y se han descrito en la literatura, véase por ejemplo, Physician's Desk Reference (56a edición, 2002, la cual se incorpora en la presente para referencia) . .4.1.1 MALIGNIDADES DE CÉLULA B La presente invención abarca terapias las cuales implican administrar un anticuerpo anti-Fc?RIIB a un animal, de preferencia un mamífero, y más preferiblemente un ser humano, para prevenir, tratar, manejar o mejorar la malignidad de células B, o uno o más síntomas de las mismas. Estas terapias son una mejora sobre las terapias actuales. En ciertos casos, los pacientes quienes no reaccionan a las terapias actuales pueden tratarse con los métodos de la invención. En algunas modalidades, la terapia por administración de uno o más anticuerpos de la invención se combina con la administración de una o más terapias tales como, pero sin limitarse a quimioterapias, terapias por radiación, terapias hormonales y/o terapias/inmunoterapias biológicas . La presente invención abarca los protocolos de tratamiento que proporcionan mejores perfiles profilácticos y terapéuticos que las terapias de agente sencillo actuales o terapias de combinación para una malignidad de células B, o uno o más síntomas de los mismos. La invención proporciona anticuerpo Fc?RIIB basado en terapias para la prevención, tratamiento, manejo o mejora de una malignidad de células B, o uno o más síntomas de los mismos. En particular, la invención proporciona protocolos profilácticos y terapéuticos para la prevención, tratamiento, manejo o mejora de una malignidad de células B, o uno o más síntomas de los mismos, que comprende la administración de un anticuerpo específico de Fc?RIIB, un análogo, derivado o un fragmento de antígeno del mismo a un sujeto con necesidad del mismo. Los anticuerpos agonísticos de la invención son útiles para tratar o prevenir cualesquiera malignidades de células B, particularmente linfoma no Hodgkin y leucemia linfocítica crónica. Otras malignidades de célula B incluyen linfoma linfocítico pequeño, linfoma de Burkitt, linfomas de célula protectora, linfomas de célula desdoblada pequeña, difusa, linfomas más foliculares y algunos linfomas de célula B grande difusa (DLBCL) , Fc?RIIB, es un objetivo para la desregulación de postdesplazamiento en linfoma maligno, particularmente en linfoma no Hodgkin de célula B (Véase Callanan M.B. et al . , 2000 Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 97 (1) : 309-314) . De este modo, los anticuerpos de la invención son útiles para tratar o prevenir cualquier leucemia linfocítica crónica del linaje de células B. La leucemia linfocítica crónica del linaje de células B se revisan por Freedman (Véase revisión por Freedman, 1990, Hematol. Oncol. Clin. North. Am. 4:405). Aunque no se pretende estar unido por ningún mecanismo de acción, los anticuerpos agonísticos de la invención inhiben o evitan malignidades de células B inhibiendo proliferación y/o activación de células B. La invención también abarca el uso de anticuerpos agonísticos de la invención en combinación con otras terapias conocidas (por ejemplo, quimioterapia y radioterapia) en la técnica para la prevención y/o el tratamiento de malignidades de célula B. La invención abarca también el uso de los anticuerpos agonísticos de la invención en combinación con otros anticuerpos conocidos en la técnica para el tratamiento y o la prevención de malignidades de células B. Por ejemplo, los anticuerpos agonísticos de la invención pueden utilizarse en combinación con los anticuerpos anti-C22 o anti-CD19 descritos por Goldenberg et ai. (Patente Norteamericana No. 6,306,393), anticuerpos anti-CD20, anticuerpos anti-CD33 o anticuerpos anti-CD52. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse también en combinación con por ejemplo, pero no a modo de limitación, Oncoscint (objetivo: CEA), Verluma (objetivo: GP40), Prostascint (objetivo: PSMA) , CEA-SCAN (objetivo: CEA), Rituxin (objetivo: CD20) , Herceptin (objetivo: HER-2) , Campath (objetivo: CD52), Mylotarge (objetivo: CD33) , Lymphocide (CD22), Lymphocide Y-90 (CD22) y Zevalin (objetivo: CD20) . .4.2 ENFERMEDAD AUTOINMUNE Y ENFERMEDADES INFLAMATORIAS Los anticuerpos agonísticos de la invención pueden utilizarse para tratar o prevenir enfermedades autoinmunes o enfermedades inflamatorias. La presente invención proporciona métodos para prevenir, tratar o manejar uno o más síntomas asociados con un trastorno autoinmune o inflamatorio en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención. La invención también proporciona métodos para prevenir, tratar o manejar uno o más síntomas asociados con un trastorno inflamatorio en sujeto que comprende además, administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes anti-inflamatorios. La invención también proporciona métodos para prevenir, tratar o manejar uno o más síntomas asociados con una enfermedad autoinme que comprende además, administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes inmunomoduladores. La sección 5.4.5 proporciona ejemplos no limitantes de agentes anti-inflamatorios y agentes inmunomoduladores. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse también en combinación con cualquiera de los anticuerpos conocidos en la técnica para el tratamiento y/o la prevención de enfermedad autoinmune o enfermedad inflamatoria. Un ejemplo no limitante de los anticuerpos de proteínas de fusión Fc que se utilizan para el tratamiento o la prevención de trastornos inflamatorios se presenta en la Tabla 6A, y un ejemplo no limitante de los anticuerpos para proteínas de fusión Fc que se utilizan para el tratamiento o la prevención de un trastorno autoinmune se presenta en la Tabla 6B. Los anticuerpos de la invención pueden por ejemplo, mejorar la eficacia del tratamiento de los anticuerpos terapéuticos o proteínas de fusión Fc presentados en la Tabla 6A y 6B. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los anticuerpos de la invención pueden mejorar la respuesta inmune en el sujeto que se trata con cualquiera de los anticuerpos o proteínas de fusión Fc en las Tablas 6A o 6B. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse también en combinación por ejemplo, pero no a modo de limitación, Orthoclone 0KT3, ReoPro, Zenapax, Simulec, Rituximab, Synagis, y Remicade. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse también en combinación con productos basados en dinucleótidos de citosina-guanina ("CpG") que se han desarrollado (Coley Pharmaceuticals) o se están desarrollando actualmente como activadores de respuestas innatas e inmunoadquiridas . Por ejemplo, la invención abarca el uso de CpG 7909, CpG 8916, CpG 8954 (Coley Pharmaceuticals) en los métodos y composiciones de la invención para el tratamiento y/o la prevención de trastornos autoinmunes o inflamatorios (Weeratna et ai., 2001, FEMS Immunol . Med Microbiol., 32(1): 65-71, la cual se incorpora en la presente para referencia) . Ejemplos de trastornos autoinmunes que pueden tratarse al administrar los anticuerpos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípidos, enfermedad de Addison autoinmune, enfermedades autoinmunes de la glándula adrenal, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, inflamación de los ovarios autoinmune y orquitis, trombocitopenia autoinmune, enfermedad de Behcet, penfigoideo bulloso, cardiomiopatía, dermatitis celiática, síndrome de disfunción inmune de fatiga crónica (CFIDS) , polineuropatía desmielizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, fenfigoide cicatrizal, síndrome de CREST, enfermedad de aglutinina fría, enfermedad de Crohn, lupus discoide, crioglobulinemia mezclada esencial, fibromialgia-fibromiositis, glomerulonefritis, enfermedad de Grave, Guillian-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiomática, trombocitopenia púrpura idiopática (ITP) , neuropatía IgA, artritis juvenil, liquen plano, lupus eritematoso, enfermedad de Méniér, enfermedad de tejido conectivo mezclado, esclerosis múltiple, diabetes mellitus mediada inmune o del tipo 1, miastenia gravis, pemphigus vulgaris, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policrondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agamablogulinemia primaria, cirrosis biliaria primaria, psoriasis, artritis psoriática, fenómeno de Raynauld, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjógren, síndrome de stiff-man, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso, arteritis takayasu, arteritis temporal/arteritis de célula gigante, colitis ulcerativa, uveitis, infección de los vasos sanguíneos tales como dermatitis herpetiformis vasculitis, vitíligo, y granulomatosis de Wegener. Ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, pero no se limitan a asma, encefalitis, enfermedad de inflamación del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía no diferenciada, artropatía no diferenciada, artritis, osteolisis inflamatoria, e inflamación crónica resultando a partir de infecciones virales o bacterianas crónicas. Como se describe en la presente en la Sección 3.1, algunos trastornos autoinmunes se asocian con una condición inflamatoria. De este modo, existe el traslape entre lo que se considera un trastorno autoinmune y un trastorno inflamatorio. Por lo tanto, algunos trastornos autoinmunes pueden caracterizarse como trastornos inflamatorios. Ejemplos de trastornos inflamatorios los cuales pueden prevenirse, tratarse o manejarse de acuerdo con los métodos de la invención, incluyen, pero no se limitan a asma, encefalitis, enfermedad de inflamación del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía no diferenciado, artropatía no diferenciada, artritis, osteolisis inflamatoria, e inflamación crónica que resulta de infecciones virales o bacterianas crónicas. En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para tratar una enfermedad autoinmune que es más prevaleciente en un sexo. Por ejemplo, el predominio de enfermedad de Grave en mujeres se ha asociado con la expresión de Fc?RIIB2 (véase Estienne et ai., 2002, FASEB J. 16:1087-1092). Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse también para reducir la inflamación experimentada por animales, particularmente mamíferos, con trastornos inflamatorios. En una modalidad específica, un anticuerpo reduce la inflamación en un animal por al menos 99%, al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 35%, al menos 30%, al menos 25%, al menos 20% o al menos 10% con relación a la inflamación en un animal en el anticuerpo no administrado. En otra modalidad, una combinación de anticuerpos reduce la inflamación en un animal por al menos 99%, al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 35%, al menos 30%, al menos 25%, al menos 20%, o al menos 10% con relación a la inflamación en un animal no se administra a tales anticuerpos. Tabla 6A. Anticuerpos para Enfermedades Inflamatorias y Enfermedades Autoinmunes que pueden utilizarse en combinación con los anticuerpos de la invención.

Nombre del Antígeno Tipo de produto Isotipo Patrocinadores Indicación anticuerpo objetivo 5G1J Complemento • Humanizado IgG Alexion Artritis (C5)' Phapn Ine Reumatoide 5G1J Complemento Humanizado IgG Alexion SLE (C5) Phap lnc 5G1J Complemento Humanizado IgG Alexion Nefritis (C5)" Phapn -tac 5G1J-SC Complemento > Humanizado ScFv Alexion Tubo de desviación (C5) Phapn Ine cardiopulmonar 5G1J-SC Complemento Humanizado ScFv Alexion Infarto al (C5) Phapn Ine miocardio 5G1J-SC Complemento - Humanizado ScFv Alexion Angioplastía (C5) Phapn lnc ABX-CBL CBL Humano Abgenix Ine GvHD ABX-CBL CD147 Murino IgG Abgenix Ine Rechazo de aloinjerto ABX-IL8 IL-8 Humano IgG2 Abgenix Ine Psoriasis Antegren VLA-4 Humanizado IgG Athena/Elan Esclerosis múltiple Anti- CDl la Humanizado IgGl Genentech Psoriasis CDl la Inc/Xoma Anti-CD18 CD18 Humanizado Fab'2 Genentech Ine Infarto al miocardio Anti-LFAl CD18 Murino Fab'2 Pasteur- Rechazo de aloinjerto Merieux/ Im unotech Antova CD40L Humanizado IgG Biogen Rechazo de aloinjerto Antova CD40L Humanizado IgG Biogen SLE BTI-322 CD2 de Rata IgG Medimmune GvHD, Psoriasis Ine CDP571 TNF-alpha Humanizado IgG4 Celltech Crohn CDP571 TNF-alpha Humanizado IgG4 Celltech Artritis Reumatoide CDP850 E-selectina Humanizado Celltech Psoriasis Corsevina Fact VII Chimérico Centocor Anticoagulante M D2E7 TNF-alpha Humano CAT/BASF Artritis Reumatoide Hu23F2G CD11/18 Humanizado ICOS Phapn Esclerosis múltiple Ine Hu23F2G CD11/18 Humanizado IgG ICOS Phapn Apoplejía Ine IC14 CD14 ICOS Phapn Choque tóxico Ine ICM3 ICAM-3 Humanizado ICOS Phapn Psoriasis Ine IDEC-114 CD80 Primatizado IDEC Psoriasis Phaim/Mitsub ishi Nombre del Antígeno Tipo de produto Isotipo Patrocinadores Indicación anticuerpo objetivo IDEC-131 CD40L Humanizado IDEC SLE Pharm Eisai IDEC-131 CD40L Humanizado IDEC Esclerosis múltiple Pharm/Eisai IDEC-151 CD4 Primatizado IgGl IDEC Artritis Phapn/Glaxo Reumatoide S ithKline IDEC-152 CD23 Primatizado IDEC Phapn Asma/Alergia mfliximab TNF-alpha Chimérico IgGl Centocor Artritis Reumatoide Infliximab TNF-alpha Chimérico IgGl Centocor Crohn ' LDP-01 beta2- Humanizado IgG Millennium Apoplejía integrina Ine (LeukoSite Inc.) LDP-01 beta2- Humanizado IgG Millennium Rechazo de aloinjerto integrina Ine (LeukoSite •Inc.) LDP-02 alpha4beta7 Humanizado Millennium Colitis ulcerativa Ine (LeukoSite Inc.) MAK- TNF alpha Murino Fab'2 Knoll Pharm, Choque tóxico 195F BASF MDX-33 CD64 (FcR) Humano Medarex Cent Trastornos eon hematógicos autoinmunes MDX-CD4 CD4 Humano IgG Medarex/Eisai Artritis / Reumatoide Genmab MEDI-507 CD2 Humanizado Medimmune Psoriasis Ine MEDI-507 CD2 Humanizado Medimmune GvHD Ine OKT4A CD4 Humanizado IgG Ortho Biotech Rechazo de aloinjerto OrthoClon CD4 Humanizado IgG Ortho Biotech Enfermedad e OKT4A autoinmune Orthoclone CD3 Murino mIgG2a Ortho Biotech Rechazo de aloinjerto / anti-CD3 OKT3 RepPro/ gpllbllla Chimérico Fab Centocor Lill Complicaciones de Abcbdmáb y angioplastía coronaria rhuMab- IgE Humanizado IgGl Genentech/No Asma/Alergia E25 vartis/Tanox Biosystems Nombre del Antígeno Tipo de produto Isotipo Patrocinadores Indicación anticuerpo objetivo SB -240563 IL5 Humanizado GlaxoSmithKl Asma/Alergia ine SB -240683 IL-4 Humanizado GlaxoSmithKl Asma/Alergia ine SCH55700 JL-5 Humanizado Celltech/Sche Asma/Alergia png Simulect CD25 Chimérico IgGl Novartis Rechazo de aloinjerto Pharm SMART CD3 Humanizado Protein Enfermedad a-CD3 Design Lab autoinmune SMART CD3 Humanizado Protein ' Rechazo de aloinjerto a-CD3 Design Lab SMART CD3 Humanizado IgG Protein Psoriasis a-CD3 Design Lab Zenapax CD25 Humanizado IgGl Protein Rechazo de aloinjerto Design Lab/Hoffman- La Roche Tabla 6B: Anticuerpos y proteínas de fusión Fc para Trastornos Autoinmunes Anticuerpo Indicación Antígeno objetivo ABX-RB2 Anticuerpo a antígeno CBL en anticuerpo totalmente humano de células T, células B y células NK a partir de xenoratón I I-ra Artritis reumatoide Proteína anti-inflamatoria recombinante sTNF-RI Enfermedad inflamatoria crónica Factor de necrosis tumoral soluble para Artritis reumatoide - receptor de tipo I bloquea acción TNF 5c8 (anticuerpo de ligando anti Pruebas de fase II se detuvieron CD-40 CD-40) en octubre. 99 "casos adversos" observados IDEC 131 Lupus eritematoso Humanizado sistémico(SLE) IDEC 151 Artritis reumatoide Privatizado; anti-CD4 IDEC 152 Asma Privatizado; anti-CD23 IDEC 114 psoriasis Privatizado; anti-CD80 MEDI-507 Artritis reumatoide, esclerosis Anti-CD2 múltiple, enfermedad de Chron, psoriasis LDP-02 (anti-b7 mAb) Enfermedad de inflamación del Receptor de integrina a4b7 en glóbulos intestino blancos (leucocitos) Enfermedad de Crhron Colitis ulcerativa Anticuerpo Interferón anti- Trastornos autoinmunes I nterferón Anti-Gamma Gamma SMART Verteportina Artritis reumatoide Talomida (talidomida) Lepra - aprobado para Inhibidor de factor de necrosis tumoral comercializar (TNF alfa) Enfermedad de Crohn Artritis reumatoide SelCIDs (fármacos inhibidores Inhibidores altamente específicos de de citoquina selectiva) enzima de fosfodiesterasa del tipo 4 (PDE-4) incrementa los niveles de cAMP (monofosfato de adenosina cíclica) activa la proteina quinasa A (PKA) Bloquea el factor de transcripción NK- kB Evita la transcripción del gen TNF-a Disminuye la producción de TNF-a IMiDs (inmunomodulador y Trastornos autoinmunes Análogos estructurales de talidomida fármacos) generales que inhibe TNF-a MDX-33 Trastornos sanguíneos Anticuerpo monoclonal contra provocados por reacciones receptores FcRI autoinmunes Trombocitopenia Idiomática Purpúrea (ITP) Anemia hemolítica autoinmune MDX-CD4 Tratar artritis reumatoide y otra Anticuerpo monoclonal contra molécula autoinmunidad receptora CD4 VX-497 Trastornos autoinmunes Inhibidor de inocina monofosfato Esclerosis múltiple deshidrogenasa (enzima necesaria para Artritis reumatoide Enfermedad hacer nuevos ARN y ADN utilizados en de inflamación del intestino la producción de nucleótidos necesarios Lupus para proliferación de linfocitos) Psoriasis VX-740 Artritis reumatoide Inhibidor de ICE lnterleucina-1 beta (convirtiendo trayectorias de control de enzima que conducen a respuesta inmune agresiva que regula citoquinas) VX-745 Específica a inflamación Inhibidor de mitogeno de quinasa Implicada en señalización P38MAP activado con proteina quinasa química de respuesta inmune Inicio y progreso de la inflamación Enbrel (etanercept) objetivos TNF (factor de necrosis tumoral) IL-8 MAB completamente humano contra II- 8 (interleucina 8) (bloquea IL-8 Bloquea la respuesta inflamatoria)) 5G1.1 Artritis reumatoide Un inhibidor del complemento C5 Penfigoide (sarpullido de piel peligroso) Psoriasis Lupus Apogen MP4 Antígeno recombinante Destruye selectivamente la enfermedad asociada con células T Induce apoptosis Elimina células T por muerte celular programada No ataca más las células propias del cuerpo Células T específicas objetivo de apógenos específicos 5.4.3 ALERGIA La invención proporciona métodos para tratar o prevenir un trastorno alérgico mediado por IgE y/o mediado por Fc?RI en un sujeto con necesidad de los mismos, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de los anticuerpos agonísticos o fragmentos de los mismos de la invención. Aunque no se pretende estar unido por un mecanismo particular de acción, los anticuerpos de la invención son útiles para inhibir activación de mastocitos inducidos por FceRI, la cual contribuye a la respuesta alérgica de fase aguda y tardía (Metcalfe D. et ai., 1997, Physiol. Rev. 77:1033). De preferencia, los anticuerpos agonísticos de la invención tienen eficacia terapéutica mejorada y/o efectos secundarios reducidos en comparación con los métodos convencionales utilizados en la técnica para el tratamiento y/o la prevención de trastornos alérgicos mediados con IgE. Los métodos convencionales para el tratamiento y/o prevención de trastornos alérgicos mediados por IgE incluyen, pero no se limitan a fármacos anti-inflamatorios (por ejemplo, corticoesteroides orales e inhalados para asma) , antihistaminas (por ejemplo, para rinitis alérgica y dermatitis atópica) , leucotrienos de cisteinilo (por ejemplo, para el tratamiento de asma) ; anticuerpos anti-IgE; e inmunoterapia específica o desensibilización.

Ejemplos de respuestas alérgicas mediadas por IgE incluyen, pero no se limitan a, asma, rinitis alérgica, alergias gastrointestinales, eosinofilia, conjuntivitis, dermatitis atópica, urticaria, anafilaxis o nefritis glomerular. La invención abarca moléculas, por ejemplo, inmunoglobulinas, diseñadas para formar complejos con Fc?RI y Fc?RIIB humano, es decir, enlazan específicamente Fc?RI y Fc?RIIB humano. De preferencia, tales moléculas tienen eficacia terapéutica en trastornos mediados con IgE y Fc?RI . Aunque no se pretende estar unido por un mecanismo particular de acción, la eficacia terapéutica de estas moléculas diseñadas, es en parte, debido a su capacidad para inhibir la función de los mastocitos y los basófilos. En una modalidad específica, las moléculas que enlazan específicamente Fc?RI y Fc?RIIB humanos son proteínas de fusión quiméricas que comprenden un sitio de enlace para Fc?RI y un sitio de enlace para Fc?RIIB. Tales moléculas pueden diseñarse de acuerdo con metodologías de ADN recombinantes estándares conocidas por un experto en la técnica. En una modalidad específica preferida, una proteína de fusión quimérica para uso en los métodos de la invención comprende una cadena sencilla F(ab') de un anticuerpo monoclonal anti-Fc?RIIB de la invención combinado a una región utilizada como un puente para unir el huFc? a la región C-terminal de la cadena sencilla F(ab') del anticuerpo monoclonal anti-Fc?RIIB. Una proteína de fusión quimérica ejemplar para uso en los métodos de la invención comprende lo siguiente: VL/Ch (Fc?RIIB) -pivote-VH/CH (Fc?RIIB) -ENLAZADOR-Ce2-CHe3-CHe4. El enlazador para las moléculas quiméricas pueden ser cinco, diez, de preferencia quince aminoácidos de longitud. La longitud del enlazador puede variar para proporcionar el enlace óptimo de la molécula tanto a Fc?RIIB como Fc?RI . En una modalidad específica, el enlazador es un enlazador de 15 aminoácidos, que consiste de la secuencia: (Gly4Ser)3. Aunque no se pretende estar unido por un mecanismo particular de acción, el enlazador de péptido flexible facilita la unificación de cadena y minimiza el repliegue posible y también permitirá la molécula quimérica para alcanzar los dos receptores, es decir, Fc?RIIB y Fc?RI en las células y las retícula. De preferencia, la molécula quimérica se clona dentro de un vector de expresión de mamífero, por ejemplo, pCI-neo, con un promotor compatible, por ejemplo, promotor de citomegalovirus . La proteína de fusión preparada de acuerdo con los métodos de la invención contendrá el sitio de enlace para FceRI (CHe2CHe3) y para Fc?RIIB (VL/CL, -pivote-VH/CH) . El ácido nucleico que codifica la proteína de fusión preparada de acuerdo con los métodos de la invención se transfectan en 293 células y la proteína secretada se purifica utilizando métodos comunes conocidos en la técnica.

El enlace de las moléculas quiméricas tanto a FceRI y Fc?RIIB humanos pueden evaluarse utilizando métodos comunes conocidos por un experto en la técnica para determinar el enlace a un Fc?R. De preferencia, las moléculas quiméricas de la invención tienen eficacia terapéutica para tratar trastornos mediados con IgE, por ejemplo, inhibiendo desgranulación conducida por antígeno e inhibición de activación celular. La eficacia de las moléculas quiméricas de la invención para bloquear desgranulación de mastocitos mediados por FceRI conducidos por IgE puede determinarse en ratones transgénicos, los cuales han sido diseñados para expresar el FceRa humano y Fc?RIIB humano, antes de su uso en seres humanos. La invención proporciona el uso de anticuerpos biespecíficos para el tratamiento y/o la prevención de trastornos alérgicos mediados por IgE y/o mediados por Fc?RI . Un anticuerpo biespecífico (BsAb) enlaza dos diferentes epítopes usualmente en distintos antígenos. Los BsAbs tienen utilidad clínica potencial y se han utilizado a virus objetivo, células viralmente infectadas y patógenos bacterianos así como el suministro de agentes trombolíticos a coágulos sanguíneos (Cao, Y., 1998 Bioconj . Chem 9: 635-644; Koelemij et ai., 1999, J. Immunother., 22, 514-525; Segal et al . , Curr. Opin. Immunol., 11, 558-562). La tecnología para la producción de BsIgG y otras moléculas biespecíficas relacionadas está disponible (véase por ejemplo, Cárter et ai., 2001 J. of Immunol. Methods, 248, 7-15; Segal et ai., 2001, J of Immunol. Methods, 248, 7-15, las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad) . La presente invención proporciona anticuerpos biespecíficos que contienen un F(ab') del anticuerpo anti-Fc?RIIB y un F(ab') de un anticuerpo anti-HuIgE monoclonal disponibles el cual agrega dos receptores, Fc?RIIB y FceRI, en la superficie de la misma célula. Cualquier metodología conocida en la técnica y descrita en la presente puede emplearse para generar anticuerpos biespecíficos para uso en los métodos de la invención. En una modalidad específica, los BsAbs producirán fragmentos F(ab') químicamente reticulados de un anticuerpo anti-Fc?RIIB y un anticuerpo anti-huIgE como se describe previamente, véase por ejemplo, Glennie et ai., 1995, Tumor Immunobiology, Oxford University press, Oxford, p. 225; el cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad). Los fragmentos F(ab') pueden producirse por proteólisis limitada con pepsina y se reducen con mercaptoetanol amina para proporcionar fragmentos Fab' con los grupos sulfhidrilo de región de pivoteo libre (SH) . El grupo SH en uno de los fragmentos Fab' (SH) pueden alquilarse con 0-0-fenilendimaleimida (0-PDM) para proporcionar un grupo maleimida libre (mal) . Las dos preparaciones Fab' (mal) y Fab' (SH) pueden combinarse en una relación apropiada, de preferencia 1:1 para generar construcciones heterodinámicas. Los BsAbs pueden purificarse por cromatografía de exclusión de tamiz y caracterizarse por HPLC utilizando métodos conocidos por un experto en la técnica. En particular, la invención abarca anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer par de cadena pesada-cadena ligera que enlaza Fc?RIIB con mayor afinidad que el par de cadena pesada-cadena ligera enlaza Fc?RIIA, y un segundo par de cadena pesada-cadena ligera que enlaza el receptor IgE, con la condición que el primer par de cadena pesada-cadena ligera enlaza Fc?RIIB en primer lugar. Los anticuerpos biespecíficos de la invención pueden diseñarse utilizando técnicas estándares conocidas en el arte para asegurar que el enlace a Fc?RIIB precede el enlace al receptor IgE. Se entenderá por un experto en la técnica para diseñar los anticuerpos biespecíficos, por ejemplo, de manera que los anticuerpos biespecíficos se enlazan Fc?RIIB con mayor afinidad que los anticuerpos enlazan el receptor IgE. Además, los anticuerpos biespecíficos pueden diseñarse por técnicas conocidas en el arte, de manera que el tamaño de pivote del anticuerpo puede incrementarse en longitud, por ejemplo, agregando enlazadores, para proporcionar los anticuerpos biespecíficos con flexibilidad para enlazar el receptor IgE y receptor Fc?RIIB en la misma célula. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse también en combinación con otros anticuerpos terapéuticos o fármacos conocidos en la técnica para el tratamiento o la prevención de trastornos alérgicos mediados por IgE. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en combinación con cualquiera de lo siguiente: azelastina, Astelin, inhalador de dipropionato de beclometasona, Vanceril, inhalador/aerosol nasal de dipropionato de beclometasona, Vancenase, inhalador/aerosol nasal de budenosida Beconase, cetirizina de Rhinocort, clorfeniramina Zyrtec, pseudoefredina, Deconamine, Sudafed, cromolina, Nasalcrom, Intal, Opticrom, desloratadina, Clarinex, fexofenadina y pseudoefredina, Allegra-D, fexofenadina, aerosol nasal de flunisolida Allegra, inhalador/aerosol nasal de propionato de fluticasona Nasalide, inhalador oral de propionato de fluticasona Flonase, Flovent, hidroxizina, Vistaril, Ataraxloratadine, pseudoefedrina, Claritin-D, loratadina, Claritin, prednisolona, Prednisolone, Pediapred Oral Líquido, prednisona Medrol, Deltasone, Predsalmeterol Líquido, inhalador de acetónida de triamcinolona Serevent, inhalador/aerosol nasal de acetónida de triamcinolona Azmacort, Nasacort, o NasacortAQ. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en combinación con productos basados en dinucleótidos de citosina-guanina ("CpG") que han sido desarrollados (Coley Pharmaceuticals) o están siendo actualmente desarrollados como activadores de respuestas inmunes innatas y adquiridas. Por ejemplo, la invención abarca el uso de CpG 7909, CpG 8916, CpG 8954 (Coley Pharmaceuticals) en los métodos y composiciones de la invención para el tratamiento y/o la prevención de trastornos alérgicos mediados por IgE (Véase también Weeratna et ai., 2001, FEMS Immunol Med Microbiol., 32(1):65-71, la cual se incorpora en la presente para referencia) . La invención abarca el uso de anticuerpos de la invención en combinación con cualesquiera anticuerpos terapéuticos conocidos en la técnica para el tratamiento de trastornos alérgicos, por ejemplo, Xolair™ (Omalizumab; Genentech); rumba-E25 (BioWorld Today, Nov. 10, 1998, p. 1; Genentech); CGP-51901 (anticuerpo anti-IgE humanizado), etc. Además, la invención abarca el uso de los anticuerpos de la invención en combinación con otras composiciones conocidas en la técnica para el tratamiento de trastornos alérgicos. En particular, los métodos y composiciones descritos en Carson et ai. (US 6,426,336; US 2002/0035109 Al; US 2002/0010343) se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. .4.4 AGENTES INMUNOMODULADORES Y AGENTES ANTI-INFLAMATORIOS El método de la presente invención proporciona métodos de tratamiento para enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias que comprenden la administración de los anticuerpos de la presente invención junto con otros agentes de tratamiento. Ejemplos de agentes inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a metotrexato, ENBREL, REMICADE™, leflunomida, ciclofosfamida, ciclosporina A y antibióticos de macrólido (por ejemplo, FK506 (tacrolimus)), metilprednisolona (MP) , corticoesteroides, esteroides, mofetil icofenolato, rapamicina (sirolimus) , mizoribina, desoxiespergualina, brequinar, malononitriloaminidas (por ejemplo, leflunamida) , moduladores del receptor de células T, y moduladores del receptor de citoquina. Los agentes anti-inflamatorios han exhibido éxito en el tratamiento de trastornos inflamatorios y autoinmunes y son ahora un tratamiento común y estándar para tales trastornos. Cualquier agente anti-inflamatorio bien conocido por un experto en la técnica puede utilizarse en los métodos de la invención. Ejemplos no limitantes de agentes antiinflamatorios incluyen fármacos anti-inflamatorios no esferoidales (los NSAID) , fármacos anti-inflamatorios esferoidales, beta-agonistas, agentes anticolinérgicos y metilxantinas . Ejemplos de los NSAID incluyen, pero no se limitan a aspirina, ibuprofeno, celecoxib (CELEBREX™) , diclofenaco (VOLTAREN™) , etodolaco (LODINE™) , fenoprofeno (NALFON™) , indometacina (INDOCIN™) , ketoralaco (TORADOL™) , oxaprozina (DAYPRO™) , nabumentona (RELAFEN™) , sulindac (CLINORIL™) , tomentina (TOLECTIN™) , rofecoxib (VIOXX™) , naproxeno (ALEVE™, NAPROSYN™) , ketoprofeno (ACTRON™) y nabumetona (RELAFEN™) . Tales NSAID funcionan al inhibir una enzima ciclooxigenasa (por ejemplo, COX-1 y/o COX-2) . Ejemplos de fármacos anti-inflamatorios esferoidales incluyen, pero no se limitan a glucocorticoides, dexametasona (DECADRON™) , cortisona, hidrocortisona, prednisona (DELTASONE™) , prednisolona, triamcinolona, azulfidina y eicosanoides tales como prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos. 5.4.5 AGENTES ANTI-CÁNCER Y ANTICUERPOS TERAPÉUTICOS En una modalidad específica, los métodos de la invención abarcan la administración de uno o más inhibidores de angiogénesis tales como pero sin limitarse a: Angiostatin (fragmento de plasminógeno) ; antitrombina III antiangiogénica; Angiozima; ABT-627; Bay 12-9566; Benefin; Bevacizumab; BMS-275291; inhibidor derivado de cartílago (CDI); CAÍ; fragmento complemento de CD59; CEP-7055; Col 3; Combretastatina A-4; Endostatina (fragmento XVIII de colágeno) ; bloqueadores/inhibidores de EGFr (Iressa®, Tarceva®, Erbitux® y ABX-EGF) ; fragmento de Fibronectina; Probeta; Halofuginona; Heparinasas; fragmento de hexasacárido de heparina; HMV833; gonadotropina coriónica humana (hCG) ; IM-862; Inferieron alfa/beta/gamma; proteína inducible de interferón (IP-10) ; Interleucina-12 ; Kringle 5 (fragmento plasminógeno) ; Marimastat; inhibidores de metaloproteinasa (los TIMP) ; 2-Metoxiestradiol; MMI 270 (CGS 27023A) ; MoAb IMC-1C11; Neovastat;NM-3; Panzem; PI-88; inhibidor de ribonucleasa placentaria; inhibidor activador de plasminógeno; factor plaquetario-4 (PF4); Prinomastat; fragmento 16kD de prolactina; proteína relacionada con proliferina (PRP); PTK 787/ZK 222594; Retinoides; Solimastat; Squalamine; SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; Tetrahidrocortisol-S; tetratiomolibdato; talidomida; Trombospondin-1 (TSP-1) ;TNP-470; factor-beta de crecimiento transformante (TGF-ß) ; Vasculostatina; Vasostatina (fragmento de calreticulina) ; ZD6126; ZD 6474; inhibidores de farnesil transferasa (FTl); y bisfosfonatos. Agentes anti-cáncer que pueden utilizarse en combinación con anticuerpos de la invención en las diversas modalidades de la invención, incluyendo composiciones farmacéuticas y formas de dosis y equipos de la invención, incluyen, pero no se limitan a: acivicina; aclarubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de amentantroña; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnalfida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar de sodio; bropirimina; busulfan; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatina; carmustina; clorhidrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cisplatina; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; clorhidrato de daunorubicina; decitabina; dexormaplatina; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel; doxorubicina; clorhidrato de doxorubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflornitina; elsamitrucina; enloplatina; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirubicina; erbulozol; clorhidrato de esorubicina; estramustina; fosfato de sodio de estramustina; etanidazol; etoposida; fosfato de etoposida; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina de sodio; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarubicina; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (incluyendo interleucina II recombinante o rIL2), interferón alfa-2a; interferón alfa-2b; interferón alfa-nl; interferón alfa-n3; interferón beta-I a; interferón gamma-I b; iproplatina; clorhidrato de irinotecan; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; clorhidrato de liárosolo; lometrexol de sodio; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maytansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalán; menogaril; ercaptopurina; metotrexato; metotrexato de sodio; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; itomalcina; mitomicina; mitospero; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico, nocodazol; nogalamicina; ormaplatina; oxisuran; paclitaxel; pegaspargase; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobromano; piposulfan; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfímero de sodio;-,, porfiromicina; prednimustina; clorhidrato de procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato de sodio; esparsomicina; clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatina; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalan de sodio; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; teniposida; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatina; zinostatina; clorhidrato de zorubicina. Otros fármacos anti-cáncer incluyen, pero no se limitan a: 20-epi-l,25 dihidroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas ALL-TK; altretamina; ambamustina, amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolida; inhibidores de angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína-1 morfogenética anti-dorsalizante; antiandrógeno, carcinoma prostático; antiestrógeno; antineoplaston; oligonucleótidos antisentido; glicinato de afidicolin; moduladores genéticos de apoptosis; reguladores de apoptosis; ácido purínico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina desaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetrón; anatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas BCR/ABL; benzoclorinas; benzoilestaurosporina; derivados de beta lactama; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina; bisanafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calciprotriol; calfostina C; derivados de canptotecina; canaripox IL-2; capecitabina; carboxamida-aminotriazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivados de cartílago; carzelesina; inhibidores de caseína quinasa (ICOS) ; castanoespermina; cecropina B; cetrorelix; chlorlns; cloroquinoxalina de sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentatraquinonas; cicloplata ; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina; deshidrodidemnina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamil; diaziquona; didemnina B; didox; dietilnorspermina; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenilespiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetrón; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebselen; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemene; emitefur; epirubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estrógeno; antagonistas de estrógeno; etanidazol; fosfato de etoposida; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; clorhidrato de fluorodaunorunicina; fofenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; gadolinio texapirina; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de glutatione; hepsulfam; heregulina; hexametileno de bisacetamida; hipericina; ácido ibandrónico; idarubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosfina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; péptidos inmunoestimulantes; inhibidor del receptor factor-1 de crecimiento similar a insulina; agonistas de interferón, interferones; interleucinas; iobenguano; yododoxorubicina; ipomeanol; 4; iroplact; irsogladina; isobenzgazol; isohomohalicondrin B; itasetrón; jasplaquinolida; kahalalida- F; triacetato de lamelarin-N; lanreotida; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinano; leptolestatina; letrozol; factor de inhibición de leucemia; leucocito alfa interferón; leoprolida+estrógeno+progesterona; leuprorelina; levamisol; liárosol; análogo de poliamina lineal; péptido disacárido lipofílico; compuestos de platino lipofílico; lisoclinamida 7; lobaplatina; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecano; lutetium texafirina; lisofilina; péptidos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inhibidores de matrilisina; inhibidores de metaloproteinasa de matriz; menogaril; merbarona; meterelin; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF, mifepristona; miltefosina; mirimostim; ARN de doble hebra incompatible; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; saponina del factor de crecimiento de fibroblasto de mitotoxina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticuerpo monoclonal; gonadotropina coriónica humana; lípido A de monofosforilo + sk de pared celular micobacteria; mopidamol; inhibidor de gen de resistencia de fármaco múltiple; terapia basada en supresor 1 de tumor múltiple; agente anticáncer de mostaza; micaperóxido B; extracto de pared celular micobacteriano; miriaporone; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxeno + pentazocina, napavin, nafterpina; nartograstim; nedaplatina; nemorubicina; ácido neridrónico; endopeptidasa neutra; nilutamida; nisamicina; moduladores del óxido nítrico; antioxidante de nitróxido; nitrulina; 06-bencilguanina; octreotida; okicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetrón; ondansetrón; oracina; inductor de citoquina oral; ormaplatina; osaterona; oxaliplatina; oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa; peldesina; polisulfato de sodio de pentosan; pentostatina; pentrozol; perflubrón; perfosfamida; alcohol perílilo; fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de fosfatasa; picibanil; clorhidrato de pilocarpina; pirarubicina; piritrexim; placetin A; placetin B; inhibidor activador de plasminógeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de triamina-platino; porfimer de sodio; porfiromicina; prednisona; propil bis-acridona; prostaglandina J2; inhibidores de proteasoma; inmune modulador basado en proteína A; inhibidor de la proteína quinasa C; inhibidores de la proteína quinasa C, microalgas; inhibidores de la proteína tirosina fosfatasa; inhibidores de purina nucleósido fosforilasa; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de hemoglobina polioxietileno piridoxilado; antagonistas raf; raltitrexedo; ramocetrón; inhibidores de transferasa de proteína de farnesilo ras inhibidores ras; inhibidor ras-GAP, reteliptina desmetilada; etidronato de renio Re 186; rizoxina; ribozimas; retinamida RII; rogletimida; rohitukina; romurtida; roquinimex; rubiginona Bl; ruboxilo; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; miméticos Sdi 1; semustina; inhibidor 1 derivado de senescencia; oligonucleótidos sentido; inhibidores de transducción de señal; moduladores de transducción de señal; proteína de enlace de antígeno de cadena sencilla; sizofiran; sobuzoxano; borocaptato de sodio; fenilacetato de sodio; solverol; proteína de enlace de somatomedina; sonermin; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; escualamina; inhibidor de la célula germinal; inhibidores de división de célula germinal; estipiamida; inhibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista de péptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramina; swainsonina; glucosaminoglicanos sintéticos; tallimustina; metioduro de tamoxifeno; tauromustina; tazoroteno; tecogalan de sodio; tegafur; telurapirilio; inhibidores de telomerasa; temoporfina; temozolomida; teniposida; tetraclorodecaóxido; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; mimético de trombopoyetina; timalfasina; agonista receptor de timopoyetina; timotrinano; hormona que estimula la tiroides; etiletiopurpurina de estaño; tirapazamina; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifeno; factor de célula germinal totipotente; inhibidores de traducción; tretinoina; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetron; turoesterida; inhibidores de la tirosina quinasa; tirfostinas; inhibidores de UBC; ubeni ex; factor inhibidor del crecimiento derivado de seno urogenital; antagonistas del receptor de uroquinasa; vapreotida; variolina B; sistema vector, terapia genética de eritrocitos; velaresol; veramina; verdins; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitamina, vorozol; zanoteron; zaniplatina; zilascorb; y estimalámero de zinostatina. Los fármacos anticáncer adicionales preferidos son 5-fluorouracil y leucovorin. Ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden utilizarse en los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a HERCEPTIN® (Trastuzumab) (Genentech, CA) que es un anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastático; REOPRO® (abciximab) (Centocor) el cual es un receptor de anti-glicoproteína Ilb/llla en las plaquetas para la prevención de formación de coágulo; ZENAPAX® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Suiza) que es un inmunosupresivo, anticuerpo monoclonal anti-CD25 humanizado para la prevención de rechazo de aloinjerto renal agudo; PANOREX™ (edrecolomab) el cual es anticuerpo IgG2a de antígeno de superficie celular anti-17IA de murino (Glaxo Wellcome/Centocor) ; BEC2 el cual es un anticuerpo de IgG anti-idiotipo de murino (epítope GD3) (ImClone System) ;Erbitus® (cetuximab) el cual es un anticuerpo IgG anti-EGFR quimérico (ImClone System) ; VITAXIN™ el cual es un anticuerpo de integrina anti-a-Vß3 humanizado (Applied Molecular Evolution/Medlmmune) ; Campath 1H/LDP-03 el cual es un anticuerpo IgGl anti-CD52 humanizado (Leukosite) ; Smart M195 el cual es un anticuerpo IgG anti-CD33 humanizado (Protein Design Lab/Kanebo) ; RITUXAN™ (rituximab) el cual es un anticuerpo IgGl anti-CD20 quimérico (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku) ; LYMPHOCIDE™ (epratuzumab) el cual es un anticuerpo IgG anti-CD22 humanizado (Immunomedics) ; ICM3 el cual es un anticuerpo anti-ICAM3 humanizado (ICOS Pharm) ; IDEC-114 el cual es un anticuerpo anti-CD80 de primate (IDEC Pharm/Mitsubishi) ; ZEVALIN™ el cual es un anticuerpo anti-CD20 de murino radioetiquetado (IDEC/Scherin AG) ; IDEC-131 el cual es un anticuerpo anti-CD40L humanizado (IDEC/Eisai) ; IDEC-151 el cual es un anticuerpo anti-CD4 de primate (IDEC) ; IDEC-152 el cual es un anticuerpo anti-CD23 de primate (IDEC/Seikagaku) ; SMART anti-CD3 el cual es una IgG anti-CD3 humanizada (Protein Design Lab); 5G1.1 el cual es un anticuerpo factor 5 (C5) anti-complemento humanizado (Alexion Pharm) ; Humira® el cual es un anticuerpo anti-TNF-a humano (Abbott Laboratories) ; CDP870 el cual es un fragmento Fab anti-TNF-a humanizado (Celltech) ; IDEC-151 el cual es un anticuerpo IgGl anti-CD4 de primate (IDEC Pharm/SmithKIine Beecham) ; MDX-CD4 el cual es un anticuerpo IgG anti-CD4 de humano (Medarex/Eisai/Genmab) ; CDP571 el cual es un anticuerpo IgG4 anti-TNF-a humanizado (Celltech) ; LDP-02 el cual es un anticuerpo anti-a4ß7 humanizado (LeukoSite/Genentech) ; OrthoClone OKT4A el cual es un anticuerpo IgG anti-CD4 humanizado (Ortho Biotech) ; ANTOVA™ el cual es un anticuerpo IgG anti-CD40L humanizado (Biogen) ; ANTEGREN™ el cual es un anticuerpo IgG anti-VLA-4 humanizado (Elan) ; y CAT-152 el cual es un anticuerpo anti-TGF-ß2 humano (Cambridge Ab Tech) . Otros ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden utilizarse en combinación con los anticuerpos de la invención se presentan en la Tabla 7. Tabla 7 : Anticuerpos monoclonales para Terapia de Cáncer que pueden utilizarse en combinación con los anticuerpos de la invención. Compañía Producto Enfermedad Objetivo Abgeñix ABX-EGF Cáncer receptor EGF AltaRex OvaRex Cáncer de ovario tumor antigenoCA125 BraváRex Cánceres tumor antigeno MUC1 metastáticos Antisoma Theragyn Cáncer de ovario antigeno PEM (pemtumomabytrrium- 90) Therex Cáncer de mama antigeno PEM Boehringer blvatuzumab Cáncer de cabeza CD44 Ingelheim y cuello Centocor/J&J Panorex Cáncer 17-1A colo-rectal ReoPro PTCA gp m-b/IIIa ReoPro Ml agudo gp D-Ib/ID-a ReoPro Apoplejía isquémica gp ID-b/IIIa Corixa Bexocar NHL CD20 CRC Technology MAb, i iotypic 105AD7 Vacuna de cáncer gp72 colo-rectal Crucell Anti-EpCAM Cáncer Ep-CAM Cytoclonal MAb, Cáncer de Cáncer de pulmón de NA pulmón célula no pequeña Genentech Herceptin Cáncer de mama HER -2 metastático Herceptin Cáncer de mama HER -2 en etapa temprana -Rituxan NHL folicular o de CD20 grado bajo reincidido/resistente Rituxan NHL intermediario y t?>n de alto grado NSCLC, MAb-VEGF VEGF metastático MAb-VEGF Cáncer VEGF coiorectal, metastático AMD Fab Degeneración CD18 macular relacionada con la edad E -26 (2na gen. IgE) Asma alérgica y IgE rinitis Compañía Producto Enfermedad Objetivo IDEC 2-evalin (-Rituxan + Grado bajo de CD20 itrio -90) NHL de célula B, CD20 positivo, reincidido o resistente folicular, y NHL resistente a Rituximab ImClone Cetuximab + innotecan Carcinoma receptor EGF colo-rectal resistente Cáncer de cabeza Cetuximab + Cisplatina y y cuello receptor EGF Radiación recientemente diagnosticado o Cetuximab + recurrente receptor EGF gemcitabine Carcinoma pancreático metastático recientemente Cetuximab + Cisplatina+ diagnosticado receptor EGF 5FU or Taxol Cáncer de cabeza y cuello recurrente o Cetuximab + metastático receptor EGF carboplatin + aclitaxel Carcinoma de pulmón de célula no pequeña Cetuximab + Cisplatina recientemente receptor EGF diagnosticado Cáncer de cabeza y cuello (enfermedad regional local incurable extensiva y metástasis distante) Carcinoma de cabeza y Cetuximab +Radiación cuello localmente receptor EGF avanzado Carcinoma de pulmón BEC2 + Bacillus de célula pequeña mimics gangliosida Calmette Guerin Melanoma GD3 BEC2 + Bacillus mimics gangliosida Calmette Guerin GD3 IMC-IC? Cáncer colo-rectal VEGF-receptor con metástasis en hígado TmmonoGen nuC242-DMl Cáncer colo-rectal, puC242 gástrico y pancreático ImmunoMedics LymphoCide Linfoma No CD22 Hodgkins LymphoCide Y-90 Linfoma No CD22 Hodgkins Compañía Producto Enfermedad Objetivo CEA-Cide Tumores sólidos CEA metastáticos CEA-CideY-90 Tumores sólidos CEA metastáticos CEA-Scan (arcitumomab Cáncer colo-rectal CEA etiquetado con Tc-99m) (radiodigitalizacióni) CEA-Scan (arcitumomab Cáncer de mama CEA CEA-Scan (arcitumomab (radiodigitalización) etiquetado con Tc-99m) Cáncer de pulmón CEA etiquetado con Tc-99m) (radiodigitalización) CEA-Scan (arcitumomab Tumores etiquetado con Tc-99m) intraoperativos CEA (radiodigitalización) Infección de tejido LeukoScan (sulesomab suave CEA etiquetado con Tc-99m) (radiodigitalización) Linfomas LymphoScan (Tc-99m- (radiodigitalización) CD22 labeled) Cánceres de célula AFP-Scan (etiquetado germinal de hígado 7 AFP con Tc-99m) (radiodigitalización) Intracel HumaRAD-HN (+ Cáncer de cuello NA itrio -90) y cabeza HumaSPECT Digitalización colo-rectal NA Próstata y otros cánceres Medarex MDX-101 (CTLA-4) Cáncer de próstata CTLA-4 MDX-210 (her-2 HER-2 sobre-expresión) MDX-210 MAK Cáncer HER-2 Medlmmvme Vitaxin Cáncer avß3 Merck KGaA MAb 425 Varios cánceres receptor EGF IS-IL-2 Varios cánceres Ep-CAM Millennium Campath Leucemia CD52 (alemtuzumab) linfocítica crónica Linfoma No NeoRx CD20-estrepatavidina Hodkings CD20 (+ biotinia-itrio 90) Cáncer Avidicina (albúmina + metastático NA NRLU13) Peregrine Oncolym (+ yodo -131) Linfoma No HLA-DR 10 beta hodgkins Cotara (+ yodo -131) Glioma maligno proteínas-associated no amputable DNA Pharmacia CD215 (+ enterotoxina Cáncer NA Corporation estafilococal) pancreático MAb, cáncer de Cáncer de NA pulmón/riñón pulmón y riñon Compañía Producto Enfermedad Objetivo nacolomab tafenatox Cáncer de colon NA (C242 + staphylococdal y pancreático enterotoxin) Protein Design Nuvion Malignidades de CD3 Labs células T SMART M195 AML CD33 SMART 1D10 NHL antigeno CEA Tit n CEAVac Cáncer colo-rectal, HLA-DR Melanoma metastático TriGem avanzado y gangliosida- GD2 ' Cáncer de pulmón de célula pequeña ' Cáncer de mama TriAb ' metastático MUC-1 Trilex CEAVac Cáncer colo-rectal, CEA Melanoma metastático TriGem avanzado y gangliosida -;GD2 Cáncer de pulmón de célula pequeña Cáncer de mama TriAb metastático MUC-1 Viventia Biotech NovoMAb-G2 Linfoma No Hodgkins NA radioetiquetado Carcinoma colo-rectal Monophapn C y pancreático antigeno s?-? Glioma, Melanoma y GliMAb-H (+ toxina neuroblastoma gelonina) NA Xoma Rituxan NHL de bajo grado, CD20 reincidido/resistente o folicular Rituxan NHL intermediario o CD20 de alto grado ING-1 Adenocarcinoma Ep-CAM . 4 , . 6 TERAPIA DE VACUNA La invención proporciona un método para mejorar una respuesta inmune a una composición de vacuna en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto un anticuerpo o un fragmento del mismo que enlaza específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA, y una composición de vacuna, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo mejora la respuesta inmune a la composición de vacuna. En una modalidad particular, el anticuerpo o fragmento de la misma mejora la respuesta inmune a la composición de vacuna mejorando la presentación de antígeno y/o procesamiento de antígeno del antígeno al cual se dirige en la vacuna. Cualquier composición de vacuna conocida en la técnica es útil en combinación con los anticuerpos o fragmentos de la misma de la invención. En una modalidad, la invención abarca el uso de anticuerpos de la invención en combinación con cualquier vacuna de cáncer conocida en la técnica, por ejemplo, CanvaxinTM (Cáncer Vax, Corporation, melanoma y cáncer de colon) ; Oncophage (HSPPC-96; -Antigénicos; melanoma metastático); vacuna de cáncer HER-2/neu, etc. Las vacunas de cáncer utilizadas en los métodos y composiciones de la invención pueden ser por ejemplo, vacunas específicas de antígeno, vacunas anti-idiotípicas, vacunas de células dendríticas o vacunas de ADN. La invención abarca el uso de los anticuerpos de la invención con vacunas basadas en células como se describe por Segal et al . (Patente Norteamericana No. 6,403,080), la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Las vacunas basadas en células utilizadas en combinación con los anticuerpos de la invención pueden ser ya sea antologas o alogeneicas . Brevemente, las vacunas basadas en cáncer como se describe por Segal et a . , se basan en el producto Opsonokine (TM) por Genitrix, LLC. Las Opsonokines (TM) son citoquinas genéticamente diseñadas que, cuando se mezclan con células tumorales, automáticamente unidas a la superficie de las células. Cuando las células "decoradas" se administran como una vacuna, la citoquina en las células activa células que presentan antígenos críticos en el receptor, mientras también se permite a las células de presentación de antígeno ingerir las células tumorales. Las células que presentan antígeno son capaces entonces para instruir linfocitos T "citotóxicos" encontrar y destruir células tumorales similares en todo el cuerpo. De este modo, El producto de Opsonokine (TM) convierte las células tumorales en un inmunoterapéutico antitumor potente . En una modalidad, la invención abarca el uso de los anticuerpos de la invención en combinación con cualquier vacuna alérgica conocida en la técnica. Los anticuerpos de la invención, pueden utilizarse por ejemplo, en combinación con moléculas híbridas recombinantes que codifican para los alérgenos de polen de pasto de fleo mayores utilizados para vacunación contra alergias de polen de pasto, como se describe por Linhart et ai. (2000, FASEB Journal, 16 (10) : 1301-3 , la cual se incorpora para referencia). Además, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en combinación con vacunaciones basadas en ADN descritas por Horner et al . (2002, Allergy, 57 Suppl, 72:24-9, la cual se incorpora para referencia) . Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en combinación con vacunación Bacille Clamett-Guerin ("BCG") como se desribe por Choi et ai. (2002, Ann. Allergy Asthma Immunology, 88(6) :584-91) y Barlan et al . (2002, Journal Asthma, 39 (3) :239-46) , ambas de las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad, para des-regular la secreción de IgE. Los anticuerpos de la invención son útiles para tratar alergias en alimentos. En particular, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en combinación con vacunas u otras inmunoterapias conocidas en la técnica (véase Hourihane et al . , 2002, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol . 2(3):227-31) para el tratamiento de alergias por cacahuate . Los métodos y composiciones de la invención pueden utilizarse en combinación con vacunas, en las cuales la inmunidad para el o los antígenos se desea. Tales antígenos pueden ser cualquier antígeno conocido en la técnica. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para mejorar una respuesta inmune, por ejemplo, a agentes infecciosos, células enfermas o anormales tales como, pero sin limitarse a, bacterias (por ejemplo, bacterias gram positivas, bacterias gram negativas, bacterias aeróbicas, Espiroquetas, Micobacterias, Rickettsias, Clamidias, etc.), parásitos, hongos (por ejemplo, Candida albicans, Aspergillus, etc.), virus (por ejemplo, virus de ADN, virus de ARN, etc.), o tumores. Las infecciones virales incluyen, pero no se limitan a virus de inmunodeficiencia humana (VIH) ; virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis D u otros virus de hepatitis; citomegalovirus, virus-1 del herpes simple (-2, -3, -4, -5, -6) , virus del papiloma humano; virus sincitial respiratorio (RSV) , virus de parainfluenza (PIV) , virus de Epstein Barr, meta-neumovirus humano (HMPV) , virus de influenza, Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS) o cualesquiera otra infecciones virales. La invención abarca métodos y composiciones de vacunas que comprenden combinaciones de un anticuerpo de la invención, un antígeno y una citoquina. De preferencia, la citoquina es IL-4, IL-10 o TGF-ß . La invención abarca también el uso de los anticuerpos de la invención para mejorar una repuesta humoral y/o mediada por célula contra el o los antígenos de la composición de vacuna. La invención abarca además el uso de los anticuerpos de la invención ya sea para prevenir o tratar un trastorno particular, en donde una respuesta inmune mejorada contra un antígeno o antígenos particulares es efectiva para tratar o prevenir la enfermedad o el trastorno.

Tales enfermedades y trastornos incluyen, pero no se limitan a, infecciones virales, tales como HIV, CMV, hepatitis, virus de herpes, sarampión, etc., infecciones bacterianas, infecciones fúngicas y parasíticas, cánceres, y otra enfermedad o trastorno sensible para tratamiento o prevención al mejorar una respuesta inmune contra un antígeno o antígenos particulares. 5.5 COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN La invención proporciona métodos y composiciones farmacéuticas que comprende anticuerpos de la invención. La invención proporciona también métodos de tratamiento, profilaxis, y mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección al administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una proteína de fusión o una molécula conjugada de la invención, o una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión o moléculas conjugadas de la invención. En un aspecto preferido, un anticuerpo o proteína de fusión o molécula conjugada, se purifica sustancialmente (es decir, sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios indeseados) . En una modalidad específica, el sujeto es un animal, de preferencia un mamífero tal como no primate (por ejemplo, vacas, puercos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) y un primate (por ejemplo, mono tal como, mono cinomologo y un humano) . En una modalidad preferida, el sujeto es un ser humano. Se conocen varios sistemas de suministro y pueden utilizarse para administrar una composición que comprende anticuerpos de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o proteína de fusión, endocitosis mediada por receptor (Véase por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un retroviral u otro vector, etc. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se formulan en liposomas para suministro objetivo de los anticuerpos de la invención. Los liposomas son vesículas comprendidas de bicapas de fosfolípido concéntricamente ordenadas las cuales encapsulan una fase acuosa. Los liposomas comprenden normalmente varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o agentes tensioactivos. Los componentes de liposomas se disponen en una configuración de bicapa, similar a la disposición de lípidos de membranas biológicas. Los liposomas son vehículos de suministro particularmente preferidos debido en parte, a su biocompatibilidad, inmunogenicidad baja y toxicidad baja. Los métodos para preparación de liposomas se conocen en la técnica y están abarcados dentro de la invención, véase por ejemplo, Epstein et ai., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:3688; Hwang et al . , 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4; Patentes Norteamericanas Nos. 4,485,045 y 4,544,545; todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. La invención abarca también métodos para preparar liposomas con una vida promedio de suero prolongada, es decir, tiempo de circulación mejorada, tal como aquellos descritos en la Patente Norteamericana No. 5,013,556. Los liposomas preferidos utilizados en los métodos de la invención no se depuran rápidamente a partir de circulación, es decir, no se absorben en el sistema de fagocito mononuclear (MPS) . La invención abarca liposomas estéricamente estabilizados las cuales se preparan utilizando métodos comunes conocidos por un experto en la técnica. Aunque no se pretende unirse por un mecanismo particular de acción, los liposomas estéricamente estabilizados contienen componentes de lípido con porciones hidrofílicas voluminosas y altamente flexibles, los cuales reducen la reacción indeseada de liposomas con proteínas de suero, reduce la oposonización con componentes de suero y reduce el reconocimiento por MPS. Los liposomas estéricamente estabilizados se preparan de preferencia utilizando polietilenglicol. Para la preparación de liposomas y liposoma estéricamente estabilizado véase por ejemplo, Bendas et ai., 2001 BioDrugs, 15 (4) : 215-224 ; Alien et ai., 1987 FEBS Lett. 223: 42-6; Klibanov et ai., 1990 FEBS Lett., 268: 235-7; Blum et al . , 1990, Biochim. Biophys. Acta., 1029: 91-7; Torchilin et al . , 1996, J. Liposome Res. 6: 99-116; Litzinger et ai., 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1190:99-107; Maruyama et ai., 1991, Chem. Pharm. Bull. 39: 1620-2, Klibanov et al . , 1991, Biochim Biophys Acta, 1062; 142-8; Alien et al . , 1994, Adv. Drug Deliv. Rev, 13: 285-309; todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. La invención abarca también liposomas que se adaptan para objetivo de órgano específico, véase por ejemplo, Patente Norteamericana No.4,544,545 u objetivo de célula específica, véase por ejemplo, la Solicitud de Publicación de Patente Norteamericana No. 2005/0074403. Los liposomas particularmente útiles para uso en las composiciones y métodos de la invención pueden generarse por un método de evaporación de fase inversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol, y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido a liposomas producidas con el diámetro deseado. En algunas modalidades, un fragmento de un anticuerpo de la invención, por ejemplo, F(ab'), pueden conjugarse a liposomas utilizando métodos previamente descritos, véase por ejemplo, Martin et ai., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.

Los anticuerpos de la invención pueden formularse como inmunoliposomas . Los inmunoliposomas se refieren a composición liposomal, en donde un anticuerpo de la invención o un fragmento de los mismos se enlazan, covalente o no covalentemente a la superficie liposomal . La química para enlazar un anticuerpo a la superficie liposomal se conoce en la técnica y está abarcada dentro de la invención, véase por ejemplo, Patente Norteamericana No. 6,787,153; Alien et ai., 1995, Stealth Liposomes, Boca Ratón; CRC Press, 233-44; Hansen et ai., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1239:133-44; las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. En las modalidades más preferidas, las inmunoliposomas para uso en los métodos y composiciones de la invención se estabilizan además estéricamente. De preferencia, los anticuerpos de la invención se enlazan covalente o no covalentemente a un soporte hidrofóbico, el cual se enraiza establemente en la bicapa de lípido del liposoma. Ejemplos de soportes hidrofóbicos incluyen, pero no se limitan a fosfolípidos, por ejemplo, fosoatidiletanolamina (PE) , fosfatidilinositol (Pl) . Para conseguir una conexión covalente entre un anticuerpo y un soporte hidrofóbico, cualquiera de las estrategias bioquímicas conocidas en la técnica puede utilizarse, véase por ejemplo, J. Thomas August, ed. , 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, Volumen 40, Academic Press, San Diego, CA. , p. 399-435, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Por ejemplo, un grupo funcional en una molécula de anticuerpo puede reaccionar con un grupo activo en un soporte hidrofóbico asociado con liposomas, por ejemplo, un grupo amino de una cadena lateral de lisina en un anticuerpo puede acoplarse a N-glutaril-fosfatidiletanolamina asociada con liposomas activada con carbodiimida soluble en agua; o un grupo tiol de un anticuerpo reducido puede acoplarse a liposomas a través de soportes reactivos de tiol tales como piridiltiopropionil-fosfatidiletanolamina. Véase por ejemplo, Dietrich et ai., 1996, Biochemistry, 35: 1110-1105; Loughrey et al . , 1987, Biochim. Biophys. Acta, 901: 157-160; Martin et al . , 1982, J. Biol. Chem. 257: 286-288; Martin et al . , 1981, Biochemistry, 20: 4429-38, todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. Aunque no se pretende unirse por un mecanismo particular de acción, las formulaciones inmunoliposomales que comprende un anticuerpo de la invención son particularmente efectivas como agentes terapéuticos, ya que suministran el anticuerpo al citoplasma de la célula objetivo, es decir, la célula comprende el receptor Fc?RIIB al cual se enlaza el anticuerpo. Los inmunoliposomas tienen de preferencia una vida promedio incrementada en la sangre, específicamente células objetivo, y pueden internalizarse dentro del citoplasma de las células objetivo por lo que se evita la pérdida del agente terapéutico o la degradación de la trayectoria endolisosomal . La invención abarca inmunoliposomas que comprenden un anticuerpo de la invención o un fragmento de la misma. En algunas modalidades, los inmunoliposomas comprenden además uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como aquellos descritos en la presente. Las composiciones inmunoliposomales de la invención comprenden uno o más lípidos que forman vesículas, un anticuerpo de la invención o un fragmento o derivado de las mismas, y opcionalmente un polímero hidrofílico. Un lípido que forma vesículas es de preferencia un lípido con dos cadenas de hidrocarburo, tales como cadenas de acilo y un grupo principal polar. Ejemplos de lípidos que forman vesícula incluyen fosfolípidos, por ejemplo, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol, esfingomielina y glicolípidos, por ejemplo, cerebrosidas, gangliosidas. Los lípidos adicionales útiles en las formulaciones de la invención se conocen por un experto en la técnica y están abarcados dentro de la invención. En algunas modalidades, las composiciones inmunoliposomales comprenden además un polímero hidrofílico, por ejemplo, polietilenglicol y gangliosida GM1, el cual incrementa la vida promedio de suero del liposoma. Los métodos para conjugar polímeros hidrofílicos a liposomas se conocen bien en la técnica y están abarcados dentro de la invención. Para una revisión de inmunoliposomas y métodos para prepararlos, véase por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2003/0044407; Publicación Internacional PCT No. WO 97/38731, Vingerhoeads et al . , 1994, Immunomethods , 4:259-72; Maruyama, 2000, Biol. Pharm. Bull. 23(7): 791-799; Abra et ai., 2002, Journal of Liposome Research, 12(1&2): 1-3; Park, 2002, Bioscience Reports, 22(2): 267-281; Bendas et ai., 2001 BioDrugs, 14 (4) .215-224, J. Thomas August, ed. , 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, Volumen 40, Academic Press, San Diego, CA, p. 399-435, todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades. Los métodos para administrar un anticuerpo de la invención incluyen, pero no se limitan a administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), epidural y mucosal (por ejemplo, intranasal y rutas orales) . En una modalidad específica, los anticuerpos de la invención se administran intramuscular, intravenosa o subcutáneamente. Las composiciones pueden administrarse por cualquier ruta conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de recubrimiento epitelial o mucocutáneo (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, la administración pulmonar puede emplearse también, por ejemplo, por el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente de aerosol. Véase por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 6,019,968; 5,985,20; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; y 4,880,078; y las Publicaciones de PCT Nos. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. La invención proporciona también que los anticuerpos de la invención se empacan en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolleta o bolsita que indica la cantidad de anticuerpo. En una modalidad, los anticuerpos de la invención se suministran como un polvo liofilizado esterilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado y puede reconstituirse, por ejemplo, con agua o solución salina a la concentración apropiada para administración a un sujeto. De preferencia, los anticuerpos de la invención se suministran como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente herméticamente sellado en una dosis unitaria de al menos 5 mg, más preferiblemente al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, o al menos 75 mg. Los anticuerpos liofilizados de la invención deben almacenarse entre 2 y 8°C en su recipiente original y los anticuerpos deben administrarse en el lapso de 12 horas, de preferencia en el lapso de 6 horas, en el lapso de 5 horas, en el lapso de 3 horas, o en el lapso de 1 hora después de reconstituirse. En una modalidad alternativa, los anticuerpos de la invención se suministran en forma líquida en un recipiente herméticamente sellado que indica la cantidad y la concentración del anticuerpo, proteína de fusión, o molécula conjugada. De preferencia, la forma líquida de los anticuerpos se suministran en un recipiente herméticamente sellado al menos 1 mg/ml, más preferiblemente al menos 2.5 mg/ml , al menos 5 mg/ml , al menos 8 mg/ml , al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/kg, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 100 mg/ml, al menos 150 mg/ml, al menos 200 mg/ml de los anticuerpos. La cantidad de la composición de la invención la cual será efectiva en el tratamiento, la prevención o mejora de uno o más síntomas asociados con un trastorno puede determinarse por técnicas clínicas estándares. La dosis precisa que se emplea en la formulación dependerá de la ruta de administración, y la seriedad de la condición, y debe determinarse de acuerdo al juicio del practicante y cada una de las circunstancias del paciente. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de curvas de respuesta de dosis derivadas a partir de sistemas de prueba de modelo in vitro o animal.

Para anticuerpos abarcados por la invención, la dosis administrada a un paciente es normalmente 0.0001 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. De preferencia, la dosis administrada a un paciente está entre 0.001 mg/kg y 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 5 mg/kg, 0.0001 y 2 mg/kg, 0.0001 y 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 0.5 mg/kg, 0.0001 mg/kg a 0.25 mg/kg, 0.0001 a 0.15 mg/kg, 0.0001 a 0.10 mg/kg, 0.001 a 0.5 mg/kg, 0.01 a 0.25 mg/kg o 0.01 a 0.10 mg/kg del peso corporal del paciente. Generalmente, los anticuerpos humanos tienen una vida promedio prolongada dentro del cuerpo humano que los anticuerpos a partir de otras especies debidas a la respuesta inmune a los polipéptidos extraños. De este modo, las dosis inferiores de anticuerpos humanos y menos administración frecuente es posible con frecuencia. Además, la dosis y frecuencia de administración de anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos pueden reducirse al mejorar la absorción y penetración de tejido de los anticuerpos por modificaciones tales como por ejemplo, lipidación. En una modalidad, la dosis de los anticuerpos de la invención administrada a un paciente son 0.01 mg a 100 mg/día, cuando se utiliza como terapia de un solo agente. En otra modalidad los anticuerpos de la invención se utilizan en combinación con otras composiciones terapéuticas y la dosis administrada a un paciente son más bajos que cuando los anticuerpos se utilizan como una terapia de un solo agente. En una modalidad específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente al área con necesidad de tratamiento; esto puede lograrse por ejemplo, y no con el objetivo de limitación, infusión local, por inyección, o por medio de un implante, el implante siendo de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas o fibras. De preferencia, cuando se administra un anticuerpo de la invención, debe tenerse cuidado para utilizar materiales a los cuales el anticuerpo o la proteína de fusión no absorben. En otra modalidad, las composiciones pueden suministrarse en una vesícula, en particular un liposoma (Véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et ai., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 343-365 (1989); Lopez-Berestein, ibídem. , pp. 317-327; véase en general ibídem ) . En aún otra modalidad, las composiciones pueden suministrarse en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida. Cualquier técnica conocida por un experto en la técnica puede utilizarse para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más anticuerpos de la invención. Véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,526,938; Publicación de PCT WO 91/05548; Publicación de PCT WO 96/20698; Ning et ai., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cáncer Xenograft Using a Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et ai., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et ai., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application", Pro. Int'l. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et ai., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanizad Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24:759-760, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. En una modalidad, una bomba puede utilizarse en un sistema de liberación controlado (Véase Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwaid et ai., 1980, Surgery 88:507; y Saudek et al . , 1989, N. Engl. J. Med.321 : 574) . En otra modalidad, los materiales poliméricos pueden utilizarse para lograr liberación controlada de anticuerpos (véase por ejemplo, Medical Applications of Controlled Reléase, Langer and Wise (eds.), CRC Press., Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984) ;Ranger and Peppas, 1983, J. , Macromol. Sci. Rev.

Macromol. Chem. 23:61; Véase también Levy et al . , 1985, Science 228:190; During et ai., 1989, Ann. Neurol . 25:351; Howard et al . , 1989, J. ?eurosurg. 71:105); Patente Norteamericana No. 5 ,679,377; Patente Norteamericana No. 5,916,597; Patente Norteamericana No. 5,912,015; Patente Norteamericana No. 5,989,463; Patente Norteamericana No. 5,128,326; Publicación PCT No. WO 99/15154; y Publicación PCT No. WO 99/20253) . Ejemplos de polímeros utilizados en las formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) , poli (metacrilato de metilo) , poli (ácido acrílico) , poli (acetato de etilen-co-vinilo) , poli (ácido metacrílico) , poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli (N-vinilpirrolidona) , poli (alcohol vinílico), poliacrilamida, poli (etilenglicol) , poliláctidos (PLA), poli (láctido-co-glicólidos) , (PLGA) y poliortoésteres . En aún otra modalidad, un sistema de liberación controlada puede colocarse en proximidad del agente terapéutico (por ejemplo, los pulmones) , requiriendo así sólo una fracción de la dosis sistémica (véase por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). En otra modalidad, las composiciones poliméricas útiles como implantes de liberación controlada se utilizan de acuerdo a Dunn et al . (Véase US 5,945,155). Este método particular se basa en el efecto terapéutico de la liberación controlada in situ del material bioactivo a partir del sistema de polímero. La implantación puede ocurrir generalmente en cualquier lugar dentro del cuerpo del paciente con necesidad de tratamiento terapéutico. En otra modalidad, un sistema de suministro sostenido no polimérico se utiliza, por lo que un implante no polimérico en el cuerpo del sujeto se utiliza como un sistema de suministro de fármaco. En la implantación en el cuerpo, el solvente orgánico del implante se disipará, dispersará o deslavará desde la composición en fluido de tejido circundante, y el material no polimérico se coagulará o precipitará gradualmente para formar una matriz microporosa sólida (Véase U.S. 5,888,533) . Se discuten sistemas de liberación controlada en la revisión por Langer (1990, Science 249:1527-1533). Cualquier técnica conocida por un experto en la técnica puede utilizarse para producir formulaciones de liberación sostenida que comprende uno o más agentes terapéuticos de la invención. Véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,526,938, Publicaciones Internacionales Nos. WO 91/05548 y WO 96/20698; Ning et al . , 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-189; Song et ai., 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al . , 1997, pro. Int'l, Symp. Control. Reí. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al . , 1997, Proc. Int'l. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24:759-760, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. En una modalidad específica, en donde la composición de la invención es un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión de su anticuerpo codificado, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de manera que se vuelva intracelular, por ejemplo, por el uso de un vector retroviral (Véase la Patente Norteamericana No. 4,980,286), o por inyección directa, o por el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, un cañón genético; Biolistic Dupont) , o recubriendo con lípidos o receptores de superficie celular o transfectando agentes, o administrándolo en conexión a un péptido similar a homeobox el cual se conoce para penetrar el núcleo (Véase por ejemplo, Joliot et al . , 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), etc. Alternativamente, un ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de célula huésped para expresión por recombinación homologa. Para anticuerpos, la dosis terapéutica o profilácticamente efectiva administrada a un sujeto es normalmente 0.1 mg/kg a 200 mg/kg del peso corporal del sujeto. De preferencia, la dosis administrada a un sujeto está entre 0.1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del sujeto y más preferiblemente la dosis administrada a un sujeto está entre 1 mg/kg a 10 mg/kg del peso corporal del sujeto. La dosis y frecuencia de administración de los anticuerpos de la invención pueden reducirse también mejorando la incorporación y penetración de tejido (por ejemplo, dentro del pulmón) de los anticuerpos o proteínas de fusión por modificaciones tales como, por ejemplo, lipidación. El tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de anticuerpos de la invención puede incluir un solo tratamiento, o de preferencia incluye una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, un sujeto se trata con anticuerpos de la invención en el rango de entre aproximadamente 0.1 a 30 mg/kg de peso corporal, una vez por semana por entre aproximadamente 1 a 10 semanas, de preferencia entre 2 a 8 semanas, más preferiblemente entre aproximadamente 3 a 7 semanas, y aún más preferiblemente durante aproximadamente 4 , 5 ó 6 semanas . En otras modalidades, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran una vez al día, dos veces al día, o tres veces al día. En otras modalidades, las composiciones farmacéuticas se administran una vez a la semana, dos veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada seis meses, una vez cada dos meses, dos veces al año o una vez por año. Se apreciará también que la dosis efectiva de los anticuerpos utilizados para el tratamiento puede incrementarse o disminuirse durante el curso de un tratamiento particular. .5.1 COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Las composiciones de la invención incluyen composiciones de fármaco a granel útiles en la fabricación de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones no estériles o impuras) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que son adecuadas para la administración a un sujeto o paciente) las cuales pueden utilizarse en la preparación de formas de dosis unitarias. Tales composiciones comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de un agente profiláctico y/o terapéutico descrito en la presente o una combinación de aquellos agentes y un portador farmacéuticamente aceptable. De preferencia, las composiciones de la invención comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de anticuerpos de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad particular, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o un fragmento de la misma que enlaza Fc?RIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo o un fragmento de la misma enlaza Fc?RIIA, un anticuerpo citotóxico que enlaza específicamente un antígeno cancerígeno, y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la composición farmacéuticamente aceptable comprende además uno o más agentes anti-cáncer. En una modalidad específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por la agencia reguladora del gobierno Federal o Estatal o listado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales y más particularmente en seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freund (completo o incompleto) , excipiente, o vehículo con el cual se administra el terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Las soluciones salinas y soluciones de dextrosa acuosa y glicerol pueden emplearse también como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede contener también cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o agentes de regulación de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similar. Generalmente, los ingredientes de composiciones de la invención se suministran ya sea de forma separada o se mezclan juntos en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado deshidratado o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolleta o saco que indica la cantidad del agente activo. En donde la composición va a administrarse por infusión, ésta puede distribuirse con una botella de infusión que contiene agua o solución salina de grado farmacéutico. En donde la composición se administra por inyección, una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina puede proporcionarse de manera que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración. Las composiciones de la invención pueden formularse como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a aquellas formadas con aniones tales como aquellas derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con cationes tales como aquellos derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2 -etilamino etanol, histidina, procaína, etc. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas y equipos que comprenden un antagonista de Fc?RIIB para uso en la prevención, tratamiento, manejo o mejora de una malignidad de células B, o uno o más síntomas de los mismos. En particular, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas y equipos que comprenden un antagonista de Fc?RIIB, un análogo, derivado o un anticuerpo anti-Fc?RIIB o un fragmento de enlace de antígeno de las mismas. 5.5.2 TERAPIA GENÉTICA En una modalidad específica, las secuencias que comprenden ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o proteínas de fusión, se administran para tratar, prevenir o mejorar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección a modo de terapia genética. La terapia genética se refiere a terapia realizada por la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta modalidad de la invención, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo codificado o proteína de fusión que median un efecto terapéutico o profiláctico. Cualquiera de los métodos para terapia genética disponibles en la técnica puede utilizarse de acuerdo a la presente invención. Métodos ejemplares se describen posteriormente . Para revisiones generales de los métodos de terapia genética, véase Goldspiel et al . , 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926-932 (1993); Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11 (5) : 155-215; y Scholl, 2003, J. Biomed Biotechnol 2003:35-47. Los métodos comúnmente utilizados en la técnica de la tecnología de ADN recombinante los cuales pueden utilizarse se describen en Ausubel et ai. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993) ; y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) . En un aspecto preferido, una composición de la invención comprende ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo, los ácidos nucleicos son parte de un vector de expresión que expresan el anticuerpo en un huésped adecuado. En particular, tales ácidos nucleicos tienen promotores, de preferencia promotores heterólogos, enlazados operablemente a la región de codificación de anticuerpos, el promotor es inducible o constitutivo, y opcionalmente, específico de tejido. En otra modalidad particular, se utilizan moléculas de ácido nucleico, en las cuales las secuencias de codificación de los anticuerpos y cualesquiera otras secuencias deseadas se flanquean por regiones que promueven la recombinación homologa en un sitio deseado en el genoma, proporcionando de este modo para expresión intracromosomal de los ácidos nucleicos que codifican anticuerpos (Koller y Smithies, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; y Zijlstra et ai., 1989, Nature 342:435-438). En otro aspecto preferido, una composición de la invención comprende ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión, los ácidos nucleicos son una parte de un vector de expresión que expresan la proteína de fusión en un huésped adecuado. En particular, tales ácidos nucleicos tienen promotores, de preferencia promotores heterólogos, enlazados operablemente a la región de codificación de una proteína de fusión, el promotor es inducible o constitutivo, y opcionalmente específico de tejido. En otra modalidad particular, se utilizan moléculas de ácido nucleico en las cuales la secuencia de codifican de la proteína de fusión y cualesquiera otras secuencias deseadas se flanquean por regiones que promueven la recombinación homologa en un sitio deseado en el genoma, proporcionando así expresión intracromosomal de la proteína de fusión que codifica ácidos nucleicos. El suministro de los ácidos nucleicos dentro de un sujeto puede ser ya sea directo, en cuyo caso el sujeto se expone directamente al ácido nucleico o vectores que transportan el ácido nucleico, o indirectamente, en cuyo caso, las células se transforman primero con los ácidos nucleicos in vi tro, luego se transplantan dentro del sujeto. Estos dos métodos se conocen, respectivamente, como terapia genética in vivo o ex vivo . En una modalidad específica, las secuencias de ácido nucleico se administran directamente in vivo, en donde ésta se expresa para producir el producto codificado. Esto puede lograrse por cualquiera de los numerosos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, al construirlos como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de manera que se vuelve intracelular, por ejemplo, por inyección utilizando vectores retrovirales defectuosos o atenuados u otros virales (véase la Patente Norteamericana No. 4,980,286) o por inyección directa de ADN desnudo, o por el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo un cañón genético; Biolistic, Dupont) o recubriendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, o administrándolos en conexión a un péptido el cual se conoce que penetra el núcleo, administrándolo en conexión a un sujeto ligando a endocitosis mediada por receptor (Véase, por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4439-4432) (la cual puede utilizarse para tipos de células objetivo que expresan específicamente los receptores), etc. En otra modalidad, los complejos de ácido nucleico-ligando pueden formarse en donde el ligando comprende un péptido viral fusogénico que interrumpe endosomas, permitiendo al ácido nucleico prevenir la degradación lisosomal. En aún otra modalidad, el ácido nucleico puede dirigirse in vivo para la absorción y expresión específica de células, dirigiendo un receptor específico (Véase por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2005/0002903; Publicaciones PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO 93/14188; WO 93/20221) . Alternativamente, el ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de célula huésped para expresión, por recombinación homologa (Koller y Smithies, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; y Zijlstra et ai., 1989, Nature 342-435-438). En una modalidad específica, se utilizan vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo o una proteína de fusión. Por ejemplo, un vector retroviral puede utilizarse (Véase Miller, et al . , 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el empacado correcto del genoma viral y la integración dentro del ADN de célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo o una proteína de fusión que se utiliza en la terapia genética se clonan dentro de uno o más vectores, lo cual facilita el suministro de la secuencia de nucleótidos en un sujeto. Más detalle acerca de los vectores retrovirales pueden encontrarse en Boesen et al . , (1994, Biotherapy 6:291-302), la cual describe el uso de un vector retroviral para suministrar el gen mdr 1 a células germinales hematopoyéticas con el fin de hacer a las células germinales más resistentes a quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en la terapia genética son: Clowes et al . , 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Klein et ai., 1994, Blood 83:1467-1473; Slamons y Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; y Grossman y Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel 3:110-114. Los adenovirus son otros vectores virales que pueden utilizarse en terapia genética. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para el suministro de genes al epitelio respiratorio. Los adenovirus infectan naturalmente epitelio respiratorio en donde éstos provocan una enfermedad moderada. Otros objetivos para sistemas de suministro basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales y el músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células no divididas. Kozarsky y Wilson (Current Opinión in Genetics and Development 3:499-503, 1993, presenta una revisión de terapia genética basada en adenovirus. Bou et ai., (Human Gene Therapy, 5:3-10, 1994) demostró el uso de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de monos de la india. Otros casos del uso de adenovirus en terapia genética puede encontrarse en Rosenfeld et al . , 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld et al . , 1992, Cell 68:143-155; Mastrangeli et al . , 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234; Publicación PCT WO 94/12649; y Wang et al . , 1995, Gene Therapy 2:775-783. En una modalidad preferida, se utilizan vectores de adenovirus. Los virus adeno-asociados (AAV) se han propuesto también para uso en terapia genética (véase por ejemplo, Walsh et ai., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 y la Patente Norteamericana No. 5,436,146). odo para terapia genética implica transferir un gen a células en cultivo de tejido por tales métodos como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio o infección viral. Usualmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable para las células. Las células se colocan entonces bajo selección para aislar aquellas células que se han incorporado y que expresan el gen transferido. Aquellas células se suministran entonces a un suministro. En esta modalidad, el ácido nucleico se introduce dentro de una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Tal introducción puede llevarse a cabo por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o de bacteriófago, que contiene las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia genética mediada por cromosoma, transferencia genética mediada por microcélula, fusión de esferoplasto, etc. Numerosas técnicas se conocen en el arte para la introducción de genes extraños en las células (Véase, por ejemplo, Loeffler y Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618; Cohén et ai., 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; y Clin. Pharma. Ther. 29:69-92, 1985) y pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención siempre y cuando el desarrollo necesario y las funciones fisiológicas de las célula receptoras no se interrumpa. La técnica debe proporcionar la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de manera que el ácido nucleico es expresable por la célula y de preferencia es heredable y expresable por su progenie celular. Las células recombinantes resultantes pueden suministrarse a un sujeto para varios métodos conocidos en la técnica. Las células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células germinal o progenitoras hematopoyéticas) se administran de preferencia intravenosamente. La cantidad de células concebidas para uso dependiente del efecto deseado, estado del paciente, etc., y pueden determinarse por un experto en la técnica.

Las células en la cuales un ácido nucleico pueden introducirse para propósitos de terapia genética abarcan cualquier tipo celular disponible, deseado, e incluye, pero no se limitan a células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células de músculo, hepatocitos; células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; varias células germinal o progenitoras, en particular células germinal o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, como se obtienen a partir de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc. En una modalidad preferida, la célula utilizada para terapia genética es autóloga al sujeto. En una modalidad, en la cual las células recombinantes se utilizan en terapia genética, secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo o una proteína de fusión se introducen en la células de manera que son expresables por las células o su progenie, y las células recombinantes se administran entonces in vivo para efecto terapéutico. En una modalidad específica, se utilizan células germinal o progenitoras . Cualesquiera células germinal y/o progenitoras las cuales pueden aislarse y mantenerse in vi tro pueden utilizarse potencialmente de acuerdo con esta modalidad de la presente invención (Véase por ejemplo, Publicación PCT WO 94/08598; Stemple y Anderson, 1992, Cell 7 1:973-985; Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A.-229; y Pittelkow y Scout, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771). En una modalidad específica, el ácido nucleico que se introduce para propósitos de una terapia genética comprende un promotor inducible enlazado operablemente a la región de codificación, de manera que la expresión del ácido nucleico es controlable al controlar la presencia o ausencia del inductor apropiado de transcripción. .5.3 EQUIPOS La invención proporciona un paquete o equipo farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con anticuerpos de la invención. Además, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de una enfermedad pueden incluirse también en el paquete o equipo farmacéutico. La invención proporciona también un paquete o equipo farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente asociada con tal o tales recipientes puede ser una advertencia en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuya advertencia refleja la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana. La presente invención proporciona equipos que pueden utilizarse en los métodos anteriores. En una modalidad, un equipo comprende uno o más anticuerpos de la invención. En otra modalidad, un equipo comprende además uno o más agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de cáncer, en uno o más recipientes. En otra modalidad, un equipo comprende además uno o más anticuerpos citotóxicos que enlazan uno o más antígenos cancerígenos asociados con cáncer. En ciertas modalidades, el otro agente profiláctico o terapéutico es un quimioterapéutico. En otras modalidades, el agente profiláctico o terapéutico es un terapéutico biológico u hormonal . .6 CARACTERIZACIÓN Y DEMOSTRACIÓN DE UTILIDAD TERAPÉUTICA Varios aspectos de las composiciones farmacéuticas o agentes profilácticos o terapéuticos de la invención se prueban de preferencia in vi tro, por ejemplo, un sistema de cultivo celular, y luego in vivo, por ejemplo, en un organismo de modelo animal, tal como un sistema de modelo animal de roedor, para la actividad terapéutica deseada antes de utilizarse en seres humanos. Por ejemplo, ensayos los cuales pueden utilizarse para determinar si la administración de una composición farmacéutica específica se indica, incluye ensayos de cultivo celular en los cuales una muestra de tejido de paciente se desarrolla en el cultivo, y se expone a, o de otra forma se pone en contacto con una composición farmacéutica, y el efecto de tal composición en la muestra de tejido se observa, por ejemplo, inhibición para la disminución en el crecimiento y/o la formación de colonias en agar suave o la formación de red tubular en la preparación de membrana de base tridimensional o matriz extracelular. La muestra de tejido puede obtenerse por biopsia a partir el paciente. Esta prueba permite la identificación de la o las moléculas terapéuticamente más efectivas, profilácticas o terapéuticas para cada paciente individual. Alternativamente, en lugar de cultivar células a partir de un paciente, los agentes y métodos terapéuticos pueden seleccionarse utilizando células de un tumor o línea celular maligna. En varias modalidades específicas, ensayos in vi tro pueden llevarse a cabo con células representativas de tipos celulares implicadas en un trastorno autoinmune o inflamatorio (por ejemplo, células T) , para determinar si una composición farmacéutica de la invención tiene un efecto deseado en tales tipos celulares . Muchos ensayos estándares en la técnica pueden utilizarse para evaluar tal supervivencia y/o crecimiento; por ejemplo, la proliferación celular puede evaluarse midiendo la incorporación de 3H-timidina, por conteo celular directo, detectando cambios en la actividad transcripcional de genes conocidos tales como proto-oncogenes (por ejemplo, fos, myc) o marcadores de ciclo celular; viabilidad celular pueden evaluarse por tinción de azul de tripano, la diferenciación puede evaluarse visualmente con base en cambios en morfología, crecimiento disminuido y/o la formación de colonias en agar suave o formación de red tubular en membrana de base tridimensional o preparación de matriz extracelular, etc. Ensayos adicionales incluyen asociación de plataforma, CDC, ADCC y ensayos de apoptosis se conocen en la técnica y se describen en los Ej emplos . Las combinaciones de agentes profilácticos y/o terapéuticos pueden probarse en sistemas de modelo animal adecuado antes de utilizarse en seres humanos. Tales sistemas de modelo animal incluyen, pero no se limitan a ratas, ratones, pollos, vacas, monos, puercos, perros, conejos, etc. Cualquier sistema de animal bien conocido en la técnica pueden utilizarse. En una modalidad específica de la invención, combinaciones de agentes profilácticos y/o terapéuticos se prueban en un sistema de modelo de ratón. Tales sistemas de modelo se utilizan ampliamente y se conocen bien por el técnico calificado. Los agentes profilácticos y/o terapéuticos pueden administrarse repetidamente. Varios aspectos del procedimiento pueden variar de manera que el régimen temporal para administrar los agentes profilácticos y/o terapéuticos, y si tales agentes se administran de modo separado o como una mezcla. Los modelos de animal preferidos para uso en los métodos de la invención son por ejemplo, Fc?R que expresa ratones transgénicos en células efectoras de ratón, por ejemplo, cualquier modelo de ratón descrito en la Patente Norteamericana No. 5,877,396 (la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad) . Los ratones transgénicos para uso en los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a ratones que portan Fc?RIIIA humano, ratones que portan Fc?RIIA humano, ratones que portan Fc?RIIB humano y Fc?RIIIA humano, ratones que portan Fc?RIIB humano y Fc?RIIA humano. Una vez que los agentes profilácticos y/o terapéuticos de la invención se han probado en un modelo animal pueden probarse en pruebas clínicas para establecer su eficacia. Establecer pruebas clínicas se hará de acuerdo con metodologías comunes conocidas por un experto en la técnica, y las dosis y rutas óptimas de administración así como perfiles de toxicidad de las composiciones de la invención pueden establecerse utilizando experimentación de rutina. La actividad anti-inflamatoria de las terapias de combinación de la invención pueden determinarse por utilizar varios modelos de animal experimentales de artritis inflamatoria conocida en la técnica y se describe en Crofford L.J. y Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animáis", en Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, Mccarty et al . (eds.), capítulo 30 (Lee y Febiger, 1993) . Modelos de animal experimentales y espontáneos de artritis inflamatoria y enfermedades reumáticas autoinmunes pueden utilizarse también para evaluar la actividad anti-inflamatoria de terapias de combinación de invención. Los siguientes son algunos ensayos provistos como ejemplos, y no por limitación. Los modelos de animal principales para artritis o enfermedad inflamatoria conocidos en la técnica y utilizados ampliamente incluyen: modelos de rata de artritis inducida por adyuvante, modelos de rata y de ratón de artritis inducida por colágeno y modelos de rata, conejo y hámster de artritis inducida por antígeno, todos descritos en Crofford L.J. y Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animáis", en Arthritis and Allied Conditions: A Texbook of Rheumatology, McCarty et al . (eds.), capítulo 30 (Lee and Febiger, 1993) , incorporada en la presente para referencia en su totalidad. La actividad anti-inflamatoria de terapias de combinación de invención puede evaluarse utilizando un modelo de rata de artritis inducida por carragenina. La artritis inducida por carragenina se ha utilizado también en conejos, perros y puercos en estudios en artritis crónica o inflamación. La evaluación histomorfométrica cuantitativa se utiliza para determina eficacia terapéutica. Los métodos para utilizar tal modelo de artritis inducida de carragenina se describe en Hansra P. et al . , "Carrageenan-Induced Arthritis in the Rat", Inflammation, 24(2): 141-155, (2000). También comúnmente utilizados son los modelos de animal de inflamación inducida por zimosan como se conocen y describen en la técnica. La actividad anti-inflamatoria de terapias de combinación de la invención pueden evaluarse también al medir la inhibición de edema de pata inducida por carrageninas en la rata, utilizando una modificación del método descrito en Winter C.A. et al . , "Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs" Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111, 544-547, (1962) . Este ensayo se ha utilizado como una selección in vivo primaria para la actividad anti-inflamatoria y la mayoría de los NSAID, y se considera predictivo de eficacia humana. La actividad anti-inflamatoria de los agentes profilácticos o terapéuticos se expresa como el porcentaje de inhibición del incremento en el peso de pata trasera del grupo de prueba con relación al grupo control dosificado con vehículo. Además, los modelos de animal para enfermedad de inflamación del intestino pueden utilizarse también para evaluar la eficacia de las terapias de combinación de la invención (Kim et al . , 1992, Scand. J. Gastroentrol . 27:529-537; Stroben, 1985, Dig. Dis. Sci. 30(12 Suppl) :3S-10S) . La colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn son enfermedades de inflamación del intestino humano, que pueden inducirse en animales. Los polisacáridos sulfatados incluyendo, pero sin limitarse a amilopectina, musgo perlado, sulfato de amilopectina y sulfato de dextrano o irritantes químicos incluyendo, pero sin limitarse a ácido trinitrobencensulfónico (TNBS) y ácido acético pueden administrarse a animales oralmente para inducir enfermedades de inflamación del intestino. Los modelos de animal para asma pueden utilizarse también para evaluar la eficacia de las terapias de combinación de la invención. Un ejemplo de tal modelo es el modelo de transferencia adoptiva de murino en el cual la provocación de aeroalergeno de ratones receptores THl o TH2 resulta en la migración de célula efectora TH a las vías respiratorias y se asocia con una respuesta inflamatoria mucosal de pulmón nuetrofílica intensa (THl) y eosinofílica (TH2) (Cohn et ai., 1997, J. Exp. Med. 1861737-1747). Modelos de animal para trastornos autoinmunes pueden utilizarse también para evaluar la eficacia de las terapias de combinación de la invención. Modelos de animal para trastornos autoinmunes tales como diabetes del tipo 1, autoinmunidad de tiroides, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis se han desarrollado (Flanders et ai., 1999, Autoimmunity 29:235-246; Krogh et ai., 1999, Biochimie 81:511-515; Foster, 1999, Semen. Nephrol . 19:12-24). Además, cualesquiera ensayos conocidos por aquellos expertos en la técnica pueden utilizarse para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de las terapias combinatoriales descritas en la presente para enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias . La toxicidad y eficacia de los protocolos profilácticos y/o terapéuticos de la presente invención pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, detectando la LD50 (dosis letal a 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) . La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED5o . Los agentes profilácticos y/o terapéuticos que exhiben índices terapéuticos grandes se prefieren. Aunque los agentes profilácticos y/o terapéuticos que exhiben efectos secundarios tóxicos pueden utilizarse, debe tenerse cuidado diseñar un sistema de suministro que dirige tales agentes al sitio de tejido afectado con el fin de minimizar el daño potencial a células no infectadas y por consiguiente, reduce los efectos secundarios.

Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y estudios de animales pueden utilizarse para formular un rango de dosis de los agentes profilácticos y/o terapéuticos para uso en seres humanos. La dosis de tales agentes yace de preferencia dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosis empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier agente utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede formularse en modelos de animal para conseguir un rango de concentración de plasma circulante que incluye la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que consigue una inhibición media-máxima de síntomas) como se determina en el cultivo celular. Tal información puede utilizarse para determinar más exactamente dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatografía líquida de rendimiento elevado. La actividad anti-cáncer de las terapias utilizadas de acuerdo con la presente invención pueden determinarse también utilizando varios modelos de animal experimentales para el estudio de cáncer tales como modelo de ratón SCID o ratones transgénicos o ratones desnudos con xenoinjertos humanos, modelos animal, tales como hámster, conejos, etc., conocidos en la técnica y se describen en Revelance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, eds. Fiebig and burger) ; Contributions to Oncology (1999, Karger) ; The Nude Mouse in Oncology Research (1991, eds. Boven and Winograd) ; y Anticancer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher) , incorporada en la presente para referencia en su totalidad. Los protocolos y composiciones de la invención se prueban in vi tro y luego in vivo, para la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes del uso en seres humanos. Los agentes y métodos terapéuticos pueden seleccionarse utilizando células de una línea celular de tumor o maligna. Muchos ensayos estándares en la técnica pueden utilizarse para evaluar tal supervivencia y/o desarrollo; por ejemplo, la proliferación celular puede evaluarse al medir la incorporación de 3H-timidina, por conteo celular directo, detectando cambios en la actividad transcripcional de genes conocidos tales como proto-oncogenes (por ejemplo, fos, myc) o marcadores de ciclo celular; la viabilidad celular puede evaluarse por tinción de azul de tripano, la diferenciación puede evaluarse visualmente con base en los cambios en morfología, crecimiento disminuido y/o formación de colonias en agar suave o formación de red tubular en membrana de base tridimensional o preparación de matriz extracelular, etc. Los compuestos para uso en terapia pueden probarse en sistemas de modelo animal adecuados antes de probar en seres humanos, incluyendo, pero sin limitarse a ratas, ratones, pollos, vacas, monos, conejos, hámsters, etc., por ejemplo, los modelos de animal descritos anteriormente. Los compuestos pueden utilizarse entonces en pruebas clínicas apropiadas . Además, cualesquiera ensayos conocidos por aquellos expertos en la técnica pueden utilizarse para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de las terapias combinatoriales descritas en la presente para tratamiento o prevención de cáncer, trastorno inflamatorio o enfermedad autoinmune . .7 MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para propósitos de diagnóstico para detectar, diagnosticar, o monitorear enfermedades, trastornos o infecciones. La invención proporciona la detección o el diagnóstico de una enfermedad, trastorno o infección, particularmente una enfermedad autoinmune que comprende: (a) evaluar la expresión de Fc?RIIB en células o una muestra de tejido de un sujeto utilizando uno o más anticuerpos que se enlazan inmunoespecíficamente a Fc?RIIB; y (b) comparando el nivel del antígeno con un nivel control, por ejemplo, niveles en muestras de tejido normales, por lo que un incremento en el nivel ensayado de antígeno comparado al nivel control del antígeno es indicativo de la enfermedad, trastorno o infección. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para evaluar niveles de Fc?RIIB en una muestra biológica utilizando métodos inmunohistológicos clásicos como se describe en la presente o como se sabe por aquellos de experiencia en la técnica (por ejemplo, véase Jalkanen et al . , 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985); Jalkanen et al . , 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096) . Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar expresión genética de proteínas incluye inmunoensayos, tales como enzimoinmunoanálisis absorbente (ELISA) y el radioinmunoensayo (RÍA) . Las etiquetas de ensayo de anticuerpo adecuadas se conocen en la técnica e incluyen etiquetas de enzima, tales como fosfatasa alcalina, oxidasa de glucosa; radioisótopos tales como yodo (125I, 131I) , carbono (1C) , azufre (35S) , tritio (3H) , indio (121In) , y tecnetio (99?nTc) ; etiquetas luminiscentes, tales como luminol; y etiquetas fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina. Un aspecto de la invención es la detección y el diagnóstico de una enfermedad, trastorno o infección en un ser humano. En una modalidad, el diagnóstico comprende: a) administrar (por ejemplo, parenteral, subcutánea o intraperitonealmente) a un sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo etiquetado que enlaza inmunoespecíficamente a Fc?RIIB; b) esperar un intervalo de tiempo después de la administración para permitir al anticuerpo etiquetado concentrarse de preferencia en sitios en el sujeto en donde Fc?RIIB se expresa (y para molécula etiquetada no unida para evacuarse a un nivel de fondo) , c) determinar el nivel de fondo; y d) detectar el anticuerpo etiquetado en el sujeto, de manera que la detección del anticuerpo etiquetado sobre el nivel de fondo indica que el sujeto tiene la enfermedad, trastorno o infección. De acuerdo con esta modalidad, el anticuerpo se etiqueta con una porción de exploración de imágenes la cual es detectable utilizando un sistema de exploración de imágenes conocido por un experto en la técnica. El nivel de fondo puede determinarse por varios métodos incluyendo, comparar la cantidad de la molécula etiquetada detectada a un valor estándar previamente determinado para un sistema particular. Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de exploración utilizado determinarán la cantidad de porción de exploración necesaria para exploración de diagnóstico. En el caso de una porción de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada variará normalmente alrededor de 5 a 20 milicuries de 99mTc. El anticuerpo etiquetado se acumulará entonces de preferencia en la ubicación de las células las cuales contienen la proteína específica. La exploración de imágenes de tumor in vivo se describe en S.W. Burchiel et ai., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments" (capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detectionof Cáncer, S.W. burchiel and B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982) . Dependiendo de diversas variables, incluyendo el tipo de etiqueta utilizada y el modo de administración, el intervalo de tiempo después de la administración para permitir la molécula etiquetada concentrarse de preferencia en sitios en el sujeto y para molécula etiquetada no enlazada que se evacúa a un nivel de fondo es 6 a 48 horas o 6 a 24 horas o 6 a 12 horas. En otra modalidad, el intervalo de tiempo después de la administración es 5 a 20 días o 5 a 10 días. En una modalidad, el monitoreo de una enfermedad, trastorno o infección se lleva a cabo repitiendo el método para diagnosticar la enfermedad, trastorno o infección, por ejemplo, un mes después del diagnóstico inicial, seis meses después del diagnóstico inicial, un año después del diagnóstico inicial, etc. La presencia de la molécula etiquetada puede detectarse en el sujeto utilizando métodos conocidos en la técnica para barrido in vivo . Estos métodos dependen del tipo de etiqueta utilizada. Obreros calificados podrán ser capaces de determinar el método apropiado para detectar una etiqueta particular. Métodos y dispositivos que pueden utilizarse en los métodos de diagnóstico de la invención incluyen, pero no se limitan a tomografía computada (CT) , barrido corporal completo tal como tomografía por medio de emisión de positrón (PET) , exploración de resonancia magnética (MRI) y sonografía. En una modalidad específica, la molécula se etiqueta con un radioisótopo y se detecta en el paciente utilizando un instrumento quirúrgico sensible a radiación (Thurston et ai., Patente Norteamericana No. 5,441,050). En otra modalidad, la molécula se etiqueta con un compuesto fluorescente y se detecta en el paciente utilizando un instrumento de barrido sensible a fluorescencia. En otra modalidad, la molécula se etiqueta con un metal que emite positrón y se detecta en el paciente utilizando tomografía de emisión de positrón. En aún otra modalidad, la molécula se etiqueta con una etiqueta paramagnética y se detecta en un paciente utilizando exploración de resonancia magnética (MRI) . 6. EJEMPLOS 6.1 PREPARACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES Se produjo un anticuerpo monoclonal de ratón a partir de los clones 3H7 ó 2B6 con números de acceso ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente. Un anticuerpo monoclonal de ratón que enlaza específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que el anticuerpo monoclonal enlaza Fc?RIIA, se generó. Los ratones Fc?RIIA transgénicos (generados en Dr. Ravetch Laboratory, Rockefeller University) se inmunizaron con Fc?RIIB purificado a partir del sobrenadante de 293 células que habían sido transfectadas con ADNc codificando el dominio extracelular del receptor Fc?RIIB humano, residuos 1-180. Las líneas celulares de hibridomas a partir de células citolíticas de estos ratones se produjeron y seleccionaron para anticuerpos que enlazan específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que los anticuerpos enlazan Fc?RIIA. 6.2 SELECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ANTICUERPOS 6.2.1 MATERIALES Y MÉTODOS Se seleccionan sobrenadantes a partir de cultivos de hibridoma para inmunorreactividad contra Fc?RIIA o Fc?RIIB utilizando ensayos ELISA. En cada caso, la placa se recubre con 100 ng/pozo de Fc?RIIA o Fc?RIIB. El enlace del anticuerpo al receptor específico se detecta con anticuerpo conjugado HRP anti-ratón de cabra monitoreando la absorbancia a 650 nm. En el experimento de bloqueo de ELISA, la capacidad del anticuerpo a partir del sobrenadante de hibridoma para bloquear el enlace de IgG agregado a Fc?RIIB se monitorea. La placa se bloquea con el "agente de bloqueo" apropiado, se lava tres veces (200 µl/pozo) con un tampón de lavado (PBS más 0.1% de Tween). La placa se pre-incuba con sobrenadante de hibridoma durante 1 hora a 37°C. Subsecuente al bloqueo, una cantidad fija de IgG humana biotinilada agregada (1 µg/pozo) se agrega a los pozos para permitir al agregado enlazarse al receptor Fc?RIIB. Esta reacción se lleva a cabo durante dos horas a 37°C. La detección se monitorea entonces, después del lavado adicional con conjugado de peroxidasa de rábano de estreptavidina, el cual detecta la IgG agregada enlazada. La absorbancia a 650 nm es proporcional a la IgG agregada enlazada. En un ensayo de liberación de /3-hexoaminidasa la capacidad de un anticuerpo a partir del sobrenadante de hibridoma para inhibir la liberación inducida por Fc? de ß-hexoaminidasa se monitorea. Las células RBL-2H3 se transfectan con Fc?RIIB humano; las células se estimulan con varias concentraciones de fragmento F(ab)2 anti-ratón de cabra, variando desde 0.03 µg/ml a 30 µg/ml; se sensibilizan ya sea con IgE de ratón sola Ja 0.01 µg/ml) o con un anticuerpo anti-Fc?RIIB. Después de 1 hora de incubación a 37°C de temperatura, las células se hacen girar; el sobrenadante se recolecta; y las células se disuelven por medio de usinas. La actividad de /?~hexoaminidasa liberada en el sobrenadante se determina en un ensayo colorimétrico utilizando p-nitrofenil N-acetil-/3 d-glucosaminida. La actividad de /?-hexoaminidasa liberada se expresa como un porcentaje de la actividad liberada con relación a al actividad total . Análisis BIAcore . El enlace de anticuerpo a CD32A- H131, CD32A-R131 o CD32B se analizó por resonancia de plasmón superficial en un biosensor BIACore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Sweden) utilizando dominios extracelulares solubles de los receptores expresados en células 293H. El anticuerpo de captura, un fragmento F(ab')2 de un anticuerpo específico Fc anti-ratón de cabra (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) se inmovilizó en el chip sensor CM-5 de acuerdo al procedimiento recomendado por el fabricante. Brevemente, los grupos carboxilo en la superficie del chip sensor se activaron con una inyección de una solución que contiene 0.2 M de N-etil-N- (3-dietilamino-propil) carbodiimida y 0.05 M de N-hidroxi-succinimida. El fragmento F(ab')2 se inyectó entonces sobre la superficie CM-5 activada en 10 mM de acetato de sodio, pH 5.0 a una velocidad de flujo de 5 µl/min durante 420 segundos, seguida por 1 M de etanolamina para desactivación. Se realizaron experimentos de enlace en tampón HBS-P conteniendo 10 mM de Hepes, pH 7.4, 150 mM de Nací, y 0.005% de tensioactivo P20. Se capturó cada anticuerpo monoclonal en el chip CM-5 inyectando una solución de anticuerpo 300nM a una velocidad de flujo de 5 µl/min durante 240 segundos, seguida por una inyección de receptores solubles monoméricos en una concentración de 100 nM y una velocidad de flujo de 50 µl/min durante 120 segundos con tiempo de disociación de 180 segundos. La regeneración de la superficie de F(ab')2 GAM se realizó por inyección de pulso de 50 mM de glicina, pH 1.5 y 50 mM de NaOH. Las curvas de referencia se obtuvieron por inyección de cada receptor soluble sobre la superficie F(ab')2 GAM inmovilizada sin anticuerpo capturado. Las curvas de referencia se sustrajeron y las respuestas se normalizaron al mismo nivel de anticuerpo capturado. Para obtener parámetros cinéticos de enlace de receptores solubles para anticuerpos capturados, las curvas de enlace a IgG correspondiente en concentraciones correspondientes se sustrajeron. Las curvas resultantes se analizaron por ajuste de ka/kd separado. Se calcularon valores KD como promedio de cuatro curvas a dos diferentes concentraciones . ANÁLISIS FACS: Las células CHO, que expresan Fc?RIIB se tiñen con varios anticuerpos y se analizan por FACS. En una serie de experimentos, las células se etiquetan directamente para determinar si los anticuerpos monoclonales reconocen el receptor. En el experimento FACS de bloqueo, la capacidad del anticuerpo a partir del sobrenadante de hibridoma para bloquear el enlace de IgG agregada a Fc?RIIB se monitorea.

Alrededor de 1 millón de células (células CHO que expresan Fc?RIIB) para cada muestra se incuban en hielo durante 30 minutos con 2 µg del control de isotipo (IgGl de ratón) o con el anticuerpo 2B6 o 3H7. Las células se lavan una vez con PBS+1% de BSA y se incuban con 1 µg de IgG humana biotinilada agregada durante 30 minutos en hielo. Las células se lavan y los anticuerpos secundarios se agregan, FITC anti-ratón detecta el anticuerpo enlazado y se conjuga estreptavidina-PE para detectar la IgG humana biotinilada agregada enlazada y se incuba en hielo durante 30 minutos. Las células se lavan y se analizan por FACS. Se tiñen los linfocitos B para detectar la presencia de Fc?RIIB y CD20. Se incuba 200 µl de "célula mononuclear de cultivo" para cada muestra en hielo con 2 µg de control isotipo o los anticuerpos monoclonales, 2B6 o 3H7. Las células se lavan una vez con PBS+1% de BSA y se incuban con 1 µl de anticuerpo PE anti-ratón de cabra durante 30 minutos en hielo. Las células se lavan una vez y se agrega el anticuerpo CD20-FITC (2 µg) a las muestras y se incuban en hielo durante 30 minutos. Todas las muestras se lavan con PBS+1%BSA una vez y las células se analizan por FACS. Se tiñeron PBMCs humanas con 2B6, 3H7 y anticuerpos IV.3, seguidos por un anticuerpo conjugado de cianina antiratón de cabra (Cy5) (tinción de dos colores utilizando anti-CD20FITC conjugado para linfocitos B, anti-CD14-PE conjugado para monocitos, anti-CD56-PE conjugado para células NK y anti-CD16-PE conjugado para granulocitos. ENSAYO ADCC: Las células objetivo 4-5xl06 que expresan antígeno Her2/neu (células IGROV-1 o SKBR-3) se etiquetan con 2 , 2 ': 6' , 2" -terpiridin—t-6" -dicarboxilato de bis (acetoximetilo) (Reactivo DELFIA BATDA, Perkin Elmer/Wallac) . El reactivo BATDA se agrega a las células y la mezcla se incuba a 37°C de preferencia bajo 5% de C02 durante al menos 30 minutos. Las células se lavan entonces con un tampón fisiológico, por ejemplo, PBS con 0.125 mM de sulfinpirazol, y medio que contiene 0.125 mM de sulfinpirazol . Las células objetivo etiquetadas se agregan a células efectoras, por ejemplo, PBMC, para producir relaciones de efectoras :objetivo de aproximadamente 50:1, 75:1 o 100:1. PMBC se aisla estratificando sangre completa sobre Ficoll-Hypaque (Sigma) y haciendo girar a temperatura ambiente durante 30 minutos a 500 g. La capa de leucocitos se cosecha como efectoras para ensayos ADCC basados en europio. Se utiliza monocitos filtrados por lavado congelados o recientemente aislados (Advanced Biotechnologies, MD) como efectores con las líneas celulares objetivo de tumor en efectores variables a la relación objetivo de 100:1 a 10:1 y la concentración de los anticuerpos se titula a partir de 1-15 µg/ml . Los monocitos obtenidos como caldos congelados estimulados con citoquinas se utilizan como células efectoras en ensayos ADCC. Si se realizan monocitos congelados óptimamente, se utilizarán rutinariamente de otro modo células recientes se utilizará. MDM se preparará por el tratamiento con citoquinas GM-CSF o M-CSF que se conocen que mejoran la viabilidad y la diferenciación de monocitos en el cultivo. MDM se estimulará con citoquinas y la expresión de los diversos Fc?Rs (I, IIA, IIB e IIA) determinados por análisis FACS. Las células efectoras y objetivo se incuban por al menos dos horas, y hasta 16 horas, a 37°C bajo 5% de C02 en la presencia de un anticuerpo anti-tumor, específico para un antígeno expresado en las células objetivo, Her2/neu, y en la presencia o ausencia de un anticuerpo anti-Fc?RIIB. Un anticuerpo 4D5 quimérico que se ha diseñado para contener la mutación N297A la cual se utiliza como un control negativo ya que este anticuerpo enlaza las células objetivo de tumor a través de su región variable. La pérdida de glicosilación en este sitio suprime el enlace de la región Fc del anticuerpo a Fc?R. IgGl/k humana comercialmente disponible sirve como un control isotipo para el anticuerpo anti-Fc?RIIB. Los sobrenadantes celulares se cosechan y se agregan a una solución de europio acídica (por ejemplo, DELFIA Europium Solution, Perkin Elmer/Wallac) . La fluorescencia de los quelatos de Europio-TDA formada se cuantifica en un fluorómetro de resolución de tiempo (por ejemplo, Víctor 1420, Perkin Elmer/Wallac) . La liberación máxima (MR) y la liberación espontánea (SR) se determinan por incubación de células objetivo con 1% de TX-100 y medio solo, respectivamente . La citotoxicidad celular independiente de anticuerpos (AICC) se mide por incubación de células objetivo y efectoras en la ausencia de anticuerpos . Cada ensayo se realiza de preferencia por triplicado. El porcentaje promedio de lisis específica se calcula como: liberación experimental (ADCC) - AICC) / (MR-SR) X 100. 6.2.2 CARACTERIZACIÓN DEL ANTICUERPO MONOCLONAL PRODUCIDO A PARTIR DEL CLON 3H7 El enlace directo de diferentes lotes de cultivos de hibridoma : El enlace directo de diferentes lotes de cultivos de hibridoma a Fc?RIIA y Fc?RIIB se compararon utilizando un ensayo ELISA (Figura 1A) . Los sobrenadantes numeradas 1, 4, 7, 9 y 3 se probaron para enlace específico y su enlace se comparó a un anticuerpo comercialmente disponible, FL18.26. Como se muestra en la FIGURA ÍA (panel izquierdo) , el sobrenadante de un clon 7 tiene el enlace máximo a Fc?RIIB, el cual es aproximadamente cuatro veces más elevado bajo condiciones de saturación que el enlace del anticuerpo comercialmente disponible a Fc?RIIB. Sin embargo, el sobrenadante del clon 7 tiene apenas alguna afinidad para Fc?RIIA, como se ve en el panel derecho, mientras el anticuerpo comercialmente disponible enlaza Fc?RIIA al menos 4 veces mejor. -Enlace directo del anticuerpo producido a partir del clon 3H7 a Fc RIIa y FcftIIIB : El enlace del sobrenadante 3H7 sin purificar y el sobrenadante 3H7 purificado se midió (FIGURA IB) . En cada caso, se suministró el sobrenadante en una concentración de 70 µg/ml y se diluyó hasta 6 veces. Como se muestra en. la FIGURA IB, en condiciones de saturación, el sobrenadante 3H7 enlaza Fc?RIIB cuatro veces mejor que enlaza Fc?RIIA. En la purificación con la columna de proteína G, el enlace absoluto del sobrenadante 3H7 a cada inmunógeno mejora . Bloqueo de Enlace de IG humana agregada a Fc?RIIB por el anticuerpo producido a partir del clon 3H7. Si el anticuerpo presente en el sobrenadante de hibridoma enlaza Fc?RIIB en el sitio de enlace de IgG y bloquea el enlace de IgG, y entonces la IgG agregada no enlaza el receptor y por lo tanto no puede detectarse ninguna absorbancia en 650. El anticuerpo en efecto es un "agente de bloqueo" que bloquea el sitio de enlace IgG en Fc?RIIB. Como un control, el ELISA se llevó a cabo sin bloqueo, con un sobrenadante control, y con sobrenadante a partir del clon 3H7. Como se muestra en la FIGURA 2 , el sobrenadante 3H7 bloquea completamente el enlace IgG, ya que la IgG agregada no enlaza el receptor como es evidente a partir de la falta de absorbancia a 650 nm. El sobrenadante control fracasa sin embargo al bloquear el enlace de IgG; la IgG agregada enlaza el receptor como es evidente por la lectura a 650 nm. El sobrenadante control se comporta de modo similar a la condición en donde no se hizo ningún bloqueo. Comparación del enlace directo del anticuerpo producido a partir del clon 3H7 a FcyRIIB bacteriano y mamíf ro . Como se muestra en la FIGURA 3 , el sobrenadante a partir del clon 3H7, enlaza comparablemente a Fc?RIIB de mamífero y bacteriana. En las condiciones de saturación, el sobrenadante 3H7 enlaza Fc?RIIB bacteriano y de mamífero alrededor de tres veces mejor que enlaza Fc?RIIA. El anticuerpo monoclonal a partir del clon 3H7 es de este modo capaz de enlace específicamente a Fc?RIIB de mamífero el cual se ha modificado post-transnacionalmente (por ejemplo, glicosilación) . Enlace directo del anticuerpo producido a partir del clon 3H7 a FcyRIIA, Fc?RIIB y Fc?RIIIA . El enlace directo de sobrenadante a partir de los cultivos de hibridoma a partir de la línea celular 3H7 a Fc?RIIA, Fc?RIIIA y Fc?RIIB se compararon utilizando un ensayo ELISA (FIGURA 4) . El anticuerpo producido a partir del clon 3H7 no tiene afinidad para Fc?RIIIA, y enlaza Fc?RIIB con aproximadamente 4 veces mas afinidad que el enlace Fc?RIIA. 6.2.2.1 CARACTERIZACIÓN DEL ANTICUERPO MONOCLONAL PRODUCIDO A PARTIR DEL CLON 2B6 Comparación de enlace directo del anticuerpo producido a partir del clon 2B6 comparado a otros tres anticuerpos monoclonales comercialmente disponibles contra FcyRII . El enlace del anticuerpo producido a partir del clon 2B6 a Fc?RIIA y Fc?RIIB se compara a aquel de los tres otros anticuerpos comercialmente disponibles, AtlO, FL18.26 y IV.3, contra Fc?RII en un ensayo ELISA. Como se ve en la FIGURA 5A, el anticuerpo producido a partir del clon 2B6 enlaza Fc?RIIB a 4.5 veces mejor que los otros anticuerpos comercialmente disponibles. Además, el anticuerpo producido a partir del clon 2B6 tiene afinidad mínima para Fc?RIIA, mientras los otros tres anticuerpos comercialmente disponibles enlazan Fc?RIIA en una manera saturable y dos veces tanto como el anticuerpo del clon 2B6 enlaza Fc?RIIA (FIGURA 5B) . Bloqueo de IgG humano agregado a Fc?RIIB por el anticuerpo producido a partir del clon 2B6. La capacidad del anticuerpo producido a partir del clon 2B6 para bloquear el enlace de la IgG agregada a Fc?RIIB se investigó por un ensayo ELISA de bloqueo y se comparó a aquel del anticuerpo producido por el clon 3H7. Como se muestra en la FIGURA 6A, el sobrenadante control no enlaza Fc?RIIB en el sitio de enlace IgG y la IgG agregada puede enlazar el receptor y por lo tanto la absorbancia a 650 nm es máxima. El clon 3H7, sin embargo bloquea el enlace de IgG hasta 75%. El clon 2B6 bloquea completamente el enlace del sitio de enlace de IgG y no permite a la IgG agregada al enlace del receptor, y aún en diluciones muy elevadas no se detecta absorbancia a 650 nm. La FIGURA 6B representa los datos en un diagrama de barra. Competición de anticuerpo 2B6 e IgG agregada en enlace Fc RIIB utilizando ensayos FACS de doble tinción . Un ensayo FACS de doble tinción se utilizó para caracterizar el anticuerpo producido a partir del clon 2B6 en células CHO que se había transfectado con Fc?RIIB de mamífero de longitud total . Como se muestra en la FIGURA 7C, el anticuerpo producido a partir del clon 2B6 bloquea efectivamente el enlace de IgG agregada al receptor Fc?RIIB en células CHO ya que no se observa ninguna tinción para IgG agregada biotinilada después de que las células se pre-incubaron con el anticuerpo monoclonal. Las células se tiñen sólo en el panel derecho inferior, indicando que la mayoría de las células se enlazaron al anticuerpo monoclonal a partir del clon 2B6. En los experimentos control, utilizar IgGl como el control de isotipo, FIGURA 7A, cuando las células se tiñen con la IgG etiquetada con isotipo, no se observa ninguna tinción ya que la IgG monomérica no enlaza Fc?RIIB con ninguna afinidad detectable, mientras en la FIGURA 7B, aproximadamente 60% de las células se tiñen con IgG agregada, la cual es capaz de enlazar Fc?RIIB. Especificidad y selectividad para CD32B por análisis de resonancia de plasmón superficial . Las afinidades específicas y relativas para CD32B humaría contra CD32A se estudiaron por análisis de resonancia de plasmón superficial . Todos los anticuerpos se capturaron en la superficie de chip por un fragmento F(ab')2 inmovilizada de un anticuerpo anti-ratón de cabra. Las formas monoméricas solubles de CD32A-H131 humano, CD32A-R131 o CD32B se inyectaron para monitorear la interacción con los anticuerpos capturados. Como se muestra en las FIGURAS 8A-C, 2B6 interactúan con CD32B (Panel A) en la ausencia de enlace detectable a CD32A (Paneles B y C) . Un anticuerpo anti-huCD32 comercial, bien caracterizado, KB61, se utilizó también en el ensayo para comparación. KB61 mostró el enlace a ambos receptores. Por lo tanto, 2B6 reacciona exclusivamente con CD32B en la ausencia de reconocimiento de CD32A detectable. 6.2.3 ANÁLISIS FACS Anticuerpos anti -Fc RIIB monoclonales y Linfocitos B Humanos de co-tinción CD20 . Se utilizó un ensayo FACS de doble tinción para caracterizar el anticuerpo producido a partir de los clones 2B6 y 3H7 en linfocitos B humanos. Las células se tiñeron con anticuerpo anti-CD20 el cual se conjugó con FITC, para seleccionar la población de linfocito B, así como los anticuerpos producidos a partir del clon 3H7 y 2B6, etiquetado con peroxidasa anti-ratón de cabra. El eje horizontal representa la intensidad de la fluorescencia de anticuerpo anti-CD20 y el eje vertical representa la intensidad de la fluorescencia de anticuerpo monoclonal. Como se muestra en las FIGURAS 9B y C, las células se tiñen dobles con el anticuerpo anti-CD20 así como los anticuerpos producidos a partir de clones 2B6 y 3H7, sin embargo el anticuerpo producido a partir del clon 2B6 muestra una tinción mas intensa que aquella producida a partir del clon 3H7. La FIGURA 9A muestra la tinción de la IgGl de ratón de control de isotipo. Tinció de células CHO que expresan Fc RUB . Las células CHO, que expresan establemente Fc?RIIB se tiñó con control de isotipo IgGl (FIGURA 10A; panel izquierdo) o con sobrenadantes a partir del hibridoma 3H7 (FIGURA 10B; panel derecho) . Se utilizó el anticuerpo conjugado de peroxidasa anti-ratón de cabra como un anticuerpo secundario. Las células se analizaron entonces por FACS; las células que se tiñen con el sobrenadante a partir del hibridoma 3H7 muestra una señal de fluorescencia fuerte y un cambio pico en la derecha; indicando la detección de Fc?RIIB en las células CHO por el sobrenadante producido a partir del hibridoma 3H7. Las células teñidas con el sobrenadante a partir del hibridoma 2B6, también muestran una fluorescencia significativa cuando se compara a las células teñidas con IgGl, y un cambio pico a la derecha, indicando la detección de Fc?RIIB en las células CHO por el sobrenadante producido a partir del hibridoma 2B6. Las células CHO que expresan hyFc?RIIB se incubaron con los anticuerpos anti CD32B, 2B6 o 3H7. Las células se lavaron y 9 µg/ml de IgG humana agregada se agregaron a las células en hielo . Las IgG agregadas humanas se detectaron con GITC de IgG anti-humana de cabra conjugada. Las muestras se analizaron por células FACS etiquetadas con 2B6 o 3H7 mostraron un pico de fluorescencia significativo en la presencia de una IgG humana agregada (FIGURA 11) . El anticuerpo 2BG bloquea completamente el enlace de IgG agregada como se evidencia por el cambio pico fluorescente a la izquierda. Mientras que el anticuerpo 3H7 bloquea parcialmente el enlace de IgG agregada como se muestra por el pico fluorescente intermediario. Los otros anticuerpos, 1D5, 1F2, 2E1, 2H9 y 2D11 no bloquean el enlace de IgG agregada. La cantidad de cada anticuerpo enlazado al receptor en las células se detectó también (inserción) en un conjunto separado de muestras utilizando un anticuerpo conjugado PE anti-ratón de cabra. -Recansci-mie-n o de CD32B en la superficie celular . Se llevaron a cabo los experimentos para probar la capacidad de los anticuerpos para discriminar CD32B a partir de CD32A expresada en células y para reconocer la molécula CD32B nativa en líneas celulares humanas. Para evaluar la especificidad de los anticuerpos, 2B6 y el anticuerpo pan-anti-CD32, FLI-826, se probaron en análisis de FACS con células humanas 293 -HEK transfectadas establemente con vectores de expresión que codifican las proteínas CD32A-R131 o CD32B humanas, Daudi, Raji y THP-1 (FIGURAS 12A-J) . 2B6 reacciona con 293 -HEK transfectadas con CD32B así como células Daudi y Raji (líneas de linfoblastoides derivados de linfoma Burkitt que expresan C32B) , aunque no se tiñeron líneas celulares monolíticas THPl, las cuales se conocen para expresar exclusivamente CD32A (forma H131) . En contraste, FL18.26 reacciona con todas las líneas celulares sin indicar presencia entre CD32A y CD32B. Perfiles FACS utilizando anticuerpos 2B6, 3H7 e IV.3 en leucocito de sangre periférica humana . El perfil FACS de los anticuerpos anti-Fc?RIIB y anticuerpo IV.3 muestran su capacidad para discriminar entre las dos isoformas Fc?RII, IIB e IIA expresadas en las células hematopoyéticas humanas. IV.3, uno de los primeros anticuerpos (comercialmente disponible) utilizados para definir Fc?RII, muestran enlace preferencial a Fc?RIIA. Existen diferencias características y funcionalmente significativas en expresión de isoformas entre mayores tipos de células hematopoyéticas humanas. Los linfocitos B humanos expresan exclusivamente la isoforma huFc?RIIB mientras los monocitos humanos expresan predominantemente la isoforma huFc?RIIA. Los granulocitos son fuertemente positivos para Fc?RIIA y la evidencia limitada sugiere que Fc?RIIB se expresa marginalmente en esta población (Pricop et al . , 2000, J. Immunol . 166:531-537) Para caracterizar además la reactividad de los anticuerpos anti-Fc?RIIB, huPBL se tiñeron con los anticuerpos anti-Fc?RIIB 2B6 y 3H7 y con IV.3, los cuales de preferencia (pero no exclusivamente) reconocen la isoforma Fc?RIIA del receptor, las poblaciones de leucocitos se seleccionaron con base en la activación periódica de FSC contra SSC (FIGURA 13) y se identificaron con mercados específicos: CD20 (células B) , CD56 o CD16 (células NK, activación de linfocitos) , CD14 (monocitos) y CD16 (granulocitos, activación de granulocitos) (FIGURA 13) . Las células positivas CD20 (células B) se tiñeron uniformemente con 2B6, 3H7. IV.3 también tiñen la mayoría de las células positivas CD20. No se observó ninguna tinción para células NK positivas CD16/CD56, mientras sólo una fracción de células positivas de CD14- (monocitos) y CD16- (granulocitos) se tiñeron con 2B6, 3H7. En contraste, IV.3 tiñe fuertemente la vasta mayoría de monocitos positivos CD-14 y la totalidad de granulocitos positivos CD16 (FIGURA 13) . Este patrón diferencial de reactividad entre 2B6 y 3H7 en el lado y IV-3 en el otro indica que los nuevos anticuerpos monoclonales reaccionan fuertemente con Fc?RIIB, pero no con Fc?RIIA, mientras IV-3 no puede discriminar entre las isoformas Fc?RIIA y Fc?RIIB in vivo. 6.2.4 INHIBICIÓN DE B-HEXOSAMINIDASA LIBERADA POR 2B6 Para examinar el papel potencial de un anticuerpo anti-CD32B en modular las reacciones de hipersensibilidad del tipo inmediato, el efecto para reducir una co-agregación de receptores de activación (FceRI) e inhibidores (Fc?RIIB) se investigó. Se eligió la línea celular de leucemia basofílica de rata, RBL-2H3 como un sistema modelo debido a su uso extensivo en la técnica como un modelo de alergia diseñado para estudiar el mecanismo subyacente de activación de células cebadas mediadas por IgE (Ott et al . , 2002, J. Immunol. 168:4430-9). Las células RBL transfectadas que expresan Fc?RIIB se suspendieron en un medio recién preparado que contiene 0.01 µg/ml de IgE anti-DNP de murino y se colocaron en placas, en placas de 96 pozos en una concentración de 2xl04 células/pozo. Después de la incubación durante la noche a 37°C en la presencia de C02, las células se lavaron dos veces con tampón liberado pre-calentado (10 mM de HEPES, 137 mM de NaCl, 2.7 mM de KCl, 0.4 mM de fosfato de sodio monobásico, 5.6 M de glucosa, 1.8 mM de cloruro de calcio, 1.3 mM de sulfato de magnesio y 0.04% de BSA, pH 7.4) y se trata a 37 °C con diluciones en serie de BSA-DNP-FITC combinado con anticuerpo 4-4-20 quimérico o BSA-DNP-FITC combinado con anticuerpo D265A 4-4-20 quimérico en 100 µl de tampón/pozo en la presencia del anticuerpo 2B6, anticuerpo 1F2 o control de isotipo de IgGl de murino. Alternativamente, las células se emplazaron con fragmentos F(ab')2 de una IgG anti-ratón de cabra policlonal para agregar Fc?RI (Genzyme) . La reticulación de los Fc?Rs ocurre debido a que el anticuerpo policlonal reconoce la cadena ligera del anticuerpo IgE de murino enlazado a Fc?RI . Este experimento se muestra esquemáticamente en la FIGURA 14A. La reacción se detuvo después de 30 minutos al colocar las células en hielo. 50 µl de sobrenadante a partir de cada pozo se removió y las células se disolvieron por lisinas osmóticamente. Los lisatos celulares se incubaron con p-Nitrofenil-N-Acetil-beta-D-glucosaminida (5 mM) durante 90 minutos, la reacción se detuvo con glicina (0.1 M, pH 10.4) y la absorbancia a 405 nm se midió después de tres minutos. El porcentaje de /3-hexosaminidasa liberada se calculó como la OD media total/OD de sobrenadante total/OD de sobrenadante total + lisato celular total. RESULTADOS . Para probar la capacidad de ch2B6 para limitar las respuestas inflamatorias o alérgicas accionadas por el receptor de activación, los fragmentos F(ab')2 se utilizaron para co-agregar receptores de activación o combinaciones de receptores inhibidores y de activación como se describe anteriormente. Cuando se sensibilizan las células solo con IgE, los fragmentos F(ab')2 de la IgG anti-ratón de cabra policlonal reconocen la cadena ligera de la IgE de murino enlazada a FceRI , agrega estos receptores de activación y jS-hexosaminidasa libera un marcador para desgranulación (Aketani et al . , 2001, Immunol . Lett. 75:185-9) , incrementada con IgE de incremento (FIGURA 14B) . En contraste, cuando las células se sensibilizan con IgE después de la incubación con 2B6 o 1F2, el fragmento F(ab')2, en efecto se co-reticula el FceRI de rata con CD32B y resulta en una disminución significativa en liberación de ß-hexosaminidasa cuando se compara a células sensibilizadas pre-incubadas con un anticuerpo acoplado control de isotipo IgG? de murino irrelevante. No se detectó ninguna desgranulación sobre los niveles de fondo en células tratadas con los anticuerpos anti-CD32B solos (datos no mostrados) . Por lo tanto, el receptor inhibidor humano, CD32B, puede inducir una señal negativa en células basofílicas de rata, validando estos transfectantes como un modelo para el estudio de anticuerpos CD32B anti-humanos . Para probar si anticuerpos anti-CD32b pueden ser capaces de mejorar tales reacciones, el co-acoplamiento del receptor inhibidor con un receptor de activación se evitó por un bloqueo de CD32B. El co-acoplamiento de estos receptores se piensa ocurre fisiológicamente cuando los antígenos interactúan simultáneamente con IgE enlazada a superficie a través de epítopes antigénicos y con CD32B a través de determinantes Fc de IgG específica de antígeno combinada con el antígeno mismo (FIGURA 15A) . Para imitar esta situación, el modelo RBL-2H3 se manipuló para obtener co-acoplamiento de FceRI y CD32B al desarrollar un antígeno sustituto que podría combinarse con IgE, IgG o ambos. Se sensibilizaron células HuCD32B+ RBL-2H3 con un anticuerpo monoclonal anti-DNP de IgE de murino. El antígeno emplazado, BSA-DNP, se conjugó además a FITC para proporcionar epítopes- adicionales reconocidos por una versión quimérica de 4-4-20, un anticuerpo anti-fluoresceína de murino cuya porción Fc había sido sustituida con IgG? Fc humana para permitir enlace óptimo a CD32B humana. Una versión quimérica de 4-4-20 con una IgG_ Fc humana que soporta una mutación en la posición 265 (asparagina a alanina) se generó también. Este anticuerpo D265A 4-4-20 quimérico carece de la capacidad para enlazar Fc?R's, incluyendo CD32B. BSA-DNP-FITC induce una liberación dependiente de dosis de |S-hexosaminidasa a partir de células RBL-2H3 sensibilizadas con IgE (FIGURA 15C) . El mismo grado de desgranulación se observó cuando el antígeno emplazado fue BSA-DNP-FITC combinado con D265A 4-4-20 quimérica, mostrando que BSA-DNP-FITC-quimérica D265A 4-4-20, como se espera fue incapaz de reclutar CD32B al receptor de activación. En la presencia de BSA-DNP-FITC combinada con 4-4-20 quimérica, una reducción sustancial en liberación de /3-hexosaminidasa se observó (FIGURA 15B) . De este modo, el antígeno polivalente es capaz de agregar FceRI con desgranulación resultante, mientras el complejo de antígeno secundario con IgG co-agrega CD32B resultando en desgranulación disminuida. Para bloquear CD32B mientras minimiza las oportunidades de acoplar simultáneamente Fc?R, fragmentos F(ab)2 de 2B6 se prepararon y las células se preincubaron con 2B6 F(ab)2, antes de la activación con el antígeno inmunocomplejo. Bajo estas condiciones, el porcentaje de liberación de /3-hexosaminidasa se restauró a los máximos niveles observados en las células tratadas con el antígeno polivalente solo (FIGURA 15C) . En concentraciones más elevadas de antígeno inmunocomplejo una desgranulación disminuida se observó además, presumiblemente debida a la competencia entre ch4-4-20 y 2B6 F(ab)2 para el sitio de enlace Fc de CD32B. Estos datos muestran que 2B6 es capaz de bloquear funcionalmente el sitio de enlace Fc de CD32B, evitando la co-ligación de receptores de activación e inhibidores por un antígeno complejo de IgG. El modo propuesto de acción puede tener uso en la regulación de activación de células mediadas por inmunocomplejo.

CELULARES DE C NCER DE OVARIO Y DE MAMA UTILIZANDO PBMC Con el fin de determinar si las células IGROV-1, OVCAR-8 y SKBR-3 expresan el antígeno Her2/neu, las células se tiñeron con cualquier anticuerpo 4D5 o ch4D5 purificado en hielo; el anticuerpo no enlazado se lavó con tampón de PBS/BSA que contiene azida de sodio, y el enlace de 4D5 o ch4D5 se detectó por anticuerpo anti-ratón de cabra o antihumano de cabra conjugado a PE (Jackson Laboratories) , respectivamente. Un anticuerpo de IgGl irrelevante (Becton Dickinson) sirve como un control para el enlace no específico. Como se muestra en las FIGURAS 16 A-C, las líneas celulares de tumor de ovario expresan menos antígenos Her2/neu que la línea celular de carcinoma de mama y evaluando estas líneas celulares en paralelo determinará la restricción de depuración del tumor por un anticuerpo anti-Fc?RIIB de la invención. Los monocitos humanos son la población efectora implicada en ADCC que expresa tanto receptores de activación como inhibidores. La expresión de Fc?Rs se trató por análisis FACS utilizando varias porciones de monocitos congelados cuando estas células se transferirán por adopción como efectoras para investigar el papel de ch2B6 en depuración de tumor. Se descongelaron monocitos destilados congelados comercialmente obtenidos en un medio basal conteniendo 10% de suero AB humano y en medio basal con suero humano y 25-50 ng/ml de GM-CSF. Las células se tiñeron ya sea directamente o se les permitió madurar a macrófagos durante 7-8 días (MDM) , se despegó el plástico, y luego se tiñó con IV-3-FITC (anti-hu Fc?RIIA) , 32.2 FITC (anti-Fc?RI) , CD16-PE (Pharmingen) o 3G8 (anti-Fc?RIII) -anti-ratón-PE de cabra, 3H/ (anti-Fc?RIIB) y marcador CD14 para monocitos (Pharmingen) , junto con los controles de isotipo relevantes . Un perfil FACS representativo de MDM a partir de dos donadores, describiendo expresión Fc?R en monocitos recientemente descongelados y monocitos cultivados, se muestra en las FIGURAS 17 A-C. Estos resultados indican que Fc?RIIB se expresan modestamente en monocitos (5-30% dependiendo del donador) . Sin embargo, esta expresión se incrementa cuando maduran dentro de los macrófagos. Los datos preeliminares muestran que los macrófagos que infiltran tumores en especímenes de tumor humano se tiñen positivamente para Fc?RIIB (datos no mostrados) . El patrón de Fc?Rs y la capacidad para diferenciar morfológicamente en macrófagos se encontró para ser reproducible en varias porciones de monocitos congelados . Estos datos indican que esta fuente de células es adecuada para experimentos de transferencia adoptiva.

Ch4D5 media ADCC efectiva con líneas de células de cáncer de ovario y de mama utilizando PBMC. La actividad de ADCC de anticuerpo anti-Her2/neu se probó en ensayo basado en europio. La línea celular de ovario, IGROV-1, y la línea celular de cáncer de mama, SKBR-3 se utilizaron como objetivos etiquetados en un ensayo de 4 horas con PBL humano como células efectoras. Las FIGURAS 18 A y B indican que ch4D5 es funcionalmente activo para medir lisis de objetivos que expresan Her2/neu. El efecto de un anticuerpo de la invención en la actividad de ADCC del anticuerpo anti-Her2/neu se mide subsecuentemente. 6.2.5.2 ANTICUERPO QUIMÉRICO ANTI-CD32, CH2B6, MEDIA CITOTOXICIDAD CELULAR MEDIADA POR ANTICUERPO (ADCC) JN VITRO Un anticuerpo anti-CD32B quimérico (ch2B6) y su forma aglicosilada (ch2B6Agly) se probaron para la capacidad para mediar citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo in vivo (ADCC) contra líneas de linfoma de células B que expresan CD32B, Daudi y Raji. Un anticuerpo anti-CD32B humanizado (h2B6) y su forma aglicosilada (hu2B6YA) se probaron también en células Daudi . El protocolo para la evaluación de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) es similar a aquel previamente descrito en (Ding et ai., 1998, Immunity) y se describe en la presente. Brevemente, las células objetivo a partir de líneas de linfomas de células B que expresan CD32B, Daudi y Raji, se etiquetaron con el 2 , 2 ' : 6' , 2"-terpiridin-6, 6" -dicarboxilato de europio quelato bis (acetoximetilo) (Reactivo DELFIA BATDA, Perkin Elmer/Wallac) o Indio-111. Las células objetivo etiquetadas se opsonizaron entonces (recubrieron) con cualquier anticuerpos anti-CD32B quimérico (Ch2B6) o anti-CD32B quiméricos aglicosilados (ch2B6Agly) en las concentraciones indicadas como se muestra en las FIGURAS 20 y 21 o con ch2B6, ch2B6Agly, hu2B6 y hu2B6YA como se muestra en la FIGURA 21. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , aisladas por centrifugación de gradiente Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia) , se utilizaron como células efectoras (relación de Efectora a Objetivo de 75 a 1) . Después de 3.5 horas de incubación a 37°C, 5% de C02, los sobrenadantes celulares se cosecharon y agregaron a una solución de europio acídica (Solución de europio DELFIA, Perkin Elmer/Wallac) . La fluorescencia de los quelatos de Europio-TDA formados se cuantificó en un fluorómetro de resolución de tiempo (Víctor2 1420, Perkin Elmer/Wallac) o un contador gama (Wizard 1470, Wallac) . La liberación máxima (MR) y la liberación espontánea (SR) se determinaron por incubación de células objetivo con 2% de Tritón X-100 y un medio solo, respectivamente. La citotoxicidad celular independiente de anticuerpos (AICC) se midió por incubación de células objetiva y efectora en la ausencia del anticuerpo. Cada ensayo se realiza por triplicado. El porcentaje promedio de lisis específico se calcula como: (ADCC-AICC) / (MR-SR) x 100. Como se muestra en las FIGURAS 20 y 21, el anticuerpo ch2B6 anti-CD32B quimérico media ADCC in vi tro contra líneas de linfoma de célula B que expresan CD32B, Daudi y Raji, en concentraciones mayores que aproximadamente lOng/ml. Esta actividad es probable de ser dependiente de Fc ya que la versión aglicosilada de este anticuerpo, ch2B6Agly, la cual es incapaz de interactuar con los receptores Fc ha reducido la actividad en este ensayo. Como se muestra en la FIGURA 22, la forma aglicosilada humana es capaz de interactuar con los receptores Fc . 6.2.6 ENSAYOS ADCC JN VJVO 6.2.6.1 ACTIVIDAD DE ANTICUERPOS Fc?RIIB EN MODELOS DE XENOINJERTO DE MURINOS UTILIZANDO LÍNEAS CELULARES DE TUMOR HUMANO Ratones desnudos Balb/c hembras de seis a ocho semanas (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME; Taconic) se utiliza para estabilizar los modelos de carcinoma de ovario y de mama de xenoinjerto. Se mantienen los ratones en BIOCON, Inc., Rockville, Maryland (véase protocolo unido). Los ratones se alojaron en instalaciones en el nivel 2 de protección biológica para el modelo de xenoinjerto utilizando células de ovario derivadas de ascitis y células cancerígenas de mama derivadas de efusión pleural como fuentes de tumores.

Los ratones se colocan en grupos de 4 para estos experimentos y se monitorean tres veces a la semana. El peso de los ratones y el tiempo de sobrevivencia se registran y el criterio para crecimiento de tumor es la distensión abdominal y tumores palpables . Los ratones que muestran signos de incomodidad visible o que alcanzan 5 gramos en peso de tumor se autorizan para morir con dióxido de carbono y se autopsian. Los animales tratados con anticuerpo se colocan bajo observación durante dos meses adicionales después del grupo control.

Establecimiento de modelo de tumor de xenoinjerto con líneas celulares de tumor. Con el fin de establecer el modelo de tumor de xenoinjerto, se inyectan células IGROV-1 o SKBR-3 viables de 5 x 106 s.c. en ratones atímicos desnudos hembra acoplados en edad y en peso con Matrigel (Becton Dickinson) . El peso estimado del tumor se calcula por la fórmula: longitud x (ancho) 2/2 no excede .de 3 gramos. Para pasaje in vivo de células para la expansión, el tumor dependiente de soporte se aisla y las células se disocian agregando 1 µg de colagenasa (Sigma) por gramo de tumor a 37°C durante la noche. La inyección de células IGROV-1 da origen subcutáneamente a tumores de crecimiento rápido mientras las rutas intraperitoneales inducen a carcinomatosis peritoneal la cual elimina ratones en 2 meses. Ya que las células IGROV-1 forman tumores en el lapso de 5 semanas, en el día 1 después de la inyección de células tumorales, los monocitos como efectores se co-inyectan i.p., junto con anticuerpos terapéuticos ch4D5 y ch2B6 a 4 µg cada uno por gramo de peso corporal de ratón (mbw) (Tabla 8) . La inyección inicial se sigue por inyecciones semanales de anticuerpos durante 4-6 semanas más adelante. Las células efectoras humanas se reabastecen una vez en dos semanas. Un grupo de ratones no recibirá ningún anticuerpo terapéutico, sino será inyectado con ch4D5 N297A e IgGl humana como anticuerpos control de isotipo para el anticuerpo anti-tumor y ch2B6, respectivamente . TABLA 8 : Descripción para estudios de depuración de tumor con anticuerpo anti-Her2neu, ch4D5 y ch2B6, el anticuerpo anti-Fc?RIIB en modelo de tumor de xenoinjerto en ratones desnudos con monocitos humanos transferidos en adopción como efectores ADCC. MWB (peso corporal de ratón) .

Como se muestra en la Tabla 8 , 6 grupos de 8 ratones cada una se requiere para probar el papel de un anticuerpo anti-Fc?RIIB en depuración de tumor con una combinación de objetivo y efector, con dos diferentes combinaciones de las concentraciones del anticuerpo. Estos grupos son A) células tumorales, B) células tumorales y monocitos, C) células tumorales, monocitos, anticuerpo antitumor, ch4D5, D) células tumorales, monocitos, anticuerpo ch4D5 anti-tumor, y un anticuerpo anti-Fc?RIIB, por ejemplo ch2B6, E) células tumorales, monocitos y un anticuerpo anti-Fc?RIIB, por ejemplo, ch2B6 y F) células tumorales, monocitos, ch4D5 N297A, una IgGl humana. Varias combinaciones de concentración de anticuerpo pueden probarse en esquemas similares. Estudios que utilizan la línea celular de cáncer de mama, SKBR-3, se llevan a cabo en paralelo con el modelo IGROV-1 como células SKBR-3 que sobre-expresan Her2/neu. Esto incrementará la restricción de la evaluación del papel de anticuerpo anti-Fc?RIIB en depuración de tumores. Con base en el resultado de estudios de depuración de tumor con las células IGROV-1, las modificaciones se hacen para diseño experimental de futuros experimentos con otros objetivos. El punto final del modelo de tumor de xenoinjerto se determina con base en el tamaño de los tumores (peso de los ratones) , tiempo de sobrevivencia, y reporte histológico para cada grupo en la Tabla 8. Los ratones se monitorean tres veces una semana; criterios para desarrollo de tumores son la distensión abdominal y la presencia de masas palpables en la cavidad peritoneal . Se calcula la estimación de peso de tumor contra días después de la inoculación. Con base en estos tres criterios a partir de ratones del grupo D en la Tabla 8 contra los otros grupos de ratones definirá el papel de anticuerpos anti-Fc?RIIB en la mejora de depuración de tumor. Los ratones que muestran signos de dolor visible o alcanzan 5 gramos de peso de tumor se autorizan morir con dióxido de carbono y se autopsian. Los animales tratados con anticuerpos se siguen por dos meses después de este punto de tiempo. 6.2.6.2 ACTIVIDAD IN VIVO DE ANTICUERPOS FC?RIIB EN MODELO DE MURINO DE XENOINJERTO CON CÉLULAS DERIVADAS DE CARCINOMA DE OVARIO Y DE MAMA PRIMARIO HUMANA Los tumores primarios se establecen a partir de cánceres de ovario y de mama primarios transfiriendo células tumorales aisladas a partir de exudados de pacientes con carcinomatosis . Con el fin de traducir estos estudios en la clínica, se evalúa el modelo de xenoinjerto con células tumorales derivados de ascitis y de efusión pleural a partir de dos pacientes con carcinoma de mama y dos con carcinoma de ovario, respectivamente. La efusión pleural, como una fuente de células de cáncer de mama, y el implante de tejido de mama maligno se han utilizado para establecer los modelos de murino de xenoinjerto exitosamente, véase por ejemplo, Sakakibara et al . , 1996, Cáncer J. Sci. Am. 2: 291, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Estos estudios determinarán el rango amplio de aplicación del anticuerpo anti-Fc?RIIB en depuración de tumor de células primarias. La depuración de tumores se prueba utilizando anticuerpo anti-tumor, ch4D5 y anticuerpo anti-Fc?RIIB, por ejemplo, ch2B6, en modelo de ratones desnudos Balb/c con monocitos humanos transferidos en adopción.

Células tumorales primarias derivadas de asci tis y de efusión pleural humana . La ascitis a partir de pacientes con cáncer de ovario y las efusiones pleurales a partir de pacientes con cáncer de mama se proporcionan por the St . Agnes Cáncer Center, Baltimore, Maryland. La ascitis y la efusión pleural a partir de pacientes puede contener 40-50% de células tumorales y las muestras con una alta expresión de células tumorales Her2neu+ se utilizará para establecer los modelos de xenoinjerto. Las muestras de ascitis y de efusión pleural se prueban para expresión de Her2/neu en células neoplásicas antes del establecimiento del modelo de tumor de xenoinjerto. El porcentaje de las células neoplásicas contra otros subconjuntos celulares que puede influenciar el establecimiento del modelo de tumor se determinará. La ascitis y la efusión pleural a partir de pacientes con cáncer de ovario y de mama, respectivamente, se analizan de forma rutinaria para determinar el nivel de expresión de Her2/neu+ en las células neoplásicas. El análisis FACS se utiliza para determinar el porcentaje de células Her2/neu+ neoplásicas en las muestras clínicas. Las muestras con alto porcentaje de células neoplásicas Her2/neu+ se selecciona para iniciación de tumores en ratones Balb/c. Histoquímica e Inmunoquímica . La histoquímica y la inmunohistoquímica se realizan en ascitis y efusión pleural de pacientes con carcinoma de ovario para analizar características estructurales de la neoplasia. Los marcadores que se monitorean son citoqueratina (para identificar células neoplásicas y mesoteliales de ovario a partir de células inflamatorias y mesenquimales) ; calretinina (para separar el mesotelio a partir de células neoplásicas positivas Her2/neu) ; y CD45 (para separar células inflamatorias a partir del resto de la población celular en las muestras) . Los marcadores adicionales que seguirán incluirán CD3 (células T) , CD20 (células B) , CD56 (linfocitos NK) y CD14 (monocitos) . Para tinción inmunohistoquímica, secciones congeladas y tejidos parafinados se preparan por técnicas estándares. Las secciones congeladas así como las desparafinadas se tiñen en un protocolo de tinción similar. La peroxidasa endógena de los tejidos se extingue sumergiendo los portaobjetos en 3% de peróxido ácido y se lavan con PBS durante 5 minutos. Las secciones se bloquean y el anticuerpo primario ch4D5 se agrega en suero en bloque durante 30 minutos seguido al lavar las muestras con PBS tres veces. El anticuerpo anti-humano secundario conjugado con biotina se agrega durante 30 minutos y los portaobjetos se lavan en PBS durante 5 minutos. El complejo de peroxidasa de Avidita-Biotina (Vector Labs) se agrega durante 30 minutos seguido por el lavado. El color se desarrolla al incubar los portaobjetos en solución de DAB de sustrato fresco y la reacción se detiene lavando en agua de la llave. Para tinción H & E, los portaobjetos se desparafinan y luego se hidratan en diferentes concentraciones de alcohol. Los portaobjetos se lavan en agua de la llave y se colocan en hematoxilina durante 5 minutos. Se remueve la tinción en exceso con alcohol acídico, seguido por amoniaco, y agua. Los portaobjetos se colocan en Eosina y se siguen por 90 a 100% de lavados de alcohol para deshidratación. Finalmente, los portaobjetos se colocan en xileno y se montan con fijador para almacenamiento a largo plazo. En todos los casos, el porcentaje de células tumorales se determina por tinción de papanicolaou. Tinción Histoquímica . La ascitis a partir de dos diferentes pacientes con carcinoma de ovario se tiñeron por Hematoxilina y Eosina (H & E) y Giemsa para analizar la presencia de células tumorales y otros tipos celulares. El resultado de la tinción histoquímica se muestra en la FIGURA 19. Modelos de Murino . Las muestras a partir de pacientes con carcinoma de ovario se procesan haciendo girar la ascitis a 6370 g durante 20 minutos a 4°C, disolviendo con lisina los glóbulos rojos seguidos al lavar las células con PBS. Con base en el porcentaje de células tumorales Her2/neu+ en cada muestra, dos muestras, un expresor mediano y elevado se seleccionan para inoculación s.c. para establecer el modelo de xenoinjerto para evaluar el papel de anticuerpo anti-Fc?RIIB, en depuración de tumores. Se ha reportado que las células tumorales realizan 40-50% del subconjunto celular de ascitis no procesada, y después de la purificación ~ 10-50 x 106 células tumorales se obtuvieron a partir de 2 litros de ascitis (Barker et al . , 2001, Gynecol . Oncol. 82: 57-63). Las células de ascitis aisladas se inyectan i.p. en ratones para expandir las células. Aproximadamente 10 ratones se inyectaron i.p y cada ascitis de ratón además se paso en dos ratones cada uno para obtener ascitis a partir de un total de 20 ratones, la cual se utiliza para inyectar un grupo de 80 ratones. La efusión pleural se maneja en una manera similar a ascitis y las células tumorales Her2neu+ se inyectan en las almohadillas mamarias derecha e izquierda superiores en matrigel. Después de inoculación s.c. de células tumorales, los ratones se siguen para cambios clínicos y anatómicos . Cuando se necesite, los ratones pueden examinarse para correlacionar la carga de tumor total con localización de órgano específica. 6.2.7 EFECTO DE ANTICUERPOS CH2B6 EN CRECIMIENTO TUMORAL Diseño Experimental : Ratones hembra desnudos Balb/c (Taconic, MD) se inyectaron el día 0 con células Daudi 5xl06 subcutáneamente. Los ratones (5 ratones por grupo) también recibieron inyección i.p. de PBS (control negativo), 10 µg/g de ch4.4.20 (anticuerpo anti-FITC, control negativo), 10 µg/g de Rituxan (control positivo) o 10 µg/g de ch2B6 una vez a la semana iniciando el día 0. Se observaron a los ratones dos veces a la semana después de la inyección y el tamaño del tumor (longitud y ancho) se determinó utilizando un calibrador. El tamaño de tumor en mg se estimó utilizando la fórmula: (longitud x ancho2) ¡2 . RESULTADOS: Como se muestra en la FIGURA 23, células Daudi forman tumores subcutáneos en hembras desnudas Balb/c iniciando alrededor del día 21 después de la inyección de célula tumoral. En el día 35, se detectaron tumores subcutáneos en ratones recibiendo PBS (5 ratones de 5) o 10 µg/g de ch4.420 (5 ratones de 5) . Los tumores se detectaron raramente en ratones que reciben 10 µg/g de Rituxan (1 ratón de 5) y no se detectaron en ratones que reciben 10 µg/g de ch2B6 (0 ratones de 5) . 6.2.8 EFECTO DE VARIANTES 2B6 EN CRECIMIENTO TUMORAL EN UN MODELO DE XENOINJERTO DE MURINO Diseño Experimental : Ratones hembras Balb/c FoxNl de ocho semanas (Taconic, Germantown, NY) se inyectaron subcutáneamente el día 0 con células Daudi 5x106 así como intraperitonealmente con variantes del anticuerpo 2B6 (ch2B6, chN297Q, h2B6, h2B6YA, h2B6YA 31/60, h2B6YA 38/60, h2B6YA 55/60 o h2B6YA 71 a 2.5 µg, 7.5 µg o 25 µg) , Rituximab (control positivo a 2.5 µg, 7.5 µg, 25 µg o 250 µg) o PBS (control negativo) . Los ratones se trataron entonces con anticuerpos o PBS una vez a la semana hasta el día 42 (total de 7 inyecciones) y el tamaño de tumor se midió dos veces a la semana utilizando un calibrador. Se estimó el peso del tumor utilizando la fórmula: (ancho2 x longitud) /2. RESULTADOS: Para evaluar la eficacia de variantes anti-CD32B mAb en la prevención de tumor del crecimiento celular in vivo, ratones Balb/c FoxNl se inyectaron simultáneamente con células Daudi y variantes anti-CD32B mAb (FIGURAS 24 A-G) . El tratamiento con el control positivo, Rituximab, reduce significativamente el crecimiento de la célula tumoral en una forma dependiente de dosis (FIGURA 24 A) . Tres diferentes variantes de anti-CD32B mAb 2B6 (2B6 quimérica (ch2B6) , 2B6 humanizada (h2B6) , y una variante en la región Fv (h2B6YA) ) fueron todas efectivas para reducir el crecimiento tumoral (FIGURA 24 B) . La variante h2BYA mostró una reducción remarcable en crecimiento tumoral en una dosis de 2.5 µg (0.1 µg/gm) . La misma dosis de Tituximab no fue tan efectiva al evitar el crecimiento de tumor. Cuatro diferentes variantes h2B6YA mAb con mutaciones Fc (h2B6YA 31/60, h2B6YA 38/60, h2B6YA 55/60 y h2B6YA 71) se analizaron para determinar si la actividad anti-tumor in vivo podría mejorarse. Los mutantes h2B6YA 31/60, h2B6YA 38/60 y h2B6YA 55/60 funciona también o mejor que h2B6YA, el cual contiene una Fc de tipo silvestre (FIGURAS 24 C, D, E y F) . h2B6YA 71 mutante mostró actividad dependiente de dosis (FIGURA 24 G) . El crecimiento de célula tumoral se redujo en dosis de 2.5 µg y 25 µg; sin embargo, poco o ningún efecto en el crecimiento de tumor se observó en la dosis de 7.5 µg (FIGURA 24 G) . Estos resultados demuestran que h2B6YA 31/60 y h2B6YA 55/60 tienen actividad anti-tumor in vivo mejorada comparada a ch2B6 o h2B6YA. 6.2.9 TINCIÓN EX VIVO DE DAUDI PARA CD20 Y CD32B Diseño experimental : Se recolectaron tumorales Daudi a partir de ratones tratados con h2B6 o h2B6YA a 25 µg. La expresión de CD20 y CD32B se comparó con aquellas de las células Daudi expandidas in vivo . Se realizó el análisis FACS como se describe en la Sección 6.2.1. RESULTADOS. Como se muestra en las FIGURAS 25 A-I, las células expandidas in vivo mantienen la expresión de CD20 y CD32B aún después del tratamiento anti-CD32B. 6.3 EXPRESIÓN DE CD32B EN CÉLULAS B-CLL La capacidad de los anticuerpos CD32B-específico para reaccionar con CD32B en células aisladas de pacientes con B-CLL se probó tiñendo células aisladas en análisis FACS.

Protocolo para aislar células B de pacientes . Los leucocitos mononucleares a partir de leucocitos de sangre periférica de donadores normales y pacientes con neoplasia de célula B se aislaron utilizando centrifugación de gradiente Ficoll-Paque PLUS (Amersham Pharmacia Biotech) y se crio-conservaron en alícuotas en nitrógeno líquido. Una alícuota de las PBMC recientemente aisladas a partir de cada paciente se lavó en PBS conteniendo 10% de suero humano y se analizaron inmediatamente para expresión de CD32B por análisis FACS estándar. La suspensión de célula sencilla a partir de biopsia de especímenes de nodulo linfático se preparará de manera similar, se analizará inmediatamente, y se crio-conservará en nitrógeno líquido. Dos portaobjetos de citospina se obtuvieron a partir de cada una de las muestras y una se tiñó inmediatamente con May-Grunwald Giemsa (MGG) para evaluación morfológica. Antes del análisis, se descongeló una alícuota de las células del paciente, la capacidad para evaluar en la descongelación y si es necesario (la capacidad en la recuperación <80%) , se sometió a centrifugación Ficoll-Paque PLUS. La cantidad de células tumorales se estimó por clonación utilizando anticuerpos de cadena anti-kappa o lambda en análisis FACS. Se realizó el fenotipo de leucocitos utilizando anticuerpos anti-CD3, CD20, CD56, CD14 y CD16 conjugados directos y la activación periódica de FSC y SCC apropiada. Las células B B-CLL se analizaron además para CD5, CD23, CD25, CD27, CD38, CD69 y CD71 (Damle et al . , 2002, Blood 99:4087-4093; Chiorazzi & Ferrarini, 2003, Ann Rev Immunol 21:841-894). Los logaritmos computarizados se mantuvieron registrando el número de frascos, números de células por frascos, y la capacidad celular antes y después de la crio-conservación, el número de células tumorales o de fenotipo de leucocitos. Protocolos para análisis FACS. Las células se incubaron con el anticuerpo monoclonal anti-CD32B, 2B6, seguido por un anticuerpo de fragmento (Fab)2 anti-ratón de cabra (Cy5 conjugado) secundario. Después de los lavados, los anticuerpos específicos de linaje conjugado con FITC o PE (anti-CD3, CD19, CD20 y CD5) se agregaron y las muestras se analizaron utilizando FACSCalibur en un formato de dos colores. Se utilizan las células CD3 positivas (células T) como un control interno cuando no expresan CD32b y no reaccionan con anticuerpo 2B6. Anticuerpos CD20, CD10 y CD5 identifican sub-poblaciones de linaje de células B. Estudios preliminares se condujeron en >10 sujetos humanos saludables para calibrar la cantidad de anticuerpos anti-CD32 individuales basados en la reactividad con las células B del donador identificadas por positividad de CD20. Para cada anticuerpo, la cantidad más pequeña de anticuerpo que da 100% de reactividad y el valor MCF más elevado en experimentos de titulación se seleccionó para uso subsecuente. Resul tados: Como se muestra en la Figura 26, las células B aisladas a partir de pacientes B-CLL teñidos intensamente con anticuerpos anti-CD32B. Las células a partir de todos los cinco pacientes son CD32B consistentemente positivos siendo reactivos con el anticuerpo 2B6, pero expresan marcadores de linaje de célula C sólo a varios grados. Los resultados indican que CD32B se expresa en células B aisladas a partir de pacientes con B-CLL. 6.4 EXPRESIÓN DE CD32B EN NODULOS LINFÁTICOS A PARTIR DE PACIENTES CON LINFOMA NO HODGKÍN Para investigar la expresión de CD32B en nodulos linfáticos a partir de pacientes con linfomas no Hodgkin, el análisis histólico y la inmunohistoquímica se realizó en una serie de tejidos linfáticos a partir de pacientes con un diagnóstico confirmado de neoplasia de célula B basada en criterios de análisis histológico y FACS. Especímenes de tejido . Se obtuvieron nodulos linfáticos congelados a partir de the Cooperative Human Tissue Network (CHTN) , Mid-Atlantic División (Charlottesville, Virginia). Se recibió el tejido en hielo seco, y se sección al arribo en dos porciones, una para el análisis histopatológico del tumor y la otra porción para análisis inmunohistoquímico.

Análisis histopatológico e Inmunohistoquímica . Todos los once casos se fijaron en 10% de Formalina Tamponada Neutra (?BF) y se parafinaron en un procesador de tejido (Miles Scientific) . Después de la parafinación, los bloques de tej ido se seccionaron con un Leica Microtome (Leica Microsystems, Bannockburn, Illinois) a 5 mieras. Las secciones se colocaron en portaobjetos, se desparafinaron con xileno y se prosiguieron con un protocolo de tinción de tejido de Hematoxilina y Eosina (H-E) (Luna, Histopathologic methods and Color Atlas Of Special Stains and Tissue Artifacts 1992 American Histolabs, Inc., Publications División, Kolb Center, 7605-F Airpark Road, Gaithersburg, MD 2087. Células B Daudi, una línea celular maligna implicada en linfomas de célula B, se utilizaron como controles positivos.

Los nodulos linfáticos y la amígdala normal se utilizaron como controles adicionales para entender la distribución de las células que expresan CD20 y CD32B en tejidos normales. Las porciones restantes de estas muestras se colocan en criomoldes y se incrustan en criocompuesto OCT (Tejido-Tek) . Una vez que se leyeron los bloques, cada uno se seccionó bajo un Cryostat (Leica Microsystems) a 6 mieras. Los portaobjetos se colocaron en 4°C de acetona y se fijaron durante 10 minutos. Horas después de la fijación los portaobjetos se secaron en aire y se lavaron con solución salina regulada con fosfato (PBS) . Luego, la actividad del peróxido endógeno se bloqueó por una incubación de 30 minutos en 0.3% de solución de peróxido ácido. Los portaobjetos se lavaron en PBS y se incubaron durante 30 minutos con 10% de suero de cabra normal en 2% de suero humano normal. Después de esta etapa, los portaobjetos se dividieron en dos grupos. Dos anticuerpos monoclonales se utilizaron e incubaron en el mismo tejido en paralelo, un anti-CD20 (1F5- un hibridoma, ATCC No. HB-9645, purificada en Macrogenics) y el anticuerpo anti-CD32B monoclonal de murino, 2B6. Cada grupo se incubó con un anticuerpo monoclonal y su control de Isotipo respectivo, IgGl (BD Biosciences, San José, California) para el grupo 2B6/anti-CD32B e IgG2a (BD Biosciences) para el grupo lF5/anti-CD20. La IgGl de ratón y la IgG2a de murino se utilizaron como controles de isotipo para anti-CD32B y anti-CD20, respectivamente. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, los portaobjetos se lavaron en PBS y se incubaron con un peroxidasa etiquetada de anti-Ratón de Cabra de anticuerpo secundario (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pennsylvania) . Después de lavar con PBS, las secciones se incubaron en amino 9-etilcarbazol (AEC) y peróxido ácido (Koretz, et al . , 1987, Histochemistry 86:471-478). Se utilizó hematoxilina como una contra-tinción. La expresión de anti CD20 y CD32B se clasificó bajo un microscopio en una magnificación de potencia baja basada en el siguiente criterio: una clasificación de cero (-) significa reactividad no detectable; una clasificación de más/menos (+/-) significa región detectable en 1-10% de las células; una más (+) fue equivalente a 10-30% de células positivas; dos más (++) para tejido con células positivas variando de 30-70%; y tres más (+++) para aquellos tejidos en donde 70% a 100% fueron positivos. Resul tados. Ambos controles positivos, es decir, una línea celular maligna implicada en linfomas de célula B (células Daudi; FIGURAS 27 A-B) y tejidos normales conocidos para contener tejido linfático (amígdala: FIGURAS 28 A-C; nodulos linfáticos: FIGURAS 29 A-C), respondieron positivamente a anticuerpos anti-Cd32B y anti-CD20 por inmunohistoquímica. Los tejidos de amígdala normales y nodulos linfáticos tiñen diferentemente con anticuerpos anti-CD32B y anticuerpos anti-CD20. Los folículos linfáticos que muestran centros germinales reaccionan con anti-CD20, mientras las células en los folículos que rodean los centros germinales reaccionan con anti-CD32B. De este modo, las diferencias morfológicas pueden detectarse por inmunohistoquímica con estos dos anticuerpos. Un total de diez nodulos linfáticos y un bazo (11 casos) obtenidos de CHTN se analizaron. Véanse las FIGURAS 30 A-57 D. Los resultados se resumen en la Tabla 9. Tabla 9: Resumen de Resultados de Inmunohistoquímica Ocho casos fueron linfomas de Célula B Grande Difusa, dos fueron Linfomas Linfocíticos Pequeños y uno fue Linfoma de Célula Protectora/Linfoma de Célula Desdoblada Pequeña Difusa. En la categoría de linfoma linfocítico pequeño, uno tuvo características plasmacitoides. Todos los portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina (H&E) se revisaron para confirmación del diagnóstico. La expresión de CD20 fue negativa en 18% de los casos y débilmente positiva en ~30%, e intermedia/fuertemente positiva en el 50% restante de los casos. CD32B se detectó en 80% de los casos y se encontró ser negativo en sólo dos casos . Conclusión . Se detectó la expresión de CD32B en 80% de los casos de prueba NHL. Se detectó la expresión de CD32B con frecuencia detectadas en más células que CD20. CD32B puede ser un objetivo útil de tratamiento de NHL. 6.5 SELECCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ESPECÍFICOS DE CD32B Los anticuerpos específicos de CD32B se seleccionarán para reactividad, asociación de plataforma, CDC, e inducción de apoptosis en líneas y células de linfoma de célula B a partir de pacientes con malignidades de célula B. El aislamiento de células a partir de pacientes y la selección de reactividad se describen en lo anterior. Asociación De plataforma . Una medida de la capacidad del anticuerpo para accionar la redistribución del antígeno en microdominios de membrana especializada, la asociación de plataforma de lípido se realizó convenientemente midiendo la cantidad de anticuerpo recuperada en la fracción celular insoluble con detergente después de la lisis con 0.5% de TX-100 a 4C (Veri et al . , 2001, Mol Cell Biol 21:6939-6950; Cragg et al . , 2004, Blood 103:2738-43). En un experimento típico, las células se recubren en hielo con el anticuerpo de interés y se lavan. Una alícuota se someterá a reticulación adicional con un anticuerpo secundario apropiado. Las células granuladas se someterán a fraccionamiento de detergente TX-100. Las muestras paralelas se solubilizarán con glucopiranosida, un detergente conocido para destruir plataformas de lípido o directamente con tampón de muestra Laemmli basado en SDS para obtener la cantidad total de anticuerpo asociado con células. Las fracciones insolubles se analizarán por SDS-PAGE y transferencia western. La redistribución a plataformas de lípido con o sin reticulación adicional se registrará por comparaciones densitométricas . CDC. CDC se evaluará por uno de varios métodos conocidos en la técnica, tal como exclusión de yoduro de propidio (Pl) en análisis FACS (Cragg et ai., 2004, Blood 103:2738-43) o liberación de radioetiqueta tradicional (por ejemplo, liberación de 51Cr y ? _n) . En breve, las células se incubarán con cantidades de titulación de los anticuerpos de interés durante 15 minutos a 37 °C seguido por la adición de suero (20% de concentración final) como una fuente de complemento y la incubación continúa durante 5 minutos adicionales antes del análisis. Debido a la variación elevada de suero humano, el suero de conejo Pel-Freeze se utilizará como una fuente estándar de complemento . El suero AB humano normal agrupado se preparará también. Cada lote de suero se probará en lisis de glóbulos rojos contra suero de conejo para seguridad de calidad. Apoptosis. La apoptosis inducida por anticuerpos anti-CD32B de placa inmovilizada o soluble se estudiará por metodología basada en FACS estándar utilizando emplazamiento de membrana V de anexina y tinción de Pl (Cragg et al . , 2004, Blood 103:2738-43) en análisis multicolor para identificar la población de interés (por ejemplo, Cy5-CD19) . Brevemente, las células se tratarán para diferentes intervalos de tiempo (2 a 18 horas) con cantidades de titulación del anticuerpo de interés en solución libre o inmovilizada en placas de 96 pozos . Las células se recuperarán entonces por raspado suave y/o centrifugación y se teñirán con 1 µg/ml de FITC-anexina V más 10 µg/ml de Pl para distinguir entre apoptosis temprana y necrosis secundaria. 6.6 ESTUDIOS DE DEPURACIÓN DE TUMOR IN VIVO EN MODELOS DE XENOINJERTO DE TUMOR MURINO DE LINFOMAS La capacidad para evitar tumores en un modelo de ratón de linfoma es un criterio importante para determinar el potencial para un anticuerpo para proseguir en estudios clínicos . Un número de líneas celulares de linfoma de Burkitt bien caracterizado están disponibles para uso como modelos de NHL (Epstein et al . , 1966, J Nati Cáncer Inst 37:547-559; Klein et al., 1968, Cáncer Res 28:1300-1310; Klein et al . , 1975, Intervirology 5:319-334; Nilsson et al . , 1977, Intl J Cáncer 19:337-344; Oshugi, et al . , 1980, J Nati Cáncer Inst 65:715-718) . Un modelo de xenoinjerto de formación de linfoma se ha establecido en ratones desnudos similares a modelos previamente reportados (Vallera et al . , 2003, Cáncer Biother Radiopharm 18:133-145; Vuist et al . , 1989, Cáncer Res 49:3783-3788) . En breve, la línea celular de linfoma de Burkitt, Daudi (5-10xl06 células) se transplantará subcutáneamente en una cepa de ratón nu/nu inmunodeficiente . La cepa de ratón BALB/c nu/nu se utilizará junto con la PBMC humana transferida en adopción a partir de un donador saludable como células efectoras. Una población de células efectoras prevalecientes en PBMC humana se representa por linfocitos NK, las cuales ejercen ADCC a través de su CD16A (Fc?RIIIa) .Una cepa de ratones nu/nu en la cual el gen CD16A de murino a sido inactivado y la cual a sido diseñada para expresar CD16A humana se utilizará también. Este ratón nu/nu CD16a-/-huCD16Atg, permite la examinación de actividad antitumor en el contexto de un receptor Fc humano sin la necesidad para la transferencia adoptiva de células humanas. Se trataron a los ratones con el anticuerpo quimerizado seleccionado inyectado i.p. en el día 1, 4, 7 y 15. Una dosis de partida de 4 µg/g de peso corporal se utilizará, pero la dosis adicional se probará para establecer la potencia relativa de los anticuerpos en este modelo. Rituxan y Campath se utilizarán para comparaciones. Además, el sinergismo potencial de terapia de combinación con Rituxan o Campath se estudiará también. En estos estudios, el crecimiento tumoral y la morbilidad se monitorearán para comparar anticuerpo tratado en grupos control . Los ratones se sacrificarán inmediatamente si están moribundos o en la terminación de los estudios . Los tumores se extirparán entonces y se realizó la necropsia completa microscópica y total . La citopatología en secciones incrustadas en parafina e inmunohistoquímica en secciones congeladas se realizará para una evaluación morfológica e inmunológica del tumor y los infiltrados celulares . La presente invención no se limita en el alcance por las modalidades específicas descritas, las cuales se pretenden como ilustraciones sencillas de aspectos individuales de la invención, y los métodos y componentes funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Ciertamente, varias modificaciones de la invención, además de aquellas mostradas y descritas en la presente serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y los dibujos anexos. Tales modificaciones se pretenden para caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Varias referencias se citan en la presente, la descripción de las cuales se incorporan para referencia en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que enlaza específicamente el dominio extracelular de Fc?RIIB humano nativo con mayor afinidad que el anticuerpo o fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA humano nativo.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es anticuerpo 2B6.
3. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo 2B6 es humanizado.
4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano. '
5. El anticuerpo de la reivindicación 3, en donde el 2B6 humanizado comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC de IDENT NO: 24 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC de IDENT NO: 18, SEC de IDENT NO: 20 o la SEC de IDENT NO: 22.
6. El anticuerpo de la reivindicación 1 ó 5, que comprende además al menos una modificación en el dominio Fc de la cadena pesada.
7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en donde el dominio Fc de la cadena pesada del anticuerpo comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 240, 243, 247, 255, 270, 292, 300, 316, 370, 392, 396, 416, 419 ó 421 con otro aminoácido en esa posición.
8. El anticuerpo de la reivindicación 6, en donde el dominio Fc de la cadena pesada del anticuerpo tiene una leucina en la posición 247, una lisina en la posición 421 y un ácido glutámico en la posición 270; una treonina en la posición 392, una leucina en la posición 396 y un ácido glutámico en la posición 270; o una lisina en la posición 255, una leucina en la posición 396, y un ácido glutámico en la posición 270.
9. El fragmento de anticuerpos de la reivindicación 1, en donde el fragmento es un fragmento F(ab')2 o un fragmento F (ab) .
10. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla.
11. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se enlaza operablemente a un polipéptido heterólogo .
12. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se conjuga a un agente terapéutico.
13. El anticuerpo de la reivindicación 12, en donde el agente terapéutico es una citotoxina.
14. El anticuerpo de la reivindicación 1, el cual bloquea el enlace de una Ig-Fc a Fc?RIIB. //////
15. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo reduce el crecimiento tumoral más efectivamente que Rituxin.
16. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una cadena pesada o una cadena ligera del anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1.
17. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 16.
18. Un vector que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una cadena ligera, la cadena pesada y la cadena ligera son del anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1.
19. El vector de la reivindicación 17, el cual es un vector de expresión.
20. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 17.
21. Una célula huésped que contiene un primer ácido nucleico enlazado operablemente a un promotor heterólogo y un segundo ácido nucleico enlazado operablemente al mismo o un diferente promotor heterólogo, el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico codifican una cadena pesada y una cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo de la reivindicación 1.
22. Un método para producir recombinantemente un anticuerpo específico de Fc?RIIB, el método comprende: (i) cultivar en un medio la célula huésped de la reivindicación 20, bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo; e (ii) recuperar el anticuerpo a partir del medio.
23. Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer par de cadena pesada-cadena ligera que enlaza específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que el par de cadena pesada-cadena ligera enlaza Fc?RIIA, y un segundo par de cadena pesada-cadena ligera que enlaza específicamente un antígeno tumoral .
24. Un método para tratar cáncer en un paciente, el método comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o un fragmento del mismo que enlaza específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que el anticuerpo o fragmento del mismo enlaza Fc?RIIA.
25. El método de la reivindicación 24, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
26. El método de la reivindicación 24, en donde el anticuerpo es anticuerpo 2B6.
27. El método de la reivindicación 24, en donde el anticuerpo es humanizado.
28. El método de la reivindicación 26, en donde el anticuerpo 2B6 es humanizado.
29. El método de la reivindicación 28, en donde el 2B6 humanizado comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC de IDENT NO: 24 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC de IDENT NO: 18, SEC de IDENT NO: 20 o la SEC de IDENT NO: 22.
30. El método de la reivindicación 26 ó 29, en donde el dominio Fc de la cadena pesada del anticuerpo 2B6 comprende al menos una sustitución de aminoácidos en la posición 240, 243, 247, 255, 270, 292, 300, 316, 370, 392, 396, 416, 419 ó 421 con otro aminoácido en esa posición.
31. El método de la reivindicación 30, en donde el dominio Fc de la cadena pesada del anticuerpo 2B6 tiene una leucina en la posición 247, una lisina en la posición 421 y un ácido glutámico en la posición 270; una treonina en la posición 392, una leucina en la posición 396 y un ácido glutámico en la posición 270; o una lisina en la posición 255, una leucina en la posición 396, y un ácido glutámico en la posición 270.
32. El método de la reivindicación 24, en donde el cáncer es de mama, ovario, próstata, cervical o cáncer pancreático.
33. El método de la reivindicación 24, que comprende además la administración de una o más terapias de cáncer adicionales .
34. El método de la reivindicación 33, en donde la terapia de cáncer adicional se selecciona a partir del grupo que consiste de quimioterapia, inmunoterapia, terapia por radiación, terapia hormonal o cirugía.
35. El método de la reivindicación 24, en donde el paciente es un ser humano .
36. El método de la reivindicación 24, en donde el anticuerpo se administra en una dosis de manera que el anticuerpo no se enlaza detectablemente a neutrófilos.
37. Un método para tratar o mejorar malignidad de células B o uno o más síntomas de la misma en un sujeto, el método comprende administrar a un sujeto con necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo específico de Fc?RIIB.
38. El método de la reivindicación 37, en donde el anticuerpo específico de Fc?RIIB enlaza Fc?RIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo específico de Fc?RIIB enlaza Fc?RIIA.
39. El método de la reivindicación 37, en donde la administración de tal cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo específico de Fc?RIIB prolonga la supervivencia de tal sujeto.
40. El método de la reivindicación 37, en donde el sujeto es un ser humano.
41. El método de la reivindicación 37, en donde el anticuerpo específico de Fc?RIIB es 2B6 o 3H7.
42. El método de la reivindicación 41, en donde 2B6 o 3H7 es humanizada.
43. El método de la reivindicación 37, en donde la malignidad de células B es una leucemia linfocítica de células B o linfoma no Hodgkin.
44. El método de la reivindicación 37, en donde el anticuerpo específico de Fc?RIIB se conjuga a un agente o fármaco terapéutico.
45. El método de la reivindicación 44, en donde el agente terapéutico es un polipéptido heterólogo.
46. El método de la reivindicación 44, en donde el agente terapéutico es un anticuerpo que enlaza inmunoespecíficamente a un receptor de superficie celular diferente de Fc?RIIB.
47. El método de la reivindicación 44, en donde el agente terapéutico es un anticuerpo que enlaza inmunoespecíficamente a un antígeno asociado con tumor.
48. El método de la reivindicación 37, que comprende además administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una o más terapias estándares o experimentales para una malignidad de célula B.
49. El método de la reivindicación 48, en donde al menos una de las terapias es terapia de anticuerpo, terapia por citoquina, quimioterapia, transplante de célula germinal hematopoyética, terapia mediada por células B, terapia biológica, terapia por radiación, terapia hormonal o cirugía.
50. El método de la reivindicación 48, en donde las terapias estándares o experimentales se administran antes de, al mismo tiempo con o subsecuente a la administración de un anticuerpo específico de Fc?RIIB o un fragmento de enlace de antígeno del mismo.
51. El método de la reivindicación 37, en donde el sujeto ha sido previamente tratado por la administración de una o más terapias estándares o experimentales para una malignidad de células B pero no por la administración de un antagonista Fc?RIIB o un fragmento de enlace de antígeno del mismo.
52. El método de la reivindicación 37, en donde el anticuerpo específico de Fc?RIIB se administra intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral o intranasalmente.
53. Una composición farmacéutica que comprende (i) una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o fragmento de la misma que enlaza específicamente Fc?RIIB con mayor afinidad que el anticuerpo o fragmento de la misma enlaza Fc?RIIA; e (ii) un portador farmacéuticamente aceptable.
54. La composición farmacéutica de la reivindicación 53 , en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
55. La composición farmacéutica de la reivindicación 53 , en donde el anticuerpo es anticuerpo 2B6.
56. La composición farmacéutica de la reivindicación 53, en donde el anticuerpo es humanizado.
57. La composición farmacéutica de la reivindicación 55, en donde el anticuerpo 2B6 es humanizado.
58. La composición farmacéutica de la reivindicación 57, en donde el 2B6 humanizado comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC de IDENT NO: 24 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC de IDENT NO: 18, SEC de IDENT NO: 20 o la SEC de IDENT NO: 22.
59. La composición farmacéutica de la reivindicación 53 ó 58, en donde el dominio Fc de la cadena pesada del anticuerpo 2B6 comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 240, 243, 247, 255, 270, 292, 300, 316, 370, 392, 396, 416, 419 ó 421 con otro aminoácido en esa posición.
60. La composición farmacéutica de la reivindicación 59, en donde el dominio Fc de la cadena pesada del 2B6 tiene una leucina en la posición 247, una lisina en la posición 421 y un ácido glutámico en la posición 270; una treonina en la posición 392, una leucina en la posición 396 y un ácido glutámico en la posición 270; o una lisina en la posición 255, una leucina en la posición 396, y un ácido glutámico en la posición 270.
61. La composición farmacéutica de la reivindicación 53, que comprende además uno o más agentes anti-cáncer adicionales.
62. La composición farmacéutica de la reivindicación 61, en donde el agente anti-cáncer es un agente quimioterapéutico, un agente terapéutico por radiación, un agente terapéutico hormonal o un agente inmunoterapéutico .
63. Una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos específicos de Fc?RIIB, en una cantidad efectiva para prevenir, tratar, manejar o mejorar una malignidad de células B, y un portador farmacéuticamente aceptable.
64. La composición de la reivindicación 63 , que comprende además uno o más agentes quimioterapéuticos, agentes terapéuticos por radiación, agentes terapéuticos hormonales o agentes terapéuticos biológicos.