JP6840682B2 - 多重特異的抗原結合タンパク質 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年12月28日に出願された米国仮特許出願第62/271,491号明細書及び2015年6月23日に出願されたPCT特許出願第PCT/欧州特許出願公開第2015/064070号明細書の利益を主張し、これらは両方とも、全ての図面及び配列表を含めてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子形式の配列表と合わせて出願されている。この配列表は、2016年6月21日に作成された301KBサイズの「BISP3PCT_ST25 txt」という名称のファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。
(i)第1のV−(CH1/Cκ)単位であって、Vドメインが第1のABDの一部を形成する、第1のV−(CH1/Cκ)単位、Fcドメイン又はその一部、及び第2のV−(CH1/Cκ)単位であって、Vドメインが第2のABDの一部を形成する、第2のV−(CH1/Cκ)単位を(例えば、N末端からC末端へと)含む中心(第1の)ポリペプチド鎖と、
(ii)V−CH1/Cκ単位(及び任意選択によりFcドメイン又はその一部)を(例えば、N末端からC末端へと)含む第2のポリペプチド鎖であって、可変ドメイン及びCH1又はCκ定常領域が中心ポリペプチド鎖の第1の(第2ではない)V−(CH1/Cκ)単位のCH1又はCκ定常領域に相補的である(例えば、それにより、第2の鎖は中心鎖とのCH1/Cκ二量体化を受け、第2の鎖のVドメインが中心鎖のVドメインと一緒に第1のABDを形成する)、第2のポリペプチド鎖と、
(iii)V−(CH1/Cκ)単位、及び直列型可変領域(この直列型可変領域は第3のABDを形成する)を(例えば、N末端からC末端へと)含む第3のポリペプチド鎖であって、可変ドメイン及びCH1又はCκ定常領域が中心ポリペプチド鎖の第2の(第1ではない)V−(CH1/Cκ)単位の可変ドメイン及びCH1又はCκ定常領域に相補的である(例えば、それにより、第3の鎖は中心鎖とのCH1/Cκ二量体化を受け、第3の鎖のV−(CH1/Cκ)単位のVドメインが中心鎖のVドメインと一緒に第2のABDを形成する)、第3のポリペプチド鎖と
を含む三量体タンパク質が提供される。一実施形態では、この直列型可変領域はscFv(ペプチドリンカーを介してVLに融合されたVH)である。そのため、そのような三量体タンパク質は、2つのF(ab)様構造と1つの直列型可変ドメインとを含むことができ、有利な結合特性がもたらされる。
V1−V1−Fcドメイン−V2−(CH1又はCK)
を有し、それにより、ドメイン配置:
a)本明細書で説明されている第1のポリペプチド鎖をコードする第1の核酸を用意するステップ、
b)本明細書で説明されている第2のポリペプチド鎖をコードする第2の核酸を用意するステップ、
c)任意選択により、本明細書で説明されている第3のポリペプチド鎖をコードする第3の核酸を用意するステップ、及び
d)前記第1及び第2(並びに任意選択により第3の)核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記第1及び第2(並びに任意選択により第3の)ポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生させ、且つヘテロ二量体(又は任意選択によりヘテロ三量体)タンパク質を回収するステップ
を含む方法を提供する。任意選択により、産生されるヘテロ二量体(又はヘテロ三量体)タンパク質は、精製前に得られる総多重特異的タンパク質の少なくとも20%、25%又は30%を示す。任意選択により、ステップ(d)は、産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインA支持体又はカラム上にローディングし、ヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ、及び/又は産生されたタンパク質(例えば、親和性交換又はプロテインAカラム上へのローディング後に回収したタンパク質)をイオン交換カラム上にローディングし、ヘテロ二量体画分を回収するステップを含む。
a)複数の核酸対を用意するステップであって、各対が、(例えば、同一の又は異なる目的の抗原に結合する様々な抗体から得られる)複数の重鎖及び軽鎖可変領域対のそれぞれに関して、重鎖候補可変領域をコードする1つの核酸と軽鎖候補可変領域をコードする1つの核酸とを含む、ステップ、
b)複数の核酸対のそれぞれに関して、
(i)コードする第1の核酸を産生し、本明細書で説明されている第1のポリペプチド鎖をコードする第1の核酸を用意することと、
(ii)本明細書で説明されている第2のポリペプチド鎖をコードする第2の核酸を用意することと、
(iii)任意選択により、本明細書で説明されている第3のポリペプチド鎖をコードする第3の核酸を用意することと
により、ヘテロ二量体又は三量体タンパク質を作製するステップであって、重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸は、第1、第2又は第3の核酸上に独立して配置されており、それにより、これらの可変領域が目的の抗原用の抗原結合ドメインを形成する、ステップ、及び
c)第1及び第2(並びに任意選択により第3)のポリペプチド鎖をコードする前記核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記第1及び第2(並びに任意選択により第3)のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生させ、且つヘテロ二量体(又はヘテロ三量体)タンパク質を回収するステップ、及び
d)産生された複数のヘテロ二量体(又はヘテロ三量体)タンパク質を目的の生物学的活性、例えば本明細書で開示されている活性に関して評価するステップ
を含む方法を提供する。
本明細書で使用される「1つの(a)」又は「1つの(an)」は1つ以上を意味し得る。請求項において「含む(comprising)」という語と共に使用される場合、「1つの(a)」又は「1つの(an)」という語は1つ又は2つ以上を意味し得る。
本明細書に記載の抗原結合ドメイン(ABD)は、様々な免疫グロブリン又は非免疫グロブリン足場、例えば、ブドウ球菌プロテインAのZドメインをベースとしたアフィボディ、エンジニアリングされたKunitzドメイン、ヒトフィブロネクチンIIIの第10細胞外ドメインをベースとしたモノボディ又はアドネクチン、リポカリンに由来するアンチカリン、DARPin(設計アンキリン反復ドメイン、多量体化LDLR−Aモジュール、アビマー、又はシステインリッチknottinペプチド)の任意のものから容易に得ることができる。例えば、参照により開示内容が本明細書に組み入れられる、Gebauer and Skerra(2009)Current Opinion in Chemical Biology 13:245−255を参照されたい。
第1、第2及び第3の目的の抗原に結合する単離されたヘテロ多量体タンパク質を様々な立体配置に従って調製することができ、いずれの場合でも、このヘテロ多量体タンパク質は、中心(第1の)ポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と任意選択により第3のポリペプチド鎖とを少なくとも含む。
そのようなヘテロ二量体タンパク質で使用する中心ポリペプチド鎖のドメイン配置(N末端からC末端へ)の例として、以下:
Va1−(CH1若しくはCK)a−Fcドメイン−Va2−Vb2、又は
Va2−Vb2−Fcドメイン−Va1−(CH1若しくは−CK)a
が挙げられ、Va1は軽鎖又は重鎖可変ドメインであり、Va2及びVb2の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。
Vb1−(CH1又はCK)b−Fcドメイン
を含むことができ、それにより、(CH1又はCK)bは中心鎖上の(CH1又はCK)aと二量体化し、Vb1は中心鎖のVa1と一緒に抗原結合ドメインを形成する。中心鎖のVa1が軽鎖可変ドメインである場合にはVb1は重鎖可変ドメインであり、中心鎖のVa1が重鎖可変ドメインである場合にはVb1は軽鎖可変ドメインである。
ヘテロ三量体タンパク質を、例えば、第1のCH1又はCK定常領域に融合された第1の可変ドメイン(V)と、第2のCH1又はCK定常領域に融合された第2の可変ドメイン(V)と、第1及び第2の可変ドメイン間に介在するFcドメイン又はその一部(即ち、このFcドメインは第1及び第2の(V−CH1/CK))単位間に介在する)とを含む中心(第1の)ポリペプチド鎖を使用することによって形成することができる。例えば、ヘテロ三量体タンパク質で使用する中心ポリペプチド鎖は、以下のようなドメイン配置(N末端からC末端へ):
Va1−(CH1又はCK)a−Fcドメイン−Va2−(CH1又はCK)b
を有することができる。
Vb1−(CH1又はCK)c−Fcドメイン
を含むことができ、それにより、(CH1又はCK)cは中心鎖上の(CH1又はCK)aと二量体化し、Va1及びVb1は抗原結合ドメインを形成する。
Vb2−(CH1又はCK)d
を含むことができ、それにより、(CH1又はCK)dは中心鎖上の(CH1又はCK)b単位と二量体化し、Va2及びVb2は抗原結合ドメインを形成する。
そのようなヘテロ二量体タンパク質で使用する中心ポリペプチド鎖のドメイン配置(N末端からC末端へ)の例として、以下:
V1−V1−Fcドメイン−V2−(CH1若しくはCK)a
(ここで、一方のV1は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のV1は重鎖可変ドメインであり、1つのV2は軽鎖又は重鎖可変ドメインである)、又は
V1−V1−Fcドメイン−V2−(CH1若しくはCK)a−V3−V3
(ここで、一方のV1は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のV1は重鎖可変ドメインであり、1つのV2は軽鎖又は重鎖可変ドメインであり、一方のV3は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方のV3は重鎖可変ドメインである)
が挙げられる。V1の対は第1のABDを形成し、V2の対は、第2のポリペプチド鎖上の相補的な可変ドメインと一緒に第2のABDを形成し、且つ2つのV3ドメインは対形成して第3のABDを形成する。中心鎖のFcドメインは、所望の機能性(例えば、FcRn結合性及び/又はCD16結合性)を付与するのに十分な完全Fcドメイン(CH2−CH3)又はその一部であり得る。次に、免疫グロブリン可変ドメインと、中心ポリペプチド鎖とのCH1−CKヘテロ二量体化を可能にするように選択されたCH1又はCK定常領域(例えば、(CH1又はCK)b単位)とを含む第2のポリペプチド鎖が構成され、この免疫グロブリン可変ドメインは、CH1又はCKドメインに隣接する中心鎖の可変ドメインを補完し、それによりこれらの相補的な可変ドメインが第1の目的の抗原用の抗原結合ドメインを形成するように選択される。
(VH若しくはVK)−(CH1若しくは(CK)b−scFv、又は
(VH若しくはVK)−(CH1若しくは(CK)b。
を含むことができ、それにより、(CH1又はCK)bは中心鎖上の(CH1又はCK)aと二量体化し、第2の鎖のVドメインは中心鎖のV2と一緒に抗原結合ドメインを形成する。中心鎖のV2が軽鎖可変ドメインである場合には第2の鎖のVは重鎖可変ドメインであり、中心鎖のV2が重鎖可変ドメインである場合には第2の鎖のVは軽鎖可変ドメインである。中心鎖がC末端scFvを欠く場合、第2のポリペプチドはC末端scFvを含むように選択される。
例えば、第1のCH1又はCK定常領域に融合された第1の可変ドメイン(V)と、第2のCH1又はCK定常領域に融合された第2の可変ドメイン(V)と、第1及び第2の可変ドメイン間に介在するFcドメイン又はその一部(即ち、このFcドメインは第1及び第2の(V−(CH1/CK))単位間に介在している)とを含む中心(第1の)ポリペプチド鎖を使用することにより、ヘテロ三量体タンパク質を形成することができる。例えば、ヘテロ三量体タンパク質で使用する中心ポリペプチド鎖は、以下のようなドメイン配置(N末端からC末端へ):
V1−(CH1又はCK)a−Fcドメイン−V2−(CH1又はCK)b
を有することができる。
V1−(CH1若しくはCK)c、又は
V1−(CH1若しくはCK)c−Fcドメイン
を含むことができ、それにより、(CH1若しくはCK)cは中心鎖上の(CH1又はCK)aと二量体化し、Va1及びVb1は抗原結合ドメインを形成する。
V2−(CH1又はCK)d−scFv
を含むことができ、それにより、(CH1又はCK)dは中心鎖上の(CH1又はCK)b単位と二量体化し、Va2及びVb2は抗原結合ドメインを形成する。
−CH3−リンカー−CH3−
を有することができる。
a)本明細書で説明されている第1のポリペプチド鎖(例えば、CK定常領域のCH1に融合された第1の可変ドメイン(V)と、第2の可変ドメイン(及び任意選択により第3の可変ドメイン、第2及び第3の可変ドメインは第1の抗原結合ドメインを形成する)と、第1及び第2の可変ドメイン間に介在するFcドメイン又はその一部とを含むポリペプチド鎖)をコードする第1の核酸を用意するステップ、
b)本明細書で説明されている第2のポリペプチド鎖(例えば、CH1又はCK定常領域にC末端で融合された第1の可変ドメイン(V)であって、CH1又はCK定常領域が、第1のポリペプチド鎖のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第1及び第2のポリペプチドが、第1のポリペプチド鎖の第1の可変ドメイン及び第2のポリペプチドの第1の可変ドメインが第2の抗原結合を形成するCH1−CKヘテロ二量体を形成する、第1の可変ドメイン(V)と、Fcドメイン又はその一部とを含むポリペプチド鎖)をコードする第2の核酸を用意するステップ、及び
c)前記第1及び第2の核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記第1及び第2のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生させ、且つヒトCD16に結合することができる二量体Fcドメインを含むヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
を含む方法を提供する。任意選択により、産生されたヘテロ二量体タンパク質は、精製前に総タンパク質(例えば、二重特異的タンパク質)の少なくとも20%、25%又は30%を示す。任意選択により、ステップ(c)は、産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインA支持体若しくはカラム上にローディングし、ヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ、及び/又は産生されたタンパク質(又は親和性交換若しくはプロテインAカラム上へのローディング後に回収したタンパク質)をイオン交換カラム上にローディングし、ヘテロ二量体画分を回収するステップを含む。一実施形態では、第1のポリペプチド鎖の第2の可変ドメインは、(任意選択により第3の可変ドメインと一緒に)NKp46に結合する。
a)複数の核酸対を用意するステップであって、各対が、(例えば、同一の又は異なる目的の抗原に結合する様々な抗体から得られる)複数の重鎖及び軽鎖可変領域対のそれぞれに関して、重鎖候補可変領域をコードする1つの核酸と軽鎖候補可変領域をコードする1つの核酸とを含む、ステップ、
b)複数の核酸対のそれぞれに関して、
(i)CH1又はCK定常領域に融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン(V)の一方と、第2の可変ドメイン(及び任意選択により第3の可変ドメイン、第2及び第3の可変ドメインは第1の抗原結合ドメインを形成する)と、候補及び第2の可変ドメイン間に介在するFcドメイン又はその一部とを含む第1のポリペプチド鎖をコードする第1の核酸を作製することと、
(ii)CH1又はCK定常領域にC末端で融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン(V)の他方であり、CH1又はCK定常領域が、第1のポリペプチド鎖のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第1及び第2のポリペプチドが、重鎖及び軽鎖候補可変ドメインが第2の抗原結合ドメインを形成するCH1−CKヘテロ二量体を形成する、重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン(V)の他方と、Fcドメイン又はその一部とを含む第2のポリペプチド鎖をコードする第2の核酸を作製することと、
(iii)前記第1及び第2のポリペプチド鎖をコードする核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記第1及び第2のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生させ、且つヒトCD16に結合することができる二量体Fcドメインを含むヘテロ二量体タンパク質を回収することと
により、ヘテロ二量体タンパク質を作製するステップ、及び
c)産生された複数のヘテロ二量体タンパク質を目的の生物学的活性、例えば本明細書で開示されている活性に関して評価するステップ
を含む方法を提供する。この方法では、第1又は第2の抗原結合ドメインの一方がNKp46に結合し、且つ他方が目的の抗原に結合する。一実施形態では、第1のポリペプチド鎖の第2の可変ドメインは、(任意選択により第3の可変ドメインと一緒に)NKp46に結合する。任意選択により、産生されたヘテロ二量体タンパク質は、精製前に総タンパク質の少なくとも20%、25%又は30%を示す。任意選択により、(iii)での回収するステップは、産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインA支持体若しくはカラム上にローディングし、ヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ、及び/又は産生されたタンパク質(又は親和性交換若しくはプロテインAカラム上へのローディング後に回収したタンパク質)をイオン交換カラム上にローディングし、ヘテロ二量体画分を回収するステップを含む。
(a)本明細書で説明されている第1のポリペプチド鎖(例えば、第1のCH1又はCK定常領域に融合された第1の可変ドメイン(V)と、第2のCH1又はCK定常領域に融合された第2の可変ドメインと、第1及び第2の(V−CH1/CK)単位間に介在するFcドメイン又はその一部とを含むポリペプチド鎖)をコードする第1の核酸を用意するステップ、
(b)本明細書で説明されている第2のポリペプチド鎖(例えば、C末端でCH1又はCK定常領域に融合された可変ドメイン(V)であって、CH1又はCK定常領域が、第1のポリペプチド鎖の第1のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第1及び第2のポリペプチドが、第1のポリペプチド鎖の第1の可変ドメイン及び第2のポリペプチドの可変ドメインが抗原結合ドメインを形成するCH1−CKヘテロ二量体を形成する、可変ドメインと、Fcドメイン又はその一部とを含むポリペプチド鎖)をコードする第2の核酸を用意するステップ、
(c)本明細書で説明されている第3のポリペプチド鎖(例えば、C末端でCH1又はCK定常領域に融合された可変ドメインを含むポリペプチド鎖を含む第3の核酸を用意するステップであって、CH1又はCK定常領域が、第1のポリペプチド鎖の第2の可変ドメイン及び第2のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第1及び第3のポリペプチドが、第1のポリペプチドの第2の可変ドメイン及び第3のポリペプチドの可変ドメインが抗原結合ドメインを形成するCH1−CKヘテロ二量体を形成する、ステップ、及び
(d)前記第1、第2及び第3の核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記第1、第2及び第3のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生させ、且つヒトCD16に結合することができる二量体Fcドメインを含むヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ
を含む方法を提供する。任意選択により、産生されたヘテロ三量体タンパク質は、精製前に総タンパク質の少なくとも20%、25%又は30%を示す。任意選択により、ステップ(d)は、産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインA支持体若しくはカラム上にローディングし、ヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ、及び/又は産生されたタンパク質(又は親和性交換若しくはプロテインAカラム上へのローディング後に回収したタンパク質)をイオン交換カラム上にローディングし、ヘテロ三量体画分を回収するステップを含む。一実施形態では、抗原結合ドメインの一方はNKp46に結合し、且つ他方は目的の抗原に結合する。一実施形態では、第2又は第3のポリペプチドは、(例えば、ヒンジドメイン又はリンカーを介して)CH1又はCKドメインのC末端に融合されたFcドメイン又はその断片をさらに含む。
a)複数の核酸対を用意するステップであって、各対が、(例えば、同一の又は異なる目的の抗原に結合する異なる抗体から得られる)複数の重鎖及び軽鎖可変領域対のそれぞれに関して、重鎖候補可変領域をコードする1つの核酸と軽鎖候補可変領域をコードする1つの核酸とを含む、ステップ、
b)複数の核酸対のそれぞれに関して、
(i)第1のCH1又はCK定常領域に融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン(V)の一方と、第2のCH1又はCK定常領域に融合された第2の可変ドメインと、第1及び第2の(V−CH1/CK)単位間に介在するFcドメイン又はその一部とを含む第1のポリペプチド鎖をコードする第1の核酸を作製することと、
(ii)C末端でCH1又はCK定常領域に融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン(V)の他方であり、CH1又はCK定常領域が、第1のポリペプチド鎖の第1のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第1及び第2のポリペプチドが、重鎖及び軽鎖候補可変ドメインが第抗原結合ドメインを形成するCH1−CKヘテロ二量体を形成する、重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン(V)の他方と、Fcドメイン又はその一部とを含む第2のポリペプチド鎖をコードする第2の核酸を作製することと、
(iii)C末端でCH1又はCK定常領域に融合された可変ドメインを含む第3のポリペプチド鎖をコードする第3の核酸を作製することであって、CH1又はCK定常領域が、第1のポリペプチド鎖の第2の可変ドメイン及び第2のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第1及び第3のポリペプチドが、第1のポリペプチドの第2の可変ドメイン及び第3のポリペプチドの可変ドメインが抗原結合ドメインを形成するCH1−CKヘテロ二量体を形成する、作製することと、
(iv)前記第1及び第2のポリペプチド鎖をコードする核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記第1及び第2のポリペプチド鎖を産生させ、且つヒトCD16に結合することができる二量体Fcドメインを含むヘテロ二量体タンパク質を回収することと
により、ヘテロ三量体タンパク質を作製するステップ、及び
c)産生された複数のヘテロ二量体タンパク質を目的の生物学的活性、例えば本明細書で開示されている活性に関して評価するステップ
を含む方法を提供する。一実施形態では、第2又は第3のポリペプチドは、(例えば、ヒンジドメイン又はリンカーを介して)CH1又はCKドメインのC末端に融合されたFcドメイン又はその断片をさらに含む。任意選択により、産生されたヘテロ三量体タンパク質は、精製前に総タンパク質の少なくとも20%、25%又は30%を示す。任意選択により、(iii)での回収するステップは、産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインA支持体若しくはカラム上にローディングし、ヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ、及び/又は産生されたタンパク質(例えば、親和性交換若しくはプロテインAカラム上へのローディング後に回収したタンパク質)をイオン交換カラム上にローディングし、ヘテロ三量体画分を回収するステップを含む。
(a)本明細書で説明されているタンパク質をコードする核酸を用意するステップ、
(b)前記核酸をそれぞれ宿主細胞中で発現させて前記タンパク質を産生させ、前記タンパク質を回収するステップ、及び
(c)産生されたタンパク質を目的の生物学的活性、例えば本明細書で開示されている活性、標的細胞(目的の抗原を発現する)の溶解を媒介する能力を評価するステップ
を含む方法を提供する。一実施形態では、複数の異なる多重特異的タンパク質を産生させて評価する。
(i)タンパク質の、このタンパク質が結合する活性化受容体を発現するエフェクター細胞(例えば、NK細胞、T細胞)に、標的細胞(目的の抗原を発現する)の存在下でそのようなエフェクター細胞と共にインキュベートされた場合に、標的細胞の溶解を媒介させる能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、ステップ(i)後、標的細胞の溶解を媒介するタンパク質を(例えば、さらなる開発のために、薬剤として使用するために)選択することを含むステップが続く。
(a)エフェクター細胞及び標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、多重特異的タンパク質のABDが結合する活性化受容体を発現するエフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を誘導して標的細胞を溶解させることができ、及び
(b)標的細胞の非存在下で、活性化受容体を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされた場合の、ABDが結合する活性化受容体でのアゴニスト活性の欠如であって、多重特異的タンパク質がCD16に結合することができ、エフェクター細胞がCD16陰性細胞(例えば、CD16−NK細胞)である、欠如。任意選択により、このエフェクター細胞は精製されたエフェクター細胞である。
一態様では、疾患の処置、予防又は診断を、それを必要とする哺乳動物において行うための医薬製剤の製造のための、本明細書で定義されている化合物(具体的には、本発明の多重特異的タンパク質若しくは抗体及び/又はそれらを発現する細胞)のいずれかの使用が提供される。また、薬剤としての又は薬剤中の活性成分若しくは活性物質としての、上記で定義されている化合物のいずれかの使用も提供される。さらなる態様では、本発明は、経口投与、局所投与、又は注射による投与のための固体又は液体製剤を生成するために本明細書で定義されている化合物を含む医薬組成物を調製する方法を提供する。そのような方法又はプロセスは、この化合物と薬学的に許容され得る担体とを混合するステップを少なくとも含む。
抗huNKp46抗体の作製
Balb/cマウスを組換えヒトNKp46細胞外ドメイン組換えFcタンパク質で免疫化した。マウスは、50μgのNKp46タンパク質と完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により最初の免疫を行い、50μgのNKp46タンパク質と不完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により2回目の免疫を行い、最後に、10μgのNKp46タンパク質の静脈投与により追加免疫した。免疫脾細胞を追加免疫の3日後にX63.Ag8.653不死化B細胞に融合し、これを放射線照射脾細胞の存在下で培養した。
実験は、Fcドメインを、抗NKp46結合ドメイン及び抗標的抗原結合ドメインと共にポリペプチドに配置する新規な二重特異的タンパク質形態を開発することを目的として行われた。そのような二重特異的タンパク質は、その抗NKp46結合ドメインを介してNKp46に一価で結合するはずである。単量体Fcドメインは、ヒト新生児Fc受容体(FcRn)に対する少なくとも部分的な結合を維持するが、ヒトCD16及び/又は他のヒトFcγ受容体には実質的に結合しないはずである。結果として、そのような二重特異的タンパク質は、Fcγ媒介(例えば、CD16媒介)標的細胞溶解を誘導しないはずである。
このようなタンパク質が機能的であり得るか否かを示すことができる抗NKp46二重特異的抗体が作製されていないため、NKp46を介したNK細胞の標的化前に新規な一価二重特異的タンパク質形態の可能な機能を調べるために、NKp46の代わりにCD3をモデル抗原として使用した。
抗CD19−VK
IgG1−Fcmono(最後のKは、この構築物中で除去された)
コード配列を直接合成及び/又はPCRによって構築した。PCRは、PrimeSTAR MAX DNAポリメラーゼ(Takara,#R045A)を用いて行い、PCR産物を、NucleoSpinゲル及びPCR clean−upキット(Macherey−Nagel,#740609.250)を用いて1%アガロースゲルから精製した。精製した後、PCR産物を定量してから、製造者のプロトコル(ClonTech,#ST0345)に記載されているようにIn−Fusion連結反応を行った。プラスミドは、Nucleospin 96プラスミドキット(Macherey−Nagel,#740625.4)を用いてEVO200(Tecan)で行われたミニプレップ調製後に得た。次いで、CHO細胞株のトランスフェクションの前に、プラスミドを配列の確認のために配列決定した。
細胞を回収して、抗CD19−F1−抗CD3産生細胞の細胞上清で、4℃で1時間染色した。染色緩衝液(PBS 1X/BSA 0.2%/EDTA 2mM)で2回洗浄した後、細胞をヤギ抗ヒト(Fc)−PE抗体(IM0550 Beckman Coulter−1/200)で4℃において30分間染色した。2回の洗浄後、染色をBD FACS Canto IIで実施し、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。
精製抗CD19−F1−抗CD3によるT細胞及びB細胞の凝集
精製抗CD19−F1−抗CD3をT/B細胞凝集アッセイで試験して、抗体が、CD19及びCD3発現細胞の凝集を促進するか否かを評価した。
二重特異的単量体FcポリペプチドのFcRnに対する結合性
表面プラズモン共鳴(SPR)による親和性試験
Biacore T100の一般的な手順及び試薬
SPR測定をBiacore T100装置(Biacore GE Healthcare)で25℃において行った。全てのBiacore実験では、酢酸緩衝液(50mM酢酸 pH5.6、150mM NaCl、0.1%界面活性剤p20)及びHBS−EP+(Biacore GE Healthcare)がそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液として使用された。センサーグラムをBiacore T100 Evaluationソフトウェアで分析した。組換えマウスFcRnをR&D Systemsから購入した。
組換えFcRnタンパク質をSensor Chip CM5上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面をEDC/NHS(N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩及びN−ヒドロキシスクシンイミド(Biacore GE Healthcare))で活性化した。FcRnタンパク質を結合緩衝液(10mM酢酸、pH5.6)で10μg/mlに希釈し、適切な固定化レベル(即ち、2500RU)に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、100mMエタノールアミン pH8(Biacore GE Healthcare)を用いて行った。
一価親和性試験をSingle Cycle Kinetic(SCK)プロトコルに従って行った。5段階希釈の41.5〜660nMの可溶性分析物(抗体及び二重特異的分子)を(再生なしで)FcRnに添加し、再生の10分前に解離させた。各分析物について、全てのセンサーグラムを、1:1SCK結合モデルを用いてフィッティングした。
CH2−CH3ドメインが2つの抗原結合ドメイン(具体的には2つのscFv)間に配置された抗CD19−F1−抗CD3を評価して、そのような二重特異的単量体Fcタンパク質が、FcRnへの結合を維持することができ、且つ従来の二重特異的抗体と比較して改善されたin vivo半減期を有するか否かを決定した。これらの実験の結果はFcRn結合性が維持されることを示しており、このモデルは、正常なIgG又は野生型IgGに対して、2:1の比(各抗体に対して2つのFcRn)ではなく1:1の比(各単量体Fcに対して1つのFcRn)を示唆している。
単量体Fcを有する多量体二重特異的タンパク質の構築
NK細胞等のエフェクター細胞上の活性化受容体はエフェクター細胞の活性化及び/又は標的細胞の溶解に寄与し得るが、従来の抗体は活性化受容体をブロックすることができ、完全長IgG1としてNKp46シグナル伝達をブロックする抗NKp46抗体により例証される。本発明者らは、標的から離れた不適切なNK活性化及び/又は標的細胞に対する全活性の低下をもたらし得る、標的細胞の非存在下でNKp46アゴニズムを誘導することなく、二重特異的タンパク質形態がNKp46のトリガーを引き起こすことができたか否かを調べた。
形態1(F1)のドメイン構造が図2Aに示されている。二重特異的Fc含有ポリペプチドを、腫瘍抗原CD19(抗CD19 scFv)に特異的なscFv及びNKp46受容体に特異的なscFvをベースに構築した。このポリペプチドは、以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する一本鎖ポリペプチドである。
(VK−VH)抗CD19−CH2−CH3−(VH−VK)抗NKp46
F2ポリペプチドのドメイン構造が図2Aに示されている。単量体CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、実施例2−1と同様であり、それは、同様にCH3ドメイン変異(変異(EU付番)L351K、T366S、P395V、F405R、T407A、及びK409Y)を含む。ヘテロ二量体は、以下から構成される。
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
(VK−VH)抗CD19−CH2−CH3−VH 抗NKp46−CH1、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK抗NKp46−CK。
F8ポリペプチドのドメイン構造を図2Bに示す。単量体CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は形態F2と同様であり、CH3ドメイン変異(変異(EU付番)L351K、T366S、P395V、F405R、T407A及びK409Y、並びにN連結グリコシル化を防止してFcγR結合性をさらに消失させるN297S変異)を同様に含む。F8タンパク質の以下の3つの変異体を作製した:(a)ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである1(野生型、F8Aと呼ばれる)、(b)ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基で置換された第2(F8B)、及び(c)ヒンジの残基DKTHTCPPCPを置換するリンカー配列GGGSSを含む第3(F8C)。変異型F8B及びF8Cは中心鎖のホモ二量体の形成を回避することから、これらの変異体は作製上の利点を提供した。このヘテロ三量体は以下から構成される:
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1の(中心)ポリペプチド鎖:
VH 抗CD19−CH1−CH2−CH3−VH 抗NKp46−CK、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK抗NKp46−CH1、及び
(3)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第3のポリペプチド鎖:
VK 抗CD19−CK。
F9ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖及びそれぞれCH1−CKの二量体化によって中心鎖に結合している2つのポリペプチド鎖を有する三量体ポリペプチドである。この三量体F9タンパク質のドメイン構造を図2Bに示し、CH1及びCKドメイン間の結合は鎖間ジスルフィド結合である。2つの抗原結合ドメインは、抗体がscFv形態で機能を維持するか否かにかかわらず、この抗体の使用を可能にするF(ab)構造を有する。CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、形態F4と同様の直列型CH3ドメインを含み、且つN297S置換を含むCH2ドメインを含む。F9タンパク質の以下の3つの変異体を作製した:(a)ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである第1(野生型、F9Aと呼ばれる)、(b)ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基で置換された第2(F9B)、及び(c)ヒンジの残基DKTHTCPPCPを置換するリンカー配列GGGSSを含む第3(F9C)。変異型F9B及びF9Cは、中心鎖のホモ二量体の形成を回避することにより作製で利点を提供した。このヘテロ三量体は以下から構成される:
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1の(中心)ポリペプチド鎖:
VH 抗CD19−CH1−CH2−CH3−CH3−VH 抗NKp46−CK、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK 抗NKp46−CH1、及び
(3)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第3のポリペプチド鎖:
VK 抗CD19−CK。
F10ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖及びCH1−CK二量体化によって中心鎖に結合している第2のポリペプチド鎖を有する二量体タンパク質である。この二量体F10タンパク質のドメイン構造を図2Bに示し、CH1及びCKドメイン間の結合は鎖間ジスルフィド結合である。2つの抗原結合ドメインの一方はFab構造を有し、且つ他方はscFvである。CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、形態F4で示すような直列型CH3ドメインを含み、且つN297S置換を含むCH2ドメインを含む。F10タンパク質の以下の3つの変異体も作製した:(a)ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである第1(野生型、F10Aと呼ばれる)、(b)ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基により置換された第2(F10B)、及び(c)ヒンジの残基DKTHTCPPCPを置換するリンカー配列GGGSSを含む第3(F10C)。変異型F10B及びF10Cは中心鎖のホモ二量体の形成を回避することから、これらの変異体は作製で利点を提供した。(VK−VH)単位は、VHドメイン、リンカー、及びVK単位(scFv)から構成されていた。このヘテロ二量体は以下から構成される:
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1の(中心)ポリペプチド鎖:
VH 抗CD19−CH1−CH2−CH3−CH3−(VH−VK)抗NKp46、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK 抗CD19−CK。
F11ポリペプチドのドメイン構造を図2Cに示す。このヘテロ二量体タンパク質はF10に類似しているが、抗原結合ドメインの構造が逆である。2つの抗原結合ドメインの一方はFab様構造を有し、且つ他方はscFvである。このヘテロ二量体は以下から構成される:
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1の(中心)ポリペプチド鎖:
(VK−VH)抗CD19−CH2−CH3−CH3−VH 抗NKp46−CK、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK 抗NKp46−CH1。
二量体F12ポリペプチドのドメイン構造を図2Cに示し、CH1及びCKドメイン間の結合はジスルフィド結合である。このヘテロ二量体タンパク質はF11に類似しているが、F(ab)構造内のCH1及びCKドメインが逆である。このヘテロ二量体は以下から構成される:
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1の(中心)ポリペプチド鎖:
(VK−VH)抗CD19−CH2−CH3−CH3−VH 抗NKp46−CH1、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK 抗NKp46−CK。
三量体F17ポリペプチドのドメイン構造を図2Cに示し、CH1及びCKドメイン間の結合はジスルフィド結合である。ヘテロ二量体タンパク質はF9と同様であるが、VH及びVKドメイン、並びにC末端F(ab)構造内のCH1及びCKドメインは、それぞれそれらのパートナーと逆である。このヘテロ三量体は以下から構成される:
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1の(中心)ポリペプチド鎖:
VH 抗CD19−CH1−CH2−CH3−CH3−VK 抗NKp46−CH1、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VH 抗NKp46−CK、及び
(3)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第3のポリペプチド鎖:
VK 抗CD19−CK。
二量体Fcドメインを有する二重特異的NKp46抗体形態
二量体Fcドメインを有する新規なタンパク質構築物を開発しており、このタンパク質構築物は、実施例3の単量体Fcドメインタンパク質の利点の多くを共有するが、より高い親和性でFcRnに結合する。FcγR(CD16を含む)への結合が低かった若しくは実質的に欠如していた又はFcγR(CD16を含む)への結合を有していた様々なタンパク質形態を作製し、例えば、ヒトCD16への結合親和性は、SPR(例えば、実施例15の方法を参照されたい)によって評価された場合に、野生型ヒトIgG1抗体の結合親和性の1−log内であった。この異なるポリペプチド形態を、(VH−(CH1/CK)−CH2−CH3−)単位又は(VK−(CH1又はCK)−CH2−CH3−)単位を有する中心鎖を含むヘテロ二量体タンパク質の機能を調べるために試験及び比較した。次いで、CH3ドメインの一方又は両方は、任意選択により介在アミノ酸配列若しくはドメインを介して、可変ドメイン(分離されたポリペプチド鎖上の可変ドメインに結合する単一可変ドメイン)、直列型可変ドメイン(例えば、scFv)、又は単一可変ドメインとして抗原に結合することができる単一可変ドメインに融合される。2つの鎖が、CH1−CK二量体化によって結合してジスルフィド結合二量体を形成するか、又は第3鎖と結合して三量体を形成する。
三量体F5ポリペプチドのドメイン構造が図2Dに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合(鎖上のCH1/CKとCH2ドメイン間に図形で示されている)及びCH1とCKドメインとの間の鎖間結合は鎖間ジスルフィド結合である。ヘテロ三量体は、以下から構成される。
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
VH 抗CD19−CH1−CH2−CH3−VH 抗NKp46−CK、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK 抗CD19−CK−CH2−CH3、及び
(3)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第3のポリペプチド鎖:
VK 抗NKp46−CH1
ヘテロ三量体F6ポリペプチドのドメイン構造が図2Dに示されている。F6タンパク質は、F5と同じであるが、N連結グリコシル化を防止するためのN297S置換を含む。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、prot−Aビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つSECによって精製した。このタンパク質は、12mg/Lの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なSECプロフィールを示した。F6タンパク質の3つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号41、42、及び43に示されている。
ヘテロ三量体F7ポリペプチドのドメイン構造が図2Dに示されている。F7タンパク質は、F6と同じであるが、但し、中心鎖とVK 抗NKp46−CH1鎖との二量体種の少数集団の形成を防止するために、それらのC末端でFcドメインに連結されたCH1及びCKドメインにシステインのセリンでの置換を有する。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、prot−Aビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つSECによって精製した。このタンパク質は、11mg/Lの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なSECプロフィールを示した。76タンパク質の3つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号44、45、及び46に示されている。
二量体F13ポリペプチドのドメイン構造が図2Dに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合(鎖上のCH1/CKとCH2ドメイン間に示されている)及びCH1とCKドメイン間の鎖間結合は、鎖間ジスルフィド結合である。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
VH 抗CD19−CH1−CH2−CH3−(VH−VK)抗NKp46、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK 抗CD19−CK−CH2−CH3。
二量体F14ポリペプチドのドメイン構造が図2Eに示されている。F14ポリペプチドは、F13形態の構造を共有する二量体ポリペプチドであるが、野生型Fcドメイン(CH2−CH3)の代わりに、F14二重特異的形態は、N連結グリコシル化をなくすためにCH2ドメイン変異N297Sを有する。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、prot−Aビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つSECによって精製した。このタンパク質は、2.4mg/Lの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なSECプロフィールを示した。F14タンパク質の2つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号49及び50に示されている。
三量体F15ポリペプチドのドメイン構造が図2Eに示されている。F15ポリペプチドは、F6形態の構造を共有するが、中心鎖と第2鎖との間のN末端VH−CH1とVK−CK単位とが逆であるため異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、prot−Aビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つSECによって精製した。このタンパク質は、0.9mg/Lの良好な産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なSECプロフィールを有していた。F15タンパク質の3つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号51、52、及び53に示されている。
三量体F16ポリペプチドのドメイン構造が図2Eに示されている。F16ポリペプチドは、F6形態の構造を共有するが、中心鎖と第2鎖との間のC末端VH−CKとVK−CH1単位とが逆であるため異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。F16タンパク質の3つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号54、55、及び56に示されている。
三量体T5ポリペプチドのドメイン構造を図2Fに示す。このT5ポリペプチドはF5形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、第3の鎖(Fcドメインを欠いている鎖)のC末端でのscFv単位の融合が異なる。従って、このタンパク質は、目的の抗原用の2つの抗原結合ドメインとNKp46用の1つとを有し、このタンパク質のFcドメインを介してCD16に結合する。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生させて精製した。以下のように、2つの異なるT5タンパク質を作製した。
CD137−T5−NKp46−CD19
ポリペプチド1:
残基1〜121は抗CD137結合ドメインであり、122〜454及び571〜677はT5配列であり、455〜570は抗NKp46結合ドメインである
残基1〜109(抗CD137)、110〜443はT5配列である
残基1〜107は抗NKp46結合ドメインであり、108〜219はT5配列であり、220〜469は抗CD19結合ドメインである
ポリペプチド1:
三量体T6ポリペプチドのドメイン構造を図2Fに示す。このT6ポリペプチドはF6形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、第3の鎖(Fcドメインを欠いている鎖)のC末端でのscFv単位の融合が異なる。このタンパク質は、目的の抗原用の2つの抗原結合ドメインとNKp46用の1つとを有するが、N297置換に起因して、この三量体タンパク質のFcドメインを介してCD16に結合しない。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生させて精製した。2つの異なるT6タンパク質を作製した。第1のT6タンパク質は、ヒトCD137に結合する1つの抗原結合ドメインと、ヒトNKp46に結合する1つの抗原結合ドメインと、CD19に結合する1つの抗原結合ドメインとを有した。第2のT6タンパク質は、ヒトCD20に結合する2つの抗原結合ドメインを有した(CD137−T6−NKp46−CD19)。第1の抗CD20 ABDは親抗体GA101のVH及びVLを含み、第2の抗CD20 ABDは親抗体リツキシマブのVH及びVLを含んだ。これらのT6タンパク質の3つの鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
CD137−T6−NKp46−CD19
ポリペプチド2:
ポリペプチド2:
三量体T9Bポリペプチドのドメイン構造を図2Fに示す。このT9BポリペプチドはF9形態(F9B変異体)の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、(第3の鎖上の)遊離CH1ドメインのC末端でのscFv単位の融合が異なる。このタンパク質は、従って、目的の抗原用の2つの抗原結合ドメインとNKp46用の1つとを有するが、単量体Fcドメイン及び/又はN297置換に起因して、このタンパク質のFcドメインを介してCD16に結合しない。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生させて精製した。2つの異なるT9Bタンパク質を作製した。第1のT9Bタンパク質は、ヒトCD137に結合する1つの抗原結合ドメインと、ヒトNKp46に結合する1つの抗原結合ドメインと、CD19に結合する1つの抗原結合ドメインとを有した(CD137−T9B−NKp46−CD19)。第2のT9Bタンパク質は、ヒトCD20に結合する2つの抗原結合ドメインを有した。第1の抗CD20 ABDは親抗体GA101のVH及びVLを含み、第2の抗CD20 ABDは親抗体リツキシマブのVH及びVLを含んだ。これらのT9Bタンパク質の3つの鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
CD137−T9B−NKp46−CD19
ポリペプチド2:
ポリペプチド2:
二量体T11ポリペプチドのドメイン構造を図2Fに示す。このT11ポリペプチドはF11形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、遊離CH1ドメインのC末端でのscFv単位の融合が異なる。このタンパク質は、従って、目的の抗原用の2つの抗原結合ドメインとNKp46用の1つとを有するが、単量体Fcドメイン及び/又はN297置換に起因して、この二量体タンパク質のFcドメインを介してCD16に結合しない。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生させて精製した。2つの異なるT11Bタンパク質を作製した。第1のT11Bタンパク質は、ヒトCD137に結合する1つの抗原結合ドメインと、ヒトNKp46に結合する1つの抗原結合ドメインと、CD19に結合する1つの抗原結合ドメインとを有した(CD137−T9B−NKp46−CD19)。第2のT9Bタンパク質は、ヒトCD20に結合する2つの抗原結合ドメインを有した。第1の抗CD20 ABDは親抗体GA101のVH及びVLを含み、第2の抗CD20 ABDは親抗体リツキシマブのVH及びVLを含んだ。これらのT11タンパク質の3つの鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
CD137−T11−NKp46−CD19
ポリペプチド1:
ポリペプチド1:
表面プラズモン共鳴(SPR)によって検出される二重特異的タンパク質によるNKp46結合親和性
Bacore T100の一般的な手順及び試薬
SPR測定をBiacore T100装置(Biacore GE Healthcare)で、25℃で行った。全てのBiacore実験では、HBS−EP+(Biacore GE Healthcare)及びNaOH 10mMは、それぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムをBiacore T100 Evaluationソフトウェアで分析した。プロテインAを(GE Healthcare)から購入した。ヒトNKp46組換えタンパク質をクローニングし、産生し、且つInnate Pharmaで精製した。
プロテインAタンパク質をSensor Chip CM5上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面をEDC/NHS(N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩及びN−ヒドロキシスクシンイミド(Biacore GE Healthcare))で活性化した。プロテインAを結合緩衝液(10mM酢酸、pH5.6)で10μg/mlに希釈し、適切な固定化レベル(即ち、2500RU)に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、100mMエタノールアミン pH8(Biacore GE Healthcare)を用いて行った。
抗体を、異なる形態F5、F6、F9、F10、F11、F13、F14として試験し、単鎖形態(F1)及び完全長ヒトIgG1のようなNKp46抗体と比較した。
一価親和性試験を、製造者(Biacore GE Healthcare kinetic wizard)が推奨する正規のCapture−Kineticプロトコルに従って行った。62.5〜400nMの範囲のヒトNKp46組換えタンパク質の7段階希釈物を、捕捉した二重特異的抗体に連続的に注入し、再生の10分前に解離させた。全てのセンサーグラムのセットを、1:1動態結合モデルを用いてフィッティングした。
SPRは、形態F1、F5、F6、F9、F10、F11、F13、F14の二重特異的ポリペプチドが、NKp46への結合性を維持したことを示した。一価親和性並びに動力学的結合及び解離速度定数が以下の表3に示されている。
Daudi腫瘍標的に対するNK細胞とFc含有NKp46xCD19二重特異的タンパク質との結合
単量体Fcドメイン及び実施例3に記載の一本鎖F1又は二量体F2形態に従って配置されたドメイン、及び異なる抗NKp46可変ドメイン(NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、又はNKp46−4)をベースとするNKp46結合領域を有する二重特異的抗体を、NK細胞にCD19陽性腫瘍標的細胞(Bリンパ芽球細胞株によって十分に特徴付けられるDaudi)を溶解させる機能的能力について試験した。F2タンパク質は、scFv形態ではNKp46への結合性を失うが、F2のF(ab)様形態では結合性を維持するさらなる抗体の可変領域(NKp46−9)をさらに含んでいた。
KHYG−1 hNKp46 NK実験モデルでは、各二重特異的抗体NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、又はNKp46−9が、陰性対照(ヒトIgG1アイソタイプ対照(IC)及びCD19/CD3二重特異的抗体)と比較して、ヒトKHYG−1 hNKp46 NK細胞株によるDaudi細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、これらの抗体が、CD19/NKp46架橋によってKHYG−1 hNKp46によるDaudi標的細胞の溶解を誘導することが示された。
完全長抗NKp46 mAbと枯渇抗腫瘍mAbとの比較:NKp46xCD19二重特異的タンパク質が非特異的NK活性化を防止する
これらの実験では、特有の二重特異的形態を有する二重特異的抗体が、非特異的NK細胞の活性化を引き起こすことなく、癌標的細胞に対するNKp46媒介NK活性化を媒介することができるか否かを評価することを目的として、そのような二重特異的抗体を作製した。
(a)完全長単一特異的抗NKp46抗体(ヒトIgG1のようなNKp46−3)、及び
(b)ADCC誘導抗体対照比較(ADCC inducing antibody control comparator)としての完全長ヒトIgG1のような抗CD19抗体。
>NK細胞のみ
>NK細胞対Daudi(C19+)
>NK細胞対HUT78(CD19−)
1.NK細胞のみ
これらの実験の結果は図4Aに示されている。標的抗原発現細胞の非存在下で、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体(NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、及びNKp46−9の可変領域のそれぞれを含む)はいずれも、CD69又はCD107の発現による評価によるとNK細胞を活性化しなかった。完全長抗CD19もNK細胞を活性化しなかった。しかしながら、完全長抗NKp46抗体は、NK細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アレムツヅマブも非常に高いレベルでNK細胞の活性化を誘導した。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
これらの実験の結果は図4Bに示されている。標的抗原発現細胞の存在下で、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体(NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、及びNKp46−9の結合ドメインのそれぞれを含む)は全て、NK細胞を活性化した。完全長抗CD19抗体は、最良でも非常に低いNK細胞の活性化のみを示した。完全長抗NKp46抗体もアレムツヅマブも、NK細胞のみの存在下で観察された活性化を超えた活性化の実質的な増加を示さなかった。図4のデータは、完全長抗NKp46抗体が、NK細胞のみの存在下で観察されたものと同様のレベルのベースライン活性化を誘発することを示す。アレムツヅマブも、NK細胞のみの存在下で観察された活性と同様のレベルのNK細胞の活性化を誘導し、この設定のより高い抗体濃度(ET 2.5:1)では、活性化は、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体を用いたときよりも高かった。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
これらの実験の結果は図4Cに示されている。標的抗原陰性HUT78細胞の存在下で、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体(NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、及びNKp46−9の可変領域のそれぞれを含む)は全て、NK細胞を活性化した。しかしながら、完全長抗NKp46抗体及びアレムツヅマブは、NK細胞のみの存在下で観察された同様のレベルでNK細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
低いET比での枯渇抗腫瘍mAb:NKp46xCD19二重特異的タンパク質の効果の比較
これらの試験は、二重特異的抗体が、低いエフェクター:標的比で、癌標的細胞に対するNKp46媒介NK細胞活性化を媒介できるか否かを調べることを目的とした。この実施例に使用されるET比は、実施例7で使用された2.5:1のET比又は実施例6の10:1のET比よりもin vivoで遭遇するであろう設定に近いと考えられる1:1とした。
(a)完全長単一特異的抗NKp46抗体(ヒトIgG1のようなNKp46−3)、及び
(b)ADCC誘導抗体対照比較としての完全長ヒトIgG1のような抗CD19抗体。
結果
上記の実験の結果は図5に示されている(図5A:CD107及び図5B:CD69)。標的抗原発現細胞の存在下では、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体(NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、又はNKp46−9の可変領域をそれぞれ含む)は全て、Daudi細胞の存在下でNK細胞を活性化した。
動作機序の研究
NKp46−3からの抗NKp46可変ドメインを有する実施例3又は4に記載のF2、F3、F5、又はF6形態に従った配置を有するNKp46x抗CD19二重特異的抗体を、CD16−/NKp46+NK細胞株にCD19陽性腫瘍標的細胞を溶解させるその機能的能力について、リツキシマブ(抗CD20 ADCC誘導抗体)、及びヒトIgG1アイソタイプ対照抗体と比較した。
上記実験の結果を図6A(KHYG−1対Daudi)及び図6B(KHYG−1対B221)に示す。KHYG−1 hNKp46 NK実験モデルでは、各NKp46×CD19二重特異的タンパク質(形態F2、F3、F5及びF6)は、ヒトKHYG−1 hNKp46 NK細胞株によるDaudi細胞又はB221細胞の特異的溶解を誘導するが、リツキシマブ及びヒトIgG1アイソタイプ対照(IC)抗体を誘導しなかった。
抗KIR3DL2二重特異的タンパク質
ヒトKIR3DL2を標的とする二重特異的タンパク質(KIR3DL2×NKp46二重特異的)をF6形態として構築し、活性に関して試験した。KIR3DL2(CD158k;キラー細胞免疫グロブリン様受容体、3つのIgドメイン及び長い細胞質尾部2)は、Pende et al.(1996)J.Exp.Med.184:505−518(この開示は参照により本明細書に組み入れられる)で説明されている約140kDの3つのIgドメイン分子のジスルフィド連結ホモ二量体である。KIR3DL2ポリペプチドに関していくつかの対立遺伝子変異体が報告されており、これらはそれぞれ用語KIR3DL2に包含される。成熟ヒトKIR3DL2(対立遺伝子*002)のアミノ酸配列をGenbankアクセッション番号AAB52520に示す。簡潔に述べると、ドナーからのBuffyコート由来のNK細胞の細胞溶解活性をU底96ウェルプレート中での典型的な4時間51Cr放出アッセイで評価した。KIR3DL2を発現するHUT78腫瘍細胞(CTCL)を51Crで標識し、次いで、1/10希釈で10μg/mL(又は100μg/mL)から始まる希釈範囲での試験抗体の存在下において、10:1(25000:2500)に等しいエフェクター/標的比でNK細胞と混合した(n=8)。アッセイは、3連においてcRPMI(150μL最終/ウェル)中であった。
多量体タンパク質内の鎖内ドメイン運動の効果
本発明者らは、NKp46二重特異的タンパク質の、標的細胞のNKp46媒介溶解を促進する能力が、NKp46抗原結合ドメイン及び目的の抗原と相互作用する抗原結合ドメインの一方又は両方の能力に影響を及ぼしてそれぞれの標的と相互作用することができる二重特異性タンパク質中の2つの抗原結合ドメイン間の距離に影響され得ることを理論化した。また、標的細胞のNkp46媒介溶解が、2つの抗原結合ドメインの構造及び/又はそれぞれの高次構造、2つの抗原結合ドメインの構造の影響を受け得る運動の自由度又は柔軟性、並びに2つの抗原結合ドメインが互いに結合する方法、例えばリンカーペプチド及びこのリンカーペプチドの特定の長さ及び化学組成の影響を受け得ることもさらに理論化した。具体的には、溶解性NKp46標的細胞シナプスが二重特異的タンパク質のサイズ及び構造の関数として変化し得ることを理論化した。従って、本発明者らは、抗原結合ドメインが、この抗原結合ドメインがその高次構造、間隔及び柔軟性をより密接に模倣又は近似する形態である二重特異的タンパク質を仮定した。
NKp46誘発及びCD16誘発の組み合わせ
NKp46−3由来の抗NKp46可変ドメインを有するF5形態に係る配置を有する、ヒトCD16に結合するNKp46×CD19二重特異的タンパク質を、精製されたNK細胞を誘導してCD19陽性Daudi腫瘍標的細胞を溶解させる機能的能力に関して、F6形態(CD16結合を欠く)での同一の二重特異的抗体及びヒトIgG1アイソタイプ抗CD19抗体並びにヒトIgG1アイソタイプ対照抗体と比較した。
CD16結合NKp46×CD19二重特異的の作用機序
NKp46×CD19二重特異的F5及びF6によるDaudi細胞の溶解を従来のヒトIgG1抗体と比較した。対照として、CD19を欠くHUT78細胞についても溶解を試験し、HUT78細胞溶解の陽性対照は、ヒトIgG1アイソタイプの抗KIR3DL2であった(HUT78はKIR3DL2陽性である)。細胞傷害アッセイを実施例10と同様に行った。NK細胞表面マーカーのフローサイトメトリー染色を実施例7と同様に行った。
Fcが操作されたCD16結合NKp46×CD20二重特異的
最も強力な新世代のFc増強抗体を改善することができる薬剤を生成するために、新規の二重特異的タンパク質をさらに構築した。この実験では、比較抗体として市販の抗体GA101(GAZYVA(登録商標)、Gazyvaro(登録商標)、オビヌツズマブ、Roche Pharmaceuticals)を選択し、これらは、低フコシル化されたN連結グリコシル化の結果としてCD16A結合性が増強されているFc改変ヒトIgG1抗体である。
様々な抗体形態のヒトFcRNに対する親和性を、実施例2〜6に記載されているように、組換えFcRnタンパク質をSensor Chip CM5上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定化することにより、表面プラズモン共鳴(SPR)によって試験した。
Fcγに対する結合性
そのような二重特異的単量体Fcタンパク質がFcγ受容体への結合を保持し得るかどうかを評価するために、様々な二重特異的Fcタンパク質を評価した。
様々な二重特異的形態の、既存の形態と比較して改善された産生プロフィール及び収率
ブリナツモマブ、並びにF1〜F17形態及びNKp46−3をベースとするNKp46及びCD19結合領域を有する2つの二重特異的抗体、並びにブリナツモマブをそれぞれ同じプロトコルに従って且つ同じ発現系を使用して、形態6(F6)、DART形態及びBITE形態の下でクローニングして産生させた。F6、DART及びBITE二重特異的タンパク質を、F6の場合にはprot−Aビーズを使用し、DART及びBITEの場合にはNi−NTAビーズを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養上清から精製した。精製したタンパク質をさらに分析し、SECにより精製した。BITE及びDARTは、F6と比較して非常に低い産生収率を示しており、精製したタンパク質は非常に複雑なSECプロフィールを有する。DART及びBITEは、予想されるSEC画分(BITEの場合には3及び4、並びにDARTの場合には4及び5)でのクマーシー染色後のSDS−PAGEによってわずかに検出可能であり、F6形態は、多量体二重特異的タンパク質を含む主ピーク(画分3)を有する、明確で単純なSEC及びSDS−PAGEプロフィールを示した。F6形態の主ピークは全タンパク質の約30%に一致する。これらの結果は、F1〜F17タンパク質で見られるものと一致し(データは示さない)、これは、これらの形態中に存在するFcドメイン(又はFc由来ドメイン)が産生を促進し、二重特異的タンパク質の品質及び溶解性を改善することを示す。
Claims (12)
- CH1又はCκドメインに融合された可変ドメイン(V−(CH1/Cκ)単位)をそれぞれ含む3つのポリペプチド鎖を含む多重特異的タンパク質であって、第1の(中心)鎖が、2つのV−(CH1/Cκ)単位と、前記単位間に介在するヒトFcドメインとを含み、第2の鎖が1つのV−(CH1/Cκ)単位とヒトFcドメインとを含み、且つ第3の鎖が1つのV−(CH1/Cκ)単位を含み、前記中心鎖の前記V−(CH1/Cκ)単位の一方が、CH1−Cκ二量体化によって前記第2の鎖の前記V−(CH1/Cκ)単位に結合され、それにより第1の抗原結合ドメイン及び二量体Fcドメインを形成し、前記中心鎖の前記V−(CH1/Cκ)単位の他方が、CH1−Cκ二量体化によって前記第3の鎖の前記V−(CH1/Cκ)単位に結合され、それにより第2の抗原結合ドメインを形成し、前記Fcドメインが残基N297(Kabat EU付番)においてN連結グリコシル化を含み、且つヒトCD16ポリペプチドに結合する、多重特異的タンパク質。
- 二量体Fcドメインを有する三量体であり、ドメイン配置:
- ドメイン配置:
- Fcドメインがヒンジ領域を介してCκドメインに融合されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 表面上に固定されて、Biacoreによる表面プラズモン共鳴を使用して決定された場合に、2000nM以下である一価結合に対するKDで可溶性ヒトCD16に結合する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記Fcドメインが、ヒトFcγ受容体への結合を増加させるためのアミノ酸置換を含むヒトCH2ドメインを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 1つの抗原結合ドメインが、エフェクター細胞の表面で発現される活性化受容体に結合し、且つ1つの抗原結合ドメインが癌、ウイルス又は細菌抗原に結合する、請求項1〜6のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 少なくとも1つの抗原結合ドメインが、完全長ヒトIgG1抗体の結合時に細胞内インターナリゼーションの誘導又は増加を受け得ることが分かっている癌、ウイルス又は細菌抗原に結合する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 標的細胞上の、前記タンパク質が結合する抗原の細胞内インターナリゼーションを実質的に増加させない、請求項1〜8のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、癌の処置のための組成物。
- ヘテロ三量体タンパク質を作製する方法であって、
(a)請求項1〜9のいずれか一項に記載の第1のポリペプチド鎖をコードする第1の核酸を用意するステップ、
(b)請求項1〜9のいずれか一項に記載の第2のポリペプチド鎖をコードする第2の核酸を用意するステップ、
(c)請求項1〜9のいずれか一項に記載の第3のポリペプチド鎖を含む第3の核酸を用意するステップ、及び
(d)前記第1、第2及び第3の核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記第1、第2及び第3のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生させ、前記産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択によりプロテインA支持体上にローディングし、且つヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ
を含む方法。 - 多量体ポリペプチドを同定又は評価する方法であって、
(a)請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリペプチド鎖をコードする核酸を用意するステップ、
(b)前記核酸を宿主細胞中で発現させて、それぞれ前記ポリペプチド鎖を産生させ、且つ前記ポリペプチド鎖を含む多量体ポリペプチドを回収するステップ、及び
(c)前記回収された多量体ポリペプチドを目的の生物学的活性に関して評価するステップ
を含む方法。
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