JP6822849B2 - 多重特異的ＮＫｐ４６結合タンパク質 - Google Patents

多重特異的ＮＫｐ４６結合タンパク質 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、全ての図面を含め、参照により両方の全内容が本明細書に組み入れられる、２０１４年６月２７日出願の米国仮特許出願第６２／０１７，８８６号明細書及び２０１５年１月２７日出願の米国仮特許出願第６２／１０８，０８８号明細書の利益を主張するものである。
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と合わせて出願されている。この配列表は、２０１５年６月２３日に作成された３０３ＫＢサイズの「ＮＫｐ４６−３ ＰＣＴ＿ＳＴ２５ ｔｘｔ」という名称のファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。
標的細胞の非存在下で、ＮＫ細胞を非特異的に活性化させることなく、ＮＫ細胞に結合し且つそれを特異的にリダイレクトして目的の標的細胞を溶解する多重特異的タンパク質が提供される。このタンパク質は、疾患、特に癌又は感染病の処置に有用である。
２つの異なるエピトープに結合する二重特異的抗体は、特異性を高める機会、効力を拡張する機会、及び従来のモノクローナル抗体では達成できない作用の新規な機序を利用する機会を提供する。同時に２つの標的に結合する二重特異的抗体の様々な形態が報告されている。また、二重特異的抗体を用いて２つの異なる受容体を架橋してシグナル伝達経路を阻害することは、様々な適用例で有用性を示している（例えば、（非特許文献１）を参照されたい）。二重特異的抗体は、２つの異なる受容体を中和するために使用されてきた。他のアプローチでは、二重特異的抗体は、免疫エフェクター細胞を動員するために使用され、ここで、Ｔ細胞の活性化が、２つの異なる細胞型における受容体に同時に結合する二重特異的抗体によって腫瘍細胞の近傍で達成される（（非特許文献２）を参照されたい）。これまでに開発されたアプローチは、主として、Ｔ細胞上のＣＤ３複合体を腫瘍関連抗原に結合する二重特異的抗体に関係している。しかしながら、他の例では、一方のアームがＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）に結合し、且つ他方のアームが目的の抗原、例えば、ＣＤ１９に結合する二重特異的抗体が開発された（（非特許文献３）を参照されたい）。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、従来にない免疫に関与するリンパ球の亜集団である。ＮＫ細胞は、不所望の細胞、例えば、腫瘍又はウイルス感染細胞を排除することができる効率的な免疫学的監視機構を提供する。ＮＫ細胞の特徴及び生物学的特性は、ＣＤ１６、ＣＤ５６、及び／又はＣＤ５７を含む表面抗原の発現、細胞表面上のα／β又はγ／δＴＣＲ複合体の非存在、特定の細胞溶解酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合してその細胞を殺す能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の異常細胞を殺す能力、及び免疫応答を刺激又は抑制するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を含む。
ＮＫ細胞の活性は、シグナルの活性化及び阻害の両方を伴う複合機構によって調節される。ＮＫ細胞媒介認識及びＨＬＡクラスＩ欠損標的細胞の殺生において重要な役割を果たすいくつかの異なるＮＫ細胞受容体が同定されている。１つの受容体は、ＮＫ細胞に特異的ではないが、ＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣに関与するＦｃγＲ３ａ（ＣＤ１６）である。別のＮＫ細胞受容体は、ＩｇスーパーファミリーのメンバーであるＮＫｐ４６である。ＮＫｐ４６は、ＮＫ細胞に特異的であり、特定のｍＡｂによって誘導されるその架橋は、細胞内Ｃａ＋＋のレベルを上昇させる強いＮＫ細胞の活性化をもたらし、それにより細胞障害性が誘発され、リンホカインが放出される。（特許文献１）（Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ）は、Ｆｃγ陽性の血液悪性腫瘍の処置での、Ｆｃγ受容体に結合する単一特異的完全長ＩｇＧ抗ＮＫｐ４６抗体の使用を開示している。腫瘍細胞（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍）上のＦｃγ受容体は、ＮＫ細胞に結合する抗ＮＫｐ４６抗体のＦｃドメインと相互作用し、それにより、活性化ＮＫ細胞が、抗体の２つの反応部分（例えば、抗原認識ドメイン及びＦｃドメイン）によってそれらの標的細胞に接近するようになり、処置の効率を高めると考えられる。
国際公開第２００５／１０５８５８号パンフレット
Ｊａｃｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：２０８５０−２０８５９ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９（１２）：４９４１−４ Ｋｅｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．３０３（２）：１２８−１３９
これまでＮＫ細胞特異的二重特異的抗体は開発されていない。ＮＫ細胞障害性を漸増させる除去剤、例えば、抗腫瘍抗体は、典型的にはＣＤ１６によってＡＤＣＣを媒介する完全長ＩｇＧ１である。様々な形態の二重特異的抗体の存在にもかかわらず、恩恵をもたらし得る新規な十分に定義された作用機序を有し、且つ完全長抗体に加えて使用することができるタンパク質が当技術分野でなお要望されている。
本発明は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６及び標的細胞上の目的の抗原に結合し、且つＮＫ細胞をリダイレクトして、目的の抗原を発現する標的細胞、例えば、疾患の一因である細胞を溶解することができる機能的な多重特異的タンパク質（例えば、限定されるものではないが、抗体ベースのタンパク質形態を含む、ポリペプチド、一本鎖タンパク質、多鎖タンパク質）の発見に由来する。
有利には、一実施形態において、ＮＫ細胞及び標的細胞の存在下で、多重特異的タンパク質が（ｉ）標的細胞上の目的の抗原、及び（ｉｉ）ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６に結合することができ、標的細胞上の目的の抗原及びＮＫｐ４６に結合すると、ＮＫｐ４６を介してＮＫ細胞のシグナル伝達及び／又はＮＫ細胞の活性化を誘導することができ（このタンパク質はＮＫｐ４６作動薬として機能する）、それにより、特にＮＫｐ４６によって伝達される活性化シグナルによってＮＫ細胞の活性化及び／又は標的細胞の溶解が促進される。特定の有利な実施形態では、多重特異的タンパク質は、一価でＮＫｐ４６に結合し、標的細胞上の目的の抗原及びＮＫｐ４６の両方に結合すると、ＮＫｐ４６を介してＮＫ細胞のシグナル伝達を誘導する。一実施形態では、このタンパク質は、第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインを含み、第１又は第２の抗原結合ドメインの一方がヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、且つ第１又は第２の抗原結合ドメインの他方が、標的細胞で発現される目的の抗原に結合する。
しかしながら、多重特異的タンパク質は、このタンパク質が標的細胞上の目的の抗原に結合していないときに（例えば、目的の抗原及び／又は標的細胞の非存在下で）、ＮＫ細胞にＮＫｐ４６シグナル伝達（及び／又はこのシグナル伝達から生じるＮＫ活性化）を実質的に誘導しない。標的細胞の非存在下でのＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性の不足により（ＮＫ細胞の活性化が、ＮＫｐ４６への結合の結果として実質的に誘導されず）、多重特異的タンパク質が、（例えば、疾患の部位以外の）不所望のＮＫ細胞の活性化を回避することができる。一実施形態では、二重特異的タンパク質は、ＮＫｐ４６でよりも目的の抗原（例えば、癌抗原）に対してより強く結合する（より強い結合親和性を有する）。
ヒトＮＫｐ４６のＮＫ細胞選択的発現パターンを考慮すると、多重特異的タンパク質は、実質的にＮＫ細胞（例えば、ＮＫｐ４６発現細胞）に限定される標的細胞に対する免疫エフェクター応答（例えば、細胞障害性応答）を誘導することができる。さらに、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）は、いずれのＮＫ細胞にも存在しないため、ＦｃγＲＩＩＩａによって抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を与えるように設計された（例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の）従来の治療用抗体は、いずれのＮＫ細胞も動員することができず、他方、本タンパク質は、ＮＫｐ４６による全てのＮＫ細胞の動員を可能にする。本発明のタンパク質は、ＦｃγＲではなくＮＫｐ４６によって伝達される活性化シグナルによる標的細胞の溶解を促進するため、本発明のタンパク質は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）によってＡＤＣＣを誘導し、それにより、２つの別個のＮＫ細胞の細胞毒性経路を標的とする治療薬、例えば、抗体と有利に併用することもできる。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、本明細書に記載の多重特異的タンパク質は、例えば、
（ａ）ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞及び標的細胞の存在下でインキュベートされたときのＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性、及び
（ｂ）標的細胞の非存在下でＮＫ細胞、例えば、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞と共にインキュベートされたときのＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性の欠如
によって特徴付けることができる。任意選択により、ＮＫ細胞は、精製ＮＫ細胞である。
タンパク質が、ＮＫｐ４６発現細胞及び標的細胞の存在下でインキュベートされたときに、ＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性を有するか否かの決定を、例えば、（ａ）ＮＫｐ４６発現（例えば、ＮＫ細胞又はレポーター細胞）、及び（ｂ）多重特異的タンパク質の非存在下で、レポーター細胞内でＮＫｐ４６シグナル伝達を誘導しない標的細胞と共にタンパク質をインキュベートすることによって行うことができ、且つタンパク質がＮＫｐ４６シグナル伝達、ＮＫ細胞の活性化、及び／又は標的細胞に対するＮＫ細胞毒性を引き起こすか否かを評価する。一実施形態では、タンパク質がＮＫｐ４６シグナル伝達を引き起こすか否かの評価は、ＮＫｐ４６シグナル伝達経路の変化の測定、例えば、リン酸化の監視によって行われる。一実施形態では、使用されるレポーター細胞は、ＮＫｐ４６シグナル伝達が引き起こされたかどうかの検出可能なシグナルを生成するように設計されている。
タンパク質が、標的細胞の非存在下でＮＫ細胞と共にインキュベートされたときに、アゴニスト活性を欠いているか否かの決定を、例えば、精製ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞と共にタンパク質をインキュベートすることによって行うことができる。タンパク質がＮＫ細胞（例えば、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞）の活性化をもたらさない場合、このタンパク質は、ＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性を欠いている。別の実施形態では、タンパク質がＮＫｐ４６シグナル伝達を引き起こさない場合、このタンパク質は、ＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性を欠いている。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、本明細書に記載の多重特異的タンパク質は、例えば、
（ａ）ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞及び標的細胞と共にインキュベートされたときの、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞を活性化する能力、及び
（ｂ）標的細胞の非存在下でＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞と共にインキュベートされたときの、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞を活性化する能力の欠如
によって特徴付けることができる。任意選択により、ＮＫ細胞は、精製ＮＫ細胞である。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、本明細書に記載の多重特異的タンパク質は、例えば、
（ａ）ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞及び標的細胞と共にインキュベートされたときの、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞に標的細胞を溶解させる能力、及び
（ｂ）標的細胞の非存在下でＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞と共に（例えば、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞のみで）インキュベートされたときの、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞を活性化する能力の欠如
によって特徴付けることができる。任意選択により、ＮＫ細胞は、精製ＮＫ細胞である。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、本明細書に記載の多重特異的タンパク質は、例えば、
（ａ）ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞及び標的細胞と共にインキュベートされたときの、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞を活性化させ、且つ／又はＮＫ細胞の細胞毒性を媒介する能力、及び
（ｂ）ＮＫｐ４６−ＣＤ１６＋ＮＫ細胞及び標的細胞と共にインキュベートされたときの、ＮＫｐ４６陰性、ＣＤ１６陽性（ＮＫｐ４６＋ＣＤ１６−）ＮＫ細胞を活性化させ、且つ／又はＮＫ細胞毒性を媒介する能力の欠如
によって特徴付けることができる。任意選択により、ＮＫ細胞は、精製ＮＫ細胞である。
一実施形態では、多重特異的タンパク質は、ヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６）に対して低下した結合性を有する（又は結合性を欠いている）。例えば、多重特異的タンパク質は、Ｆｃドメインを欠いていることができる。
一実施形態では、免疫グロブリンの抗原結合ドメイン及び／又は定常領域ドメインを含む抗体ベースの形態を含め、ＮＫｐ４６ベースのＮＫ細胞エンゲイジャー（ｅｎｇａｇｅｒ）に使用されるように構成された多重特異的タンパク質形態が提供される。ＮＫｐ４６のＮＫ選択的発現を、多重特異的タンパク質がヒトＦｃγ受容体に対する低下した結合を有している（又はそれを欠いている）が、Ｆｃドメインの少なくとも一部を維持している多重特異的（例えば、二重特異的）抗体形態と組み合わせることにより、本発明者らは、少なくとも部分的なＦｃＲｎ結合による好ましい薬理学を有し、且つＮＫ細胞毒性を目的の標的に向ける多重特異的抗体形態を提供し、このとき、抑制性Ｆｃγ受容体を活性化させることも、（ＮＫ細胞の効力を低下させ得る）ＮＫ細胞上のＦｃγ受容体の活性化をブロッキングすることもなく、且つ不所望の免疫抑制効果又は不所望の毒性（例えば、サイトカイン媒介毒性）をもたらし、全体的な多重特異的タンパク質の特異性を低下させ、及び／又は他の不所望の効果、例えば、Ｆｃγ受容体発現細胞によって媒介される腫瘍誘発効果（ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒａｌ ｅｆｆｅｃｔ）をもたらし得る、他の免疫細胞上の抑制性及び／又は活性化Ｆｃγ受容体（例えば、単球由来マクロファージ上のＣＤ１６）をトリガーすることもない。
本明細書の任意の実施形態の別の態様では、本明細書に記載の多重特異的タンパク質は、Ｆｃγ受容体発現細胞（例えば、Ｆｃγ受容体発現リンパ球）の存在下で、且つ標的細胞（例えば、目的の抗原を発現する細胞）の非存在下で、ＮＫ細胞と共にインキュベートされたときの、ＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性の欠如によって特徴付けることができる。一態様では、本明細書に記載の多重特異的タンパク質は、Ｆｃγ受容体発現細胞（例えば、Ｆｃγ受容体発現リンパ球、Ｆｃγ受容体発現ＮＫ細胞）の存在下で、且つ標的細胞（例えば、目的の抗原を発現する細胞）の非存在下で、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞と共にインキュベートされたときの、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞を活性化させる能力の欠如によって特徴付けることができる。
一実施形態では、多重特異的タンパク質は、例えば、
（ａ）ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞）及び標的細胞の存在下でインキュベートされたときのＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性、及び
（ｂ）Ｆｃγ受容体発現細胞（例えば、Ｆｃγ受容体発現リンパ球）の存在下で、且つ標的細胞（目的の抗原を発現する細胞）の非存在下で、ＮＫ細胞と共にインキュベートされたときのＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性の欠如
によって特徴付けることができる。
一実施形態では、多重特異的タンパク質は、例えば、
（ａ）ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞）及び標的細胞の存在下でインキュベートされたときの、ＮＫｐ発現ＮＫ細胞を活性化する能力、及び
（ｂ）Ｆｃγ受容体発現細胞（例えば、Ｆｃγ受容体発現リンパ球）の存在下で、且つ標的細胞（目的の抗原を発現する細胞）の非存在下で、ＮＫ細胞と共にインキュベートされたときの、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞を活性化する能力の欠如
によって特徴付けることができる。
タンパク質が、Ｆｃγ受容体発現細胞の存在下で、且つ標的細胞の非存在下でＮＫ細胞と共にインキュベートされたときにアゴニスト活性を欠いているか否かの決定を、例えば、標的細胞は存在しないが、Ｆｃγ受容体発現リンパ球の存在下でＮＫ細胞と共にタンパク質をインキュベートすることによって（例えば、タンパク質をＰＢＭＣと共にインキュベートすることによって）行うことができる。
一実施形態では、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６及び標的細胞によって発現される目的の抗原に結合する多重特異的タンパク質を同定する、試験する、及び／又は産生する方法が提供され、この方法は、
（ａ）多重特異的タンパク質が、ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞）及び標的細胞の存在下でインキュベートされたときにＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性を有するか否かを決定するステップ、及び
（ｂ）多重特異的タンパク質が、標的細胞の非存在下で（任意選択により、さらにＦｃγ受容体発現細胞の存在下で）ＮＫ細胞と共にインキュベートされたときにＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性を有するか否かを決定するステップ
を含む。
任意選択により、ＮＫ細胞は、精製ＮＫ細胞である。
一実施形態では、多重特異的タンパク質を同定する、試験する、及び／又は産生する方法が提供され、この方法は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６及び標的細胞によって発現される目的の抗原に結合する複数の多重特異的タンパク質を用意するステップを含み、
（ａ）各多重特異的タンパク質を、ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞）及び標的細胞の存在下でインキュベートされたときのＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性について評価するステップ、
（ｂ）各多重特異的タンパク質が、標的細胞の非存在下でＮＫ細胞と共に（任意選択により、さらにＦｃγ受容体発現細胞と共に）インキュベートされたときのＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性について評価するステップ、及び
（ｃ）多重特異的タンパク質が、
ａ．ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞）及び標的細胞の存在下でインキュベートされたときに、ＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性を有し、且つ
ｂ．標的細胞の非存在下で（任意選択により、さらにＦｃγ受容体発現細胞の非存在下で）ＮＫ細胞と共にインキュベートされたときにＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性を欠いている場合に、（例えば、薬剤として使用するため、さらなる評価のため、さらなる産生などのために）多重特異的タンパク質を選択するステップ
を含む。
任意の実施形態では、アゴニスト活性（又はその欠如）は、例えば、ＮＫ細胞活性化マーカーの発現、ＮＫ細胞毒性の誘導、又はＮＫ細胞の活性の増加についての他の適切なアッセイによって評価される、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞を活性化させる能力（又はその欠如）によって特徴付けることができる。
さらに、ＮＫｐ４６上の特定のエピトープが提供され、このエピトープは、有利な特性、特に（例えば、ＮＫｐ４６媒介シグナル伝達による）ＮＫ細胞による標的細胞の溶解の誘導において高い効果を有する二重特異的タンパク質をもたらすＮＫｐ４６結合部分を標的とするのに良く適している。また、効率的な多重特異的タンパク質の構築に使用するのに適した異なる抗ＮＫｐ４６抗体のＣＤＲ、及び例示的な多重特異的タンパク質のアミノ酸配列も提供される。
一実施形態では、多重特異的タンパク質（例えば、ポリペプチド、非抗体ポリペプチド、抗体）が提供され、この多重特異的タンパク質は、（ａ）第１の抗原結合ドメイン、及び（ｂ）第２の抗原結合ドメインを含み、第１の抗原結合ドメインの一方がＮＫｐ４６に結合し、且つ他方が（ＮＫｐ４６以外の）標的細胞上の目的の抗原に結合し、この多重特異的タンパク質は、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞に前記標的細胞を溶解させることができる。一実施形態では、このタンパク質は、ヒトＦｃドメインの少なくとも一部、例えば、ＦｃＲｎによって結合されるＦｃドメインを含み、任意選択により、多重特異的抗体は、低下したＦｃγＲ結合性を有するか、又はそれを実質的に欠くように設計され、一実施形態では、Ｆｃドメインは、２つのＡＢＤ（１つのＡＢＤがＦｃドメインのＮ末端に位置し、且つ他方がＣ末端に位置する）間に位置する。
一態様では、多重特異的タンパク質は、一本鎖タンパク質である。一態様では、多重特異的タンパク質は、２つ以上のポリペプチド鎖、即ち、複数鎖ポリペプチドを含む。例えば、多重特異的タンパク質又は複数鎖タンパク質は、二量体、三量体、又は四量体である。
ポリペプチド鎖に位置する抗原結合ドメインは、このようにその標的（即ち、ＮＫｐ４６若しくは目的の抗原）に結合することができるか、又は任意選択により、異なるポリペプチド鎖に位置する相補的なタンパク質ドメイン（抗原結合ドメイン）と共にその標的に結合することができ、この２つのポリペプチド鎖は結合して多量体（例えば、二量体、三量体など）を形成する。
一態様では、多重特異的タンパク質は、一価で（例えば、ＮＫ細胞の表面の）ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する。一態様では、タンパク質は、一価で目的の抗原に結合する。
一態様では、このタンパク質（及び／又はＮＫｐ４６に結合するその抗原結合ドメイン）は、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合について、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９、又は抗ＣＤ１９−Ｆ２−抗ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９二重特異的抗体のいずれか１つ又はいずれかの組み合わせと競合する。一実施形態では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９、又は抗ＣＤ１９−Ｆ２−抗ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９二重特異的抗体のいずれか１つ又は組み合わせに結合した残基から選択される１つ、２つ、又は３つ以上の残基を含む配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチド上のエピトープに結合する。一実施形態では、多重特異的タンパク質は、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができる。一実施形態では、多重特異的タンパク質は、例えば、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒト及び／又は非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）Ｆｃγ受容体に対して低い結合性を有するか、又は結合性が消失している。一実施形態では、多重特異的タンパク質は、低下した（例えば、部分的又は完全に消失した）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、ＦｃＲ媒介細胞活性化（例えば、ＦｃＲ架橋によるサイトカインの放出）、及び／又はＮＫｐ４６陰性エフェクター細胞によって媒介されるＦｃＲ媒介血小板活性化／減少を有する。
別の実施形態では、単量体又は多量体多重特異的一本鎖又は複数鎖タンパク質が提供され、このタンパク質は、（ａ）第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｂ）第２の抗原結合ドメインであって、第１又は第２の抗原結合ドメインの一方がＮＫｐ４６に結合し、且つ他方が（ＮＫｐ４６以外の）標的細胞上の目的の抗原に結合する、第２の抗原結合ドメイン、及び（ｃ）ヒトＦｃドメインの少なくとも一部を含み、このＦｃドメインは、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができ、且つ例えば完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体に対して低い結合性を有する。一実施形態では、多重特異的タンパク質は、低下した（例えば、部分的又は完全に消失した）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、ＦｃＲ媒介細胞活性化（例えば、ＦｃＲ架橋によるサイトカインの放出）、及び／又はＮＫｐ４６陰性エフェクター細胞によって媒介されるＦｃＲ媒介血小板活性化／減少を有する。一実施形態では、多重特異的タンパク質は、単量体である。一実施形態では、多重特異的Ｆｃ由来タンパク質は、二量体、例えば、ヘテロ二量体である。一実施形態では、単量体又は二量体タンパク質は、ドメイン構造を有するタンパク質を含み、このドメイン構造では、Ｆｃドメインは、ＮＫｐ４６に結合する第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）と目的の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインとの間に位置する。一実施形態では、多重特異的Ｆｃ由来ポリペプチドは、二重特異的抗体である。
本明細書の任意のタンパク質の一実施形態では、目的の抗原に結合する抗原結合ドメインは、ＮＫ細胞によって溶解される標的細胞によって発現される抗原（例えば、ポリペプチド）に結合する。任意選択により、このような抗原は、癌細胞、ウイルス感染細胞、又は自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の原因となる細胞によって発現される。
一実施形態では、多重特異的タンパク質は、一価でＮＫｐ４６に結合する。一実施形態では、多重特異的タンパク質は、一価で目的の抗原に結合する。一実施形態では、多重特異的タンパク質は、一価でＮＫｐ４６及び目的の抗原の両方に結合する。
一実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。任意選択により、前記重鎖及び軽鎖可変ドメインの両方は、ＮＫｐ４６との結合相互作用に関与する。
一実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。任意選択により、前記重鎖及び軽鎖可変ドメインの両方は、第２の抗原結合ドメインに結合された抗原との結合相互作用に関与する。
任意選択により、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部及びＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。
一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、野生型ＣＨ２ドメインに対してアミノ酸改変を含む。一実施形態では、ＣＨ２改変は、二重特異的ポリペプチドのヒトＦｃγ受容体への結合性を低下させる。一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、Ｎ２９７Ｘ突然変異（Ｋａｂａｔと同様のＥＵ付番）を含み、このＸは、アスパラギン以外の任意のアミノ酸である。一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、野生型ＣＨ３ドメインに対してアミノ酸改変を含む。
一実施形態では、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインは、天然に存在する（非変異）ヒトＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインである。一実施形態では、多重特異的タンパク質は、Ｎ結合型グリコシル化を欠いているか、又は改変Ｎ結合型グリコシル化を有するＦｃ由来ポリペプチドを含む。
一実施形態では、Ｆｃ由来ポリペプチドは単量体である。
一実施形態では、Ｆｃ由来ポリペプチドは二量体であり、任意選択により、ホモ二量体又はヘテロ二量体である。一実施形態では、Ｆｃ由来ポリペプチドはヘテロ三量体である。一実施形態では、Ｆｃ由来ポリペプチドはヘテロ四量体である。
一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、別のＦｃ由来ポリペプチドと二量体化しない（例えば、別の同一のＦｃポリペプチドとホモ二量体を実質的に形成しないが、ヘテロ二量体又はヘテロ三量体として残り、ホモ二量体を形成せず、単量体として残る）。一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体の形成を防止するためにＣＨ３ドメインの界面にアミノ酸変異（例えば、置換）を含む。
単量体二重特異的タンパク質の例は、図１〜図３及び図６Ａ〜図６Ｃに示されている。一実施形態では、（ａ）目的の抗原に結合する第１の抗原結合ドメイン、（ｂ）ＮＫｐ４６に結合する第２の抗原結合ドメイン、及び（ｃ）ヒトＦｃドメインの少なくとも一部を含む単量体二重特異的タンパク質が提供され、このＦｃドメインは、別のＦｃ由来ポリペプチドと二量体化しない（例えば、同一の単量体二重特異的ポリペプチドと二量体を形成しない）。一実施形態では、単量体二重特異的タンパク質は、ヒトＦｃＲｎに結合することができ、且つ野生型完全長ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体に対して低い結合性を有する。一実施形態では、単量体二重特異的タンパク質は、完全長野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有するポリペプチドと比較して、ヒトＦｃγ受容体に対して低い結合性を有するが、他は同一である。任意選択により、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止する（例えば、同一の単量体二重特異的ポリペプチド中の別のＣＨ３ドメインと相互作用により二量体を形成しないようにする）ための改変ＣＨ３ドメインを含む。
一実施形態では、Ｆｃドメインは、ポリペプチド鎖上の第１の抗原結合ドメインと第２の結合ドメインとの間に位置し、例えば、このポリペプチドは、ドメイン配置：（ＡＢＤ１）−ＣＨ２−ＣＨ３−（ＡＢＤ２）を有するか、又はさらにこのポリペプチドは、ドメイン配置：（ＡＢＤ１）−リンカー−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−（ＡＢＤ２）を有し、任意選択により、介在アミノ酸配列は、任意のタンパク質ドメイン間に存在する。一実施形態では、ＡＢＤ１は目的の抗原に結合する抗原結合ドメインであり、ＡＢＤ２はＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインである。
任意の実施形態の一態様では、第１の抗原結合ドメイン及び／又は第２の抗原結合ドメインは、重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインを含む。任意の実施形態の一態様では、第１の抗原結合ドメイン及び／又は第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、任意選択により、ｓｃＦｖは、ヒトフレームワークアミノ酸配列を含む。
任意選択により、単量体ポリペプチドは、中程度の親和性でヒトＦｃＲｎに結合することができ、例えば、ＦｃＲｎに結合するが、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃＲｎ受容体に対して低い結合性を有し、任意選択により、単量体ポリペプチドは、さらに、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγＲ（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、及び／又はＣＤ６４）に対して低い結合性を有する。
一実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質又はポリペプチドは四量体抗体であり、この四量体抗体は、２つの異なる親抗体に由来する可変領域（又はその１つ、２つ、若しくは３つのＣＤＲ）を含む２つの重鎖、及び２つの異なる親抗体に由来する可変領域（又はその１つ、２つ、若しくは３つのＣＤＲ）を含む２つの軽鎖から構成される。このような四量体は、（ａ）それぞれ可変領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、及びＦｃドメインを含む２つの重鎖、並びに（ｂ）それぞれ軽鎖可変領域及びＣＫドメインを含む２つの抗体軽鎖を含むことができ、１つの重鎖可変領域は軽鎖可変領域と共にＮＫｐ４６に結合し、且つ他方の重鎖可変領域は軽鎖可変領域と共に目的の抗原に結合する。任意選択により、Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎ結合性を保持しているが、ＦｃγＲ結合性が欠如した又は低いＩｇＧ４アイソタイプ又は改変型（例えば、アミノ酸置換を有するか、又は適切な宿主細胞で産生される）である。
一実施形態では、ヘテロ多量体、例えば、ヘテロ二量体の二重特異的タンパク質が提供され、この二重特異的タンパク質は、（ａ）ＣＨ１又はＣＫドメインに融合された第１の可変領域（Ｖ）を含み、Ｖ−（ＣＨ１／ＣＫ）単位がヒトＦｃドメイン（完全Ｆｃドメイン又はその一部）の第１の末端（Ｎ末端又はＣ末端）に融合されている、第１のポリペプチド鎖、（ｂ）第１鎖のＣＨ１又はＣＫと相補的なＣＨ１又はＣＫドメインに融合されてＣＨ１−ＣＫ二量体を形成する第１の可変領域（Ｖ）を含み、任意選択により、Ｖ−（ＣＨ１／ＣＫ）単位が少なくともヒトＦｃドメイン（完全Ｆｃドメイン又はその一部）に融合され、２つの第１の可変領域が、一価で目的の第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、第２のポリペプチド鎖、並びに（ｃ）（任意選択により、相補的な抗原結合ドメインと共に）第２の抗原に結合する抗原結合ドメイン、及び任意選択により、ＦｃドメインがＶ−（ＣＨ１／ＣＫ）単位と第２の抗原に結合する抗原結合ドメインとの間に位置するように第１のポリペプチドのＦｃドメインの第２の末端（Ｎ末端又はＣ末端）に融合された第２のＣＨ１又はＣＫドメインを含み、第１及び第２の抗原の一方はＮＫｐ４６である。任意選択により、第１及び第２のポリペプチド鎖は、例えば、それぞれのＣＨ１ドメインとＣＫドメインとの間に形成された鎖間ジスルフィド結合によって結合される。任意選択により、Ｖ−（ＣＨ１／ＣＫ）単位は、ヒトＦｃドメインに直接的に、又は介在配列、例えば、リンカー、他のタンパク質ドメインなどによって融合される。
上記のヘテロ多量体ポリペプチド又はタンパク質の一実施形態では、ポリペプチド又はタンパク質は、ヘテロ二量体であり、第２の抗原の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、任意選択により、ＮＫｐ４６に結合するｓｃＦｖである。
上記のヘテロ多量体ポリペプチド又はタンパク質の一実施形態では、ポリペプチド又はタンパク質はヘテロ三量体であり、第２の抗原の抗原結合ドメインは重鎖又は軽鎖可変領域であり、ヘテロ多量体ポリペプチド又はタンパク質は、第１鎖のＣＨ１又はＣＫと相補的なＣＨ１又はＣＫドメインに融合されてＣＨ１−ＣＫ二量体を形成する可変領域（Ｖ）を含む、第３のポリペプチド鎖をさらに含み、第１のポリペプチドの第２の抗原の抗原結合ドメインである可変領域と第３鎖の可変領域とが抗原結合ドメインを形成する。二重の二量体化から形成された３つのポリペプチド鎖は、三量体を形成する。第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣＫ定常領域は、（第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１／ＣＫに相補的ではないが）第１のポリペプチド鎖の第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択される。
一態様では、一価で目的の第１及び第２の抗原に結合し、抗原の一方がＮＫｐ４６であり、且つ他方が目的の抗原である、単離されたヘテロ二量体ポリペプチドが提供され、このヘテロ二量体ポリペプチドは、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、第１の可変ドメイン（Ｖ）、ＣＨ１又はＣＫ定常領域、Ｆｃドメイン又はその一部、第２の可変ドメイン、及び第３の可変ドメインを含む、第１のポリペプチド鎖、及び
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、第１の可変ドメイン（Ｖ）、ＣＨ１又はＣＫ定常領域、及び任意選択によりＦｃドメイン又はその一部を含む、第２のポリペプチド鎖
を含み、ＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチドの第１の可変ドメインとが、目的の第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成し、第２の可変ドメインと第３の可変ドメインとが、目的の第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する。第２のポリペプチド鎖にＦｃドメインが欠如している場合、第１のポリペプチド鎖は、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化（例えば、置換又は直列型ＣＨ３ドメイン）を防止するための改変されたＦｃドメインを含む。
一態様では、一価で目的の第１及び第２の抗原に結合し、抗原の一方がＮＫｐ４６であり、且つ他方が目的の抗原である、単離されたヘテロ二量体ポリペプチドが提供され、このヘテロ二量体ポリペプチドは、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、第２の可変ドメイン及び第３の可変ドメイン、Ｆｃドメイン又はその一部、第１の可変ドメイン（Ｖ）、並びにＣＨ１又はＣＫ定常領域を含む、第１のポリペプチド鎖、及び
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、第１の可変ドメイン（Ｖ）、ＣＨ１又はＣＫ定常領域、及び任意選択によりＦｃドメイン又はその一部を含む、第２のポリペプチド鎖
を含み、ＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチドの第１の可変ドメインとが、目的の第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成し、第２の可変ドメインと第３の可変ドメインとが、目的の第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する。第２のポリペプチド鎖にＦｃドメインが欠如している場合、第１のポリペプチド鎖は、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化（例えば、置換又は直列型ＣＨ３ドメイン）を防止するための改変されたＦｃドメインを含む。
一態様では、一価で目的の第１及び第２の抗原に結合し、抗原の一方がＮＫｐ４６であり、且つ他方が目的の抗原である、三量体ポリペプチドが提供され、この三量体ポリペプチドは、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、Ｆｃドメイン又はその一部、及び第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）を含む、第１のポリペプチド鎖、
（ｂ）第２のポリペプチド鎖であって、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖の（第２ではなく）第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された可変ドメイン、及び任意選択によりＦｃドメイン又はその一部を含む、第２のポリペプチド鎖、及び
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された可変ドメインを含み、ＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１のポリペプチド鎖の（第１ではなく）第２の可変領域及び第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域と相補的であるように選択される、第３のポリペプチド鎖
を含む。従って、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドとは、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣＫ定常領域と第１のポリペプチドの第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域との間ではなく、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣＫ定常領域と第１のポリペプチドの第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域との間にＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成する。第１のポリペプチドと第２のポリペプチドと第３のポリペプチドとは、ＣＨ１−ＣＫヘテロ三量体を形成し、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチド鎖の可変ドメインとは、目的の第１の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成し、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインと第３のポリペプチド鎖の可変ドメインとは、目的の第２の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する。
一実施形態では、上記のヘテロ多量体ポリペプチド又はタンパク質は、１つ以上の追加のポリペプチド鎖を含む。
一実施形態では、ヘテロ多量体ポリペプチド又はタンパク質は、単量体Ｆｃドメインを含み（例えば、第２のポリペプチドはＦｃドメインを含まない）、任意選択により、Ｆｃドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化又は直列型ＣＨ３ドメインを防止するためのアミノ酸変異を有するＣＨ３ドメインを含む。
一実施形態では、上記のヘテロ多量体ポリペプチド又はタンパク質は、二量体Ｆｃドメインを含む。
任意選択により、ヘテロ二量体ポリペプチド又はタンパク質は、中程度の親和性でヒトＦｃＲｎに結合することができ、例えば、ＦｃＲｎに結合するが、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃＲｎ受容体に対して低い結合性を有し、任意選択により、単量体ポリペプチドは、さらに、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγＲ受容体（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、及び／又はＣＤ６４）に対して低い結合性を有する。
任意選択により、ＣＨ１及び／又はＣＫドメインは、ヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合される。任意選択により、ヒンジ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３は、ヒトＦｃγＲ受容体（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、及び／又はＣＤ６４）に対する結合性が低下するか又は実質的に消失するようにアミノ酸改変を含む。任意選択により、このような変異は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、ＦｃＲ媒介細胞活性化（例えば、ＦｃＲ架橋によるサイトカインの放出）、及び／又はＮＫｐ４６陰性細胞によるＦｃＲ媒介血小板活性化／減少を低下させる（例えば、部分的又は完全に消失させる）。好ましくは、本明細書の任意の実施形態では、ＣＨ１及びＣＫドメインはヒト起源である。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、二重特異的タンパク質は、ＮＫｐ４６に対してよりも、目的の抗原（例えば、癌抗原）に対してより強く結合する（より高い結合親和性を有する）。このような抗体は、有利な薬理学的特性を提供する。本明細書の任意の実施形態の一態様では、このポリペプチドは、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合について、１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、又は好ましくは１０−９Ｍ未満のＮＫｐ４６との結合（一価）のＫｄを有し、任意選択により、このポリペプチドは、ＮＫｐ４６ポリペプチドとの結合（一価）のＫｄよりも低い、癌、ウイルス、又は細菌抗原との結合（一価）のＫｄを有する（即ち、より優れた結合親和性を有する）。本明細書の任意の実施形態の一態様では、このポリペプチドは、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合について１０−７Ｍ（１００ナノモル）〜１０−１０Ｍ（０．１ナノモル）のＮＫｐ４６との結合（一価）のＫｄを有する。本明細書の任意の実施形態の一態様では、このポリペプチドは、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合について１０−８Ｍ（１０ナノモル）〜１０−１０Ｍ（０．１ナノモル）のＮＫｐ４６との結合（一価）のＫｄを有する。本明細書の任意の実施形態の一態様では、このポリペプチドは、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合について１０−８Ｍ（１０ナノモル）〜１０−９Ｍ（１ナノモル）のＮＫｐ４６との結合（一価）のＫｄを有する。
本発明の任意の実施形態の一態様では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９、又は抗ＣＤ１９−抗ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９二重特異的抗体のいずれか１つに結合されたアミノ酸残基に一致するＮＫｐ４６の少なくとも１つの残基に結合する。一態様では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９、又は抗ＣＤ１９−抗ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９二重特異的抗体のいずれか１つ又は組み合わせに結合されたエピトープ内のＮＫｐ４６の少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つ以上のアミノ酸に結合する。本発明の任意の実施形態の一態様では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９、又は抗ＣＤ１９−抗ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９二重特異的抗体のいずれかと同じＮＫｐ４６ポリペプチドのエピトープに結合する。一実施形態では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、又は−９のいずれかに結合された残基の群から選択される１つ、２つ、又は３つ以上の残基を含む配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドのエピトープに結合する。
一部の実施形態では、ＮＫｐ４６に結合するタンパク質は、配列番号１の野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドと比較して、抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、又は−９のいずれかに結合された残基が異なるアミノ酸で置換された変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して著しく低い結合性を示す。
本発明の任意の実施形態の一態様では、ＮＫｐ４６に結合するタンパク質は、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合について、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、若しくはＮＫｐ４６−９、又は抗ＣＤ１９−抗ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９二重特異的抗体のいずれか１つ又はいずれかの組み合わせと競合する。一実施形態では、ＮＫｐ４６に結合するタンパク質は、以下の群から選択される抗体と、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合について競合する：
（ａ）配列番号３のＶＨ領域及び配列番号４のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−１）、
（ｂ）配列番号５のＶＨ領域及び配列番号６のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−２）、
（ｃ）配列番号７のＶＨ領域及び配列番号８のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−３）、
（ｄ）配列番号９のＶＨ領域及び配列番号１０のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−４）、
（ｅ）配列番号１１のＶＨ領域及び配列番号１２のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−６）、及び
（ｆ）配列番号１３のＶＨ領域及び配列番号１４のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−９）。
一実施形態では、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合について、以下の群から選択される抗体と競合する、Ｎｋｐ４６に特異的に結合する単離されたタンパク質（例えば、単一特異的モノクローナル抗体、多重特異的ポリペプチド、二重特異的抗体）が提供される：
（ａ）配列番号３のＶＨ領域及び配列番号４のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−１）、
（ｂ）配列番号５のＶＨ領域及び配列番号６のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−２）、
（ｃ）配列番号７のＶＨ領域及び配列番号８のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−３）、
（ｄ）配列番号９のＶＨ領域及び配列番号１０のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−４）、
（ｅ）配列番号１１のＶＨ領域及び配列番号１２のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−６）、及び
（ｆ）配列番号１３のＶＨ領域及び配列番号１４のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−９）。
本発明の任意の実施形態の一態様では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９のいずれか１つの超可変領域を含む。
本発明の任意の実施形態の一態様では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、及びＮＫｐ４６−９からなる群から選択される抗体の重鎖の１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを有する重鎖可変領域及び／又はこれらの抗体の軽鎖の１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を有する。
一態様では、（ｉ）ＮＫｐ４６、及び（ｉｉ）（ＮＫｐ４６以外の）目的の抗原に特異的に結合する単離された多重特異的タンパク質（単量体又は多量体ポリペプチド）が提供され、この多重特異的タンパク質は、配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含む単量体Ｆｃドメインを含み、任意選択により、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸によって置換され、任意選択により、配列番号２の残基１２１、１３６、１６５、１７５、１７７、又は１７９の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つに置換を含む。
一実施形態では、本開示によるＮＫｐ４６に結合する単離された多重特異的タンパク質は、以下の群から選択される任意の抗体の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３並びに軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３又はその抗原結合ドメインを含む：
（ａ）配列番号３のＶＨ領域及び配列番号４のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−１）、
（ｂ）配列番号５のＶＨ領域及び配列番号６のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−２）、
（ｃ）配列番号７のＶＨ領域及び配列番号８のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−３）、
（ｄ）配列番号９のＶＨ領域及び配列番号１０のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−４）、
（ｅ）配列番号１１のＶＨ領域及び配列番号１２のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−６）、及び
（ｆ）配列番号１３のＶＨ領域及び配列番号１４のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−９）。
一実施形態では、ＮＫｐ４６に結合する、本開示による抗体又は抗原結合ドメインは、以下を含む：
（ａ）（ｉ）表ＡのＮＫｐ４６−１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに（ｉｉ）表ＡのＮＫｐ４６−１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、
（ｂ）（ｉ）表ＡのＮＫｐ４６−２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに（ｉｉ）表ＡのＮＫｐ４６−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、
（ｃ）（ｉ）表ＡのＮＫｐ４６−３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに（ｉｉ）表ＡのＮＫｐ４６−３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、
（ｄ）（ｉ）表ＡのＮＫｐ４６−４の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに（ｉｉ）表ＡのＮＫｐ４６−４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、
（ｅ）（ｉ）表ＡのＮＫｐ４６−６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに（ｉｉ）表ＡのＮＫｐ４６−６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、又は
（ｆ）（ｉ）表ＡのＮＫｐ４６−９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに（ｉｉ）表ＡのＮＫｐ４６−９の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖。
一態様では、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、若しくはＮＫｐ４６−９からなる群から選択される抗体と同じＮＫｐ４６のエピトープに結合するＮＫｐ４６に特異的に結合する単離されたポリペプチド（単量体又は多量体ポリペプチド）（例えば、単一特異的モノクローナル抗体、多重特異的ポリペプチド、二重特異的抗体）が提供される。単離されたポリペプチドは、例えば、単一特異的モノクローナル抗体、多重特異的ポリペプチド、又は二重特異的抗体であり得る。
一態様では、以下を含む、ＮＫｐ４６に特異的に結合する単離されたポリペプチド（単量体又は多量体ポリペプチド）（例えば、単一特異的モノクローナル抗体、多重特異的ポリペプチド、二重特異的抗体）が提供される：
（ａ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、
（ｂ）配列番号５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、
（ｃ）配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、
（ｄ）配列番号９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、
（ｅ）配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号１２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、又は
（ｆ）配列番号１３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号１４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖。
一態様では、単離された多重特異的ヘテロ二量体タンパク質が提供され、この多重特異的ヘテロ二量体タンパク質は、本明細書に開示されるＦ１〜Ｆ１７ポリペプチドの第１のポリペプチド鎖の配列に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％同一である第１のアミノ酸配列、及び本明細書に開示されるそれぞれのＦ１〜Ｆ１７ポリペプチドの第２のポリペプチド鎖の配列に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％同一である第２のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド鎖を含む。任意選択により、第１鎖及び第２鎖の可変領域又はＣＤＲのいずれか又は全ては、異なる可変領域で置換され、任意選択により、可変領域又はＣＤＲは、同一性の計算に考慮される配列から除外され、任意選択により、抗ＮＫｐ４６可変領域又はＣＤＲは、同一性の計算に含められ、他の抗原に結合する抗原結合ドメインの可変領域又はＣＤＲは、同一性の計算に考慮される配列から除外される。
一態様では、単離された多重特異的ヘテロ三量体タンパク質が提供され、この多重特異的ヘテロ三量体タンパク質は、本明細書に開示されるＦ１〜Ｆ１７ポリペプチドの第１のポリペプチド鎖の配列に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％同一である第１のアミノ酸配列、本明細書に開示されるそれぞれのＦ１〜Ｆ１７ポリペプチドの第２のポリペプチド鎖の配列に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％同一である第２のアミノ酸配列、及び本明細書に開示されるそれぞれのＦ１〜Ｆ１７ポリペプチドの第３のポリペプチド鎖の配列に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％同一である第３のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド鎖を含む。任意選択により、第１及び第２鎖の可変領域又はＣＤＲのいずれか又は全ては、異なる可変領域で置換され、任意選択により、可変領域又はＣＤＲは、同一性の計算に考慮される配列から除外され、任意選択により、抗ＮＫｐ４６可変領域又はＣＤＲは、同一性の計算に含められ、他の抗原に結合する抗原結合ドメインの可変領域又はＣＤＲは、同一性の計算に考慮される配列から除外される。
本明細書の任意のポリペプチドの一実施形態では、多重特異的ポリペプチドは、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞に目的の標的細胞（例えば、ＮＫｐ４６以外の抗原を発現する標的細胞）を溶解させることができる。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、本開示の任意のタンパク質の第１のポリペプチド鎖、及び／又は第２のポリペプチド鎖、及び／又は第３のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸が提供される。本明細書の任意の実施形態の一態様では、本開示の任意のタンパク質の第１のポリペプチド鎖、及び／又は第２のポリペプチド鎖、及び／又は第３のポリペプチド鎖をコードする核酸を含む組換え宿主細胞が提供され、任意選択により、この宿主細胞は、少なくとも１、２、３、又は４ｍｇ／Ｌの収量（精製後の最終生産性）で本開示のタンパク質を産生する。また、本開示の第１のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸、本開示の第２のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸、及び任意選択により、本開示の第３のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸を含む核酸のキット又はセットも提供される。また、本開示の単量体、ヘテロ二量体、及びヘテロ三量体タンパク質を産生する方法も提供される。
いずれの方法も、特に「発明を実施するための形態」を含め、本出願に開示されるあらゆるステップを含むとしてさらに特徴付けることができる。本発明はさらに、本明細書に開示のタンパク質を同定する、試験する、及び／又は産生する方法に関する。本発明はさらに、任意の本方法によって得ることができる多重特異的タンパク質に関する。本開示はさらに、本明細書に開示される多重特異的タンパク質の医薬剤又は診断剤に関する。本開示はさらに、治療又は診断の方法での多重特異的タンパク質の使用方法に関する。
一実施形態では、多重特異的タンパク質は、治療有効量のＡＤＣＣ誘導抗体と組み合わせて、疾患（例えば、癌、ウイルス疾患、又は細菌疾患）を有する個人に投与される。ＡＤＣＣ誘導抗体は、例えば、ヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６）に結合されたＦｃドメインを含む、癌抗原、ウイルス抗原、又は細菌抗原に結合する抗体であり得る。一部の実施形態では、ＡＤＣＣ誘導抗体は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ抗体からのナイーブ又は改変Ｆｃドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＤＣＣ誘導抗体は、例えば、１つ以上のアミノ酸改変、例えば、アミノ酸置換又は低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を含むＦｃドメインを含み、ナイーブヒトＩｇＧ Ｆｃドメインと比較して高いＡＤＣＣ活性を有する。
本発明のこれら及び追加の有利な態様及び特徴は、本明細書の他の部分にさらに開示され得る。
抗原結合ドメイン（ＡＢＤ１又はＡＢＤ２）の一方がＮＫｐ４６に特異的に結合し、且つＡＢＤの他方が目的の抗原に結合する多重特異的ポリペプチドの２つの例を示し、左側の図は、直列型ｓｃＦｖを有し、右側の図は、間にＦｃドメインが配置された２つのＡＢＤを有する。 本明細書の実施例で使用される抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＮＫｐ４６の概略図を示す。ＣＨ２ドメインの星は任意選択のＮ２９７Ｓ変異を示す。 抗ＣＤ１９−抗ＮＫｐ４６−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏの概略図を示す。ｓｃＦｖ直列型構築物のために、抗ＮＫｐ４６ ＶＫドメイン（Ｃ末端）が、規則的なＶＫ−ＣＫ Ｌ型接合部（ｒｅｇｕｌａｒ ＶＫ−ＣＫ ｅｌｂｏｗ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を模倣したリンカーペプチド（ＲＴＶＡ）を用いてＣＨ２ドメイン（Ｎ末端）に連結されている。 抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３が、分離されているときは、Ｂ２２１（ＣＤ１９）又はＪＵＲＫＡＴ（ＣＤ３）細胞株の存在下でＴ／Ｂ細胞の凝集を引き起こさないが、Ｂ２２１及びＪＵＲＫＡＴ細胞の両方が共にインキュベートされたときに細胞の凝集を引き起こすことを示す。 抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３が、２：１の比率（各抗体に対して２つのＦｃＲｎ）でＦｃＲｎに結合するヒトＩｇＧ１定常領域（ＫＤ＝１５．４ｎＭ）を有するキメラ完全長抗体と比較して、１：１の比率（各単量体Ｆｃに対して１つのＦｃＲｎ）でＦｃＲＮとの結合（ＫＤ＝１９４ｎＭ）を維持することを示す。 作製される二重特異的抗ＮＫｐ４６タンパク質の異なるドメイン配置を示す。 図７Ａは、図７Ｂのそれぞれの差し引きセンサーグラム（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）を作成するために使用された、生データ曲線、サンプル（ＮＫｐ４６）、及びブランク（緩衝液）を示す重畳センサーグラムを示す。図７Ｂは、ＮＫｐ４６組換えタンパク質の捕捉二重特異的単量体ポリペプチドへの結合性を示す重畳差し引きセンサーグラムを示す。 それぞれＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４をベースとするＮＫｐ４６結合領域を有する二重特異的Ｆ１及びＦ２抗体を示し、これらの抗体は、静止ＮＫ細胞をそれらのＣＤ１９陽性Ｄａｕｄｉ腫瘍標的細胞に誘導することができ、アイソタイプ対照抗体は、Ｄａｕｄｉ細胞の除去をもたらさなかった。リツキシマブ（ＲＴＸ）はＡＤＣＣの陽性対照としての役割を果たし、ＲＴＸ（このアッセイでは１０μｇ／ｍｌ）で得られた最大応答は２１．６％の特異的溶解であった。 図９Ａは、Ｆ２形態のタンパク質におけるＮＫｐ４６及びＣＤ１９結合領域を有する二重特異的抗体が標的細胞の非存在下で静止ＮＫ細胞を活性化しないが、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及び陽性対照アレムツズマブがＮＫ細胞を活性化したことを示す。図９Ａ。図９Ｂは、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４の結合ドメインのそれぞれを含む）がＤａｕｄｉ標的細胞の存在下で静止ＮＫ細胞を活性化したが、完全長抗ＣＤ１９が最良でも非常に低いＮＫ細胞の活性化を示し、完全長抗ＮＫｐ４６抗体もアレムツズマブも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性化を実質的に超える活性化を示さなかったことを示す。図９Ｃは、ＣＤ１９陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４の可変領域のそれぞれを含む）のいずれもＮＫ細胞を活性化しなかったことを示す。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツズマブは、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された同様のレベルで、ＮＫ細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アイソタイプ対照抗体は活性化を誘導しなかった。 １：１の低いエフェクター：標的の比率では、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体のそれぞれは、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化させ、且つ二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９が、ＡＤＣＣ誘導抗体としての完全長ヒトＩｇＧ１のような抗ＣＤ１９抗体よりも遥かに効力があったことを示す。 各ＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的タンパク質（形態Ｆ３、Ｆ５、及びＦ６）は、ヒトＫＨＹＧ−１ ＣＤ１６陰性ｈＮＫｐ４６陽性ＮＫ細胞株によってＤａｕｄｉ細胞又はＢ２２１細胞の特異的溶解を誘導したが、リツキシマブ及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体はそうではなかったことを示す。 抗体の異なるＮＫｐ４６変異体への結合を示す。抗体ＮＫｐ４６−１は、野生型ＮＫｐ４６（図１２Ａ）と比較して、変異体２（図１２Ｂ）に対して低い結合性を有し、野生型ＮＫｐ４６（図１３Ａ）と比較して、追加変異体Ｓｕｐｐ７（図１３Ｂ）に対して低い結合性を有していた。抗体ＮＫｐ４６−３は、野生型ＮＫｐ４６（図１４Ａ）と比較して、変異体Ｓｕｐｐ８（図１４Ｂ）に対して低い結合性を有し、野生型ＮＫｐ４６（図１５Ａ）と比較して、追加変異体１９（図１５Ｂ）に対して低い結合性を有していた。抗体ＮＫｐ４６−４は、野生型ＮＫｐ４６（図１６Ａ）と比較して、変異体６（図１６Ｂ）に対して低い結合性を有し、野生型ＮＫｐ４６（図１７Ａ）と比較して、追加変異体Ｓｕｐｐ６（図１７Ｂ）に対して低い結合性を有していた。 カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）組換えＦｃｇＲ（上のグラフ；ＣｙＣＤ６４、ＣｙＣＤ３２ａ、ＣＹＣＤ３２ｂ、ＣｙＣＤ１６）及びヒト組換えＦｃｇＲ（下のグラフ；ＨｕＣＤ６４、ＨｕＣＤ３２ａ、ＨｕＣＤ３２ｂ、ＨＵＣＤ１６ａ）の固定化ヒトＩｇＧ１対照（灰色）及びＣＤ１９／ＮＫｐ４６−１二重特異的抗体（黒色）に対する結合性を示す重畳センサーグラムを示す。完全長野生型ヒトＩｇＧ１は、全てのカニクイザル及びヒトＦｃγ受容体に結合したが、ＣＤ１９／ＮＫｐ４６−１二重特異的抗体は、いずれの受容体にも結合しなかった。 図１９Ａは、ＤＡＲＴ及びＢＩＴＥと比較した、タンパク質形態６（Ｆ６）のＳＥＣによる精製の結果を示す。ＢＩＴＥ及びＤＡＲＴは、Ｆ６と比較して非常に低い産生収率を示し、極めて複雑なＳＥＣプロフィールを有する。図１９Ｂは、予想ＳＥＣ画分でのクマーシー染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し（ＢＩＴＥの３及び４並びにＤＡＲＴの４及び５）、Ｆ６形態は、主ピーク（画分３）が所望の二重特異的タンパク質を含む明確且つ単純なＳＥＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを示した。
定義
本明細書で使用される「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は１つ以上を意味し得る。請求項において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と共に使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は１つ又は２つ以上を意味し得る。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、これは、任意選択により「本質的に〜からなる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」で置き換えることができ、さらに任意選択により「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」に置き換えることができる。
本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」という語は、エピトープに免疫特異的に結合することができる３次元構造を含むドメインを指す。従って、一実施形態では、前記ドメインは、超可変領域、任意選択により抗体鎖のＶＨ及び／又はＶＬドメイン、任意選択により少なくとも１つのＶＨドメインを含み得る。別の実施形態では、結合ドメインは、抗体鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。別の実施形態では、結合ドメインは、非免疫グロブリン足場からのポリペプチドドメインを含み得る。
本明細書の「抗体」という語は、広い意味で使用され、特に、完全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、並びに抗体断片及び誘導体（但し、所望の生物学的活性を示すものに限られる）を含む。抗体の作製に適切な様々な技術が、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）に示されている。「抗体断片」は、完全長抗体、例えば、その抗原結合領域又は可変領域の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメイン）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片（典型的には、ＶＨ及びＣＨ１ドメイン）、及びｄＡｂ（典型的には、ＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、及びＶ−ＮＡＲドメイン；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びカッパボディ（例えば、Ｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９７；１０：９４９−５７を参照されたい）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；並びに抗体断片から形成された多重特異的抗体断片、及び１つ以上の単離されたＣＤＲ又は機能的パラトープが挙げられ、単離されたＣＤＲ又は抗原結合残基若しくはポリペプチドは、機能的抗体断片を形成するように１つに結合又は連結され得る。様々なタイプの抗体断片が、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２３，１１２６−１１３６；国際公開第２００５０４０２１９号パンフレット、及び米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号明細書及び同第２００２０１６１２０１号明細書に記載され、再考察されている。
本明細書で使用される「抗体誘導体」という語は、完全長抗体、又は例えばその少なくとも抗原結合領域又は可変領域を含む抗体の断片を含み、１つ以上のアミノ酸が、例えば、アルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成、又はアミド形成などによって化学修飾されている。これは、限定されるものではないが、ＰＥＧ化抗体、システイン−ＰＥＧ化抗体、及びこれらの変異体を含む。
「超可変領域」という語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、及び８９−９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインの残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１）、及び／又は「超可変ループ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、及び９１−９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １９８７；１９６：９０１−９１７）を含む。典型的には、この領域のアミノ酸残基の付番は、前出のＫａｂａｔらに記載の方法によって行われる。本明細書の「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔと同様の可変ドメイン残基の付番」、及び「Ｋａｂａｔによる」などの句は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについてのこの付番方式を指す。Ｋａｂａｔ付番方式を用いると、ペプチドの実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又はＦＲ又はＣＤＲへの挿入に一致するより少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後の単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、抗体の配列の相同領域と「基準」Ｋａｂａｔ付番配列とのアラインメントによって所与の抗体について決定することができる。
本明細書で使用される「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基とは、ＣＤＲとして定義される部分を除く抗体可変ドメインの領域のことである。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離された連続した領域にさらに細分することができる（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）。
本明細書で定義される「定常領域」とは、軽鎖又は重鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子の１つによってコードされる抗体由来定常領域のことである。本明細書で使用される「定常軽鎖」又は「軽鎖定常領域」とは、κ（Ｃκ）又はλ（Ｃλ）軽鎖によってコードされる抗体の領域のことである。定常軽鎖は、典型的には、単一ドメインを含み、且つ本明細書で定義されるように、Ｃκの１０８〜２１４位、又はＣλを指し、付番は、ＥＵインデックスによる（（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）。本明細書で使用される「定常重鎖」又は「重鎖定常領域」とは、μ、δ、γ、α、又はε遺伝子によってそれぞれコードされてＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＥとして抗体のアイソタイプを確定する抗体の領域のことである。完全長ＩｇＧ抗体では、本明細書で定義される定常重鎖は、ＣＨ１ドメインのＮ末端からＣＨ３ドメインのＣ末端までを指し、従って１１８〜４４７位を含み、付番は、ＥＵインデックスによる。
本明細書で使用される「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドのことである。Ｆａｂは、分離されたこの領域、又はポリペプチド、多重特異的ポリペプチド、若しくはＡＢＤ、又は本明細書で概説されたその他の実施形態との関連でのこの領域を指し得る。
本明細書で使用される「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」とは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片のことであり、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが、抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖを作製する方法は当技術分野で周知である。ｓｃＦｖを作製する方法の再考察については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
本明細書で使用される「Ｆｖ」、又は「Ｆｖ断片」、又は「Ｆｖ領域」とは、単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドのことである。
本明細書で使用される「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドのことである。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びに可撓性ヒンジＮ末端からこれらのドメインまでを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭでは、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧでは、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２（ＣＨ２）及びＣγ３（ＣＨ３）、並びにＣγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６、Ｐ２３０、又はＡ２３１からそのカルボキシ末端までを含むように定義され、この付番はＥＵインデックスによる。Ｆｃは、以下に記載される、分離されたこの領域、又はＦｃポリペプチドとの関連でのこの領域を指し得る。本明細書で使用される「Ｆｃポリペプチド」又は「Ｆｃ由来ポリペプチド」とは、Ｆｃ領域の全て又は一部を含むポリペプチドのことである。Ｆｃポリペプチドは、限定されるものではないが、抗体、Ｆｃ融合体、及びＦｃ断片を含む。
本明細書で使用される「可変領域」とは、それぞれ軽鎖（κ及びλを含む）免疫グロブリン遺伝子座及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶＬ（Ｖκ（ＶＫ）及びＶλを含む）遺伝子及び／又はＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含む抗体の領域のことである。軽鎖可変領域又は重鎖可変領域（ＶＬ又はＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域からなる。フレームワーク領域及びＣＤＲとの関連では、例えば、Ｋａｂａｔと同様に（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” Ｅ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）を参照されたい）、及びＣｈｏｔｈｉａと同様に正確に定義されている。抗体のフレームワーク領域、即ち、構成軽鎖及び構成重鎖の組み合わせフレームワーク領域は、ＣＤＲを配置して整列させる役割を果たし、ＣＤＲは抗原への結合に主に関与する。
「特異的に結合する」という語は、抗体又はポリペプチドを、タンパク質の組換え形態、その中のエピトープ、又は単離された標的細胞の表面に存在するナイーブタンパク質のいずれかを用いて評価される、好ましくは競合的結合アッセイでの結合パートナー、例えば、ＮＫｐ４６に結合できることを意味する。競合的結合アッセイ及び特異的結合を決定する他の方法は、以下にさらに記載され、当技術分野で周知である。
抗体又はポリペプチドが、特定のモノクローナル抗体（例えば、抗ＮＫｐ４６単一又は二重特異的抗体との関連でのＮＫｐ４６−１、−２、−４、−６、又は−９）と「競合する」と言われる場合、この「競合する」は、抗体又はポリペプチドが、組換え標的（例えば、ＮＫｐ４６）分子又は表面発現標的（例えば、ＮＫｐ４６）分子のいずれかを用いた結合アッセイでモノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が、結合アッセイにおいてＮＫｐ４６−１、−２、−４、−６、又は−９のＮＫｐ４６ポリペプチド又はＮＫｐ４６発現細胞に対する結合性を低下させる場合、抗体は、それぞれＮＫｐ４６−１、−２、−４、−６、又は−９と「競合する」と言われる。
本明細書で使用される「親和性」という語は、抗体又はポリペプチドのエピトープへの結合の強さを指す。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］として定義される解離定数ＫＤによって示され、［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は非結合抗体のモル濃度であり、及び［Ａｇ］は非結合抗原のモル濃度である。親和定数ＫＡは１／ＫＤによって定義される。ｍＡｂの親和性の決定に好ましい方法は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるＨａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３）に記載されている。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知の１つの好ましい標準的な方法では、（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析によって）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニングを使用する。
本発明との関連では、「決定基」は、ポリペプチド上の相互作用又は結合の部位を指定する。
「エピトープ」という語は、抗原決定基を指し、抗体又はポリペプチドが結合する抗原の範囲又は領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、並びに特定の抗原結合抗体又はペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基、即ち、抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。タンパク質エピトープは、例えば、抗体又は受容体と結合することができる複合抗原分子上の最も単純な形態又は最も小さい領域である。エピトープは、線形又は高次構造／構造であり得る。「線形エピトープ」という語は、アミノ酸の線形配列（一次構造）上の連続したアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。「高次構造又は構造エピトープ」という語は、全てが連続しているわけではないアミノ酸残基から構成され、従って分子の折り畳み（二次、三次、及び／又は四次構造）によって互いに近接するアミノ酸の線形配列の分離した部分を表すエピトープとして定義される。高次構造エピトープは３次元構造によって決まる。従って、「高次構造の」という語は、「構造の」という語と頻繁に同義的に使用される。
本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失のことである。本明細書のアミノ酸改変の一例は置換である。本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失のことである。本明細書の「アミノ酸置換」又は「置換」とは、タンパク質配列の所与の位置のアミノ酸の別のアミノ酸での置換のことである。例えば、置換Ｙ５０Ｗは、親ペプチドの変異体を指し、５０位のチロシンがトリプトファンで置換されている。ポリペプチドの「変異体」は、基準ポリペプチド、典型的にはナイーブ又は「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体は、ナイーブアミノ酸配列内の特定の位置に１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を有し得る。
「保存的な」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の物理化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で公知であり、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
２つ以上のポリペプチドの配列間の関係で使用される「同一性」又は「同一の」という語は、２つ以上のアミノ酸残基のストリング間の一致の数によって決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の計算モデル又はコンピュータープログラム（即ち、「アルゴリズム」）によって行われる、（存在する場合）ギャップアライメントを用いた同様の２つ以上の配列間の完全な一致のパーセントを示す。関連ポリペプチド間の同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。このような方法としては、限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載の方法が挙げられる。
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を得るように設計されている。同一性を決定する方法は、公表されているコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））を含め、ＧＣＧプログラムパッケージを含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）及び他の情報源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，前出）から公表されている。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性の決定に使用することができる。
「単離された」分子は、組成物中の主な種である分子であり、この組成物中では、この分子は、この分子が属する分子のクラスに対して見出される（即ち、単離された分子は、組成物中の分子のタイプの少なくとも約５０％を構成し、典型的には、組成物中の分子、例えば、ペプチドの種の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％以上を構成する）。通常、ポリペプチドの組成は、組成物中に存在する全てのペプチド種との関連でのポリペプチドに対して、又は少なくとも提案される使用との関連での実質的に活性なペプチド種に対して９８％、９８％、又は９９％の均一性を示す。
本明細書に関連して、「処置」又は「処置する」は、反対の旨の記載がない限り、疾患又は障害の１つ以上の症状又は臨床的に関連する兆候を予防すること、緩和すること、管理すること、治癒すること、又は軽減することを指す。例えば、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連する兆候が確認されていない患者の「処置」は、防止又は予防療法であり、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連する兆候が確認された患者の「処置」は、一般に、防止又は予防療法とはならない。
本明細書で使用される「ＮＫ細胞」は、従来にない免疫に関与するリンパ球の亜集団を指す。ＮＫ細胞は、特定の特徴及び生物学的特性、例えば、ヒトＮＫ細胞のＣＤ５６及び／又はＮＫｐ４６を含む特定の表面抗原の発現、細胞表面のα／β又はγ／δＴＣＲ複合体の非存在、特定の細胞溶解装置の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合してその細胞を殺す能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の異常細胞を殺す能力、及び免疫応答を刺激又は抑制するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力によって特定することができる。これらの特徴及び活性のいずれかを用いて、当技術分野で周知の方法でＮＫ細胞を特定することができる。ＮＫ細胞のいかなる亜集団もＮＫ細胞という語に包含される。本明細書に関連して、「活性な」ＮＫ細胞は、標的細胞を溶解する又は他の細胞の免疫機能を促進する能力を有するＮＫ細胞を含む生物学的に活性なＮＫ細胞を指す。ＮＫ細胞は、当技術分野で公知の様々な技術、例えば、血液サンプルからの単離、細胞吸着除去療法、組織又は細胞の収集などによって得ることができる。ＮＫ細胞を伴うアッセイの有用なプロトコルは、Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＫＳ ａｎｄ Ｃｏｌｏｎｎａ Ｍ）．Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．２１９−２３８（２０００）に記載されている。
本明細書で使用される、Ｎｋｐ４６で「アゴニスト」活性を有する作用物質は、「ＮＫｐ４６シグナル伝達」を引き起こす又は増加させることができる作用物質である。「ＮＫｐ４６シグナル伝達」は、細胞内シグナル伝達経路を活性化させる又は伝達するＮＫｐ４６ポリペプチドの能力を指す。ＮＫｐ４６シグナル伝達活性の変化は、例えば、シグナル伝達要素のリン酸化の監視などによるＮＫｐ４６シグナル伝達経路の変化を測定するように設計されたアッセイ、特定のシグナル伝達要素と他のタンパク質若しくは細胞内構造の結合を測定するアッセイ、又はキナーゼなどの成分の生化学活性において、又はＮＫｐ４６感受性プロモーター又はエンハンサーの制御下でのレポーター遺伝子の発現を測定するように設計されたアッセイによって、又はＮＫｐ４６ポリペプチドによって媒介される下流の効果（例えば、ＮＫ細胞における特定の細胞溶解装置の活性化）によって間接的に測定することができる。レポーター遺伝子は、天然に存在する遺伝子であり得る（例えば、サイトカインの産生を監視する）、又は細胞に人工的に導入される遺伝子であり得る。他の遺伝子は、このような調節要素の制御下に置くことができ、従って、ＮＫｐ４６シグナル伝達のレベルを報告する役割を果たす。
「ＮＫｐ４６」は、Ｎｃｒ１遺伝子又はこのような遺伝子から調製されるｃＤＮＡによってコードされるタンパク質又はポリペプチドを指す。あらゆる天然に存在するイソ型、対立遺伝子、又は変異体は、ＮＫｐ４６ポリペプチドという語（例えば、配列番号１に９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一のＮＫｐ４６ポリペプチド、又はその少なくとも２０、３０、５０、１００、若しくは２００のアミノ酸残基の連続した配列）に包含される。ヒトＮＫｐ４６（イソ型ａ）の３０４のアミノ酸残基の配列は、以下のように示される。
Figure 0006822849
配列番号１は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００４８２０に一致し、この開示は、参照により本明細書に組み入れられる。ヒトＮＫｐ４６ ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４８２９に示されており、この開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
ポリペプチドの産生
本明細書に記載のタンパク質に使用される抗原結合ドメインは、様々な免疫グロブリン又は非免疫グロブリン足場、例えば、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメインをベースとしたアフィボディ、エンジニアリングされたＫｕｎｉｔｚドメイン、ヒトフィブロネクチンＩＩＩの第１０細胞外ドメインをベースとしたモノボディ又はアドネクチン、リポカリンに由来するアンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリン反復ドメイン、多量体化ＬＤＬＲ−Ａモジュール、アビマー、又はシステインリッチｋｎｏｔｔｉｎペプチド）から容易に得ることができる。例えば、参照により開示内容が本明細書に組み入れられる、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：２４５-２５５を参照されたい。
可変ドメインは、通常、抗体（免疫グロブリン鎖）に由来し、例えば、２つのポリペプチド鎖に存在する結合したＶＬ及びＶＨドメイン、又は一本鎖抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｄＡｂ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、又はＶＨＨドメインの形態である。抗原結合ドメイン（例えば、ＡＢＤ１及びＡＢＤ２）はまた、Ｆａｂのような抗体から容易に得ることができる。
典型的には、抗体は、最初は、抗体（例えば、ヒトポリペプチド）を得るのに望ましいポリペプチド、又は典型的には免疫原性断片であるその断片若しくは誘導体を含む免疫原を用いて、非ヒト動物、例えば、マウスの免疫によって得られる。非ヒト哺乳動物を抗原で免疫するステップは、マウスの抗体の産生を刺激するための当技術分野で周知の任意の方式で行うことができる（例えば、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＥ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい）。免疫に使用される抗原に対する抗体を発現するＢ細胞を産生するのであれば、他のプロトコルも使用することができる。非免疫非ヒト哺乳動物からのリンパ球を単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ、これを細胞培養で免疫原に曝露することもできる。次いで、リンパ球を回収し、以下に記載される融合ステップを行う。例示的なモノクローナル抗体では、次のステップは、免疫された非ヒト哺乳動物からの脾細胞の単離であり、続いて、抗体産生ハイブリドーマを産生するためのこれらの脾細胞の不死化細胞との融合である。次いで、ハイブリドーマコロニーを、抗体が望ましいポリペプチドに特異的に結合する抗体の産生についてアッセイした。アッセイは、典型的には、比色ＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマが増殖されるウェルに適合させることができる任意のアッセイを利用することができる。他のアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ又は蛍光活性化細胞分類が挙げられる。所望の抗体の産生に陽性なウェルを検査して、１つ以上の異なるコロニーが存在するか否かを決定する。２つ以上のコロニーが存在する場合、細胞を再びクローニングして、単一の細胞のみが、所望の抗体を産生するコロニーに生じるようになるように成長させることができる。所望のモノクローナル抗体を産生するまで十分に成長させたところで、モノクローナル抗体を含む成長培地（又は腹水）を細胞から分離し、そこに存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、典型的には、ゲル電気泳動法、透析、プロテインＡ若しくはプロテインＧセファロースを用いるクロマトグラフィー、又は固体支持体、例えば、アガロース若しくはセファロースビーズに連結された抗マウスＩｇによって達成される（全てが、例えば、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．１８−１０３７−４６，Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＣに記載されている）。
ヒト抗体は、ヒト抗体レパートリーを発現するようにエンジニアリングされたトランスジェニック動物（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ ｅｔ Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５）を免疫に用いることによって、又はファージ提示法を用いる抗体レパートリーの選択によって産生することもできる。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を免疫に使用することができる。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、その免疫グロブリン遺伝子が機能的なヒト免疫グロブリン遺伝子によって置き換えられたマウス宿主である。従って、このマウスによって、又はこのマウスのＢ細胞から産生されたハイブリドーマで産生される抗体は既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、参照によりその内容が本明細書に組み入れられる米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。
抗体はまた、例えば、（参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４）に開示されているように、免疫グロブリンの組み合わせライブラリーの選択によって産生することもできる。ファージ提示法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３）を用いて、非免疫ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから抗体を産生することができる。例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４；米国特許第５５６５３３２号明細書；同第５５７３９０５号明細書；同第５５６７６１０号明細書；同第５２２９２７５号明細書を参照されたい。組み合わせライブラリーが、ヒト起源の可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーを含む場合、組み合わせライブラリーからの選択により、ヒト抗体が得られる。
加えて、広範囲の抗体が、ＤＮＡ及び／又はアミノ酸配列を含む化学文献及び特許文献で、又は民間供給業者から入手可能である。抗体は、典型的には、所定の抗原に対するものである。抗体の例としては、除去されるべき標的細胞、例えば、増殖細胞又は病理の原因となる細胞によって発現される抗原を認識する抗体が挙げられる。例としては、腫瘍抗原、微生物（例えば、細菌）抗原、又はウイルス抗原を認識する抗体が挙げられる。
ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載される（「ＣＤＲ配列」のセクションを参照されたい）抗ＮＫｐ４６抗体に由来し得る。可変領域は、直接使用することもできるし、又はＮＫｐ４６抗体の超可変又はＣＤＲ領域を選択して、これらを適切なＶＬ又はＶＨフレームワーク、例えば、ヒトフレームワークに入れることによって改変することもできる。ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインはまた、抗体を産生する方法を用いて新たに得ることもできる。抗体は、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合性について試験することができる。本明細書の任意の実施形態の一態様では、ＮＫｐ４６に結合するポリペプチド（例えば、多重特異的ポリペプチド、二重特異的又は単一特異的抗体）は、細胞の表面で発現されるＮＫｐ４６、例えば、ＮＫ細胞によって発現されるナイーブＮＫｐ４６に結合することができる。
目的の抗原に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、所望の細胞標的に基づいて選択することができ、例えば、癌抗原、細菌抗原、又はウイルス抗原などを含み得る。本明細書で使用される「細菌抗原」という語は、限定されるものではないが、無傷細菌、弱毒細菌、若しくは死菌、あらゆる構造的若しくは機能的細菌タンパク質若しくは炭水化物、又は抗原性であるべき十分な長さ（典型的には、約８アミノ酸以上）の細菌タンパク質の任意のペプチド部分を含む。例としては、グラム陽性細菌抗原及びグラム陰性細菌抗原が挙げられる。一部の実施形態では、細菌抗原は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、特にヘリコバクターピロリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ）；ボレリア（Ｂｏｒｅｌｉａ）種、特にボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種、特にレジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）；マイコバクテリア属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓ）種、特に結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、アビウム菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、イントラセルラ菌（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）；ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）；ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、特に淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、特にリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、特にＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．ファエカリス（Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓ）；Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ）；嫌気性連鎖球菌（ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種；病原性カンピロバクター（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種；ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、特にヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚｕｅ）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特に炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）種、特にブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、特にウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、特にエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、特にクレブシエラ１Ｓニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ １Ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パストレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）種、特にパストレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）種、特にパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種；フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）；ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特にストレプトバチルス・モリホルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）；トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、特にトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）；レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）；病原性エシェリキア種（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）；及びアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、特にアクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉ）からなる群から選択される細菌に由来する。
本明細書で使用される「ウイルス抗原」という語は、限定されるものではないが、無傷全ウイルス、弱毒全ウイルス、若しくは死滅全ウイルス、任意の構造的若しくは機能的ウイルスタンパク質、又は抗原性であるべき十分な長さ（典型的には、約８アミノ酸以上）のウイルスタンパク質の任意のペプチド部分を含む。ウイルス抗原の供給源としては、限定されるものではないが、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、又はＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる；及び他の分離株、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス；ヒトコクサッキーウイルス；ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、及びロタウイルス）；ボルナビリダエ科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス（殆どのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（バリオラウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；及びイリダウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；及び未分類ウイルス（例えば、デルタ肝炎の作用物質（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライト（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）と考えられる）、Ｃ型肝炎；ノーウォーク及び関連ウイルス、及びアストロウイルス）の科からのウイルスが挙げられる。別法では、ウイルス抗原は、組換えにより作製することができる。
本明細書で使用される「癌抗原」及び「腫瘍抗原」という語は、同義的に使用され、癌細胞によって差次的に発現される抗原を指し、従って、癌細胞を標的にするために利用することができる。癌抗原は、明らかに腫瘍特異的免疫応答を潜在的に刺激し得る抗原である。これらの抗原の一部は、正常細胞によってコードされるが、必ずしも発現されるものではない。これらの抗原は、正常細胞では通常サイレントである（即ち、発現されない）抗原、分化の特定の段階のみで発現される抗原、及び胚抗原及び胎児抗原のように一時的に発現される抗原として特徴付けることができる。他の癌抗原は、変異細胞遺伝子、例えば、癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば、突然変異ｐ５３）、内部欠失又は染色体転座から生じる融合タンパク質によってコードされる。さらに他の癌抗原は、ウイルス遺伝子、例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルスに保持されたウイルス遺伝子によってコードすることができる。
癌抗原は、通常、過剰発現される又は異常な回数で発現される正常細胞の表面抗原である。理想的には、標的抗原は、増殖細胞（例えば、腫瘍細胞）のみで発現されるが、これは、実際には稀にのみ観察される。結果として、標的抗原は、通常、増殖組織と健康組織との間の差次的な発現に基づいて選択される。受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４７、糖タンパク質ＮＭＢ、ＣａｎＡｇ、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ）、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２）、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ３）、ＣＤ７９、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＰＳＣＡ、Ｌ１−ＣＡＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＢＣＭＡ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ７０、Ｅ−セレクチン、ＥｐｈＢ２、メラノトランスフェリン、Ｍｕｄ６、及びＴＭＥＦＦ２を含む特定の腫瘍関連抗原を標的とする抗体が産生された。癌抗原の例としては、網羅するものではないが、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＰＤ−Ｌ１、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、主要組織適合複合体クラスＩ関連鎖Ａ及びＢポリペプチド（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、キラーＩｇ様受容体３ＤＬ２（ＫＩＲ３ＤＬ２）、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、受容体タンパク質チロシンキナーゼ３（ＴＹＲＯ−３）、ネクチン（例えば、ネクチン−４）、主要組織適合複合体クラスＩ関連鎖Ａ及びＢポリペプチド（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリーのタンパク質、レチノイン酸初期ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−１（ＲＡＴＥ１）ファミリーのタンパク質、癌胎児抗原（ＣＥＡ）及びその免疫原性エピトープＣＡＰ−１及びＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３ζ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体、δ様リガンド４（ＤＬＬ４）、ＤＲ５、ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１又はＮＴＲＫＲ１（ＥＣ２．７．１０．１）としても知られている）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＭＵＣファミリー、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、アンジオポイエチン−２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ヒトＥＧＦ様受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、又は少なくとも１つのＨＥＲサブユニットからなるヘテロ二量体受容体、ガストリン放出ペプチド受容体抗原、Ｍｕｃ−１、ＣＡ１２５、αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリン、αＩＩｂβ３インテグリン、ＰＤＧＦβ受容体、ＳＶＥ−カドヘリン、ＩＬ−８、ｈＣＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１５、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン及びγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸線種様ポリープタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ウイルス産物、例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質、ｉｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１及びＣＴ−７、及びｃ−ｅｒｂＢ−２が挙げられる。一態様では、目的の抗原はＣＤ１９ポリペプチドであり、一態様では、多重特異的タンパク質はｓｃＦｖを含み、このｓｃＦｖは、本明細書の実施例の抗ＣＤ１９ｓｃＦｖの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤ１９に結合する、又は本明細書に示される抗ＣＤ１９重鎖及び軽鎖可変領域の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ−１、２、及び３を含む。
一実施形態では、ＡＢＤは、癌抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、又は感染（例えば、ウイルス感染）細胞上若しくは炎症性免疫細胞上に存在する抗原に結合する。一実施形態では、前記抗原は、腫瘍細胞、及び感染細胞又は炎症性細胞で選択的に発現される又は過剰発現されるポリペプチドである。一実施形態では、前記抗原は、阻害されると、腫瘍細胞、感染細胞、又は炎症性細胞の増殖及び／又は生存率を低下させるポリペプチドである。例えば、第１及び／又は第２の抗体又は断片は、それぞれ抗Ｈｅｒ−１及び抗Ｈｅｒ−２に結合することができる。抗Ｈｅｒ−２は、例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（トラスツズマブ）又は２Ｃ４（ペルツズマブ）に由来するＣＤＲを含む抗体であり得る。抗Ｈｅｒ２及び抗Ｈｅｒ−１（抗体Ｄ１−５及びＣ３−１０１）アミノ酸配列は、国際公開第２０１１／０６９１０４号パンフレットに示されている。
ポリペプチドに含められるＡＢＤは、多重特異的ＮＫｐ４６結合タンパク質に含められる前に任意の所望の活性について試験することができ、例えば、ＡＢＤは、目的の抗原への結合性について試験することができる。
抗体に由来するＡＢＤは、一般に、結合活性を付与するのに十分な超可変領域を少なくとも含む。ＡＢＤは、限定されるものではないが、リンカー要素（例えば、リンカーペプチド、ＣＨ１、Ｃκ又はＣλドメイン、ヒンジ、又はそれらの断片）を含む他のアミノ酸又は機能的ドメインを、場合により必要に応じて含み得ることを理解されたい。一例では、ＡＢＤは、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン、又は単一ドメイン抗体（ナノボディ又はｄＡｂ）、例えば、Ｖ−ＮＡＲドメイン又はＶＨＨドメインを含む。例示的な抗体形態は、本明細書にさらに説明され、ＡＢＤは、所望の形態に基づいて選択することができる。
任意の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体から得ることができ、このヒト化抗体では、ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、元の抗体（親又はドナー抗体、例えば、マウス又はラット抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されているが、所望の特異性、親和性、及び元の抗体の能力を維持している。非ヒト生物を起源とする核酸によって一部又は全てがコードされた親抗体のＣＤＲを、ヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに全て又は一部を移植して、その特異性が移植されるＣＤＲによって決まる抗体を作製する。このような抗体の作製は、例えば、国際公開第９２／１１０１８号パンフレット、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５，Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６に記載されている。従って、抗原結合ドメインは、非ヒト超可変領域又はＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域の配列（任意選択により逆突然変異を含む）を有し得る。
所望の特異性及び／又は活性を有する適切な抗原結合ドメインが特定されると、ＡＢＤのそれぞれをコードするＤＮＡを、適切な宿主へのトランスフェクションのために、任意の要素、例えば、酵素認識タグ又はＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン並びにその他の任意選択の要素をコードするＤＮＡ（例えば、ヒンジ領域をコードするＤＮＡ）と共に、適切な配置で適切な発現ベクターに別個に配置することができる。ＡＢＤは、互いに機能的に連結された所望のドメインを有するＦｃポリペプチドを作製するために、いずれのタイプのポリペプチドが作製されるべきかに応じて、１つの発現ベクター又は別個のベクターに配置することができる。次いで、宿主を、多重特異的ポリペプチドの組換え産生に使用することができる。
例えば、ポリペプチド融合産物をベクターから作製することができ、このベクターでは２つのＡＢＤのうちの第１のＡＢＤが、ＣＨ２ドメインのＮ末端に（例えば、重鎖又は軽鎖ＣＨ１、ＣＫ、又はＣλ定常領域及び／又はヒンジ領域を介して直接）機能的に連結され、ＣＨ２ドメインが、そのＣ末端からＮ末端でＣＨ３ドメインに機能的に連結されている。２つのＡＢＤのうちの第２のＡＢＤは、いずれかの末端でポリペプチドに連結することができる、又は第１のＡＢＤを含むポリペプチドと二量体、例えば、ヘテロ二量体を形成する第２のポリペプチド鎖上とすることができる。このポリペプチドは、完全長Ｆｃドメインを含み得る。
次いで、多重特異的ポリペプチドを、適切な宿主細胞で、又は任意の適切な合成プロセスによって産生することができる。多重特異的ポリペプチドの発現用に選択された宿主細胞は、限定されるものではないが、免疫グロブリンＣＨ２ドメインのタンパク質を装飾するオリゴ糖部分の組成の変化を含め、最終組成物にとって重要な寄与因子である。従って、本発明の一態様は、多重特異的ポリペプチドが、少なくとも部分的なＦｃＲＮ結合を維持するが、例えば、野生型完全長ヒトＩｇＧ１抗体と比較してＦｃγ受容体に対する結合性が低下するように、所望の治療用タンパク質を発現する産生細胞の使用及び／又は開発のための適切な宿主細胞の選択を含む。宿主細胞は、哺乳動物起源であってもよく、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はそれらの任意の誘導体、不死化若しくは形質転換細胞から選択してもよい。別法では、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化できない種又は生物、例えば、原核細胞又は生物、例えば、天然又はエンジニアリングされた大腸菌属（Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｐｐ．）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、又はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）から選択することができる。
単量体タンパク質
単量体多特異タンパク質は、様々な形式によって産生することができる。一例では、多特異タンパク質は、単一ポリペプチド鎖に、ＮＫｐ４６に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びＮＫｐ４６以外の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、抗体は、任意選択により別のポリペプチド又はアミノ酸配列に融合された、直列型ｓｃＦｖである。一実施形態では、単一ポリペプチド鎖は、Ｆｃドメイン（例えば、完全長Ｆｃドメイン又はその一部）をさらに含み、任意選択により、Ｆｃドメインは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に配置される。
（ａ）ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメイン、（ｂ）ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する抗原結合ドメイン、及び（ｃ）ヒトＦｃドメインの少なくとも一部を含む、有利な特性を有する単量体二重特異的Ｆｃ由来ポリペプチドを産生することができ、このＦｃドメインは、（ｉ）別のＦｃ由来ポリペプチドと二量体化せず、（ｉｉ）ヒトＦｃＲｎに結合することができ、且つ（ｉｉｉ）野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、ヒトＦｃγ受容体に対して低い結合性を有する（又は結合性が欠如している）。任意選択により、Ｆｃドメインは、第１のＡＢＤと第２のＡＢＤとの間に配置される。
任意の実施形態の一態様では、第１の抗原結合ドメイン及び／又は第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、任意選択により、このｓｃＦｖは、ヒトフレームワークアミノ酸配列を含む。一実施形態では、（ａ）ＮＫｐ４６に結合する第１のｓｃＦｖ、（ｂ）ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する第２のｓｃＦｖ、及び（ｃ）ヒトＦｃドメインの少なくとも一部を含む単量体二重特異的Ｆｃ由来ポリペプチドが提供され、このＦｃドメインは、（ｉ）別のＦｃ由来ポリペプチドと二量体化せず、（ｉｉ）ヒトＦｃＲｎに結合することができ、且つ（ｉｉｉ）野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、ヒトＦｃγ受容体に対して低い結合性を有する。任意選択により、Ｆｃドメインは、第１のｓｃＦｖと第２のｓｃＦｖとの間に配置される。
２つのＡＢＤ及びＦｃドメインの少なくとも一部を含むポリペプチド融合産物が単量体である場合、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するために配置することができ、且つ／又はアミノ酸改変を含むことができる。一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、鎖間ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するために二量体の界面に変異を含む。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、鎖間ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するための直列型ＣＨ３ドメインである（又はＦｃドメインが直列型ＣＨ３ドメインを含む）。このような単量体は、（例えば、野生型完全長ヒトＩｇＧ１抗体と比較して）部分的なＦｃＲｎ結合性を維持するが、低いヒトＦｃγ受容体結合性を有する。任意選択により、単量体ポリペプチドは、中程度の親和性でヒトＦｃＲｎに結合することができ、例えば、ＦｃＲｎに対する結合性を維持するが、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃＲｎ受容体に対して低い結合性を有する。Ｆｃ部分は、例えば、ＣＨ２ドメインに、１つ以上のＦｃγ受容体に対する結合性をさらに低下させるか、又は実質的に消失させる１つ以上のアミノ酸改変をさらに含み得る。
任意選択により、任意の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインと、このＦｃドメインが別のＦｃ由来ポリペプチドと二量体化しない（例えば、相互作用により別のＣＨ３ドメインと二量体化しない）ように１つ以上のアミノ酸改変を含むＣＨ３ドメインとを含む。
ポリペプチドの一部の実施形態では、ＮＫｐ４６に結合するＡＢＤは、ＮＫｐ４６以外の抗原に結合するＡＢＤに機能的に連結され（例えば、２つのＡＢＤはリンカーを介して融合され）、２つのＡＢＤのうちの一方が、ＣＨ２ドメインに融合され、このＣＨ２ドメインは、ＣＨ３ドメイン（又はＣＨ２ドメインに融合されるＣＨ３）に融合される（例えば、そのＣ末端で融合される）。一部の実施形態では、第１のＡＢＤは、両方のＡＢＤを含む直列型抗原結合ドメインが形成されるようにペプチドリンカーによって第２のＡＢＤに機能的に連結される。
このようなポリペプチドの例としては、以下のいずれか１つのドメイン配置：
（ＡＢＤ１）−（ＡＢＤ２）−ＣＨ２−ＣＨ３
（ＡＢＤ２）−（ＡＢＤ１）−ＣＨ２−ＣＨ３
ＣＨ２−ＣＨ３−（ＡＢＤ１）−（ＡＢＤ２）
ＣＨ２−ＣＨ３−（ＡＢＤ２）−（ＡＢＤ１）
を含むことができ、ＡＢＤ１及びＡＢＤ２の一方が目的の抗原に結合し、且つ他方がＮＫｐ４６に結合し、任意選択により、ＣＨ１ドメイン又はその断片及び／又はヒンジドメインが、ＡＢＤ１とＣＨ２との間、又はＡＢＤ２とＣＨ２との間に配置される。任意選択により、各ＡＢＤは、ＶＬ及びＶＨドメインを含む。任意選択により、これらの任意のポリペプチドが直列型ＣＨ３ドメインを含み、第２のＣＨ３ドメインが第１のＣＨ３ドメインのＣ末端に可撓性リンカーを介して融合される。
任意選択により、ＡＢＤは、直列型ｓｃＦｖを含むポリペプチドが産生されるようにそれぞれのｓｃＦｖである。第１及び第２のＡＢＤは、ＡＢＤが結合しようとするそれぞれの抗原への結合を可能にするようにＡＢＤを折り畳むことができる十分な長さのリンカーによって互いに連結することができる。ＡＢＤ１のＡＢＤ２への連結に使用される、又はＡＢＤのＣＨ２若しくはＣＨ３への連結に使用される適切なペプチドリンカーが当技術分野で公知であり、例えば、参照によりその開示内容が本明細書に組み入れられる国際公開第２００７／０７３４９９号パンフレットを参照されたい。リンカー配列の例としては、（Ｇ４Ｓ）ｘが挙げられ、ｘは、整数（例えば、１、２、３、又は４以上）である。従って、直列型抗原結合ドメインは、例えば、構造（ＡＢＤ１−ペプチドリンカー−ＡＢＤ２−ペプチドリンカー−（単量体ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド））を有し得る。例えば、このポリペプチドは、融合産物として、構造（ｓｃＦｖ１−ペプチドリンカー−ｓｃＦｖ２−ペプチドリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３）を含み得、各要素は、以下の要素に融合されている。
本明細書で提示される任意のドメイン配置では、ＡＢＤ１又はＡＢＤ２の一方がＮＫｐ４６に結合し、且つ他方が目的の抗原に結合するのであれば、ＮＫｐ４６に結合するＡＢＤをＡＢＤ１又はＡＢＤ２のいずれかで表すことができ、目的の抗原に結合するＡＢＤをＡＢＤ１又はＡＢＤ２のいずれかで表すことができる。
第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ１）及び第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ２）を有するポリペプチドの一部の実施形態では、２つのＡＢＤの一方は、任意選択により介在アミノ酸を介して、（例えば、完全又は部分的なＣＨ２ドメイン及び完全又は部分的なＣＨ３ドメインを含む）Ｆｃドメインの一端に融合され、２つのＡＢＤの他方が、任意選択により介在アミノ酸を介して、Ｆｃドメインの他端に融合される。一部の実施形態では、ＡＢＤは、（例えば、完全若しくは部分的なヒンジ領域及び／又は完全若しくは部分的なＣＨ１ドメインを含む）リンカーを介してＣＨ２ドメインに連結される。このようなポリペプチドは、特に、直列型ｓｃＦｖとして構築されると機能的ではないが単一ｓｃＦｖ形態では機能的である抗体のＶＬ及びＶＨドメインを容易に使用できるという利点を有する。このポリペプチドは、以下のいずれか１つのドメイン配置：
（ＡＢＤ１）−ＣＨ２−ＣＨ３−（ＡＢＤ２）
（ＡＢＤ２）−ＣＨ２−ＣＨ３−（ＡＢＤ１）
を含むことができ、ＡＢＤ１及びＡＢＤ１の一方が目的の抗原に結合し、且つ他方がＮＫｐ４６に結合し、任意選択により、ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジドメインが、ＡＢＤ１とＣＨ２との間、又はＡＢＤ２とＣＨ２との間に配置される。任意選択により、各ＡＢＤは、ＶＬ及びＶＨドメインを含む。任意選択により、これらの任意のポリペプチドが、可撓性リンカーを介して第１のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合された第２のＣＨ３ドメインを有する。このようなポリペプチドの例は、図６Ａの形態１、３、及び４として示されている。
ヒトＦｃドメインの少なくとも一部を有する単量体Ｆｃ由来ポリペプチドは、ＦｃγＩＩＩＡポリペプチド（ＣＤ１６）及びＣＨ３ドメインに実質的に結合しないＣＨ２ドメインを有利に含むことができ、前記ＣＨ３ドメインは、別のＦｃ由来ポリペプチドとの二量体化を防止するための改変ＣＨ３二量体界面（例えば、ＣＨ３二量体界面の変異）を含む。
本明細書の任意のポリペプチド又は方法の一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｌ３５１位、Ｔ３６６位、Ｌ３６８位、Ｐ３９５位、Ｆ４０５位、Ｔ４０７位（又はＹ４０７位）、及び／又はＫ４０９位（Ｋａｂａｔと同様のＥＵ付番）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つでアミノ酸置換を含む。
単量体多重特異的タンパク質に使用することができるＣＨ３ドメインの別の構成は、直列型ＣＨ３ドメインである（例えば、図６Ａの形態３及び４を参照されたい）。直列型ＣＨ３ドメインは、第１及び第２のＣＨ３ドメインを含み、２つのＣＨ３ドメインは、非共有相互作用を介して互いに結合している。一実施形態では、２つのＣＨ３ドメインは、各ＣＨ３ドメインのＣＨ３二量体化界面を介して互いに結合している。一実施形態では、ポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインを含む別のポリペプチド鎖と二量体化しない。直列型ＣＨ３ドメインを含むＦｃドメインは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と相互作用するが、ヒトＦｃγ受容体、特にＣＤ１６に対して低い結合性を有する又は結合しない。
本明細書の任意の態様の一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、リンカーによって第２のＣＨ３ドメインに接続されている。従って、直列型ＣＨ３ドメインは、以下のようにＮ末端からＣ末端にドメイン配置：
−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−
を有するように同じポリペプチド鎖上に配置することができる。
リンカーは、可撓性リンカー（例えば、ペプチドリンカー）であり得る。一実施形態では、リンカーにより、ＣＨ３ドメインが、非共有相互作用によって互いに結合することができる。一実施形態では、リンカーは、１０〜５０のアミノ酸残基を有するペプチドリンカーである。任意選択により、リンカーは、式（Ｇ４Ｓ）ｘを有する。一実施形態では、ｘは、２、３、４、５、又は６である。任意の実施形態では、各ＣＨ３ドメインは独立に、完全長及び／又はナイーブＣＨ３ドメイン、又は機能的なＣＨ３二量体化界面を維持する断片若しくは改変ＣＨ３ドメインである。
従って、本発明の単量体タンパク質のドメイン配置の例は、以下のいずれか１つを含む：
（ＡＢＤ１）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（ＡＢＤ２）
（ＡＢＤ２）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（ＡＢＤ１）
（ＡＢＤ１）−（ＡＢＤ２）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３
（ＡＢＤ２）−（ＡＢＤ１）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３
ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（ＡＢＤ１）−（ＡＢＤ２）
ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（ＡＢＤ２）−（ＡＢＤ１）。
多量体タンパク質
多量体二重特異的タンパク質、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及び四量体（この四量体は、例えば、２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する抗体を含む）は、様々な形態に従って産生することができる。
ＮＫｐ４６抗体の１つの有利な形態では、多量体ポリペプチドは、ヒトＦｃＲｎに結合することができ、例えば、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体（例えば、Ｄ１６、ＣＤ３２、及び／又はＣＤ６４）に対して低い結合性を有する。２つのＡＢＤを含むポリペプチドが多量体である場合、少なくとも部分的なＦｃＲｎ結合性及び低い又は消失したヒトＦｃγ受容体結合性を有するＦｃ部分は、本明細書にさらに記載されるように、適切なＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを使用して得ることができる。一実施形態では、ＩｇＧ４ベースのＦｃドメインが、実質的なＦｃＲｎ結合性を維持するが低いＦｃγ受容体結合性を有するため、Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ定常領域に由来する。一実施形態では、Ｆｃ部分は、宿主細胞でのポリペプチドの産生によって、又はＮ２９７連結グリコシル化を生じさせないプロセス、例えば、細菌細胞によって得ることができる。一実施形態では、Ｆｃ部分は、例えば、ＣＨ２ドメインに、１つ以上のＦｃγ受容体への結合性を低下させ、少なくとも部分的なＦｃＲＮ結合性を維持する１つ以上のアミノ酸改変を含む。
一実施形態では、例示的なヘテロ二量体分子は、ドメイン配置：
Figure 0006822849
 を有することができ、Ｖ１及びＶ２は、単一可変ドメイン（例えば、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｄＡｂ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、又はＶＨＨドメイン）であり、Ｖ１及びＶ２の一方はＮＫｐ４６に結合し、且つ他方は目的の抗原に結合する。任意選択により、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するための直列型ＣＨ３ドメイン又は改変されたＣＨ３ドメインである。
一実施形態では、例示的なヘテロ二量体分子は、ドメイン配置：
Figure 0006822849
 を有することができ、Ｖ１及びＶ２は、単一可変ドメイン（例えば、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｄＡｂ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、又はＶＨＨドメイン）であり、Ｖ１及びＶ２の一方はＮＫｐ４６に結合し、且つ他方は目的の抗原に結合する。
一実施形態では、例示的なヘテロ二量体分子は、ドメイン配置：
Figure 0006822849
 を有することができ、Ｖ１ａ、Ｖ１ｂ、Ｖ２ａ、及びＶ２ｂは、それぞれＶＨドメイン又はＶＬドメインであり、Ｖ１ａ及びＶ１ｂの一方はＶＨであり、且つ他方はＶＬであり、従って、Ｖ１ａとＶ１ｂとが第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、Ｖ２ａ及びＶ２ｂの一方はＶＨであり、且つ他方はＶＬであり、従って、Ｖ２ａとＶ２ｂとが第２のＡＢＤを形成し、ＡＢＤの一方はＮＫｐ４６に結合し、且つ他方は目的の抗原に結合する。任意選択により、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するための直列型ＣＨ３ドメイン又は改変されたＣＨ３ドメインである。Ｖドメインの各対は、（例えば、ｓｃＦｖを形成するために）リンカーペプチドによって分離することができる。
一実施形態では、例示的なヘテロ二量体分子は、ドメイン配置：
Figure 0006822849
 を有することができ、Ｖａ−１、Ｖｂ−１、Ｖａ−２、及びＶｂ−２は、それぞれＶＨドメイン又はＶＬドメインであり、Ｖａ−１及びＶｂ−１の一方はＶＨであり、且つ他方はＶＬであり、従って、Ｖａ−１とＶｂ−１とが第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方はＶＨであり、且つ他方はＶＬであり、従って、Ｖａ−２とＶｂ−２とが第２の抗原結合ドメインを形成し、ＡＢＤの一方はＮＫｐ４６に結合し、且つ他方は目的の抗原に結合する。前述の一変異型では、Ｖａ−１、Ｖｂ−１、Ｖａ−２、及びＶｂ−２のいずれか又はそれぞれは、（２つの可変ドメインから形成された）ｓｃＦｖである。Ｖドメインの各対は、（例えば、ｓｃＦｖを形成するために）リンカーペプチドによって分離することができる。
同様のアプローチでは、三量体を作製することができる。例示的なヘテロ三量体分子は、ドメイン配置：
Figure 0006822849
 を有することができ、第１／中心鎖と第２鎖とは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化によって結合し、第１／中心鎖と第３鎖とは、ＣＨ１又はＣＫ二量体化によって結合し、第１／中心鎖及び第３鎖のドメインは、第１鎖と第３鎖とがＣＨ１−ＣＫ二量体化によって結合できるように相補的となるように選択され、Ｖａ−１、Ｖｂ−１、Ｖａ−２、及びＶｂ−２は、それぞれＶＨドメイン又はＶＬドメインであり、Ｖａ−１及びＶｂ−１の一方はＶＨであり、且つ他方はＶＬであり、従って、Ｖａ−１とＶｂ−１とが第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方はＶＨであり、且つ他方はＶＬであり、従って、Ｖａ−２とＶｂ−２とが第２の抗原結合ドメイン（例えば、Ｖａ−２及びＶｂ−２がリンカーによって分離されているｓｃＦｖ）を形成し、ＡＢＤの一方はＮＫｐ４６に結合し、且つ他方は目的の抗原に結合する。任意選択により、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換を含み、抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン界面は、Ｆｃ二量体界面にわたって変更された電荷極性が生じるように変異され、従って、静電気的に一致したＦｃ鎖の同時発現が有利な引力相互作用を支援し、それにより、所望のＦｃヘテロ二量体の形成が促進され、不利な反発電荷相互作用が不所望のＦｃホモ二量体の形成を抑制する。
他の態様では、１つ又は２つの鎖がそれぞれＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化によって中心鎖に結合した、間置Ｆｃドメインによって分離された２つのＡＢＤを有するヘテロ二量体又はヘテロ三量体ポリペプチドを作製することができる。このような多量体は、異なる抗体特異性の別個の抗原結合ドメインの一部である２つの免疫グロブリン可変ドメインを含む中心（第１）のポリペプチド鎖から構成することができ、Ｆｃドメインが、ポリペプチド鎖上の２つの免疫グロブリン可変ドメイン間に配置され、ＣＨ１又はＣＫ定常ドメインが、可変ドメインに隣接したポリペプチド鎖上に配置される。
第１（中心）のポリペプチド鎖は、第２のポリペプチド鎖上の相補的な可変ドメインと共に、目的の１つの（例えば、第１の）抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する１つの可変ドメインを提供する。第１（中心）のポリペプチド鎖はまた、相補的な可変ドメインと対を形成して目的の別の（例えば、第２の）抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する（間置Ｆｃドメインの反対側の端部に位置する）第２の可変ドメインを提供し、第２の可変ドメインに相補的な可変ドメインは、（例えば、直列型可変ドメイン構築物、例えば、ｓｃＦｖの第２の可変ドメインに隣接した）中心ポリペプチド上に配置することができる、又は別個のポリペプチド鎖、特に第３のポリペプチド鎖上に配置することができる。第２（及び第３（存在する場合））のポリペプチド鎖は、ＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化によって中心ポリペプチド鎖に結合し、それぞれのヒンジドメイン間及び相補的なＣＨ１ドメインとＣＫドメインとの間に鎖間ジスルフィド結合を形成し、ＣＨ／ＣＫ及びＶＨ／ＶＫドメインが、優先的に所望のＶＨ−ＶＬ対形成をもたらす好ましい二量体化構造を生じさせるように選択される限り、一次多量体ポリペプチドが形成される。残りの不所望の対形成は、産生中に最小限に維持することができ、精製ステップ中に除去することができる。三量体では、又はポリペプチドが三量体の調製のために作製される場合、一般に、天然に存在しないＶＨ−ＣＫ又はＶＫ−ＣＨ１ドメイン配置を含む１つのポリペプチド鎖が必要であろう。
このようなヘテロ二量体タンパク質に使用される中心ポリペプチド鎖のドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端）の例としては、
Ｖａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖａ−２−Ｖｂ−２、及び
Ｖａ−２−Ｖｂ−２−Ｆｃドメイン−Ｖａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ
が挙げられ、Ｖａ−１は、軽鎖又は重鎖可変ドメインであり、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。
さらなる例としては、
Ｖａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖｂ、及び
Ｖｂ−Ｆｃドメイン−Ｖａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ
が挙げられ、Ｖｂは、単一可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶｈＨ）である。
中心鎖のＦｃドメインは、所望の機能（例えば、ＦｃＲｎ結合性）を付与するのに十分な完全なＦｃドメイン（ＣＨ２−ＣＨ３）又はその一部であり得る。次いで、第２のポリペプチド鎖が作製され、この第２のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン可変ドメイン、及びＣＨ１−ＣＫの中心ポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を可能にするように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域、例えば、（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ単位を含み、この免疫グロブリン可変ドメインは、ＣＨ１又はＣＫドメインに隣接した中心鎖の可変ドメインを補完し、それにより、相補的な可変ドメインが、目的の第１の抗原の抗原結合ドメインを形成するように選択される。
例えば、第２のポリペプチド鎖は、ドメイン配置：
Ｖｂ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ、又は
Ｖｂ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ−Ｆｃドメイン
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣＫ）２が中心鎖の（ＣＨ１又はＣＫ）１と二量体化し、Ｖｂ−１が中心鎖のＶａ−１と共に抗原結合ドメインを形成する。中心鎖のＶａ−１が軽鎖可変ドメインである場合、Ｖｂ−１は重鎖可変ドメインであり、中心鎖のＶａ−１が重鎖可変ドメインである場合、Ｖｂ−１は軽鎖可変ドメインである。
次いで、目的の第２の抗原の抗原結合ドメインを、目的の第２の抗原の抗原結合ドメインを形成する中心鎖の直列型可変ドメイン（例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖（κ）可変ドメイン（ＶＫ）であり、例えば、ｓｃＦｖ単位を形成する）として構成されたＶａ−２及びＶｂ−２から形成することができる。目的の第２の抗原の抗原結合ドメインは、別法では、中心鎖に存在する単一可変ドメインＶｂから形成することもできる。
得られるヘテロ二量体は、例えば、以下の構成を有することができる（図６Ａ及び図６Ｃに形態２、１１、及び１２として示されているようなタンパク質の例も参照されたい）。
Figure 0006822849
 ここで、第１のポリペプチド鎖のＶａ−１及び第２のポリペプチド鎖のＶｂ−１の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインであり、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。
得られるヘテロ二量体は、別の例では、以下の構成を有することができる（図６Ｂに形態１０として示されているこのようなタンパク質の例も参照されたい）。
Figure 0006822849
 ここで、第１のポリペプチド鎖のＶａ−１及び第２のポリペプチド鎖のＶｂ−１の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインであり、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。
得られるヘテロ二量体は、別の例では、以下の構成を有することができる（図６Ｄ及び図６Ｅに形態１３及び１４として示されているようなタンパク質の例も参照されたい）。
Figure 0006822849
 ここで、第１のポリペプチド鎖のＶａ−１及び第２のポリペプチド鎖のＶｂ−１の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインであり、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。
一実施形態では、ヘテロ二量体二重特異的Ｆｃ由来ポリペプチドは、以下の１つのドメイン配置を含み、任意選択により、一方又は両方のヒンジドメインがペプチドリンカーによって置き換えられ、任意選択により、Ｆｃドメインがペプチドリンカーを介して抗ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖに融合される。
Figure 0006822849
形成されるヘテロ二量体ポリペプチドのドメイン配置の例としては、限定されるものではないが、以下の表のドメイン配置が挙げられる。
Figure 0006822849
ヘテロ三量体タンパク質は、例えば、第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）、及び第１の可変ドメインと第２の可変ドメインとの間に配置されたＦｃドメイン又はその一部（即ち、Ｆｃドメインは、第１及び第２のＶ−（ＣＨ１／ＣＫ）単位間に配置されている）を含む中心（第１）のポリペプチド鎖を使用することによって形成することができる。例えば、ヘテロ三量体タンパク質に使用される中心のポリペプチド鎖は、（Ｎ末端からＣ末端に）以下のドメイン配置を有することができる：
Ｖａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖａ−２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ。
次いで、第２のポリペプチド鎖は、（Ｎ末端からＣ末端に）ドメイン配置：
Ｖｂ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｃ、又は
Ｖｂ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｃ−Ｆｃドメイン
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣＫ）ｃが中心鎖の（ＣＨ１又はＣＫ）１と二量体化し、Ｖａ−１とＶｂ−１とが抗原結合ドメインを形成する。
次いで、第３のポリペプチド鎖は、（Ｎ末端からＣ末端に）ドメイン配置：
Ｖｂ−２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｄ
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣＫ）ｄが中心鎖の（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ単位と二量体化し、Ｖａ−２とＶｂ−２とが抗原結合ドメインを形成する。
二量体Ｆｃドメイン（図６Ｄ及び図６Ｅにも形態５、６、７、及び１６として示されている）を有する、得られるヘテロ三量体の構成の一例は、ドメイン配置：
Figure 0006822849
 を有する。
単量体Ｆｃドメイン（図６Ｂ及び図６Ｃにも形態８、９、及び１７として示されている）を有する、得られるヘテロ三量体の構成の一例は、ドメイン配置：
Figure 0006822849
 を有する。
従って、三量体ポリペプチドの構成では、第１のポリペプチドは、別個のポリペプチド鎖の可変ドメイン（即ち、第２鎖及び第３鎖の可変ドメイン）を有する抗原結合ドメインをそれぞれ形成する２つの可変ドメインを有することができ、第２のポリペプチド鎖は、１つの可変ドメインを有し、第３のポリペプチドは、１つの可変ドメインを有する。
三量体ポリペプチドは、
（ａ）第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）、及び第１の可変ドメインと第２の可変ドメインとの間に配置されたＦｃドメイン又はその一部を含む、第１のポリペプチド鎖、
（ｂ）第１及び第２のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された可変ドメイン、及び任意選択によりＦｃドメインを含む、第２のポリペプチド鎖、及び
（ｃ）ＣＨ１又はＣＫ定常領域に（例えば、そのＣ末端で）融合された可変ドメインを含む、第３のポリペプチド鎖であって、この可変ドメイン及び定常領域が、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメイン及び第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第１及び第３のポリペプチドが、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣＫ定常領域と第１のポリペプチドの第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域との間ではなく、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣＫ定常領域と第１のポリペプチドの第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域との間に形成されたジスルフィド結合によって結合されたＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成する、第３のポリペプチド鎖
を含み、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドと第３のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ三量体を形成し、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、目的の第１の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成し、且つ第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインと第３のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、目的の第２の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する。
形成される三量体二重特異的ポリペプチドのドメイン配置の例としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる。
Figure 0006822849
任意のドメイン配置では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２−ＣＨ３単位（完全長ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン又はその断片）を含み得る。Ｆｃドメイン（二量体Ｆｃドメイン）を有する２つの鎖を含むヘテロ二量体又はヘテロ三量体では、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が可能である（例えば、野生型ＣＨ３ドメイン）。Ｆｃドメイン（単量体Ｆｃドメイン）を有する１つの鎖のみを含むヘテロ二量体又はヘテロ三量体では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が不可能であり、例えば、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３二量体界面にアミノ酸改変を有する、又はＦｃドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が不可能な直列型ＣＨ３ドメインを含む。本明細書の任意の態様の一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、リンカーによって第２のＣＨ３ドメインに接続されている。直列型ＣＨ３ドメインは、以下のように、Ｎ末端からＣ末端にドメイン配置を有することができる：
−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−。
直列型ＣＨ３ドメインのリンカーは、可撓性リンカー（例えば、ペプチドリンカー）であり得る。一実施形態では、リンカーは、非共有相互作用によるＣＨ３ドメインの互いの結合を可能にする。一実施形態では、リンカーは、１０〜５０のアミノ酸残基を有するペプチドリンカーである。一実施形態では、リンカーは、式（Ｇ４Ｓ）ｘを有する。任意選択により、ｘは、２、３、４、５、又は６である。任意の実施形態では、各ＣＨ３ドメインは、独立に、完全長及び／若しくはナイーブＣＨ３ドメイン、又は機能的なＣＨ３二量体化界面を維持する断片又は改変ＣＨ３ドメインである。
一部の例示的な構成では、多特異タンパク質は、四量体、例えば、２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する四量体であり得る。一部の実施形態では、「Ｆａｂ−ｅｘｃｈａｎｇｅ」アプローチが使用され、このアプローチでは、異なる抗体の重鎖及び付着した軽鎖が２つのＩｇＧ４抗体間又は２つのＩｇＧ４様抗体間で交換される。例えば、参照によりその開示内容が本明細書に組み入れられる国際公開第２００８／１１９３５３号パンフレット及び同第２０１１／１３１７４６号パンフレットを参照されたい。一部の実施形態では、「ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」アプローチが使用され、このアプローチでは、抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン界面が、抗体がヘテロ二量体（付着した軽鎖をさらに含む）を優先的に形成するように変異される。これらの変異は、Ｆｃ二量体界面にわたる電荷極性の変化を生じさせ、従って、静電気的に一致したＦｃ鎖の同時発現が有利な引力相互作用を支援し、それにより、所望のＦｃヘテロ二量体の形成が促進され、不利な反発電荷相互作用が不所望のＦｃホモ二量体の形成を抑制する。例えば、参照によりその開示内容が本明細書に組み入れられる国際公開第２００９／０８９００４号パンフレットを参照されたい。このようなヘテロ多量体抗体が、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域を有する場合、抗体は、実質的なＦｃＲｎ結合性を維持するが、低いＦｃγ受容体結合性を有する。一実施形態では、抗体は、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）におけるＮ連結グリコシル化を欠いている。
一部の実施形態では、ＡＢＤの一方がＣＨ１ドメインに連結され（例えば、ＣＨ１ドメインに連結された可変領域を含み）、ＡＢＤの他方が相補的なＣκ（又はＣλ）定常ドメインに連結され（例えば、Ｃκ（又はＣλ）定常ドメインに連結された可変領域を含み）、ＣＨ１及びＣκ（又はＣλ）定常ドメインが結合してヘテロ二量体分子を形成する。例えば、第１及び第２のＡＢＤは、有利には、異なる抗原結合特異性（例えば、ＶｈＨ１及びＶｈＨ２）を有する単一可変ドメイン（例えば、ＶｈＨドメイン）であり得る。ＶｈＨ１は、ＣＨ１ドメインに融合することができ、ＶｈＨ２は、Ｃκ又はＣλドメインに融合することができる。Ｖ１−Ｃκ（又はＣλ）鎖は、Ｆａｂが形成されるようにＶ２−ＣＨ１鎖と結合する。Ｆｃドメインを含まないこのような抗体の例については、例えば、参照によりその開示内容が本明細書に組み入れられる国際公開第２００６／０６４１３６号パンフレット及び同第２０１２／０８９８１４号パンフレットを参照されたい。次いで、ＣＨ１及び／又はＣκドメインを、任意選択によりヒンジ領域（又は、例えば同様の機能的特性を有する、リンカーペプチド）を介して、ＣＨ２ドメインに連結することができる。次いで、ＣＨ２ドメインがＣＨ３ドメインに連結される。従って、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、任意選択により完全長Ｆｃドメインとして実施することができる。
一部の実施形態では、このタンパク質は、異なる親抗体からの２つの軽鎖及び重鎖の対を含む四量体抗体であり、抗体がヘテロ二量体を優先的に形成するように改変ＣＨ３ドメイン界面を含み、任意選択によりさらに、Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン又はその一部であり、任意選択により１つ以上のアミノ酸改変を含む。
一実施形態では、四量体タンパク質は、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化及び／又はヒンジ二量体化により二量体を形成する２つのＦｃ含有鎖（例えば、第１鎖及び第２鎖）、並びに２つのＦｃ含有鎖の一方と二量体化するＶ−ＣＨ／ＣＫ単位をそれぞれ含む２つのさらなる鎖（例えば、第３鎖及び第４鎖）をベースとする。例えば、このような例示的な四量体分子は、ドメイン配置：
Figure 0006822849
 を有することができ、Ｖａ−１、Ｖｂ−１、Ｖａ−２、及びＶｂ−２は、それぞれＶＨドメイン又はＶＬドメインであり、Ｖａ−１とＶｂ−１とが第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成するように、Ｖａ−１及びＶｂ−１の一方はＶＨであり、且つ他方はＶＬであり、Ｖａ−２とＶｂ−２とが第２の抗原結合ドメインを形成するように、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方はＶＨであり、且つ他方はＶＬである。ＣＨ１及びＣＫは、第３鎖が第１鎖と、第４鎖が第２鎖と結合できるように選択される。
例えば、このような例示的な四量体分子は、ドメイン配置：
Figure 0006822849
 を有することができ、Ｖａ−１、Ｖｂ−１、Ｖａ−２、及びＶｂ−２は、それぞれＶＨドメイン又はＶＬドメインであり、Ｖａ−１とＶｂ−１とが第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成するように、Ｖａ−１及びＶｂ−１の一方はＶＨであり、且つ他方はＶＬであり、Ｖａ−２とＶｂ−２とが第２の抗原結合ドメインを形成するように、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方はＶＨであり、且つ他方はＶＬである。ＣＨ１及びＣＫは、第３鎖が第１鎖と、第４鎖が第２鎖と結合できるように選択される。
本開示の任意のタンパク質では、ヒンジ領域は、典型的には、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のポリペプチド鎖に存在し、且つ／又はＣＫドメインとＣＨ２ドメインとの間に存在し得る。ヒンジ領域は、任意選択により、例えば、適切なリンカーペプチドによって置き換えることができる。
本開示で記載されるタンパク質ドメインは、任意選択により、Ｎ末端からＣ末端であると指定することができる。例示のための開示のタンパク質の配置は、Ｎ末端（左側）からＣ末端へと示されている。ドメインは、互いに融合されていると言える（例えば、ドメインは、その左側のドメインのＣ末端に融合されていると言え、且つ／又はドメインは、その右側のドメインのＮ末端に融合されていると言える）。
本開示に記載されるタンパク質ドメインは、直接又は介在アミノ酸配列を介して互いに融合することができる。例えば、ＣＨ１又はＣＫドメインは、リンカーペプチド、任意選択によりヒンジ領域又はその断片を介してＦｃドメイン（又はそのＣＨ２若しくはＣＨ３ドメイン）に融合される。別の例では、ＶＨ又はＶＫドメインは、リンカーペプチドを介してＣＨ３ドメインに融合される。直列型に互いに連結されたＶＨ及びＶＬドメインは、（例えば、ｓｃＦｖのように）リンカーペプチドを介して融合される。Ｆｃドメインに連結されたＶＨ及びＶＬドメインは、リンカーペプチドを介して融合される。２つのポリペプチド鎖は、好ましくは相補的なＣＨ１及びＣＫドメイン内のシステイン残基間に形成される鎖間ジスルフィド結合によって、互いに結合される（「｜」によって示される）。
可変ドメインのリンカー
一実施形態では、ＡＢＤ（例えば、ｓｃＦｖ、ＶＨ又はＶＬドメイン）のＣＨ２又はＣＨ３への連結に使用されるペプチドリンカーは、ＣＨ１ドメインの断片を含む。例えば、ＣＨ１のＮ末端アミノ酸配列は、抗体の天然の構造を可能な限り模倣するために、ＡＢＤ（例えば、ｓｃＦｖ、ＶＨ又はＶＬドメインなど）に融合することができる。一実施形態では、リンカーは、２〜４の残基、２〜４の残基、２〜６の残基、２〜８の残基、２〜１０の残基、２〜１２の残基、２〜１４の残基、２〜１６の残基、２〜１８の残基、２〜２０の残基、２〜２２の残基、２〜２４の残基、２〜２６の残基、２〜２８の残基、又は２〜３０の残基のＮ末端ＣＨ１アミノ酸配列を含み得る。一実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＲＴＶＡを含む、又はアミノ酸配列ＲＴＶＡからなる。
ＡＢＤがｓｃＦｖである場合、ｓｃＦｖを形成するＶＨドメイン及びＶＬドメイン（ＶＬ又はＶＨドメイン、又は結合特異性を維持したその断片）は、ＡＢＤが結合する予定の抗原への結合を可能にするようにＡＢＤを折り畳むことができる十分な長さのリンカーによって互いに連結される。リンカーの例としては、例えば、グリシン及びセリン残基、例えば、アミノ酸配列ＧＥＧＴＳＴＧＳ（Ｇ２Ｓ）２ＧＧＡＤを含むリンカーが挙げられる。別の特定の実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）３によって互いに連結される。
任意のペプチドリンカーは、少なくとも５残基、少なくとも１０残基、少なくとも１５残基、少なくとも２０基、少なくとも２５残基、少なくとも３０残基以上の長さを含み得る。他の実施形態では、リンカーは、２〜４の残基、２〜４の残基、２〜６の残基、２〜８の残基、２〜１０の残基、２〜１２の残基、２〜１４の残基、２〜１６の残基、２〜１８の残基、２〜２０の残基、２〜２２の残基、２〜２４の残基、２〜２６の残基、２〜２８の残基、又は２〜３０の残基の長さを含む。
一実施形態では、ヒンジ領域は、ヒンジ領域の断片（例えば、システイン残基を含まない切断ヒンジ領域）であるか、又はシステイン残基、任意選択によりヒンジ領域中の両方のシステイン残基を（例えば、別のアミノ酸による置換、又は欠失により）除去するために１つ以上のアミノ酸改変を含み得る。システインの除去は、単量体ポリペプチドのジスルフィド架橋の形成を防止するのに有用であり得る。
定常領域
定常領域ドメインは、任意の適切な抗体から得ることができる。特に興味深いのは、定常重（ＣＨ）ドメイン及びヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体との関連では、ＩｇＧアイソタイプは、それぞれ３つのＣＨ領域を有する。従って、ＩｇＧとの関連での「ＣＨ」ドメインは、次の通りである：「ＣＨ１」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスによると１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスによると２３７〜３４０位を指す。「ＣＨ３」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスによると３４１〜４４７位を指す。「ヒンジ」、「ヒンジ領域」、又は「抗体ヒンジ領域」とは、抗体における第１及び第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可撓性ポリペプチドのことである。構造的に、ＩｇＧ Ｃｈ１ドメインは、ＥＵ２２０位で終端し、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは、ＥＵ２３７位の残基で始まる。従って、ＩｇＧでは、ヒンジは、本明細書では、２２１位（ＩｇＧ１のＤ２２１）〜２３６位（ＩｇＧ１のＧ２３６）を含むように定義され、付番は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従った。ポリペプチド内に見られる定常領域ドメイン内のアミノ酸残基について言及する場合、特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、ＩｇＧ抗体との関連で、Ｋａｂａｔに準拠するものとする。
本抗体に役立ち得るＣＨ３ドメインは、任意の適切な抗体から得ることができる。このようなＣＨ３ドメインは、改変ＣＨ３ドメインの基準として役立ち得る。任意選択により、ＣＨ３ドメインはヒト起源である。
（例えば、単量体Ｆｃドメインを含む単量体、二量体、又は三量体二重特異的抗体の）本明細書の特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３二量体化界面を妨害するために１つ以上のアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換）を含み得る。任意選択により、ＣＨ３ドメインの改変は、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインが単量体型である場合に疎水性残基の露出によって引き起こされるタンパク質の凝集を防止する。任意選択により、ＣＨ３ドメインの改変は、Ｆｃ由来ポリペプチドの新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、例えば、ヒトＦｃＲｎに結合する能力をさらに消失させるものではない。
ホモ二量体の形成を防止するために使用することができるＣＨ３ドメインは、様々な刊行物に記載されている。例えば、参照によりそれぞれの開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００６／００７４２２５号明細書、国際公開第２００６／０３１９９４号パンフレット、同第２０１１／０６３３４８号パンフレット、及びＹｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７（２３）：１９３９９−１９４０７を参照されたい。ホモ二量体の形成を抑制するために、ＣＨ３−ＣＨ３界面を構成する１つ以上の残基が、相互作用が静電気的に不利になるように荷電アミノ酸で置換される。例えば、国際公開第２０１１／０６３３４８号パンフレットには、界面における正に荷電したアミノ酸、例えば、リジン、アルギニン、又はヒスチジンが、異なるアミノ酸（例えば、負に荷電したアミノ酸、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）で置換され、且つ／又は界面における負に荷電したアミノ酸が、異なる（例えば、正に荷電した）アミノ酸で置換されることが記載されている。一例としてヒトＩｇＧを使用すると、反対の電荷に荷電することができる界面内の荷電残基は、Ｒ３５５、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｄ３９９、Ｋ４０９、及びＫ４３９を含む。特定の実施形態では、界面内の２つ以上の荷電残基が反対の電荷に荷電される。例示的な分子としては、Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ変異を含む分子、並びにＤ３９９Ｋ及びＤ３５６Ｋ変異を含む分子が挙げられる。単量体型のポリペプチドの安定性を維持するために、ＣＨ３−ＣＨ３界面を構成する１つ以上の大きい疎水性残基が小さい極性アミノ酸で置換される。一例としてヒトＩｇＧを使用すると、ＣＨ３−ＣＨ３界面の大きい疎水生残基は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｌ３９８、Ｖ３９７、Ｆ４０５、及びＹ４０７を含む。小さい極性アミノ酸残基は、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、及びトレオニンを含む。従って、一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｒ３５５位、Ｄ３５６位、Ｅ３５７位、Ｋ３７０位、Ｋ３９２位、Ｄ３９９位、Ｋ４０９位、及びＫ４３９位の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つでアミノ酸改変（例えば、置換）を含む。国際公開第２０１１／０６３３４８号パンフレットでは、ＣＨ３ドメイン界面に密接して位置する２つの正に荷電したＬｙｓ残基がＡｓｐに変異された。次いで、トレオニンスキャニング突然変異誘発が、これらの２つのＬｙｓからＡｓｐへの変異の背景において構造的に保存された大きい疎水性残基に対して行われた。トレオニンでの様々な置換と共にＫ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ変異を含むＦｃ分子が、単量体形成について分析された。例示的な単量体Ｆｃ分子は、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ、及びＹ３４９Ｔ置換を有する単量体Ｆｃ分子、並びにＫ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ、及びＦ４０５Ｔ置換を有する単量体Ｆｃ分子を含む。
Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７（２３）：１９３９９−１９４０７では、ＣＨ３ドメイン内の残基Ｌ３５１、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｐ３９５、Ｆ４０５、Ｔ４０７、及びＫ４０９でアミノ酸が置換された。異なる変異の組み合わせにより、タンパク質の凝集が起きることなく、ＣＨ３二量体化界面の破壊が起きた。従って、一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｌ３５１位、Ｔ３６６位、Ｌ３６８位、Ｐ３９５位、Ｆ４０５位、Ｔ４０７位、及び／又はＫ４０９位の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つでのアミノ酸改変（例えば、置換）を含む。一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｔ３６６Ｙ、Ｌ３６８Ａ、Ｐ３９５Ｒ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ｍ、及びＫ４０９Ａを含む。一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｓ、Ｔ３６６Ｒ、Ｌ３６８Ｈ、Ｐ３９５Ｋ、Ｆ４０５Ｅ、Ｔ４０７Ｋ、及びＫ４０９Ａを含む。一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙを含む。
一実施形態では、ホモ二量体の形成を防止するための改変されたＣＨ３ドメインを含むＣＨ２−ＣＨ３部分は、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２と少なくとも９０％、９５％、若しくは９８％同一の配列を含み：
Figure 0006822849
 任意選択により、配列番号２の残基１２１、１３６、１６５、１７５、１７７、又は１７９の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つの置換を含む。
本明細書の特定の実施形態では、単量体Ｆｃドメインを有する単量体、二量体、又は三量体二重特異的抗体では、Ｆｃドメインは、直列型ＣＨ３ドメインを含む。直列型ＣＨ３ドメインは、リンカーを介して第２のＣＨ３ドメインに接続された第１のＣＨ３ドメインを含む。従って、直列型ＣＨ３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に以下のドメイン配置：
−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−
を有するようにポリペプチド鎖に配置することができる。
リンカーは、可撓性リンカー（例えば、ペプチドリンカー）である。一実施形態では、リンカーは、非共有相互作用によってＣＨ３ドメインの互いに対する結合を可能にする。一実施形態では、リンカーは、１０〜５０のアミノ酸残基を有するペプチドリンカーである。一実施形態では、リンカーは、式（Ｇ４Ｓ）ｘを有する。任意選択により、ｘは、２、３、４、５、又は６である。任意の実施形態では、各ＣＨ３ドメインは、独立に、完全長及び／又はナイーブＣＨ３ドメイン、又は機能的なＣＨ３二量体化界面を維持する断片若しくは改変ＣＨ３ドメインである。
可撓性ペプチドリンカー（下線が引かれている）を有する例示的な直立型ＣＨ３が以下に示されている。従って、例示的な直列型ＣＨ３ドメインは、配列番号１１２のアミノ酸配列、又は配列番号１１２と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９８％同一の配列を含み得る。
Figure 0006822849
ＣＨ２ドメインは、任意の適切な抗体から容易に得ることができる。任意選択により、ＣＨ２ドメインはヒト起源である。ＣＨ２は、ヒンジ又はリンカーアミノ酸配列に（例えば、そのＮ末端で）連結されてもよく、又は連結されなくてもよい。一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、天然に存在するＩｇＧ１、２、３、４、又は４サブクラスのヒトＣＨ２ドメインである。一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメインの断片（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、又は５０のアミノ酸）である。
一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、本明細書に記載のポリペプチドに存在する場合、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、特にヒトＦｃＲｎに対する結合性を維持する。
一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドに存在する場合のＣＨ２ドメイン、及び本明細書に記載のポリペプチドは、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）に対して結合しにくくするか、又は全く結合しないようにする。
一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド並びにそのＦｃドメイン及び／又はそのＣＨ２ドメインは、低下した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、ＦｃＲ媒介細胞活性化（例えば、ＦｃＲ架橋によるサイトカインの放出）、及び／又はＮＫｐ４６陰性免疫細胞によって媒介されるＦｃＲ媒介血小板活性化／減少を有するか、又はそれらを実質的に欠いている。
一実施形態では、ポリペプチド内のＣＨ２ドメインは、活性化Ｆｃγ受容体、例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、若しくはＣＤ６４に対する結合性、又は抑制性Ｆｃ受容体、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）に対する結合性が実質的に消失する。一実施形態では、ポリペプチドのＣＨ２ドメインはさらに、補体（Ｃ１ｑ）の第１の成分に対する結合性が実質的に消失する。
本明細書に記載の例示的な多重特異的タンパク質は、単量体Ｆｃドメインの野生型ＣＨ２ドメイン、又は二量体Ｆｃドメインタンパク質の残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ付番）でのＣＨ２変異を利用する。しかしながら、当業者であれば、他の構成も実施できることを理解されよう。例えば、２３３〜２３６位でのヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２残基の置換、並びに３２７位、３３０位、及び３３１位でのＩｇＧ４残基の置換は、Ｆｃγ受容体に対する結合性、従ってＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に低下させることを示した。さらに、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（８）：４１７８−８４は、Ｋ３２２を含む異なる位置でのアラニン置換が補体の活性化を著しく低下させることを実証した。
一実施形態では、ＦｃＲｎ受容体に対する結合性は維持するが、Ｆｃγ受容体に対する結合性の減少を有するＣＨ２ドメインは、例えば残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ）でのＮ連結グリコシル化を欠いているか、又は改変されたＮ連結グリコシル化を有する。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドのＦｃ領域に結合するＮアセチルグルコサミンへのフコシルの付加について高い酵素活性を自然に有するか、又はＮ２９７でグリコシル化が起きない細胞株（例えば、細菌宿主細胞）で発現される。別の実施形態では、ポリペプチドは、残基２９７〜２９９での正準Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ Ｎ連結グリコシル化モチーフの欠如を引き起こし、従ってＦｃγ受容体に対する結合性も低下させ得る１つ以上の置換を有し得る。従って、ＣＨ２ドメインは、Ｎ２９７及び／又は隣接残基（例えば、２９８、２９９）に置換を有し得る。
一実施形態では、Ｆｃドメイン又はそのＣＨ２ドメインは、ＦｃｙＲ結合能の低下を示すが、ＦｃＲｎ結合性を維持したＩｇＧ１、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、又はＩｇＧ２ Ｆｃ変異に由来する。一態様では、ＩｇＧ２ Ｆｃ変異若しくは誘導多重特異的ポリペプチド、Ｆｃドメイン、又はＣＨ２ドメインは、ＥＵ付番方式による変異Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓを含む。別の態様では、ＩｇＧ２ Ｆｃ変異若しくは誘導多重特異的ポリペプチド又はＦｃドメインは、ＥＵ付番方式による変異Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｈ２６８Ｑ、又はＨ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓを含む。特定の態様では、ＩｇＧ２ Ｆｃ変異若しくは誘導多重特異的ポリペプチド又はＦｃドメインは、ＥＵ付番方式による変異Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、及び任意選択によりＰ２３３Ｓを含む。任意選択により、Ｆｃγ受容体に対する結合性が消失したＣＨ２ドメインは、ＰＡＡＡＰ、ＰＡＡＡＳ、及びＳＡＡＡＳから選択されるｎ個のアミノ酸配列を含む残基２３３、２３４、２３５、２３７、及び２３８（ＥＵ付番方式）を含み得、任意選択により、このような変異を有するＦｃドメインは、変異Ｈ２６８Ａ又はＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓをさらに含み得る（参照によりその開示内容が本明細書に組み入れられる国際公開第２０１１／０６６５０１号パンフレットを参照されたい）。
一実施形態では、Ｆｃγ受容体に対する結合性を消失したＣＨ２ドメインは、任意選択によりさらに他のドメイン（例えば、ヒンジドメイン又はＣＨ３ドメイン）の１つ以上のアミノ酸改変と組み合わせて、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに少なくとも１つのアミノ酸改変を含む（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つ以上のアミノ酸改変を有する）。Ｆｃ改変の任意の組み合わせは、例えば、Ａｒｍｏｕｒ ＫＬ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３−２４；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０（４）：４８７−４９０；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６；２７７（３０）：２６７３３−２６７４０ ａｎｄ Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４）に開示されている異なる改変の任意の組み合わせで行うことができる。一実施形態では、ヒトＦｃγ受容体に対する低い結合性を有する本発明のポリペプチドは、アミノ酸残基２３７〜３４０（ＥＵ付番）内の野生型ＣＨ２ドメインに対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つ以上のアミノ酸改変を有し）、このようなＣＨ２ドメインを含むポリペプチドは、野生型ＣＨ２ドメインを含む同等のポリペプチドと比較して、目的のヒトＦｃγ受容体に対して低い親和性を有し、任意選択により、変異型ＣＨ２ドメインは、２３３位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２６８位、２９７位、２３８位、２９９位、３０９位、３２７位、３３０位、３３１位（ＥＵ付番）のいずれか１つ以上に置換を含む。
ＣＤＲ配列及びエピトープ
一実施形態では、本明細書のタンパク質及び抗体は、配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドのＮＫｐ４６のＤ１ドメイン、ＮＫｐ４６のＤ２ドメイン、又は（Ｄ１とＤ２ドメインの境界、Ｄ１／Ｄ２接合部において）Ｄ１及びＤ２ドメインの両方に跨る領域に結合する。一実施形態では、タンパク質又は抗体は、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、又は１０−１０Ｍ未満のＫＤによって特徴付けられるヒトＮＫｐ４６に対する親和性を有する。
別の実施形態では、この抗体は、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−と実質的に同じＮＫｐ４６上のエピトープでＮＫｐ４６に結合する。別の実施形態では、この抗体は、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６によって結合されたセグメントの少なくとも１つの残基と少なくとも部分的に重複するか、又はこの少なくとも１つの残基を含む。一実施形態では、エピトープの全ての重要な残基は、ドメインＤ１又はＤ２に対応するセグメント内にある。一実施形態では、この抗体は、Ｄ１ドメイン内に存在する残基及びＤ２ドメイン内に存在する残基に結合する。一実施形態では、抗体は、配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドのドメインＤ１又はＤ２に対応するセグメント内の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つ以上の残基を含むエピトープに結合する。一実施形態では、抗体は、ドメインＤ１に結合し、且つ残基Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４、及び／又はＬ１０５の１つ、２つ、３つ、又は４つを含むエピトープに結合する。
一実施形態では、抗体は、ドメインＤ１／Ｄ２接合部に結合し、且つ残基Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１、及び／又はＹ１９４の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含むエピトープに結合する。
一実施形態では、抗体は、ドメインＤ２に結合し、且つ残基Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５、及び／又はＳ１３６の１つ、２つ、３つ、又は４つを含むエピトープに結合する。
本明細書の実施例のセクションに、一連の変異ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドの構築が記載される。ＮＫｐ４６変異体でトランスフェクトされた細胞への抗ＮＫｐ４６抗体の結合を測定し、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（配列番号１）に結合する抗ＮＫｐ４６抗体の能力と比較した。本明細書で使用される抗ＮＫｐ４６抗体と変異ＮＫｐ４６ポリペプチドとの間の結合の低下は、抗ＮＫｐ４６抗体の結合親和性の低下（例えば、公知の方法、例えば、特定の変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験によって、又は変異ポリペプチドへの結合性のＢｉａｃｏｒｅ試験によって測定される）、及び／又は抗ＮＫｐ４６抗体の総結合能の低下（例えば、抗ＮＫｐ４６抗体濃度のポリペプチド濃度に対するプロットにおけるＢｍａｘの減少によって裏付けられる）が存在することを意味する。結合性の著しい低下は、変異残基が抗ＮＫｐ４６抗体に対する結合性に直接関与しているか、又は抗ＮＫｐ４６抗体がＮＫｐ４６に結合するときに結合タンパク質に非常に近接していることを示唆する。従って、抗体エピトープは、好ましくはこのような残基を含み、且つこのような残基に隣接した追加の残基を含み得る。
一部の実施形態では、結合性の著しい低下は、抗ＮＫｐ４６抗体と変異ＮＫｐ４６ポリペプチドとの間の結合親和性及び／又は結合能が、この抗体と野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、配列番号１に示されているポリペプチド）との間の結合性に対して、４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、又は９５％超低下していることを意味する。特定の実施形態では、結合性は、検出限界未満に低下する。一部の実施形態では、結合性の著しい低下は、抗ＮＫｐ４６抗体の変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合性が、抗ＮＫｐ４６抗体と野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、配列番号１に示されているポリペプチド（又はその細胞外ドメイン））との間で観察される結合性の５０％未満（例えば、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、又は１０％未満）であるときに立証される。このような結合性の測定は、当技術分野で公知の様々な結合アッセイを用いて行うことができる。１つのこのようなアッセイの特定の例が、実施例のセクションに記載される。
一部の実施形態では、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、配列番号１）の残基が置換されている変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する著しい結合性の低下を示す抗ＮＫｐ４６抗体が提供される。本明細書で使用される略語では、その形式は、配列番号１に示されている残基の番号が付された野生型残基：ポリペプチドの位置：変異残基である。
一部の実施形態では、抗ＮＫｐ４６抗体は、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して、（配列番号１における）残基Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４、及び／又はＬ１０５のいずれか１つ以上に変異（例えば、アラニン置換）を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して低い結合性を有する。
一部の実施形態では、抗ＮＫｐ４６抗体は、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して、（配列番号１における）残基Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１、及び／又はＹ１９４のいずれか１つ以上に変異（例えば、アラニン置換）を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して低い結合性を有する。
一部の実施形態では、抗ＮＫｐ４６抗体は、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して、（配列番号１における）残基Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５、及び／又はＳ１３６のいずれか１つ以上に変異（例えば、アラニン置換）を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して低い結合性を有する。
抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、及びＮＫｐ４６−９の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ本明細書の表Ｂに列記され（配列番号：３、５、７、９、１１、及び１３）、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、及びＮＫｐ４６−９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列もそれぞれ本明細書の表Ｂに列記されている（配列番号：４、６、８、１０、１２、及び１４）。
特定の一実施形態では、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９と本質的に同じエピトープ又は決定基に結合する、二重特異的単量体ポリペプチドを含む抗体、例えば、完全長単一特異的抗体、多重特異的又は二重特異的抗体が提供され、任意選択により、この抗体は、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の超可変領域を含む。本明細書の任意の実施形態では、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９は、そのアミノ酸配列及び／又はそれをコードする核酸配列によって特徴付けることができる。一実施形態では、この抗体は、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、若しくはＮＫｐ４６−９のＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の重鎖可変領域を含む抗体も提供される。一実施形態によると、抗体は、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、若しくはＮＫｐ４６−９の軽鎖可変領域のＣＤＲの１つ、２つ、又は３つをさらに含むポリペプチドも提供される。任意選択により、前記軽鎖又は重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上は、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を含み得る。任意選択により、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、若しくはＮＫｐ４６−９の抗原結合領域の一部若しくは全てを含む軽鎖及び／又は重鎖可変領域のいずれかがヒトＩｇＧ型の免疫グロブリン定常領域に融合されたポリペプチドが提供される。
別の態様では、本発明は、タンパク質、例えば、抗体、完全長単一特異的抗体、多重特異的若しくは二重特異的タンパク質、又はポリペプチド鎖若しくはその断片、並びにこれらのいずれかをコードする核酸を提供し、このタンパク質は、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の重鎖ＣＤＲを含み、それぞれの抗体が、表Ａに示されているアミノ酸配列、又は少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０の連続したそのアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ１領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上を異なるアミノ酸によって置換することができる、ＨＣＤＲ１領域；表Ａに示されているアミノ酸配列、又は少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０の連続したそのアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ２領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上を異なるアミノ酸によって置換することができる、ＨＣＤＲ２領域；表Ａに示されているアミノ酸配列、又は少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０の連続したそのアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ３領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上を異なるアミノ酸によって置換することができる、ＨＣＤＲ３領域を含む。
別の態様では、本発明は、タンパク質、例えば、抗体、完全長単一特異的抗体、多重特異的若しくは二重特異的タンパク質、又はポリペプチド鎖若しくはその断片、並びにこれらのいずれかをコードする核酸を提供し、このタンパク質は、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の軽鎖ＣＤＲを含み、それぞれの抗体が、表Ａに示されているアミノ酸配列、又は少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０の連続したそのアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ１領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上を異なるアミノ酸によって置換することができる、ＬＣＤＲ１領域；表Ａに示されているアミノ酸配列、又は少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０の連続したそのアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ２領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上を異なるアミノ酸によって置換することができる、ＬＣＤＲ２領域；表Ａに示されているアミノ酸配列、又は少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０の連続したそのアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ３領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上を異なるアミノ酸によって欠失させる又は置換することができる、ＬＣＤＲ３領域を含む。
別の態様では、本発明は、ヒトＮＫｐ４６に結合するタンパク質を提供し、このタンパク質は、
（ａ）任意選択により１つ、２つ、又は３つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ｂに示されているＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の重鎖可変領域、
（ｂ）任意選択により１つ、２つ、又は３つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ｂに示されているＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の軽鎖可変領域、
（ｃ）任意選択により１つ以上のこれらのアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ｂに示されているＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の重鎖可変領域、及び任意選択により１つ、２つ、又は３つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ｂに示されているＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９のそれぞれの軽鎖可変領域、
（ｄ）任意選択によりＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ａに示されているＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２）アミノ酸配列、
（ｅ）任意選択によりＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ａに示されているＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列、又は
（ｆ）任意選択によりＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ａに示されているＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列、並びに任意選択によりＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ａに示されているそれぞれのＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９抗体の軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列
を含む。
一実施形態では、上述のＣＤＲは、例えば、表１に示されているようにＫａｂａｔに従っている。一実施形態では、上述のＣＤＲは、例えば、表Ａに示されているようにＣｈｏｔｉａ付番に従っている。一実施形態では、上述のＣＤＲは、例えば、表Ａに示されているようにＩＭＧＴ付番に従っている。
本明細書の任意の実施形態の別の態様では、重鎖及び軽鎖の任意のＣＤＲ１、２、及び３は、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０の連続したそのアミノ酸配列によって、並びに／又は対応する配列番号若しくは表Ａに列記されている特定のＣＤＲ若しくは一連のＣＤＲと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有することによって特徴付けることができる。
別の態様では、本発明は、ＮＫｐ４６の結合について、上述の（ａ）〜（ｆ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、上述の（ａ）〜（ｆ）のヒトＮＫｐ４６に結合する抗体、又はこの抗体とＮＫｐ４６の結合について競合する、単量体Ｆｃドメインに（任意選択により、介在アミノ酸配列によって）融合され、任意選択により第２の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｄＡｂ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、若しくはＶＨＨドメイン）にさらに（任意選択により、介在アミノ酸配列によって）融合された抗体を含む二重特異的抗体を提供する。任意選択により、第２の抗原結合ドメインは、癌抗原、ウイルス抗原、又は細菌抗原に結合する。
ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、及びＣｈｏｔｈｉａ定義方式に従ったＣＤＲの配列が以下の表Ａに要約されている。本発明による抗体の可変鎖の配列は、以下の表Ｂに列記されている。本明細書の任意の実施形態では、ＶＬ又はＶＨ配列は、シグナルペプチド若しくはその任意の部分を含む又は含まないように指定又は付番することができる。
Figure 0006822849
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Figure 0006822849
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また、本明細書の実施例に示されるように、単量体二重特異的ポリペプチドのアミノ酸配列を含むタンパク質が提供され、このタンパク質は、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、及びＮＫｐ４６−９の配列番号３〜１４として列記されているそれぞれに重鎖及び軽鎖可変領域の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３を含むｓｃＦｖ、単量体Ｆｃドメイン、並びに抗ＣＤ１９抗体、例えば、本明細書の実施例のセクションに示される抗ＣＤ１９の重鎖及び軽鎖可変領域の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３を含むｓｃＦｖを含む。
多重特異的タンパク質が作製されると、このタンパク質を、生物学的活性、例えば、アゴニスト活性について評価することができる。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、多重特異的タンパク質は、ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、精製ＮＫ細胞）及び目的の抗原を発現する標的細胞の存在下でインキュベートされた場合、ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞、レポーター細胞）の活性化を誘導することができる。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、多重特異的タンパク質は、標的細胞の非存在下で、ＮＫｐ４６発現細胞（任意選択によりさらにＦｃγ受容体発現細胞の存在下で、例えば、精製ＮＫ細胞又は精製レポーター細胞）と共にインキュベートされた場合、ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞、レポーター細胞）の実質的な活性化を誘導することができる。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、多重特異的タンパク質は、ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、精製ＮＫ細胞）及び目的の抗原を発現する標的細胞の存在下でインキュベートされた場合、ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞、レポーター細胞）にＮＫｐ４６シグナル伝達を誘導することができる。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、多重特異的タンパク質は、標的細胞の非存在下で、ＮＫｐ４６発現細胞（任意選択によりさらにＦｃγ受容体発現細胞の存在下で、例えば、精製ＮＫ細胞又は精製レポーター細胞）と共にインキュベートされた場合、ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞、レポーター細胞）にＮＫｐ４６シグナル伝達を引き起こす（又はＮＫｐ４６シグナル伝達を増加させる）ことができない。
任意選択により、ＮＫ細胞の活性化又はシグナル伝達は、活性化の細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ１０７、ＣＤ６９などの発現の増加によって特徴付けられる。
活性は、例えば、多重特異的ポリペプチドの存在下で、標的細胞とＮＫｐ４６発現細胞とを互いに接触させることによって測定することができる。一例では、標的細胞とＮＫ細胞との凝集が測定される。別の例では、多重特異的タンパク質は、例えば、ＮＫ細胞の活性に関連した当技術分野で公知の任意の特性又は活性、例えば、細胞毒性のマーカー（ＣＤ１０７）又はサイトカインの産生（例えば、ＩＦＮ−γ若しくはＴＮＦ−α）の測定可能な増加をもたらす能力、細胞内遊離カルシウムレベルの増加、リダイレクト殺傷アッセイ（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）において標的細胞を溶解する能力などについて評価することができる。
標的細胞（目的の抗原を発現する標的細胞）及びＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞の存在下で、多重特異的タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＮＫ細胞の活性に関連した特性又は活性（例えば、ＮＫ細胞の細胞毒性の活性化、ＣＤ１０７の発現、ＩＦＮγの産生）の増加を引き起こすことができる。例えば、本開示の多重特異的タンパク質は、多重特異的タンパク質に接触されない同じＮＫ細胞と標的細胞を用いて同じエフェクター：標的細胞比で達成されるＮＫ細胞の活性と比較して、約２０％超、好ましくは少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又はそれを超えるＮＫ細胞の活性を増加させることができるように選択することができ、このＮＫ細胞の活性は、ＮＫ細胞の活性のアッセイ、例えば、ＮＫ細胞傷害性の活性化マーカー、ＣＤ１０７又はＣＤ６９の発現、ＩＦＮγの産生、従来のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性のクロム放出試験によって測定される。活性化及び細胞毒性アッセイのプロトコルの例は、本明細書の実施例のセクション、及び例えばＰｅｓｓｉｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１９９８，１８８（５）：９５３−９６０；Ｓｉｖｏｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９．２９：１６５６−１６６６；Ｂｒａｎｄｏ ｅｔ ａｌ，（２００５）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７８：３５９−３７１；Ｅｌ−Ｓｈｅｒｂｉｎｙ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７（１８）：８４４４−９；ａｎｄ Ｎｏｌｔｅ−’ｔ Ｈｏｅｎ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｂｌｏｏｄ １０９：６７０−６７３）に記載されている。
活性はまた、使用できるレポーターアッセイを用いて評価することもでき、このアッセイでは、ＮＫｐ４６リガンド発現標的細胞がＮＫｐ４６発現レポーター細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞）に接触され、抗体がＮＫｐ４６シグナル伝達を誘導する能力が評価される。例えば、ＮＫｐ４６発現レポーター細胞は、ＤＯ．１１．１０ Ｔ細胞ハイブリドーマ、又はマウスＣＤ３ζの細胞質内ドメインがＮＫｐ４６の細胞外部分に融合された（例えば、ＤＯＭＳＰ４６ ｃｅｌｌｓ ａｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｓｃｈｌｅｉｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．５８：３２１６−３２２３を参照されたい）キメラＮＫｐ４６タンパク質をコードするレトロウイルス粒子で形質導入された同様の細胞であり得る。キメラタンパク質の細胞表面での結合は、ＩＬ−２の分泌を引き起こす。インキュベーション後、細胞上清を、標準的な標的細胞生存アッセイでマウスＩＬ−２の存在についてアッセイすることができる。多重特異的タンパク質の非存在下ではレポーター細胞にＮＫｐ４６シグナル伝達を誘導しない標的細胞を選択することができる。次いで、多重特異的タンパク質を、標的細胞の存在下でＮＫｐ４６発現レポーター細胞に接触させることができ、ＮＫｐ４６シグナル伝達を評価することができる。ＤＯＭＳＰ４６又はＤＯ．１１．１０（９６ウェルプレートで２０，０００細胞／ウェル）を、９６ウェルプレートで標的細胞及び多重特異的タンパク質と共にインキュベートすることができる。２０時間後、細胞上清を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて標準的なＣＴＬＬ−２生存アッセイでマウスＩＬ−２の存在についてアッセイする。
一実施形態では、本発明は、単量体ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の任意の単量体タンパク質）を産生する方法を提供し、この方法は、
ａ）本明細書に記載の単量体二重特異的ポリペプチド（例えば、（ａ）ＮＫｐ４６に結合する第１の抗原結合ドメイン、（ｂ）標的細胞で発現されるポリペプチドに結合する第２の抗原結合ドメイン、及び（ｃ）ヒトＦｃドメインの少なくとも一部を含むポリペプチド、ここで、多重特異的ポリペプチドは、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができ、且つ完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体に対する低い結合性を有する）をコードする核酸を用意するステップ、及び
ｂ）それぞれ前記核酸を宿主細胞で発現させて前記ポリペプチドを産生し、且つ単量体タンパク質を回収するステップ
を含む。任意選択により、ステップ（ｂ）は、産生されたタンパク質を、親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体又はカラムにローディングし、且つ単量体タンパク質を収集するステップを含む。
一実施形態では、本発明は、ヘテロ二量体タンパク質（例えば、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体タンパク質）を産生する方法を提供し、この方法は、
ａ）本明細書に記載の第１のポリペプチド鎖（例えば、ＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、第２の可変ドメイン（及び任意選択により第３の可変ドメイン、ここで、第２及び第３の可変ドメインは第１の抗原結合ドメインを形成する）、及び第１の可変ドメインと第２の可変ドメインとの間に配置されたＦｃドメイン又はその一部を含むポリペプチド鎖）をコードする第１の核酸を用意するステップ、
ｂ）本明細書に記載の第２のポリペプチド鎖（例えば、第１及び第２のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）を含み、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチドの第１の可変ドメインとが第２の抗原結合ドメインを形成する、ポリペプチド鎖）をコードする第２の核酸を用意するステップであって、第１又は第２の抗原結合ドメインの一方がＮＫｐ４６に結合し、且つ他方が目的の抗原に結合する、ステップ、及び
ｃ）それぞれ前記第１及び第２の核酸を宿主細胞で発現させて、前記第１及び第２のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、且つヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
を含む。任意選択により、産生されたヘテロ二量体タンパク質は、精製前の総タンパク質（例えば、二重特異的タンパク質）の少なくとも２０％、２５％、又は３０％を占める。任意選択により、ステップ（ｃ）は、産生されたタンパク質を、親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体又はカラムにローディングし、且つヘテロ二量体タンパク質を収集するステップ、及び／又は産生されたタンパク質（又は親和性交換若しくはプロテインＡカラムにローディングした後に収集されたタンパク質）をイオン交換カラムにローディングし、且つヘテロ二量体画分を収集するステップを含む。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインは、（任意選択により第３の可変ドメインと共に）ＮＫｐ４６に結合する。
本開示のタンパク質は、ＢＩＴＥ、ＤＡＲＴ、及び他の二重特異的形態と異なり、標準的な細胞株及び高収量の標準化方法で産生することができるため、多重特異的タンパク質に組み込まれるべき最も有効な可変領域についてのスクリーニング用の従来のツールも提供する。一態様では、本開示は、ヘテロ二量体タンパク質に使用される候補可変領域を特定又は評価する方法を提供し、この方法は、
ａ）複数の核酸対を用意するステップであって、各対が、（例えば、同じ又は異なる目的の抗原に結合する異なる抗体から得られる）複数の重鎖及び軽鎖可変領域対のそれぞれについて、重鎖候補可変領域をコードする１つの核酸及び軽鎖候補可変領域をコードする１つの核酸を含む、ステップ、
ｂ）複数の核酸対のそれぞれについて、ヘテロ二量体タンパク質を、
（ｉ）ＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン（Ｖ）の一方、第２の可変ドメイン（及び任意選択により第３の可変ドメイン、ここで、第２及び第３の可変ドメインは第１の抗原結合ドメインを形成する）、及び候補と第２の可変ドメインとの間に配置されたＦｃドメイン又はその一部を含む、第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を作製するステップ、
（ｉｉ）第１及び第２のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン（Ｖ）の他方を含む、第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を作製するステップであって、重鎖と軽鎖候補可変ドメインとが第２の抗原結合ドメインを形成する、ステップ、及び
（ｉｉｉ）それぞれ第１及び第２のポリペプチド鎖をコードする前記核酸を宿主細胞で発現させて、前記第１及び第２のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、且つヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
によって作製するステップ、及び
ｃ）産生された複数のヘテロ二量体タンパク質を、目的の生物学的活性、例えば、本明細書に開示される活性について評価するステップ
を含む。この方法では、第１又は第２の抗原結合ドメインの一方がＮＫｐ４６に結合し、且つ他方が目的の抗原に結合する。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインは、（任意選択により第３の可変ドメインと共に）ＮＫｐ４６に結合する。任意選択により、産生されたヘテロ二量体タンパク質は、精製前の総タンパク質の少なくとも２０％、２５％、又は３０％を占める。任意選択により、（ｉｉｉ）の回収するステップは、産生されたタンパク質を、親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体又はカラムにローディングし、且つヘテロ二量体タンパク質を収集するステップ、及び／又は産生されたタンパク質（又は親和性交換若しくはプロテインＡカラムにローディングした後に収集されたタンパク質）をイオン交換カラムにローディングし、且つヘテロ二量体画分を収集するステップを含む。一実施形態では、第１の抗原結合ドメインはＮＫｐ４６に結合し、第２の抗原結合ドメインは目的の抗原に結合し、任意選択により、第１の抗原結合ドメインは抗ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖである。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインは、（任意選択により第３の可変ドメインと共に）ＮＫｐ４６に結合する。
一実施形態では、本発明は、ヘテロ三量体タンパク質（例えば、本明細書に記載の任意のヘテロ三量体タンパク質）を産生する方法を提供し、この方法は、
（ａ）本明細書に記載の第１のポリペプチド鎖（例えば、第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン、及び第１の（Ｖ−ＣＨ１／ＣＫ）単位と第２の（Ｖ−ＣＨ１／ＣＫ）単位との間に配置されたＦｃドメイン若しくはその一部を含むポリペプチド鎖）をコードする第１の核酸を用意するステップ、
（ｂ）本明細書に記載の第２のポリペプチド鎖（例えば、第１及び第２のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチドの可変ドメインとが抗原結合ドメインを形成する、ＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された可変ドメイン（Ｖ）を含みポリペプチド鎖）をコードする第２の核酸を用意するステップ、
（ｃ）本明細書に記載の第３のポリペプチド鎖（例えば、そのＣ末端でＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された可変ドメインを含むポリペプチド鎖であって、このＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１及び第３のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメイン及び第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、第１のポリペプチドの第２の可変ドメインと第３のポリペプチドの可変ドメインとが抗原結合ドメインを形成する、ポリペプチド鎖）を含む、第３の核酸を用意するステップ、及び
（ｄ）それぞれ前記第１、第２、及び第３の核酸を宿主細胞で発現させて、前記第１、第２、及び第３のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、且つヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ
を含む。任意選択により、産生されたヘテロ三量体タンパク質は、精製前の総タンパク質の少なくとも２０％、２５％、又は３０％を占める。任意選択により、ステップ（ｄ）は、産生されたタンパク質を、親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体又はカラムにローディングし、且つヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ、及び／又は産生されたタンパク質（例えば、親和性交換又はプロテインＡカラムにローディングした後に収集されたタンパク質）をイオン交換カラムにローディングし、且つヘテロ三量体画分を収集するステップを含む。この方法では、抗原結合ドメインの一方はＮＫｐ４６に結合し、且つ他方は目的の抗原に結合する。一実施形態では、第２又は第３のポリペプチドは、（例えば、ヒンジドメイン又はリンカーを介して）ＣＨ１又はＣＫドメインのＣ末端に融合されたＦｃドメイン若しくはその断片をさらに含む。一実施形態では、第１のポリペプチドの第２の可変ドメインと第３のポリペプチドの可変ドメインとは、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインを形成する。
一態様では、本開示は、ヘテロ三量体タンパク質に使用される候補可変領域を特定又は評価する方法を提供し、この方法は、
ａ）複数の核酸対を用意するステップであって、各対が、（例えば、同じ又は異なる目的の抗原に結合する異なる抗体から得られる）複数の重鎖及び軽鎖可変領域対のそれぞれについて、重鎖候補可変領域をコードする１つの核酸及び軽鎖候補可変領域をコードする１つの核酸を含む、ステップ、
ｂ）複数の核酸対のそれぞれについて、ヘテロ三量体タンパク質を、
（ｉ）第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン（Ｖ）の一方、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン、及び第１の（Ｖ−ＣＨ１／ＣＫ）単位と第２の（Ｖ−ＣＨ１／ＣＫ）単位との間に配置されたＦｃドメイン若しくはその一部を含む、第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を作製するステップ、
（ｉｉ）第１及び第２のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン（Ｖ）の他方を含む、第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を作製するステップであって、重鎖及び軽鎖候補可変ドメインが抗原結合ドメインを形成する、ステップ、
（ｉｉ）そのＣ末端でＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された可変ドメインを含む、第３のポリペプチド鎖をコードする第３の核酸を作製するステップであって、このＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１及び第３のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメイン及び第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、第１のポリペプチドの第２の可変ドメインと第３のポリペプチドの可変ドメインとが抗原結合ドメインを形成する、ステップ、及び
（ｉｉｉ）それぞれ第１及び第２のポリペプチド鎖をコードする前記核酸を宿主細胞で発現させて、前記第１及び第２のポリペプチド鎖を産生し、且つヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
によって作製するステップ、及び
ｃ）産生された複数のヘテロ二量体タンパク質を、目的の生物学的活性、例えば、本明細書に開示される活性について評価するステップ
を含む。一実施形態では、第２又は第３のポリペプチドは、（例えば、ヒンジドメイン又はリンカーを介して）ＣＨ１又はＣＫドメインのＣ末端に融合されたＦｃドメイン若しくはその断片をさらに含む。任意選択により、産生されたヘテロ三量体タンパク質は、精製前の総タンパク質の少なくとも２０％、２５％、又は３０％を占める。任意選択により、（ｉｉｉ）の回収するステップは、産生されたタンパク質を、親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体又はカラムにローディングし、且つヘテロ三量体タンパク質を収集するステップ、及び／又は産生されたタンパク質（例えば、親和性交換若しくはプロテインＡカラムにローディングした後に収集されたタンパク質）をイオン交換カラムにローディングし、且つヘテロ三量体画分を収集するステップを含む。
候補可変領域を特定又は評価する方法では、候補可変領域が、抗ＮＫｐ４６抗体を形成するか、又は目的の抗原に結合する抗原を形成し得ることを理解されたい。また、候補可変領域対及び他の可変領域対のそれぞれのＡＢＤの位置を逆にできることも理解されたい。例えば、三量体タンパク質では、この方法は、重鎖及び軽鎖候補可変ドメインが第１のポリペプチドの第２のＶ領域及び第２のポリペプチドのＶ領域によって形成され、且つ他方の可変領域対が第１のポリペプチドの第１のＶ領域及び第３のポリペプチドのＶ領域によって形成されるように変更することができる。
一実施形態では、第１のポリペプチドの第２の可変ドメインと第３のポリペプチドの可変ドメインとが、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインを形成する。
さらに、標準的な細胞株及び高収量の標準化方法で全てを産生することができるが、タンパク質の機能的活性に影響を与え得る異なる特性（例えば、配座柔軟性、２つの抗原結合ドメイン間の空間など）を有する異なる多重特異的タンパク質の形態のパネルを提供することにより、本開示のタンパク質の形態をパネルに使用してタンパク質の構造又は形態をスクリーニングし、所与の目的の抗原又は目的の第１及び第２の抗原の組み合わせに対して最も有効な構造又は形態を特定することができる。異なるタンパク質形態は、それらの抗原標的に別々にアクセス又は結合することができる。
一態様では、本開示は、ヘテロ二量体タンパク質に使用される候補タンパク質の構造を特定又は評価する方法を提供し、この方法は、
本開示の、ドメイン配置が異なる複数の多重特異的タンパク質を別個に（例えば、別の容器で）産生するステップ、及び
産生された複数の多重特異的タンパク質を、目的の生物学的活性、例えば、本明細書に開示の活性について評価するステップ
を含む。一実施形態では、異なるドメイン配置を有するタンパク質は、ＮＫｐ４６及び／又は目的の抗原について抗原結合ドメイン（例えば、同じＣＤＲ又は可変ドメイン）を共有する。一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又はそれを超える異なるタンパク質が産生され、評価される。一実施形態では、タンパク質の１つ以上（又は全て）が、本明細書に開示のドメイン配置を有するタンパク質、例えば、形態Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１６、及びＦ１７のタンパク質の群から選択される。一実施形態では、タンパク質は、本明細書に開示の方法に従って産生される。任意選択により、複数の多重特異的タンパク質は、単量体Ｆｃドメインを有する１つのタンパク質及び二量体Ｆｃドメインを有する１つのタンパク質を含む。
一態様では、本開示は、少なくとも５つ、１０、２０、３０、５０の本開示のヘテロ多量体タンパク質のライブラリーを提供し、これらのタンパク質は、ドメイン配置を共有するが、それらの抗原結合ドメインの一方又は両方の可変ドメインのアミノ酸配列が異なる。
一態様では、本開示は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は１０の本開示のヘテロ多量体タンパク質のライブラリーを提供し、これらのタンパク質は、それらの抗原結合ドメインの一方又は両方の可変ドメインのアミノ酸配列を共有するが、ドメイン配置が異なる。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、単量体、ヘテロ二量体、又はヘテロ三量体タンパク質を回収するステップは、タンパク質を固定化するために固相にタンパク質を導入するステップを含み得る。続いて、固定化タンパク質を溶出することができる。一般に、固体支持体は、タンパク質を不所望の物質、例えば、過剰な試薬、汚染物質、及び溶媒から分離できるように直接的又は間接的に可逆的に取り付けることができる任意の適切な不溶性の機能性物質であり得る。固体支持体の例としては、例えば、機能性ポリマー材料、例えば、アガロース、又はそのビーズ形態Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、デキストラン、ポリスチレン、及びポリプロピレン、又はそれらの混合物；微小流体チャネル構造を含むコンパクトディスク；タンパク質アレイチップ；ピペットチップ；膜、例えば、ニトロセルロース又はＰＶＤＦ膜；及び微粒子、例えば、常磁性又は非常磁性ビーズが挙げられる。一部の実施形態では、親和性媒体は、固体支持体に結合され、タンパク質は、親和性媒体を介して固体支持体に間接的に取り付けられる。一態様では、固体支持体は、プロテインＡ親和性媒体又はプロテインＧ親和性媒体を含む。「プロテインＡ親和性媒体」及び「プロテインＧ親和性媒体」は、それぞれプロテインＡ若しくはプロテインＧのＦｃ結合ドメインを含む天然若しくは合成タンパク質がそれぞれ結合した固相、又はプロテインＡ若しくはプロテインＧのＦｃ結合ドメインの変異した変異体若しくは断片がそれぞれ結合した固相を指し、この変異体又は断片は、抗体のＦｃ部分の親和性を維持している。プロテインＡ及びプロテインＧは、哺乳動物ＩｇＧのＦｃ部分の結合部位を有する細菌細胞壁タンパク質である。ＩｇＧについてのこれらのタンパク質の能力は、種によって異なる。一般に、ＩｇＧは、プロテインＡよりもプロテインＧに対して高い親和性を有し、プロテインＧは、広範囲の種のＩｇＧに結合することができる。特にマウス及びヒトからの様々なＩｇＧサブクラスの親和性は、プロテインＧよりもプロテインＡで異なる。従って、プロテインＡは、アイソタイプ的に純粋なＩｇＧをいくつかの種から調製するために使用することができる。固体マトリックス、例えば、架橋アガロースに共有結合する場合、これらのタンパク質を使用して、生化学溶液から抗原−タンパク質複合体を捕捉して精製することができる。市販の製品の例としては、例えば、アガロース又はセファロースビーズに結合されたプロテインＧ、Ａ、又はＬが挙げられ、例えば、ＥＺｖｉｅｗ（登録商標）Ｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌが、４％アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ）；又はＰＯＲＯＳ（登録商標）Ａ、Ｇ、及びＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＨＰＬＣカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）に共有結合されたプロテインＧである。また、親和性捕捉試薬が、例えば、参照によりその開示内容が本明細書に組み入れられるＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．１８−１０３７−４６，Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＣに記載されている。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、単量体、ヘテロ二量体、又はヘテロ三量体タンパク質を目的の特徴について評価するステップは、タンパク質を、目的の抗原への結合性、ＮＫｐ４６に対する結合性、腫瘍、ウイルス、又は細菌抗原に対する結合性、ＦｃＲｎ受容体に対する結合性、Ｆｃγ受容体に対する結合性、Ｆｃドメイン媒介エフェクター機能、多量体タンパク質が結合するポリペプチドでのアゴニスト又はアンタゴニスト活性、目的の抗原を発現する細胞の活性（例えば、この細胞死を引き起こす）を調節する能力、目的の抗原を発現する細胞にリンパ球を誘導する能力、目的の抗原を発現する細胞の存在下及び／又は非存在下でリンパ球を活性化する能力、ＮＫ細胞の活性化、標的細胞の非存在下ではなく存在下でのＮＫｐ４６発現リンパ球（例えば、ＮＫ細胞）の活性化、ＮＫｐ４６陰性リンパ球の活性化の欠如、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでの安定性又は半減期、産生収率、組成物内の純度、及び溶液中での凝集のしやすさからなる群から選択される１つ以上の特性について評価する。
一態様では、本開示は、抗ＮＫｐ４６二重特異的タンパク質を特定又は評価する方法を提供し、この方法は、
（ａ）本明細書に記載の抗ＮＫｐ４６二重特異的タンパク質をコードする核酸を用意するステップ、
（ｂ）それぞれ前記核酸を宿主細胞で発現させて、前記タンパク質を産生し、及び前記タンパク質を回収するステップ、及び
（ｃ）産生されたタンパク質を、目的の生物学的活性、例えば、本明細書に開示の活性について評価するステップ
を含む。一実施形態では、複数の異なる抗ＮＫｐ４６二重特異的タンパク質が産生され、評価される。
一実施形態では、ステップ（ｃ）は、
（ｉ）（目的の抗原を発現する）標的細胞の存在下で、ＮＫｐ４６を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、タンパク質がこのようなエフェクター細胞を活性化させる能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、ステップ（ｉ）の後に、前記エフェクター細胞を活性化するタンパク質を（例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために）選択するステップを含む。
一実施形態では、ステップ（ｃ）は、
（ｉ）（目的の抗原を発現する）標的細胞の非存在下で、ＮＫｐ４６を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、タンパク質がこのようなエフェクター細胞を活性化させる能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、ステップ（ｉ）の後に、前記エフェクター細胞を実質的に活性化しないタンパク質を（例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために）選択するステップを含む。
一実施形態では、ステップ（ｃ）は、
（ｉ）（目的の抗原を発現する）標的細胞の存在下で、ＮＫｐ４６を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、タンパク質がこのようなエフェクター細胞を活性化させる能力を試験するステップ、及び
（ｉｉ）（目的の抗原を発現する）標的細胞の非存在下で、ＮＫｐ４６を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、タンパク質がこのようなエフェクター細胞を活性化させる能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、この方法は、標的細胞の非存在下でインキュベートされたときに前記エフェクター細胞を実質的に活性化せず、且つ標的細胞の存在下でインキュベートされたときに前記エフェクター細胞を活性化するタンパク質を（例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために）選択するステップをさらに含む。
一実施形態では、ステップ（ｃ）は、
（ｉ）（目的の抗原を発現する）標的細胞の存在下で、ＮＫｐ４６を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、ポリペプチドが、このようなエフェクター細胞に（目的の抗原を発現する）標的細胞を溶解させる能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、ステップ（ｉ）の後に、標的細胞の存在下で、ＮＫｐ４６を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞に標的細胞を溶解させるタンパク質を（例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために）選択するステップを含む。
一実施形態では、ステップ（ｃ）は、
（ｉ）標的細胞の存在下で、ＣＤ１６を発現するがＮＫｐ４６を発現しないエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞を活性化させるタンパク質の能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、ステップ（ｉ）の後に、標的細胞の存在下で前記エフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞を実質的に活性化しないタンパク質を（例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために）選択するステップを含む。
化合物の使用
一態様では、必要とする哺乳動物の処置又は診断用の医薬製剤の製造における本明細書で定義される任意の化合物の使用が提供される。また、薬剤として、又は薬剤中の活性成分若しくは活性物質として上記定義された任意の化合物の使用も提供される。さらなる態様では、経口投与、局所投与、又は注射用の固体又は液体製剤を提供するために、上記定義された化合物を含む医薬組成物を調製する方法が提供される。このような方法又はプロセスは、少なくとも化合物を薬学的に許容され得る担体と混合するステップを含む。
一態様では、特定の効果を与えることによって所定の状態を処置する、予防する、若しくはより一般的には所定の状態に影響を及ぼす、又は本明細書に記載の多重特異的タンパク質若しくはこの多重特異的タンパク質を含む（医薬）組成物を用いて特定の状態を検出する方法が提供される。
例えば、一態様では、本発明は、必要とする患者（例えば、癌又はウイルス若しくは細菌感染を有する患者）においてＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞の活性を回復させる又は高める方法を提供し、この方法は、前記患者に本明細書に記載の多重特異的タンパク質を投与するステップを含む。一実施形態では、この方法は、リンパ球（例えば、ＮＫ細胞）の活性の増加が有益であるか、又は不十分なＮＫ細胞の活性によって引き起こされる若しくは特徴付けられる疾患、例えば、癌又はウイルス若しくは微生物／細菌感染を有する患者にＮＫｐ４６＋リンパ球の活性の増加に関する。
本明細書に記載のポリペプチドを使用して、抗体で処置することができる障害、例えば、癌、固形及び非固形腫瘍、血液悪性腫瘍、感染、例えば、ウイルス感染、及び免疫又は自己免疫疾患を予防又は処置することができる。
一実施形態では、目的の抗原（非ＮＫｐ４６抗原）は、以下からなる群から選択される癌のタイプの悪性細胞の表面で発現される抗原である：膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌、及び扁平上皮癌を含む皮膚癌を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、及びバーケッツリンパ腫を含むリンパ系統の造血腫瘍；急性及び慢性の骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系起源の腫瘍；神経芽腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む横紋筋起源の腫瘍；並びに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍、リンパ系統の造血腫瘍、例えば、限定されるものではないが、小細胞及び大脳細胞型を含むＴ細胞障害、例えば、Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）を含むＴ細胞及びＢ細胞腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒性リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄ Ｔ−ＮＨＬ肝脾臓リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性亜型）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ １＋）大細胞リンパ腫；腸管Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球；並びにリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）。
一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドを使用して、以下からなる群から選択される癌を予防又は処置することができる：膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌、及び扁平上皮癌を含む皮膚癌を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、及びバーケッツリンパ腫を含むリンパ系統の造血腫瘍；急性及び慢性の骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系起源の腫瘍；神経芽腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む横紋筋起源の腫瘍；並びに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍。本発明によって処置することができる他の例示的な障害としては、リンパ系統の造血腫瘍、例えば、限定されるものではないが、小細胞及び大脳細胞型を含むＴ細胞障害、例えば、Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）を含むＴ細胞及びＢ細胞腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒性リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄ Ｔ−ＮＨＬ肝脾臓リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性亜型）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ １＋）大細胞リンパ腫；腸管Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球；並びにリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）が挙げられる。
一例では、腫瘍抗原は、リンパ腫細胞又は白血病細胞の表面で発現される抗原であり、多重特異的タンパク質は、リンパ腫又は白血病を有する個人に投与され、且つ／又はこの個人の処置に使用される。任意選択により、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、又はＣＤ３３から選択される。
一態様では、処置の方法は、治療有効量の本明細書に記載の多重特異的タンパク質を個人に投与するステップを含む。治療有効量は、疾患又は障害を有する患者に治療効果を有する（又は疾患若しくは障害を有する患者及び患者と実質的に同様の特徴を有する患者の少なくとも相当数でこのような効果を促進する、高める、及び／又は誘導する）任意の量であり得る。
一実施形態では、本明細書に記載の多重特異的タンパク質は、抗体が投与される特定の治療目的に通常は利用される作用物質を含む１つ以上の他の治療薬との併用治療に使用することができる。追加の治療薬が、処置される特定の疾患又は状態の単一療法でその治療薬に典型的に使用される量及び治療計画で通常は投与される。このような治療薬は、癌の処置に使用される場合、限定されるものではないが、抗癌剤及び化学療法薬を含み、感染疾患の処置では、限定されるものではないが、抗ウイルス薬及び抗生物質を含む。
一実施形態では、追加の治療薬は、例えば、ＮＫ細胞によって発現されるＣＤ１６を介して作用物質が結合する細胞のＡＤＣＣを誘導することができる作用物質である。典型的には、このようなタンパク質は、Ｆｃドメイン又はその一部を有し、且つＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６）に対する結合性を示す。一実施形態では、そのＡＤＣＣ活性は、ＣＤ１６によって少なくとも部分的に媒介される。一実施形態では、追加の治療薬は、ナイーブ又は改変ヒトＦｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３抗体からのＦｃドメインを有する抗体である。「抗体依存性細胞媒介傷害」又は「ＡＤＣＣ」という語は、当技術分野で良く理解されている語であり、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する非特異的細胞傷害性細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球を含む。「ＡＤＣＣ誘導抗体」という語は、当業者に公知のアッセイによって測定されるＡＤＣＣを立証する抗体を指す。このような活性は、典型的には、Ｆｃ領域の様々なＦｃＲとの結合によって特徴付けられる。任意の特定の機序に限定されるものではないが、当業者であれば、抗体がＡＤＣＣを立証する能力が、例えば、そのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３）によって、Ｆｃ領域に導入される変異によって、又は抗体のＦｃ領域における糖のパターンの改変によって可能であることを理解されよう。
野生型Ｆｃ領域と比較した抗体のＦｃ領域の特定の改変が、ＡＤＣＣ活性を高めることも当業者に周知である。追加の治療薬としてのこのような「ＡＤＣＣ促進」抗体との組み合わせは、このような抗体が、ＣＤ１６による高い活性化を誘導し得るために特に有利であり、及びＮＫｐ４６を介して作用する多重特異的タンパク質は、ＡＤＣＣ促進抗体によって利用されるＣＤ１６経路を妨害することなく、且つさらなる免疫関連毒性を引き起こすことなく、相補的な機序によってＮＫ細胞の活性化及び／又は標的細胞の溶解を誘導する。典型的な改変は、少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、置換、欠失、挿入）を含む改変ヒトＩｇＧ１定常領域、及び／又は変更されたタイプのグリコシル化、例えば、低フコシル化を含む。このような改変は、Ｆｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）との相互作用に影響を与え得る。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、活性化（即ち、免疫系強化）受容体であるが、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は、抑制（即ち、免疫系抑制）受容体である。改変は、例えば、エフェクター（例えば、ＮＫ）細胞上でのＦｃドメインのＦｃγＩＩＩａへの結合を増加させ、且つ／又はＦｃγＲＩＩＢへの結合を減少させる。改変の例は、参照によりその開示内容が本明細書に組み入れられる２０１３年９月１７日出願の国際出願ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１３／０６９３０２号明細書に記載されている。
一部の実施形態では、追加の治療薬は、変異型Ｆｃ領域を含む抗体であり、このＦｃ領域は、そのＣＨ３ドメインに少なくとも１つのアミノ酸改変を含む（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ以上のアミノ酸改変を有する）。他の実施形態では、変異型Ｆｃ領域を含む抗体は、このＦｃ領域のＣＨ２ドメインに少なくとも１つのアミノ酸改変を含み（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ以上のアミノ酸改変を有し）、ＣＨ２ドメインは、アミノ酸２３１〜３４１まで伸長していると定義される。一部の実施形態では、抗体は、少なくとも２つのアミノ酸改変を含み（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ以上のアミノ酸改変を有し）、少なくとも１つのこのような改変は、ＣＨ３領域にあり、且つ少なくとも１つのこのような改変は、ＣＨ２領域にある。また、ヒンジ領域のアミノ酸改変も包含される。一実施形態では、Ｆｃ領域のＣＨ１ドメインのアミノ酸改変が包含され、ＣＨ１ドメインは、アミノ酸２１６〜２３０まで伸長していると定義される。Ｆｃ改変のあらゆる組み合わせ、例えば、米国特許第７，６３２，４９７号明細書；同第７，５２１，５４２号明細書；同第７，４２５，６１９号明細書；同第７，４１６，７２７号明細書；同第７，３７１，８２６号明細書；同第７，３５５，００８号明細書；同第７，３３５，７４２号明細書；同第７，３３２，５８１号明細書；同第７，１８３，３８７号明細書；同第７，１２２，６３７号明細書；同第６，８２１，５０５号明細書、及び同第６，７３７，０５６号明細書；国際公開第２０１１／１０９４００号パンフレット；同第２００８／１０５８８６号パンフレット；同第２００８／００２９３３号パンフレット；同第２００７／０２１８４１号パンフレット；同第２００７／１０６７０７号パンフレット；同第０６／０８８４９４号パンフレット；同第０５／１１５４５２号パンフレット；同第０５／１１０４７４号パンフレット；同第０４／１０３２２６９号パンフレット；同第００／４２０７２号パンフレット；同第０６／０８８４９４号パンフレット；同第０７／０２４２４９号パンフレット；同第０５／０４７３２７号パンフレット；同第０４／０９９２４９号パンフレット、及び同第０４／０６３３５１号パンフレット；並びにＬａｚａｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３（１１）：４０５−４１０；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０（４）：４８７−４９０；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６；２７７（３０）：２６７３３−２６７４０ ａｎｄ Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４）に開示されている異なる改変のあらゆる組み合わせが可能である。
一部の実施形態では、追加の治療薬は、変異型Ｆｃ領域を含む抗体であり、この変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ以上のアミノ酸改変を有し）、それにより、この分子は、野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して増強されたエフェクター機能を有し、任意選択により、変異型Ｆｃ領域は、２２１位、２３９位、２４３位、２４７位、２５５位、２５６位、２５８位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７６位、２７８位、２８０位、２８３位、２８５位、２８６位、２８９位、２９０位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９８位、３００位、３０１位、３０３位、３０５位、３０７位、３０８位、３０９位、３１０位、３１１位、３１２位、３１６位、３２０位、３２２位、３２６位、３２９位、３３０位、３３２位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位、３３５位、３３７位、３３８位、３３９位、３４０位、３５９位、３６０位、３７０位、３７３位、３７６位、３７８位、３９２位、３９６位、３９９位、４０２位、４０４位、４１６位、４１９位、４２１位、４３０位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び／又は４３９位のいずれか１つ以上に置換を含む。一実施形態では、一部の実施形態では、追加の治療薬は、変異型Ｆｃ領域を含む抗体であり、変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ以上のアミノ酸改変を有し）、それにより、この分子は、野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して増強されたエフェクター機能を有し、任意選択により、変異型Ｆｃ領域は、２３９位、２９８位、３３０位、３３２位、３３３位、及び／又は３３４位のいずれか１つ以上に置換（例えば、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、及び／又はＫ３３４Ａ置換）を含む。
一部の実施形態では、追加の治療薬は、抗体のＦｃ受容体結合能を増大させる変更されたグリコシル化パターンを含む抗体である。このような炭水化物修飾は、例えば、変更されたグリコシル化装置を有する宿主細胞で抗体を発現させることによって達成することができる。変更されたグリコシル化装置を有する細胞は、当技術分野で説明されており、組換え抗体を発現させてグリコシル化が変更された抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、それぞれ参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられるＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１、並びに欧州特許第１，１７６，１９５号明細書；国際公開第０６／１３３１４８号パンフレット；同第０３／０３５８３５号パンフレット；同第９９／５４３４２号パンフレットを参照されたい。一態様では、抗体は、それらの定常領域が低フコシル化されている。このような抗体は、アミノ酸の変更を含んでもよく、又はアミノ酸の変更を含まなくてもよいが、このような低フコシル化が得られるような条件下で産生する又は処置することができる。一態様では、抗体組成物は、本明細書に記載のキメラ、ヒト、又はヒト化抗体を含み、組成物中の抗体種の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、又は実質的に全てが、フコースが欠損したコア炭水化物構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）を含む定常領域を有する。一実施形態では、フコースを有するコア炭水化物構造を含む抗体が含まれていない抗体組成物が提供される。コア炭水化物は、好ましくは、Ａｓｎ２９７の糖鎖である。
ＡＤＣＣ促進抗体の例としては、限定されるものではないが、ＧＡ−１０１（低フコシル化抗ＣＤ２０）、マルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）（Ｆｃ強化抗ＨＥＲ２）、メポリズマブ（ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＭＥＤＩ−５５１（Ｆｃエンジンリング抗ＣＤ１９）、オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）（糖エンジニアリング／低フコシル化抗ＣＤ２０）、オカラツヅマブ（ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）（Ｆｃエンジニアリング抗ＣＤ２０）、ＸｍＡｂ（登録商標）５５７４／ＭＯＲ２０８（Ｆｃエンジニアリング抗ＣＤ１９）が挙げられる。
一例では、追加の治療薬（例えば、ＡＤＣＣを誘導することができる抗体）は、リンパ腫又は白血病細胞上に存在する癌抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、又はＣＤ３３に結合し、及び多重特異的タンパク質及び追加の治療薬は、リンパ腫又は白血病を有する個人に投与され、且つ／又はこのような個人の処置に使用される。
「併用療法」は、第２の治療薬（例えば、ＡＤＣＣ誘導抗体）及び本明細書に記載の多重特異的タンパク質の相互作用による有利な効果を提供することを目的とした特定の治療計画の一部としてのこれらの治療薬の投与を含む。併用療法の有利な効果は、限定されるものではないが、治療薬の併用から生じる薬物動態学的又は薬力学的相互作用を含む。これらの治療薬の併用投与は、典型的には、所定の期間（通常は、選択される併用によって数分間、数時間、数日間、又は数週間）にわたって行われる。「併用療法」は、一般に、偶然且つ任意に本発明の併用となる別個の単一治療計画の一部としてこれらの治療薬の２つ以上の投与を含むものではない。「併用療法」は、これらの治療薬の連続的な投与、即ち、これらの各治療薬が異なる時間に投与される投与、及びこれらの治療薬又はこれらの治療薬の少なくとも２つの実質的に同時の投与を含む。実質的に同時の投与は、例えば、一定比率の各治療薬を有する単一カプセルの対象への投与、又は治療薬のそれぞれの単一カプセルの複数回投与によって達成することができる。それぞれの治療薬の連続的な投与又は実質的に同時の投与は、限定されるものではないが、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、及び粘膜組織を介して直接の吸収を含む任意の適切な経路によって行うことができる。治療薬は、同じ経路によって、又は異なる経路によって投与することができる。例えば、選択される併用の第１の治療薬は、静脈注射によって投与することができ、併用の他方の治療薬は、経口投与することができる。別法では、例えば、両方の治療薬を経口投与してもよく、又は両方の治療薬を静脈注射によって投与してもよい。治療薬が投与される順序は、それほど重要ではない。「併用療法」はまた、他の生物学的に活性な成分（例えば、限定されるものではないが、第２の異なる抗悪性腫瘍薬）及び非薬物療法（例えば、限定されるものではないが、外科手術又は放射線治療）とさらに併用される上記の治療薬の投与も含み得る。
多重特異的ポリペプチドは、キットに含めることができる。このキットは、任意選択により、任意の数のポリペプチド及び／又は他の化合物、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又はその他の数の多重特異的ポリペプチド及び／又は他の化合物をさらに含み得る。キットの内容についてのこの記載は、全く限定ではないことを理解されたい。例えば、キットは、他のタイプの治療化合物を含み得る。任意選択により、キットは、ポリペプチドの使用についての取扱説明書、例えば、本明細書に記載の方法の詳細も含む。
また、上記定義された化合物を含む医薬組成物も提供される。化合物は、医薬組成物として医薬担体と共に精製された形態で投与することができる。形態は、意図する投与方式及び治療又は診断用途によって決まる。医薬担体は、化合物を患者に送達するのに適した任意の適合性の非毒性物質とすることができる。薬学的に許容され得る担体は、当技術分野で公知であり、例えば、水溶液、例えば、（滅菌）水若しくは生理緩衝食塩水、又は他の溶媒若しくはビヒクル、例えば、グリコール、グリセロール、油、例えば、オリーブ油、又は注射可能な有機エステル、アルコール、脂肪、ワックス、及び不活性固体を含む。薬学的に許容され得る担体は、例えば化合物の吸収を安定させる又は高めるように作用する、生理的に許容され得る化合物をさらに含み得る。このような生理的に許容され得る化合物は、例えば、炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、又はデキストラン、抗酸化物、例えば、アスコルビン酸又はグルタチオン、キレート剤、低分子量タンパク質、又は他の安定剤若しくは賦形剤を含む。当業者であれば、生理的に許容され得る化合物を含む薬学的に許容され得る担体の選択が、例えば、組成物の投与経路によって決まることを理解されよう。薬学的に許容され得るアジュバント、緩衝剤、及び分散剤なども医薬組成物に含まれ得る。
化合物は、非経口投与することができる。非経口投与用の化合物の調製は、滅菌でなければならない。滅菌は、任意選択により凍結乾燥及び再生の前又は後での、滅菌濾過膜に通す濾過によって容易に達成される。化合物の投与の非経口経路は、公知の方法、例えば、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、動脈内経路、若しくは病巣内経路による注射又は注入に従う。化合物は、注入又はボーラス注射によって連続的に投与することができる。静脈注射用の典型的な組成物は、特定のタイプの化合物及びその必要な投与計画に合わせて、任意選択により２０％アルブミン溶液が添加された１００〜５００ｍｌの滅菌０．９％ＮａＣｌ又は５％グルコース及び１ｍｇ〜１０ｇの化合物を含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製する方法は、当技術分野で公知である。
実施例１
抗ｈｕＮＫｐ４６抗体の作製
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、組換えヒトＮＫｐ４６細胞外ドメイン組換えＦｃタンパク質で免疫した。マウスは、５０μｇのＮＫｐ４６タンパク質と完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により最初の免疫を行い、５０μｇのＮＫｐ４６タンパク質と不完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により２回目の免疫を行い、最後に、１０μｇのＮＫｐ４６タンパク質の静脈投与により追加免疫した。免疫脾細胞を、追加免疫の３日後にＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞に融合し、これを、放射線照射脾細胞の存在下で培養した。
一次スクリーニング：増殖しているクローンの上清（Ｓ／Ｎ）を、細胞表面でヒトＮＫｐ４６構築物を発現する細胞株を用いるフローサイトメトリーによって一次スクリーニングで試験した。簡単に述べると、ＦＡＣＳスクリーニングでは、上清中の反応抗体の存在を、ＰＥで標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）によって明らかにした。
ＮＫｐ４６に結合する抗体のセレクションを選択し、産生し、及びそれらの可変領域を二重特異的分子との関連でのそれらの活性についてさらに評価した。
実施例２ エフェクター細胞受容体を標的とする、ＦｃＲｎには結合するがＦｃγＲには結合しない二重特異的抗体形態の同定
この実験の目的は、Ｆｃドメインを、抗ＮＫｐ４６結合ドメイン及び抗標的抗原結合ドメインと共にポリペプチドに配置する新規な二重特異的タンパク質形態を開発することにあった。二重特異的タンパク質は、その抗ＮＫｐ４６結合ドメインを介してＮＫｐ４６に一価で結合する。単量体Ｆｃドメインは、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する少なくとも部分的な結合を維持するが、ヒトＣＤ１６及び／又は他のヒトＦｃγ受容体には実質的に結合しない。結果として、二重特異的タンパク質は、Ｆｃγ媒介（例えば、ＣＤ１６媒介）標的細胞溶解を誘導しない。
実施例２−１ 抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ抗ＣＤ３の作製及び結合分析
このようなタンパク質が機能的であり得るか否かを示すことができる抗ＮＫｐ４６二重特異的抗体が作製されていないため、ＮＫｐ４６を介したＮＫ細胞の標的化前に新規な一価二重特異的タンパク質形態の機能を調べるために、ＮＫｐ４６の代わりにＣＤ３をモデル抗原として使用した。
腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）及びＴ細胞の活性化受容体ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ）をベースとした二重特異的Ｆｃを使用して、新規な単量体二重特異的ポリペプチド形態のＦｃＲｎ結合及びＣＤ１９結合機能を評価した。最終ポリペプチドのドメイン配置が図２に示されており、このドメイン配置は、「Ｆ１」形態とも呼ばれる（ＣＨ２ドメインの星は、本明細書で試験されたポリペプチドには含まれていない任意選択のＮ２９７Ｓ変異を示す）。
二重特異的単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを、腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）及びＴ細胞の活性化受容体ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ）をベースに構築した。ＣＨ３ドメインは、変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙを含んでいた。このポリペプチドは、次のように配置されたドメインを有する：抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−抗ＣＤ３。アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために設計した。
ＣＨ３ドメインは、変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙを含んでいた。ＣＨ２ドメインは、野生型ＣＨ２であった。単量体ＣＨ２−ＣＨ３Ｆｃ部分及び抗ＣＤ１９のＤＮＡ及びアミノ酸配列は以下に示されている。
抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖに対応する軽鎖及び重鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列は次の通りであった。
Figure 0006822849
単量体ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分及び最終二重特異的ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏポリペプチド（その構築物では最後のＫが除去された）のＤＮＡ配列が配列番号１１７に示されている。アミノ酸配列が配列番号２に示されている。抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３完全配列（成熟タンパク質）が配列番号１１８に示されている。
組換えタンパク質のクローニング及び産生
コード配列を、直接合成及び／又はＰＣＲによって構築した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ，＃Ｒ０４５Ａ）を用いて行い、ＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎゲル及びＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，＃７４０６０９．２５０）を用いて１％アガロースゲルから精製した。精製した後、ＰＣＲ産物を定量してから、製造者のプロトコル（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，＃ＳＴ０３４５）に記載されているようにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ連結反応を行った。プラスミドは、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ９６プラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，＃７４０６２５．４）を用いてＥＶＯ２００（Ｔｅｃａｎ）で行われたミニプレップ調製後に得た。次いで、ＣＨＯ細胞株のトランスフェクションの前に、プラスミドを配列の確認のために配列決定した。
ＣＨＯ細胞を、フェノールレッド及び６ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘが添加されたＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖した。トランスフェクションの前日に、細胞をカウントし、１７５，０００細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクションのために、細胞（２００，０００細胞／トランスフェクション）を、ＡＭＡＸＡ ＳＦ細胞株キット（ＡＭＡＸＡ，＃Ｖ４ＸＣ−２０３２）に記載されているように調製し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ４Ｄ装置でＤＳ１３７プロトコルを用いてヌクレオフェクトした。全てのトランスフェクションは、３００ｎｇの検証済みプラスミドを用いて行った。トランスフェクション後、細胞を、２４ウェルプレートの予熱された培養培地に播種する。２４時間後、ハイグロマイシンＢを、培養培地に添加した（２００μｇ／ｍｌ）。タンパク質の発現を、１週間後に培地で監視する。次いで、タンパク質を発現している細胞をサブクローニングして最高の産生株を得る。９６平底ウェルプレートを用いて、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢが添加された２００μｌの培養培地に１細胞／ウェルで細胞を播種して、サブクローニングを行った。クローンの生産性を試験する前に、細胞を３週間放置した。
ＩｇＧ１−Ｆｃ断片を含む組換えタンパク質を、プロテインＡビーズ（−ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｒｅｆ．：１７−１２７９−０３）を用いて精製する。簡単に述べると、細胞培養上清を濃縮し、遠心分離によって清澄化し、プロテインＡカラムに注入し、組換えＦｃ含有タンパク質を捕捉した。タンパク質を酸性ｐＨ（クエン酸０．１Ｍ ｐＨ３）で溶出し、ＴＲＩＳ−ＨＣＬ ｐＨ８．５を用いて即座に中和し、１×ＰＢＳで透析した。「ｓｉｘ ｈｉｓ」タグを含む組換えｓｃＦｖを、コバルト樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。他の組換えｓｃＦｖを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。
実施例２−２：抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ−抗ＣＤ３〜Ｂ２２１、ＪＵＲＫＡＴ、ＨＵＴ７８、及びＣＨＯ細胞株の結合分析
細胞を回収して、抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３産生細胞の細胞上清で、４℃で１時間染色した。染色緩衝液（ＰＢＳ １Ｘ／ＢＳＡ ０．２％／ＥＤＴＡ ２ｍＭ）で２回洗浄した後、細胞を、ヤギ抗ヒト（Ｆｃ）−ＰＥ抗体（ＩＭ０５５０ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ−１／２００）で、４℃で３０分間染色した。２回の洗浄後、染色物をＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
ＣＤ３及びＣＤ１９の発現もフローサイトメトリーによって制御した。細胞を回収して、５μｌの抗ＣＤ３−ＡＰＣ及び５μｌの抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ抗体を用いて、ＰＢＳ １Ｘ／ＢＳＡ ０．２％／ＥＤＴＡ ２ｍＭ緩衝液で、４℃で３０分間染色した。２回の洗浄後、染色物をＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３細胞株（ＨＵＴ７８及びＪＵＲＫＡＴ細胞株）及びＣＤ１９細胞株（Ｂ２２１細胞株）に結合するが、陰性対照として使用されるＣＨＯ細胞株には結合しない。
実施例２−３：
精製抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３によるＴ細胞及びＢ細胞の凝集
精製抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３をＴ／Ｂ細胞凝集アッセイで試験して、抗体が、ＣＤ１９及びＣＤ３発現細胞の凝集において機能するか否かを評価した。
結果が図４に示されている。上のパネルは、抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３は、Ｂ２２１（ＣＤ１９）又はＪＵＲＫＡＴ（ＣＤ３）細胞株の存在下で凝集を引き起こさないが、Ｂ２２１及びＪＵＲＫＡＴ細胞の両方が同時にインキュベートされるときに細胞を凝集させることを示し、二重特異的抗体が機能的であることを例示する。下のパネルは、抗体を含まない対照を示す。
実施例２−４：
二重特異的単量体ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎに対する結合性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性試験
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００の一般的な手順及び試薬
ＳＰＲ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、２５℃で行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、酢酸緩衝液（５０ｍＭ酢酸 ｐＨ５．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％界面活性剤ｐ２０）及びＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）がそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。組換えマウスＦｃＲｎをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
ＦｃＲｎの固定化
組換えＦｃＲｎタンパク質を、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。ＦｃＲｎタンパク質を、結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
親和性試験
一価親和性試験を、Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｙｃｌｅ Ｋｉｎｅｔｉｃ（ＳＣＫ）プロトコルに従って行った。５段階希釈の４１．５〜６６０ｎＭの可溶性分析物（抗体及び二重特異的分子）を（再生なしで）ＦｃＲｎに添加し、再生の１０分前に解離させた。各分析物について、全てのセンサーグラムを、１：１ＳＣＫ結合モデルを用いてフィッティングした。
結果
そのＣＨ２−ＣＨ３ドメインが２つの抗原結合ドメイン（ここでは２つのｓｃＦｖ）間に配置された抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３を評価して、このような二重特異的単量体Ｆｃタンパク質が、ＦｃＲｎに対する結合性を維持することができ、それにより、従来の二重特異的抗体と比較して改善されたｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有するか否かを決定した。結果は、ＦｃＲＮ結合性が維持されたことを示し、このモデルは、正常なＩｇＧに対して、２：１の比率（各抗体に対して２つのＦｃＲｎ）ではなく１：１の比率（各単量体Ｆｃに対して１つのＦｃＲｎ）を示唆している。結果は図５に示されている。
親和性を、ヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラ完全長抗体に対してＳＰＲを用いて評価した。結果が表５に示されている。単量体Ｆｃは、ＦｃＲｎに対して著しい単量体結合性を維持した（単量体Ｆｃ：ＫＤ＝１９４ｎＭの親和性；二価結合性を有する完全長抗体：ＫＤ＝１５．４ｎＭの親和性）。
実施例３：
抗ＣＤ１９ｘ抗ＮＫｐ４６二重特異的単量体Ｆｃドメインポリペプチドの作製
ＮＫ細上の活性化受容体が標的細胞の溶解に寄与し得るかは不明であり、抗ＮＫｐ４６抗体がＮＫｐ４６をブロックし得るため、細胞毒性がＮＫｐ４６のトリガーによって媒介することができたか否かは不明であった。本発明者らは、二重特異的タンパク質形態が、ＮＫｐ４６のトリガーを引き起こすことができたか否か、さらに標的細胞の非存在下でＮＫｐ４６アゴニズムを誘導することなく、標的から離れた不適切なＮＫ活性化及び／又は標的細胞に対する全活性の低下をもたらすことができたかを調べた。
新規な二重特異的タンパク質形態を、ＦｃＲｎには結合するがＦＣγＲには結合しない一本鎖タンパク質として開発した。加えて、２つ又は３つのポリペプチド鎖を含み、Ｆｃドメインが単量体を維持している多量体タンパク質を開発し、この多量体タンパク質は、ｓｃＦｖ形態に変換されたときにそれらの標的に対する結合性を維持しない抗体可変領域での使用に適合している。ｓｃＦｖ形態は、抗体のスクリーニングに便利に使用することができ、少なくとも１つの結合領域をＦ（ａｂ）構造として含めることにより、任意の抗標的（例えば、抗腫瘍）抗体可変領域を、抗体がｓｃＦｖとして結合性を維持するか否かにかかわらず、二重特異的タンパク質内のＦ（ａｂ）形態として二重特異的構築物で直接発現させて試験することができ、それにより、利用可能な抗体を単純にスクリーニングしてその数を増加させることができる。Ｆｃドメインが単量体を維持するこれらの形態は、ＮＫｐ４６又は標的抗原に対する最適な結合性を可能にし得る最大の配座柔軟性を維持するという利点を有する。
異なる構築物を、実施例２−１に記載の腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖからの可変ドメインＤＮＡ及びアミノ酸配列、及び実施例１に示されたＮＫｐ４６受容体に特異的な抗体からの異なる可変領域を用いて、二重特異的抗体の調製に使用するために作製した。また、ＮＫｐ４６受容体に特異的な既存の抗体Ｂａｂ２８１（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）が市販するｍＩｇＧ１（Ｐｅｓｓｉｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１９９８，１８８（５）：９５３−９６０ ａｎｄ Ｓｉｖｏｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９．２９：１６５６−１６６６も参照されたい））からの可変領域を抗ＮＫｐ４６として用いて作製した。
Ｆｃドメインが、一本鎖ポリペプチドで、又は１つの鎖のみがＦｃドメインを有する多量体で単量体を維持するために、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が、２つの異なる戦略：（１）変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙを含むＣＨ３ドメインの使用によって、又は（２）直列型ＣＨ３ドメインが互いに結合された可撓性リンカーによって分離され、それにより、鎖間ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止する直列型ＣＨ３ドメインの使用によって防止された。点変異を有する単量体ＣＨ２−ＣＨ３Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、実施例２−１と同様であった。直列型ＣＨ３ドメインを有する単量体ＣＨ２−ＣＨ３−リンカーＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、図６Ａ〜図６Ｄに示されている。
抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖの軽鎖及び重鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列は、実施例２−１と同様であった。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。以下に、抗ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖの軽鎖及び重鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列が示される。
Figure 0006822849
Figure 0006822849
形態１（Ｆ１）（抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ−抗ＮＫｐ４６（ｓｃＦｖ））
形態１（Ｆ１）のドメイン構造が図６Ａに示されている。二重特異的Ｆｃ含有ポリペプチドを、腫瘍抗原ＣＤ１９（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）に特異的なｓｃＦｖ及びＮＫｐ４６受容体に特異的なｓｃＦｖをベースに構築した。このポリペプチドは、以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する一本鎖ポリペプチドである。
（ＶＫ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−（ＶＨ−ＶＫ）抗ＮＫｐ４６
アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために設計した。図２に示されている最終ポリペプチドのドメイン配置（ＣＨ２ドメインの星は、任意選択のＮ２９７Ｓ変異を示す）では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖが抗ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖによって置換されている。（ＶＫ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメインとＶＫドメインとの間にリンカーを含む。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的ポリペプチドのアミノ酸配列（完全な配列（成熟タンパク質））が、以下の表３に列記された対応する配列番号に示されている。
Figure 0006822849
形態２（Ｆ２）：ＣＤ１９−Ｆ２−ＮＫｐ４６−３
Ｆ２ポリペプチドのドメイン構造が図６Ａに示されている。単量体ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、実施例２−１と同様であり、ＣＨ３ドメイン変異（変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙ）を含む。ヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
（ＶＫ-ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ。
（ＶＫ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶＫ単位（即ち、ｓｃＦｖ）から構成されていた。二重特異的ポリペプチドの他の形態と同様に、アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために設計した。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。Ｆ２タンパク質の第１鎖及び第２鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４０及び１４１に示されている。
形態３（Ｆ３）：ＣＤ１９−Ｆ３−ＮＫｐ４６−３
Ｆ３ポリペプチドのドメイン構造が図６Ａに示されている。ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、同じポリペプチド鎖上の２つのＣＨ３ドメインが互いに結合し、それにより、異なる二重特異的タンパク質間の二量体化が防止される直列型ＣＨ３ドメインを含んでいた。
一本鎖ポリペプチドは、以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する。
（ＶＫ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−（ＶＨ−ＶＫ）抗ＮＫｐ４６
（ＶＫ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶＫ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、３．４ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィール有していた。Ｆ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１４２に示されている。
形態４（Ｆ４）：ＣＤ１９−Ｆ４−ＮＫｐ４６−３
Ｆ４ポリペプチドのドメイン構造が図６Ａに示されている。ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ３と同様に直列型ＣＨ３ドメインを含むが、さらに、Ｎ連結グリコシル化を防止してＦｃγＲ結合性を消失させるＮ２９７Ｓ変異を含んでいた。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、１ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィール有していた。ＮＫｐ４６−３可変ドメインを有するＦ４タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１４３に示されている。
形態８（Ｆ８）
Ｆ８ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｂに示されている。単量体ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、ＣＨ３ドメイン変異（変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙ、並びにＮ連結グリコシル化を防止してＦｃγＲ結合性を消失させるためのＮ２９７Ｓ変異）を含む形態Ｆ２と同様であった。Ｆ８タンパク質の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである（野生型、Ｆ８Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換されている（Ｆ８Ｂ）、及び（ｃ）リンカー配列ＧＧＧＳＳがヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換している（Ｆ８Ｃ）。変異型Ｆ８Ｂ及びＦ８Ｃは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止することによって作製に利点を提供した。ヘテロ三量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ
タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、３．７ｍｇ／Ｌ（Ｆ８Ｃ）の高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。ＮＫｐ４６−３可変領域を有するＦ８タンパク質（Ｃ変異体）の３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４４、１４５、及び１４６に示されている。
形態９（Ｆ９）：ＣＤ１９−Ｆ９−ＮＫｐ４６−３
Ｆ９ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖、及びそれぞれＣＨ１−ＣＫの二量体化によって中心鎖に結合された２つのポリペプチド鎖を有する三量体ポリペプチドである。三量体Ｆ９タンパク質のドメイン構造が図６Ｂに示されており、ＣＨ１とＣＫドメインとの間の結合は、鎖間ジスルフィド結合である。２つの抗原結合ドメインは、抗体がｓｃＦｖ形態で機能を支持するか否かにかかわらず、この抗体の使用を可能にするＦ（ａｂ）構造を有する。ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ４と同様の直列型ＣＨ３ドメイン及びＮ２９７Ｓ置換を含むＣＨ２ドメインを含んでいた。Ｆ９タンパク質の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである（野生型、Ｆ９Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換されている（Ｆ９Ｂ）、及び（ｃ）リンカー配列ＧＧＧＳＳがヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換している（Ｆ９Ｃ）。変異型Ｆ９Ｂ及びＦ９Ｃは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止することによって作製に利点を提供した。このヘテロ三量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ
タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、８．７ｍｇ／Ｌ（Ｆ９Ａ）及び３．０ｍｇ／Ｌ（Ｆ９Ｂ）の高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。
Ｆ９タンパク質変異型Ｆ９Ａの３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４７、１４８、及び１４９に示されている。Ｆ９タンパク質変異型Ｆ９Ｂの３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５０、１５１、及び１５２に示されている。Ｆ９タンパク質変異型Ｆ９Ｃの３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５３、１５４、及び１５５に示されている。
形態１０（Ｆ１０）：ＣＤ１９−Ｆ９−ＮＫｐ４６−３
Ｆ１０ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖、及びＣＨ１−ＣＫの二量体化によって中心鎖に結合された第２のポリペプチド鎖を有する二量体タンパク質である。二量体Ｆ１０タンパク質のドメイン構造が図６Ｂに示され、ＣＨ１とＣＫドメインとの間の結合は、鎖間ジスルフィド結合である。２つの抗原結合ドメインの一方はＦａｂ構造を有し、且つ他方はｓｃＦｖである。ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ４と同様の直列型ＣＨ３ドメイン及びＮ２９７Ｓ置換を有するＣＨ２ドメインを含んでいた。加えて、Ｆ１０タンパク質の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである（野生型、Ｆ１０Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換されている（Ｆ１０Ｂ）、及び（ｃ）リンカー配列ＧＧＧＳＳがヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換している（Ｆ１０Ｃ）。変異型Ｆ１０Ｂ及びＦ１０Ｃは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止することによって作製に利点を提供した。（ＶＫ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶＫ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。ヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−（ＶＨ−ＶＫ）抗ＮＫｐ４６、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ。
タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２ｍｇ／Ｌ（Ｆ１０Ａ）の良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ１０Ａタンパク質変異体の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５６（第２鎖）及び１５７（第１鎖）に示されている。Ｆ１０Ｂタンパク質変異体の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５８（第２鎖）及び１５９（第１鎖）に示されている。Ｆ１０Ｃタンパク質変異体の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６０（第２鎖）及び１６１（第１鎖）に示されている。
形態１１（Ｆ１１）：ＣＤ１９−Ｆ１１−ＮＫｐ４６−３
Ｆ１１ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｃに示されている。このヘテロ二量体タンパク質は、Ｆ１０に類似しているが、抗原結合ドメインの構造が逆である。２つの抗原結合ドメインの一方はＦａｂ様構造を有し、且つ他方はｓｃＦｖである。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
（ＶＫ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１。
タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ１１タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６２（第１鎖）及び配列番号１６３（第２鎖）に示されている。
形態１２（Ｆ１２）：ＣＤ１９−Ｆ１２−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１２ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｃに示されており、ＣＨ１とＣＫドメインとの間の結合は、ジスルフィド結合である。このヘテロ二量体タンパク質は、Ｆ１１に類似しているが、Ｆ（ａｂ）構造内のＣＨ１とＣＫドメインが逆である。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
（ＶＫ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ。
タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２．８ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ１２タンパク質のＤＮＡ及びアミノ酸配列が、以下に示されている。Ｆ１２タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６４（第１鎖）及び配列番号１６５（第２鎖）に示されている。
形態１７（Ｆ１７）：ＣＤ１９−Ｆ１７−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１７ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｃに示されており、ＣＨとＣＫドメインとの間の結合はジスルフィド結合である。ヘテロ二量体タンパク質は、Ｆ９と同様であるが、ＶＨ及びＶＫドメイン、並びにＣ末端Ｆ（ａｂ）構造内のＣＨ１及びＣＫドメインは、それぞれ、それらのパートナーと逆である。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ
加えて、Ｆ１７タンパク質の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである（野生型、Ｆ１７Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換されえいる（Ｆ１０Ｂ）、及び（ｃ）リンカー配列ＧＧＧＳＳがヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換している（Ｆ１７Ｃ）。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。Ｆ１７Ｂタンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６６、１６７、及び１６８に示されている。
実施例４：
二量体Ｆｃドメインを有する二重特異的ＮＫｐ４６抗体形態
二量体Ｆｃドメインを有する新規なタンパク質構築物を開発し、このタンパク質構築物は、実施例３の単量体Ｆｃドメインタンパク質の利点を共有するが、高い親和性でＦｃＲｎに結合し、さらにＦｃγＲに対して低い結合性を有する、又は結合性が消失している。このポリペプチド形態を、（ＶＨ−（ＣＨ１／ＣＫ）−ＣＨ２−ＣＨ３−）単位又は（ＶＫ−（ＣＨ１又はＣＫ）−ＣＨ２−ＣＨ３−）単位を有する中心鎖を含むヘテロ二量体タンパク質の機能を調べるために試験した。次いで、ＣＨ３ドメインの一方又は両方は、任意選択により介在アミノ酸配列若しくはドメインを介して、可変ドメイン（分離されたポリペプチド鎖上の可変ドメインに結合する単一可変ドメイン）、直列型可変ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）、又は単一可変ドメインとして抗原に結合することができる単一可変ドメインに融合される。次いで、２つの鎖が、ＣＨ１−ＣＫ二量体化によって結合してジスルフィド結合二量体を形成する、又は第３鎖と結合して三量体を形成する。形態のこのファミリーのメンバーは、ナイーブ抗体又は他の二重特異的構築物と比較して低い配座柔軟性を有し得る。
様々な構築物を、二重特異的抗体の調製に使用するために、実施例２−１に記載の腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖに由来する可変ドメインＤＮＡ及びアミノ酸配列及び実施例１で明らかにされたＮＫｐ４６に特異的な抗体からの異なる可変領域を用いて作製した。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。ドメイン構造は、図６Ａ〜図６Ｄに示されている。
形態５（Ｆ５）：ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ５ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｄに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合（鎖上のＣＨ１／ＣＫとＣＨ２ドメイン間に図形で示されている）及びＣＨ１とＣＫドメインとの間の鎖間結合は鎖間ジスルフィド結合である。ヘテロ三量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ−ＣＨ２−ＣＨ３、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１
タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、３７ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６９（第２鎖）、１７０（第１鎖）、及び１７１（第３鎖）に示されている。
形態６（Ｆ６）：ＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３
ヘテロ三量体Ｆ６ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｄに示されている。Ｆ６タンパク質は、Ｆ５と同じであるが、Ｎ連結グリコシル化を防止するためのＮ２９７Ｓ置換を有する。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、１２ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１７２（第２鎖）、１７３（第１鎖）、及び１７４（第３鎖）に示されている。
形態７（Ｆ７）：ＣＤ１９−Ｆ７−ＮＫｐ４６−３
ヘテロ三量体Ｆ７ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｄに示されている。Ｆ７タンパク質は、Ｆ６と同じであるが、中心鎖とＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１鎖との二量体種の少数集団の形成を防止するために、それらのＣ末端でＦｃドメインに連結されたＣＨ１及びＣＫドメインにシステインのセリンでの置換を有する。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、１１ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１７５（第２鎖）、１７６（第１鎖）、及び１７７（第３鎖）に示されている。
形態１３（Ｆ１３）：ＣＤ１９−Ｆ１３−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１３ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｄに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合（鎖上のＣＨ１／ＣＫとＣＨ２ドメイン間に示されている）及びＣＨ１とＣＫドメイン間の鎖間結合は、鎖間ジスルフィド結合である。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−（ＶＨ−ＶＫ）抗ＮＫｐ４６、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ−ＣＨ２−ＣＨ３。
（ＶＨ−ＶＫ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶＫ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。
タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、６．４ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。２つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１７８（第２鎖）及び１７９（第１鎖）に示されている。
形態１４（Ｆ１４）：ＣＤ１９−Ｆ１４−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１４ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｅに示されている。Ｆ１４ポリペプチドは、Ｆ１３形態の構造を共有する二量体ポリペプチドであるが、野生型Ｆｃドメイン（ＣＨ２−ＣＨ３）の代わりに、Ｆ１４は、Ｎ連結グリコシル化をなくすためにＣＨ２ドメイン変異Ｎ２９７Ｓを有する。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２．４ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。２つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１８０（第２鎖）及び１８１（第１鎖）に示されている。
形態１５（Ｆ１５）：ＣＤ１９−Ｆ１５−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１５ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｅに示されている。Ｆ１５ポリペプチドは、Ｆ６形態の構造を共有するが、中心鎖と第２鎖との間のＮ末端ＶＨ−ＣＨ１とＶＫ−ＣＫ単位とが逆であるため異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、０．９ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１８２（第２鎖）、１８３（第１鎖）、及び１８４（第３鎖）に示されている。
形態１６（Ｆ１６）：ＣＤ１９−Ｆ１６−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１６ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｅに示されている。Ｆ１６ポリペプチドは、Ｆ６形態の構造を共有するが、中心鎖と第２鎖との間のＣ末端ＶＨ−ＣＫとＶＫ−ＣＨ１単位とが逆であるため異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１８５（第２鎖）、１８６（第１鎖）、及び１８７（第３鎖）に示されている。
実施例５：
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、二重特異的タンパク質によるＮＫｐ４６結合親和性
Ｂａｃｏｒｅ Ｔ１００の一般的な手順及び試薬
ＳＰＲ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、２５℃で行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＮａＯＨ １０ｍＭは、それぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。プロテインＡを（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から購入した。ヒトＮＫｐ４６組換えタンパク質を、クローニングし、産生し、且つＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａで精製した。
プロテインＡの固定化
プロテインＡタンパク質を、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。プロテインＡを、結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
結合試験
まず、二重特異的タンパク質を、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４の抗体からの異なる抗ＮＫｐ４６可変領域を有する実施例２に記載の形態Ｆ１で試験した。次に、抗体を、ＮＫｐ４６−３抗体からの抗ＮＫｐ４６可変領域を有する異なる形態Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ１４として試験し、完全長ヒトＩｇＧ１のようなＮＫｐ４６−３抗体と比較した。
二重特異的タンパク質を１μｇ／ｍＬで、プロテインＡチップ上で捕捉し、組換えヒトＮＫｐ４６タンパク質を、５μｇ／ｍＬで、捕捉した二重特異的抗体に注入した。ブランク差し引きのために、サイクルを再び行って、ＮＫｐ４６タンパク質を泳動用緩衝液に替えた。
Ｂａｂ２８１抗体を、ＳＰＲによってＮＫｐ４６に対する結合性について別個に試験し、さらに細胞表面にヒトＮＫｐ４６構築物を発現する細胞株を用いてフローサイトメトリーによって試験した。ＦＡＣＳスクリーニングのために、上清中の反応抗体の存在を、ＰＥで標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）によって明らかにした。ＳＰＣ及びＦＡＣＳの結果は、Ｂａｂ２８１ベースの抗体が、ＮＫｐ４６細胞株にもＮＫｐ４６ Ｆｃタンパク質にも結合しないことを示した。Ｂａｂ２８１は、二重特異的形態で存在する場合、その標的に対する結合性を失った。
親和性試験
一価親和性試験を、製造者（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｗｉｚａｒｄ）が推奨する正規のＣａｐｔｕｒｅ−Ｋｉｎｅｔｉｃプロトコルに従って行った。６２．５〜４００ｎＭの範囲のヒトＮＫｐ４６組換えタンパク質の７段階希釈物を、捕捉した二重特異的抗体に連続的に注入し、再生の１０分前に解離させた。全てのセンサーグラムのセットを、１：１動態結合モデルを用いてフィッティングした。
結果
ＳＰＲは、ＮＫｐ４６−１、２、３、及び４ ｓｃＦｖ結合ドメインを有する形態Ｆ１の二重特異的ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合したが、他の抗ＮＫｐ４６抗体のｓｃＦｖを有する他の二重特異的ポリペプチドは、ＮＫｐ４６結合性を維持しなかったことを示した。単量体二重特異的形態で結合性を維持しなかった結合ドメインは、当初はＮＫｐ４６に結合したが、二重特異的形態への変換時に結合性を失った。形態Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ１４の二重特異的ポリペプチドの全ては、ＮＫｐ４６−３可変領域を用いる場合にＮＫｐ４６に対する結合性を維持した。
図７Ａは、図７Ｂのそれぞれの差し引きセンサーグラムを作成するために使用された生データ曲線、サンプル（ＣＤ１９−Ｆ１−ＮＫｐ４６−１）、及びブランク（緩衝液）を示す代表定な重畳センサーグラムを示す。差し引きセンサーグラムは、サンプルのセンサーグラムからブランクのセンサーグラムを差し引くことによって得た。センサーグラムは、ブランク差し引きの前の捕捉ステップの注入の開始時にｙ軸及びｘ軸で０に合わせた。
図７Ｂは、ＣＤ１９−Ｆ１−ＮＫｐ４６−１組換えタンパク質の捕捉された二重特異的単量体ポリペプチドに対する結合を示す代表的な重畳差し引きセンサーグラムを示す。センサーグラムは、サンプルステップの注入の開始時にｙ軸及びｘ軸で０に合わせた。
一価親和性並びに動力学的結合及び解離速度定数が以下の表３に示されている。
Figure 0006822849
実施例６：
Ｄａｕｄｉ腫瘍標的に対するＮＫ細胞とＦｃ含有ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質との結合
単量体Ｆｃドメイン及び実施例３に記載の一本鎖Ｆ１又は二量体Ｆ２形態に従って配置されたドメイン、及びＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４をベースとするＮＫｐ４６結合領域を有する二重特異的抗体を、ＮＫ細胞にＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｂリンパ芽球細胞株によって十分に特徴付けられるＤａｕｄｉ）を溶解させる機能的能力について試験した。Ｆ２タンパク質は、ｓｃＦｖ形態ではＮＫｐ４６に対する結合性を失うが、Ｆ２のＦ（ａｂ）様形態では結合性を維持するＮＫｐ４６−９の可変領域をさらに含んでいた。
簡単に述べると、（ａ）静止ヒトＮＫ細胞、及び（ｂ）ヒトＮＫｐ４６でトランスフェクトされたヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１のそれぞれの細胞溶解活性を、Ｕ底９６ウェルプレートで、典型的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞を５１Ｃｒ（５０μＣｉ（１．８５ＭＢｑ）／１×１０６細胞）で標識し、次いで、異なる濃度の単量体二重特異的抗体の存在下で、ＫＨＹＧ−１では５０、静止ＮＫ細胞では（Ｆ１タンパク質に対して）１０又は（Ｆ２タンパク質に対して）８．８に等しいエフェクター／標的比で、ｈＮＫ４６でトランスフェクトされたＫＨＹＧ−１と混合した。短時間の遠心分離及び３７℃で４時間のインキュベーション後、上清のサンプルを取り出して、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移し、５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ ベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）での標的細胞の溶解によって得られ、自然放出は、培地（エフェクターもＡｂｓも含まない）中の標的細胞に一致する。
結果
ＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６ ＮＫ実験モデルでは、各二重特異的抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９が、陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）及びＣＤ１９／ＣＤ３二重特異的抗体）と比較して、ヒトＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６ ＮＫ細胞株によるＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、これらの抗体が、ＣＤ１９／ＮＫｐ４６架橋によってＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６によるＤａｕｄｉ標的細胞の溶解を誘導することが示された。
静止ＮＫ細胞をエフェクターとして使用したときに、各二重特異的抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９が同様に、陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体）と比較して、ヒトＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、これらの抗体が、ＣＤ１９／ＮＫｐ４６架橋によってヒトＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ標的細胞の溶解を誘導することが示された。リツキシマブ（ＲＴＸ、キメラＩｇＧ１）を、静止ヒトＮＫ細胞によるＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）の陽性対照として使用した。ＲＴＸ（このアッセイでは１０μｇ／ｍｌで）で得られた最大応答は、２１．６％の特異的溶解であり、二重特異的抗体が高い標的細胞溶解活性を有することを例証した。静止ＮＫ細胞での実験の結果は、一本鎖Ｆ１タンパク質については図８Ａに示され、二量体Ｆ２タンパク質については図８Ｂに示されている。
実施例７：
完全長抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂと枯渇抗腫瘍ｍＡｂとの比較：ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質が非特異的ＮＫ活性化を防止する
これらの試験は、二重特異的抗体が、非特異的ＮＫ細胞の活性化を引き起こすことなく、癌標的細胞に対するＮＫｐ４６媒介ＮＫ活性化を媒介できるか否かを調べることを目的とした。
ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３に記載のＦ２形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質を、以下と比較した：
（ａ）完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体（ヒトＩｇＧ１のようなＮＫｐ４６−３）、及び
（ｂ）ＡＤＣＣ誘導抗体対照比較（ＡＤＣＣ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）としての完全長ヒトＩｇＧ１のような抗ＣＤ１９抗体。
実験は、対照として以下をさらに含んでいた：リツキシマブ、高い発現レベルを有する標的抗原の抗ＣＤ２０ ＡＤＣＣ誘導抗体対照；抗ＣＤ５２抗体アレムツヅマブ、標的細胞及びＮＫ細胞の両方に存在するＣＤ５２標的に結合するヒトＩｇＧ１；並びに陰性対照アイソタイプ対照治療抗体（標的細胞（ＨＵＧ１−ＩＣ）に存在する標的に結合しないヒトＩｇＧ１）。
様々なタンパク質を、ＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）の存在下、ＣＤ１９陰性ＣＤ１６陽性標的細胞（ＨＵＴ７８ Ｔリンパ腫細胞）の存在下、且つ標的細胞の非存在下でのＮＫ細胞の活性化に対する機能的な影響について試験した。
簡単に述べると、ＮＫ活性化を、フローサイトメトリーによって、ＮＫ細胞でのＣＤ６９及びＣＤ１０７の発現を評価することによって試験した。アッセイは、完全ＲＰＭＩ、１５０μＬ最終／ウェルで、９６Ｕウェルプレートで行った。エフェクター細胞は、ドナーから精製した新鮮なＮＫ細胞とした。標的細胞は、Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９−陽性）、ＨＵＴ７８（ＣＤ１９−陰性）、又はＫ５６２（ＮＫ活性化対照細胞株）とした。Ｋ５６２陽性対照に加えて、以下の３つの条件を試験した。
＞ＮＫ細胞のみ
＞ＮＫ細胞対Ｄａｕｄｉ（Ｃ１９＋）
＞ＮＫ細胞対ＨＵＴ７８（ＣＤ１９−）
エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比は、２．５：１（５０，０００Ｅ：２０，０００Ｔ）とし、抗体の希釈範囲は、１／４希釈で１０μｇ／ｍＬから始めた（ｎ＝８の濃度）。抗体、標的細胞、及びエフェクター細胞を混合し、３００ｇで１分間回転させ、３７℃で４時間インキュベートし、５００ｇで３分間回転させ、染色緩衝液（ＳＢ）で２回洗浄し、５０μＬの染色Ａｂミックスを加え、３００ｇで３０分間インキュベートし、ＣｅｌｌＦｉｘを含むＳＢ再懸濁ペレットで２回洗浄し、４℃で一晩保存し、Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＨＴＳ）で蛍光を明らかにした。
結果
１．ＮＫ細胞のみ
結果は図９Ａに示されている。標的抗原発現細胞の非存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の可変領域のそれぞれを含む）はいずれも、ＣＤ６９又はＣＤ１０７の発現による評価によるとＮＫ細胞を活性化しなかった。完全長抗ＣＤ１９もＮＫ細胞を活性化しなかった。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体は、ＮＫ細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アレムツヅマブも非常に高いレベルでＮＫ細胞の活性化を誘導した。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
２．ＮＫ細胞対Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９＋）
結果は図９Ｂに示されている。標的抗原発現細胞の存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の結合ドメインのそれぞれを含む）は全て、ＮＫ細胞を活性化した。完全長抗ＣＤ１９は、最良でも非常に低いＮＫ細胞の活性化のみを示した。完全長抗ＮＫｐ４６抗体もアレムツヅマブも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性化を超えた活性化の実質的な増加を示さなかった。図９は、完全長抗ＮＫｐ４６抗体が、ＮＫ細胞のみの存在下で観察されたベースライン活性化と同様のレベルを示すことを示す。アレムツヅマブも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性と同様のレベルのＮＫ細胞の活性化を誘導し、この設定のより高い抗体濃度（ＥＴ ２．５：１）では、活性化は、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体を用いたときよりも高かった。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
３．ＮＫ細胞対ＨＵＴ７８（ＣＤ１９−）
結果は図９Ｃに示されている。標的抗原陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の可変領域のそれぞれを含む）は全て、ＮＫ細胞を活性化した。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツヅマブは、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された同様のレベルでＮＫ細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
結論として、二重特異的抗ＮＫｐ４６タンパク質は、完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体、及び標的細胞の非存在下で同様にＮＫ細胞を活性化する枯渇ＩｇＧアイソタイプの完全長抗体とは異なり、標的細胞特異的にＮＫ細胞を活性化することができる。抗ＮＫｐ４６二重特異的タンパク質で達成されるＮＫ細胞の活性化は、完全長抗ＣＤ１９ ＩｇＧ１抗体で観察される活性化よりも高かった。
実施例８：
低いＥＴ比での枯渇抗腫瘍ｍＡｂ：ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質の効果の比較
これらの試験は、二重特異的抗体が、低いエフェクター：標的比で、癌標的細胞に対するＮＫｐ４６媒介ＮＫ細胞活性化を媒介できるか否かを調べることを目的とした。この実施例に使用されるＥＴ比は、実施例７で使用された２．５：１のＥＴ比又は実施例６の１０：１のＥＴ比よりもｉｎ ｖｉｖｏで遭遇するであろう設定に近いと考えられる１：１とした。
ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３に記載のＦ２形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質を、以下と比較した：
（ａ）完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体（ヒトＩｇＧ１のようなＮＫｐ４６−３）、及び
（ｂ）ＡＤＣＣ誘導抗体対照比較としての完全長ヒトＩｇＧ１のような抗ＣＤ１９抗体。
実験は、対象として以下をさらに含んでいた：リツキシマブ（高い発現レベルを有する標的抗原の抗ＣＤ２０ ＡＤＣＣ誘導抗体対照）；抗ＣＤ５２抗体アレムツヅマブ（標的細胞及びＮＫ細胞の両方に存在するＣＤ５２標的に結合するヒトＩｇＧ１）、並びに陰性対照アイソタイプ対照治療抗体（標的細胞（ＨＵＧ１−ＩＣ）に存在する標的に結合しないヒトＩｇＧ１）。様々なタンパク質を、ＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）の存在下、ＣＤ１９陰性ＣＤ１６陽性標的細胞（ＨＵＴ７８ Ｔリンパ腫細胞）の存在下、且つ標的細胞の非存在下でのＣＤ６９又はＣＤ１０７の発現により評価される、ＮＫ細胞活性化に対する機能的な影響について試験した。これらの実験は、ＥＴ比を１：１としたことを除いて実施例７と同様に行った。
結果
結果は図１０に示されている（図１０Ａ：ＣＤ１０７及び図１０Ｂ：ＣＤ６９）。標的抗原発現細胞の存在下では、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の可変領域のそれぞれを含む）は全て、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化した。
Ｄａｕｄｉ細胞の存在下で二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体によって誘導される活性化は、この設定で低い活性を有するＡＤＣＣ誘導抗体のような完全長ヒトＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体よりも遥かに強力であった。さらに、この低いＥ：Ｔ比の設定では、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体によって誘導される活性化は、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブと同程度に強力であり、差異は、差異が２．５：１のＥＴ比で観察された濃度よりも１０倍高い最高濃度でのみ観察された。
標的細胞の非存在下又は標的抗原陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下では、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツヅマブは、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下で観察されたベースライン活性化と同様のレベルを示した。抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体は、ＨＵＴ７８細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化しなかった。
結論として、二重特異的抗ＮＫｐ４６タンパク質は、標的細胞特異的にＮＫ細胞を活性化することができ、より低いエフェクター：標的比は、ＮＫ細胞の活性化の媒介において従来のヒトＩｇＧ１抗体よりも有効である。
実施例９：
動作機序の試験
ＮＫｐ４６−３からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３又は４に記載のＦ２、Ｆ３、Ｆ５、又はＦ６形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９二重特異的抗体を、ＣＤ１６−／ＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞株にＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞を溶解させる機能的能力について、リツキシマブ（抗ＣＤ２０ ＡＤＣＣ誘導抗体）、及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較した。
簡単に述べると、ＣＤ１６−／ＮＫｐ４６＋ヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１の細胞溶解活性を、Ｕ底９６ウェルプレートで、典型的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞又はＢ２２１細胞を５１Ｃｒ（５０μＣｉ（１．８５ＭＢｑ）／１×１０６細胞）で標識し、次いで、１／５希釈（ｎ＝８の濃度）で１０−７ｍｏｌ／ｍＬから始まる希釈範囲の試験抗体の存在下、５０：１に等しいエフェクター／標的比でＫＨＹＧ−１と混合した。
短時間の遠心分離及び３７℃で４時間のインキュベーション後、５０μＬの上清を取り出して、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移し、５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）での標的細胞の溶解によって得られ、自然放出は、培地（エフェクターもＡｂｓも含まない）中の標的細胞に一致する。
結果
結果は、図１１Ａ（ＫＨＹＧ−１対Ｄａｕｄｉ）及び図１１Ｂ（ＫＨＹＧ−１対Ｂ２２１）に示されている。ＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６ ＮＫ実験モデルでは、各ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質（形態Ｆ２、Ｆ３、Ｆ５、及びＦ６）は、ヒトＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６ ＮＫ細胞株によるＤａｕｄｉ細胞又はＢ２２１細胞の特異的溶解を誘導したが、リツキシマブ及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体は誘導しなかった。
実施例１０：
様々な二重特異的形態のＦｃＲｎに対する結合性
様々な抗体形態のヒトＦｃＲＮに対する親和性を、実施例２〜６に記載されているように、組換えＦｃＲｎタンパク質をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定化することによって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって試験した。
ヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラ完全長抗ＣＤ１９抗体、及びＮＫｐ４６−３（Ｆ２ではＮＫｐ４６−２）からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３又は４に記載のＦ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、又はＦ１４形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質をそれぞれの分析物について試験し、全てのセンサーグラムを、定常状態又は１：１のＳＣＫ結合モデルを用いてフィッティングした。
結果は以下の表４に示されている。二量体Ｆｃドメイン（形態Ｆ５、Ｆ６、Ｆ１３、Ｆ１４）を有する二重特異的タンパク質は、完全長ＩｇＧ１抗体の親和性と同様の親和性でＦｃＲｎに結合した。単量体Ｆｃドメイン（Ｆ３、Ｆ４、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１）を有する二重特異的タンパク質もＦｃＲｎに対する結合性を示したが、二量体Ｆｃドメインを有する二重特異的タンパク質よりも低い結合性であった。
Figure 0006822849
実施例１１
Ｆｃγに対する結合性
ここでは２つのｓｃＦｖである２つの抗原結合ドメイン間に配置されたそのＣＨ２−ＣＨ３ドメインを有する抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＮＫｐ４６を、このような二重特異的単量体Ｆｃタンパク質が、Ｆｃγ受容体に対する結合性を維持できるか否かを決定するために評価した。
ヒトＩＧＧ１抗体及びＣＤ１９／ＮＫｐ４６−１二重特異的抗体をＣＭ５チップに固定した。組換えＦｃγＲ（カニクイザル及びヒトＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、及びＣＤ１６）をクローニングし、産生し、且つＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａで精製した。図１８は、固定化ヒトＩｇＧ１対照（灰色）及びＣＤ１９／ＮＫｐ４６−１二重特異的抗体（黒色）に対するカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）組換えＦｃｇＲ（上のパネル；ＣｙＣＤ６４、ＣｙＣＤ３２ａ、ＣＹＣＤ３２ｂ、ＣｙＣＤ１６）及びヒト組換えＦｃｇＲ（下のパネル；ＨｕＣＤ６４、ＨｕＣＤ３２ａ、ＨｕＣＤ３２ｂ、ＨｕＣＤ１６ａ）の結合性を示す重畳センサーグラムを示す。センサーグラムは、サンプルの注入開始時にｙ軸及びｘ軸で０に合わせた。
図１８は、完全長野生型ヒトＩｇＧ１が全てのカニクイザル及びヒトＦｃγ受容体に結合したが、ＣＤ１９／ＮＫｐ４６−１二重特異的抗体がいずれの受容体にも結合しなかったことを示す。
実施例１２：
抗ＮＫｐ４６抗体のエピトープマッピング
Ａ．競合アッセイ
競合アッセイを、以下に記載の方法に従って表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって行った。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００の一般的な手順及び試薬
ＳＰＲ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、２５℃で行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＮａＯＨ １０ｍＭ ＮａＣｌ ５００ｍＭがそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。抗６ｘＨｉｓ標識抗体をＱＩＡＧＥＮから購入した。ヒト６ｘＨｉｓ標識ＮＫｐ４６組換えタンパク質（ＮＫｐ４６−Ｈｉｓ）をクローニングし、産生し、且つＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａで精製した。
抗６ｘＨＩｓ標識抗体の固定化
抗Ｈｉｓ抗体を、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。プロテインＡ及び抗Ｈｉｓ抗体を、結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２０００〜２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
競合試験
ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４に一致するＮＫｐ４６結合領域を有する正常なヒトＩｇＧ１キメラ親抗体を、抗６ｘＨｉｓ標識抗体チップを用いて行われた競合試験に使用した。
１μｇ／ｍＬの、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４をベースとするＮＫｐ４６結合領域を有する二重特異的抗体を、プロテインＡチップで捕捉し、組換えヒトＮＫｐ４６タンパク質を、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４の群の第２の試験二重特異的抗体と共に５μｇ／ｍＬで注入した。
ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４のいずれも、ＮＫｐ４６に対する結合について互いに競合せず、これらの抗体はそれぞれ異なるエピトープを表している。
Ｂ．ＮＫｐ４６変異体に対する結合性
抗ＮＫｐ４６抗体のエピトープを定義するために、本発明者らは、ＮＫｐ４６の２つのドメイン上の分子表面に露出された１つ、２つ、又は３つのアミノ酸置換によって定義されるＮＫｐ４６変異体を設計した。このアプローチにより、以下の表に示されている、Ｈｅｋ−２９３Ｔ細胞でトランスフェクトされた４２の変異体が作製された。以下の表５の標的アミノ酸変異は共に、配列番号１の付番を用いて示されている（Ｊａｒｏｎ−Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８８（１２）：６１６５−７４で使用された付番にも一致している）。
Figure 0006822849
変異体の生成
ＮＫｐ４６変異体をＰＣＲによって生成した。増幅された配列をアガロースゲルにかけて、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（参照番号７４０６０９）を用いて精製した。次いで、それぞれの変異体について生成された２つ又は３つの精製ＰＣＲ産物を、ＣｌｏｎＴｅｃｈ ＩｎＦｕｓｉｏｎシステムで発現ベクターに連結した。変異配列を含むベクターを、Ｍｉｎｉｐｒｅｐで調製し、配列決定した。配列決定後、変異配列を含むベクターを、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを用いてＭｉｎｉｐｒｅｐで調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いてベクターでトランスフェクトし、導入遺伝子発現の試験前にＣＯ２インキュベーターで、３７℃で２４時間インキュベートした。
抗ＮＫｐ４６のＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクト細胞に対する結合性のフローサイトメトリー分析
全ての抗ＮＫｐ４６抗体を、それらのそれぞれの変異体に対する結合性についてフローサイトメトリーによって試験した。１つ又はいくつかの変異体に対する結合性をある濃度（１０μｇ／ｍｌ）で失う抗体を決定するために最初の実験を行った。結合性の消失を確認するために、抗体の滴定を、結合性がＮＫｐ４６変異体（１〜０，１〜０．０１〜０．００１μｇ／ｍｌ）によって影響を受けると思われる抗体に対して行った。
結果
結果は図１２〜図１７に示されている。抗体ＮＫｐ４６−１は、（図１２Ｂ（変異体２）と比較して図１２Ａ（ＮＫｐ４６野生型）に示されているように、残基Ｋ４１、Ｅ４２、及びＥ１１９に変異を有する）変異体２に対して低い結合性を有していた。同様に、ＮＫｐ４６−１はまた、（図１３Ｂ（変異Ｓｕｐｐ７）と比較して図１３Ａ（ＮＫｐ４６野生型）に示されているように、残基Ｙ１２１及びＹ１９４に変異を有する）追加変異Ｓｕｐｐ７に対して低い結合性を有していた。
抗体ＮＫｐ４６−３は、（図１５Ｂ（変異体１９）と比較して図１５Ａ（ＮＫｐ４６野生型）に示されているように、残基Ｉ１３５及びＳ１３６に変異を有する）変異体１９に対して低い結合性を有していた。同様に、ＮＫｐ４６−１はまた、（図１４Ｂ（変異Ｓｕｐｐ８）と比較して図１４Ａ（ＮＫｐ４６野生型）に示されているように、残基Ｐ１３２及びＥ１３３に変異を有する）追加変異Ｓｕｐｐ８に対して低い結合性を有していた。
抗体ＮＫｐ４６−４は、（図１６Ｂ（変異体６）と比較して図１６Ａ（ＮＫｐ４６野生型）に示されているように、残基Ｒ１０１及びＶ１０２に変異を有する）変異体６に対して低い結合性を有していた。同様に、ＮＫｐ４６−１はまた、（図１７Ｂ（変異Ｓｕｐｐ６）と比較して図１７Ａ（ＮＫｐ４６野生型）に示されているように、残基Ｅ１０４及びＬ１０５に変異を有する）追加変異Ｓｕｐｐ６に対して低い結合性を有していた。
この試験では、本発明者らは、抗ＮＫｐ４６抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−３、及びＮＫｐ４６−４）のエピトープを特定した。ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−３、及びＮＫｐ４６−１のエピトープは、それぞれＮＫｐ４６のＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、及びＤ１／Ｄ２接合部にある。Ｒ１０１、Ｖ０１２、Ｅ１０４、及びＬ１０５は、ＮＫｐ４６結合性に不可欠の残基であり、ＮＫｐ４６−４のエピトープの一部と定義される。ＮＫｐ４６−１のエピトープは、Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１、及びＹ１９４残基を含む。ＮＫｐ４６−３のエピトープは、Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５、及びＳ１３６残基を含む。
実施例１３：
既存の形態と比較して改善された様々な二重特異的形態の産生プロフィール及び産生収率
ブリナツモマブ、並びにＦ１〜Ｆ７形態及びＮＫｐ４６−３をベースとするＮＫｐ４６及びＣＤ１９結合領域を有する２つの二重特異的抗体、並びにブリナツモマブをそれぞれ同じプロトコルに従って、同じ発現系を用いて形態６（Ｆ６）、ＤＡＲＴ形態、及びＢＩＴＥ形態の下でクローニングし、産生した。Ｆ６、ＤＡＲＴ、及びＢＩＴＥ二重特異的タンパク質を、Ｆ６にはｐｒｏｔ−Ａビーズを用い、ＤＡＲＴ及びＢＩＴＥにはＮＩ−ＮＴＡビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。精製されたタンパク質をさらに分析し、且つＳＥＣによって精製した（図１９Ａ）。ＢＩＴＥ及びＤＡＲＴは、Ｆ６と比較して非常に低い産生収率を示し、非常に複雑なＳＥＣプロフィールを有していた。図１９Ｂ（矢印）に示されているように、ＤＡＲＴ及びＢＩＴＥは、予想ＳＥＣ画分（ＢＩＴＥでは３及び４、ＤＡＲＴでは４及び５）でのクマーシー染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによってわずかに検出可能であり、Ｆ６形態は、多量体二重特異的タンパク質を含む主ピーク（画分３）を有する、明確で単純なＳＥＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを示した。Ｆ６形態の主ピークは、全タンパク質の約３０％に一致する。これらの観察は、Ｆ１〜Ｆ１７タンパク質にも当てはまり（データは不図示）、これらの形態中に存在するＦｃドメイン（又はＦｃ由来ドメイン）が産生を促進し、二重特異的タンパク質の質及び溶解性を改善することを示唆している。
さらに、タンパク質Ｆ１〜Ｆ１７中に存在するＦｃドメインは、例えば、プロテインＡによって精製することができないＢｉＴｅ及びＤＡＲＴ抗体の場合、治療製品の不所望の部分として後に残存するペプチドタグの組み込みを必要とすることなく、アフィニティークロマトグラフィーに適応しているという利点を有する。Ｆ１〜Ｆ１７抗体は全て、プロテインＡに結合される。以下の表６は、様々な形態の産生性を示す。
Figure 0006822849
表題及び副題は、本明細書では便宜のためにのみ使用され、本発明を限定すると決して一切解釈するべきではない。上述の要素の全ての可能なバリエーションでのあらゆる組み合わせが、本明細書に特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、本発明に包含される。本明細書で述べられた値の範囲は、本明細書に特段の記載がない限り、範囲内に含まれるそれぞれの別個の値について個々に述べられる省略方法の役割を単に果たすものであり、それぞれの別個の値は、本明細書で個々に述べられたかのように本明細書に包含される。特段の記載がない限り、本明細書に記載される全ての正確な値は、対応するおおよその値を代表する（例えば、特定の因子又は測定値に関して記載される全ての正確な例示的な値は、適切な場合は「約」によって変更される、対応するおおよその測定値を示すものと見なすことができる）。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、任意の適切な順序で行うことができる。
本明細書に記載されるあらゆる例又は例示的な語（例えば、「〜など」）の使用は、単に本発明をより明確にするためのものであり、特段の記載がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明確な記載がない限り、いずれの要素も本発明の実施に不可欠であることを示すと解釈される語は本明細書には存在しない。
語、例えば、１つ又は複数の要素を指す語を用いた、本発明の任意の態様又は実施形態の本明細書の説明は、特段の記載がない限り、又は文脈から明確に他の旨である場合を除き、その１つ又は複数の特定の要素「からなる」、「から実質的になる」、又は「を実質的に含む」本発明の同様の態様又は実施形態を支援するためである（例えば、特定の要素を含むとして本明細書に記載される組成物は、特段の記載がない限り、又は文脈から明確に他の旨である場合を除き、その要素からなる組成物の記載でもあることを理解されたい）。
本発明は、適用される法律によって許容される最大程度まで、本明細書に記載される態様又は請求項で述べられる主題の全ての変更形態及び均等物を含む。
本明細書で述べられる全ての刊行物及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が、参照により含められると具体的且つ個別に示されたかのように、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる。
前述の発明は、理解を明確にするために例示及び例によってある程度詳細に説明されたが、当業者であれば、添付の特許請求の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の変形形態及び変更形態をなし得ることが本発明の教示から明白であろう。

Claims (47)

  1. 第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインを含む単離された多重特異的タンパク質であって、前記第１又は第２の抗原結合ドメインの一方がヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する、Ｆａｂ又はリンカーによって分離される可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（”ｓｃＦｖ”）を含み、且つ他方が目的の抗原に結合し、前記多重特異的タンパク質が一価で前記ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、前記多重特異的タンパク質が、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞に前記目的の抗原を発現する標的細胞を溶解させることができ、前記タンパク質が、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができ、且つ完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体に対して低い結合性を有するヒトＦｃドメインを少なくとも含み、
    ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する前記抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号３の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３、並びに配列番号４の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３、
    （ｂ）配列番号５の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３、並びに配列番号６の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３、
    （ｃ）配列番号７の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３、並びに配列番号８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３、
    （ｄ）配列番号９の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３、並びに配列番号１０の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３、又は
    （ｆ）配列番号１３の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３、並びに配列番号１４の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３
    を含み、ここにＣＤＲはＫａｂａｔにしたがって定められる、
    単離された多重特異的タンパク質。
  2. 前記標的細胞の前記溶解がＮＫｐ４６シグナル伝達によって媒介される、請求項１に記載の多重特異的タンパク質。
  3. 前記多重特異的タンパク質が、前記目的の抗原を発現する細胞の非存在下で、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞と共にインキュベートされたときに前記ＮＫ細胞の活性化をもたらさない、請求項１又は２に記載の多重特異的タンパク質。
  4. 前記多重特異的タンパク質が、前記目的の抗原を発現する細胞の存在下で、ＮＫｐ４６陰性、ＣＤ１６陽性リンパ球と共にインキュベートされたときに前記ＮＫ細胞の活性化をもたらさない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  5. 前記多重特異的タンパク質が、（ａ）ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞及び標的細胞と共にインキュベートされたときにＮＫ細胞を活性化し、且つ（ｂ）標的細胞の非存在下でＮＫ細胞と共にインキュベートされたときにＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞を活性化しない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  6. 前記多重特異的タンパク質が、Ｆｃγ発現細胞の存在下で、ＮＫ細胞及び標的細胞と共にインキュベートされたときにＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞の活性化をもたらさない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  7. 前記ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  8. 前記タンパク質が、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができ、且つ完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体に対して低い結合性を有するように改変された、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  9. 前記Ｆｃドメインが前記２つの抗原結合ドメイン間に配置されている、請求項８に記載の多重特異的タンパク質。
  10. 前記多重特異的タンパク質が、
    ａ．残基Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４、及び／又はＬ１０５に変異を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチド、
    ｂ．残基Ｋ４１、Ｋ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１、及び／又はＹ１９４のいずれか１つ以上に変異を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチド、及び
    ｃ．残基Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５、及び／又はＳ１３６のいずれか１つ以上に変異を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチド
    からなる群から選択される変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して低い結合性を有し、各場合において、前記結合性の低下が野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドと比較される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  11. 前記タンパク質がヒトＦｃγ受容体に対する結合性を実質的に欠いている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  12. 前記多重特異的タンパク質が、（ａ）ＮＫｐ４６に結合する第１の抗原結合ドメイン、（ｂ）標的細胞で発現されるポリペプチドに結合する第２の抗原結合ドメイン、及び（ｃ）ヒトＦｃドメインを含む一本鎖タンパク質であり、前記多重特異的ポリペプチドがヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができ、且つ完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体に対して低い結合性を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  13. 前記Ｆｃドメインが、（ｉ）ＣＨ２ドメイン、及び（ｉｉ）ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するためのアミノ酸変異を有するＣＨ３ドメインを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  14. 前記ＣＨ３ドメインが、Ｌ３５１位、Ｔ３６６位、Ｌ３６８位、Ｐ３９５位、Ｆ４０５位、Ｔ４０７位、及び／又はＫ４０９位（Ｋａｂａｔと同様のＥＵ付番）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つにアミノ酸置換を含む、請求項１３に記載の多重特異的タンパク質。
  15. 前記Ｆｃドメインが、（ｉ）ＣＨ２ドメイン、及び（ｉｉ）リンカーペプチドによって分離された第１及び第２のＣＨ３ドメインを含み、前記２つのＣＨ３ドメインが、非共有相互作用によって互いに結合している、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  16. 前記タンパク質が、前記第１の抗原結合ドメインと前記第２の抗原結合ドメインとの間に配置されたＦｃドメインを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  17. 前記タンパク質が、ドメイン配置：（ＡＢＤ１）−ＣＨ２−ＣＨ３−（ＡＢＤ２）を有するポリペプチドを含む、請求項１６に記載の多重特異的タンパク質。
  18. 前記タンパク質が、ドメイン配置：（ＡＢＤ１）−リンカー−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−（ＡＢＤ２）を有するポリペプチドを含む、請求項１６又は１７に記載の多重特異的タンパク質。
  19. 前記タンパク質が、ドメイン配置：（ＡＢＤ１）−リンカー−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−リンカー−（ＡＢＤ２）を有するポリペプチドを含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  20. 前記タンパク質が、単離されたヘテロ二量体ポリペプチドであり、前記ヘテロ二量体ポリペプチドが、
    （ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、第２の可変ドメイン及び第３の可変ドメイン、Ｆｃドメイン、第１の可変ドメイン（Ｖ）、並びにＣＨ１又はＣＫ定常領域を含む、第１のポリペプチド鎖、及び
    （ｂ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、第１の可変ドメイン（Ｖ）、及びＣＨ１又はＣＫ定常領域を含む、第２のポリペプチド鎖、ここに、該ＣＨ１又はＣＫ定常領域は、前記第１及び第２のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、前記第１のポリペプチド鎖の前記ＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択される、
    を含み、
    前記第１のポリペプチド鎖の前記第１の可変ドメインと前記第２のポリペプチドの前記第１の可変ドメインとが、目的の第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成し、第２の可変ドメインと第３の可変ドメインとが、目的の第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  21. 前記タンパク質が、単離されたヘテロ二量体ポリペプチドであり、前記ヘテロ二量体ポリペプチドが、
    （ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、第１の可変ドメイン（Ｖ）、ＣＨ１又はＣＫ定常領域、Ｆｃドメイン、第２の可変ドメイン、及び第３の可変ドメインを含む、第１のポリペプチド鎖、及び
    （ｂ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、第１の可変ドメイン（Ｖ）、及びＣＨ１又はＣＫ定常領域を含む、第２のポリペプチド鎖、ここに、該ＣＨ１又はＣＫ定常領域は、前記第１及び第２のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、前記第１のポリペプチド鎖の前記ＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択される、
    を含み、
    前記第１のポリペプチド鎖の前記第１の可変ドメインと前記第２のポリペプチドの前記第１の可変ドメインとが、目的の第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成し、第２の可変ドメインと第３の可変ドメインとが、目的の第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  22. 前記タンパク質が、ヘテロ二量体であり、且つ、
    （ａ）Ｖａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖａ−２−Ｖｂ−２、及びＶａ−２−Ｖｂ−２−Ｆｃドメイン−Ｖａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂから選択されるドメイン配置を有する第１のポリペプチド、及び
    （ｂ）ドメイン配置：Ｖｂ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂを有する第２のポリペプチド鎖
    を含み、
    Ｖａ−１及びＶｂ−１の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、
    （ＣＨ１又はＣＫ）ｂが中心鎖上の前記（ＣＨ１又はＣＫ）ａと二量体化し、且つ前記Ｖｂ−１が前記中心鎖のＶａ−１と共に抗原結合ドメインを形成し、Ｖａ−２とＶｂ−２とが共に抗原結合ドメインを形成する、請求項１〜１１、２０、又は２１のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  23. 前記タンパク質が、ヘテロ二量体であり、且つ、
    （ａ）ドメイン配置：Ｖａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖａ−２−Ｖｂ−２を有する第１のポリペプチド、及び
    （ｂ）ドメイン配置：Ｖｂ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ−Ｆｃドメインを有する第２のポリペプチド鎖
    を含み、
    Ｖａ−１及びＶｂ−１の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、
    （ＣＨ１又はＣＫ）ｂが中心鎖上の前記（ＣＨ１又はＣＫ）ａと二量体化し、且つ前記Ｖｂ−１が前記中心鎖のＶａ−１と共に抗原結合ドメインを形成し、Ｖａ−２とＶｂ−２とが共に抗原結合ドメインを形成する、請求項１〜１１又は２１のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  24. Ｖａ−２とＶｂ−２とが共に、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインを形成する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  25. 前記タンパク質が、単離されたヘテロ三量体ポリペプチドであり、前記ヘテロ三量体ポリペプチドが、
    （ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、Ｆｃドメイン、及び第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）を含む、第１のポリペプチド鎖、
    （ｂ）第２のポリペプチド鎖であって、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記第１及び第２のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、前記第１のポリペプチド鎖の（前記第２ではなく）前記第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された可変ドメインを含む、第２のポリペプチド鎖、及び
    （ｃ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された可変ドメインを含み、該ＣＨ１又はＣＫ定常領域が、前記第１のポリペプチド鎖の（前記第１ではなく）前記第２の可変ドメイン及び第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域と相補的であるように選択される、第３のポリペプチド鎖
    を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  26. 前記タンパク質が、ヘテロ三量体であり、且つ、
    （ａ）ドメイン配置：Ｖａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖａ−２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂを有する第１のポリペプチド鎖、
    （ｂ）ドメイン配置：Ｖｂ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｃを有する第２のポリペプチド鎖、及び
    （ｃ）ドメイン配置：Ｖｂ−２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｄを有する第３のポリペプチド鎖
    を含み、
    Ｖａ−１及びＶｂ−１の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、
    （ＣＨ１又はＣＫ）ｃが中心鎖上の前記（ＣＨ１又はＣＫ）ａと二量体化し、且つ前記Ｖａ−１と前記Ｖｂ−１とが抗原結合ドメインを形成し、
    （ＣＨ１又はＣＫ）ｄが前記中心鎖上の前記（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ単位と二量体化し、且つ前記Ｖａ−２と前記Ｖｂ−２とが抗原結合ドメインを形成する、請求項１〜１１又は２５のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  27. 前記Ｆｃドメインが、（ｉ）ＣＨ２ドメイン、及び（ｉｉ）ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するためのアミノ酸変異を有するＣＨ３ドメインを含む、請求項２５又は２６に記載の多重特異的タンパク質。
  28. 前記Ｆｃドメインが、（ｉ）ＣＨ２ドメイン、及び（ｉｉ）リンカーペプチドによって分離された第１及び第２のＣＨ３ドメインを含み、前記２つのＣＨ３ドメインが、非共有相互作用によって互いに結合している、請求項２５又は２６に記載の多重特異的タンパク質。
  29. 前記タンパク質が、ヘテロ三量体であり、且つ、
    （ａ）ドメイン配置：Ｖａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖａ−２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂを有する第１のポリペプチド鎖、
    （ｂ）ドメイン配置：Ｖｂ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｃ−Ｆｃドメインを有する第２のポリペプチド鎖、及び
    （ｃ）ドメイン配置：Ｖｂ−２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｄを有する第３のポリペプチド鎖
    を含み、
    Ｖａ−１及びＶｂ−１の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、
    （ＣＨ１又はＣＫ）ｃが中心鎖上の前記（ＣＨ１又はＣＫ）ａと二量体化し、且つ前記Ｖａ−１と前記Ｖｂ−１とが抗原結合ドメインを形成し、
    （ＣＨ１又はＣＫ）ｄが前記中心鎖上の前記（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ単位と二量体化し、且つ前記Ｖａ−２と前記Ｖｂ−２とが抗原結合ドメインを形成する、請求項１〜１１又は２５のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  30. 前記タンパク質が、ヘテロニ量体であり、且つドメイン配置：
    Figure 0006822849
     を含み、Ｖａ−１、Ｖｂ−１、Ｖａ−２、及びＶｂ−２がそれぞれＶＨドメイン又はＶＬドメインであり、Ｖａ−１及びＶｂ−１の一方がＶＨであり、且つ他方がＶＬであり、それにより、Ｖａ−１とＶｂ−１とが第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方がＶＨであり、且つ他方がＶＬであり、それにより、Ｖａ−２とＶｂ−２とが第２の抗原結合ドメインを形成し、前記ＡＢＤの一方がＮＫｐ４６に結合し、且つ他方が目的の抗原に結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  31. 前記タンパク質が、異なる親抗体からの２つの軽鎖及び重鎖の対を含む四量体抗体であり、抗体がヘテロ二量体を優先的に形成するように改変ＣＨ３ドメイン界面を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  32. 前記タンパク質が、ドメイン配置：
    Figure 0006822849
     を含み、Ｖａ−１、Ｖｂ−１、Ｖａ−２、及びＶｂ−２がそれぞれＶＨドメイン又はＶＬドメインであり、Ｖａ−１及びＶｂ−１の一方がＶＨであり、且つ他方がＶＬであり、それにより、Ｖａ−１とＶｂ−１とが第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方がＶＨであり、且つ他方がＶＬであり、それにより、Ｖａ−２とＶｂ−２とが第２の抗原結合ドメインを形成し、第１鎖と第２鎖とがＣＨ３−ＣＨ３二量体化によって結合し、且つ第３鎖が第１鎖と、第４鎖が第２鎖と結合できるようにＣＨ１及びＣＫが選択される、請求項３１に記載の多重特異的タンパク質。
  33. 各抗原結合ドメインが、抗体の超可変領域を含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  34. 前記Ｆｃドメインが、ヒトＦｃγ受容体に対する結合性を低下させるためのアミノ酸置換を含むヒトＣＨ２ドメインを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  35. 標的細胞で発現される前記ポリペプチドが癌抗原である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  36. 標的細胞で発現される前記ポリペプチドが、ウイルス又は細菌抗原である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  37. ＮＫｐ４６に結合する前記抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、
    （ｂ）配列番号５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、
    （ｃ）配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、又は
    （ｄ）配列番号９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖
    を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質。
  38. ＮＫｐ４６に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、
    （ａ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、
    （ｂ）配列番号５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、
    （ｃ）配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、
    （ｄ）配列番号９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、
    （ｅ）配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号１２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖、又は
    （ｆ）配列番号１３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖、並びに配列番号１４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖
    を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  39. 前記抗体又は抗原結合ドメインが、ヒトフレームワーク領域からのフレームワーク残基を含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質又はモノクローナル抗体。
  40. 請求項１〜３９のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質又はモノクローナル抗体及び薬学的に許容され得る担体を含む、疾患の処置用の医薬組成物。
  41. 疾患の処置用の薬剤の製造における、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質又はモノクローナル抗体の使用。
  42. 前記疾患が、癌、感染疾患、又は炎症性若しくは自己免疫疾患である、請求項４０又は４１に記載の医薬組成物又は使用。
  43. 請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物又は使用であって、前記医薬組成物又は薬剤が第２の治療薬との併用で投与され、前記第２の治療薬が、抗体であって、該抗体に結合される抗原を発現する細胞に対するＡＤＣＣを媒介することができる抗体である、医薬組成物又は使用。
  44. ヘテロ二量体タンパク質を産生する方法であって、
    ａ）請求項２０〜２４又は３０のいずれか一項に記載の第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を用意するステップ、
    ｂ）請求項２０〜２４又は３０のいずれか一項に記載の第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を用意するステップ、及び
    ｃ）それぞれ前記第１及び第２の核酸を宿主細胞で発現させて、前記第１及び第２のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、産生された前記タンパク質を親和性精製支持体にローディングし、且つヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
    を含む、方法。
  45. ヘテロ三量体タンパク質を産生する方法であって、
    （ａ）請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を用意するステップ、
    （ｂ）請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を用意するステップ、
    （ｃ）請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の第３のポリペプチド鎖を含む、第３の核酸を用意するステップ、及び
    （ｄ）それぞれ前記第１、第２、及び第３の核酸を宿主細胞で発現させて、前記第１、第２、及び第３のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、産生された前記タンパク質を親和性精製支持体にローディングし、且つヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ
    を含む、方法。
  46. ポリペプチドを特定又は評価する方法であって、
    （ａ）請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異的タンパク質をコードする核酸を用意するステップ、
    （ｂ）それぞれ前記核酸を宿主細胞で発現させて、前記多重特異的タンパク質を産生し、且つ前記多重特異的タンパク質を回収するステップ、及び
    （ｃ）産生された前記多重特異的タンパク質をＮＫｐ４６発現細胞の活性化について評価するステップ
    を含む、方法。
  47. 前記多重特異的タンパク質を評価するステップが、
    （ａ）（目的の抗原を発現する）標的細胞の存在下で、活性化受容体を発現するＮＫｐ４６発現エフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、前記多重特異的タンパク質が前記エフェクター細胞を活性化する能力を試験するステップ、及び
    （ｂ）（目的の抗原を発現する）標的細胞の非存在下で、ＮＫｐ４６発現エフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、前記多重特異的タンパク質が前記エフェクター細胞を活性化する能力を試験するステップ
    を含む、請求項４６に記載の方法。
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