KR100725315B1 - 면역글로불린 단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의제조방법 - Google Patents

면역글로불린 단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체내 지속성 및 안정성이 향상된 단백질 결합체에 관한 것으로, 구체적으로 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 상호 공유결합에 의해 연결되어 있어 상기 생리활성 폴리펩타이드의 생체내 지속성 및 안정성이 향상된 단백질 결합체 및 그 이용에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 결합체는 생리활성 폴리펩타이드의 생체내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중반감기가 현저히 증가되며, 면역반응 유발의 위험이 적어 다양한 폴리펩타이드 약물의 지속형 제제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
폴리펩타이드, 면역글로불린 Fc, 비펩타이드성 중합체, 결합체, 공유결합

Description

면역글로불린 단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의 제조방법{PROTEIN COMPLEX USING AN IMMUNOGLOBULIN FRAGMENT AND METHOD FOR THE PREPARATION THEREOF}
도 1은 면역글로불린을 파파인으로 절단하여 얻은 면역글로불린 Fc 영역을 크로마토그래피로 정제한 결과이고,
도 2는 정제된 면역글로불린 Fc 영역을 SDS-PAGE로 분석한 결과이고,
레인 M: 분자량 크기 마커, 레인 1: IgG
레인 2: Fc
도 3은 커플링 반응 후 생성된 IFNα-PEG-Fc(A), 17Ser-G-CSF-PEG-Fc(B) 및 EPO-PEG-Fc(C) 결합체를 SDS-PAGE로 분석한 결과이고,
레인 M: 분자량 크기 마커, 레인 1: Fc
레인 2: 생리활성 단백질, 레인 3: 생리활성 단백질-PEG-Fc 결합체
도 4는 커플링 반응 후 정제된 IFNα-PEG-Fc 결합체를 크기 배제 크로마토그래피로 분석한 결과이고,
도 5는 EPO-PEG-Fc 결합체를 MALDI-TOF 질량 분석기로 분석한 결과이고,
도 6a 및 도 6b는 각각 천연형 면역글로불린 Fc와 탈당쇄화 면역글로불린 Fc(deglycosylated Fc; DG Fc)의 MALDI-TOF 질량 분석기 및 SDS-PAGE로 분석한 결과이고,
도 7은 IFNα-PEG-Fc 결합체 및 IFNα-PEG-DG Fc 결합체를 MALDI-TOF 질량 분석기로 분석한 결과이고,
도 8a 내지 도 8c는 각각 IFNα-PEG-Fc 결합체, IFNα-PEG-DG Fc 및 IFNα-PEG-재조합 AG Fc 유도체 결합체를 역상 HPLC로 분석한 결과이고,
도 9는 천연형 IFNα, IFNα-40K PEG, IFNα-PEG-알부민 결합체 및 IFNα-PEG-Fc 결합체의 약물동력학 그래프이고,
도 10은 천연형 EPO, 고 당쇄화 EPO, EPO-PEG-Fc 및 EPO-PEG-AGFc 결합체의 약물동력학을 분석한 그래프이고,
도 11은 IFNα-PEG-Fc 결합체, IFNα-PEG-DG Fc 및 IFNα-PEG-재조합 AG Fc 유도체 결합체의 약물동력학을 분석한 그래프이고,
도 12는 Fab’, Fab’-S-40K PEG 연결체, Fab’-N-PEG-N-Fc 결합체 및 Fab’-S-PEG-N-Fc 결합체의 약물동력학을 분석한 그래프이고,
도 13은 Fab’, Fab’-S-40K PEG 연결체, Fab’-N-PEG-N-Fc 결합체 및 Fab’-S-PEG-N-Fc 결합체의 세포내 활성을 분석한 그래프이다.
도 14는 인간 IgG subclass에서 보체 C1q의 결합활성을 비교분석한 그래프이고,
도 15는 당쇄화된 Fc, 효소를 이용하여 당을 제거한 DG Fc 및 대장균에서 생산한 AGFc를 캐리어로 이용한 인터페론-PEG-캐리어 결합체에서의 보체 C1q의 결합 활성을 비교분석한 그래프이다.
본 발명은 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 상호 공유결합에 의해 연결되어 생리활성 지속기간이 천연형에 비해 연장된 단백질 결합체 및 그 이용에 관한 것이다.
폴리펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 단백질 약물의 지속성 제제는 단백질 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
단백질을 안정화시키고 단백질 가수분해효소와의 접촉 및 신장 소실을 억제하기 위한 방법으로, 종래에는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol: 이하 "PEG"라 약칭함)과 같이 용해도가 높은 고분자를 단백질 약물 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어 왔다. PEG는 목적단백질의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 용해도를 높임으로써 단백질을 안정화시키고, 단백질의 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는 것으로 알려져 있다(Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139, 1991). 그러나, PEG의 결합에 의해 단백질의 안정성은 증가할 수 있지만 생리활성 단백질의 역가가 현저히 낮아지고, PEG의 분자량이 증가할수록 단백질과의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.
최근에는, PEG의 양쪽 말단에 동일한 단백질 약물을 결합시킨 이중체를 만들어 활성 증가를 꾀하거나(미국특허 제5,738,846호), 서로 다른 종류의 단백질 약물을 PEG의 양쪽 말단에 결합시켜 동시에 2가지 활성을 나타내는 단백질(국제출원공개 제WO 92/16221호)도 개발되었지만, 이들은 단백질 약물의 활성을 지속시키는 면에서는 뚜렷한 효과를 보이지 못하였다.
한편, 킨스틀러 등은 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)와 인간 알부민을 PEG에 결합시킨 융합단백질이 증가된 안정성을 보인다고 보고하였다(Kinstler et al., Pharmaceutical Research 12(12): 1883-1888, 1995). 그러나, G-CSF-PEG-알부민 구조를 갖는 상기 문헌의 변형된 약물은 체내 잔류시간이 천연형 약물을 단독 투여한 경우에 비해 약 4배 증가하는데 불과하고, 혈중반감기 증가가 미미하여 단백질 약물의 효과적인 지속성 제제로서 실용화되지 못하고 있다.
생리활성 단백질의 생체내 안정성을 높이는 또 다른 방법으로서, 유전자 재조합에 의해 혈중 안정성이 높은 단백질 유전자와 생리활성 단백질 유전자를 연결한 후, 상기 재조합 유전자로 형질전환된 동물세포 등을 배양하여 융합단백질을 생산하는 방법이 개발되어 있다. 예를 들면, 현재까지 단백질의 안정성 증가에 가장 효과가 높은 것으로 알려져 있는 알부민 또는 그 단편을 유전자 재조합에 의해 목적하는 생리활성 단백질에 결합시켜 생산한 융합단백질이 보고되어 있다(국제출원공개 제WO 93/15199호 및 제WO 93/15200호, 유럽특허공개 제EP 413,622호). 또한, 휴먼 게놈 사이언스(Human Genome Science)사가 효모에서 생산한 인터페론 알파와 알부민의 융합단백질(제품명: Albuferon™)은 원숭이에서 인터페론의 반감기를 5시간에서 93시간으로 증가시켰지만, 변형되지 않은 인터페론에 비해 생체 활성도가 5% 미만으로 현저히 감소하는 문제가 있다(Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther. 303(2): 540-548, 2002).
한편, 면역글로불린(immunoglobulin, Ig)은 크게 항원 결합부위를 가진 Fab 영역과 보체 결합부위를 가진 Fc 영역으로 구분되는데, 유전자 재조합 방법에 의해 인터페론(대한민국 특허공개 제2003-9464호), 및 인터루킨-4 수용체, 인터루킨-7 수용체 또는 적혈구 생성인자 수용체(대한민국 특허등록 제249572호)를 면역글로불린의 Fc 영역과 융합된 형태로 포유동물에서 발현시키는 것이 알려져 있으며, 국제특허공개 제WO 01/03737호에는 사이토카인 또는 성장인자를 올리고펩타이드 링커(linker)를 통해 면역글로불린의 Fc 단편에 결합시킨 융합단백질이 개시되어 있다.
또한, 미국특허 제5,116,964호는 LHR(lymphocyte cell surface glycoprotein) 또는 CD4 단백질을 면역글로불린 Fc 영역의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 유전자 재조합 방법에 의해 융합시킨 단백질을 개시하고 있고, 미국특허 제5,349,053호는 IL-2를 면역글로불린 Fc 영역에 융합시킨 융합단백질을 개시하고 있다. 그 외에도, 유전자 재조합에 의해 제조된 Fc 융합단백질의 예로서 인터페론-베타 또는 그의 유도체와 면역글로불린 Fc 영역의 융합단백질(국제특허공개 제WO 00/23472호), IL-5 수용체와 면역글로불린 Fc 영역의 융합단백질(미국특허 제5,712,121호), 인터페론 알파와 면역글로불린 G4의 Fc 영역의 융합단백질(미국특허 제5,723,125호) 및 CD4 단백질과 면역글로불린 G2의 Fc 영역의 융합단백질(미국특허 제6,451,313호)이 개시되었다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역의 아미노산을 변형시킨 미국특허 제5,605,690호에는 면역글로불린 Fc 영역에서 특히 보체 결합부위나 수용체 결합부위의 아미노산을 변형시킨 Fc를 이용하여 유전자 재조합 방법에 의해 제조된 TNFR-IgG1 Fc 융합단백질을 개시되어 있고, 이와 같이 변형된 면역글로불린의 Fc 영역을 이용한 유전자 재조합 방식의 융합단백질의 제조방법은 미국특허 제6,277,375호, 제6,410,008호 및 제6,444,792호에도 개시되어 있다.
미국특허 제6,660,843호는 면역글로불린 Fc 영역과 목적단백질을 링커를 사용하여 융합시킨 결합체를 대장균에서 유전자 재조합 방법으로 생산하는 방법을 개시하고 있다. 상기 방법은 포유동물세포를 이용하는 방법보다 저렴한 비용으로 생산이 가능하며, 당쇄가 제거된 형태로 결합체를 얻을 수 있다. 그러나, 목적단백질과 면역글로불린 Fc 영역을 대장균에서 동시에 생산하기 때문에 천연형에 당쇄가 있는 목적단백질에는 적용하기 어려울 뿐만 아니라, 봉입체(inclusion body)를 이용하기 때문에 오중첩(misfolding) 확률이 매우 높다는 문제점이 있다.
이러한 유전자 재조합 방법에 의해 생산된 Fc 융합단백질은 면역글로불린 Fc 영역의 특정 부위 즉, 아미노 말단 또는 카르복시 말단에서만 단백질 융합이 가능하고 동종이량체의 형태로만 발현되어 단량체의 형태로는 생산이 불가능하며, 당쇄화 단백질간 또는 비당쇄화 단백질간의 융합만이 가능하기 때문에 당쇄화 단백질과 비당쇄화 단백질의 융합은 불가능하다는 문제점이 있다. 또한, 융합에 의해 새로 생긴 아미노산 서열로 인하여 면역반응이 유발될 수 있을 뿐만 아니라 링커 부위에 대한 단백질 가수분해효소의 민감성이 증가될 수 있다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역을 이용한 융합단백질의 개발에 있어서, 천연형 인체 유래 Fc 및 교차결합제를 사용하여 목적단백질과의 결합체를 얻고자 하는 시도는 아직까지 보고된 바 없다. 링커를 사용한 결합체의 제조는 결합부위 및 결합되는 두 단백질의 방향성을 선택하여 조절할 수 있고, 단량체, 이량체 또는 다량체 제조가 가능하며, 동종 또는 이종 형태 모두 제조할 수 있다는 장점이 있다. 면역글로불린 Fc 영역은 포유동물세포 또는 대장균을 이용한 재조합 방법에 의해 생산이 가능하지만, 목적단백질을 포함하지 않은 천연형 면역글로불린 Fc 영역만을 대장균으로부터 높은 수율로 대량 생산하여 지속형 제형에 사용한 예는 현재까지 보고된 바 없다. 뿐만 아니라, 이러한 재조합 방법에 의해 생산된 대장균 유래 면역글로불린 Fc 영역을 사용하여 교차결합제를 매개로 목적단백질과의 결합체를 생산한 시도도 아직까지 보고된 바 없다.
한편, 면역글로불린은 항체-의존성 세포독성(antibody-dependent cell cytotoxicity, ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC) 효과와 같은 항체로서의 기능을 가지고 있으며, 면역글로불린 Fc 영역에 존재하는 당쇄는 ADCC 및 CDC 효과에 중요한 역할을 한다고 보고되었다(Burton D., Molec. Immun. 22, 161-206, 1985). 당쇄가 없는 경우에는 면역글로불린 자체의 혈중반감기는 당쇄가 있는 면역글로불린과 비슷하지만, 보체 결합력 및 수용체 결합력은 10 내지 1000배 감소한다고 알려져 있다(Waldmann H., Eur. J. Immunol. 23, 403-411, 1993; Morrison S., J. Immunol. 143, 2595-2601, 1989).
이처럼 생리활성 단백질에 고분자를 결합시키는 다양한 방법이 시도되어 왔지만, 기존의 방법들은 폴리펩타이드의 안정성을 높이면 활성이 현저히 감소하거나, 안정성과는 무관하게 활성만을 증가시키는 것이어서, 변형에 의한 단백질 약물의 활성 감소를 최소화하고 안정성 향상을 동시에 달성하는 방법의 개발이 여전히 요구되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 종래에는 동시에 달성하기 어려운 것으로 여겨져 왔던 활성 감소 최소화와 안정성 증가를 동시에 이룰 수 있는 지속성 단백질 약물 제제를 개발하기 위해 연구를 계속한 결과, 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 생리활성 폴리펩타이드를 상호 공유결합에 의해 연결시켜 제조한 단백질 결합체가 생리활성 단백질의 혈중반감기를 획기적으로 증가시키고, 공지의 단백질 약물에 비해 높은 역가를 유지함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 생리 활성 폴리펩타이드의 활성 감소를 최소화하면서도 혈중반감기를 연장시키고 면역 반응 유발의 위험이 없는, 단백질 결합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 혈중반감기가 연장된 상기 단백질 결합체를 유효성분으로 하는 지속성 단백질 약물 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생리활성 폴리펩타이드의 활성 감소를 최소화하는 동시에 혈중반감기를 증가시켜 안전성 및 생리활성의 지속성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 한 양태는 생리활성 폴리펩타이드, 양 말단에 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 상호 공유결합에 의해 연결되어 있는 단백질 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명에서, “단백질 결합체(complex)" 또는 "결합체"라 함은 하나 이상의 생리활성 폴리펩타이드, 양 말단에 반응기를 갖는 하나 이상의 비펩타이드성 중합체 및 하나 이상의 면역글로불린 Fc 영역을 포함하고, 이들 구성요소가 공유결합으로 상호 연결되어 있는 것을 가리킨다. 또한, 상기 "결합체"와 구별하기 위하여, 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역에서 선택된 2 종류의 물질 분자만이 공유결합으로 연결된 구조물은 "연결체(conjugate)"로 표시한다.
본 발명의 단백질 결합체는 단백질 약물의 생리활성 감소를 최소화하고 생체내 지속성을 최대한 증진시키기 위한 단백질 약물의 변형체로 본 발명에서는 면역글로불린 Fc 영역을 결합시킴을 특징으로 한다.
면역글로불린 Fc 영역은 생체내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서 "면역글로불린 Fc 영역"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역 1(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH 2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함한 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역 은 1)CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2)C H1 도메인 및 CH2 도메인, 3)CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4)CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5)1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6)중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔 기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab’)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천 연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 “당쇄의 제거(Deglycosylation)”는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, “비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 “조합(combination)”이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complement-dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다(도 14 및 도 15 참조).
즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명에서 면역글로불린 Fc 영역과 단백질 약물은 비펩타이드성 중합체로 연결됨을 특징으로 한다.
본 발명에서 “비펩타이드성 중합체”는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.
본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다. 비펩타이드성 중합체는 분자량이 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위인 것이 바람직하다. 또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질 약물과 결합될 수 있는 반응기를 가진다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기의 종류에는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 데리바티브(derivative)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 데리바티브로는 석시니미딜 프로피오네이 트, 하이드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하면서 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역과 각각 결합하는 데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 하이드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol. PEG)을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는, 공지의 화학반응에 의해 상기 하이드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 단백질 결합체를 제조할 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 중합체의 연결체는 생리활성 폴리펩타이드에 결합되어 단백질 결합체를 형성하게 된다.
본 발명에서 “생리활성 폴리펩타이드”, “생리활성 단백질”, “활성 단백질” 또는 “단백질 약물”이란 생체 내에서 생리적 현상에 길항작용을 나타내는 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미하는 용어로서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
이러한 단백질 약물은 쉽게 변성되거나 생체내에 존재하는 단백질 분해효소 에 의해 잘 분해되는 등의 이유로 장시간에 걸쳐 생리학적 활성을 지속할 수 없는 단점이 있다. 그러나, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역과 폴리펩타이드를 결합시킨 결합체의 경우, 약물의 구조적 안정성이 증가하고 분해 반감기가 증가하게 된다. 그러나, Fc 영역의 결합에 의한 폴리펩타이드의 생리학적 활성의 감소는 기타 공지된 다른 폴리펩타이드 약물 제제에 비해 아주 경미하다 할 것이다. 그러므로, 기존의 폴리펩타이드 약물의 생체내 이용률에 비해 본 발명의 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역의 결합체는 생체내 이용률이 현저히 증가하였음을 특징으로 한다. 이는 하기 본 발명의 실시예를 통해서도 명백히 개시되고 있는 바, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 IFNα, G-CSF, hGH 등이 PEG만 결합되거나 PEG와 알부민이 결합된 기존의 제제에 비해 약 2배 내지 약 6배 정도 증가하였음을 확인할 수 있다(표8, 표9 및 표10).
한편, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역과 단백질의 결합은 종래의 재조합적인 방법에 의한 융합이 아닌 것을 특징으로 한다. 면역글로불린 Fc 영역과 약물로 사용되는 활성 폴리펩타이드가 재조합적인 방법에 의해 융합된 형태는, Fc 영역의 N 말단 또는 C 말단에 폴리펩타이드가 펩타이드 결합으로 연결된 형태로, 이를 코딩하는 핵산 서열에서 하나의 폴리펩타이드로 발현되어 폴딩된다.
단백질의 생리학적 기능체로서의 활성이 구조에 의해 결정된다는 점에 기초할 때, 이는 융합 단백질 활성의 급격한 감소를 초래한다. 따라서 폴리펩타이드 약물이 Fc와 재조합적인 방법에 의한 융합될 경우, 구조적 안정성이 증가하였다 하 더라도 생체내 이용률 면에서 효과가 없다. 또한, 이런 융합 단백질은 미스폴딩(misfolding) 되어 응집체의 형태로 발현되는 경향이 있으므로, 단백질 제조, 분리의 수율 면에서 경제적이지 않다. 또한, 활성형 폴리펩타이드가 당쇄화된 형태일 경우, 진핵세포에서 발현시켜야 되고, 이럴 경우 Fc 또한 당쇄화되므로 생체내에서 부적절한 면역반응을 야기할 수도 있다.
즉, 본 발명에 의해서만이 비로소 당쇄화된 활성형 폴리펩타이드를 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역과 연결시킨 결합체가 가능하게 되었고, 최상의 시스템에서 각각이 제조, 분리되므로 단백질 획득의 수율을 높일 수 있는 등 상기 문제점을 모두 극복할 수 있다.
한편, 본 발명의 단백질 결합체에 적용될 수 있는 생리활성 폴리펩타이드로는 호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질과 같은 다양한 생리활성 폴리펩타이드, 및 이들의 유도체 및 유사체들을 예시할 수 있다.
구체적으로, 생리활성 폴리펩타이드는 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류와 인터페론 수용체류(예: 인터페론-α, -β 및 -γ, 수용성 타입 I 인터페론 수용체 등), 콜로니 자극인자, 인터루킨류(예: 인터루킨-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30 등)와 인터루킨 수용체류(예: IL-1 수용체, IL-4 수용체 등), 효소류(예: 글루 코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 이두로네이트-2-설파타아제(iduronate-2-sulfatase), α-갈락토시다제-A(α-galactosidase-A), α-L-이두로니다제, 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나아제(chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파제(lipase), 유리카제(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤라제(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티다아제(neutral endopeptidase), 마이엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase) 등), 인터루킨 및 사이토카인 결합 단백질류(예: IL-18bp, TNF-결합 단백질 등), 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴(angiopoeitin)류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드(thrombin receptor activating peptide), 트롬보모듈린(thrombomodulin), 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘(hirudin), 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴(angiostatin), 안지오텐신(angiotensin), 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌(elcatonin), 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor), 여포 자 극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류(예: 신경 성장 인자(Nerve growth factor), 모양체 신경 영양성 인자(cilliary neurotrophic factor), 악소제네시스인자-1(axogenesis factor-1), Glucagon-like-pepetide 류(GLP-1), 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide), 신경아세포 유래 신경인자(glial derived neurotrophic factor), 네트린(netrin), 향신경성 억제인자(neurophil inhibitor factor), 신경인자, 뉴르투린(neurturin) 등), 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신(autotaxin), 락토페린(lactoferrin), 미오스타틴(myostatin), 수용체류(예: TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, B 세포 활성인자 수용체 등), 수용체 길항물질(예: IL1-Ra 등), 세포표면항원(예: CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 등), 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편류(예: scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2 및 Fd), 바이러스 유래 백신 항원 등 다양한 종류를 포함한다.
특히 바람직한 생리활성 폴리펩타이드는, 질병의 치료 또는 예방의 목적으로 인체에 투여될 때 투여 빈도가 높은 인간 성장 호르몬, 인터페론류(인터페론-α, -β, -γ 등), 과립구 콜로니 자극인자, 적혈구 생성인자 및 항체 단편류 등이며 가장 바람직하게는 인터페론-α이다. 또한, 상기 생리활성 폴리펩타이드의 천연형과 실질적으로 동등하거나 증가된 기능, 구조, 활성 또는 안정성을 갖는 한, 임의의 유도체 또는 유도체도 본 발명의 생리활성 폴리펩타이드의 범위에 포함된다.
본 발명에서 항체 단편은 특정 항원에 결합할 수 있는 능력을 지닌 Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd 또는 scFv일 수 있으며, 바람직하게는 Fab’이다. Fab 단편은 경쇄의 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)과 중쇄의 가변 도메인(VH) 및 제 1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab’ 단편은 CH1 도메인의 카르복실 말단에 힌지(hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 수 개의 아미노산 잔기가 부가되어 있다는 점에서 Fab 단편과 구별된다. Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인으로만 구성된 단편이며, F(ab’)2는 두 분자의 Fab’ 단편이 이황화 결합 혹은 화학적 반응을 통해 결합한 것이다. scFv는 VL 및 VH 도메인만이 펩타이드 링커로 연결된 단일 폴리펩타이드 사슬이다.
한편, 비펩타이드성 중합체를 매개로 면역글로불린 Fc 영역과 단백질 약물이 결합할 경우 면역글로불린 Fc 영역의 결합부위는 힌지부위 또는 불변영역에 존재하는 아미노산 잔기의 유리 반응기 중 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는 면역글로불린 Fc 불변영역 및 단백질 약물의 아미노 말단, 라이신의 아미노 잔기, 히스티딘의 아미노 잔기 또는 유리 시스테인 잔기가 비펩타이드성 중합체의 말단 반응기와 공유결합에 연결되는 것이 바람직하다.
본 발명의 단백질 결합체는 [생리활성 폴리펩타이드-비펩타이드성 중합체-면역글로불린 Fc 영역]의 단위구조를 하나 이상 포함할 수 있으며, 여기에서 모든 구성 요소들은 공유결합에 의해 선형으로 연결되어 있다. 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 반응기를 가질 수 있으므로, 이를 통해 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역과 각각 공유결합으로 연결된다. 즉, 하나의 면역글로불린 Fc 영역에, 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 비펩타이드성 중합체의 연결체 하나 이상이 공유결합으로 연결됨으로써, 면역글로불린 Fc 영역을 매개체로 하여 생리활성 폴리펩타이드 단량체, 이량체 혹은 다량체를 형성할 수 있으며, 이를 통해 생체내 활성 및 안정성 증가를 보다 효과적으로 달성할 수 있다.
본 발명의 단백질 결합체에 있어 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역은 다양한 몰비로 결합될 수 있다.
또한, 종래 알려진 바와 같이 두 가지 단백질이 올리고펩타이드를 매개로 하여 연결되는 경우, 그 연결부위에 의하여 새롭게 형성되는 단백질 서열이 면역반응을 유발시킬 위험이 있으며, 연결되는 단백질들의 결합 부위가 N-말단과 C-말단으로만 제한되었던 반면, 본 발명의 단백질 결합체는 생체적합성을 갖는 비펩타이드성 중합체에 의하여 매개되기 때문에 독성이나 면역반응 유발과 같은 부작용이 없고, 결합 부위의 다양성으로 인해 다양한 단백질 결합체를 제공할 수 있는 장점이 있다.
또한, 종래의 유전자 재조합에 의한 면역글로불린 Fc 영역과 활성 단백질을 직접적으로 융합시키는 방법은 융합 파트너로 사용되는 면역글로불린 Fc 영역의 말단 서열에서만 융합이 가능하고, 동물세포 배양에 의존하므로 그 생산량이 제한적일 뿐만 아니라, 활성 단백질의 비천연형 당쇄화로 인해 활성이 감소할 수 있으며, 정확한 폴딩(folding)이 이루어져야 하고, 동종이량체(homodimer) 형태의 융합단백 질이 생산될 수 있고, 특히 대장균 유래 결합체의 제조시 불용성의 오중첩 결합체 제거가 매우 어렵다는 문제점이 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 결합체는 이러한 문제점들을 야기하지 않으면서 보다 높은 지속성 및 안정성을 달성할 수 있으며, 폴리펩타이드의 활성 유지면에서도 바람직하고, 당쇄화된 치료 단백질과 비당쇄화된 Fc의 결합체를 제조할 수 있다는 장점이 있다.
한편, 카보디이미드나 글루타르알데히드와 같은 저분자량의 화학적 결합제를 사용하는 경우에는 상기 화학적 결합제가 단백질의 여러 부위에 동시에 결합하여 단백질을 변성시키거나, 비특이적 결합으로 결합부위의 조절을 곤란하게 하거나, 결합된 단백질의 정제를 어렵게 하는 등의 문제점이 있다. 이에 반해, 본 발명의 단백질 결합체는 비펩타이드성 중합체를 사용하므로 결합부위의 조절이 용이하고, 비특이적 반응을 최소화하며, 정제가 용이하다는 장점을 갖는다.
구체적으로 본 발명의 실시예를 중심으로 본 발명의 유용성을 설명하면, PEG의 양 말단에 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 본 발명의 단백질 결합체(폴리펩타이드-PEG-Fc)는 폴리펩타이드-PEG 연결체 또는 폴리펩타이드-PEG-알부민 결합체보다 월등히 우수한 안정성 및 활성을 나타낸다. 약물동력학 분석(pharmacokinetic analysis) 결과, 인터페론 알파(IFNα)의 혈중반감기가 인터페론 알파-40 kDa PEG 연결체(IFNα-40K PEG)의 경우에는 천연형에 비해 약 20배 증가하고, IFNα-PEG-알부민 결합체는 약 10배 증가한 반면, 본 발명의 IFNα-PEG-Fc 결합체는 약 50배 정도로 획기적으로 증가하였다(표 3 참조). 또한, 목적단백질로 IFNα 대신 인간 성장 호르몬(hGH), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 및 그의 유도체(17S-G-CSF) 또는 적혈구 생성인자(EPO)를 이용한 경우에도 동일한 결과를 나타내었는데, PEG-Fc를 결합시킨 본 발명의 단백질 결합체가 천연형 단백질, 또는 PEG 또는 PEG-알부민을 결합시킨 경우에 비해 약 10배까지 증가한 평균 체류시간(mean residence time; MRT) 및 혈중반감기를 나타내었다(표 4 내지 표 7 참조).
또한, Fab’-PEG-Fc 결합체는 PEG-Fc 연결체가 Fab’의 C-말단 근처의 -SH기 또는 N-말단에 연결된 경우 모두 40K PEG-Fab’ 연결체에 비하여 2 내지 3배 연장된 혈중반감기를 나타내었다(도 12 참조).
그리고, 면역글로불린 Fc의 당쇄를 제거한 탈당쇄화된 면역글로불린 Fc(DG Fc)와 재조합 비당쇄화 면역글로불린 Fc(AG Fc) 유도체를 이용하여 단백질 결합체를 제조하여도 혈중반감기와 생체외 활성이 비슷하게 유지되는 것으로 확인되었다(표 3 및 8, 도 11 참조).
이와 같이, 본 발명의 단백질 결합체는 인간 성장 호르몬, 인터페론, 적혈구 생성인자, 콜로니 자극인자 또는 그의 유도체 및 항체 유도체를 포함하는 다양한 생리활성 폴리펩타이드에 적용되어 탁월한 혈중반감기와 평균 체류 시간(MRT)을 나타내므로, 다양한 종류의 생리활성 폴리펩타이드의 지속형 제제 개발에 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은
(a) 양 말단에 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체, 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역을 반응시켜 이들을 상호 공유결합에 의해 연결시키는 단 계; 및
(b) 비펩타이드성 중합체의 양 말단에 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 각각 공유결합에 의해 연결된 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 생체내 지속성 및 안정성이 증가된 단백질 결합체의 제조방법을 제공한다.
상기 단계 (a)에서, 세 구성요소의 공유결합은 순차적으로 또는 동시에 일어날 수 있다. 예를 들어, 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단에 각각 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역을 결합시키는 경우에는, 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역 중 어느 하나를 먼저 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 결합시킨 후, 나머지 성분을 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 결합시키는 방식으로 순차적으로 반응을 진행하는 것이 목적하는 단백질 결합체 외의 부산물 생성을 최소화하는데 유리하다.
따라서, 상기 단계 (a)는
(a1) 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드를 공유결합에 의해 연결시키는 단계;
(a2) 상기 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체에 결합된 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드 연결체를 분리하는 단계; 및
(a3) 상기에서 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드를 공유결합에 의해 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 (a1)에서, 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 최적 반응 몰비는 1:2.5 내지 1:5이고, 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 중합체의 최적 반응 몰비는 1:5 내지 1:10이다.
한편, 단계 (a3)에서, 단계 (a2)에서 수득된 연결체:면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰비는 1:0.5 내지 1:20 범위일 수 있고, 1:1 내지 1:3 범위인 것이 바람직하다.
단계 (a1) 및 단계 (a3)의 반응은, 반응에 참가하는 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단 반응기의 종류를 고려하여 필요에 따라 환원제의 존재하에서 수행될 수 있다. 바람직한 환원제로는 나트륨 시아노 보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염 또는 피리딘 붕산염 등이 사용될 수 있다.
상기에서 단계 (a2) 및 (b)는 요구되는 순도 및 생성된 산물의 분자량 및 전하량과 같은 특성을 고려하여, 단백질의 분리에 사용되는 통상의 방법들 중에서 필요에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 다양한 공지의 방법들을 적용할 수 있으며, 필요에 따라서는 보다 높은 순도로 정제하기 위해 복수개의 서로 다른 방법을 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 단백질 결합체를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 생체내 지속성 및 안정성이 증가된 생리 활성 폴리펩타이드의 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 결합체의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 결합체를 포함한 약제학적 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, hgksdir, 캡 슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어 Fc 단편이 캐리어로 사용된 약물의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 생체내 지속성이 매우 우수하므로, 본 발명의 약제학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 좀더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 인터페론 알파(IFNα)-PEG-면역글로불린 Fc 영역(Fc) 결합체의 제조 I
<단계 1> 면역글로불린을 이용한 면역글로불린 Fc 영역의 제조
면역글로불린 Fc 영역을 제조하기 위하여, 10 mM 인산염 완충액에 용해된 분자량 150 kDa의 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG, 녹십자) 200 ㎎에 단백질 가수분해효소 파파인(Papain, Sigma사)을 2 ㎎ 처리하여 37℃에서 2시간 동안 천천히 교반하면서 반응시켰다. 효소반응 후, 생성된 면역글로불린 Fc 영역을 정제하기 위하여 슈퍼덱스 컬럼, 단백질 A 컬럼 및 양이온 교환수지 컬럼 크로마토그래피를 순차적으로 수행하였다. 구체적으로, 반응액을 10 mM 인산나트륨 완충액(PBS, pH 7.3)으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200 컬럼(Superdex 200, Pharmacia사)에 점적하였으며, 동일한 완충액을 이용하여 유속 1 ㎖/분으로 용출시켰다. 면역글로불린 Fc 영역보다 분자량이 상대적으로 큰 미반응 면역글로불린(IgG)과 F(ab’)2 등은 앞쪽에서 용출되므로 이를 먼저 제거하였다. 면역글로불린 Fc 영역과 분자량이 유사한 Fab는 다음과 같이 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 제거하였다(도 1). 20 mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 단백질 A 컬럼(Pharmacia사)에 슈퍼덱스 200 컬럼에서 용출된 면역글로불린 Fc 영역 함유 분획을 5 ㎖/분의 유속으로 부하한 후 컬럼에 결합하지 않은 단백질을 제거하기 위해 동일 완충액으로 충분히 세척하였다. 여기에 100 mM 시트르산 나트륨(Na citrate, pH 3.0) 완충액을 흘려주어 순도가 높은 면역글로불린 Fc 영역을 용출시켰다. 단백질 A 컬럼으로 정제된 Fc 분획을 마지막으로 양이온 교환수지 컬럼(polyCAT, PolyLC사)을 사용하여 최종 정제하였는데, 10 mM 아세테이트 완충액(pH 4.5)을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0.15 M → 0.4 M) 방법으로 흘려 고순도의 Fc 분획을 얻고, 이를 12% SDS- PAGE 상에서 확인하였다(도 2의 레인 2).
<단계 2> IFNα-PEG 연결체의 제조
양쪽 말단에 알데히드 반응기를 가진 분자량 3.4 kDa의 폴리에틸렌 글리콜인 ALD-PEG-ALD(Shearwater사)를 인간 인터페론 알파-2b(hIFNα-2b, 분자량 20 kDa)가 5 ㎎/㎖ 농도로 용해된 100 mM 인산염 완충액에 IFNα:PEG의 몰비가 1:1, 1:2.5, 1:5, 1:10 및 1:20이 되도록 첨가하였다. 여기에 환원제인 나트륨 시아노 보로하이드라이드(NaCNBH3, Sigma사)를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가하고, 4℃에서 천천히 교반하면서 3시간 동안 반응시켰다. 인터페론 알파의 아미노 말단 부위에 선택적으로 PEG가 연결되고, PEG와 인터페론 알파가 1:1로 결합된 연결체를 얻기 위하여, 상기 반응 혼합물을 가지고 슈퍼덱스(SuperdexR, Pharmacia사) 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피를 실시하였다. 용출액으로 10 mM 칼륨-포스페이트 완충액(pH 6.0)을 사용하여 IFNα-PEG 연결체를 정제하였고, PEG와 결합하지 않은 인터페론 알파, 미반응 PEG 및 2개의 인터페론 알파가 PEG와 연결된 이량체 부산물을 제거하였다. 정제된 IFNα-PEG 연결체를 5 ㎎/㎖ 농도로 농축하였다. 이로부터 반응성이 가장 좋고 이량체 등과 같은 부산물이 적은 IFNα:PEG의 최적 반응 몰비는 1:2.5 내지 1:5임을 확인하였다.
<단계 3> IFNα-PEG-Fc 결합체 형성
상기 단계 2에서 정제된 IFNα-PEG 연결체를 면역글로블린 Fc 영역 N 말단에 결합시키기 위하여, 단계 1에서 준비된 면역글로불린 Fc 영역(약 53 kDa)을 10 mM 인산염 완충액에 용해시킨 후, IFNα-PEG 연결체:Fc의 몰비가 각각 1:1, 1:2, 1:4 및 1:8이 되도록 IFNα-PEG 연결체와 혼합하여 반응시켰다. 반응액을 100 mM 인산염 완충액 상태로 만들었고, 환원제로서 NaCNBH3를 최종 농도가 20 mM이 되도록 첨가한 후 4℃에서 20시간 동안 천천히 교반하면서 반응시켰다. 이로부터 반응성이 가장 좋고 이량체 등과 같은 부산물이 적은 IFNα-PEG 연결체:Fc의 최적 반응 몰비는 1:2임을 확인하였다.
<단계 4> IFNα-PEG-Fc 결합체의 분리 및 정제
상기 단계 3의 결합반응 후 미반응 물질 및 부산물을 제거하고 생성된 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하기 위하여 슈퍼덱스 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 반응 혼합물을 농축한 후 10 mM 인산염 완충액(pH 7.3)을 이용하여 유속 2.5 ㎖/분으로 컬럼에 통과시켜 결합되지 않은 Fc 및 미반응 물질을 제거하고 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체 분획을 얻었다. 얻어진 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체 분획에는 불순물로서 소량의 미반응 Fc 및 인터페론 알파 이량체가 혼재되어 있기 때문에 이를 제거하기 위해 추가로 양이온 교환수지 크로마토그래피를 수행하였다. IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체 분획을 10 mM 아세트산 나트륨(pH 4.5)으로 평형화시킨 PolyCAT LP 컬럼(PolyLC사)에 넣고 1 M 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 10 mM 아세트산 나트륨(pH 4.5) 완충액을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0 M → 0.5 M) 방법으로 흘려 추가로 정제하였다. 마지막으로 음이온 교환컬럼을 사용하여 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체를 순수하게 획득하였다. PolyWAX LP 컬럼(PolyLC사)을 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액으로 평형화시킨 후 정제된 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체 분획을 부하하고 1 M 염화나트륨을 포함하는 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0 M → 0.3 M) 방법으로 흘려 순수한 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하였다.
<실시예 2> IFNα-PEG-Fc 결합체의 제조 Ⅱ
<단계 1> Fc-PEG 연결체의 제조
양쪽 말단에 알데히드 반응기를 가진, 분자량 3.4 kDa의 폴리에틸렌 글리콜인 ALD-PEG-ALD(Shearwater사)를 상기 실시예 1의 단계 1에서 준비된 면역글로불린 Fc 영역이 15 ㎎/㎖ 농도로 용해된 100 mM 인산염 완충액에 면역글로불린 Fc:PEG의 몰비가 각각 1:1, 1:2.5, 1:5, 1:10 및 1:20이 되도록 첨가하였다. 환원제인 NaCNBH3를 최종 농도 20 mM로 첨가한 후, 4℃에서 천천히 교반하면서 3시간 동안 반응시켰다. 면역글로불린 Fc 영역의 아미노 말단부위에 선택적으로 PEG:Fc가 1:1로 결합된 연결체를 얻기 위하여 상기 반응 혼합물을 가지고 슈퍼덱스(SuperdexR, Pharmacia사) 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 용출액으로 10 mM 칼륨-포 스페이트 완충액(pH 6.0)을 사용하여 Fc-PEG 연결체를 정제하였고, PEG와 결합하지 않은 면역글로불린 Fc 영역, 미반응 PEG 및 2개의 면역글로불린 Fc 영역이 PEG와 연결된 이량체 부산물을 제거하였다. 정제된 Fc-PEG 연결체를 약 15 ㎎/㎖로 농축하였다. 이로부터 반응성이 가장 좋고 이량체 등과 같은 부산물이 적은 Fc:PEG의 최적 반응 몰비는 1:3 내지 1:10임을 확인하였다.
<단계 2> Fc-PEG 연결체와 인터페론 알파의 결합체 형성 및 정제
상기 단계 1에서 정제된 Fc-PEG 연결체를 IFNα N 말단에 결합시키기 위하여, 10 mM 인산염 완충액에 용해된 인터페론 알파를 사용하고, Fc-PEG 연결체:IFNα의 몰비를 각각 1:1, 1:1.5, 1:3 및 1:6이 되도록 첨가하여 반응시켰다. 반응액을 100 mM 인산염 완충액 상태로 만들었고, 환원제로서 NaCNBH3를 최종 농도가 20 mM이 되도록 첨가한 후 4℃에서 20시간 동안 천천히 교반하면서 반응을 진행시켰다. 반응 후 실시예 1의 단계 4와 동일한 방법으로 정제하여 미반응 물질 및 부산물을 제거하고, 이로부터 생성된 Fc-PEG-IFNα 단백질 결합체를 순수하게 분리하였다.
<실시예 3> 인간 성장 호르몬(hGH)-PEG-Fc 결합체의 제조
인터페론 알파 대신에 인간 성장 호르몬(hGH, 분자량 22 kDa)을 사용하고, hGH:PEG의 몰비를 1:5로 하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 hGH-PEG-Fc 단백질 결합체를 제조 및 정제하였다.
<실시예 4> 인간 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)-PEG-Fc 결합체의 제조
인터페론 알파 대신에 인간 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)를 사용하고, G-CSF:PEG의 몰비를 1:5로 하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체를 제조 및 정제하였다.
한편, 천연형 G-CSF의 17번째 아미노산이 세린으로 치환된 유도체(17S-G-CSF)를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 17S-G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체를 제조 및 정제하였다.
<실시예 5> 인간 적혈구 생성인자(EPO)-PEG-Fc 결합체의 제조
인터페론 알파 대신 인간 적혈구 생성인자(Erythropoietin; EPO)를 사용하고, EPO:PEG의 몰비를 1:5로 하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 EPO-PEG-Fc 단백질 결합체를 제조 및 정제하였다.
<실시예 6> 반응기의 종류를 달리하는 PEG를 이용한 단백질 결합체의 제조
양쪽 말단의 반응 그룹이 모두 석시니미딜 프로피오네이트(succinimidyl propionate; SPA)인 PEG를 사용하여 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체를 다음과 같이 제조하였다. 인터페론 알파 10 ㎎이 용해된 100 mM 인산염 완충액에 양쪽 말단에 SPA 반응기를 갖는, 분자량 3.4 kDa의 폴리에틸렌 글리콜인 SPA-PEG-SPA(Shearwater사)를 IFNα:PEG의 몰비가 각각 1:1, 1:2.5, 1:5, 1:10 및 1:20이 되도록 정량하여 첨가하고, 상온에서 천천히 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 인터페론 알파의 라이신 잔기의 아미노 그룹 부위에 선택적으로 PEG가 1:1로 결합된 PEG-IFNα 연결체를 얻기 위하여 반응 혼합물을 가지고 슈퍼덱스 크기 배제 크로마토그래피를 실시하였다. 용출액으로 10 mM 칼륨-포스페이트 완충액(pH 6.0)을 사용하여 IFNα-PEG 연결체를 정제하였고, PEG와 결합하지 않은 인터페론 알파, 미반응 PEG, 및 PEG의 양쪽 말단에 2개의 인터페론 알파가 연결된 이량체 부산물을 제거하였다. IFNα-PEG 연결체를 면역글로블린 Fc 라이신 잔기의 아미노 그룹 부위에 융합하기 위하여 정제된 IFNα-PEG 연결체를 약 5 ㎎/㎖로 농축한 후, 실시예 1의 단계 3 및 4와 동일한 방법으로 IFNα-PEG-Fc 결합체를 제조 및 정제하였다. 이로부터 반응성이 가장 좋고 이량체 등과 같은 부산물이 적은 인터페론 알파:PEG의 최적 반응 몰비는 1:2.5 내지 1:5임이 확인되었다.
한편, 상기와 동일한 방법을 수행하되 양쪽 말단의 반응 그룹이 모두 N-하이드록시석시니미딜(N-hydroxysuccinimidyl; NHS)인 PEG(NHS-PEG-NHS; Shearwater사) 또는 부틸알데히드(buthyl aldehyde)인 PEG(BUA-PEG-BUA; Shearwater사)를 사용하여 IFNα-PEG-Fc 결합체의 생성을 확인하였다.
<실시예 7> 분자량이 다른 PEG를 이용한 단백질 결합체의 제조
분자량이 10 kDa이고, 양쪽 말단에 알데히드 반응기를 가진 폴리에틸렌 글리콜인 ALD-PEG-ALD(Shearwater사)를 사용하여 실시예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 IFNα-10K PEG 연결체를 제조 및 정제하였다. 이때, 반응성이 가장 좋고 이량체 등과 같은 부산물이 적은 인터페론 알파:10K PEG의 최적 몰비는 1:2.5 내지 1:5임이 확인되었다. 정제된 IFNα-PEG 연결체를 약 5 ㎎/㎖이 되도록 농축한 후, 이를 이용하여 실시예 1의 단계 3 및 4와 동일한 방법으로 IFNα-10K PEG-Fc 단백질 결합체를 제조 및 정제하였다.
<실시예 8> Fab’-S-PEG-N-Fc 결합체의 제조(-SH기)
<단계 1> Fab’의 발현 및 정제
항-종양 괴사인자-알파 Fab’를 발현하는 대장균 형질전환체 BL21/poDLHF(기탁번호: KCCM-10511)를 LB 배지 100 ㎖에 접종하여 밤새 진탕 배양한 후 5 ℓ의 발효기(Marubishi)에 접종하여 온도 30℃, 공기 투입량 20 vvm, 교반 속도 500 rpm의 조건하에서 배양하였다. 발효가 진행됨에 따라 미생물의 성장을 위해 부족한 에너지원은 포도당(glucose)과 효모 추출액(yeast extract)을 미생물의 발효 상태에 따라 투여하였고, 흡광도 600 ㎚에서 OD값이 80이 되는 시기에 IPTG를 투여하여 단백 질 발현을 유도하였다. 이를 40 내지 45시간 동안 배양하여 흡광도 600 ㎚에서 OD값이 120 내지 140이 되도록 고농도로 배양하였다. 얻어진 발효액을 원심분리(20,000 g, 30분)하여 침전물은 버리고 상층액만을 취하였다.
얻어진 상층액으로부터 다음과 같은 3 단계의 컬럼 크로마토그래피를 거쳐 항-종양괴사인자-알파 Fab’를 순수하게 정제하였다. 20 mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 HiTrap 단백질 G 컬럼(5 ㎖, Pharmacia사)에 상기 상층액을 점적한 후, 100 mM 글리신(Glycine, pH 3.0) 완충액으로 용출하였다. 용출된 Fab’ 분획을 10 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200 컬럼(Superdex 200, Pharmacia사)에 점적하였으며, 동일한 완충액으로 용출하였다. 용출된 Fab’ 분획을 polyCAT 21×250 컬럼(PolyLC사)을 사용하여 최종 정제하였는데, 10 mM 아세테이트 완충액(pH 4.5)을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0.15 M → 0.4 M) 방법으로 흘려 순수한 항-종양괴사인자-알파 Fab’ 분획을 었다.
<단계 2> Fc-PEG 연결체의 제조 및 정제
면역글로블린 Fc N 말단의 아미노 그룹에 링커 PEG를 결합시키기 위하여 상기 실시예 1의 단계 1과 동일한 방법으로 제조된 면역글로불린 Fc를 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)에 5 ㎎/㎖ 농도로 용해시키고, 여기에 NHS-PEG-MAL(3.4 kDa, Shearwater사)을 Fc:PEG의 몰비가 1:10이 되도록 첨가한 후, 4℃에서 천천히 교반하면서 12시간 동안 반응시켰다.
반응 종료 후, 반응 완충액을 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 교환하 면서 반응하지 않은 NHS-PEG-MAL을 제거하였다. 완충액 교환 후 반응물을 polyCAT 컬럼(PolyLC사)에 부하하고, 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0.15 M → 0.5 M) 방법으로 흘려 면역글로불린 Fc-PEG 연결체를 먼저 용출하여 얻고, 이후에 반응하지 않은 면역글로불린 Fc를 용출시켜 제거하였다.
<단계 3> Fab’-S-PEG-N-Fc 결합체(-SH기)의 제조 및 정제
Fab' 의 유리 시스테인 그룹에 면역글로블린 Fc-PEG 연결체를 결합시키기 위하여 단계 1에서 정제된 Fab’를 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)에 2 ㎎/㎖로 용해시킨 후, 동일한 완충액에 단계 2에서 준비된 면역글로불린 Fc-PEG 연결체를 Fab’:연결체의 몰비가 1:5가 되도록 넣어주었다. 최종 단백질 농도가 50 ㎎/㎖이 되도록 농축하였고, 4℃에서 천천히 교반하면서 24시간 동안 반응시켰다.
커플링 반응 종료 후, 반응액을 10 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200 컬럼(Superdex 200, Pharmacia사)에 점적하였으며, 동일한 완충액을 1 ㎖/분의 유속으로 흘려 용출시켰다. 커플링된 Fab’-S-PEG-N-Fc 결합체는 분자량이 커서 먼저 용출되고, 반응하지 않은 면역글로불린 Fc-PEG 연결체 및 Fab’는 이후에 용출되어 제거할 수 있었다. 잔존하는 미반응 면역글로불린 Fc를 완전히 제거하기 위해, 용출된 Fab’-S-PEG-N-Fc 결합체 분획을 다시 polyCAT 21×250 컬럼(PolyLC사)에 점적하고, 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0.15 M → 0.5 M) 방법으로 흘려 Fc-PEG 연결체가 Fab’의 C-말단 부근 -SH기에 연결된 Fab’-S-PEG-N-Fc 결합체를 순수하게 얻었다.
<실시예 9> Fab’-N-PEG-N-Fc 결합체의 제조(N-말단)
<단계 1> Fab’-PEG 연결체(N-말단)의 제조 및 정제
상기 실시예 8의 단계 1에서 얻은 정제된 Fab’ 40 ㎎을 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)에 5 ㎎/㎖로 용해시킨 후, 부틸ALD-PEG-부틸ALD(3.4 kDa, shearwater사)을 Fab’:PEG의 몰비가 1:5가 되도록 첨가하였다. 환원제로서 NaCNBH3를 최종 농도가 20 mM이 되도록 첨가한 후, 4℃에서 천천히 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다.
반응 종료 후, 반응 완충액을 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 교환하였다. 완충액 교환 후 반응물을 polyCAT 컬럼(PolyLC사)에 부하하고, 20 mM 아세테이트 완충액(pH 4.5)을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0.15 M → 0.4 M) 방법으로 흘려 Fab' N 말단에 링커 PEG 결합된 Fab’-PEG 연결체 분획을 먼저 용출하여 얻고, 이후에 반응하지 않은 Fab’를 용출시켜 제거하였다.
<단계 2> Fab’-N-PEG-N-Fc 결합체의 제조 및 정제
단계 1에서 정제된 Fab’-PEG 연결체를 면역글로블린 Fc N 말단에 결합시키기 위하여 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)에 10 ㎎/㎖로 용해시킨 후, 동일한 완충액에 용해된 면역글로불린 Fc를 Fab’-PEG 연결체:Fc의 몰비가 1:5가 되도록 넣어주었다. 최종 단백질 농도가 50 ㎎/㎖이 되도록 농축하였고, 환원제로서 NaCNBH3를 최종 농도가 20 mM이 되도록 첨가한 후, 4℃에서 천천히 교반하면서 24시간 동안 반응시켰다.
커플링 반응 종료 후, 반응액을 10 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200 컬럼(Superdex 200, Pharmacia사)에 점적하였으며, 동일한 완충액을 1 ㎖/분의 유속으로 흘려 용출시켰다. 커플링된 Fab’-N-PEG-N-Fc 결합체는 분자량이 커서 먼저 용출되고, 반응하지 않은 면역글로불린 Fc 및 Fab’-PEG 연결체는 이후에 용출되어 제거할 수 있었다. 잔존하는 미반응 면역글로불린 Fc를 완전히 제거하기 위해, 용출된 Fab’-N-PEG-N-Fc 결합체 분획을 다시 polyCAT 21×250 컬럼(PolyLC사)에 부하하고, 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0.15 M → 0.5 M) 방법으로 흘려 면역글로불린 Fc-PEG 연결체가 Fab’의 N-말단에 연결된 Fab’-N-PEG-N-Fc 결합체를 순수하게 얻었다.
<실시예 10> 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc의 제조 및 정제
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 면역글로불린 Fc 200 ㎎을 100 mM 인산염 완충액(pH 7.5)에 2 ㎎/㎖이 되도록 준비한 후, 탈당쇄화 효소인 PNGase F(NEB사)를 300 U/㎎이 되도록 첨가하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 24시간 동안 천천히 교반하면서 반응시켰다. 반응 종료 후, 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc를 정제하기 위하여 반응물을 SP 세파로즈 FF 컬럼(Pharmacia사)에 부하하고, 10 mM 아세테이트 완충액(pH 4.5) 조건에서 1 M NaCl을 사용한 직선 농도구배(0.1 M → 0.6 M) 방법으로 용출하여, 천연형 면역글로불린 Fc 분획을 먼저 용출한 후, 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc (deglycosylated Fc: DG Fc)를 용출하여 얻었다.
<실시예 11> IFNα-PEG-DG Fc 결합체의 제조
상기 실시예 1의 단계 2에서 정제된 IFNα-PEG 연결체에 상기 실시예 10에서 제조된 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc를 결합시키기 위하여, IFNα-PEG 연결체를 10 mM 인산염 완충액에 용해된 DG Fc에 IFNα-PEG 연결체:DG Fc의 몰비가 각각 1:1, 1:2, 1:4 및 1:8이 되도록 첨가하여 반응시켰다. 반응액을 100 mM 인산염 완충액 상태로 만들었고, 환원제로서 NaCNBH3를 최종 농도가 20 mM이 되도록 첨가한 후 4℃에서 20시간 동안 천천히 교반하면서 반응시켰다. 이로부터 반응성이 가장 좋고 이량체 등과 같은 부산물이 적은 IFNα-PEG 연결체:DG Fc의 최적 반응 몰비는 1:2임을 확인하였다.
융합반응 후 미반응 물질 및 부산물을 제거하고 생성된 IFNα-PEG-DG Fc 결합체를 정제하기 위하여 반응 혼합물을 이용하여 슈퍼덱스(SuperdexR, Pharmacia사) 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 인산염 완충액(pH 7.3)을 이용하여 유속 2.5 ㎖/분으로 컬럼에 통과시켜 결합되지 않은 DG Fc 및 미반응 물질을 제거하고 IFNα-PEG-DG Fc 단백질 결합체 분획을 정제하였다. 이로부터 얻어진 IFNα- PEG-DG Fc 단백질 결합체 분획에는 불순물로서 소량의 미반응 DG Fc 및 인터페론 알파-PEG 연결체가 혼재되어 있기 때문에 이를 제거하기 위해 추가로 양이온 교환수지 크로마토그래피를 수행하였다. IFNα-PEG-DG Fc 단백질 결합체 분획을 10 mM 아세트산 나트륨(pH 4.5)으로 평형화시킨 PolyCAT LP 컬럼(PolyLC사)에 넣고 1 M NaCl을 포함한 10 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.5)을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0 M → 0.6 M) 방법으로 흘려 추가로 정제하였고, 마지막으로 음이온 교환컬럼을 사용하여 IFN α-PEG-DG Fc 단백질 결합체를 순수하게 획득하였다. PolyWAX LP 컬럼(PolyLC사)을 10 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형화시킨 후 정제된 IFNα-PEG-DG Fc 단백질 결합체 분획을 부하하고, 1 M 염화나트륨을 포함한 10 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0 M → 0.3 M) 방법으로 흘려 순수한 IFNα-PEG-DG Fc 단백질 결합체를 정제하였다.
<실시예 12> 재조합 비당쇄화 면역글로불린 Fc 유도체의 제조 및 정제
<IgG4 Fc 유도체1 발현벡터 제조>
사람 면역글로불린 IgG4 중쇄 불변영역을 제조하기 위하여, 천연형 힌지 영역에서 아미노 말단으로부터 9개 아미노산이 제거된 유도체1(IgG4 delta-Cys)와 12개 아미노산 모두가 제거되어 힌지 영역이 결실된 유도체2(IgG4 단량체)를 제조하였다. 대장균 분비서열을 포함한 발현벡터는 본 발명자들에 의해 개발된 pT14S1SH-4T20V22Q(대한민국특허 제38061호)를 사용하였다.
사람 면역글로불린 IgG4의 중쇄 불변 영역을 제작하기 위해 사람의 혈액에서 수득한 혈구 세포의 RNA를 주형으로 하여 다음과 같은 RT-PCR을 수행하였다. Qiamp RNA blood 키트 (Qiagen사)를 사용하여 약 6 ㎖의 혈액에서 전체 RNA를 수득한 후 이 RNA를 주형으로 하고 서열 번호 1 및 2, 서열 번호 2와 3의 프라이머 쌍을 합성 후 One-Step RT-PCR 키트 (Qiagen사)를 사용하여 유전자를 증폭하였다. 서열번호 1은 하기 IgG4 힌지 영역의 12개 아미노산 서열중 10번째 아미노산 서열인 세린으로부터 시작되는 서열이며 서열번호 3은 CH2 도메인의 첫 번째 아미노산인 알라닌으로 시작되게 설계되어 있다. 서열번호 2는 종결 코돈을 포함한 BamHI 제한효소 인식부위를 삽입하였다.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca tca tgc cca
ctc agg ttt ata cca ggg ggt acg ggt agt acg ggt
Glu Ser Lys Ty rGly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
각기 증폭된 IgG4 불변 영역 단편들을 대장균 분비서열 유도체를 이용한 발현벡터에 클로닝하기 위해 본 발명자들에 의해 개발된 발현벡터인 pT14S1SH-4T20V22Q (대한민국 특허 제38061호)를 사용하였다. 상기 발현벡터는 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 열안정성 엔테로톡신 분비서열 유도체를 포함한다. 클로닝을 용이케 하기 위해 pT14S1SH-4T20V22Q 플라스미드의 열안정성 엔테로톡신 분비서열 유도체에 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍을 사용한 특정 부위 치환 돌연변이법 (site-directed mutagenesis)을 수행하여 분비 서열의 마지막 유전자 서열에 StuI 제한효소 인식부위를 삽입하였으며 염기서열 분석법을 통해 정확히 StuI 제한효소 인식부위가 생성되었음을 확인하였다. pT14S1SH-4T20V22Q 플라스미드에 StuI 제한효소 인식부위가 생성된 플라스미드를 pmSTII로 명명하였다. 상기와 같이 제작된 플라스미드 pmSTII에 StuI/BamHI 제한효소를 처리한 후 아가로즈 겔에 전기영동을 수행하여 대장균 열안정성 엔테로톡신 분비서열 유도체를 포함하는 큰 단편 (4.7 kb)을 회수하였다. 상기에서 증폭된 유전자들를 BamHI 제한효소를 처리한 후 발현 벡터에 삽입하여 플라스미드 pSTIIdCG4Fc 및 pSTIIG4Mo를 제작하였다.
상기 제작된 발현벡터를 발현 숙주인 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시켜 대장균 형질전환체 BL21/pSTIIdCG4Fc(HM10932)과 BL21/pSTIIG4Mo(HM10933)를 얻고 이들을 한국미생물보존센타(KCCM)에 2004년 9월 15일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM-10597, KCCM-10598) 이후, 흡광도 600 ㎚에서 OD값이 80이 되는 시기에 유도물질(inducer)인 IPTG를 투여하여 발현을 유도하였다. 이를 40 내지 45시간 동안 배양하여 흡광도 600 ㎚에서 OD값이 100 내지 120이 되도록 고농도로 배양하였다. 발효액으로부터 회수된 대장균 세포를 파쇄하여 세포 용혈액(cell lysate)을 얻고, 세포질내에 존재하는 재조합 면역글로불린 불변영역 유도체를 2단계 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다.
단백질 A 친화컬럼(protein A affinity column, Pharmacia사) 5 ㎖을 PBS로 평형화한 후, 상기 세포 용혈액을 5 ㎖/분의 유속으로 부하하였다. 결합하지 않은 분획을 PBS로 세척한 후, 100 mM 시트레이트 용액(pH 3.0)으로 용출하였다. 용출된 분획을 탈염컬럼(desalting column, HiPrep 26/10, Pharmacia사)을 사용하여 10 mM Tris 완충액(pH 8.0)으로 교환하였다. 그 후, Q HP 26/10 컬럼(Pharmacia사) 50 ㎖을 사용하여 2차 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 실시하고, 1차 정제된 재조합 AG Fc 유도체 분획을 결합시킨 후 10 mM Tris 조건(pH 8.0)에서 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0 M → 0.2 M) 방법으로 흘려 재조합 비당쇄화 면역글로불린 Fc(aglycosylated Fc: AG Fc) 유도체인 IgG4 delta-Cys 및 IgG4 단량체 분획을 고순도로 얻었다.
<실시예 13> 인터페론 알파-PEG 연결체와 재조합 AG Fc 유도체의 결합체 제조
상기 실시예 1 및 11과 동일한 방법으로, 실시예 12에서 제조된 AG Fc 유도체인 IgG4 delta-Cys N 말단에 IFNα-PEG 연결체를 결합시켰다. 융합반응 후 미반응 물질 및 부산물을 제거하고 생성된 IFNα-PEG-AG Fc 단백질 결합체(I)를 정제하기 위하여 Q HP 26/10 컬럼(Pharmacia사) 50 ㎖을 사용하여 1차 정제한 후 고압컬럼인 polyCAT 21.5×250 컬럼(polyLC사)으로 고순도의 결합체를 정제하였다. 커플링 반응액을 탈염컬럼 HiPrep 26/10 (Pharmacia사)을 사용하여 10 mM Tris 완충액(pH 8.0)으로 교환한 후 Q HP 26/10 50 ㎖ 컬럼에 8 ㎖/분의 유속으로 부하하여 결합시킨 후, 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0 M → 0.2 M) 방법으로 원하는 분획을 얻었다. 용출된 분획을 10 mM 아세트산 완충액(pH 5.2)으로 평형화된 polyCAT 21.5×250 컬럼에 15 ㎖/분 유속으로 다시 결합시킨 후 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0.1 M → 0.3 M) 방법으로 용출하여 고순도의 분획을 얻을 수 있었다. 동일한 방법으로, 실시예 12에서 제조된 또 다른 AG Fc 유도체인 IgG4 단량체를 사용하여 IFNα-PEG-AG Fc 단백질 결합체(Ⅱ)를 제조하였다.
<실시예 14> 인간 적혈구 생성인자(EPO)-PEG-재조합 AG Fc 유도체의 결합체 제조
상기 실시예 13과 동일한 방법으로, EPO-PEG 연결체와 AG Fc 유도체인 IgG4 delta-Cys가 연결된 결합체를 제조하였다.
<비교예 1> IFNα-40K PEG 연결체의 제조
100 mM 인산칼륨 완충액(pH 6.0)에 인터페론 알파 5 ㎎을 넣어 최종 부피 5 ㎖가 되도록 준비한 후, PEG의 분자량이 40 kDa인 활성화된 메톡시-PEG-알데히드(Shearwater사)를 인터페론 알파:40K PEG의 몰비가 1:4가 되도록 상기 용액에 첨가하였다. 상기 반응용액에 환원제인 NaCNBH3를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가한 후, 4℃에서 18시간 동안 서서히 교반시키면서 반응시켰다. 인터페론 알파에 반응하지 않은 PEG를 불활성화시키기 위해 에탄올아민을 최종 농도가 50 mM이 되도록 첨가하였다.
미반응 PEG의 분리 및 완충액 교체를 위해 세파덱스 G-25 컬럼(Pharmacia사)을 이용하였다. 먼저, 2 칼럼 부피(column volume; CV)의 10 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 컬럼을 평형화시킨 후 반응 혼합물을 점적하였고, 파장 260 ㎚에서 자외부 흡광계로 흡광도를 검출하였다. 상기 컬럼을 동일한 완충액으로 용출하면 크기가 더 큰 PEG로 (N 말단에:삽입KYM) 수식된 인터페론 알파가 먼저 용출되고 미반응 PEG는 시차를 두고 나중에 용출되기 때문에 IFNα-40K PEG만을 분리할 수 있다.
상기에서 얻은 용출액으로부터 IFNα-40K PEG 연결체를 더욱 순수하게 분리, 정제하기 위해 다음과 같이 크로마토그래피를 수행하였다. 3 ㎖의 PolyWAX LP 컬럼(Polywax사)을 10 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형화시켰다. PEG-IFNα 연결체를 함유하는 용출액을 1 ㎖/분의 유속으로 컬럼에 부가한 후, 15 ㎖의 평형 완충액으로 세척하였다. 30 ㎖의 1 M NaCl 완충액으로 30분 동안 0에서 100%까지의 염 농도구배 방법을 이용하여 트리-, 디- 및 모노-PEG가 결합된 인터페론 알파를 순서대로 용출시켰다.
더욱 순수한 모노-PEG 결합 인터페론 알파를 분리하기 위해 상기에서 수득한 모노-PEG와 인터페론 알파의 연결체 용출분획을 가지고 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 10 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200(Superdex 200, Pharmacia사)에 상기 용출액을 농축하여 점적한 후 동일한 완충액으로 용출하였다. 이때, 1 ㎖/분의 유속으로 완충액을 흘려주었다. 트리- 및 디-PEG가 결합된 인터페론 알파는 모노-PEG가 결합된 인터페론 알파보다 용출시간 이 상대적으로 빠르므로 이를 제거하여 모노-PEG가 결합된 인터페론 알파만을 순수하게 분리하였다.
동일한 방법으로 인간 성장 호르몬, 과립구 콜로니 자극인자 및 그의 유도체의 아미노 말단에 40K PEG가 결합된 hGH-40K PEG, G-CSF-40K PEG 및 40K PEG-17S-G-CSF 유도체의 연결체들을 제조하였다.
<비교예 2> IFNα-PEG-알부민 결합체의 제조
실시예 1의 단계 2에서 정제된 IFNα-PEG 연결체에 알부민 아미노말단에 결합시키기 위하여 10 mM 인산염 완충액에 용해된 인간 알부민(human serum albumin, HSA, 약 67 kDa, 녹십자)을 IFNα-PEG 연결체:알부민의 몰비가 각각 1:1, 1:2, 1:4 및 1:8이 되도록 첨가한 후 반응시켰다. 반응액을 100 mM 인산염 완충액 상태로 만들었고, 환원제로서 NaCNBH3를 최종 농도가 20 mM이 되도록 첨가한 후 4℃에서 20시간 동안 천천히 교반하면서 반응시켰다. 이로부터 반응성이 가장 좋고 이량체 등과 같은 부산물이 적은 IFNα-PEG 연결체:알부민의 최적 반응 몰비는 1:2임을 확인하였다.
융합반응 후 미반응 물질 및 부산물을 제거하고 생성된 IFNα-PEG-알부민 단백질 결합체를 정제하기 위하여 슈퍼덱스 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 각 반응 혼합물을 농축한 후 10 mM 아세트산 나트륨 완충액을 유속 2.5 ㎖/분으로 컬럼에 통과시켜 결합되지 않은 알부민 및 미반응 물질을 제거하고 IFNα-PEG-알부민 단백질 결합체만을 정제하였다. 얻어진 IFNα-PEG-알부민 단백질 결합체 분획에는 불순물로서 소량의 미반응 알부민 및 인터페론 알파 이량체가 섞여 있으므로 이를 제거하기 위해 추가로 양이온 교환수지 크로마토그래피를 수행하였다. IFNα-PEG-알부민 단백질 결합체 분획을 10 mM 아세트산 나트륨 용액(pH 4.5)으로 평형화시킨 컬럼(SP5PW, Waters사)에 넣고 1 M 염화나트륨(NaCl)을 포함한 10 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.5)을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0 M → 0.5 M) 방법으로 흘려 추가로 정제하였고, IFNα-PEG-알부민 단백질 결합체를 순수하게 획득하였다.
동일한 방법으로 인간 성장 호르몬, G-CSF 및 그의 유도체에 각각 알부민이 결합된 hGH-PEG-알부민, G-CSF-PEG-알부민 및 17S-G-CSF-PEG-알부민 결합체를 제조하였다.
<비교예 3> Fab’-S-40K PEG 연결체의 제조
실시예 8의 단계 1에서 정제된 Fab’에 존재하는 유리 시스테인기를 활성화시키기 위해, 활성화 완충액(20 mM 아세트산 나트륨(pH 4.0), 0.2 mM DTT)에 1시간 동안 방치하였다. PEG 수식 완충액인 50 mM 인산 칼륨(pH 6.5)으로 완충액을 교환한 후, 말레이미드-PEG(분자량 40 kDa, Shearwater사)를 Fab’:40K PEG의 몰비가 1:10이 되도록 첨가한 다음, 4℃에서 천천히 교반하면서 24시간 동안 반응시켰다.
반응 종료 후, 반응액을 10 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200 컬럼(Superdex 200, Pharmacia사)에 점적하였으며, 동일한 완충액을 1 ㎖/분의 유속으로 흘려 용출시켰다. 40K PEG가 수식된 Fab’-40K PEG 연결체는 분자량이 커서 반응하지 않은 Fab’보다 앞쪽에서 용출되고 Fab’는 이후에 용출되어 제거할 수 있었다. 완전히 제거되지 않은 Fab’를 제거하기 위해, 용출된 Fab’-40K PEG 연결체 분획을 polyCAT 21×250 컬럼(PolyLC사)을 사용하여 최종 정제하였는데, 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 4.5)을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0.15 M → 0.5 M) 방법으로 흘려 Fab’의 -SH기에 40K PEG가 연결된 Fab’-S-40K PEG 연결체를 순수하게 얻었다.
<실험예 1> 단백질 결합체의 확인 및 정량
<1-1> 단백질 결합체의 확인
상기 실시예들에서 제조한 단백질 결합체는 4 내지 20% 농도구배 겔 및 12% 겔을 사용한 비환원성 SDS-PAGE 및 ELISA(R&D system사) 방법으로 확인하였다.
SDS-PAGE 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체인 PEG 및 면역글로불린 Fc 영역의 커플링 반응에 의해 IFNα-PEG-Fc 결합체(A), 17Ser-G-CSF-PEG-Fc 결합체(B) 및 EPO-PEG-Fc 결합체(C)가 생성되었음을 확인하였다.
또한, 상기 실시예 10에서 제조한 DG Fc를 확인하기 위해 비환원성 12% SDS- PAGE를 수행한 결과, 도 6b에 나타난 바와 같이, 천연형 Fc에 비해 제거된 당쇄 분자량만큼 감소한 위치에서 DG Fc 밴드가 검출되었다.
<1-2> 단백질 결합체의 정량
상기 실시예에서 제조한 각각의 단백질 결합체의 양은 슈퍼덱스 컬럼(Superdex 75 26/60, Pharmacia사)과 10 mM 칼륨-포스페이트 완충액(pH 6.0)을 용출액으로 사용하는 크기 배제 크로마토그래피 상에서 피크면적을 대조구와 비교하여 환산하는 방법으로 계산하였다. 이미 정량되어 있는 IFNα, hGH, G-CSF, 17S-G-CSF, EPO 및 Fc로 각각 크기 배제 크로마토그래피를 실시한 후 농도와 피크면적 간의 환산계수를 측정하였다. 각 단백질 결합체의 일정량을 사용하여 동일한 크기 배제 크로마토그래피를 실시하고, 여기서 얻어진 피크면적에서 면역글로불린 Fc 영역에 해당하는 피크면적을 뺀 값을 각 단백질 결합체에 존재하는 생리활성 단백질의 정량 값으로 결정하였다. 도 4는 정제된 IFNα-PEG-Fc 결합체의 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 분석 결과를 나타낸 것으로, 이량체 이상의 다량체 불순물이 없는 단일피크를 확인하였다.
Fc가 생리활성 폴리펩타이드에 결합되면 생리활성 폴리펩타이드의 항체로 그 양을 정량할 때 항체와 상기 폴리펩타이드와의 결합이 저해되어 크로마토그래피에 의해 계산되는 실제 값보다 적게 정량된다. ELISA 분석 결과, IFNα-PEG-Fc의 경우에는 ELISA에 의해 측정된 값이 대략 실제 값의 약 30% 정도인 것으로 확인되었다.
<1-3> 단백질 결합체의 순도 및 질량 확인
각각의 실시예에서 얻은 단백질 결합체에 대해 크기 배제 크로마토그래피를 실시한 후 280㎚에서 흡광했을 때, IFNα-PEG-Fc, hGH-PEG-Fc, G-CSF-PEG-Fc 및17Ser-G-CSF-PEG-Fc는 분자량 70 내지 80 kDa인 물질의 체류시간대에서 단일 피크를 나타내었다.
한편, 실시예 1, 11 및 13에서 획득한 단백질 결합체 IFNα-PEG-Fc, IFNα-PEG-DG Fc 및 IFNα-PEG-재조합 AG Fc 유도체 시료의 순도를 분석하기 위해 역상 HPLC를 수행하였다. 역상 컬럼(Vydac사, 259 VHP54 칼럼)을 이용하여 분석하였고, 0.5% TFA 존재하에 아세토니트릴 용매를 이용하여 100%까지 농도구배(40 내지 100%) 방법을 이용하여 280 ㎚의 파장에서 순도를 분석하였다. 그 결과, 도 8에서 알 수 있듯이, 결합하지 않은 인터페론이나 면역글로불린 Fc는 존재하지 않았으며 IFNα-PEG-Fc 결합체(A), IFNα-PEG-DG Fc 결합체(B) 및 IFNα-PEG-재조합 AG Fc 유도체 결합체(C) 모두 96% 이상의 순도로 순수하게 정제되었음을 알 수 있었다.
각 정제된 시료의 정확한 분자량을 확인하기 위하여, 각 시료의 질량을 MALDI-TOF(Voyager DE-STR, Applied Biosystems사) 초고속 질량분석기를 이용하여 분석하였다. 매트릭스로는 시나핀 산(sinapinic acid)을 사용하였으며, 각각의 시험용 시료 0.5 ㎕를 시료 슬라이드에 도포하여 자연 건조한 후, 동량의 매트릭스 용액을 첨가한 다음 다시 자연 건조시켜 이온원(ion source)에 도입하였다. 검출은 포지티브 방식으로 리니어 모드 TOF 방식 장치를 사용하여 수행하였으며, 이온 은 지연된 이온 추출(DE)을 사용하는 분할 추출 공급원에서, 지연된 추출 시간은 750 nsec/1500 nsec로, 약 2.5 kV의 전체 전위차를 통해 가속화하였다.
하기 표 1은 상기 실시예에서 얻은 각각의 Fc 단백질 결합체의 MALDI-TOF 질량분석 결과를 수치화하여 나타낸 것이고, 도 5는 EPO-PEG-Fc 결합체, 도 7은 IFNα-PEG-Fc 및 IFNα-PEG-DG Fc 결합체의 MALDI-TOF 질량분석 결과를 나타낸 것이다. 그 결과, 수득된 EPO-PEG-Fc 단백질 결합체의 순도는 95% 이상이었고, 이론치와 매우 가까운 분자량을 나타내었다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역에 적혈구 생성인자(EPO)가 1:1로 결합된 형태인 것으로 나타났다.
이론치(kDa) 측정치(kDa)
IFNα-PEG-Fc(실시예 1) 75.4 75.9
hGH-PEG-Fc(실시예 3) 78.4 78.6
G-CSF-PEG-Fc(실시예 4) 75.3 75.9
17S-G-CSF 유도체-PEG-Fc(실시예 4) 75.0 75.9
EPO-PEG-Fc(실시예 5) 91.4 91.0
또한, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 실시예 10에서 제조된 Fc 및 DG Fc의 분자량을 측정한 결과, DG Fc의 분자량은 천연형 Fc보다 3 kDa 정도 작은 50 kDa으로 확인되었다(도 6a). 감소한 3 kDa은 이론적 당쇄 크기에 해당하는 분자량으로 당쇄가 완전히 제거되었을 확인할 수 있었다.
하기 표 2는 상기 실시예 11에서 제조된 IFNα-PEG-DG Fc 결합체와, 실시예 13에서 제조된 IFNα-PEG-재조합 AG Fc 유도체 결합체(Ⅰ 및 Ⅱ)의 MALDI-TOF 질량 분석 결과를 나타낸 것이다. IFNα-PEG-Fc 결합체의 분자량(75.9 kDa)과 비교했을 때, IFNα-PEG-DG Fc 결합체는 약 3 kDa 정도 작은 분자량을 나타내었고, IFNα-PEG-재조합 AG Fc 유도체 결합체(Ⅰ)는 약 3-4 kDa 정도 작은 분자량을 나타내었다. Fc 단량체와 연결된 IFNα-PEG-재조합 AG Fc 유도체 결합체(Ⅱ)의 분자량은 Fc 단량체 분자량에 해당하는 24.5 kDa이 감소한 분자량을 나타내었다.
이론치(kDa) 측정치(kDa)
IFNα-PEG-DG Fc (실시예 11) 72.8 73.0
IFNα-PEG-재조합 AG Fc 유도체(I) (실시예 13) 72.3 72.2
IFNα-PEG-재조합 AG Fc 유도체(II) (실시예 13) 46.8 46.6
<실험예 2> 약물동력학 조사 Ⅰ
각 군당 5 마리의 SD 랫트(Rat)에 천연형 생리활성 단백질(대조군)과 상기 실시예 및 비교예에서 제조한 -40K PEG 연결체, -PEG-알부민 결합체, -PEG-Fc 결합체, -PEG-DG Fc 결합체, 및 -PEG-재조합 AG Fc 유도체 결합체의 혈액내 안정성 및 약물동력학 계수를 비교하였다. 대조군 및 -40K PEG 연결체, -PEG-알부민 결합체, -PEG-Fc 결합체, -PEG-DG Fc 결합체, 및 -PEG-재조합 AG Fc 유도체 결합체(시험군)를 각 100 ㎍/㎏씩 피하주사한 후, 대조군은 주사 후 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 30, 48, 72 및 96시간 후에 채혈하였고, 시험군은 주사 후 1, 6, 12, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 240 및 288시간 후에 채혈하였다. 헤파린을 함유하는 튜브에 혈액시료를 모아 응고를 방지하였고, 에펜도르프 고속 마이크로 원심분리기에서 5분간 원 심분리하여 세포를 제거하였다. 혈장내 단백질 양은 각 생리활성 단백질에 대한 항체를 이용하여 ELISA 방법으로 측정하였다.
IFNα, hGH, G-CSF 또는 EPO의 천연형 단백질, 이들의 -40K PEG 연결체, -PEG-알부민 결합체, -PEG-Fc 결합체, 및 -PEG-DG Fc 결합체의 약물동력학 분석 결과를 하기 표 3 내지 표 7에 나타내었다. 하기 표에서 Tmax는 최고 약물 농도에 도달하는 시간을, T1/2는 약물의 혈중반감기를, MRT(mean residence time)는 약물분자의 평균적인 체내 체류시간을 의미한다.
천연형 IFNα IFNα-40K PEG (비교예 1) IFNα -PEG-알부민 (비교예 2) IFNα -PEG-Fc (실시예 1) IFNα -PEG-DG Fc (실시예 11) IFNα-PEG-재조합 AG Fc 유도체(I) (실시예 13) IFNα-PEG-재조합 AG Fc 유도체(II) (실시예 13)
Tmax(hr) 1.0 30 12 30 48 24 24
T1/2(hr) 1.7 35.8 17.1 90.4 71.0 61.2 31.2
MRT(hr) 2.1 71.5 32.5 150.1 120.6 111.0 58.8
천연형 hGH hGH-40K PEG (비교예 1) hGH-PEG-알부민 (비교예 2) hGH-PEG-Fc (실시예 3)
Tmax(hr) 1.0 12 12 12
T1/2(hr) 1.1 7.7 5.9 11.8
MRT(hr) 2.1 18.2 13.0 18.8
천연형 G-CSF G-CSF-40K PEG (비교예 1) G-CSF-PEG-알부민 (비교예 2) G-CSF-PEG-Fc (실시예 4)
Tmax(hr) 2.0 12 12 12
T1/2(hr) 2.8 4.8 5.2 6.9
MRT(hr) 5.2 24.5 25.0 32.6
17S-G-CSF 유도체 17S-G-CSF-40K PEG (비교예 1) 17S-G-CSF-PEG-알부민 (비교예 2) 17S-G-CSF-PEG-Fc (실시예 4)
Tmax(hr) 2.0 24 24 24
T1/2(hr) 2.9 4.3 6.4 7.0
MRT(hr) 5.8 24.4 25.1 33.2
천연형 EPO 고 당쇄화 EPO EPO-PEG-Fc (실시예 5) EPO-PEG-재조합 AG Fc 유도체 (실시예 13)
Tmax(hr) 6.0 12 30 48
T1/2(hr) 9.4 18.4 61.5 87.9
MRT(hr) 21.7 26.8 117.6 141.6
상기 표 3 및 도 9의 약물 동력학 그래프에서 알 수 있듯이, IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체의 경우 혈중반감기는 90.4시간으로 천연형에 비해 약 50배 증가하였으며, 이는 비교예 1에서 제조한 IFNα-40K PEG의 반감기인 35.8시간보다 약 2.5배 증가한 것이다. 또한, IFNα-PEG-알부민의 반감기인 17.1시간에 비해서도 본 발명의 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체가 월등히 우수한 혈중반감기를 나타냄을 확인하였다.
한편, 표 3 및 도 11에 나타난 바와 같이, IFNα-PEG-DG Fc 결합체의 경우에는 혈중반감기가 71.0시간으로 IFNα-PEG-Fc 결합체와 거의 동등하여 당쇄가 없더라도 생체내 안정성에는 큰 영향이 없으며, 재조합 방법으로 생산된 재조합 AG Fc 유도체를 이용한 결합체도 천연형 유래 DG Fc와 동일한 효과를 나타냄을 확인하였다. 그러나, Fc 단량체를 사용한 결합체의 경우에는 정상적인 Fc 이량체의 결합체 와 비교했을 때 약 2배 감소한 혈중반감기를 나타내었다.
인간 성장 호르몬의 경우도 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단백질 결합체가 나타내는 혈중반감기의 증가효과를 확인할 수 있다. 즉, 천연형(1.1시간)에 비해서 hGH-40K PEG 연결체 및 hGH-PEG-알부민 결합체의 반감기가 7.7시간 및 5.9시간으로 다소 증가한 반면, 본 발명의 hGH-PEG-Fc 단백질 결합체의 경우에는 혈중반감기가 11.8시간으로 획기적으로 증가하였다.
표 5 및 표 6에서의 과립구 콜로니 자극인자와 그의 유도체에 대한 약물동력학 분석 결과에서도, 천연형, -40K PEG 연결체 및 -PEG-알부민 결합체에 비해 본 발명의 G-CSF-PEG-Fc 및 17S-G-CSF-PEG-Fc 결합체가 훨씬 긴 혈중반감기를 나타내었다. 단백질의 혈중 지속성을 증가시키는 면역글로불린 Fc 영역의 효과는 천연형 생리활성 단백질 뿐만 아니라 일부 아미노산을 변형시킨 유도체에서도 천연형과 비슷한 정도임을 확인할 수 있었고, 이러한 결과로부터 본 발명의 방법이 다른 단백질의 유도체에서도 유사한 효과를 나타낼 것임을 쉽게 예상할 수 있다.
표 7 및 도 10에서 보듯이, 당쇄화가 되어 있는 천연형 단백질인 적혈구 생성인자에 대해서도 본 발명의 단백질 결합체의 혈중반감기 증가효과가 확인되었다. 즉, 천연형 적혈구 생성인자의 혈중반감기가 9.4시간이고, EPO를 고 당쇄화시켜 혈중 안정성을 높인 다베포에틴-α(Darbepoetin-α, Aranesp, Amgen사)의 경우는 반감기가 18.4시간으로 증가하는 것으로 나타났다. 적혈구 생성인자에 면역글로불린 Fc 영역을 결합시킨 본 발명의 EPO-PEG-Fc 결합체의 경우에는 혈중반감기가 무려 61.5시간으로 획기적으로 증가하였으며, 당쇄가 제거된 대장균 유래 재조합 AG Fc 유도체를 사용한 결합체의 경우는 87.9시간까지 반감기 증가를 보여 당쇄가 제거되어도 혈중 안정성에는 영향을 미치지 않으면서 항체 기능이 없는 결합체를 제조할 수 있음을 확인하였다.
상기 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 면역글로불린 Fc 영역 및 비펩타이드성 중합체와 공유결합된 단백질 결합체들은 천연형 단백질들에 비해 수배에서 수십배 이상 증가된 혈중반감기를 나타내었다. 또한, 면역글로불린 Fc를 유전자 재조합 방법으로 대장균에서 생산하거나, 효소 처리에 의해 당쇄를 제거하여도 이를 이용하여 제조된 단백질 결합체에서의 혈중반감기 증가효과는 비슷하게 유지되었다.
특히, 기존의 단백질 혈중 지속성을 증가시키기 위한 PEG 제형 중 지속성이 가장 높은 40 kDa PEG를 수식한 단백질과의 비교에서도 면역글로불린 Fc 단백질 결합체가 월등하게 높은 혈중 안정성을 나타내었다. 또한, 면역글로불린 Fc 대신 알부민을 결합시킨 단백질 결합체와의 비교시험에서도 본 발명의 단백질 결합체가 탁월한 혈중 안정성을 보여줌으로써 본 발명의 단백질 결합체가 지속형 단백질 약물 제제 개발에 효과적임을 확인할 수 있었다. 점 돌연변이(point mutation)에 의한 콜로니 자극인자 유도체까지 광범위한 범위의 단백질에서 종래의 PEG 결합 단백질 또는 알부민 단백질 결합체보다 탁월한 혈중 안정성과 평균 체류시간(MRT)을 나타내는 결과를 볼 때, 본 발명의 단백질 결합체에 의한 안정성 및 지속성 증가효과는 다른 생리활성 폴리펩티드에도 적용 가능함을 알 수 있다.
한편, 비펩타이드성 중합체로서 10 kDa PEG를 사용한 IFNα-10K PEG-Fc 단백 질 결합체(실시예 7)를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 혈중반감기를 측정했을 때, 혈중반감기는 48.8시간으로 나타나 분자량 3.4 kD인 PEG를 사용한 단백질 결합체의 혈중반감기인 79.7시간보다 다소 감소하였다.
또한, 비펩타이드성 중합체인 PEG의 분자량 증가에 따라 혈중반감기는 오히려 다소 감소하였는데, 이러한 결과로부터 단백질 결합체의 혈중 안정성 및 지속성 증가의 주된 요인이 비펩타이드성 중합체의 분자량보다는 결합된 면역글로불린 Fc 영역에 의한 효과임을 확인할 수 있다.
PEG의 반응기를 알데히드 반응기 외의 반응기로 변화시킨 경우에도 겉보기 분자량과 혈중반감기가 알데히드 반응기를 갖는 PEG를 사용한 경우와 유사한 양상을 보였다.
<실험예 3> 약물동력학 조사 Ⅱ
실시예 8 및 9에서 제조된 Fab’-S-PEG-N-Fc, Fab’-N-PEG-N-Fc 결합체 및 비교예 3에서 제조된 Fab’-S-40K PEG 연결체의 혈중반감기를 측정하기 위하여, Fab’를 대조군으로 하고 상기 결합체 또는 연결체를 이용하여 실험예 2와 동일한 방법으로 약물 동력학 조사를 실시하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, Fab’-S-PEG-N-Fc 및 Fab’-N-PEG-N-Fc 결합체들이 Fab’ 또는 Fab’-S-40K PEG 연결체에 비해 2 내지 3배 연장된 혈중반감기를 나타내었다.
<실험예 4> 세포내 활성 측정
<4-1> 인터페론 알파 단백질 결합체의 세포내 활성비교
인터페론 알파 단백질 결합체의 세포내 활성비교를 위하여, IFNα-PEG-Fc(실시예 1), IFNα-PEG-DG Fc(실시예 11), IFNα-PEG-재조합 AG Fc 유도체(실시예 13), IFNα-40K PEG(비교예 1) 및 IFNα-PEG-알부민(비교예 2)의 항바이러스 활성을 수포성 구내염 바이러스로 포화시킨 마딘-다비 소 신장세포(MDBK, Madin Darby Bovine Kidney, ATCC CCL-22)를 사용하는 세포배양 생검으로 측정하였다. 이때, PEG가 결합되지 않은 인터페론 알파-2b(NIBSC 국제표준품)를 표준물질로 사용하였다.
MDBK 세포를 MEM(minimum essential medium: JBI사)에 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 측정하고자 하는 시료 및 표준물질을 일정 농도로 세포 배양배지에 희석하여 96웰 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 분주하였다. 상기에서 배양된 세포를 플라스크에서 떼어내어 시료가 분주되어 있는 플레이트에 100 ㎕씩 가한 후, 37℃, 5% CO2 조건에서 약 1시간 가량 배양하였다. 1시간 후 바이러스 농도가 5 내지 7×103 PFU가 되도록 조절된 VSV(Vesilculer stomatitis virus)를 50 ㎕씩 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 조건에서 약 16 내지 20시간 추가로 배양하였다. 시료 및 표준물질을 넣 지 않고 세포와 바이러스만을 넣은 웰을 음성 대조군으로, 바이러스 희석용액을 넣지 않고 세포만 넣은 웰을 양성 대조군으로 각각 사용하였다.
배양액을 제거하고 살아있는 세포를 염색하기 위하여 뉴트랄 레드(neutral red) 용액 100 ㎕씩을 첨가한 후 37℃, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 배양하였다. 상등액을 제거한 후 100% 에탄올과 1% 아세트산을 1:1로 섞어서 100 ㎕씩 넣어주었다. 염색된 세포를 잘 흔들어서 녹인 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군을 블랭크(blank)로 하고, 양성 대조군을 세포 성장 100%로 간주하여 50% 세포 성장시의 농도(ED50)를 계산하였다.
농도(ng/㎖) 비활성(IU/㎎) 천연형 IFNα에 대한 상대적 활성(%)
천연형 IFNα 100 4.24E+08 100
IFNα-40K PEG 100 2.04E+07 4.8
IFNα-PEG-알부민 100 2.21E+07 5.2
IFNα-PEG-Fc 100 1.19E+08 28.1
IFNα-PEG-DG Fc 100 1.09E+08 25.7
IFNα-PEG-재조합AG Fc 유도체 100 9.58E+07 22.6
그 결과, 표 8에서 보는 바와 같이, IFNα-40K PEG는 그 활성도가 천연형의 4.8% 수준으로 떨어짐을 확인할 수 있다. 특히, 수식된 PEG의 크기가 클수록 혈중 안정성은 증가하지만 상대적으로 활성도가 점차 감소하였는데, 인터페론 알파의 경우, 12 kDa PEG가 수식된 경우에는 25%, 40 kDa PEG가 수식된 경우에는 약 7% 정도의 시험관내 활성을 갖는다고 보고된 바 있다(P. Bailon et al., Bioconjugate Chem. 12: 195～202, 2001). 즉, PEG의 분자량이 증가하면 혈중반감기는 길어지게 되나 상대적으로 활성이 급격하게 감소되므로, 혈중반감기가 길면서 활성도 뛰어난 단백질 결합체의 개발이 요구되고 있다. 또한, IFNα-PEG-알부민 결합체도 천연형에 비하여 약 5.2% 정도로 낮은 활성을 나타내었으나, 본 발명의 IFNα-PEG-Fc 결합체 및 IFNα-PEG-DG Fc 결합체는 천연형에 비하여 상대적 활성도가 28.1% 및 25.7%로 획기적으로 높아짐을 확인할 수 있었고, 재조합 AG Fc 유도체를 사용한 결합체에서도 유사한 활성 증가효과를 보였다. 이와 같은 결과로부터 혈중반감기의 획기적 증가와 더불어 인터페론 알파와 면역글로불린 Fc 영역의 결합체의 생체내 약효가 매우 뛰어날 것을 기대할 수 있다.
<4-2> 인간 성장 호르몬 단백질 결합체의 세포내 활성비교
인간 성장 호르몬 단백질 결합체의 세포내 활성을 비교하기 위하여 hGH-PEG-Fc, hGH-40K PEG 및 hGH-PEG-알부민의 세포내 활성을 비교 시험하였다.
인간 성장 호르몬 의존성 유사분열을 하는 세포인 랫트 결절 림포종(rat node lymphoma) 세포주인 Nb2 세포(European Collection of Cell Cultures(ECACC) 97041101)를 이용하여 세포내 활성도를 시험관내 분석을 통해 측정하였다.
Nb2 세포를 배양액(Fisher’s medium)에 10% 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 0.075% NaCO3, 0.05 mM 2-메르캅토에탄올 및 2 mM 글루타민을 첨가한 배지에서 배양한 후, 10% 소 태아 혈청을 제외한 동일한 배지에서 24시간 동안 더 배양하였다. 배양액에서 배양된 세포의 수를 세어 약 2×104개의 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 넣은 후, hGH-PEG-Fc, hGH-40K PEG, hGH-PEG-알부민, 대조군인 국제표준품(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC) 및 천연형 인간 성장 호르몬(HM-hGH)을 각각 희석하여 농도별로 첨가한 후 37℃, CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 이후 세포의 성장 정도(각 웰의 세포 수)를 측정하기 위해 세포 염색약(cell titer 96 Aqueous One Solution, Promega사)을 각 웰에 25 ㎕씩 넣은 후, 4시간 동안 배양하였다. 이후 490 ㎚에서 흡광도를 측정하여 각 시료의 역가를 계산하였고, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
농도(ng/㎖) 비활성* (U/㎎) 천연형 HM-hGH에 대한 상대적 활성(%)
천연형 hGH 100 2.71E+06 100
hGH(NIBSC국제표준품) 100 2.58E+06 95.2
hGH-40K PEG 100 0.206E+06 7.6
hGH-PEG-알부민 100 0.141E+06 5.2
hGH-PEG-Fc 100 0.76E+06 28.1
비활성*= 1/ED50×106(ED50: 최대 세포 성장의 50%를 나타내는 단백질양)
표 9에서 볼 수 있듯이, 인간 성장 호르몬의 경우도 hGH-40K PEG의 활성도는 천연형의 약 7.6%로 저하되었고, hGH-PEG-알부민 결합체의 시험관내 활성은 천연형 대비 약 5.2% 정도로 낮은 활성을 나타내었다. 그러나, 본 발명의 hGH-PEG-Fc 결합체는 상대적 활성도가 천연형 대비 28% 이상 획기적으로 증가하였다. 이와 같은 결과로부터, 혈중반감기의 획기적 증가와 더불어 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역의 단백질 결합체의 생체내 약효가 매우 뛰어날 것으로 기대할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 단백질 결합체의 활성 증가는 면역글로불린 Fc로 인한 혈중 안정성 증가 및 수용체와의 결합력 보존, 또는 비펩타이드성 중합체로 인해 형성된 공간적 여유에 의한 것으로 파악되며, 이러한 작용은 다른 생리활성 단백질들의 면역글로불린 Fc 단백질 결합체에서도 유사할 것으로 기대된다.
<4-3> 과립구 콜로니 자극인자 단백질 결합체의 세포내 활성비교
과립구 콜로니 자극인자 유도체의 단백질 결합체의 세포내 활성비교를 위하여, 천연형 G-CSF(Filgrastim, 제일약품(주)), 17Ser-G-CSF 유도체, 20K PEG-G-CSF(Neulasta사), 40K PEG-17S-G-CSF, 17Ser-G-CSF-PEG-알부민 및 17S-G-CSF-PEG-Fc의 세포내 활성을 측정하였다.
우선, 인간 골수 기원의 세포주인 HL-60(ATCC CCL-240, Promyelocytic leukemia patient/36 yr old Caucasian female)을 10%의 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하다가, 세포의 숫자를 약 2.2×105 세포/㎖이 되도록 조정한 후, DMSO(dimethylsulfoxide, culture grade, Sigma사)를 최종 1.25%(v/v)가 되도록 첨가하였다. 위의 세포주를 96웰 플레이트(Corning/low evaporation 96 well plate)에 90 ㎕씩 넣어서 웰당 세포가 약 2×104개가 되도록 한 후, 5% CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 약 72시간 동안 배양하였다.
G-CSF ELISA 키트(R&D systems사)를 이용하여 농도가 결정되어진 각 시료들 을 동일한 농도가 되도록 RPMI 1640으로 희석하여 최종 농도가 10 ㎍/㎖이 되도록 하였고, 이를 다시 RPMI 1640으로 1/2로 희석하는 것을 19회 반복하였다. 이렇게 만들어진 시료를 배양 중인 HL-60 세포주의 각 웰에 10 ㎕씩 가하여, 최종 농도가 1 ㎍/㎖로부터 연속적으로 반감되도록 하였다. 위에서 제조한 단백질 시료들을 처리한 세포주는 37℃ 배양기에서 72시간을 다시 배양하였다.
배양 후 세포주의 증가 정도를 알아보기 위하여, CellTiter96TM(Cat. No. G4100, Promega사)을 이용하여 증가한 세포주의 숫자를 670 ㎚ 파장에서의 흡광도로 결정하여 분석하였다.
ED50(IU/㎖) G-CSF에 대한 상대적 활성(%)
천연형 G-CSF(Filgrastim) 0.30 100
17Ser-G-CSF 0.26 115
G-CSF-20K PEG(Neulasta) 1.20 25
17Ser-G-CSF-40K PEG 10.0 <10.0
17Ser-G-CSF-PEG-알부민 1.30 23.0
17Ser-G-CSF-PEG-Fc 0.58 51.7
그 결과, 표 10에서 보는 바와 같이, G-CSF의 아미노산을 치환시킨 17Ser-G-CSF 유도체의 면역글로불린 Fc 단백질 결합체도 천연형 단백질의 단백질 결합체와 유사한 효과를 나타내었다. 17Ser-G-CSF-PEG의 경우에는 PEG로 수식되지 않은 것에 비하여 혈중반감기는 증가하지만 활성도는 떨어짐이 이미 보고된 바 있다(대한민국 특허공개 제2004-83268호). 특히, 수식된 PEG의 크기가 클수록 혈중 안정성 은 증가하지만 상대적으로 활성도가 점차 떨어짐을 알 수 있고, 17Ser-G-CSF-40K PEG는 천연형에 비하여 약 10% 이하의 매우 낮은 활성도를 나타내었다. 즉, PEG의 분자량이 증가하면 혈중반감기는 길어지게 되나 상대적으로 활성이 급격하게 감소되므로, 혈중반감기가 길면서 활성도 뛰어난 단백질 결합체의 개발이 요구되고 있다. 17Ser-G-CSF-PEG-알부민도 천연형에 비하여 약 23% 정도로 낮은 활성을 나타내었으나, 17Ser-G-CSF-PEG-Fc는 천연형에 비하여 상대적 활성도가 51% 이상으로 높아짐을 확인할 수 있었다. 이로부터 혈중반감기의 획기적 증가와 더불어 면역글로불린 Fc 영역과 17Ser-G-CSF 유도체의 결합체의 생체내 약효가 매우 뛰어날 것으로 기대할 수 있다.
<4-4> Fab’ 결합체의 세포 독성 중화 시험
실시예 8 및 9에서 제조된 Fab’-S-PEG-N-Fc, Fab’-N-PEG-N-Fc 결합체, 및 비교예 3에서 제조된 Fab’-S-40K PEG 연결체의 시험관내 활성 실험을 진행하였다. 마우스 섬유아세포주 L929(ATCC CRL-2148)를 이용하여 TNFα의 세포 독성을 측정하는 실험을 기본 골격으로 하여 Fab’가 TNFα의 세포 괴사 활성을 얼마나 중화시키는가를 측정하였다.
Fab’-S-PEG-N-Fc, Fab’-N-PEG-N-Fc 결합체 및 Fab’-S-40K PEG 연결체를 각각 2배씩 순차적으로 희석하여 96웰 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 분주한 후, rhTNF-α(R&D systems사) 및 RNA 합성의 저해제로 이용되는 악티노마이신-디(actinomycin D, Sigma사)를 각각 최종농도가 10 ng/㎖ 및 1 ㎍/㎖이 되도록 첨가 하여 37℃, 5% CO2에서 30 분간 반응시킨 뒤 분석용 마이크로플레이트로 옮겼다. 플레이트의 각 웰에 L929 세포주를 5×104 개/50 ㎕ 배지로 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 마이크로플레이트 내의 배양액을 제거한 뒤 PBS에 5 ㎎/㎖ 농도로 녹아 있는 MTT(Sigma사)를 50 ㎕씩 넣었다. 약 4시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 150 ㎕의 DMSO를 첨가하여 녹인 후, 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 독성 중화 정도를 확인하였다. 대조군으로는 실시예 8의 단계 1에서 정제한 Fab’을 사용하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 실험에 사용한 모든 단백질 결합체들은 Fab’과 비슷한 역가를 나타내었으며, 이러한 결과로부터 Fab’의 N-말단 또는 C-말단 근처의 유리 시스테인 잔기에 PEG를 통해 면역글로불린 Fc를 융합시킨 단백질 결합체들은 Fab’의 혈중반감기를 획기적으로 증가시킴은 물론 생체내 활성도도 높게 유지시킴을 알 수 있다.
<4-5> CDC 활성 측정
상기 실시예에서 제조한 유도체들과 대장균 형질전환체로부터 발현되어 정제된 면역글로불린 불변영역 단백질들이 인간 C1q와 결합하는지 여부를 확인하기 위해, 하기와 같이 활성효소 면역측정 분석법(ELISA)을 수행하였다. 실험군으로서 한국미생물보존센타(KCCM)에 2004년 9월 15자로 기탁한 형질전환체 HM10932(기탁번호: KCCM-10597) 및 HM10927(기탁번호: KCCM-10588)으로부터 생산된 면역글로불린 불변영역 시료와 상기 실시예들에서 제조한 유도체들을 사용하였으며 비교군으로 당이 결합되어 있는 면역글로불린(IVIG-글로불린 에스, 녹십자 PBM)을 비롯하여 상업화되어 치료용 항체로 쓰이고 있는 여러 항체들을 사용하였다. 상기 실험군과 비교군 시료들을 10 mM 카보네이트 완충액(pH 9.6)에 1 ㎍/㎖의 농도로 준비하였다. 준비된 시료를 96-웰 플레이트(Nunc)에 웰당 200 ng의 양으로 분주한 후 4℃에서 밤새 코팅한 다음, 웰 플레이트를 PBS-T 용액(137 mM NaCl, 2 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 0.05% 트윈 20)으로 3번 세척하였다. 소 혈청 알부민을 1%의 농도로 PBS-T 용액에 용해시켜 준비한 차단(blocking) 완충액 250 ㎕를 각 웰에 첨가한 후, 상온에서 1시간 동안 방치하고 동일한 PBS-T 용액으로 3번 세척하였다. 표준액과 시료를 적당한 농도로 PBS-T 용액으로 희석한 후 항체가 코팅된 웰에 점적하여 상온에서 1시간 동안 방치시켜 반응시킨 후 다시 PBS-T 용액으로 3번 세척하였다. 차단반응이 완료된 플레이트에 2 ㎍/㎖ C1q(R&D systems사, 미국)를 첨가한 후 2시간 동안 상온에서 반응시켰으며, 반응이 완료된 플레이트를 상기 PBS-T 용액으로 6번 세척하였다. 인간의 항-인간 C1q 항체-퍼옥시다제 컨쥬게이트(Biogenesis사, 미국)를 차단 완충용액에 1000:1로 희석하여 각 웰에 200 ㎕씩 점적한 후 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 각 웰을 PBS-T 용액으로 3번 세척한 후 발색용액 A와 B(칼라-A-안정화 퍼옥시다제 [Color A-Stabilized peroxide] 용액 및 칼라 B-안정화 크로모젠 [Color B-stabilized chromogen] 용액, DY 999, R&D Systems사)를 동량으로 혼합하여 각 웰에 200 ㎕씩 첨가하고 30분간 방치하였다. 그 후에 반응 정지용액인 2 M 황산을 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 정지 시켰다. 반응이 완료된 웰 플레이트는 마이크로플레이트 판독기(Molecular Device사)를 이용하여 450 ㎚ 파장에서 표준액과 검액의 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 14, 15에 각각 나타내었다.
면역글로불린의 Fc 영역에서의 보체 활성을 subclass에 따라 비교해본 결과 인간 면역글로불린 IgG1(Fitzgerald), IgG2(Fitzgerald), IgG4(Fitzgerald)의 순서대로 C1q에 대한 높은 결합력을 가지고 있음을 확인 할 수 있었고 이에 따라 보체 활성도 subclass 간에 차이가 있음을 알 수 있었다. 상기 실험에 사용한 IVIG의 경우 IgG subclass들의 집합체이지만 IgG1이 거의 대부분을 차지 하고 있으므로 분리 정제된 IgG1 과 거의 유사한 친화도를 보였다. 이러한 대조군과 비교하여 볼 때 비당쇄화에 의한 C1q의 친화도 변이는 보체 활성이 가장 강한 IgG1 Fc에서 현저하게 감소하는 것을 볼 수가 있으며, 이미 보체 반응이 없는 것으로 알려진 IgG4 Fc에서는 C1q에 대한 결합력이 거의 없는 것으로 나타나 보체 활성이 없는 뛰어난 재조합 캐리어임을 알 수 있었다. (도 14)
C1q 친화도가 제거된 캐리어의 특성이 생리활성 펩타이드와 결합체를 만든 후 에도 여전히 유지되는지를 보기 위하여, IFN alpha를 모델로하여 당쇄화된 Fc, 효소를 이용한 탈당쇄화된 Fc 및 당쇄화가 제거된 재조합 Fc를 캐리어로 사용하여 각 결합체를 만든 후 C1q에 대한 결합력을 조사하였다. 당쇄화된 Fc와 IFNa 결합체(IFNα-PEG-Fc: Glycosylated IgG1Fc)는 C1q에 대한 여전히 높은 친화도를 유지하지만, 여기에 PNGaseF등을 이용하여 탈당쇄화를 시킨 인터페론 결합체(IFNα-PEG-DGFc: Deglycosylated IgG1Fc)는 결합력이 현격하게 낮아짐을 확인하였고, 그 정도 는 비당쇄화 된 대장균 유래의 Fc 결합체와 유사한 수준의 C1q에 대한 결합력을 나타내었다. 뿐만 아니라 IgG1의 비당쇄화된 Fc를 이용한 인터페론 결합체(IFNα-PEG-AGFcG1: Aglycosylated IgG1Fc)를 IgG1에서 IgG4로 바꾼 인터페론 결합체(IFNα-PEG-FcG4 유도체1: Aglycosylated IgG4Fc) 경우 C1q에 대한 친화도가 완전히 제거되는 것을 볼 수 있었고, 결합체를 비당쇄화된 IgG4 Fc 단량체로 바꾼 결합체 (IFNα-PEG-FcG4 유도체2: Aglycosylated IgG4Fc) 경우에도 역시 C1q에 대한 결합능력은 완전히 제거되는 것으로 보아 항체단편의 effector 기능이 없는 좋은 캐리어임을 확인 할 수 있었다. (도 15)
본 발명의 단백질 결합체는 폴리펩타이드 약물의 혈중반감기 증가가 기존에 보고된 어떠한 변형 단백질보다도 높고, 기존 지속형 제형의 가장 큰 단점인 역가의 감소를 극복하여, 종래 가장 효과가 좋은 것으로 알려진 알부민을 이용한 경우보다 월등한 혈중 지속성과 생체내 활성을 가질 뿐만 아니라, 면역반응 유발의 위험도 거의 없어 단백질 약물의 지속형 제재 개발에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 단백질 약물의 지속형 제제는 잦은 주사로 인한 환자의 고통을 감소시킬 수 있고, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 지속적으로 유지하여 약효를 안정적으로 나타낼 수 있다.
아울러, 본 발명의 단백질 결합체의 제조방법은 발현 시스템 확립의 어려움, 천연형과 상이한 당쇄화, 면역반응 유발, 단백질 융합 방향성의 제한 등 유전자 조 작에 의한 융합단백질 생산방식의 단점과 반응의 비특이성으로 인한 낮은 수율 및 결합제로 사용되는 화학물질의 독성 문제 등 화학적 결합방식의 문제점을 극복하여 증가된 혈중반감기와 높은 활성을 갖는 단백질 약물을 용이하고 경제적인 방식으로 제공할 수 있다.
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Claims (45)

  1. 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통해 공유결합으로 연결된 단백질 결합체.
  2. 제 1항에 있어서, 비펩타이드성 중합체가 양 말단 반응기를 통해 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역과 각각 공유결합으로 연결되는 단백질 결합체.
  3. 제 2항에 있어서, 하나의 면역글로불린 Fc 영역에, 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 연결체가 1개 이상 공유결합으로 연결되는 단백질 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 비당쇄화됨을 특징으로 하는 단백질 결합체
  5. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 선택되는 도메인으로 이루어진 단백질 결합체.
  6. 제5항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 힌지영역을 추가로 포함하는 단백 질 결합체.
  7. 제 1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 이들의 조합(combination) 및 이들의 하이브리드(hybrid)의 Fc 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합체.
  8. 제 7항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 이들의 조합 및 이들의 하이브리드의 Fc 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합체.
  9. 제8항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 단백질 결합체.
  10. 제9항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 단백질 결합체.
  11. 제 2항에 있어서, 비펩타이드성 중합체의 반응기가 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 데리바티브로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합체.
  12. 제 11항에 있어서, 석시니미드 데리바티브가 석시니미딜 프로피오네이트, 석시니미딜 카르복시메틸, 하이드록시 석시니미딜 또는 석시니미딜 카보네이트인 단백질 결합체.
  13. 제 12항에 있어서, 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 단백질 결합체.
  14. 제 1항에 있어서, 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역과 생리활성 폴리펩타이드의 아미노 말단, 라이신 잔기, 히스티딘 잔기 또는 시스테인 잔기의 유리 반응기에 결합되어 있는 단백질 결합체.
  15. 제 1항에 있어서, 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독 중합체, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합체.
  16. 제 15항에 있어서, 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 단백질 결합체.
  17. 제 1항에 있어서, 생리활성 폴리펩타이드가 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 및 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합체.
  18. 제 17항에 있어서, 생리활성 폴리펩타이드가 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류, 인터페론 수용체류, 콜로니 자극인자류, 글루카콘-유사 펩타이드류 (GLP-1등), 지프로테인 관련수용체 (G-protein-coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체류, 효소류, 인터루킨 결합 단백질류, 사이토카인 결합 단백질류, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체류, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편류로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합체.
  19. 제 18항에 있어서, 생리활성 폴리펩타이드가 인간 성장 호르몬, 인터페론-알파, 과립구 콜로니자극인자, 적혈구 생성인자 또는 Fab’ 항체 단편인 단백질 결합체.
  20. (a) 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체를 사용하여 공유결합으로 연결하는 단계; 및
    (b) 상기 (a)의 반응 결과물인 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 제1항의 단백질 결합체의 제조방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    단계 (a)는
    (a1) 활성화된 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드를 공유결합으로 연결하는 단계;
    (a2) 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체와 연결된 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (a3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드를 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 제조방법.
  22. 제 21항에 있어서, 단계 (a1)에서 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응 몰비가 1:2.5 내지 1:5인 제조방법.
  23. 제 21항에 있어서, 단계 (a1)에서 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 중합체의 반응 몰비가 1:5 내지 1:10인 제조방법.
  24. 제 21항에 있어서, 단계 (a3)에서 단계 (a2)에서 수득된 연결체: 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰비가 1:0.5 내지 1:20인 방법.
  25. 제 21항에 있어서, 단계 (a1) 및 단계 (a3)의 반응이 환원제의 존재하에서 수행되는 제조방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 환원제가 나트륨 시아노 보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화 붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염 및 피리딘 붕산염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 단백질 결합체는 상기 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 지속성 및 안정성을 증가시키기 위한 것인 단백질 결합체.
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