CZ20014123A3 - Exprese a export interferonů-alfa jako Fc fúzních proteinů - Google Patents

Exprese a export interferonů-alfa jako Fc fúzních proteinů Download PDF

Info

Publication number
CZ20014123A3
CZ20014123A3 CZ20014123A CZ20014123A CZ20014123A3 CZ 20014123 A3 CZ20014123 A3 CZ 20014123A3 CZ 20014123 A CZ20014123 A CZ 20014123A CZ 20014123 A CZ20014123 A CZ 20014123A CZ 20014123 A3 CZ20014123 A3 CZ 20014123A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
interferon
immunoglobulin
leu
region
glu
Prior art date
Application number
CZ20014123A
Other languages
English (en)
Inventor
Kin-Ming Lo
Yaping Sun
Stephen D. Gillies
Original Assignee
Lexigen Pharmaceuticals Corp.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lexigen Pharmaceuticals Corp. filed Critical Lexigen Pharmaceuticals Corp.
Publication of CZ20014123A3 publication Critical patent/CZ20014123A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Exprese a export interferonů-α ve formě Fc fúzních proteinů.
Tato přihláška uplatňuje prioritu z US prozatímní přihlášky pořadové č. 60/134895, podané 19.5.1999, jejíž obsah je zde uveden jako odkaz.
Oblast techniky
Vynález se týká použití expresních systémů pro fúzní proteiny, které zlepšují produkci proteinů třídy interferonua. Přesněji se vynález týká vysoké úrovně exprese a sekrece Fc fúzních proteinů v savčích buňkách, kde uvedeným proteiny jsou například Fc imunoglobulinu - interferon-α a různé strukturální formy, a jejich použití.
Dosavadní stav techniky
Bylo zjištěno, že proteiny rodiny interfejronu-α (IFN-a) jsou použitelné pro léčbu mnoha onemocnění. Například, interferony-α 2a a 2b (prodávané pod názvem Roferon a Intron A, v příslušném pořadí) jsou používány pro léčbu chronické hepatitidy B, C a D (což jsou život ohrožující onemocnění jater), condylomata acuminata (genitální bradavice), Kaposiho sarkomu při AIDS, vlasatobuněčné leukemie, maligního melanomu, bazocelulárního karcinomu, maligního myelomu, adenokarcinomu ledvin, herpes I a II, planých neštovic/herpes zoster a mycosis fungoides. Účinnost léčebných protokolů obsahujících interferon-α při karcinomu prostaty a chronické myeloidní leukémii se také studuje.
Lidská rodina interferonu-α je největší a nejkomplexnější rodinou interferonů. Členy rodiny interferonu-α mají podobné • · • · ·· ·· · · » ······ aminokyselinové sekvence, které je definují jako skupinu odlišnou od jiných interferonů; tj. tyto proteiny mají obvykle alespoň 35% identitu aminokyselin při obvyklé srovnávání sekvencí. SwissProt databáze obsahuje mnoho lidských proteinů rodiny interferonu-α, včetně alternativně označených interferonu-δ a interferonu-ω. Tyto proteiny jsou obvykle syntetizovány s vedoucí sekvencí velikosti 23 aminokyselin a zralé proteiny mají obvykle molekulovou hmotnost přibližně 19 kD. Protože jsou tyto proteiny takto podobné, získá se při odběru a přečištění interferonu-α od člověka nebo jiného savce směs interferonů s různými biologickými vlastnostmi (Georgiadis et al., US patent č. 4732683). Obdobně, cDNA kódující tyto proteiny mají dostatečně podobnou velikost a vlastnosti, takže pro jejich úpravu za účelem konstrukce plasmidu může být použita jedna sada procedur. Proto by bylo dobré mít metodu pro účinnou produkci a přečištění jednoho druhu interferonu-α ze savčího zdroje.
Z důvodu relativně malé velikosti přibližně 19 kD (Lawn et al., 1981, Proč. Nati. Acad. Sci USA 78: 5435) může být interferon-α filtrován ledvinami. Nicméně, po filtrování je interferon-α obvykle absorbován a metabolizován buňkami renálních tubulů a proto není obvykle vylučován. V současné klinické praxi je interferon-α podáván intramuskulární injekcí, po které jeho plasmatické koncentrace klesají s poločasem přibližně 5 hodin pro interferon-α 2a a 2-3 hodiny pro interferon-α 2b (Physician Desk Reference, 50. vydání, 1996: 2145-2147 a 2364-2373).
Dále, v důsledku malé velikosti jsou nutné časté injekce interferonu-α (obvykle 3xtýdně) a mohou se vyskytovat významné variace koncentrací interferonu-α u pacienta. Dále, injikované • · · · • · · · · · · dávky jsou vysoké, v rozmezí od přibližně 50 μg na dávku při vlasatobuněčné leukémii do 300 μg na dávku při Kaposhiho sarkomu při AIDS. Vysoké koncentrace cirkulujícího interferonu-α mohou způsobovat významné nežádoucí účinky, včetně kožních, neurologických, imunitních a endokrinních toxických nežádoucích účinků. Předpokládá se, že malá velikost interferonu-α umožňuje jeho průnik hematoencephalickou bariérou a vstup do centrálního nervového systému, což může způsobovat některé neurologické nežádoucí účinky. Proto by bylo vhodné zvýšit účinnost a efektivní sérový poločas u pacientů léčených interferonem-α za současné minimalizace vedlejších účinků.
Vzhledem k vysokým dávkám, nízké účinnosti, krátkému sérovému poločasu, obtížím při přečištění a vedlejším účinkům interferonu-α existuje potřeba metod pro zlepšení produkce a zlepšení farmakologických vlastností tohoto terapeutického činidla.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká způsobů a prostředků použitelných pro výrobu a použití fúzních proteinů obsahujících interferon-α. Konkrétně se vynález týká nukleových kyselin, například DNA nebo RNA sekvencí, kódujících fúzní protein tvořený Fc imunoglobulinu interferonem-α, a způsobů pro expresi nukleové kyseliny za produkce fúzních proteinů. Fúzní proteiny mohou usnadnit vysokou expresi biologicky aktivního interferonu-α. Fúzní protein může být kombinován s farmaceuticky přijatelným nosičem před podáním savci, například člověku. Za některých okolností může být interferon-α odštěpen z fúzního proteinu • · před přípravou a/nebo podáním. Alternativně může být sekvence nukleové kyseliny kódující fúzní protein obsahující interferon-α kombinována s farmaceuticky přijatelným nosičem a podána savci.
Předmětem předkládaného vynálezu jsou nové sekvence nukleové kyseliny, například DNA nebo RNA, které usnadňují produkci a sekreci interferonu-α. Konkrétně, vynález poskytuje: (i) sekvence nukleové kyseliny, které usnadňují účinnou produkci a sekreci interferonu-α; (ii) konstrukty nukleových kyselin pro rychlou a účinnou produkci a sekreci interferonu-α v různých savčích hostitelských buňkách; a (iii) způsoby pro produkci, sekreci a odběr rekombinantního interferonu-α nebo jeho geneticky upravených variant, včetně nepřirozených, biosyntetizovaných nebo jinak artificiálních proteinů interferonu-α, jako jsou proteiny, které mohu být vytvořeny racionálním vývojem.
Dalším předmětem vynálezu jsou polynukleotidové sekvence, které, když jsou fúzované na polynukleotid kódující interferon-α, kódují fúzní polypeptid obsahující interferon-a, který může být přečištěn za použití běžných činidel a technik. Ještě dalším předmětem vynálezu je vložení proteolytického štěpícího místa mezi sekreční kazetu a kódovaný interferon-a tak, že sekreční kazeta může být odštěpena od domény interferonu-α a tak může být interferon-α odštěpen nezávisle.
V souladu s tím v jednom aspektu vynález poskytuje molekuly nukleové kyseliny, například DNA nebo RNA molekuly, které kódují fúzní protein skládající se z Fc regionu imunoglobulinu a interferonu-α. Molekula nukleové kyseliny kóduje, postupně ve směru 5' -> 3', signální sekvenci, Fc region imunoglobulinu, a alespoň jeden cílový protein, kde cílový protein zahrnuje interferon-a.
Ve výhodném provedení obsahuje Fc region imunoglobulinu pantový region imunoglobulinu a výhodně obsahuje alespoň jednu konstantní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu, například konstantní doménu 2 těžkého řetězce (CH2) imunoglobulinu, konstantní doménu 3 těžkého řetězce (CH3) imunoglobulinu, a podle typu imunoglobulin použitého pro generování Fc regionu volitelně konstantní doménu 4 těžkého řetězce (CH4) imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení neobsahuje Fc region imunoglobulinu alespoň konstantní doménu 1 těžkého řetězce (CH1) imunoglobulinu. Ačkoliv mohou být Fc regiony imunoglobulinu odvozeny od imunoglobulinových tříd IgA, IgD, IgE, IgG a IgM, jsou výhodné Fc regiony z IgG.
Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může být inkorporována v operativní asociaci do replikovatelného expresního vektoru, který může být potom vložen do savčí hostitelské buňky kompetentní k produkci fúzních proteinů obsahujících interferon-α. Získaný fúzní protein obsahující interferon-α je produkován a secernován ze savčí hostitelské buňky. Secernované fúzní proteiny obsahující interferon-a mohou být získány z kultivačního media bez lýzy savčích hostitelských buněk. Proteinový produkt může být testován na aktivitu a/nebo může být přečištěn za použití běžných činidel, a/nebo může být odštěpen od fúzního partnera, vždy za použití obvyklých technik.
V jiném aspektu vynález poskytuje fúzní proteiny obsahující interferon-α. Fúzní proteiny podle předkládaného vynálezu mají lepší biologické vlastnosti ve srovnání s přirozeným interferonem-α, jako je lepší rozpustnost, prodloužený sérový ·*·· ··· *···
poločas a lepší vazba na receptor. Tyto vlastnosti mohou významně zlepšit klinickou účinnost interferonu-α. Ve výhodném provedení fúzní protein obsahuje - ve směru od N- k C-konci Fc region imunoglobulinu a interferon-α, a další skupiny, jako je například místo pro proteolytické štěpení, jsou volitelně vloženy mezi Fc region imunoglobulinu a interferon-α. Výsledný fúzní protein je výhodně syntetizován v buňce, která glykosyluje Fc region v obvyklých glykosylačních místech, tj. které obvykle existují v templátových protilátkách.
V jiném provedení může fúzní protein obsahovat druhý cílový protein, například zralý úplný interferon-α nebo jeho biologicky aktivní fragment. V tomto typu konstruktu mohou být prvním a druhým cílovým proteinem stejné nebo různé proteiny. První a druhý cílový protein mohou být na sebe vázány navzájem, buď přímo, nebo prostřednictvím polypeptidové spojovací skupiny. Alternativně mohou být oba cílové proteiny vázány buď přímo, nebo prostřednictvím polypeptidové spojovací skupiny, na Fc region imunoglobulinu. V tomto případě může být první cílový protein navázán na N-konec Fc regionu imunoglobulinu a druhý cílový protein může být navázán na Ckonec Fc regionu imunoglobulinu.
V jiném provedení mohou dva fúzní proteiny asociovat, buď kovalentně, například disulfidovou vazbou, peptidovou vazbou nebo prostřednictvím zesíťovacího Činidla, nebo nekovalentně, za vzniku dimerního proteinu. Ve výhodném provedení jsou dva fúzní proteiny asociovány kovalentně prostřednictvím alespoň jedné, lépe dvou meziřetězcových disulfidových vazeb prostřednictvím cysteinových zbytků, výhodně umístěných v pantových regionech imunoglobulinu umístěných v Fc regionech imunoglobulinů každého řetězce.
• · • · • ·
Dalšími předměty vynálezu jsou multivalentní a multimerní formy interferon-α - fúzních proteinů a jejich kombinace.
V jiném aspektu vynález poskytuje způsoby pro produkci fúzních proteinů obsahujících Fc region imunoglobulinu a cílový protein. Způsob zahrnuje kroky: (a) poskytnutí savčích buněk obsahujících DNA molekulu kódující takový fúzní protein, s nebo bez signální sekvence, a (b) kultivaci savčích buněk za produkce fúzního proteinu. Výsledný fúzní protein může být odebrán, skládán, pokud je to nutné, a přečištěn za použití běžných přečišťovacích technik dobře známých v oboru. Za předpokladu, že fúzní protein obsahuje proteolytické štěpící místo mezi Fc regionem imunoglobulinu a cílovým proteinem, může být cílový protein odštěpen z fúzního protein za použití běžných proteolytických enzymů a pokud je to nutné, může být přečištěn před použitím.
V ještě jiném aspektu vynález poskytuje způsoby pro léčbu stavů zmírněných interferonem-α nebo jeho aktivními variantami, kde uvedený způsob zahrnuje podání účinného množství interferonu-α savci, kde uvedený interferon-α je produkován způsobem podle předkládaného vynálezu a/nebo zahrnuje podání fúzního konstruktu podle předkládaného vynálezu. Vynález také poskytuje způsoby pro léčbu stavů zmírněných interferonem-α nebo jeho aktivními variantami, kde uvedený způsob zahrnuje podání nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, například holé DNA, nebo vektoru obsahujícího DNA nebo RNA podle předkládaného vynálezu.
Ve výhodném provedení mohou být konstrukty podle předkládaného vynálezu použity pro léčbu jaterního onemocnění, kde při této léčbě se interferon-α prostřednictvím Fc regionu lokalizuje v játrech. Konstrukty podle předkládaného vynálezu • · • · · · · · · ····· mohou být zejména užitečné pro léčbu jaterních onemocnění, mezi která patří například virová onemocnění, jako je hepatitida B, hepatitida C nebo hepatitida D, nádory jater a jiné nádory metastazující do jater.
Uvedené a další předměty, rysy a výhody předkládaného vynálezu budou jasné z popisu, připojených a výkresů a patentových nároků.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1A-1C jsou schématickými ilustracemi příkladů fúzních proteinů připravených způsobem podle předkládaného vynálezu.
Obr. 2 je graf ukazující křivky přežití pro skupiny SCID myší, kterým byla injekčně podána suspenze Daudi buněk a které byly potom léčeny huFc-huIFN-α. V den 0 byly myším injekčně podány Daudi buňky. V den 3-8 bylo skupinám po 8 myších injekčně aplikováno PBS (kosočtverce), 30 μg huFc-huIFN-a (křížky) nebo 60 pg huFc-huIFN-a (trojúhelníčky).
Obr. 3 je graf ukazující rychlost růstu podkožních nádorů Daudi buněk u SCID myší léčených huFc-huIFN-α. Přibližně 4 týdny před léčbou byly myším podkožně injekčně aplikovány Daudi buňky. Když z aplikovaných Daudi buněk vyrostli nádory o objemu 200-400 mm3, byly myši rozděleny do skupin po 8 a byly léčeny po dobu 6 dnů injekcí PBS (kosočtverce), 30 μρ huFchuIFN-ct v PBS (čtverečky) nebo 60 μρ huFc-huIFN-α. v PBS (trojúhelníčky) .
• · · · A
AAAA AAA AAAA ·· ·· A · · A A A A A A
Podrobný popis vynálezu
Mnoho onemocnění může být zlepšeno aplikací interferonu-a. Například, jak bylo uvedeno výše, interferony-α 2a a 2b (obchodní názvy Roferon a Intron A, v příslušném pořadí) jsou používány pro léčbu chronické hepatitidy B, C a D, condylomata acuminata (genitální bradavice), Kaposiho sarkomu při AIDS, vlasatobuněčné leukemie, maligního melanomu, bazocelulárního karcinomu, maligního myelomu, adenokarcinomu ledvin, herpes I a II, planých neštovic/herpes zoster a mycosis fungoides. Účinnost léčebných protokolů obsahujících interferon-α při karcinomu prostaty a chronické myeloidní leukémii se také studuje.
Pro léčbu hepatitidy by bylo výhodné mít formu interferonua, která se koncentruje v játrech. Tímto způsobem může být minimalizována koncentrace interferonu-α v jiných tkáních, což redukuje nežádoucí účinky. Jaterní tkáň je primárním místem pro odstraňování solubilních imunokomplexů a Fc receptory jsou hojné na jaterních makrofágách (Kupfférových buňkách) (Benacerraf, B. et al., 1959, J. Immunol. 82: 131; Paul, W.E. (1993) Fundamentals of Immunology, 3. vydání, kapitola 5: 113116). Proto může být při fúzi interferonu-α na Fc region imunoglobulinu molekula interferonu-α cíleně dopravena do jaterní tkáně ve srovnání se stejnou molekulou interferonu-a bez Fc regionu imunoglobulinu. Protilátka IgGl má nejvyšší afinitu pro Fc receptory. Nicméně, naopak, IgG4 má přibližně 10-násobně nižší afinitu pro Fc-gamma receptor (Anderson and Abraham, 1980, J. Immunol. 125: 2735; Woof et al., 1986, Mol. Immunol. 23: 319). Fc-gamma 1 z IgGl může, když je umístěn na C-konec ligandu, zprostředkovat buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC) proti buňkám, které exprimují receptory • · • · ···· · · · · ·« · 10 ················ • · · · · · · ······ pro tento ligand. Dále, Fc-gamma 1 může, když je přítomen na Q-konci ligandu, zprostředkovat vazbu Clq a fixaci komplementu proti buňkám, které exprimují receptory pro tento ligand.
Oproti IgGl nefixuje IgG4 účinně komplement. Toto vedlo k návrhu, že N-konec interferonu-α může být fixován na C-konec Fc regionu z IgG4 (Chang, T.W. et al., US patent č. 5723125). Nicméně, když je Fc region IgG4 separován od Fab regionu, tak Fc IgG4 fixuje komplement stejně jako F region IgGl (Isenman, D.E. et al., 1975, J. Immunol. 114: 1726). Podle těchto výsledků a vzhledem ke skutečnosti, že Fc sekvence IgGl a IgG4 jsou dosti podobné se předpokládá, že Fab region IgG4 sféricky blokuje vazbu Clq a fixaci komplementu, protože pantový region spojující IgG4 Fab a Fc regiony je kratší než pantový region IgGl. Když je velký Fab region IgG4 nahrazen menší molekulou, jako je interferon-α, a interferon-α a Fc region jsou spojeny flexibilní spojovací sekvencí, tak se předpokládá, že takový fúzní protein obsahující interferon-α a Fc-gamma 4 bude fixovat komplement při vazbě na buňky nesoucí receptory pro inter f eron-<x.
Cytotoxický efekt způsobený fúzí N-konce cytokinu a C-konce Fc regionu je dobře známý. Například, fúze cytokinu interleukinu-2 (IL-2) na Fc region vytváří molekulu, která může fixovat komplement a způsobovat lýzu buněk nesoucích receptor pro IL-2 (Landolfi, N.F., US patent č. 5349053).
Fúzní proteiny, ve kterých je Fc region umístěn na N-konci ligandu (označované jako imunofúze nebo Fc-X fúze, kde X le ligand, jako například interferon-α) mají mnoho odlišných a výhodných biologických vlastností (Lo et al., US patenty č. 5726044 a 5541087; Lo et al., 1998, Protein Engineering 11: 495). Konkrétně, takové fúzní proteiny se mohou stále ještě * · · « vázat na relevantní Fc receptory na povrchu buněk. Nicméně, když se ligand váže na svůj receptor na povrchu buněk, tak se orientace Fc regionu mění a sekvence, které zprostředkují ADCC a fixaci komplementu se uzavírají. V důsledku toho Fc region v Fc-X molekule nezprostředkuje ADCC ani fixaci komplementu. Proto se předpokládá, že Fc-X fúze budou mít delší sérový poločas a vyšší relativní koncentrace v játrech, s menšími nežádoucími účinky pramenícími z ADCC a fixace komplementu.
Jednou charakteristikou Fc-X konstruktů podle předkládaného vynálezu je to, že koncentrují cílový protein, v tomto případě interferon-α, v játrech. Fc region z gammal a gamma3 řetězců vykazuje nejvyšší afinitu pro Fc receptor, z gamma4 řetězce vykazuje nižší afinitu a z gamma2 řetězce vykazuje extrémně nízkou afinitu pro Fc receptor. Proto jsou Fc regiony z gammal nebo gamma3 řetězců výhodně použity pro Fc-X konstrukty podle předkládaného vynálezu, protože mají nejvyšší afinity pro Fc receptory a tak mohou dopravit interferon-α přednostně do jaterní tkáně. Toto je v protikladu k X-Fc proteinům, například interferon-a-Fc fúzním proteinům, kde musí být potenciální výhoda koncentrování v játrech vyvážena skutečností, že fúzní protein může zprostředkovat efektorové funkce, jmenovitě fixaci komplementu a ADCC, namířené proti buňkám nesoucím receptory pro interferon-a.
Vynález tak poskytuje sekvence nukleové kyseliny kódující aminokyselinové sekvence definující fúzní proteiny obsahující Fc region imunoglobulinu a alespoň jeden cílový protein, kterým je zde interferon-α. Tři příkladná provedení proteinových konstruktů podle předkládaného vynálezu jsou uvedena na výkresech 1A-1C. Protože jsou preferovány dimerní konstrukty, jsou všechny ilustrovány jako dimery zesítěné párem disulfidových vazeb mezi cysteiny na sousedních « · podjednotkách. Na obrázcích jsou disulfidové vazby znázorněny jako vazby dvou Fc regionů těžkých řetězců dvou imunoglobulinů prostřednictvím pantového regionu imunoglobulinu v každém těžkém řetězci, a tak se jedná o charakteristiky dvou přirozených forem těchto molekul. Ačkoliv jsou preferovány konstrukty obsahující pantové regiony Fc a tyto se jeví jako slibná terapeutická činidla, zahrnuje vynález i provedení se zesítěním v jiných pozicích. Dále, za některých okolností mohou být dimery nebo multimery použitelné při provádění předkládaného vynálezu produkovány nekovalentní asociací, například pomocí hydrofobních interakcí. Protože jsou homodimerní konstrukty důležitým provedením vynálezu, ilustrují obrázky takové konstrukty. Je třeba si však uvědomit, že heterodimerní konstrukty jsou také použitelné při provedení předkládaného vynálezu.
Obr. 1 ilustruje dimerní konstrukt produkovaný podle uvedených zásad (viz například příklad 1). Každý monomer homodimeru obsahuje imunoglobulinový Fc region 1 včetně pantového regionu, CH2 domény a CH3 domény. Přímo navázán, tj. polypeptidovou vazbou, na C konec Fc regionu je interferon-a 2. Je třeba si uvědomit, že Fc region může být navázán na cílový protein prostřednictvím polypeptidové spojovací skupiny (není uvedena).
Obr. 1B a 1C ukazují proteinové konstrukty podle předkládaného vynálezu, které obsahují jako cílový protein více interferonů-α uspořádaných v tandemu a spojených spojovací skupinou. Na obr. 1B se cílový protein skládá z kompletního interferonu-a 2, polypeptidové spojovací skupiny vyrobené z glycinových a serinových zbytků 4 a aktivní varianty interferonu-a 3. Obr. 1C se liší od konstruktu z obr. 1B v tom, že většina C-koncové proteinové domény obsahuje * · • · · druhou, kompletní kopii interferonu-a 2. Ačkoliv reprezentují obr. 1A-1C Fc-X konstrukty, kde X je cílový protein, předpokládá se, že použitelné proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být také označeny vzorcem X-Fc-X, kde X mohou představovat stejné nebo různé cílové proteiny.
Termín polypeptidová spojovací skupina, jak je zde použit, označuje polypeptidovou sekvenci, která může spojit dohromady dva proteiny, které za normálních okolností nejsou spojeny. Polypeptidová spojovací skupina výhodně obsahuje více aminokyselin jako je alanin, glycin a serin nebo kombinaci takových aminokyselin. Výhodně obsahuje polypeptidová spojovací skupina sérii glycinových a serinových peptidů délky 10-15 zbytků. Viz například US patent č. 5258698. Nicméně, předpokládá se, že optimální délka spojovací skupiny a její aminokyselinové složení mohou být určeny běžnými pokusy.
Termín multivalentní, jak je zde použit, označuje rekombinantní molekulu, která obsahuje dva nebo více biologicky aktivních segmentů. Proteinový fragment tvořící multivalentní molekulu může být volitelně navázán prostřednictvím polypeptidové spojovací skupiny, která spojuje složky a umožňuje nezávislou funkci každé složky.
Termín bivalentní, jak je zde použit, označuje multivalentní rekombinantní molekulu mající konfiguraci Fc-X nebo X-Fc, kde X je cílová molekula. Fc region imunoglobulinu může být navázán, například, prostřednictvím meziřetězcových disulfidových vazeb, za zisku konstruktu typu uvedeného na obr. 1A. Pokud má fúzní konstrukt podle předkládaného vynálezu konfiguraci Fc-X-X, tak je výsledná Fc molekula uvedena na obr. 1C. Dva cílové proteiny mohou být vázány prostřednictvím peptidové spojovací skupiny. Konstrukty typu uvedeného na obr.
* · ·* ·* · »» *· «*·« · φ < · · , » » · · · »·«· φ * * • Τ ΦΦ« Φ Φ · ···· φ * r 9 • Φ · r < ♦ < r * ·· 9Λ ·< » t Φ t · φ ·
ΙΑ mohou zvyšovat vazebnou afinitu mezi cílovou molekulou a jejím receptorem.
Termín multimerní, jak je zde použit, označuje stabilní asociaci dvou nebo více polypeptidových řetězců buď kovalentní, například prostřednictvím kovalentních interakcí, například disulfidových vazeb, nebo nekovalentní, například prostřednictvím hydrofobních interakcí. Termín multimer zahrnuje jak homomultimery, ve kterých jsou podjednotky stejné, tak heteromultimery, ve kterých jsou podjednotky odlišné.
Termín dimerní, jak je zde použit, označuje specifické multimerní molekuly, ve které jsou dva polypeptidové řetězce stabilně asociovány prostřednictvím kovalentních nebo nekovalentních interakcí. Takové konstrukty jsou schématicky uvedeny na obr. 1A. Je třeba si uvědomit, že Fc region imunoglobulinu obsahující alespoň část pantového regionu, CH2 doménu a CH3 doménu, obvykle vytváří dimer. 0 mnoha proteinových ligandech je známo, že se váží na své receptory ve formě dimerů. Pokud proteinový ligand X dimerizuje spontánně, bude X skupina v Fc-X molekule dimerizovat v mnohem větším rozsahu, protože proces dimerizace je závislý na koncentraci. Fyzikální blízkost dvou X skupin spojených Fc vytváří z dimerizace intramolekulový proces, za značného posunu rovnováhy ve prospěch dimeru a za zesílení jeho vazby na receptor.
Termín interferon-α”, jak je zde použit, označuje nejen kompletní zralý interferon-α, jako je například lidský interferon-α 1 (SEQ ID NO: 8), lidský interferon-a 2 (SEQ ID NO: 9), lidský interferon-a 4 (SEQ ID NO: 10), lidský • · · · · interferon-α 5 (SEQ ID NO: 11), lidský interferon-a 6 (SEQ ID NO: 12), lidský interferon-a 7 (SEQ ID NO: 13), lidský interferon-a 8 (SEQ ID NO: 14), lidský interferon-a 10 (SEQ ID NO: 15), lidský interferon-a 14 (SEQ ID NO: 16), lidský interferon-a 16 (SEQ ID NO: 17), lidský interferon-a 17 (SEQ ID NO: 18), lidský interferon-a 21 (SEQ ID NO: 19), interferon-δ 1 (SEQ ID NO: 20), II-l (interferon-ω 1)(SEQ ID NO: 21) a myší interferon-a 1 (SEQ ID NO: 22), myší interferon-a 2 (SEQ ID NO: 23), myší interferon-a 4 (SEQ ID NO: 24), myší interferon-a 5 (SEQ ID NO: 25), myší interferona 6 (SEQ ID NO: 26), myší interferon-a 7 (SEQ ID NO: 27), myší interferon-a 8 (SEQ ID NO: 28) a myší interferon-a 9 (SEQ ID NO: 29), ale také jejich varianty a biologicky aktivní fragmenty. Známé sekvence interferonu-α jsou uvedeny v GenBank.
Termín biologicky aktivní fragment označuje jakýkoliv fragment interferonu-α, který má alespoň 50%, lépe alespoň 70% a nejlépe alespoň 90% biologické aktivity lidského interferonu-α sekvence uvedené v SEQ ID NO: 2, jak je určeno za použití testu inhibice buněčné proliferace popsaného v příkladu 4. Termín varianta označuje druhy a alelické varianty, stejně jako přirozeně se vyskytující a nevyskytující varianty, například varianty připravené genetickým inženýrstvím, které jsou alespoň ze 70% podobné nebo ze 60% identické, lépe alespoň ze 75% podobné nebo ze 65% identické, a ještě lépe alespoň z 80% podobné nebo ze 70% identické s lidským zralým interferonem-α popsaným v SEQ ID NO: 2.
Pro určení toho, zda má testovaný polypeptid požadované procento podobnosti nebo identity s referenčním polypeptidem, • · • · • · ····« ······· · · jsou testovaná aminokyselinová sekvence a referenční aminokyselinová sekvence nejprve přiřazeny za použiti dynamického programovacího algoritmu popsaného ve Smith and Waterman, 1981, J. Mol. Biol. 147: 195-197, v kombinaci s BLOSUM62 substituční matricí popsanou na obr. 2 v Henikoff and Henikoff (1992) Amino acids substitution matrices from protein blocks, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919.
Pro předkládaný vynález je vhodná hodnota pro penále za vložení mezery -12 a vhodná hodnota pro penále za prodloužení mezery je -4. Počítačové programy provádějící srovnání za použití algoritmu dle Smith-Watermana a BLOSUM62 matrice, jako je GCG program (Oxford Molecular Group, Oxford, England), jsou komerčně dostupné a jsou používané odborníky v oboru.
Po provedení seřazení testované a referenční sekvence se může vypočítat procento podobnosti. Jednotlivé aminokyseliny každé sekvence jsou srovnávány postupně podle jejich vzájemné podobnosti. Pokud hodnota odpovídající dvěma přiřazeným aminokyselinám v BLOSUM62 matrici je 0, tak je skóre párové podobnosti 0; jinak je skóre párové podobnosti 1,0. Hrubé skóre podobnosti je součtem skóre párové podobnosti seřazených aminokyselin. Hrubé skóre se potom normalizuje dělením počtem aminokyselin v menší z testované a referenční sekvence. Normalizované hrubé skóre je procento podobnosti.
Alternativně, pro výpočet procenta identity jsou přiřazené aminokyseliny každé sekvence srovnávány postupně. Když aminokyseliny nejsou identické, tak je skóre identity páru 0; jinak je skóre identity páru 1,0. Hrubé skóre identity je součtem skóre identity párů seřazených aminokyselin. Hrubé skóre se potom normalizuje dělením počtem aminokyselin v menší z testované a referenční sekvence. Normalizované hrubé skóre je procento identity. Inserce a delece jsou ignorovány pro výpočet procenta podobnosti a identity. Proto nejsou penále za mezery použity v tomto výpočtu, ačkoliv byly použity v počátečním přiřazení.
Varianty mohou také zahrnovat jiné mutantní interferony-a mají aktivitu podobnou aktivitě interferonu-α. Typy a alelické varianty zahrnují, například, lidské a myší sekvence interferonu-α. Lidské varianty interferonu-α jsou uvedeny v SEQ ID NO: 8-21 a myší varianty interferonu-α jsou uvedeny v SEQ ID NO: 22-29.
Dále, sekvence interferonu-cc mohou obsahovat část nebo celou konvenční sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 7, kde interferon-α má alespoň 50%, lépe alespoň 70% a nejlépe alespoň 90% biologické aktivity zralého lidského interferonu-a SEQ ID NO: 2, jak je určeno za použití testu inhibice buněčné proliferace podle příkladu 4.
Tyto proteiny mají velmi podobné přečišťovací vlastnosti a jiné biologické vlastnosti. Konkrétně, manipulace s DNA, exprese fúzních proteinů a přečištění fúzních proteinů pro Fcinterferon-α proteiny je velmi podobná. Například lidský interferon-α 2a a lidský interferon-α 2b se liší pouze v jedné aminokyselině, kde interferon-α 2a má lysinový zbytek ve stejné pozici, jako má interferon-α 2b argininový zbytek. Lidský interferon-α 2a a lidský interferon-α 2b mají extrémně podobné vlastnosti a jsou zaměnitelné pro všechny známé účely.
Trojrozměrná struktura interferonu-α byla určena rentgenovou krystalografií (Ramaswamy et al., 1986, Structure 4: 1453). Sekvence interferonů-α jsou tak podobné, že určená struktura je považována za strukturu pro celou rodinu • · ····· · · · proteinů. Trojrozměrná struktura interferonu-α, podobně jako interferonu-β, je dimer se zinkovým iontem na přechodu dimeru. Nicméně, nakonec se interferon-α chová jako monomer.
Předpokládá se, že analogicky s cytokinem IL-6 a jinými proteinovými ligandy, může interferon-α dimerizovat po vazbě na receptor (Radhakrishnan, R. et al., 1996, Structure 4:
1453; Karpusas, M. et al., 1997, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94: 11813) .
Dimerizace ligandu může zvyšovat vazebnou afinitu mezi ligandem a jeho receptorem. Například, pokud se jedna skupina interferonu-α fúzního proteinu Fc-interferon-α může vázat na receptor na buňce s určitou afinitou, může se druhá skupina interferonu-α fúzního proteinu Fc-interferon-a vázat na receptor na stejné buňce s mnohem vyšší aviditou (zřetelnou afinitou). K tomuto může dojít v důsledku fyzikálního přiblížení druhé skupiny interferonu-α k receptoru po navázání první skupiny interferonu-α. V případě vazby protilátky na antigen může být zřetelná afinita zvýšena alespoň 10000-krát. Každá proteinová podjednotka, tj . X, má svou vlastní nezávislou funkci, takže v multivalentní molekule mohou být funkce proteinových podjednotek aditivní nebo synergní. Proto fúze normální dimerní Fc molekuly na interferon-ot může zvyšovat aktivitu interferonu-α. V souladu s tím mohou mít konstrukty typu uvedeného na obr. 1A vyšší zřetelnou vazebnou afinitu mezi interferonem-α a jeho receptorem.
Zde popsané cílové proteiny jsou exprimovány jako fúzní protein s Fc regionem imunoglobulinu. Jak je známo, každý konstantní region těžkého řetězce imunoglobulinu se skládá ze čtyř nebo pěti domén. Domény jsou postupně označeny následovně: CHl-pant-CH2-CH3(-CH4). DNA sekvence domén těžkého • · řetězce mají zkříženou homologii mezi imunoglobulinovými třídami, například CH2 doména IgG je homologní s CH2 doménou IgA a IgD, a CH3 doménou IgM a IgE.
Termín Fc region imunoglobulinu, jak je zde použit, označuje karboxy-koncovou část konstantního regionu řetězce imunoglobulinu, výhodně konstantního regionu těžkého řetězce imunoglobulinu, nebo jeho části. Například může Fc region imunoglobulinu obsahovat: 1) CH1 doménu, CH2 doménu a CH3 doménu; 2) CH1 doménu a CH2 doménu; 3) CH1 doménu a CH3 doménu; 4) CH2 doménu a CH3 doménu; nebo 5) kombinaci dvou nebo více domén a pantového regionu imunoglobulinu. Ve výhodném provedení obsahuje Fc region imunoglobulinu alespoň pantový region imunoglobulinu a CH2 doménu a CH3 doménu, a výhodně neobsahuje CHl doménu.
Současně preferovanou třídou imunoglobulinů, ze které je použit konstantní region těžkého řetězce, je IgG (Igy) (y podtřídy 1, 2, 3 nebo 4). Nukleotidové a aminokyselinové sekvence lidského Fc γ-l jsou uvedeny v SEQ ID NO: 3 a 4. Mohou být použity i jiné třídy imunoglobulinů, IgA (Iga), IgD (Igó), IgE (Ige) a IgM (Igp). Volba vhodného konstantního regionu těžkého řetězce imunoglobulinu je podrobně uvedena v US patentu č. 5541087 a 5726044. Volba konkrétní sekvence konstantního regionu těžkého řetězce imunoglobulinu z některých imunoglobulinových tříd a podtříd pro dosažení konkrétního výsledku je snadná pro odborníka v oboru. Část DNA konstruktu kódující Fc region imunoglobulinu výhodně obsahuje alespoň část pantové domény a výhodně alespoň část CH3 domény Fcy nebo homologní domény v jakémkoliv z IgA, IgD, IgE nebo IgM.
• ·
V závislosti na použití mohou být použity geny pro konstantní regiony z druhů jiných než je člověk, například od myši nebo krysy. Fc region imunoglobulinu použitý jako fúzní partner v DNA konstruktu může být obecně od jakéhokoliv druhu savce. Když je nežádoucí vyvolání imunitní reakce v hostitelských buňkách nebo zvířatech proti Fc regionu, tak by měl být Fc region ze stejného druhu jako hostitelská buňka nebo zvíře. Pokud je živočichem člověk, může být použit Fc region lidského imunoglobulinu; obdobně, pokud je hostitelským živočichem myš, může být použit Fc region myšího imunoglobulinu.
Kódující sekvence nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence definující Fc region lidského imunoglobulinu použitelné v provedení předkládaného vynálezu jsou uvedeny jako SEQ ID NO: 3 a 4. Nicméně, předpokládá se, že existují jiné sekvence Fc regionu imunoglobulinu použitelné při provedení předkládaného vynálezu, jako jsou například sekvence kódované nukleotidovými sekvencemi popsanými v GenBank a/nebo EMBL databázích, například AF045536.1 (Macaca fuscicularis), AF045537.1 (Macaca mulatta), AB016710 (Felix catus), K00752 (Oryctolagus cuniculus), U03780 (Sus scrofa), Z48947 (Camelus dromedarius), X62916 (Bos taurus), L07789 (Mustela vison), X69797 (Ovis aries), U17166 (Cricetulus migratorius), X07189 (Rattus rattus), AF57619.1 (Trichosurus vulpecula), nebo AF035195 (Monodelphis domestica), které jsou zde uvedeny jako odkazy.
Dále se předpokládá, že v provedení předkládaného vynálezu mohou být použitelné substituce nebo delece aminokyselin v konstantních regionech těžkého řetězce imunoglobulinu.
Jedním příkladem je vložení aminokyselinových substitucí v horní části CH2 regionu za zisku Fc varianty s redukovanou • · afinitou pro Fc receptory (Cole et al., 1997, J. Immunol. 159: 3613). Odborník v oboru bude schopen připravit takové konstrukty za použití dobře známých molekulárně-biologických technik.
Použití lidských Fcyl jako Fc regionů má několik výhod. Například, když má být Fc fúzní protein použit jako biofarmaceutické činidlo, tak může Fcyl doména dodávat efektorové aktivity fúznímu proteinu. Mezi efektorové aktivity patří biologické aktivity jako je přenos přes placentu a prodloužený sérový poločas. Fc region imunoglobulinu také poskytuje prostředek pro detekci anti-Fc ELISA a pro přečištění prostřednictvím vazby na protein A Staphylococcus aureus (protein A) . V některých aplikacích může však být žádoucí odstranění specifických efektorových funkcí z Fc regionu imunoglobulinu, jako je například vazba na Fc receptor a/nebo fixace komplementu.
Je třeba si uvědomit, že předkládaný vynález využívá běžné techniky rekombinantní DNA pro přípravu Fc fúzních proteinů použitelných při provedení předkládaného vynálezu. Fc fúzní konstrukty jsou výhodně připraveny na úrovni DNA a vzniklé DNA jsou integrovány do expresních vektorů a jsou exprimovány za produkce fúzních proteinů podle předkládaného vynálezu. Termín vektor, jak je zde použit, označuje jakoukoliv nukleovou kyselinu obsahující nukleotidovou sekvenci, která může být inkorporována do hostitelské buňky a která může být rekombinována s a. integrována do genomu hostitelské buňky, nebo která se může replikovat autonomně jako episom. Mezi takové vektory patří lineární nukleové kyseliny, plasmidy, fágemidy, kosmidy, RNA vektory, virové vektory a podobně. Příklady virových vektorů jsou retrovirus, adenovirus a adenoasociovaný virus. Termín genová exprese nebo exprese • · cílového proteinu označuje transkripci DNA sekvence, translaci mRNA transkriptu a sekreci Fc fúzního proteinu.
Vhodným expresním vektorem je pdCs (Lo et al., 1988,
Protein Engineering 11: 495, ve kterém transkripce Fc-X genu využívá zesilovač/promotor z lidského cytomegaloviru a SV40 polyadenylační signál. Použitá sekvence zesilovače a promotoru z lidského cytomegaloviru byla získána z nukleotidů -601 až +7 sekvence uvedené v Boshart et al., 1985, Cell 41: 521. vektor také obsahuje mutantní gen pro dihydrofolát reduktasu jako markér pro selekci (Simonsen and Levinson, 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 2495) .
Vhodná hostitelská buňka může být transformována nebo transfektována DNA sekvencí podle předkládaného vynálezu a může být použita pro expresi a/nebo sekreci cílového proteinu. V současnosti preferovanými hostitelskými buňkami pro použití v předkládaném vynálezu jsou imortalizované hybridomní buňky, NS/O myelomové buňky, 293 buňky, ovariální buňky čínského křečka, HELA buňky a COS buňky.
Jeden expresní systém, který byl použit pro expresi fúzních proteinů v savčích buňkách, je DNA konstrukt kódující, ve směsu 5'->3', sekreční kazetu, která obsahuje signální sekvenci a Fc region imunoglobulinu, a cílový protein. V tomto systému byl úspěšně exprimováno několik cílových proteinů, mezi které patří, například, IL-2, CD26, Tat, rev, OSF-2, PIG-H3, IgE receptor, PSMA a gpl20. Tyto expresní konstrukty jsou popsány v US patentech č. 5541087 a 5726044, Lo et al.
Termín signální sekvence, jak je zde použit, označuje segment, který řídí sekreci interferón-α. fúzního proteinu a který je odštěpen po translaci v hostitelské buňce. Signální • ♦ • · • · · · · · · • · · · · · · • ······» « · sekvencí podle předkládaného vynálezu je polynukleotid, který kóduje aminokyselinovou sekvenci, která iniciuje transport proteinu přes membránu endoplasmatického retikula. Mezi signální sekvence, které jsou použitelné v předkládaném vynálezu, patří signální sekvence lehkého řetězce protilátek, například protilátky 14.18 (Gillies et al., 1989, J. Immunol. Meth. 125: 191), signální sekvence těžkého řetězce protilátek, jako je například signální sekvence těžkého řetězce protilátky M0PC141 (Sakano et al., 1980, Nátuře 286: 5774) a jakákoliv jiná signální sekvence známá v oboru (viz například Watson (1984) Nucleic Acids Research 12: 5145).
Signální sekvence byly dobře charakterizovány v oboru a obvykle obsahují 16 až 30 aminokyselinových zbytků a mohou obsahovat také více nebo méně aminokyselinových zbytků.
Typický signální peptid se skládá ze tří regionů: bazického Nkoncového regionu, centrálního hydrofobního regionu a polárnějšího C-koncového regionu. Centrální hydrofobní region obsahuje 4 až 12 hydrofobních zbytků, které ukotvují peptid v membránové dvojvrstvě během transportu rostoucího polypeptidu. Po iniciaci se signální peptid obvykle odštěpí v lumen endoplasmatického retikula působením buněčných enzymů známých jako signální peptidasy. Potenciální štěpící místa signálního peptidu obvykle sledují pravidlo -3,-1. Proto obsahuje typický signální peptid malý, neutrální aminokyselinový zbytek v pozicích -1 a -3 a v tomto regionu neobsahuje prolinový zbytek. Signální peptidasy štěpí takový signální peptid mezi -1 a +1 aminokyselinou. Tak může být signální sekvence odštěpena z amino konce fúzního proteinu během sekrece. Toto vede k sekreci Fc fúzního proteinu skládajícího se z Fc regionu imunoglobulinu a cílového proteinu. Podrobný popis signálních sekvencí je uveden ve von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4683.
• ·
Jak bude odborníkům v oboru jasné, vhodnost konkrétní signální sekvence pro použití v sekreční kazetě může vyžadovat ověření určitým rutinním experimentováním. Mezi takové pokusy patří stanovení schopnosti signální sekvence řídit sekreci Fc fúzního proteinu a také stanovení optimální konfigurace, genomové nebo cDNA, sekvence, která je vhodná pro dosažení účinné sekrece Fc fúzních proteinů. Dále, odborník v oboru je schopen vytvořit syntetický signální peptid podle pravidel uvedených ve von Heijne, a testovat účinnost takové syntetické signální sekvence běžnými způsoby. Signální sekvence může být také označována jako signální peptid, vedoucí sekvence nebo vedoucí peptid.
Fúze signální sekvence a Fc regionu imunoglobulinu je někdy označována jako sekreční kazeta. Příkladem sekreční kazety použitelné v provedení předkládaného vynálezu je polynukleotid kódující, ve směru 5'->3', signální sekvenci genu pro lehký řetězec imunoglobulinu a Fcyl region lidského genu pro imunoglobulin γΐ. Fcyl region genu imunoglobulinu Fcyl výhodně obsahuje alespoň část pantové domény imunoglobulinu a alespoň CH3 doménu, nebo lépe alespoň část pantové domény, CH2 doménu a CH3 doménu. Termín část pantového regionu imunoglobulinu označuje část pantového regionu imunoglobulinu, která obsahuje alespoň jeden, lépe dva, cysteinové zbytky schopné tvořit meziřetězcové disulfidové vazby. DNA kódující sekreční kazetu může být v genomové konfiguraci nebo v cDNA konfiguraci. Za některých okolností může být výhodné produkovat Fc region ze sekvence těžkého řetězce imunoglobulinu Fcy2. Ačkoliv se Fc fúze připravené ze sekvencí lidského imunoglobulinu γΐ a γ2 chovají u myší podobně, mohou mít Fc fúze využívající γ2 sekvence u člověka lepší farmakokinetiku.
* · •» · · · • · · · fc » • ··»·« ···· » » · » ·
V jiném provedení kóduje DNA sekvence proteolytické štěpící místo vložené mezi sekreční kazetu a cílový protein. Štěpící místo poskytuje místo pro proteolytické štěpení kódovaného fúzního proteinu, což umožňuje separování Fc domény od cílového proteinu. Termín proteolytické štěpící místo, jak je zde použit, označuje aminokyselinové sekvence, které jsou přednostně štěpeny proteolytickým enzymem nebo jiným proteolytickým štěpícím činidlem. Vhodnými proteolytickými štěpícími místy jsou aminokyselinové sekvence, které jsou rozpoznávány proteolytickými enzymy, jako je trypsin, plasmin nebo enterokinasa K. Je známo mnoho párů štěpící místo/štěpící činidlo (viz například US patent č. 5726044).
Dále, substituce nebo delece konstruktů těchto konstantních regionů, ve kterých je jeden nebo více aminokyselinových zbytků domén konstantního regionu substituován nebo deletován, mohou být také použity. Jedním příkladem je vložení aminokyselinových substitucí do horního CH2 regionu za vytvoření Fc varianty s redukovanou afinitou pro Fc receptory (Cole et al., 1997, J. Immunol. 159: 3616). Odborník v oboru bude schopen připravit takové konstrukty za použití dobře známých technik molekulární biologie.
V popsaných příkladech jsou produkovány vysoké koncentrace Fc-interferonu-α. Počáteční klony produkují přibližně 50 μρ/ml Fc-interferonu-α, který může být snadno přečištěn do homogenity afinitní chromatografií s proteinem A. Úrovně exprese mohou být často několikanásobně zvýšeny subklonováním. Jak bylo uvedeno výše, bylo zjištěno, že když je interferon-a exprimován jako Fc fúzní molekula, tak jsou dosaženy vysoké úrovně exprese, pravděpodobně proto, že Fc část působí jako nosič, což napomáhá správnému složení polypeptidu na C-konci a • · účinné sekreci. Dále, Fc region je glykosylovaný a při fyziologickém pH má značný náboj, takže Fc region může napomoci solubilizaci hydrofobnich proteinů.
Kromě vysoké úrovně exprese máji fúzni proteiny interferonu-α delší sérové poločasy ve srovnání s interferonem-α samotným, částečně v důsledku jejich větší velikosti molekuly. Například, Fc-interferon-α má cirkulační poločas 19,3 hodiny u myši (viz příklad 6), ve srovnání s 2-5 hodinami pro interferon-α (Physician Desk Reference, 50. vydání, 1996; 2156-2147 a 2364-2373). Interferon-α, který má molekulovou hmotnost přibližně 19 kD, je dosti malý proto, aby mohl být účinně odstraňován renální filtrací. Naopak, Fcinterferon-α má molekulovou hmotnost přibližně 100 kD, protože se skládá ze dvou interferonů-α navázaných na každou Fc molekulu (tj. dva interferony-α, protože Fc je ve formě dimeru). Taková dimerní struktura může vykazovat vyšší vazebnou afinitu k receptoru pro interferon-α. Protože je aktivita interferonu-α zprostředkovaná jeho receptorem, budou bivalentní fúzni proteiny s interferonem-α potenciálně účinnější než interferon-α samotný.
Dále, je známo, že mnoho proteinových ligandů se váže na své receptory ve formě dimeru. Protože interferon-α náleží do třídy proteinových ligandů se slabou dimerizační konstantou, činí fyzikální charakteristiky dodané Fc z dimerizace interferonu-α intramolekulový proces, což posouvá rovnováhu ve prospěch dimeru a zesiluje jeho vazbu na receptory. Do · monomeru mohou být také standardními technikami rekombinantní DNA vloženy do vhodných míst cysteinové zbytky, za účelem stabilizace dimeru tvorbou kovalentních disulfidových vazeb.
• · ··· « « · · · · ·
Fúzní proteiny podle předkládaného vynálezu poskytují několik významných klinických výhod. Jak bylo prokázáno v testech biologické aktivity na Daudi buňkách a v testech cytopatického efektu (příklad 4), je biologická aktivita Fcinterferonu-α významně vyšší než biologická aktivita interferonu-a.
Jiné provedení předkládaného vynálezu poskytuje konstrukty mající různé strukturální konformace, například bivalentní nebo multivalentní konstrukty, dimerní nebo multimerní konstrukty a jejich kombinace. Takové funkční konformace molekul podle předkládaného vynálezu umožňují testování synergního účinku interferonu-α a jiných anti-virových a protinádorových proteinů na zvířecích modelech.
Důležitým aspektem vynálezu je to, že sekvence a vlastnosti různých interferonů-α a kódujících DNA jsou dosti podobné.
V kontextu Fc-X fúzí jsou vlastnosti interferonů-α a kódujících DNA v podstatě identické, takže může být pro přípravu jakékoliv DNA fúze Fc-interferon-α použita jedna sada technik, stejně jako pro expresi fúzního proteinu, přečištění fúzního proteinu a podání fúzního proteinu pro terapeutické účely.
Předkládaný vynález také poskytuje způsoby pro produkci interferonu-α z druhů jiných než je člověk jako Fc fúzních proteinů. Non-lídské interferon-α fúzní proteiny jsou použitelné pro preklinické testy interferonu-a, protože testy účinnosti a toxicity proteinového léku musejí být před testováním na člověku provedeny na zvířecím modelu. Lidský protein nemusí působit v myším modelu stejně, protože protein může vyvolat imunitní reakci a/nebo může mít jinou • · farmakokinetiku, což může zkreslit výsledky testu. Proto je při testování na myším modelu použit místo lidského proteinu ekvivalentní myší protein.
Předkládaný vynález poskytuje způsoby pro léčbu různých nádorů, virových onemocnění, jiných onemocnění, příbuzných stavů a příčin, kde uvedené způsoby zahrnují podání DNA, RNA nebo proteinů podle předkládaného vynálezu savcům s takovým onemocněním. Mezi příbuzné stavy patří, například, hepatitida P, hepatitida C, hepatitida D, condylomata accuminata, vlasatobuněčná leukemie, Kaposhiho sarkom při AIDS, melanom, karcinom prostaty a jiné formy virových onemocnění a nádorů.
Z hlediska široké úlohy interferonu-α v modulování imunitní reakce poskytuje předkládaný vynález také způsoby pro léčbu onemocnění zmírněných podáváním interferonu-α. Tyto způsoby zahrnují podávání účinného množství prostředku podle předkládaného vynálezu savci s onemocněním, které může a nemusí přímo souviset s virovou infekcí nebo nádorem.
Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou použitelné nejen jako terapeutická činidla, ale také při produkci protilátek pro diagnostické použití. Obdobně, vynález zahrnuje vhodné podání DNA nebo RNA, například ve vektoru nebo v jiném přepravním systému.
Jako fúzní protein obsahující Fc region imunoglobulinu, má Fc-interferon-α velmi výhodnou tkáňovou distribuci a mírně odlišný způsob účinku pro dosažení klinické účinnosti, zejména delší sérový poločas a může být podána vysoká dávka solubilního proteinu. Konkrétně, v játrech existují velmi vysoké koncentrace Fc-γ receptoru a játra jsou místem infekci viry způsobujícími hepatitidu B a hepatitidu D. Neurologické vedlejší účinky interferonu-α jsou způsobeny malou molekulou • · • ·
interferonu-α, která prochází hematoencephalíckou bariérou. Mnohem věší velikost Fc-interferonu-α významně redukuje rozsah, ve kterém tento protein prochází hematoencephalíckou barierou.
Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být podány jakýmkoliv způsobem, který je kompatibilní s konkrétními molekulami. Předpokládá se, že prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být podány zvířatům jakýmikoliv prostředky, přímo (například lokálně, jako je injekcí, implantací nebo lokálním podáním do určité tkáně), nebo systémově (například parenterálně nebo orálně). Když má být prostředek podán parenterálně, například intravenosně, podkožně, očně, intraperitoneálně, intramuskulárně, bukkálně, rektálně, vaginálně, intarorbitálně, intarcerebrálně, intrakraniálně, intraspinálně, intraevntrikulárně, intrathekálně, intracisternálně, intrakapsulárně, intranasálně nebo v aerosolu, tak prostředek výhodně obsahuje podíl vodné nebo fyziologicky přijatelné kapalné suspenze nebo roztoku.Nosič nebo vehikulum je fyziologicky přijatelné, takže při podání požadovaného prostředku pacientovi tento prostředek neovlivňuje nežádoucím způsobem rovnováhu elektrolytů a/nebo objemu kapalin u pacienta. Kapalným mediem pro činidlo tak může být normální fyziologický roztok.
DNA konstrukty (nebo genové konstrukty) podle předkládaného vynálezu mohou být použity jako součást protokolu genové terapie pro přenos nukleových kyselin kódujících interferon-a nebo fúzní protein obsahující interferon-α. Vynález se týká expresních vektorů pro in vivo transfekci a expresi interferonu-α nebo fúzního proteinu obsahujícího interferon-a v konkrétním typu buněk tak, aby se obnovila nebo doplnila funkce interferonu-α. Expresní konstrukty pro interferon-a • · · « • ·
---- - . « ► · · · · < »* · · · ·« ·« nebo pro fúzní protein obsahující interferon-α mohou být podány v jakémkoliv biologicky efektivním nosiči, například v jakémkoliv prostředku schopném přenést gen pro interferon-a nebo fúzní protein do buněk in vivo. Mezi vhodné postupy patří inserce daného genu ve virových vektorech včetně rekombinantních retrovirů, adenovirů, adeno-asociovaných virů a virů herpes simplex 1, nebo v rekombinantních bakteriálních nebo eukaryotických plasmidech. Výhodné dávky pro aplikaci nukleových kyselin kódujících fúzní proteiny podle předkládaného vynálezu jsou v rozmezí od 1 pg/m do 100 mg/m , lépe od 20 gg/m2 do 10 mg/m2, a nejlépe od 400 gg/m2 do 4 mg/m2. Předpokládá se, že optimální dávky a způsob podání bude určen odborníkem v oboru za použití běžných pokusů.
Výhodné dávky fúzního proteinu na podání jsou v rozmezí od
2 2 2 0,1 mg/m do 100 mg/m , lépe od 1 mg/m do 20 mg/m a nejlépe od 2 mg/m do 6 mg/m . Předpokládá se však, že optimální dávka závisí na léčeném onemocnění a na existenci nežádoucích účinků. Nicméně, optimální dávky mohou být určeny běžným experimentováním. Podání fúzního proteinu může být provedeno jako periodické bolusové injekce, nebo může být podání provedeno kontinuální intravenosní nebo intraperitoneální infusí (například z intravenosního vaku) nebo z biodegradovatelného implantátu. Dále se předpokládá, že fúzní proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být podány příjemci společně s různými dalšími biologicky aktivními molekulami. Nicméně, předpokládá se, že optimální kombinace fúzního proteinu a jiných molekul, způsoby podání a dávky mohou být určeny rutinním experimentováním.
Vynález bude nyní ilustrován v následujících příkladech.
·
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Exprese huFc-huinterferonu-α (huFc-IFN-a) mRNA se připravila z mononukleárních buněk lidské periferní krve a reverzně se transkribovala reevrzní transkriptasou. Vzniklá cDNA se použila jako templář pro polymerasovou řetězovou reakci (PCR) pro klonování a adaptaci lidské cDNA interferonu-α pro expresi ve formě fúzního proteinu huFcinterferon-a (huFc-IFN-a). Primer ve směsu kódující sekvence byl 5' C CCG GGT AAA TGT GAT CTG CCT CAG AC (SEQ ID NO: 5), kde sekvence CCCGGG (Xmal restrikční místo)TAAA kóduje karboxykonec těžkého řetězce imunoglobulinu, a po ní následuje sekvence (tučně) kódující N-konec interferonu-α. Reversní primer byl 5'-CTC GAG TCA ATC CTT CCT CCT TAA TC (SEQ ID NO:
6), který kóduje karboxy-koncovou sekvenci (protismyslnou) interferonu-α s translačnim STOP kodonem (antikodonem, TCA) , a po ní následuje Xhol místo (CTCGAG) . Produkt PCR velikosti 517 párů baží se klonoval a sekvenoval. Analýza sekvence potvrdila, že PCR produkt kóduje zralý lidský interferon-a adaptovaný pro expresi, tj. s Xmal na 5' konci a Xhol místem na 3' konci.
Expresní vektor pdCs-huFc-IFN-α se konstruoval následujícím způsobem. Xmal-Xhol restrikční fragment obsahující cDNA lidského interferonu-α se ligoval do Xmal-Xhol fragmentu pdCshuFc vektoru způsobem podle Lo et al., 1998, Protein Engineering 11: 495. huFc je lidský Fc fragment imunoglobulinu gamma 1. Vzniklý vektor, pdCs-huFc-IFN-α, se použil pro transfekci savčích buněk pro expresi huFc-IFN-a.
Příklad 2: Transfekce a exprese proteinu • · ♦ * ·
Pro dočasnou transfekci se plasmid pdCs-huFc-IFN-α vloží do lidských ledvinných 293 buněk současným srážením plasmidové DNA s fosforečnanem vápenatým (Sambrook et al., ed., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY) nebo lipofekcí za použití Lipofectamine Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) podle návodu výrobce.
Pro získání stabilně transfektovaných klonů se plasmidová DNA vloží do myších myelomových NS/0 buněk elektroporací. Stručně, NS/0 buňky se kultivují v Dulbeccově modifikovaném Eaglově mediu doplněném 10% fetálním hovězím sérem, 2 mM glutaminu a penicilinem/streptomycinem. Přibližně 5x10 buněk se promyje jednou fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS) a resuspenduje se v 0,5 ml PBS. 10 gg linearizované plasmidové DNA se potom inkubuje s buňkami v Gene Pulser kyvetě (0,4 cm mezera mezi elektrodami, BioRad) na ledu po dobu 10 minut. Elektroporace se provede za použití Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) s nastavením 0,25 V a 500 μΓ. Buňky se nechají zotavit 10 minut na ledu a potom se resuspendují v kultivačním mediu a vloží se do dvou 96-jamkových ploten. Stabilně transfektované klony se selektují za přítomnosti 100 nM methotrexátu (MTX), který se přidá dva dny po infekci. Buňkám se dodává methotrexát každé tři dny a kolonie resistentní na MTX se objeví za 2-3 týdny. Supernatanty z klonů se testují za použití anti-Fc ELISA (viz příklad 3) pro identifikaci buněk s vysokou produkcí. Klony s vysokou produkcí se izolují a propagují se v kultivačním mediu obsahujícím 100 nM MTX.
Pro běžnou charakterizaci gelovou elektroforesou se Fc fúzní proteiny v kondicionovaném mediu navážou na Protein A Sepharosu (Repligen, Cambridge, MA) a potom se eluují ·<· z Protein A Sepharosy vařením ve standardním proteinovém vzorkovém pufru s nebo bez 2-merkaptoethanolu. Po elektroforese na dodecyl síran sodný - polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) se proteinové proužky vizualizují barvením Coomasie modří. Podle SDS-PAGE má huFc-interferon-α zřetelnou molekulovou hmotnost přibližně 52 kD.
Pro přečištění se fúzní proteiny navázané na Protein A Sepharosu eluovaly v pufru tvořeném fosforečnanem sodným (100 mM NafoPOo pH 3 a 150 mM NaCl) . Eluát se potom ihned neutralizoval 0,1 objemu 2M Tris-hydrochloridu, pH 8.
Příklad 3: ELISA test
Koncentrace proteinových produktů obsahujících lidský Fc v supernatantech klonů resistentních na MTX a jiných testovaných vzorcích se určila anti-huFc ELISA. Postup je podrobně popsán dále.
A. Potahování ploten
ELISA plotny se potáhly AffiniPure kozím anti-myším IgG (H+L) (Jacson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) v koncentraci 5 gg/ml v PBS, a za použití 100 μΐ/jamku v 96jamkových plotnách (Nunc-Immuno plotna Maxisorp). Potažené plotny se zakryly a inkubovaly se při 4 °Č přes noc. Plotny se potom promyly 4-krát 0,05% Tween (Tween 20) v PBS a blokovaly se 1% BSA/1% kozím sérem v PBS, 200 gg/jamku. Po inkubaci s blokovacím pufrem při 37 °C po dobu 2 hodin se plotny promyly
4-krát 0,05% Tween v PBS a vysušily se papírovou utěrkou.
B. Inkubace testovaných vzorků a sekundární protilátky
4« ·· ♦< · • · · · · D » • · · · « *> · « · ····· «« • » · » « •· ·« ·« • β ·» ·
Testované vzorky se naředily podle potřeby ve vzorkovém pufru (1% BSA/1% kozí sérum/0,05% Tween v PBS). Standardní křivka se připravila za použití chimérické protilátky (s lidským Fc), jejíž koncentrace byla známá. Pro přípravu standardní křivky se připravily sériová ředění ve vzorkovém pufru za zisku standardní křivky v rozsahu od 125 ng/ml do 3,9 ng/ml. Naředěné vzorky a standardy se přidaly k plotně v dávce 100 μΐ/jamku a plotna se inkubovala při 37 °C po dobu 2 hodin.
Po inkubaci se plotna promyla 8-krát 0,05% Tween v PBS. Do každé jamky se potom přidalo 100 μΐ sekundární protilátky, anti-lidského IgG konjugovaného s křenovou peroxidasou (Jackson Immuno Research), v ředění přibližně 1:120000 ve vzorkovém pufru. Přesné ředění sekundární protilátky bylo určeno pro každou šarži anti-lidského IgG konjugovaného s HRP. Po inkubaci při 37 °C po dobu 2 hodin se plotna promyla 8-krát 0,05% Tween v PBS.
C. Vyvíjení
Roztok substrátu se přidal k plotně v množství 100 μΐ/jamku. Roztok substrátu se připravil rozpuštěním 30 mg OPD (ofenylendiamindíhydrochloridu (OPD) (1 tableta) v 15 ml 0,025 M kyseliny citrónové/0,05 M Na2HPO4 pufru, pH 5, který obsahoval 0,03% čerstvě přidaného peroxidu vodíku. Barva se nechala vyvíjet po dobu 30 minut při teplotě místnosti ve tmě. Doba vývoje může být různá, podle variability šarží potažených ploten, sekundární protilátky atd. Reakce se ukončila přidáním 4N kyseliny sírové, 100 μΐ/jamku. Plotna se odečítala na čtečce ploten, která byla nastavena na 490 a 650 nm a která byla naprogramována pro odečtení základní OD při 650 nm od OD při 490 nm.
·· • ·
• * • · • · » · ·· ·· « ··· · · · ···· · • · » ·
Příklad 4: Biotesty
Biologická aktivita huFc-huIFN-α se srovnávala s aktivitou lidského interferonu-α (hu-IFN-a), což je leukocytární interferon od Sigam, St. Louis, MO) za použití dvou různých testů. První test určuje inhibici proliferace Daudi lidské lymfoblastové B-lymfocytární linie (ATCC CCL 213). Druhý test měří inhibici cytopatického efektu viru encephalomyokarditidy (EMCV) na A549 buněčnou linii lidského karcinomu plic (ATCC CCL 185).
Interferon a inhibuje proliferaci Daudi buněk (lidský Burkitův lymfom). Daudi buňky se promyly dvakrát bezsérovým RPMI 1640 a resuspendovaly se v kultivačním mediu skládajícím se z RPMI 1640 a 20% teplem inaktivovaného (56 °C) fetálního hovězího séra. Buňky se potom vložily v hustotě lxlO5 buněk/ml do 24-jamkové plotny za přítomnosti různých koncentrací alFH (2,lxl06 mezinárodních jednotek/mg). Po 3-4 dnech se zjistilo, že 50 pg/ml IFN-α ve formě huFc-huIFN-a bylo stejně účinné jako 750 pg/ml huIFN-a v dosažení 50-100% inhibice růstu Daudi buněk. Kontrolní interferon-γ (Pharmingen, San Diego, CA) v koncentraci 100 ng/ml nevykazoval v tomto testu žádnou aktivitu. Toto dokazuje, že inhibice je specifická pro interferon-a.
Příklad 5: Měření antivirové aktivity
Replikace viru v buněčné kultuře často vede k cytotoxicitě, což se označuje jako cytopatický efekt (CPE). Interferony mohou indukovat anti-virový stav v buněčných kulturách a mohou chránit buňky před CPE. Antivirová aktivita IFN-α může být kvantifikována testem redukce cytopatického efektu (CPER), jak • · • ·
je popsán v Lymphokines and Interferons: A Parctical
Approach, ed. M.J. Clemens, A.G. Morris a A.J.H. Gearing, IRL Press, Oxford, 1987. Antivirové aktivity huFc-huIFN-α a huIFNα byly srovnávány za použití A54 9 buněčné linie lidského karcinomu plic (ATCC CCL 185) a viru encephalomyokarditidy (ATCC VR 129B) za použití CPER protokolu uvedeného výše. Bylo zjištěno, že účinné dávky pro dosažení 50% CPER (tj. 50% ochrany) jsou 570 pg/ml (podle množství IFN-α) pro huFc-huIFNa a 500 pg/ml pro hu-IFN-a. Tak má IFN-α, v huFc-huIFN-α a huIFN-α v podstatě stejnou anti-virovou aktivitu.
Příklad 6: Farmakokinetika
Farmakokinetika huFc-huIFN-α byla určena na skupině 4 Balb/c myší. 25 mg huFc-huIFN-α bylo injekčně aplikováno do ocasní žíly každé myši. Krev byla odebírána retroorbitálně ihned po injekci (tj. v t = 0) a za 0,5, 1, 2, 4, 8 a 24 hodin po injekci. Vzorky krve byly odebrány do zkumavek obsahujících heparin pro prevenci srážení. Buňky se odstranily odstředěním v Eppendorfově vysokorychlostní odstředivce po dobu 4 minut. Koncentrace huFc-huIFN-α v plasmě se měřila anti-huFc ELISA a westernovou hybridizací s anti-huFc protilátkou, což ukázalo, že huFc-huIFN-α zůstával intaktní v cirkulaci (52 kD proužek pro huFc-huIFN-α). Nebyly detekovány žádné degradační produkty (32 kD pro huFc). Cirkulační poločas huFc-huIFN-α byl stanoven na 19,3 hodiny,což je významně delší, než popsaný cirkulační poločas lidského IFNa, který je přibližně 2 až 5 hodin) (Physician Desk Reference, 50. vydání, 1996: 2145-2147 a 23642373).
Příklad 7: Léčba disseminovaného lidského Burkitova lymfomu u SCID myší
Daudi buňky (lidský Burkitův lymfom) se kultivovaly v C-B17 SCID (těžká kombinovaná imunodeficience) myší jako disseminované nádory (Ghetie et al., 1990, Int. J. Cancer 45: 481). Přibližně 5xl06 Daudi buněk ve formě jednobuněčné suspenze ve 0,2 ml PBSB se injikovalo intravenosně SCID myším stáří 6-8 týdnů. O tři dny později se myši rozdělily do tří skupin po osmi a denně se jim aplikovala intraperitoneální injekce 0,2 ml PBS, 30 Mg huFc-huIFN-α (obsahující přibližně 15 Mg IFN-α) v PBS, nebo 60 Mg huFc-huIFN-a v PBS. Myši se sledovaly denně. Výsledky jsou uvedené na obr. 2.
V den 28 po injekci Daudi buněk se u všech myší v kontrolní PBS skupině (kosočtverečky) vyvinula paralýze zadních tlapek. Myši v této PBS kontrolní skupině začaly umírat v den 38 a v den 61 byly všechny myši v kontrolní skupině mrtvé. Naopak, myši v léčené skupině přežívaly mnohem déle a nezávisle na dávce. Ve skupině, které bylo podáváno 30 Mg huFc-huIFN-a (křížky), se první úmrtí vyskytlo v den 70a všechny myši skonaly do dne 134. Ve skupině, které bylo podáváno 60 Mg huFchuIFN-α (trojúhelníčky) nebylo žádné úmrtí do dne 126 a čtyři myši pošli do dne 153. Ostatní myši byly nemocné a byly utraceny.
Příklad 8: Léčba lokalizovaného lidského Burkitova lymfomu u SCID myší
V tomto modelu byly Daudi buňky kultivovány v C.B-17 SCID myších jako podkožní nádory (Getie et al., 1990, Int. J.
Cancer 45: 481). Přibližně 5xl06 Daudi buněk ve formě jednobuněčné suspenze ve 0,2 ml PBSB se injikovalo podkožně SCID myším stáří 6-8 týdnů.Léčba se zahájila tehdy, když o
nádory dosáhly velikosti 200-400 mm , což trvalo přibližně 4 • · týdny. Myši se rozdělily do 3 skupin po 8 a každé skupině se aplikovalo 6 denních intraperitoneálních injekcí 0,2 ml PBS, gg huFc-huIFN-α v PBS nebo 60 gg huFc-huIFN-α v PBS.
Výsledky jsou uvedeny na obr. 3. Velikost nádorů byla měřena dvakrát týdně.
Nádory v kontrolní skupině myší (kosočterečky) rostly rychle a dosáhly průměrného objemu 5602 mm3 (rozmezí 4343-6566 mm3) v den 35, po kterém byly všechny myší ve skupině utraceny. Naopak, růst nádorů u myší v léčených skupinách byl inhibován způsobem závislým na dávce. Skupiny, kterým bylo aplikováno 30 μg a 60 μg huFc-huIFN-α, měly průměrné objemy nádorů 214 a 170 mm3, v příslušném pořadí, v den 35, což bylo méně než 268 a 267 mm3 před léčbou. Ve skutečnosti podkožní nádory zcela vymizely u 5 z 8 myší ve skupině, které bylo aplikováno 30 μg huFchuIFN-α, a u 4 z 8 myší ve skupině, které bylo aplikováno 60 μg huFc-huIFN-α. Bez další léčby však některé nádory recidivovaly a rostly. Nicméně, dvě myši ve skupině zůstaly bez nádoru dó dne 205, kdy byl pokus ukončen.
Příklad 9: Léčba jaterních onemocnění F interferonem-a
Předpokládá se, že jaterní onemocnění, například hepatitida nebo jaterní metastázy, mohou být účinněji léčeny Fcinterferonem-α nebo interferonem-a nebo interferonem-a-Fc.
Například se předpokládá, že Fc-interferon-α může být účinný v léčbě myšího modelu, ve kterém nádorové buňky metastazují do jater. Myši se uvedou do anestesie intraperitoneální injekcí ketaminu v dávce 80 mg/kg a xylazinu v dávce 5 mg/kg v 0,2 ml PBS přibližně 5 minut před chirurgickým zákrokem. Následující kroky se potom provedly • · • · v boxu s laminárním prouděním pro zajištění sterility. Kůže každé myši se očistila betadinem a ethanolem. Nádorové buňky, jako jsou Daudi buňky, se injikovaly ve 100 μΐ RPMI 1640 media bez doplňků do pouzdra sleziny během 1 minuty za použití 27gauge jehly. Po 2 minutách se výběžek sleziny ligoval 4,0 hedvábným stehem a slezina se odstranila.
Některé buňky se přesunuly z místa injekce do jater, kde vytvořily metastatické nádory. Myši s metastatickými jaterními nádory se léčily Fc-interferonem-α. Předpokládá se, že myši léčené Fc-interferonem-α budou mít významnou redukci růstu nádorů ve srovnání s myšmi léčenými ekvimolárním množstvím interferonu-α nebo fúzního proteinu interferon-a-Fc.
Dále se předpokládá, že specifický efekt Fc-interferonu-α je více zvýrazněn při léčbě jaterních onemocnění než při léčbě onemocnění lokalizovaných do jiných tkání, ve kterých není Fcinterferon-α koncentrován.
Ekvivalenty
Vynález má i jiné specifické formy spadající do rozsahu předkládaného vynálezu. Uvedená provedení jsou ve všech ohledech ilustrativní a nijak neomezují rozsah vynálezu, který je definován pouze připojenými patentovými nároky.
Objevy všech článků a patentových dokumentů jsou zde uvedeny jako odkazy.
• ·
Seznam sekvencí <110> Lo, Kin-Ming Sun, Yaping Gillies, Stephen D.
Lexigen Pharmaceuticals Corp.
<120> Exprese a export interferonů-α ve formě Fc fúzních proteinů <130> LEX-009 PC <140>
<141>
<150> US 60/134895 <151> 19.5.1999 <160> 29 <170> Patentln verze 2.0 <210> i <211> 498 <212> DNA <213 > Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(498) < 2 x 3 > DNA sekvence lidského interferonu-a <400> i
tgt cat Cys Asp 1 ctg Leu CCt Pro cag Gin 5 acc cac Thr Kis age Ser cta Leu sgt Gly 10 aat Asn agg Arg agg Arg gcc Ala ttg Leu 15 ata Ile 48
ctc ctg gca caa atg gga atc tet cct ttc tcc tgc ctg aag gac 96
Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
aga cat gac ttt gga ttc ccc cag gag ttt gat 9SC aac cag ttc 144
Arg Kis Asp Phe Gly Fhe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe
35 40 45
cag aag gct Cča gcc atc CCt ctc ctc cat cag atg ate cag cag acc 192
C-ln Lys Ala Gin Ala Ile Pro Val Leu Kis Glu Met Ile Gin Gin Thr
50 55 60
ttc aat ctc ttc age aca aag gac tea tet gct act tgg gaa cag age 240
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gin Ser
65 70 75 80
ctc cta gaa HS3 ttt tcc act caa ctt aac cag cag ctg aat gac ctg 288
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gin Gin Leu Asn Asp Leu
85 9 0 95
gaa gcc tec ctg ata cag Sa3 gtt SSS gtg caa gag act ccc ctg atg 336
Glu A.la Cys Val Ile . Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
• ·
41 • · • · • · •
čet ctg gsc tec atc ctg get ctg aag aaa tac ttc caa aga atc act 384
Asn Val Asp Ser lle Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gin Arg lle Thr
115 120 125
crt ca t ctg ses gag aag aea tec age cct tgt gcc tgg gag gtt gtc 432
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
ags cca esa atc £t.g aga tec ttc tet tta tea aaa att ttt caa gaa 480
Are AJ.a Giu lle Met Arg Ser Fhe Ser Leu Ser Lys lle Phe Gin Glu
145 150 155 160
aga tta asg aag aag gat 498
Arg Leu Arg Lys Lys Asp
165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Hotno sapiens
<400> 2 Leu Pro Gin Thr 5 His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu lle
Cys 1 Asp
10 15
Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg lle Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Fhe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe A.sp Gly Asn Gin Phe
35 40 45
C-ln Lys Ala Gin Al a lle Pro Val Leu Eis Glu Met lle Gin Gin Thr
50 55 60 -
Phe Asn Leu Fhe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gin Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gin Gin Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val lle Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Val Asp Ser lle Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gin Arg lle Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu lle Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Lys lle Phe Gin Glu
145 150 155 160
Arg Leu Arg Lys Lys Asp 165 <210> 3 <211> 696.
<212> DNA <213> Horno sapiens • · c220>
<221> CDS <222> (1) . . (696) <223>
DNA sekvence lidského Fc <400> 3
cac ccc Glu Pro 1 čcc. Lys tet Ser tet CSC a a a Lys act Thr cac His a ca Thr 10 tgc Cys cca Pro ccg tgc cca gca 4 8
Ser 5 Asp Pro Cys Pro 15 Ala
cct gaa ctc ctc 999 gga ccg cca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc 95
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
5SC CHC acc ctc atg atc tcc ccg acc cct 939 gtc a ca tgc gtg gtg 144
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
ctc gsc gtg age cac gaa gac cct gag gtc 3BO ttc aac tgg tac gtg 192
Var Αερ Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 €0
esc ggc ctg esc ctg est aat ccc BBC óCo aag ccg cgg gag gag cag 24 0
Asp Gly Val Glu Val His Asn Al a Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin
€5 70 75 80
tac aac age acc tac cgt gtc ctc age ctc ctc acc gtc ctg cac cag 288
Tyr Αεη Ser Thr Tyr Arg val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin
85 90 95
esc tgg ctg aat cac étBCj gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 333 gcc 336
Αερ Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
ctc cca gcc ccc ctC SSS asa acc atc tcc 33.3 gcc 333 9S9 cag ccc 384
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro
115 120 3.25
ega esa cca cag ctg tac acc ctg ccc cca tea cgg cag gag atg acc 432
Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg' Glu Glu Met Thr
130 135 140
asg aac cag ctc age ctg acc tgc Ctg ctc 333 ggc ttc tat ccc age 480
Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Vel Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
cac etc gcc ctg 939 tgg gag ago aa t 999 cag ccg gag aac aac tac 528
Asp Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn. Tyr
165 170 175
3SQ óCC a cg cct CCC gtg ctg gac tcc gac 99c tcc ttc ttc ctc tat 576
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
scc SS9 ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag 939 aac gtc ttc 624
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe
195 200 205
tea tgc tcc g tg atg cat gag Jgct ctg cac aac cac tac acg cag aag 672
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys
• · • · · · · · • ·· ·--·• · ····· · • · · · ·
210 215 220
aac ctc tcc ctg tcc ccg 991 aaa €96
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 4 <211> 232 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 4
Glu Prc Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser Eis Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr val
50 55 60
Άερ Gly Val Glu Vel His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Xle Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gl-n Pro
115 120 125
A.rg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Jle Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225
230 <210> 5 <211> 27 • · • · · · · · •44 <212> DNA <213 > Komo sapiens <220>
<22 3 > Forward PCR primer <400> 5 cccgcctaaa tgtgatctgc ctcagac 27 <210> € <211> 26 <212 > DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ctcgagtcaa tccttcctcc ttaatc 26 <210> 7 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens<220>
< x < 3 > Konvenční sekvence BFN-α, kde Xyy v jakékoliv z ( pozic 24,31,70 a 129 je jakákoliv aminokyselina <220>
<223> Xaa24 může být Ile nebo Leu, Xaa 31 může být Lys nebo Gin,
Xaa 70 může být Thr nebo Ser a Xaa 129 může být Leu nebo Val <400> 7
Cys 1 Asp Leu Xaa Xaa 5 Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 10 Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 15 Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa 20 Met Xaa Xaa Xaa Ser 25 Pro Xaa Xaa Cys Leu 30 Xaa Xaa
Arg Xaa Asp 35 Phe Xaa Xaa Pro Xaa 40 Glu Xaa Xaa Xaa Xaa 45 Xaa Gin Xaa
Xaa Xaa 50 Xaa Gin Ala Xaa Xaa 55 Val Leu Xaa Xaa Xaa 60 Xaa Gin Gin Xaa
Xaa 65 Xaa Leu Phe Xaa Xaa 70 Xaa Xaa Xaa Ser Ala 75 Xaa Trp Xaa Xaa Thr SO
Leu Leu Xaa Xaa Xaa 85 Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 90 Gin Gin Leu Xaa Asp 95 Leu
Xaa Xaa Cys Xaa 100 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 105 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 110 Leu Xaa
Xaa Val Xaa 115 Xaa Xaa Leu Xaa Val 120 Xaa Xaa Tyr Phe Xaa 125 Xaa Ile Xaa
Xaa Tyr Leu Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Ser Xaa Cys Ala Trp Glu Xaa Xaa
130 135 140 • « • · ·
Xaa Xaa Xaa Xaa Met Arg Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xsa Xaa Leu Xaa Xaa 145 150 155 160
Arg Leu <210> 8 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<223 > ! Lidský IFN-α 1 protein <400> 8
Cys 1 Asp Leu Pro Glu 5 Thr His Ser Leu Asp 10 Asn Arg Arg Thr Leu 15 Met
Leu Leu Ala Gin. 20 Met Ser Arg Tle Ser 25 Pro Ser Ser Cys Leu 30 Met Asp
Arg His Asp 35 Phe Gly Phe Pro Gin 40 Glu Glu Phe Asp Gly 45 Asn Gin Phe
Gin Lys 50 Ala Pro Ala lle Ser 55 Val Leu His Glu Leu 60 Tle Gin Gin Tle
Phe 65 Asn Leu Phe Thr Thr 70 Lys Asp Ser Ser Ala 75 Ala Trp Asp Glu Asp 80
Leu Leu Asp Lys Phe 85 Cys Thr Glu Leu Tyr 90 Gin Gin Leu Asn Asp 95 Leu
Glu Ala Cys Val 100 Met Gin Glu Glu Arg 105 Val Gly Glu Thr Pro 110 Leu Met
Asn Ala Asp 115 Ser lle Leu Ala Val 120 Lys Lys Tyr Phe Arg 125 Arg Tle Thr
Leu Tyr 130 Leu Thr Glu Lys Lys 135 Tyr Ser Pro Cys Ala 3.40 Trp Glu Val Val
Arg 145 Ala Glu lle Met Arg 150 Ser Leu Ser Leu Ser 155 Thr Asn Leu Gin Glu 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu
165 <210> 9 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>
<223> i Lidský IFN-α 2 protein <4Q0> 9
Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met • · ·« • * · • · · • · ·· οϋυ. ·..· ..
• · · · · • · · · · » • ♦ · · « · ·····«» · 9 • · · · · • ······
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gin Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn. Gin. Phe Gin
35 40 45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gin Gin Ile Phe
50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu
85 90 95
Ala Cys Val Ile Gin Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
100 105 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Tle Thr Leu
115 - 120 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
130 135 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Ser
145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Glu
165 <210> 10 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220> < 22 3 > i Lidský IFN-a 4 protein <400> 10
Cys 1 Asp Leu Pro Gin 5 Thr His Ser Leu Gly 10 Asn Arg Arg Ala Leu 15 Ile
Leu Leu Ala Gin 20 Met Gly Arg Ile Ser 25 His Phe Ser Cys Leu 30 Lys Asp
Arg His Asp 35 Phe Gly Phe Pro Glu 40 Glu Glu Phe Asp Gly 45 His Gin Phe
Gin Lys 50 Thr Gin Ala Ile Ser 55 Val Leu His Glu Met 60 Ile Gin Gin Thr
Phe 65 Asn Leu Phe Ser Thr Glu 70 Asp Ser Ser Ala 75 Ala Trp Glu Gin Ser 80
Leu Leu Glu Lys Phe 85 Ser Thř Glu Leu Tyr 90 Gin Gin Leu Asn Asp 95 Leu
Glu Ala Cys Val Ile Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu. Met • · ·
100 105 110
Asn Val Asp 115 Ser Ile Leu Ala Val 120 Arg Lys Tyr Phe Gin 125 Arg Ile Thr
Leu Tyr 130 Leu Thr GlU Lys Lys 135 Tyr Ser Pro Cys Ala 140 Trp Glu Val Val
Arg 145 Ala Glu Ile Met Arg 150 Ser Leu Ser Phe Ser 155 Thr Asn Leu Gin Lys 160
Arg Leu Arg Arg Lys Asp
165 <210> 11 <211> 166 <212> PRT <213> Horao sapiens
<220>
< 2 2 3 > Lidský IFN-a 5 protein
<400> 11
Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Ile Met Ala Gin Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn. Gin Phe
35 40 45
Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gin Gin Thr
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Met Met Gin Glu Val Gly Val Glu Asp Thr Pro Leu Msti
100 105 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Thr Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ala Asn Leu Gin Glu
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu
c210> 12 <211> 166 <212> PRT
165 • · « • 9 * · <213> Homo sapiens <220>
<223> HUman IFN alpha-6 protein
<400> 12 Cys Asp 1 Leu Pro Gin 5 Thr His Ser Leu Gly 10 His Arg Arg Thr Met 15 Met
Leu Leu Ala Gin 20 Met Arg Arg Ile Ser 25 Leu Phe Ser Cys Leu 30 Lys Asp
Arg His Asp 35 Phe Arg Phe Pro Gin 40 Glu Glu Phe Asp Gly 45 Asn Gin Phe
Gin Lys 50 Ala Glu Ala Ile Ser 55 Val Leu His. Glu Val 60 Ile Gin Gin Thr
Phe 65 Asn Leu Phe Ser Thr 70 Lys Asp Ser Ser Val 75 Ala Trp Asp Glu Arg 80
Leu Leu Asp Lys Leu 85 Tyr Thr Glu Leu Tyr 90 Gin Gin Leu Asn Asp 95 Leu
Glu Ala Cys Val 100 Met Gin Glu Val Trp 105 Val Gly Gly Thr Pro 110 Leu Met
Asn Glu Asp 115 Ser Ile Leu Ala Val 120 Arg Lys Tyr Phe Gin 125 Arg Ile Thr
Leu Tyr 130 Leu Thr Glu Lys Lys 135 Tyr Ser Pro Cys Ala 140 Trp Glu Val Val
Arg 145 Ala Glu Ile Met Arg 150 Ser Phe Ser Ser Ser 155 Arg Asn Leu Gin Glu 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 13 <211> 166 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> I Lidský IFN-oc 7 protein
<400> 13
Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Glu Phe Arg Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gin Phe
35 40 45
Gin Lys Thr Gin Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gin Gin Thr
50 55 60
*» ·· • « · » • »» · • · ··· » * · »> <<
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gin Ser
70 75 80
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu
90 95
Glu Ala Cys Val Ile Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110
Asn Glu Asp Phe Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr 115 120 125
Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Lys Lys 145 150 155 150
Gly Leu Arg Arg Lys Asp 155
<210> 14 <211> 156 <212> PRT <213> Hono sapiens
<220> <223> Lidský IFN-a 8 protein
<400> 14 Cys Asp 1 Leu Pro Gin 5 Thr His Ser Leu Gly 10 Asn Arg Arg Ala Leu 15 Ile
Leu Leu Ala Gin 20 Met Arg Arg Ile Ser 25 Pro Phe Ser Cys Leu 30 Lys Asp
Arg Kis Asp 35 Phe Glu Phe Pro Gin 40 Glu Glu Phe Asp Asp 45 Lys Gin Phe
Gin Lys 50 Ala Gin Ala Ile Ser 55. Val Leu Eis Glu Met 60 Ile Gin Gin Thr
Phe 65 Asn Leu Phe Ser Thr 70 Lys Asp Ser Ser Ala 75 Ala Leu Asp Glu Thr 80
Leu Leu Asp Glu Phe 85 Tyr Ile Glu Leu Asp 90 Gin Gin Leu Asn Asp 95 Leu
Glu Val Leu Cys 100 Asp Gin Glu Val Gly 105 Val Ile Glu Ser Pro 110 Leu Met
Tyr Glu Asp 115 Ser Ile Leu Ala Val 120 Arg Lys Tyr Phe Gin 125 Arg Ile Thr
Leu Tyr 130 Leu Thr Glu Lys Lys 135 Tyr Ser Ser Cys Ala 140 Trp Glu Val Val
Arg 145 Ala Glu Ile- Met ' Arg 150 Ser Phe Ser Leu Ser 155 Ile Asn Leu Gin Lys 160
• · ··»« · · » · ···· ··«· · • · ··»>·_· ·······
Arg Leu Lys Ser Lys Glu 165 <210> 15 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<2 2 3 > Lidský IFN-α 10 protein <400> 15
Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile
1 5 10 15
- Leu Leu Gly Gin Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Arg Ile Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe
35 40 45
Gin Lys Ala Gin Ala íle Ser Val Leu His Glu Met ile Gin Gin Thr
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gin Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu
85 SO 95
Glu Ala Cys Val Ile Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Ile Glu Arg Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gin Lys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Asp
165 <210> 16 <211> 170
- <212> PRT <213> Homo sapiens
1 <220> <223> i Lidský IFN-a 14 protein
<40Q> 16 Cys Ser Leu Gly Cys Asn Leu 1 5· Ser Gin Thr 10 His Ser Leu Asn Asn 15 Arg
Arg Thr Leu Met Leu Met Ala 20 Gin· Met 25 Arg Arg Ile Ser Pro 30 Phe Ser
• · · · ·
Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp
35 40 45
Gly Α,εη Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met
50 55 60
Met Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala
65 70 75 80
Trp Asp Glu Thr Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gin Gin
85 90 95
Met Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gin Glu Val Gly Val Glu Glu
100 105 110
Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe
115 120 125
Gin Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala
130 135 140
Trp Glu Vel Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr
145 150 155 160
Asn Leu Gin Lys Arg Leu Arg Arg Lys Asp
165
170 <210> 17 <211> 166 <212> PHT <213> Homo sapiens <220>
< 2 2 3 > Lidský EFN-a 16 protein c400> 17
Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Leu A.Ia Gin Met Gly Z«Y*cr Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Val Phe Asp Gly Asn. Gin Phe
35 40 45
Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gin Gin Thr
50 55 60
Phe A.sn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65 70 75 80.
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gin Gin Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Thr Gin Glu Val Gly val Glu Glu Ile Ala Leu Met
100 105 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Vaí Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr
115
120
125 ···· ·«· · ···· ···· · • · ···«· '·····«· ♦ ♦ · · · ♦ · • · · · · * · . 52
Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gin Lys
14 5 150 155 160
Gly Leu Arg Arg Lys Asp
165 <210> 18 <211> 166 <212> PRT <213 > Homo sapiens <220>
< 2 2 3 > : Lidský IFN-α 17 protein <400> 18
Cys 1 Asp Leu Pro Gin 5 Thr His Ser Leu Gly 10 Asn Arg Arg Ala Leu 15 Ile
Leu Leu Ala Gin 20 Met Gly Arg Ile Ser 25 Pro Phe Ser Cys Leu 30 Lys Asp
A.rg His Asp 35 Phe Gly Leu Pro Gin 40 Glu Glu Phe Asp Gly 45 Asn Gin Phe
Gin Lys 50 Thr Gin Ala Ile Ser 55 Val Leu His Glu Met 60 Ile Gin Gin Thr
Phe 65 Asn Leu Phe Ser Thr 70 Glu Asp Ser Ser Ala 75 Ala Trp Glu Gin Ser 80
Leu Leu Glu Lys Phe 85 Ser Thr Glu Leu Tyr 90 Gin Gin Leu Asn Asn 95 Leu
Glu Ala cys Val 100 Ile Gin Glu Val Gly 105 Met Glu Glu Thr Pro 110 Leu Met
Asn Glu &gp 115 Ser Ile Leu Ala Val 120 Arg Lys Tyr Phe Gin 125 Arg Ile Thr
Leu Tyr 130 Leu Thr Glu Lys Lys 135 Tyr Ser Pro Cys Ala 140 Trp Glu Val Val
Arg 145 Ala Glu Ile Met A-rg 150 Ser Leu Ser Phe Ser 155 Thr Asn Leu Gin Lys 160
Ile Leu Arg Arg Lys Asp
165 <210> 19 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<223> íLidskýIFN-a 21 protein
WO 00/69913
HCTz'CiSOO/T.3827 <400> 19
Cys Asp Leu 1 Pro Gin 5 Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg 10 Ala Leu 15 Ile
Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe
35 40 45
Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gin Gin Thr
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gin Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gin Gin Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Ile Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Lys Ile Phe Gin Glu
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu
165 <210> 20 <211> 172 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<223> IFN delta-1 protein <400> 20
Cys 1 Asp Leu Ser Gin 5 Asn His Val Leu Val 10 Gly Arg Lys Asn Leu 15 Arg
Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro His Phe Cys Leu Gin Asp
20 25 30
Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gin Glu Met Val Glu Gly Gly Gin Leu
35 40 45
Gin Glu Ala Gin Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gin Gin Ser
50 55 60
Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Pro Cys Arg Thr Gly Leu His Gin Gin Leu Asp Asn Leu
. 54
85 90 95
Asp Ala Cys Leu 100 Gly Gin Val Met Gly 105 Glu Glu Asp Ser Ala 110 Leu Gly
Arg Thr Gly 115 Pro Thr Leu Ala Leu 120 Lys Arg Tyr Phe Gin 125 Gly Ile His
Val Tyr 130 Leu Lys Glu Lys Gly 135 Tyr Ser Asp Cys Ala 140 Trp Glu Thr Val
Arg 145 Leu Glu Ile Met Arg 150 Ser Phe Ser Ser Leu 155 Ile Ser Leu Gin Glu 160
Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro
165 170 <210> 21 <211> 172 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220> <22 3 > : Lidský IFN-ω 1 protein E His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu Val
<400> 21 Gin 5 Asn
Cys 1 Asp Leu Pro
10 15
Leu Leu His Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg Arg A.sp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Met Val Lys Gly Ser Gin Leu
35 40 45
Gin Lys Ala His Val Met Ser Val Leu His Glu Met Leu Gin Gin Ile
50 55 60
Phe Ser Leu Phe Eis Thr Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Gin Leu His Thr Gly Leu His Gin Gin Leu Gin His Leu
85 90 95
Glu Thr Cys Leu Leu Gin Val Val Gly Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala
100 105 110
Ile Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu Arg Arg Tyr Phe Gin Gly Ile Arg
115 120 125
Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Met Glu ile Met Lvs Ser Leu Phe Leu Ser Thr A.sn Met Gin Glu
145 150 155 160
Arg Leu Arg Ser Lys Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser
165 170
• · · · · · * • ·
<210> 22 <211> 166 <212=· PRT <213 > Mus musculus <220>
<223 > l.Myší IFN-al protein .
<400> 22
Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Asn Leu Arg Asn Lys Arg Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Val Gin Met Arg Arg Leu Ser Pro Leu Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg Lys Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Lys Val Asp Ala Gin. Gin Ile
35 40 45
Lys Lys Ala Gin Ala 11 e Pro Val Leu Ser Glu Leu Thr Gin Gin Ile
50 55 60
Leu Asn Ile Fhe Thr Ser Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asn Ala Thr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Ser Phe Cys Asn Asp Leu His Gin Gin Leu. Asn Asp Leu
85 90 95
Gin Gly Cy'S Leu Met Gin C-ln Val Gly Val Gin Glu Phe Pro Leu Thr
100 105 110
C-ln Glu Asp Ala Leu Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Eis Arg Xle Thr
115 120 125
Val Tyr Leu A-rg Glu Lys Lys Eis Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Val Trp A.rg Ala Leu Ser Ser Ser Ala Asn Val Leu Gly
145 150 155 160
Arg Leu Arg Glu Glu Lys
165 <210> 23 <211> 167 <212> PRT <213> Mus musculus <220>
<223> 1 Myší IFN-a2 protein <400> 23
Cys Asp Leu Pro His Thr Tyr Asn Leu Arg Asn Lys Arg Ala Leu’ Lys
* 1 5 10 15
Val Leu Ala Gin Met Arg Arg Leu Pro Phe Leu Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg Gin Asp Phe Gly Phe Pro Leu Glu Lys Val Asp Asn Gin Gin Ile
z 40 45 • · · • · • · · · * « · • · · · · ·· · • · ··>··· ···· • · · · · · • · · · · · « '
Gin Lys Ala 50 Gin Ala Ile Pro 55 Val Leu Arg Asp Leu 60 Thr Gin Gin Thr
Leu Asn Leu Phe Thr Ser Lys Ala Ser Ser Ala Ala Trp Asn Ala Thr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Ser Phe Cys Asn Asp Leu His Gin Gin Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Gin Thr Cys Leu Met Gin Gin Val Gly Vel Gin Glu Pro Pro Leu Thr
100 105 110
Gin Glu A.sp Ala Leu Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Ile Thr
115 120 125
Val Tyr Leu Arg Glu Lys Lys His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Val Trp Arg Ala Leu Ser Ser Ser val Asn Leu Leu Pro
145 150 155 160
Arg Leu Ser Glu Glu Lys Glu
165 <210> 24 <211> 162 <212> PRT <213 > Mus musculus <220>
<223> i Myší IFN-a4 protein <400> 24
Cys 1 Asp Leu Pro Eis 5 Thr Tyr
Val Leu Glu Glu 20 Met Arg Arg
Arg Lys Asp 35 Phe Gly Phe Pro
Gin Lys 50 Ala Gin Ala Ile Leu 55
Leu 65 Asn Leu Phe Thr Ser 70 Lys
Leu Leu Asp Ser Phe 85 Cys Asn
Lys Ala Cys Val 100 Met Gin Glu
Leu Ala Val 115 Arg Thr Tyr Phe
Lys Lys 130 His Ser Leu Cys Ala 135
Asn Leu Gly Asn 10
Leu Pro Pro Leu 25
Leu Glu Lys Val 40
Val Leu Arg Asp
Asp Leu Ser Ala 75
Asp Leu His Gin so
Pro Pro Leu Thr 105
His Arg Ile Thr 120
Trp Glu Val Ile
Lys Arg Ala Leu Thr 15
Ser Cys Leu Lys Asp 30
Asp Asn Gin Gin Ile 45
Leu Thr Gin Gin Ile 60
Thr Trp Asn Ala Thr 80
Gin Leu Asn Asp Leu 95
Gin Glu Asp Ser Leu 110
Val Tyr Leu Arg Lys 125
Arg Ala Glu Val Trp 140 • ·
* · · ·
Arg Ala Leu Ser Ser Ser Thr Asn Leu Leu Ala Arg Leu Ser Glu Glu 145 150 155 160
Lys Glu <210> 25 <211> 166 <212 > PRT <213> Mus rausculus <220>
<223 > ! Myší IFN-a5 protein <400> 25
Cys 1 Asp Leu Leu Gin 5 Thr His Asn Leu Arg 10 Asn Lys Arg Ala Leu 15 Thr
Leu Leu Val Lys 20 Met Arg Arg Leu Ser 25 Pro Leu Ser Cys Leu 30 Lys Asp
Arg Lys Asp 35 Phe Gly Phe Pro Gin 40 Glu Lys Val Gly Ala 45 Gin Gin Ile
Gin Glu 50 Ala Gin Ala Ile Pro 55 Val Leu Ser Glu Leu 60 Thr Gin Gin Val
Leu 65 Asn Xle Phe Thr Ser 70 Lys Asp Ser Ser Ala 75 Ala Trp Asn Ala Thr 80
Leu Leu Asp Ser Phe 85 Cys Asn Glu Val His 50 Gin Gin Leu Asn Asp 95 Leu
Lys Ala Cys Val 100 Met Gin Gin Val Gly 105 Val Gin Glu Ser Pro 110 Leu Thr
Gin Glu Asp 115 Ser Leu Leu Ala Val 120 Arg Lys Tyr Phe His 125 Arg Ile Thr
Val Tyr 130 Leu Arg Glu Lys Lys 135 His Ser Pro Cys Ala 140 Trp Glu Val Val
Arg 145 Ala Glu Val Trp Arg 150 Ala Leu Ser Ser Ser 155 Val Asn Leu Leu Ala 160
Arg Leu Ser Lys Glu Glu 165 <210> 26 <211> 166 <212> PRT <213 > Mus rausculus <220>
<223 > 1 Myší IFN-cc6 protein <400> 26 u Λ
Cys Asp Leu Pro Gin Thr HiS Asn Leu Arg Asn Lys Arg Ala Leu Thr 15 10 15 • · • * • » • · · · • · · • · · • · · · · · · · · · · ·· ·· · ····«·
Leu Leu Val Lys Met Arg Arg Leu Ser Pro Leu Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg Lys Αερ Phe Gly Phe Pro Gin Glu Lys Val Gly Ala Gin Gin Ile
35 40 45
Gin Glu Ala Gin Ala Ile Pro Val Leu Thr Glu Leu Thr Gin Gin Ile
50 55 60
Leu Thr Leu Phe Thr Ser Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asn Ala Thr
65 70 75 80
Leu Leu Αερ Ser Phe Cys Asn Asp Leu His Gin Leu Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Gin Gly Cys Leu Met Gin Gin Val Glu Ile Gin Ala Leu Pro Leu Thr
100 105 110
Gin Glu Asp Ser Leu Leu Ala Val Arg Thr Tyr Phe His Arg Ile Thr
115 120 125
Val Fhe Leu Arg Glu Lys Lys His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Val Trp Arg Ala Leu Ser Ser Ser Ala Lys Leu Leu Ala
145 150 155 160
Arg Leu Asn Glu Asp Glu
165 <210> 27 <211> 167 <212> PRT <213> Mus wusculus <220>
< 2 2 3 > Myší IFN-a7 protein <400> 27
Cys 1 Leu Pro Gin 5 Thr His Asn Leu Arg 10 Asn Lys Arg Ala Leu 15 Thr
Leu Leu Val Lys 20 Met Arg Arg Leu Ser 25 Pro Leu Ser Cys Leu 30 Lys Asp
Arg Lys Asp 35 Phe Gly Phe Pro Gin 40 Ala Lys Val Asp Ala 45 Gin Gin Ile
Gin Glu 50 Ala Gin Ala Ile Pro 55 Val Leu Ser Glu Leu 60 Thr Gin Gin Ile
Leu 65 Asn Ile Phe Thr Ser 70 Lys Asp Ser Ser Ala 75 Ala Trp Asn Ala Thr 80
Leu Leu Asp Ser Val 85 Cys Asn Asp Leu His 90 Gin Gin Leu Asn Asp 95 Leu
Gin Gly Cys Leu Met Gin Glu Val Gly Val Gin Glu Leu Ser Leu Thr
100 105 110
-Od *··· ···,· · • * ···· · · · · * · ·
Gin Glu Asp 115 Ser Leu Leu Ala Val 120 Arg Lys Tj-r Phe EiS 125 Arg Ile Thr
Val Phe 130 Leu Arg Glu Lys Lys 135 Eis Ser Pro Cys Ala 140 Trp Glu Val Val
Arg 145 Ala Glu Ile Trp Arg 150 Ala Leu Ser Ser Ser 155 Ala Asn Leu Leu Ala 160
Arg Leu Ser Glu Lys Lys Glu
165 <210> 28 <211> 166 <212> PRT <213> Mus musculus <220>
< 2 23 > Myší IFN-aS protein <400> 28
Cys 1 Asp Leu Pro Gin 5 Thr His Asn Leu Arg 10 Asn Lys Arg Ala Leu 15 Thr
Leu Leu Val Lys 20 Met Arg Arg Leu Ser 25 Pro Leu Ser Cys Leu 30 Lys Asp
Arg Lys Asp 35 Phe Gly Phe Pro Gin 40 Glu Lys Val Gly Ala 45 Gin Gin Ile
Gin Glu 50 Ala Gin Ala Ile Pro 55 Val Leu Thr Glu Leu 60 Thr Gin Gin Ile
Leu 65 Ala Leu Phe Thr Ser 70 Lys Asp Ser Ser Ala 75 Ala Trp Asn Ala Thr 80
Leu Leu Asp Ser Phe 85 Cys Asn Asp Leu His 90 Gin Leu Leu Asn Asp 95 Leu
Gin Gly Cys Leu 100 Met Gin Gin Val Glu 105 Ile Gin Ala Leu Pro 110 Leu Thr
Gin Glu Asp 115 Ser Leu Leu Ala Val 120 Arg Thr Tyr Phe His 125 Arg Ile Thr
Val Phe 130 Leu Arg Glu Lys Lys 135 His Ser Pro Cys Ala 140 Trp Glu Val Val
Arg 145 Ala Glu Val Trp Arg 150 Ala Leu Ser Ser Ser 155 Ala Lys Leu Leu Ala 16 0
Arg Leu Asn Glu Asp Glu 165 <210> 29 <211> 167 <212> PRT <213 > Mus musculus • · .60 • ·
<220> <223> Myší IFN-«9 protein
<400> 2S Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Asn Leu Arg Asn Lys Lys Ile Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg Leu Ser Pro Leu Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg Lys Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Lys Val Asp Ala Gin Gin Ile
35 40 45
Gin Glu Ala Gin Ala Ile Pro Val Leu Ser Glu Leu Thr Gin Gin Ile
50 55 60
Leu Thr Leu Phe Thr Ser Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asn Ala Thr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Sex Phe Cys Thr Gly Leu His Gin Leu Leu Asn Asp Leu
85 90 S5
Gin Gly Cys Leu Met Gin Leu Val Gly Met Lys Glu Leu Pro Leu Thr
100 105 110
Gin Glu Asp Ser Gin Leu Ala Met Lys Lys Tyr Phe His Arg Ile Thr
115 120 125
Val Tyr Leu Arg Glu Lys Lys His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Val Trp Arg Ala Leu Ser Ser Ser Val Asn Leu Leu Ala
145 ISO 155 160
Arg Leu Ser Glu Glu Lys Glu

Claims (29)

  1. Patentové nároky
    1. Molekula nukleové kyseliny kódující fúzní protein obsahující:
    (a) signální sekvenci;
    (b) Fc region imunoglobulinu; a (c) sekvenci cílového proteinu zahrnující interferon-a; kde signální sekvence, Fc region imunoglobulinu a sekvence cílového proteinu jsou kódované postupně ve směsu 5'->3'.
  2. 2. Nukleová kyselina podle nároku 1, kde Fc region imunoglobulinu obsahuje pantový region imunoglobulinu.
  3. 3. Nukleová kyselina podle nároku 1, kde Fc region imunoglobulinu obsahuje pantový region imunoglobulinu a doménu konstantního regionu těžkého řetězce imunoglobulinu.
  4. 4. Nukleová kyselina podle nároku 1, kde Fc region imunoglobulinu obsahuje pantový region imunoglobulinu a CH3 doménu imunoglobulinu.
  5. 5. Nukleová kyselina podle nároku 1, kde Fc region imunoglobulinu obsahuje pantový region imunoglobulinu, CH2 doménu a CH3 doménu.
  6. 6. Nukleová kyselina podle nároku 1, kde Fc region imunoglobulinu obsahuje sekvence imunoglobulinu gamma.
  7. 7. Nukleová kyselina podle nároku 1, kde imunoglobulin gamma je lidský imunoglobulin gamma 1.
    ··
  8. 8. Replikovatelný expresní vektor pro transfekci savčích buněk vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 1.
  9. 9. Replikovatelný expresní vektor podle nároku 8 vyznačující se tím, že se jedná o virový vektor.
  10. 10. Savčí buňka vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 1.
  11. 11. Fúzní protein vyznačující se tím, že obsahuje ve směru od amino- konce ke karboxy-konci Fc region imunoglobulinu a cílový protein obsahující interferon-a.
  12. 12. Fúzní protein podle nároku 11 vyznačující se tím, že interferon-α obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2, 7 nebo 8-21 nebo její druhovou nebo alelickou variantu.
  13. 13. Fúzní protein podle nároku 11 vyznačující se tím, že cílový protein obsahuje alespoň dvě molekuly interferonu-α vázané spojovacím polypeptidem.
  14. 14. Fúzní protein podle nároku 13 vyznačující se tím, že dále obsahuje spojovací polypeptid navazující Fc region imunoglobulinu na cílový protein.
  15. 15. Fúzní protein podle nároku 11 vyznačující se tím, že Fc region imunoglobulinu obsahuje pantový region imunoglobulinu a doménu konstantního regionu těžkého řetězce imunoglobulinu.
    • · • ·
    63 , • · ·· ·· · · · · ·»
  16. 16. Fúzní protein podle nároku 11 vyznačující se tím, že doména konstantního regionu těžkého řetězce obsahuje CH3 doménu.
  17. 17. Fúzní protein podle nároku 11 vyznačuj ící se tím, že Fc region imunoglobulinu obsahuje pantový region imunoglobulinu, CH2 doménu a CH3 doménu.
  18. 18. Multimerní protein vyznačující se tím, že obsahuje alespoň dva fúzní proteiny podle nároku 6 spojené kovalentní vazbou.
  19. 19. Protein podle nároku 18 vyznačující se tím, že kovalentní vazba je disulfidová vazba.
  20. 20. Způsob produkce fúzního proteinu vyznačuj ící se t i m, že zahrnuje kroky:
    (a) poskytnutí savčích buněk podle nároku 10; a (b) kultivaci savčích buněk za produkce fúzního proteinu.
  21. 21. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že obsahuje další krok odběru fúzního proteinu.
  22. 22. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že obsahuje další krok přečištění fúzního proteinu.
  23. 23. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že obsahuje další krok odštěpení Fc region imunoglobulinu proteolytickým enzymem od cílového proteinu v proteolytickém štěpícím místě umístěném mezi Fc regionem imunoglobulinu a cílovým proteinem.
  24. 24. Způsob léčby onemocnění zmírněných podáváním interferonu-a • · vyznačující se tím, že zahrnuje krok podání nukleové kyseliny podle nároku 1 savci s uvedeným onemocnění.
  25. 25. Způsob léčby onemocnění zmírněných podáváním interferonu-a vyznačující se tím, že zahrnuje krok podání vektoru podle nároku 8 savci s uvedeným onemocnění.
  26. 26. Způsob léčby onemocnění zmírněných podáváním interferonu-a vyznačující se tím, že zahrnuje krok podání fúzního proteinu podle nároku 11 savci s uvedeným onemocnění.
  27. 27. Způsob léčby onemocnění zmírněných podáváním interferonu-a vyznačující se tím, že zahrnuje krok podání proteinu podle nároku 18 savci s uvedeným onemocnění.
  28. 28. Způsob podle nároku 26 vyznačující se tím, že onemocněním je jaterní onemocnění.
  29. 29. Způsob podle nároku 28 vyznačující se tím, že jaterním onemocněním je hepatitida.
    • »
CZ20014123A 1999-05-19 2000-05-19 Exprese a export interferonů-alfa jako Fc fúzních proteinů CZ20014123A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13489599P 1999-05-19 1999-05-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20014123A3 true CZ20014123A3 (cs) 2002-06-12

Family

ID=22465500

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20014123A CZ20014123A3 (cs) 1999-05-19 2000-05-19 Exprese a export interferonů-alfa jako Fc fúzních proteinů

Country Status (22)

Country Link
US (2) US20020081664A1 (cs)
EP (1) EP1187852B1 (cs)
JP (1) JP2003530070A (cs)
KR (1) KR20020018197A (cs)
CN (1) CN1361793A (cs)
AT (1) ATE369384T1 (cs)
AU (1) AU777963B2 (cs)
BR (1) BR0010725A (cs)
CA (1) CA2372400C (cs)
CZ (1) CZ20014123A3 (cs)
DE (1) DE60035871T2 (cs)
DK (1) DK1187852T3 (cs)
ES (1) ES2291205T3 (cs)
HK (1) HK1046694A1 (cs)
HU (1) HUP0201474A3 (cs)
MX (1) MXPA01011845A (cs)
NO (1) NO20015587L (cs)
PL (1) PL352332A1 (cs)
PT (1) PT1187852E (cs)
RU (1) RU2262510C9 (cs)
WO (1) WO2000069913A1 (cs)
ZA (1) ZA200109227B (cs)

Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1037927T3 (da) 1997-12-08 2004-09-06 Emd Lexigen Res Ct Corp Heterodimere fusionsproteiner, der er nyttige til målrettet immunterapi og generel immunstimulering
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
CA2328076C (en) * 1998-04-15 2009-10-06 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with angiogenesis inhibitor
BR0010725A (pt) * 1999-05-19 2002-02-19 Lexigen Pharm Corp Expressão e exportação de proteìnas de interferon-alfa como proteìnas de fusão de fc
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
RU2263118C2 (ru) * 1999-08-09 2005-10-27 Лексиген Фармасьютикэлс Корп. Комплексы антител с несколькими цитокинами
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
AU4314801A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Lexigen Pharm Corp Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
EP2213743A1 (en) 2000-04-12 2010-08-04 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1294401B1 (en) * 2000-06-29 2007-08-01 EMD Lexigen Research Center Corp. Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
WO2002072605A2 (en) * 2001-03-07 2002-09-19 Merck Patent Gmbh Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
WO2002088161A1 (en) * 2001-05-02 2002-11-07 Pepgen Corporation Method for expression of human interferon alpha 1 in pichia pa storis
WO2002090566A2 (en) * 2001-05-03 2002-11-14 Merck Patent Gmbh Recombinant tumor specific antibody and use thereof
BR0214650A (pt) * 2001-12-04 2005-05-03 Merck Patent Gmbh Imunocitoquinas com seletividade modulada
EP2261250B1 (en) 2001-12-21 2015-07-01 Human Genome Sciences, Inc. GCSF-Albumin fusion proteins
US7314613B2 (en) 2002-11-18 2008-01-01 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
WO2004046365A2 (en) * 2002-11-18 2004-06-03 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
CA2510180C (en) * 2002-12-17 2012-09-11 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2
PL376673A1 (pl) * 2003-02-18 2006-01-09 Merck Patent Gmbh Białka fuzyjne mutein interferonu alfa o ulepszonych właściwościach
US20050176108A1 (en) * 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US20040180054A1 (en) * 2003-03-13 2004-09-16 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
PL1624891T5 (pl) * 2003-05-06 2014-02-28 Bioverativ Therapeutics Inc Białka chimeryczne o strukturze czynnik krzepliwości krwi-fc do leczenia hemofilii
AU2004238263A1 (en) * 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
TWI353991B (en) * 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
US8383132B2 (en) * 2003-10-16 2013-02-26 The Regents Of The University Of California Immunostimulatory recombinant intracellular pathogen immunogenic compositions and methods of use
CA2545603A1 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto
EP1682582B1 (en) * 2003-11-13 2011-08-31 Hanmi Holdings Co., Ltd Method for the mass production of immunoglobulin constant region
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
JP2008502317A (ja) * 2003-12-30 2008-01-31 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング Ｉｌ−７融合タンパク質
CA2551916C (en) * 2003-12-31 2014-04-29 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
CA2552590A1 (en) 2004-01-05 2005-07-21 Emd Lexigen Research Center Corp. Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
CA2553883C (en) 2004-01-22 2013-04-02 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
AU2008201682B2 (en) * 2004-02-02 2011-02-24 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
BRPI0507159A (pt) 2004-02-02 2007-06-26 Ambrx Inc polipeptìdeos em feixe de quatro hélices humanos modificados e seus usos
AU2005245918A1 (en) 2004-05-19 2005-12-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Interferon-alpha polypeptides and conjugates
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
CA2575607C (en) 2004-08-03 2017-07-11 Innate Pharma Therapeutic and diagnostic methods and compositions targeting 4ig-b7-h3 and its counterpart nk cell receptor
CA2591297C (en) * 2004-12-09 2015-01-13 Stephen D. Gillies Il-7 variants with reduced immunogenicity
KR20070100346A (ko) 2005-01-05 2007-10-10 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 크립토 결합 분자
US8158129B2 (en) * 2005-04-06 2012-04-17 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dimeric alpha interferon PEGylated site-specifically shows enhanced and prolonged efficacy in vivo
US20170121692A1 (en) * 2005-04-06 2017-05-04 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for Generating Stably Linked Complexes Composed of Homodimers, Homotetramers or Dimers of Dimers and Uses
CN101501068A (zh) 2005-05-18 2009-08-05 马克西根公司 改进的α-干扰素多肽
US7566456B2 (en) * 2005-06-23 2009-07-28 Haiming Chen Allergen vaccine proteins for the treatment and prevention of allergic diseases
ES2539250T3 (es) 2005-07-25 2015-06-29 Emergent Product Development Seattle, Llc Reducción de células B mediante el uso de moléculas de unión específica a CD37 y de unión específica a CD20
US7968316B2 (en) 2005-08-16 2011-06-28 Hanmi Holdings Co., Ltd. Method for the mass production of immunoglobulin Fc region deleted initial methionine residues
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
EA015338B1 (ru) * 2005-12-30 2011-06-30 Мерк Патент Гмбх ВАРИАНТЫ ИЛ-12p40 С УЛУЧШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ
DK2270050T3 (da) 2005-12-30 2013-08-12 Merck Patent Gmbh Anti-CD19-antistoffer med nedsat immunogenicitet
CA3149553C (en) 2006-06-12 2023-11-21 Aptevo Research And Development Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
US8454948B2 (en) 2006-09-14 2013-06-04 Medgenics Medical Israel Ltd. Long lasting drug formulations
EP2061515A4 (en) 2006-09-14 2013-01-30 Medgenics Medical Israel Ltd LONG-TERM MEDICINAL FORMULATIONS
CN1944463B (zh) * 2006-10-30 2010-05-12 中国科学技术大学 具有α干扰素活性的融合蛋白及其编码基因与应用
SI2132228T1 (sl) 2008-04-11 2011-10-28 Emergent Product Dev Seatle CD37 imunoterapevtik in kombinacija z njegovim bifunkcionalnim kemoterapevtikom
SG175233A1 (en) 2009-04-22 2011-11-28 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites
WO2011064758A2 (en) * 2009-11-30 2011-06-03 Pfizer Limited Fusion protein
ME03091B (me) 2009-12-01 2019-01-20 Translate Bio Inc Isporuka irnk za povećanje ekspresije proteina i enzima u humanim genetskim oboljenjima
EP2582396A4 (en) 2010-06-15 2014-01-01 Medgenics Medical Israel Ltd REMEDY FORMULATIONS WITH LONG-TERM EFFECT
CN102585013B (zh) * 2011-01-07 2014-04-23 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种含有ω干扰素的融合蛋白及制备方法
US9534056B2 (en) 2011-06-06 2017-01-03 Immungene Inc Engineered TAA antibody-TNFSF member ligand fusion molecules
BR112013031553A2 (pt) 2011-06-08 2020-11-10 Shire Human Genetic Therapies, Inc. composições, mrna que codifica para uma hgla e seu uso, uso de pelo menos uma molécula de mrna e um veículo de transferência e uso de um mrna que codifica para proteína exógena
EP2859102A4 (en) 2012-06-08 2016-05-11 Shire Human Genetic Therapies NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF
US8956623B2 (en) 2012-07-24 2015-02-17 Sbc Virbac Limited Recombinant fusion interferon for animals
US8784834B2 (en) 2012-07-24 2014-07-22 Sbc Virbac Biotech Co., Ltd. Recombinant fusion interferon for animals
CN105142676B (zh) 2013-03-14 2022-06-28 夏尔人类遗传性治疗公司 Cftr mrna组合物以及相关方法和用途
EP2970940B1 (en) * 2013-03-14 2018-07-25 Translate Bio, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
EP3467108B1 (en) 2013-03-14 2024-05-22 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
LT6164B (lt) 2013-10-15 2015-06-25 Uab Biotechnologinės Farmacijos Centras "Biotechpharma" Sulieti interferono-alfa 5 baltymai su kitu citokinu ir jų gamybos būdas
WO2015061491A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for phenylketonuria
EP3060303B1 (en) 2013-10-22 2018-11-14 Translate Bio, Inc. Mrna therapy for argininosuccinate synthetase deficiency
CN106164248B (zh) 2014-04-25 2019-10-15 川斯勒佰尔公司 信使rna的纯化方法
EA201890613A1 (ru) 2015-09-21 2018-10-31 Аптево Рисёрч Энд Девелопмент Ллс Полипептиды, связывающие cd3
US11661455B2 (en) * 2016-02-05 2023-05-30 Orionis Biosciences BV Chimeric protein comprising an interferon alpha 2mutant and a PD-L1 binding moiety
MX2019010155A (es) 2017-02-27 2020-12-10 Translate Bio Inc Arnm de cftr optimizado por codón novedoso.
CN110636854A (zh) 2017-03-31 2019-12-31 阿卡尼斯生物技术F&E有限责任两合公司 非黑素瘤皮肤癌(nmsc)的预防和治疗
US11173190B2 (en) 2017-05-16 2021-11-16 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mRNA encoding CFTR
RU2650755C1 (ru) * 2017-05-24 2018-04-17 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) Способ очистки лекарственного средства пролонгированного действия на основе рекомбинантного аналога интерферона альфа-17 для лечения вирусного гепатита С
CN107254482A (zh) * 2017-07-18 2017-10-17 哈尔滨紫霞生物科技有限公司 一种提高重组猪干扰素‑α融合蛋白抗病毒活性的方法
CN108727504B (zh) * 2018-04-16 2021-08-27 泉州向日葵生物科技有限公司 一种ifn与抗pd-l1抗体的融合蛋白及其应用
CU24554B1 (es) 2018-05-07 2021-11-04 Ct Inmunologia Molecular Proteínas de fusión compuestas por una muteína de interleucina 2 e interferón tipo 1
US11174500B2 (en) 2018-08-24 2021-11-16 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
WO2020214690A1 (en) 2019-04-15 2020-10-22 Qwixel Therapeutics Fusion protein composition(s) comprising targeted masked type i interferons (ifna and ifnb) and an antibody against tumor antigen, for use in the treatment of cancer
RU2764787C1 (ru) * 2020-12-08 2022-01-21 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины" (ФИЦ ФТМ) Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая химерный интерферон alpha2b, рекомбинантный штамм дрожжей P. pastoris X33 - продуцент химерного интерферона alpha2b и способ получения указанного белка

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4196265A (en) * 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4469797A (en) * 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4966843A (en) * 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
US5082658A (en) * 1984-01-16 1992-01-21 Genentech, Inc. Gamma interferon-interleukin-2 synergism
US5679543A (en) * 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
US4676980A (en) * 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5359035A (en) * 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
EP0307434B2 (en) * 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US4732462A (en) * 1987-04-27 1988-03-22 Ronald Bel Safety viewing apparatus for crane car
US5258498A (en) * 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) * 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
JP3040121B2 (ja) * 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
US5120525A (en) * 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
US5601819A (en) * 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US6750329B1 (en) * 1989-05-05 2004-06-15 Research Development Foundation Antibody delivery system for biological response modifiers
US5399346A (en) * 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
EP0406857B1 (en) * 1989-07-07 1995-05-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Proteins and production thereof
US5314995A (en) * 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5349053A (en) * 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US7253264B1 (en) * 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
US5650150A (en) * 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
US5709859A (en) * 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
US20020037558A1 (en) * 1991-10-23 2002-03-28 Kin-Ming Lo E.coli produced immunoglobulin constructs
US6627615B1 (en) * 1991-12-17 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
DK0615451T3 (da) * 1992-05-26 2006-04-24 Immunex Corp Hidtil ukendt cytokin der binder til CD30
WO1993025673A1 (en) * 1992-06-04 1993-12-23 The Regents Of The University Of California In vivo gene therapy with intron-free sequence of interest
US5614184A (en) * 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
DE69332485T2 (de) * 1992-08-11 2003-11-13 The President And Fellows Of Harvard College, Cambridge Immunmodulierende peptide
DE4228839A1 (de) * 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
US5554512A (en) * 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
US5541087A (en) * 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US6485726B1 (en) * 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) * 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
JP3342873B2 (ja) * 1995-03-10 2002-11-11 ジェネンテク・インコーポレイテッド ｇａｓ６による受容体活性化
US6281010B1 (en) * 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
US6620413B1 (en) * 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
ATE218143T1 (de) * 1996-09-03 2002-06-15 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verwendung bi-und trispezifischer antikörper zur induktion einer tumorimmunität
US6100387A (en) * 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
DK1037927T3 (da) * 1997-12-08 2004-09-06 Emd Lexigen Res Ct Corp Heterodimere fusionsproteiner, der er nyttige til målrettet immunterapi og generel immunstimulering
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
AU3655899A (en) * 1998-04-20 1999-11-08 Regents Of The University Of California, The Modified immunoglobulin molecules and methods for use thereof
WO2000009560A2 (en) * 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6646113B1 (en) * 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6335176B1 (en) * 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
SG143935A1 (en) * 1999-05-06 2008-07-29 Univ Wake Forest Compositions and methods for identifying antigens which elicit an immune response
BR0010725A (pt) * 1999-05-19 2002-02-19 Lexigen Pharm Corp Expressão e exportação de proteìnas de interferon-alfa como proteìnas de fusão de fc
RU2263118C2 (ru) * 1999-08-09 2005-10-27 Лексиген Фармасьютикэлс Корп. Комплексы антител с несколькими цитокинами
AU4314801A (en) * 2000-02-11 2001-08-20 Lexigen Pharm Corp Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
MXPA02011016A (es) * 2000-05-12 2004-03-16 Neose Technologies Inc Glicopeptidos recombinantes de glucolisacion in vitro.
EP1294401B1 (en) * 2000-06-29 2007-08-01 EMD Lexigen Research Center Corp. Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
WO2002072605A2 (en) * 2001-03-07 2002-09-19 Merck Patent Gmbh Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
WO2002090566A2 (en) * 2001-05-03 2002-11-14 Merck Patent Gmbh Recombinant tumor specific antibody and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CN1361793A (zh) 2002-07-31
RU2262510C9 (ru) 2006-04-20
PT1187852E (pt) 2007-11-14
BR0010725A (pt) 2002-02-19
CA2372400C (en) 2010-04-27
US20050042729A1 (en) 2005-02-24
CA2372400A1 (en) 2000-11-23
DE60035871T2 (de) 2008-06-05
EP1187852A1 (en) 2002-03-20
AU5031800A (en) 2000-12-05
NO20015587D0 (no) 2001-11-15
ATE369384T1 (de) 2007-08-15
HUP0201474A2 (en) 2002-08-28
EP1187852B1 (en) 2007-08-08
HUP0201474A3 (en) 2002-11-28
ES2291205T3 (es) 2008-03-01
JP2003530070A (ja) 2003-10-14
MXPA01011845A (es) 2002-06-21
AU777963B2 (en) 2004-11-04
DE60035871D1 (de) 2007-09-20
PL352332A1 (en) 2003-08-11
DK1187852T3 (da) 2007-11-26
RU2262510C2 (ru) 2005-10-20
US20020081664A1 (en) 2002-06-27
WO2000069913A1 (en) 2000-11-23
HK1046694A1 (zh) 2003-01-24
KR20020018197A (ko) 2002-03-07
ZA200109227B (en) 2003-02-03
NO20015587L (no) 2002-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20014123A3 (cs) Exprese a export interferonů-alfa jako Fc fúzních proteinů
JP7087047B2 (ja) 改変されたインターロイキン－７タンパク質およびその使用
ES2332924T3 (es) Proteinas de fusion fc-interferon-beta.
KR102609197B1 (ko) 인터류킨 15 단백질 복합체 및 그의 용도
JP3507507B2 (ja) 非免疫原性ペプチドを介して結合されたインターフェロン―αと免疫グロブリンとのハイブリッド
AU778939B2 (en) Expression and export of anti-obesity proteins as Fc fusion proteins
US20060247425A1 (en) Glycosylated immunoglobulin and immunoadhesin comprising the same
JP2008502317A (ja) Ｉｌ−７融合タンパク質