LT6164B - Sulieti interferono-alfa 5 baltymai su kitu citokinu ir jų gamybos būdas - Google Patents

Abstract

Šis išradimas aprašo viso ilgio sulietus interferono-alfa 5 baltymus su kitu citokinu, kurie atitinka formulę X-IFNa5 ar IFNa5-X. Du segmentai yra sujungti be polipeptido linkerio. Taip pat aprašytos yra nukleorūgščių sekos, koduojančios tokius intereferono sulietus baltymus, raiškos vektoriai, turintys šias sekas ir interferono sulietų baltymų terapinis panaudojimas. Taip pat aprašytos minėtų sulietų baltymų biosintezės ir gryninimo schemos. IFNa5 sulieti baltymai yra skirti įvairių virusinių ir vėžinių ligų gydymui, bei autoimuninių ligų, tokių kaip reumatoidinis artritas, gydymui.

Description

Išradimo sritis

Šis išradimas susijęs su imunomoduliuojančiu chimeriniu baltymu, kuris yra naudingas kaip antivirusinė ir priešnavikinė priemonė. Labiausiai šis išradimas susijęs su genu, koduojančiu žmogaus interferoną alfa, sulietą su tokiu pačiu arba kitokiu interferonu alfa (pageidautina žmogaus interferonu alfa-2b) arba kitokiu citokinu (pageidautina žmogaus natyviu subrendusiu onkostatino M baltymu). Sulieto chimerinio konstrukto N-galo arba C-galo fragmentu gali būti IFNa5. Taip pat šis išradimas susijęs su minėto chimerinio geno įterpimu į tinkamą šeimininką, rekombinantinio kamieno kultūros gavimu ir heterologinio polipeptido raiškos stimuliavimu bei jo kaupimusi netirpiuose intarpiniuose kūneliuose. Išradimas taip pat numato fermentinį anksčiau minėto sulieto baltymo gamybos būdą kartu apimantį ir tinkamą baltymo gryninimo būdą. Šis išradimas ypač susijęs su sulieto baltymo gavimu naudojant atitinkamą geną, įterptą į rekombinantinį Escherichia coli kamieną, taip užtikrinant N-metionilintą subrendusio baltymo formą. Be to, išradimas taip apima minėto baltymo išskyrimo iš netirpios bakterinio kamieno frakcijos ir gryninimo būdu tirpinant (soliubilizuojant), oksiduojant ir atliekant medžiagos chromatografiją.

Suformuluojamas stabilus išskirto baltymo preparatas.

Išradimo technikos lygis

Interferonai yra gerai žinomi farmacijos rinkoje baltymai, kurie yra svarbūs daugumos vėžinių ir hepatito susirgimų gydymo komponentai. Šie citokinai pasižymi antivirusiniu, priešnavikiniu ir imunomoduliuojančiu aktyvumu, ir jų raiška plačiai pasireiškia vykstant įvairiems imunogeniniams procesams. IFNa2b ir IFNa5 yra alfa interferonai, kurie skirtingu giminingumu jungiasi prie to paties IFNAR1/2 receptoriaus komplekso ir kurie gali vienas kitą papildyti, pvz., gydant nuo hepatito C. OSM naudojimas gydant piktybinius navikus paprastai būna susijęs su gydymo periodu pasireiškiančiomis neutropeninėmis infekcijomis, gydant pvz., krūties vėžį, limfomą ar leukemiją.

Interferonai, pasižymėdami antivirusiniu, priešnavikiniu ir imunomoduliuojančiu aktyvumu, kartu veikia ląstelių augimą ir diferenciaciją su kryžminiu aktyvumu hormonų (epinefrino, adrenokortikotropino) funkcijų atžvilgiu (Dummer, R.; Mongana, J. 2009. Long term pegylated inteferon-α and its potential in the treatment of melanoma. Biologics: targets & therapy 3: 169-182). Šiuo metu interferonai sudaro svarbią biofarmacinių preparatų grupę gydant įvairias autoimunines ir vėžines ligas, taip pat laikytini preparatais, stimuliuojančiais imuninį atsaką į virusinius patogenus. Rekombinantiniai interferonų preparatai yra registruoti rinkoje kaip naudotini gydant keletą vėžio rūšių (alfa interferonai ir natūralūs plazmos interferonų mišiniai), hepatitą B ir C (alfa interferonai), išsėtinę sklerozę (beta interferonas), reumatoidinį artritą (gama interferonai) bei kaip profilaktinių vakcinų adjuvantai ar koadjuvantai (Crommelin, D. J. A.; Sindelar, R. D. 1997. Pharmaceutical biotechnology. Harvvood academic publishers. 369 p. ISBN 90-5702-249-4; VVang, H., et ai. 2010. Recombinant human interferon-like proteins. JAV patentas Nr: 20100099612. VVang, W., et ai. 2008. Effects of high-dose IFNa2b on regionai lymph node metastases of human melanoma: modulation of STAT5, FOXP3, and IL-7. Clinical cancer research 14: 8314 - 8320). Interferonas alfa taip pat naudojamas gydant plaukuotųjų ląstelių leukemiją, su AIDS susijusią Kapoši sarkomą, lėtinę mielogeninę leukemiją ir inkstų ląstelių karcinomą.

Dėl jų antivirusinio ir priešnavikinio aktyvumo kartu su įtaka įgimtojo nespecifinio imuniteto reakcijoms, dauguma gydymo metodų medicinoje naudoja alfa interferonus rekombinantinių baltymų arba natūralių mišinių, kuriuos išskiria užkrėstos žmogaus limfocitų ląstelių kultūros, formoje.

Yra žinoma daugybė patentų, kur aprašomi įvairūs rekombinantinio interferono preparatai įvairių šeimininkų organizmuose (VV02004039996, WO 2007022799, WO 2011109556 ir kt.).

Tačiau šie baltymo preparatai paprastai organizme išlieka trumpai, todėl gydant naudojamos didelių koncentracijų dozės, dėl ko toliau pasireiškia stiprūs neigiami šalutiniai poveikiai (Crommelin, D. J. A.; Sindelar, R. D. 1997. Pharmaceutical biotechnology. Harvvood academic publishers. 369 p. ISBN 90-5702-249-4). Siekiant sumažinti šiuos poveikius, konstruojami chimeriniai interferonų analogai, kurių toksiškumas mažesnis, o pusamžis plazmoje ilgesnis, tokiu būdu dozės koncentracija gali būti mažinama (VV02007002233 ir kt.).

Siekiant pagerinti farmakokinetines interferonų savybes ir sumažinti dozių dažnį, buvo sukurta keletas stabilizavimo strategijų, tokių kaip asociacija su cheminėmis liekanomis, pavyzdžiui, 2-sulfo-9-fluorenilmetoksikarbonilu, rekombinantinis ilgo poveikio žmogaus albumino sulietas baltymas, ir kitokie metodai, pvz., baltymo prijungimas prie stambesnių struktūrų, tokių kaip polietileno glikolis.

Interferonas alfa-2b yra vienas labiausiai ištirtų anksčiau minėtos šeimos potipių, skirtas gydyti įvairias vėžio rūšis bei hepatitą B ir C (Crommelin, D. J. A.; Sindelar, R. D. 1997. Pharmaceutical biotechnology. Harvvood academic publishers. 369 p. ISBN 90-5702-249-4). Yra parodyta (VVO9958143), kad interferono alfa 5 baltymas turi didelį hepatito C gydymo potencialą, nes tokios infekcijos metu šio baltymo kiekis sumažėja.

Yra žinomi ir sukonstruoti įvairūs šių baltymų rekombinantiniai analogai sulieti baltymai su žmogaus serumo albuminu, įvairiais alfa interferono fragmentais arba Ig Fc receptoriaus segmentais (VV00069913, kt.), polipeptidų ir polinukleotidų fragmentų deriniai, skirti gydymui ir diagnostikai (VV003000896, kt.). Daug tirta kombinuota terapija derinant IFNa2b su IFNa5, tačiau vis dar lieka neaišku, ar gydant abiem baltymais pasiekiamas didesnis efektyvumas.

Dauguma interferonų, tarp jų ir anksčiau minėti IFNa2b ir IFNa5, ekspresuojami rekombinantinėse bakterinėse sistemose dėl jų aukšto produktyvumo ir baltymų neglikozilinimo (Loignon, M., et ai. 2008. Stable high volumetric production if glycosylated human recombinant IFNalpha2b in HEK293 cells. BMC Biotechnology 8: 65).

Tiek IFNa2b, tiek IFNa5 jungiasi prie to paties IFNAR1/2 receptoriaus komplekso, tačiau sukelia kiek skirtingas reakcijų grandines (Jaks E., Gavutis M., Uzė G., Martai J., Piehler J.: Differential receptor subunit affinities of type I interferons govern differential signal activation. J Mol Biol 2007, 366(2): 525-539). Nors buvo parodyta, kad citokino kovakcinavimas siekiant sukurti efektyvias virusines vakcinas, turi didelį potencialą ir ypač pagerina imunitetą, kurj sukelia virusinės DNR vakcinos nuo ŽIV, visgi transgeninių pelių kombinuotas gydymas derinant IFNa5 ir IFNa6 nedavė pakankamai reikšmingų klinikinių tyrimų rezultatų.

Sulietojo baltymo formos kompleksas, kuriame I tipo IFN yra prijungtas prie žmogaus interferono α/β receptoriaus kovalentine jungtimi arba peptidiniu linkeriu, yra atkleistas patente EP1037658 (1997-12-19 prioritetas).

Toks suliejimas imituoja tam tikrą medžiagų apykaitos būklę, kai I tipo interferonai organizme cirkuliuoja susijungę su savo tirpiais receptoriais. Kai pasiekiama tam tikra IFN ir jo receptoriaus koncentracija, tai gali sumažinti ir sulėtinti imuninį atsaką dėl tirpių receptorių kraujo plazmoje konkurencinio jungimosi. Dėl šios priežasties toks sulietas baltymas gali tiek skatinti, tiek slopinti priešuždegiminį atsaką, priklausomai nuo paciento ir ligos eigos.

Patente EP2412730 (2009-03-27 prioritetas) atskleistas sulietas baltymas, apimantis interferono alfa baltymą, sulietą su citoplazminiu transdukcijos peptidu, ir papildomai prijungtą polietileno glikolį. Tai leidžia kurti vaistus baltymo pagrindu, kurių mažos dozės veiksmingos įvairių kepenų ligų, susijusių su virusinėmis infekcijomis, profilaktikai arba gydymui.

Vaistinių medžiagų gamyboje atsiradus pegilinimo technologijoms, tai tapo viena iš svarbiausių strategijų siekiant prailginti farmakokinetinį aktyvumą. Tačiau pegilinimas stipriai slopina absorbciją ląstelių lygyje ir endosominį išlaisvinimą, kas pasireiškia ženkliu pristatymo sistemos aktyvumo praradimu. Stambios PEG grupės didina hidrodinaminį molekulės tūrį, taip kad tampa mažai tikėtinas išskyrimas per inkstus dėl inkstų pamatinės membranos mažo pralaidumo. Šios dvi pegilinto baltymo savybės gali būti lemtingos ilgiems klinikiniams tyrimams, net jei jie pasižymi prailgintu veikimu ir mažų dozių veiksmingumu.

Sulietas baltymas, pasižymintis inferferono alfa biologiniu aktyvumu ir galintis koncentruoti interferoną alfa kepenyse, yra žinomas iš patento EP1187852 (prioritetas 1999.05.19). Toks sulietas baltymas kryptimi nuo N galo j C galą apima imunoglobulino Fc sritį, gautą iš lgG1 arba lgG3, ir tikslinį baltymą, kurį sudaro interferonas alfa. Fc sritis ir tikslinis baltymas yra sujungti betarpiškai arba polipeptidiniu jungtuku (linkeriu). Šis sulietas baltymas naudojamas gydant kepenų ligas, ypač hepatitą.

Šiame patente minėtas sulietas baltymas turi du pagrindinius trūkumus. Toks sulietas baltymas yra skirtas kepenims ir yra naudotinas tik gydant hepatitą B arba C. Minėtų imunoglobulino Fc sričių prijungimas, gydant ilgesnį laiką, gali sukelti neutralizuojančių antikūnų susidarymą, dėl kurių sumažėja terapinis efektas ir paciento atsparumas ilgalaikiam gydymui.

Sulietas baltymas pagal mūsų siūlomą išradimą yra universalesnis: suliejus IFN alfa 5 su interferonu alfa 2b, jis gali būti aktyvus pasikartojančios melanomos gydyme. Sulieti alfa 2b baltymai (tiek IFNa5-IFNa2b, tiek IFNa2b-IFNa5) gali būti skiriami imunitetui moduliuoti, įvairioms vėžio formoms (melanomoms, limfomoms ir sarkomoms) gydyti, o taip pat prieš virusus, pvz., Artimųjų Rytų respiratorinio sindromo koronavirusą, arba tokių odos sutrikimų atvejais, kaip ŽPV infekcijų sukeliami odos ar gleivinės pažeidimai. Suliejus su citokinų OSM, toks baltymas gali būti skiriamas lėtinio hepatito C gydymui, kai gydymas vien IFNa5 neveiksmingas. Bendrai paėmus, siūlomo išradimo sulieti baltymai nėra skirti vienam konkrečiam žmogaus organui, bet demonstruoja kombinuotos terapijos požymius, ir gali būti skiriami, gydant platų virusinių ir vėžinių ligų spektrą.

Iš to, kas išdėstyta, aišku, kad poreikis sulėtinti pasišalinimo iš plazmos greitį, kas leistų naudoti mažesnes dozes ir susilpnintų šalutinius poveikius, yra reali ir aktuali šios srities problema.

Todėl kuriant sulietą baltymą, pagamintą iš dviejų viso ilgio interferonų, būtų įdomu išbandyti tokio chimerinio baltymo antivirusinį aktyvumą ir pasišalinimo greitį.

Kita rimta techninė problema yra susijusi su sunkumais išskiriant ir ypač gryninant tokius naujus sulietus baltymus. Siekiant įveikti šią problemą, reikia išrasti subalansuotą viso proceso, skirto efektyviai gauti tikslinį produktą, sistemą, kiek įmanoma išsaugant suliejimo partnerių aktyvumo tipą.

Apibrėžimai

Aiškumo dėlei čia pateikiamos kai kurių šio išradimo kontekste naudojamų terminų ir išsireiškimų reikšmės.

Terminu „interferonas alfa 5“ (arba IFNa5) čia ir toliau vadinamas baltymas, gaminamas leukocituose, kuris akivaizdžiai daugiausiai yra susijęs su įgimtuoju imuniniu atsaku į virusines infekcijas ir kuris gali prisijungti prie specifinio ląstelės paviršiaus receptoriaus komplekso, žinomo kaip IFNa receptorius (IFNAR). IFNa5 apima baltymus, kurių (I) aminorūgščių seka yra bent iš esmės identiška natyvaus IFNa5 baltymo aminorūgščių sekai, ir kurie (II) pasižymi natyviam IFNa5 būdingu biologiniu aktyvumu.

Terminu „interferonas alfa 2b“ (IFNa2b) vadinamas normalių žmogaus leukocitų gausiausiai gaminamas interferonas alfa 2b. Leukocitų gaminamas IFNa2b priklauso interferonų šeimai ir yra daugiausiai susijęs su įgimtuoju imuniniu atsaku j plačią virusinių infekcijų grupę, pvz., hepatito B ir C. Rekombinantinį IFNa2b skiria pacientams, sergantiems pasikartojančiomis melanomomis, bei kaip imunomoduliuojančią priemonę, siekiant sustiprinti įgimtos imuninės sistemos atsaką į virusinius patogenus veikiant išorinius ląstelės receptorius ir stimuliuojant šeimininko viduląstelinį ir ekstraląstelinj aktyvumą.

Terminu „onkostatinas M“ (OSM) vadinamas baltymas, kurį gamina aktyvintieji T limfocitai, monocitai, mikroglijos. Pagal savo struktūrą ir funkcijas jis priskiriamas hematopoetinių ir neutrofinių citokinų, žinomų kaip interleukinai 6 (IL6) tipo citokinų šeima, pošeimiui. Žmogaus OSM signalo perdavimas sąlygotas jo prisijungimu prie dviejų receptorių kompleksų: I tipo OSM receptoriaus komplekso (LIF receptoriaus), susidedančio iš interleukino 6 signalo keitiklio (gp130) ir leukemijos slopinimo faktoriaus receptoriaus (LIFR) subvienetų bei II tipo OSM komplekso (OSM receptoriaus), susidedančio iš gp130 ir OSM receptoriaus beta (OSMR) subvienetų.

Toliau vartojamu terminu „chimerinis IFNa5 baltymas“ vadinamas baltymas, kurį produkuoja mikroorganizmai, transformuoti panaudojant sulietą geną, koduojantį baltymą, kur N-galinės arba C-galinės dalies aminorūgščių seka yra bent iš esmės identiška natyvaus žmogaus IFNa5 aminorūgščių sekai.

„Iš esmės identiška aminorūgščių seka“ reiškia, kad sekos yra identiškos arba skiriasi vienos ar daugiau (iki 5 %) konservatyvių aminorūgščių mutacijomis arba pakeitimais (t. y. delecijomis, intarpais ar pakaitais), kurie nesukelia neigiamų funkcinių skirtumų tarp rekombinantinio baltymo ir natyvaus žmogaus IFNa5, IFNa2b arba OSM. Sekos procentinį identiškumą galima nustatyti naudojant programą BLAST („blast2seq“, numatytieji parametrai) [Tatutsova and Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250 (1990)].

Čia vartojamu terminu „mikroorganizmas, produkuojantis IFNa5 sulietą baltymą“ vadinamas mikroorganizmas, kuris buvo genetiškai modifikuotas taip, kad gamintų baltymą, pasižymintį su žmogaus IFNa5 siejamu biologiniu aktyvumu. Atitinkamai, terminu „E. coli ląstelė šeimininkė, produkuojanti IFNa5 sulietą baltymą“ vadinama E. coli ląstelė šeimininkė, kuri buvo genetiškai modifikuota taip, kad gamintų baltymą, pasižymintį su IFNa5 siejamu biologiniu aktyvumu.

Terminai „plazmidė“, „vektoriaus sistema“ arba „raiškos vektorius“ reiškia konstruktą, galintį vykdyti ekspresiją in vivo arba in vitro. Šio išradimo kontekste tokie konstruktai gali būti naudojami, į ląsteles šeimininkes įterpiant genus, koduojančius tikslinius sulietus baltymus.

Optimaliai raiškos vektorius yra įjungiamas į tinkamo šeimininko organizmo genomą. Terminas „įjungtas“ optimaliai apima stabilų jungimąsi į genomą.

Terminas „reguliacinės sekos“ apima promotorius, stipriklius ir kitus raiškos reguliacijos signalus. Reguliacinė seka, „funkciškai susieta“ su koduojančiąja seka, yra prijungta tokiu būdu, kad koduojančios sekos raiška pasiekiama sąlygomis, kurios suderinamos su kontroliuojančiomis sekomis.

Terminas „promotorius“ vartojamas šioje srityje įprasta prasme, pvz., RNR polimerazės jungimosi vieta.

Terminas „ląstelė šeimininkė“ šio išradimo kontekste apima bet kurią ląstelę, turinčią arba nukleotidų seką, arba raiškos vektorių, aprašytus aukščiau, ir kuri yra naudojama rekombinantinių būdu gauti tikslinį sulietą baltymą, pasižymintį specifinėmis savybėmis, kurios nurodytos čia arba šio išradimo būdo aprašyme.

Kaip „išskirtas“ ir/arba „išgrynintas“ suprantamas IFNa5 sulietas baltymas, kai jis yra santykinai grynas, t. y. mažiausiai apie 90 % grynumo, pageidautina bent apie 95 % grynumo, geriausia bent 98 % grynumo.

IŠRADIMO ATSKLEIDIMAS

Išradimo esmė

Pagrindinis šio išradimo tikslas yra sulietas baltymas, apimantis interferoną alfa 5 (IFNa5), kurio bendroji formulė yra (I) arba (II),

IFNa5-X X-IFNa5 (l) (II) kur suliejimo partneris X yra kitas interferonas alfa arba citokinas.

Konkrečiau siūlomas išradimas apima sulietus baltymus, kuriuose IFNa5 yra rekombinantinis žmogaus interferonas alfa 5 ir X yra pasirenkamas iš grupės, susidedančios iš IFNa5, IFNažb ir onkostatino.

Šio išradimo objektai apima tokius baltymus, kaip:

IFNa5-IFNa5 homodimeras, kurio aminorūgščių seka yra SEQ ID No: 1 arba kurio seka yra jai identiška mažiausiai 95 %;

IFNa2b-IFNa5 heterodimeras, kurio aminorūgščių seka yra SEQ ID No: 2 arba kurio seka yra jai identiška mažiausiai 95 %;

IFNa5-IFNa2b heterodimeras, kurio aminorūgščių seka yra SEQ ID No: 3 arba kurio seka yra jai identiška mažiausiai 95 %;

IFNa5-OSM heterodimeras, kurio aminorūgščių seka yra SEQ ID No: 4 arba kurio seka yra jai identiška mažiausiai 95 %;

OSM-IFNa5 heterodimeras, kurio aminorūgščių seka yra SEQ ID No: 5 arba kurio seka yra jai identiška mažiausiai 95 %.

Optimaliame įgyvendinimo variante šio išradimo sulietas baltymas pasižymi IFNa5 būdingu biologiniu aktyvumu ir kartu prailgintu pasišalinimo iš organizmo laiku, bent jau žiurkių serumo mėginiuose.

DNR fragmentas, koduojantis minėtą sulietą baltymą, turi koduojančiąją seką, pasirinktą iš grupės, susidedančios iš SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, arba sekos, koduojančios tą patį baltymą. Tinkamas vektorius, apimantis DNR fragmentą, koduojantį sulietą šio išradimo baltymą, yra pasirinktas iš grupės, susidedančios iš pET21b+, pET28a+, pUC57/T arba pT7, optimaliai yra pET21b+.

Kitas šio išradimo aspektas yra sulieto baltymo pagal siūlomą išradimą gamybos būdas vykdant raišką atitinkamoje ląstelėje šeimininkėje, kur būdas apima stadijas, kuriose:

a) paruošia ląsteles šeimininkes, produkuojančias minėtą IFNa5 sulietą baltymą;

b) kultivuoja ląsteles šeimininkes sąlygomis, efektyviomis ekspresuoti minėtą IFNa5 sulietą baltymą tinkamoje fermentacijos terpėje;

c) išskiria ir grynina ekspresuotą IFNa5 sulietą baltymą.

Šio išradimo būdas skiriasi tuo, kad:

- minėtas išskyrimas yra išskyrimas iš b) stadijoje gauto mišinio, apimančio tikslinį sulietą baltymą intarpinių kūnelių pavidalu, vykdant jų tirpinimą ir po to - oksidacinę renatūraciją; ir

- minėtas gryninimas yra trijų pakopų chromatografinis apdorojimas, kuriame:

minėtą mišinį, apimantį renatūruotą IFNa5 sulietą baltymą, apdoroja hidrofobinės sąveikos chromatografiją;

po to gautą prieš tai einančioje pakopoje mišinį veikia anijonų mainų chromatografija;

ir toliau gautą ankstesnėje pakopoje tirpalą grynina katijonų mainų chromatografija.

Sąlygos, efektyvios ekspresuoti minėtą IFNa5 sulietą baltymą, apima indukciją, optimaliai su izopropil-3-D-tiogalaktopiranozidu (IPTG), optimaliai IPTG esant 0,1 mM - 1 mM koncentracijos, geriausia 0,5 mM koncentracijos, ir indukcija nebūtinai yra perkelta į ankstyvą auginimo stadiją.

Viename iš išradimo įgyvendinimo variantų ląstelė šeimininkė yra pasirenkama iš E. coli, S. cerevisiae, K. lactis, optimaliai E. coli, geriau - proteazių neturinčio E. coli kamieno, tokio kaip E. coli BL21 ir Rosetta gami-2, geriausia - E. coli BL21, ir kur fermentacijai tinkama terpė yra bet kuri sudėtinė terpė, apimanti mielių ekstraktą kaip azoto šaltinį ir gliukozę kaip anglies šaltinį, optimaliai M9m terpė.

Kitame išradimo įgyvendinimo variante tirpinimo stadiją atlieka chaotropiniame ir denatūruojančiame tirpale, kuris apima 6-8 M karbamidą arba 4-6 M guanidino hidrochloridą, optimaliai 6 M guanidino hidrochloridą, nebūtinai turintį 20 mM ditiotreitolio DTT.

Oksidacinę renatūraciją pagal optimalų siūlomo išradimo įgyvendinimo variantą vykdo glicino/NaOH burefyje pH intervale 7,0-9,6 ir esant redukuotojo/oksiduotojo glutationo poros GSH/GSSH santykiui 5-20:1 su buferinę talpą turinčiais priedais, pasirinktais iš grupės, susidedančios iš natrio chlorido, natrio sulfato ir amonio sulfato.

šio išradimo trijų pakopų chromatografiniame gryninime hidrofobinės sąveikos chromatografijos sorbentas yra pasirenkamas iš grupės, susidedančios iš butilSefarozės, oktil-Sefarozės, fenil-Sefarozės, optimaliai yra fenil-Sefarozė, pH esant intervale 8,2-9,2; anijonų mainų chromatografijos sorbentas yra pasirenkamas iš grupės, susidedančios iš ΑΝΧ-Sefarožės, Q-Sefarozės, DEAE-Sefarozės, QAESefarozės, optimaliai Q-Sefarozės arba DEAE-Sefarozės, pH esant intervale 8,6-9,0; ir katijonų mainų chromatografijos sorbentas yra pasirenkamas iš grupės, susidedančios iš S-Sefarozės, SP-Sefarozės ir CM-Sefarozės, optimaliai SPSefarozės arba CM-Sefarozės, pH esant intervale 5,2-5,6.

Kiti šio išradimo aspektai yra išradimo būdu gauti sulietas baltymas ir preparatas, apimantis sulietą baltymą pagal siūlomą išradimą stabilaus tirpalo formoje. Tiek šio išradimo sulietas baltymas, tiek preparatas yra skirti naudoti terapijoje.

Farmacinė kompozicija pagal šį išradimą apima minėto sulieto baltymo arba minėto preparato terapiškai veiksmingą kiekį ir farmaciniu požiūriu priimtiną nešiklį, ekscipientą ir/arba pagalbines medžiagas.

Toliau išradimas aprašomas išsamiau, su nuorodomis į pateiktus brėžinius ir pavyzdžius.

Trumpas brėžiniu aprašymas

Sulietų IFNa5 baltymų pagal siūlomą išradimą paruošimas iliustruojamas 1-8 brėžiniais.

Fig.1 yra IFNa5-IFNa5 homodimero klonavimo schema.

Fig. 2 parodyta IFNa2b-IFNa5 heterodimero klonavimo schema.

Fig. 3 pateiktas IFNa2b-IFNa5/pET21b+ genolapis su restrikcijos endonukleazėmis, kurios naudotos atliekant klonų restrikcijos schemos analizę.

Fig. 4 pateiktos augimo kreivės ir biosintezės parametrų charakteristikos skirtingose augimo terpėse, kaip pavyzdį naudojant IFNa2b-IFNa5/pET21b+/E.co//' BL21 (DE3) kamieno sistemą.

Fig. 5 pateiktas IFNa2b-IFNa5, ekspresuoto E.coli BL21 (DE3) / pET21b+ sistemoje, SDS-PAGE ir VVestern-blot analizės vaizdas. 1 takelis - baltymo molekulinės masės markeris; 2 takelis - bendra baltymų frakcija (prieš indukciją); 3 takelis - bendra baltymų frakcija (2,5 vai. po indukcijos); 4 takelis - tirpių baltymų frakcija (2,5 vai. po indukcijos); 5 takelis - netirpių baltymų frakcija (2,5 vai. po indukcijos); 6 takelis - etaloninis IFNa5 tirpalas.

Fig. 6 pateikiama išgryninto IFNa2b-IFNa5 baltymo SE-HPLC.

Fig. 7 parodo suformuluotos IFNa2b-IFNa5 sulietos substancijos sidabru dažytos 15 % SDS-PAGE vaizdą. 2 takelis - SP-Sefarozė FF kolonėlės mėginys, 10 gg A6 fr.; 3 takelis - SP-Sefarozė FF kolonėlės mėginys, 1 μg A6 fr.; 4 takelis mėginys iš SP-Sefarozė FF kolonėlės, 0,1 μg A6 fr. 1 ir 5 takeliai - baltymo molekulinės masės markeris („Fermentas“, #26616, serija #00079685).

Fig. 8 fig. yra IFNa5-IFNa2b baltymo HPLC vaizdas.

Detalus išradimo aprašymas

Išradimo objektai

Šio išradimo tikslas yra numatyti būdą gauti rekombinantinę DNR, koduojančią IFNa5 sulietą baltymą, kuris pasižymėtų fizikocheminėmis savybėmis, panašiomis j subrendusio natyvaus IFNa5. Kitas šio išradimo tikslas yra pagaminti bet kuriuos iš sulietų IFNa5 baltymų kontroliuojamos fermentacijos būdu. Dar vienas šio išradimo tikslas yra gauti IFNa5 sulietą baltymą grynoje formoje. Papildomas šio išradimo tikslas yra pagaminti farmacinę kompoziciją, apimančią minėtą IFNa5 sulietą baltymą.

Kaip paminėta anksčiau, pagrindiniai šio išradimo objektai yra sulieti IFNa5 baltymai, kurių bendroji formulė yra (I) arba (II), gaunami šio išradimo būdu, kur abu partneriai yra suliejami betarpiškai, be linkerio. Papildomos linkerio aminorūgščių sekos kartais ne visada pageidaujamos dėl jų nenuspėjamo toksiškumo, įtakos susivyniojimo bei proteolizės procesams ir dėl biopanašumo aspektų.

Konkrečiais išradimo jgyvendinimo atvejais tinkami yra 1 lentelėje žemiau išvardyti sulieti IFNa5 baltymai.

lentelė

Sekos ID Nr.	Sulietas baltymas	Molekulinė masė	Aminorūgščių seka
1	IFNa5-IFNa5	39161,7	MCDLPQTHSLSNRRTLMIMAQMGRISPFS CLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISV LHEMIQQTFNLFSTKDSSATWDETLLDKF YTELYQQLNDLEACMMQEVGVEDTPLMN

			VDSILTVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEV VRAEIMRSFSLSANLQERLRRKECDLPQT HSLSNRRTLMIMAOMGRISPFSCLKDRHD FGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQT FNLFSTKDSSATWDETLLDKFYTELYQQL NDLEACMMOEVGVEDTPLMNVDSILTVR KYFQRITLYLTEKKYSPCAWEWRAEIMR SFSLSANLOERLRRKE
2	IFNa2b- IFNa5	38906,5	MCDLPOTHSLGSRRTLMLLAOMRRISLFS CLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTE LYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSIL AVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEWRAEI MRSFSLSTNLOESLRSKECDLPOTHSLSN RRTLMIMAOMGRISPFSCLKDRHDFGFPO EEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFS TKDSSATWDETLLDKFYTELYQQLNDLEA CMMOEVGVEDTPLMNVDSILTVRKYFORI TLYLTEKKYSPCAVVEVVRAEIMRSFSLSA NLOERLRRKE
3	IFNa5- IFNa2b	38906,5	MCDLPOTHSLSNRRTLMIMAOMGRISPFS CLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISV LHEMIQQTFNLFSTKDSSATWDETLLDKF YTELYQQLNDLEACMMQEVGVEDTPLMN VDSILTVRKYFORITLYLTEKKYSPCAVVEV VRAEIMRSFSLSANLOERLRRKECDLPOT HSLGSRRTLMLLAOMRRISLFSCLKDRHD FGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFN LFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLND LEACVIOGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFO RITLYLKEKKYSPCAVVEVVRAEIMRSFSLS TNLOESLRSKE
4	IFNa5-0SM	41788,7	MCDLPOTHSLSNRRTLMIMAOMGRISPFS CLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISV LHEMIOOTFNLFSTKDSSATVVDETLLDKF YTELYQQLNDLEACMMQEVGVEDTPLMN VDSILTVRKYFORITLYLTEKKYSPCAVVEV VRAEIMRSFSLSANLOERLRRKEAAIGSC SKEYRVLLGQLQKQTDLMQDTSRLLDPYI RIOGLDVPKLREHCRERPGAFPSEETLRG LGRRGFLOTLNATLGCVLHRLADLEORLP KAODLERSGLNIEDLEKLOMARPNILGLR NNIYCMAOLLDNSDTAEPTKAGRGASOP PTPTPASDAFORKLEGCRFLHGYHRFMH SVGRVFSKVVGESPNRSRR
5	0SM-IFNa5	41788,7	MAAIGSCSKEYRVLLGQLQKQTDLMQDT SRLLDPYIRIOGLDVPKLREHCRERPGAF PSEETLRGLGRRGFLOTLNATLGCVLHRL ADLEQRLPKAQDLERSGLNIEDLEKLQMA RPNILGLRNNIYCMAOLLDNSDTAEPTKA

GRGASQPPTPTPASDAFQRKLEGCRFLH GYHRFMHSVGRVFSKVVGESPNRSRRCD LPQTHSLSNRRTLMIMAQMGRISPFSCLK DRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHE MIQQTFNLFSTKDSSATWDETLLDKFYTE LYQQLNDLEACMMQEVGVEDTPLMNVDS ILTVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEWRA EIMRSFSLSANLOERLRRKE

Mikroogranizmas, produkuojantis IFNa5 sulietą baltymą, gali būti sukuriamas įterpiant DNR fragmentą/nukleorūgšties molekulę, koduojančią chimerinj baltymą.

Konkretūs išradimo įgyvendinimo variantai apima šio išradimo sulietus IFNa5 baltymus koduojančias sekas, nurodytas žemiau 2 lentelėje lentelė

Sekos ID Nr.	Sulietas baltymas	Koduojanti seka
6	IFNa5-	ATGTGTG ATCTGCCGCA GACCCACTCC	CTGTCTAACC
	IFNa5	GTCGTACTCT	GATGATCATG	GCACAGATGG
		GTCGTATCTC	TCCTTTCTCC	TGCCTGAAGG
		ACAGACATGA	CTTTGGATTT	CCTCAGGAGG
		AGTTTGATGG	CAACCAGTTC	CAGAAGGCTC
		AAGCCATCTC	TGTCCTCCAT	GAGATGATCC
		AGCAGACCTT	CAATCTCTTC	AGCACAAAGG
		ACTCATCTGC TACTTGGGAT GAGACACTTC TAGACAAATT
		CTACACTGAA	CTTTACCAGC	AGCTGAATGA
		CCTGGAAGCC	TGTATGATGC	AGGAGGTTGG
		AGTGGAAGAC	ACTCCTCTGA	TGAATGTGGA
		CTCTATCCTG ACTGTGAGAA AATACTTTCA AAGAATCACT
		CTCTATCTGA	CAGAGAAGAA	ATACAGCCCT
		TGTGCATGGG	AGGTTGTCAG	AGCAGAAATC
		ATGAGATCCT TCTCTTTATC AGCAAACTTG CAAGAACGTT
		TACGTCGTAA GGAATGTG ATCTGCCGCA GACCCACTCC
		CTGTCTAACC	GTCGTACTCT	GATGATCATG
		GCACAGATGG	GTCGTATCTC	TCCTTTCTCC
		TGCCTGAAGG	ACAGACATGA	CTTTGGATTT
		CCTCAGGAGG	AGTTTGATGG	CAACCAGTTC
		CAGAAGGCTC	AAGCCATCTC	TGTCCTCCAT
		GAGATGATCC	AGCAGACCTT	CAATCTCTTC
		AGCACAAAGG	ACTCATCTGC	TACTTGGGAT
		GAGACACTTC TAGACAAATT CTACACTGAA CTTTACCAGC
		AGCTGAATGA	CCTGGAAGCC	TGTATGATGC
		AGGAGGTTGG	AGTGGAAGAC	ACTCCTCTGA
		TGAATGTGGA CTCTATCCTG ACTGTGAGAA AATACTTTCA
		AAGAATCACT	CTCTATCTGA	CAGAGAAGAA
		ATACAGCCCT	TGTGCATGGG	AGGTTGTCAG

		AGCAGAAATC ATGAGATCCT TCTCTTTATC AGCAAACTTG CAAGAACGTT TACGTCGTAA GGAATAA
8	IFNa5-	ATGTGTG ATCTGCCGCA GACCCACTCC	CTGTCTAACC
	IFNa2b	GTCGTACTCT	GATGATCATG	GCACAGATGG
		GTCGTATCTC	TCCTTTCTCC	TGCCTGAAGG
		ACAGACATGA	CTTTGGATTT	CCTCAGGAGG
		AGTTTGATGG	CAACCAGTTC	CAGAAGGCTC
		AAGCCATCTC	TGTCCTCCAT	GAGATGATCC
		AGCAGACCTT	CAATCTCTTC	AGCACAAAGG
		ACTCATCTGC TACTTGGGAT GAGACACTTC TAGACAAATT
		CTACACTGAA	CTTTACCAGC	AGCTGAATGA
		CCTGGAAGCC	TGTATGATGC	AGGAGGTTGG
		AGTGGAAGAC	ACTCCTCTGA	TGAATGTGGA
		CTCTATCCTG ACTGTGAGAA AATACTTTCA AAGAATCACT
		CTCTATCTGA	CAGAGAAGAA	ATACAGCCCT
		TGTGCATGGG	AGGTTGTCAG	AGCAGAAATC
		ATGAGATCCT TCTCTTTATC AGCAAACTTG CAAGAACGTT
		TACGTCGTAA GGAA TGTG ATCTGCCGCA GACTCACTCT
		CTGGGTTCTC	GTCGTACTCT	GATGCTGCTG
		GCTCAGATGC	GTCGTATCTC	TCTTTTCTCT
		TGCCTGAAAG	ACCGTCATGA	CTTCGGTTTC
		CCGCAGGAAG	AGTTCGGTAA	CCAGTTCCAG
		AAAGCTGAAA	CTATCCCTGT	TCTGCATGAA
		ATGATCCAGC AAATCTTCAA CCTGTTCTCT ACTAAAGACT
		CTTCTGCTGC	TTGGGACGAA	ACCCTGCTGG
		ACAAATTCTA	CACTGAACTG	TACCAGCAAC
		TCAACGACCT	CGAGGCTTGT	GTTATTCAGG
		GCGTTGGTGT	TACCGAAACT	CCGCTGATGA
		AAGAGGATAG	CATCCTGGCT	GTTCGCAAGT
		ATTTCCAGCG TATCACTCTT TACCTGAAGG AAAAGAAGTA
		TAGCCCGTGT	GCTTGGGAAG	TTGTTCGTGC
		TGAGATCATG	CGTTCCTTCT	CCCTGTCTAC
		TAACCTGCAG GAATCTCTGC GTTCTAAGGA ATAG
7	IFNa2b-	ATGTGTG ATCTGCCGCA GACTCACTCT	CTGGGTTCTC
	IFNa5	GTCGTACTCT	GATGCTGCTG	GCTCAGATGC
		GTCGTATCTC TCTTTTCTCT TGCCTGAAAG ACCGTCATGA
		CTTCGGTTTC	CCGCAGGAAG	AGTTCGGTAA
		CCAGTTCCAG	AAAGCTGAAA	CTATCCCTGT
		TCTGCATGAA ATGATCCAGC AAATCTTCAA CCTGTTCTCT
		ACTAAAGACT	CTTCTGCTGC	TTGGGACGAA
		ACCCTGCTGG	ACAAATTCTA	CACTGAACTG
		TACCAGCAAC	TCAACGACCT	CGAGGCTTGT
		GTTATTCAGG	GCGTTGGTGT	TACCGAAACT
		CCGCTGATGA	AAGAGGATAG	CATCCTGGCT
		GTTCGCAAGT	ATTTCCAGCG	TATCACTCTT
		TACCTGAAGG	AAAAGAAGTA	TAGCCCGTGT
		GCTTGGGAAG	TTGTTCGTGC	TGAGATCATG
		CGTTCCTTCT	CCCTGTCTAC	TAACCTGCAG
		GAATCTCTGC	GTTCTAAGGAA TGTG	ATCTGCCGCA
I	GACCCACTCC	CTGTCTAACC	GTCGTACTCT

		GATGATCATG	GCACAGATGG	GTCGTATCTC
		TCCTTTCTCC	TGCCTGAAGG	ACAGACATGA
		CTTTGGATTT	CCTCAGGAGG	AGTTTGATGG
		CAACCAGTTC	CAGAAGGCTC	AAGCCATCTC
		TGTCCTCCAT	GAGATGATCC	AGCAGACCTT
		CAATCTCTTC	AGCACAAAGG	ACTCATCTGC
		TACTTGGGAT GAGACACTTC TAGACAAATT CTACACTGAA
		CTTTACCAGC	AGCTGAATGA	CCTGGAAGCC
		TGTATGATGC	AGGAGGTTGG	AGTGGAAGAC
		ACTCCTCTGA	TGAATGTGGA	CTCTATCCTG
		ACTGTGAGAA AATACTTTCA AAGAATCACT CTCTATCTGA
		CAGAGAAGAA	ATACAGCCCT	TGTGCATGGG
		AGGTTGTCAG AGCAGAAATC ATGAGATCCT TCTCTTTATC
		AGCAAACTTG CAAGAACGTT TACGTCGTAA GGAATAA
9	IFNa5-OSM	ATGTGTG ATCTGCCGCA GACCCACTCC	CTGTCTAACC
		GTCGTACTCT	GATGATCATG	GCACAGATGG
		GTCGTATCTC	TCCTTTCTCC	TGCCTGAAGG
		ACAGACATGA	CTTTGGATTT	CCTCAGGAGG
		AGTTTGATGG	CAACCAGTTC	CAGAAGGCTC
		AAGCCATCTC	TGTCCTCCAT	GAGATGATCC
		AGCAGACCTT	CAATCTCTTC	AGCACAAAGG
		ACTCATCTGC TACTTGGGAT GAGACACTTC TAGACAAATT
		CTACACTGAA	CTTTACCAGC	AGCTGAATGA
		CCTGGAAGCC	TGTATGATGC	AGGAGGTTGG
		AGTGGAAGAC	ACTCCTCTGA	TGAATGTGGA
		CTCTATCCTG ACTGTGAGAA AATACTTTCA AAGAATCACT
		CTCTATCTGA	CAGAGAAGAA	ATACAGCCCT
		TGTGCATGGG	AGGTTGTCAG	AGCAGAAATC
		ATGAGATCCT TCTCTTTATC AGCAAACTTG CAAGAACGTT
		TACGTCGTAA	GGAAGCG GCTATAGGCA	GCTGCTCGAA
		AGAGTACCGC	GTGCTCCTTG	GCCAGCTCCA
		GAAGCAGACA	GATCTCATGC	AGGACACCAG
		CAGACTCCTG	GACCCCTATA	TACGTATCCA
		AGGCCTGGAT	GTTCCTAAAC	TGAGAGAGCA
		CTGCAGGGAG	CGCCCCGGGG	CCTTCCCCAG
		TGAGGAGACC	CTGAGGGGGC	TGGGCAGGCG
		GGGCTTCCTG	CAGACCCTCA	ATGCCACACT
		GGGCTGCGTC	CTGCACAGAC	TGGCCGACTT
		AGAGCAGCGC	CTCCCCAAGG	CCCAGGATTT
		GGAGAGGTCT	GGGCTGAACA	TCGAGGACTT
		GGAGAAGCTG	CAGATGGCGA	GGCCGAACAT
		CCTCGGGCTC	AGGAACAACA	TCTACTGCAT
		GGCCCAGCTG	CTGGACAACT	CAGACACGGC
		TGAGCCCACG	AAGGCTGGCC	GGGGGGCCTC
		TCAGCCGCCC	ACCCCCACCC	CTGCCTCGGA
		TGCTTTTCAG	CGCAAGCTGG	AGGGCTGCAG
		GTTCCTGCAT	GGCTACCATC	GCTTCATGCA
		CTCAGTGGGG	CGGGTCTTCA	GCAAGTGGGG
		GGAGAGCCCG AACCGGAGCC GGAGATAA
10	OSM-IFNa5	ATGGCG GCTATAGGCA GCTGCTCGAA	AGAGTACCGC

GTGCTCCTTG

GATCTCATGC

GACCCCTATA

GTTCCTAAAC

CGCCCCGGGG

CTGAGGGGGC

CAGACCCTCA

CTGCACAGAC

CTCCCCAAGG

GGGCTGAACA

CAGATGGCGA

AGGAACAACA

CTGGACAACT

AAGGCTGGCC

ACCCCCACCC

CGCAAGCTGG

GGCTACCATC

CGGGTCTTCA

AACCGGAGCC

GACCCACTCC

GATGATCATG

TCCTTTCTCC

CTTTGGATTT

CAACCAGTTC

TGTCCTCCAT

CAATCTCTTC

GCCAGCTCCA AGGACACCAG TACGTATCCA TGAGAGAGCA CCTTCCCCAG TGGGCAGGCG ATGCCACACT TGGCCGACTT CCCAGGATTT TCGAGGACTT GGCCGAACAT TCTACTGCAT CAGACACGGC GGGGGGCCTC CTGCCTCGGA AGGGCTGCAG GCTTCATGCA GCAAGTGGGG GGAGA TGTG CTGTCTAACC GCACAGATGG TGCCTGAAGG CCTCAGGAGG CAGAAGGCTC GAGATGATCC

GAAGCAGACA

CAGACTCCTG

AGGCCTGGAT

CTGCAGGGAG

TGAGGAGACC

GGGCTTCCTG

GGGCTGCGTC

AGAGCAGCGC

GGAGAGGTCT

GGAGAAGCTG

CCTCGGGCTC

GGCCCAGCTG

TGAGCCCACG

TCAGCCGCCC

TGCTTTTCAG

GTTCCTGCAT

CTCAGTGGGG

GGAGAGCCCG

ATCTGCCGCA

GTCGTACTCT

GTCGTATCTC

ACAGACATGA

AGTTTGATGG

AAGCCATCTC

AGCAGACCTT

ACTCATCTGC

TGTATGATGC

ACTCCTCTGA

AGTGGAAGAC

CTCTATCCTG

AGCACAAAGG TACTTGGGAT GAGACACTTC TAGACAAATT CTACACTGAA CTTTACCAGC AGCTGAATGA CCTGGAAGCC

AGGAGGTTGG

TGAATGTGGA

ACTGTGAGAA AATACTTTCA AAGAATCACT CTCTATCTGA CAGAGAAGAA ATACAGCCCT TGTGCATGGG AGGTTGTCAG AGCAGAAATC ATGAGATCCT TCTCTTTATC AGCAAACTTG CAAGAACGTT TACGTCGTAA GGAATAA

Paprastai koduojanti seka gali būti raiškos vektoriaus dalis. Čia aprašytos nukleotidų sekos, tarp jų ir šio išradimo nukleotidų sekos, gali būti vektoriuje, kuriame nukleotidų seka yra funkciškai susieta su reguliacinėmis sekomis, galinčiomis užtikrinti tinkamo šeimininko organizmo nukleotidų sekos ekspresiją.

Siekiant, kad vyktų šio išradimo sulietų baltymų ekspresija, tinkama ląstelė šeimininkė gali būti transformuota, kaip aprašyta toliau, su vektoriais, skirtais naudoti pagal šį išradimą.

Vektoriaus, pvz., plazmidės, kosmidės arfago vektoriaus pasirinkimas dažnai priklauso nuo ląstelės šeimininkės, į kurią jis yra jterptinas. Tinkami vektoriai yra pET21b+, pET28a+, pUC57/T ir pT7, pirmenybę suteikiant pET21b+ .

Skirti naudoti šiame išradime vektoriai gali turėti vieną ar daugiau atrankos markerio genų, tokių kaip genai, suteikiantys atsparumą antibiotikams, pvz., ampicilinui, kanamicinui, chloramfenikoliui arba tetraciklinui. Alternatyviai, atranka gali būti vykdoma atliekant kotransformaciją.

Vektoriai gali būti naudojami in vitro, pvz., gaminant RNR, arba siekiant transfekuoti, transformuoti, transdukuoti arba infekuoti ląstelę šeimininkę.

Taigi toliau išradimo įgyvendinimas numato nukleotidų sekų gavimo būdą, įterpiant šio išradimo nukleotidų seką (DNR fragmentą) j replikuotis galintį vektorių, jj įterpiant į atitinkamą ląstelę šeimininkę ir auginant šeimininko ląsteles sąlygomis, užtikrinančiomis vektoriaus replikaciją.

Vektorius gali papildomai turėti nukleotidų seką, leidžiančią jam replikuotis konkrečioje ląstelėje šeimininkėje. Tokių sekų pavyzdžiai yra plazmidžių pUC19, pACYC177, pUBHO, pE194, pAMBI, plJ702 ir pBR322 replikacijos pradžios sekos.

Koduojančios IFNa5 sulietą baltymą nukleotidų sekos raiška taip pat gali būti sustiprinta, pasirenkant heterologines reguliacines sritis, pvz., promotoriaus, sekrecijos lyderinę ir terminatoriaus sritis.

Pageidautina, kad šio išradimo nukleotidų seka būtų funkciškai susieta bent su promotoriumi. Tinkamų promotorių, skirtų valdyti nukleotidų sekos transkripciją tinkamose bakterijų ląstelėse šeimininkėse, pavyzdžiai yra gerai žinomi šioje srityje.

Siūlomo išradimo įgyvendinimas numato ląsteles šeimininkes, transformuotas arba transfekuotas naudojant nukleotidų seką, kuri ekspresuoja chimerinį baltymą kaip čia aprašyta. Pasirinktinos suderinamos su minėtu vektoriumi ląstelės, kurios gali būti prokariotinės (pvz., bakterinės), grybų, mielių arba augalų ląstelės. Geriau, kad ląstelės šeimininkės būtų prokariotinės.

Tinkamų bakterinių organizmų šeimininkų pavyzdžiai yra gramteigiamų arba gramneigiamų bakterijų rūšys.

Tinkamas bakterinės ląstelės šeimininkės apima Escherichia coli. Tinkami E. coli kamienai apima BL21, BL21 (DE3), Rosetta gami-2, JMI09, K12 ir K802, optimaliai BL21 (DE3) ir Rosetta gami-2.

Siekiant efektyvesnės raiškos, ląstelės šeimininkės genotipas gali būti modifikuotas. Ląstelės šeimininkės modifikacijų pavyzdžiai apima proteazių delecijas, papildymą retomis tRNR, citoplazmos redukuojančio potencialo modifikaciją, siekiant palengvinti disulfidinių ryšių formavimąsi, pvz., tioredoksino reduktazės (trxB) ir glutationo oksidoreduktazės (gor) mutacijas.

Pvz., E. coli ląstelė šeimininkė gali ekspresuoti retų tRNR perteklių, kad būtų pagerinta heterologinių baltymų raiška, kaip parodė ir aprašė Kane [Curr. Opin. Biotechnol. (1995), 6,494-500 „Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E. coli“]. Ląstelėje šeimininkėje gali trūkti kelių redukuojančių fermentų, dėl ko susidarytų palankesnės sąlygos formuotis stabiliems disulfidiniams ryšiams, kaip nurodė Bessette [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96, 13703-13708 „Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichia coli cytoplasm“].

Konkrečiu išradimo įgyvendinimo atveju E. coli ląstelė šeimininkė gali būti kamienas, pasižymintis proteazių trūkumu, toks kaip E. coli lon/omp kamienas su Tproteazių trūkumu, optimaliai E. coli BL21 kamienas, geriausia E. coli BL21 (DE3) kamienas.

Vienas iš transformuotų šio išradimo E. coli šeimininkų turėjo raiškos vektorių, paruoštą iš pET21b+ (Novagene).

Pagal siūlomą išradimą minėtas sulietas genas buvo klonuotas į pET21b+ vektorių už ankstyvojo bakteriofago T7 promotoriaus. Laikoma, kad genas yra skaitymo rėmelyje nuo promotoriaus, lac operonas turi būti prieš T7 promotorių, ir norimo sulieto konstrukto, kuriame yra atviras skaitymo rėmelis, raiška griežtai kontroliuojama ir nutraukiama T7 terminatoriumi.

Pagrindinis išradimo aspektas yra IFNa5 sulieto baltymo gamybos būdas, taikant ekspresiją IFNa5 produkuojančioje E. coli ląstelėje šeimininkėje, kur būdas apima tokias stadijas:

a) paruošia E. coli. ląsteles šeimininkes, produkuojančias minėtą IFNa5 sulietą baltymą;

b) E. coli ląsteles šeimininkes, produkuojančias IFNa5 sulietą baltymą, kultivuoja sąlygomis, kuriomis efektyviai vyksta minėto IFNa5 sulieto baltymo raiška minėtoje rekombinantinėje E. coli ląstelėje šeimininkėje, esančioje tinkamoje fermentacijos terpėje, kur fermentacijos terpė apima gyvūninės arba mielių kilmės komponentus;

c) išskiria ir grynina gautą IFNa5 sulietą baltymą.

Konkrečiu išradimo įgyvendinimo atveju minėtas rekombinantinis IFNa5 sulietas baltymas, kuris gali būti gaminamas išradimo būdu, yra IFNa5 sulietas baltymas, kurio vienas iš suliejimo partnerių yra iš esmės identiškas natyviam IFNa5, t. y. baltymas, kurį gamina E. coli ląstelė šeimininkė, transformuota genu, koduojančiu chimerinj IFNa5 sulietą baltymą, arba genu, modifikuotu taip, kad koduotų baltymą, kurio (1) aminorūgščių seka yra bent iš esmės identiška natyvaus IFNa5, sulieto su kitu citokinų, aminorūgščių sekai, ir (2) kuris pasižymi biologiniu aktyvumu, būdingu natūraliajam IFNa5. Pirmenybė teikiama išradimo įgyvendinimo variantui, kur minėtas IFNa5 yra hlFNa5.

Konkretesniu atveju rekombinantinis IFNa5 sulietas baltymas, gaminamas pagal šj išradimą, yra chimerinis baltymas, kurio aminorūgščių seka atitinka bet kurią nurodytą SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 arba SEQ ID No. 5.

E. coli ląstelę šeimininkę, gaminančią IFNa5 sulietą baltymą, galima gauti, naudojant įprastas klonavimo ir raiškos metodikas ir protokolus, [pvz., Sambrook et ai. Molecular cloning: A Laboratory Manual. Antras leid., CSH Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, 1-31. (Ausubel F.M. et ai., red.) John VViley & Sons, Ine., Brooklyn, New York, 1994-1998].

Konkrečiu išradimo įgyvendinimo atveju IFNa5 koduojančio geno klonavimas ir raiška ir bakterinio kamieno, produkuojančio rekombinantinį IFNa5 baltymą (t. y. E. coli ląstelės šeimininkės, gaminančios IFNa5), konstravimas gali būti vykdomas klonuojant cDNR geną, koduojantį chimerinj geną, modifikuojant minėto geno DNR seką taip, kad optimizuotų jo raišką E. coli, konstruojant raiškos plazmidę, transformuojant pasirinktą plazmidę j tinkamo kamieno E. coli ir pasirenkant raiškos/indukcijos sąlygas. 1, 2, 3 ir 4 pavyzdžiuose atskleidžiamos E. coli ląstelės šeimininkės, produkuojančios chimerinj hlFNa5 sulietą baltymą, konstravimo detalės.

Tam tikru atveju, kai E. coli ląstelė šeimininkė yra E. coli kamienas, pasižymintis proteazių trūkumu, toks kaip E. coli BL21 (DE3) kamienas, minėta ląstelė šeimininkė yra transformuojama naudojant vektorių, turinčiu seką, koduojančią IFNa5 sulietą baltymą kontrolės indukuojamu promotoriumi sąlygomis. Šiuo atveju baltymo raiškai, kaip minėta anksčiau, reikia įdėti induktoriaus, tokio kaip izopropil-P-Dtiogalaktopiranozidas (IPTG). Taigi konkrečiu atveju, kai E. coli ląstelė šeimininkė yra E. coli BL21 kamienas, pvz., E. coli BL21 (DE3) kamienas,, b) stadijos sąlygos apima indukciją. Rekombinantinio IFNa5 sulieto baltymo raiška indukuojama pasiekus atitinkamą biomasės prieaugį, naudojant tinkamą lac operono induktorių, tokį kaip laktozė ir pan. Optimaliai, naudoja IPTG 0,1-1 mM koncentracijos, geriausia 0,5 mM koncentracijos.

Išradimo būdo b) stadijos kultūrinė terpė pasirenkama iš sudėtinių terpių, tokių kaip LB, YPD, TB, M9 arba M9m, kur minėta kultūrinė terpė apima vieną arba daugiau azoto šaltinių, kurie pasirenkami iš grupės, apimančios amonio druskas, nitratus, triptoną, mielių ekstraktą ir amonio hidrochloridą; bei anglies šaltinį, kuris pasirenkamas iš grupės, susidedančios iš glicerolio, gliukozės, fruktozės ir pan., optimaliai yra gliukozė.

Sudėtinėje terpėje biomasės padidėjimas yra nuo 10 iki 50 g/l, geriau 25-40 g/l, skaičiuojant pagal drėgnų ląstelių masę, kai minėtos terpės parametrai tokie:

- sudėtinės terpės pH yra intervale 3,0-8,0, geriausia 6,0-6,8;

- temperatūra yra 25 - 45 °C intervale, geriausia nuo 37 iki 42 °C; ir

- ištirpęs deguonis yra 20-80 % įsotinimo, geriau 20-40 % įsotinimo; ir minėtą kultivavimą vykdo nuo 4 iki 10 valandų, geriau 6 valandas.

Tikslinio IFNa5 sulieto baltymo išskyrimas iš baltymą produkuojančio mikroorganizmo ir gryninimas, t. y. būdo pagal išradimą c) stadija apima:

- mikroorganizmo ūžavimą ir netirpios medžiagos, kurioje yra sulieto baltymo, atskyrimą nuo tirpios baltymingos ląstelių medžiagos;

- netirpioje medžiagoje esančio sulieto baltymo tirpinimą;

- sulieto baltymo oksidavimą esant oksiduojančio/redukuojančio agento porai;

- tirpalo chromatografiją;

- išgryninto sulieto baltymo gavimą.

Konkrečiau IFNa5 sulieto baltymo išskyrimo ir gryninimo iš produkuojančio mikroorganizmo stadija apima:

- mikroorganizmo ūžavimą ir netirpios medžiagos, kurioje yra rekombinantinio IFNa5 sulieto baltymo, atskyrimą nuo tirpios baltymingos medžiagos;

- netirpioje medžiagoje esančio rekombinantinio baltymo tirpinimą;

- IFNa5 sulieto baltymo oksidavimą naudojant oksiduotąjį glutationą esant redukuotojo glutationo;

- persivyniojusio tikslinio baltymo atskyrimą nuo chaotropinės medžaigos;

- tinkamų chromatografinio gryninimo būdų derinimą.

Optimaliai, įgyvendinant šio išradimo c) stadiją, netirpioje medžiagoje esantį IFNa5 sulietą baltymą tirpina naudojant chaotropinį agentą, geriausia esant vidutinei chaotropinio agento koncentracijai ir pH intervale 8,00-9,00. Tirpinimą galima atlikti naudojant guanidino hidrochloridą, kurio koncentracija 3,0-7,0 M, geriau 6,0-6,2 M.

Taikant šį išradimą, pirmenybė teikiama variantui, kuriame oksiduojančio/redukuojančio agentų pora yra oksiduoto/redukuoto glutationo pora, kur oksiduotos ir redukuotos glutationo formų molinis santykis yra nuo 1:5 iki 1:20, geriausia 1:20.

Be to, išradimas apima persivyniojusio IFNa5 sulieto baltymo atskyrimą nuo chaotropinės medžiagos, kai persivyniojusj IFNa5 sulietą baltymą atskiria nuo chaotropinės medžiagos hidrofobinės sąveikos chromatografija.

Optimaliai c) stadijos chromatografija yra trijų pakopų chromatografinio gryninimo derinys apimantis hidrofobinės sąveikos chromatografiją, katijonų mainų chromatografiją ir anijonų mainų chromatografiją.

Gali būti naudojamos įvairios hidrofobinės sąveikos chromatografijos kolonėlės, pasirinktos iš grupės, susidedančios iš BioBeads SM-2, butil-S-Sefarozės,

Capto Oktil, oktil- Sefarozės, fenil-Sefarozės, Capto Butil ir butil-Sefarozės.

Tinkamos įvairios anijonų mainų chromatografijos kolonėlės, pasirinktos iš grupės, susidedančios iš UnoSphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep DEAE, Macro-Prep 25 Q, DEAE Sefacel, ΑΝΧ Sefarozės 4 ir Q Sefarozės HP.

Gali būti naudojamos įvairios katijonų mainų kolonėlės, pasirinktos iš grupės, susidedančios iš SP Sefarozės FF, SP Sefarozės HP, CM Sefarozės FF, TSK gel SP5PW, TSK gel SP-5PVV-HR, Toyopearl SP-650M, Toyopearl SP-650S, Toyopearl SP650C, Toyopearl CM-650M, Toyopearl CM-650S, Macro-Prep High S support, MacroPrep S support, Macro-Prep CM support ir kt.

Dar vienas išradimo aspektas - suformuluotas tikslinio sulietojo baltymo stabilus tirpalas, skirtas naudoti terapijoje ir stabilumo tyrimams. Išradimo sulietam baltymui farmaciniu požiūriu priimtini nešikliai yra vanduo, fiziologinis tirpalas, fiziologinis tirpalas acetatinio arba fosfatinio buferio pagrindu, dekstrozė, glicerolis ir panašiai, bei šių nešiklių deriniai. Daugeliu atveju į kompoziciją rekomenduotina pridėti izotoninių agentų, pvz., cukrų (manozės arba ramnozės), polialkoholių (manitolio, sorbitolio) arba mažos molekulinės masės junginius, kaip natrio chloridas arba glicinas. Visais atvejais laikoma, kad paruošiami tirpalai yra sterilūs: išgryninus, sulietoji molekulė integruojama į atitinkamą tirpiklį ir steriliai nufiltruojama.

Potencialios indikacijos yra susijusios su suliejimo partnerių indikacijomis, tai ūminis ir lėtinis hepatitas B ir C; vėžinės ligos, tokios kaip melanomos, limfomos ir sarkomos; platus virusinių infekcijų spektras (Artimųjų Rytų respiratorinio sindromo koronavirusas arba odos sutrikimai, pvz., odos ar gleivinės pakitimai, sukeliami ŽPV infekcijų) bei reumatoidinio artrito priešuždegiminis gydymas.

Išradimo įgyvendinimas

Kaip minėta, pagrindinė šio išradimo strategija suliejant genus, yra išlaikyti tokią pačią aminorūgščių seką nenaudojant jokių linkerių (jungtukų) tarp genų. Tai svarbu, siekiant išvengti tam tikro linkerinių sekų imunogeniškumo. Eksperimentų eiga bendru atveju buvo įprasta: genų suliejimas genų inžinerijos būdais, DNR transformacija į rekombinantines E coli ir klonų atranka, biosintezės optimizacija sudėtinėje terpėje ir galiausiai rekombinantinio baltymo gryninimo tinkamos schemos sukūrimas.

Visi genetiniai pakeitimai buvo atlikti įterpiant mutacijas, bet nekeičiant pagrindinės aminorūgščių sekos. Pagrindinė suliejimo klonavimo procedūrų strategija buvo PGR optimizacija, genų suliejimas lipniais galais ir tinkamo dydžio bei orientacijos geno produkto ekstrakcija, šio produkto įjungimas į laikiną arba raiškos plazmidę ir jos naudojimas įvairiems E. coli kamienams transformuoti. Buvo patikrinti visų gautų klonų intarpo dydis, orientacija, raiškos lygiai; atliktos atrinktų klonų restrikcinė analizė bei sekoskaita. Interferono alfa 5 dimerui sulieti buvo vykdyta speciali ir unikali klonavimo eiga (išsamus aprašymas pateikiamas 1 pavyzdyje ir Fig.1).

Sulietas baltymas buvo įterptas j kelias skirtingas plazmides, ieškant geriausiomis savybėmis pasižyminčio producento. Išbandytos pET21b+ ir pET28+ plazmidės, kurios abi yra skirtos griežtai kontroliuojamai ir efektyviai rekombinantinių baltymų ekspresijai. Tinkamo restrikcijos modelio ir intarpo dydžio perspektyvūs klonai toliau buvo panaudoti transformuojant du skirtingus E.coli kamienus, siekiant stabilios ekspresijos - E.coli BL21 (DE3) ir Rosetta gami-2. Pagrindinis kriterijus tolimesniam biosintezės optimizavimui buvo pasirinkto klono geriausias raiškos greitis ir plazmidės stabilumo santykis.

Biosintezė atlikta „Biorad“ bioreaktoriuose su oro padavimu ir temperatūros ir pH palaikymu. Kultivuota sudėtinėje terpėje, optimizavus jos sudėtį, priedus, temperatūros režimus, IPTG koncentraciją ir indukcijos trukmę. Viename sėkmingiausių eksperimentų (žr. 4 pavyzdį) sulietas IFNa5 baltymas buvo ekspresuotas intarpinių kūnelių pavidalu, akumuliavus iki 40 % netirpios ląstelių baltymų frakcijos. Interferono alfa 5 sulietų baltymų biosintezę galima apibūdinti kaip serijinę biosintezę terpėje, praturtintoje mielių ekstraktu ir gliukoze kaip pagrindiniu anglies šaltiniu.

Optimizuojant biosintezės procesą atsižvelgta į keletą kriterijų. Nors pagrindinis biosintezės proceso įvertinimo kriterijus yra rekombinantinio baltymo išeiga, tačiau žemas plazmidės stabilumas gali būti lemiamasis parametras biosintezės sąlygų pakeitimui, net ir paaukojant baltymo išeigą. Žemas plazmidės stabilumas, stebimas pradiniuose biosintezės optimizavimo etapuose, gali sąlygoti produkuojančių E. coli ląstelių kaupimąsi, kas apsunkina gryninimo procesą, taigi ir išeiga bus mažesnė. Naudojant E.coli Rosetta gami-2 kamieną, sulietą baltymą galima gauti ląstelės baltymo tirpioje frakcijoje. Tokia praktika pageidautina, kai IFNa5 baltymas suliejamas su citokinu, kurio apsunkintas baltymo susivyniojimas. Optimizavus biosintezės procesą, pavyko sukurti rekombinantinio baltymo gamybos technologija su maksimaliai geromis biosintezės proceso parametrų reikšmėmis. Detalesnė informacija pateikta 5 pavyzdyje.

Gryninimui atlikti buvo derinami ir optimizuojami jvairiūs jonų mainų ir hidrofobines sąveikos sorbentai. Gryninimo procesas buvo kruopščiai atiderintas taip, kad atitiktų šių sulietų baltymų gryninimo specifiką. Po denatūracijos etapo vykstantis baltymų susivyniojimo procesas didele dalimi priklauso nuo peptido fragmentų polinkio susivynioti tam tikromis formomis. Sulietų baltymų atveju visuose gryninimo pakopose ir atliekant jų analizę RP-HPLC metodu pastebėta, kad aplink tikslinio baltymo pagrindinę smailę susiformuoja netinkamai susivyniojusio baltymo grupė. Buvo atlikti pradiniai sulieto baltymo išskyrimo iš intarpinių kūnelių ir gryninimo tyrimai. Didžiausių sunkumų kilo dėl galimos tirpikliui prieinamų -S-S- ryšių (esančių kilpos ribose) sąveikos galimo persiklojimo, dėl ko susidaro nežinomos sudėties junginiai (aptikti RPHPLC), kurie sunkiai atskiriami nuo pagrindinės suliejimo formos. Siekiant išvengti šių formų, buvo pasirinkta susivyniojimo ir gryninimo schema su mažesnėmis bendro baltymo išeigomis, paaukojant išeigos dalj, kad pavyktų išsaugoti pagrindinę dalj korektiškai susivyniojusios frakcijos.

Visais tirtais atvejais persivyniojimas buvo pasiektas, praskiedžiant intarpinių kūnelių tirpalą iš viso 16 kartų. Tam tikslui 56 ml intarpinių kūnelių (IB) tirpalo buvo įpilta j refoldingo buferį, švelniai maišant galutinį tirpalą nustatytą laiką +4 °C temperatūroje. Refoldingo buferis paprastai turėjo 25 mM glicino/NaOH buferio nustatytos pH reikšmės; buferio sudėtyje buvo 1,2 M NaCI, 0,5 M L-Arg ir pasirinkta redukuoto/oksiduoto glutationo pora arba oksiduotas glutationas, papildantis likutinį DTT kaip redukuojančią medžiagą. Persivyniojimo sąlygos optimizuotos tiriant pH įtaką, būtent pH 7,0; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5, esant GSH/GSSG moliniam santykiui ir koncentracijai = 2,5 mM : 0,25 mM, bei GSH/GSSG molinio santykio ir koncentracijos įtaką, būtent šiam santykiui esant 2,5 mM : 0,25 mM; 5,0 mM : 0,25 mM; 5,0 mM : 0,5 mM; 10 mM : 1,0 mM, kai pH reikšmė 9,6. Persivyniojimo efektyvumas buvo kontroliuotas RP-HPLC. Kaip optimizuotos pasirinktos tokios persivyniojimo sąlygos, kuriomis gautas didžiausias korektiškai susivyniojusios suliejimo formos procentas, būtent GSH/GSSG molinis santykis ir koncentracija = 2,5 mM : 0,25 mM.

Sulietam IFNa2b-IFNa5 baltymui gauti intarpiniai kūneliai buvo redukuoti naudojant DTT, o persivyniojimas pasiektas pridedant 0,5 mM oksiduoto glutationo. Kiti refoldingo buferio (1,2 M NaCI, 0,5 M L-Arg) priedai liko tie patys. Tačiau pastangos gauti didesnį sulieto baltymo kiekį nepasiteisino proceso išeigos požiūriu. Išradimo autoriams pavyko nustatyti, kad į refoldingo buferį pridėjus amonio sulfato vietoj NaCI, galima beveik du kartus padidinti korektiškai susivyniojusio sulieto baltymo kiekį. Atsižvelgiant į tai, tolesnis suliejimo procesas buvo atliekamas, į refoldingo buferį pridedant 0,5 M amonio sulfato. Šitoks druskos pakeitimas persivyniojimo proceso metu sąlygojo ir pradinio suliejimo chromatografijos etapo pakeitimą, kadangi pirmoji chromatografinio gryninimo su fenil-Sefarozės FF kolonėle pakopa anksčiau buvo atiderinta, naudojant NaCI. Fenil-Sefarozės FF kolonėlė yra skirta persivyniojusio baltymo tirpalui atskirti nuo likutinio guanidino hidrochlorido (GdmCI). Todėl naudojant fenil-Sefarozės FF kolonėlę, t. y. pakraunant persivyniojusį baltymą į kolonėlę, nupusiausvirintą su 1,5 NaCI, tapo būtina NaCI pakeisti į amonio sulfatą arba atrasti tinkamas šios kolonėlės eksploatavimo sąlygas, naudojant pusiausvirinimo buferį su tinkamai parinktos koncentracijos amonio sulfatu. Buvo tiriamas fenil-Sefarozės FF kolonėlės darbas, į pusiausvyrinimo buferį pridedant įvairios koncentracijos amonio sulfato. Buvo nustatyta, kad persivyniojusio baltymo chromatografija fenil-Sefarozės FF kolonėlėje yra įmanoma, naudojant 1,25 M amonio sulfatą. Tokiu atveju, atliekant renatūracijos stadiją su 0,5 M amonio sulfato priedais, sekantį chromatografijos per fenil-Sefarozės FF kolonėlę etapą galima atlikti, praleidžiant Sefadekso G-25 kolonėlę. Pasirodė, kad pakanka pridėti amonio sulfato į persivyniojusio baltymo tirpalą ir pusiausvyrinimo buferį iki 1,25 M koncentracijos ir atlikti chromatografiją analogiškai, kaip ir naudojant NaCI. Fenil-Sefarozės chromatografijos kolonėlė buvo nupusiausvirinama naudojant 20 mM Tris HCI, 1,5 M NaCI, pH = 8,2, laidumas 115,1 mS/cm. Po chromatografijos per Sefadekso G-25 kolonėlę 2500 ml sulieto IFNa2bIFNa5 baltymo tirpalo buvo pakrauta į kolonėlę, kurios eliuavimo srauto greitis 20 ml/min, ir išplauta su 10 mM TrisHCI, pH = 9,2, laidumas 1196 pS/cm.

Po fenil-Sefarozės atliekama Q-Sefarozės chromatografija, pusiausvirinimui naudojant 20 mM Tris-HCI, 0,05 M NaCI, pH 8,8. Apjungtos baltymo frakcijos po fenilSefarozės, pakoregavus pH iki 8,8 su 6 M HCL, laidumas 8 mS/cm, pakrautos į kolonėlę. Desorbcijos gradientas taikytas kaip 20 mM TrisHCI, linijinis gradientas nuo 0,05 iki 0,25 M NaCI, pH 8,8. Surinkta frakcija buvo chromatografuota per SPSefarozę. SP-Sefarozės kolonėlė buvo nupusiausvirinta naudojant 20 mM CHaCOONa, 100 mM NaCI, pH 5,4. Mėginys pakrautas, su 6 M HCI pakoregavus pH iki 5,4, laidumą - iki 9,5 mS/cm. Desorbcija iš kolonėlės vykdyta su 20 mM CHsCOONa gradientu nuo 50 mM iki 0,25 M NaCI, pH 5,4. Atlikus SP-Sefarozės FF chromatografiją, į apjungtas frakcijas, turinčias sulieto baltymo, pridėjus 1 dalį (10:1 pagal tūrį) koncentruoto fosfatinio buferio (250 mM fosfato, 150 mM NaCI, pH 7,0), pH pakoreguotas iki 7,0 ir tirpalas koncentruotas, naudojant Millipore Ultracel (10 MWC0) centrifūgos filtrus. Po koncentravimo buferis pakeistas į PBS (25 mM fosfato, 150 mM NaCI, pH 7,0). Pakeitus buferį, bendras baltymo kiekis buvo nustatytas naudojant baltymų tyrimo rinkinį Pierce 660. Baltymo tirpalas nufiltruotas naudojant Mustang E filtrą ir sterilioje aplinkoje (laminarinio oro srauto gaubtas) išpilstytas alikvotinėmis dalimis j 1 ml indelius (galutinė koncentracija - 1,005 mg/ml). Indeliai buvo užšaldomi ir laikomi -80 °C temperatūroje. Paimti mėginiai RP-, SEC-HPLC, bendram baltymo ir endotoksinų kiekiui nustatyti.

Sulietiems IFNa5-OSM ir OSM-IFNa5 baltymams buvo įvertintas amonio sulfato poveikis sulietų baltymų renatūracijos išeigai. Visi renatūracijos buferiai buvo sudaryti iš 25 mM glicino/NaOH buferių, turinčių 0,5 M L-Arg, pH 9,6, 5 mM redukuoto (GSH) ir 0,25 mM oksiduoto (GSSG) glutationo. Refoldingo buferyje padidinus amonio sulfato koncentraciją, gauta didesnė renatūruoto baltymo išeiga, palyginus su ankstesnę, pridedant 1,2 M NaCI. Toliau pateikiama schema, optimizuota IFNa5 ir OSM sulietiems baltymams:

g biomasės resuspenduojama 500 ml 0,1 M Tris-HCI buferio (pH 7,4), kurio sudėtyje yra 2 mM EDTA, 25 mM DTT, 250 mM PMSF, 0,1% Triton Χ-100, ir suardoma naudojant ultragarsą. Suardymas atliekamas naudojant 1:1 impulsą, 40 % amplitudę;

g suardymo laikas - 25 min. Gauta suspensija 30 min. centrifuguojama 12000 aps./min. greičiu, ir granulės, turinčios intarpinių kūnelių, užšaldomos -20 °C temperatūroje.

Intarpinių kūnelių plovimas atliekamas tokiu būdu:

Du kartus su I plovimo buferiu: 10 mM Tris-HCI, 1 M NaCI, 0,1% polisorbato80, pH 7,4, kiekvieną kartą su 500 ml;

plovimo buferis: 10 mM Tris-HCI, 6 M karbamido, pH 8,0, 500 ml;

III plovimo buferis: 10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 500 ml

Po kiekvieno plovimo intarpiniai kūneliai IB buvo centrifuguojami 10000 aps./min. greičiu Backman centrifūgoje.

Preliminariai išplauti IB buvo 2 vai. tirpinami 300 ml 25 mM Gly/NaOH buferyje, pH 8,7, turinčiame 2 mM EDTA, 6 M GdmCI, 20 mM DTT (297 mS/cm, +4°C), ir po to min. centrifuguojami 9500 aps./min. greičiu Backman centrifūgoje.

Persivyniojimas vyko 2 I talpos Duran tipo karščiui atsparaus stiklo laboratorinėse stiklinėse, uždengtose tampiąja plėvele. Ištirpinti (soliubilizuoti) intarpiniai kūneliai buvo 10 kartų atskiedžiami refoldingo buferiu (25 mM Gly/NaOH, 0,5 M arginino, 0,25 M (NH₄)2SO₄ 2,5 mM GSH, 0,25 mM GSSG, pH 9,6), iki galutinio 3000 ml tūrio. Persivyniojimas vyksta apytikriai 64 vai. Po persivyniojimo baltymo tirpalas 30 min. centrifuguojamas +4 °C temperatūroje 9500 aps./min. greičiu Beckman centrifūgoje. Chromatografijai su Sefadeks G-25 visas po persivyniojimo gautas tirpalas buvo pakraunamas j kolonėlę ir išplaunamas 20 mM Tris-HCI, 0,5 M NaCI (pH 9,0) iki 1,2 kolonėlės tūrio. Po druskų pašalinimo atlieka baltymo tirpalo chelatinę Sefarozės chromatografiją. Chelatinė Sefarozės FF terpė plaunama 50 mM EDTA tirpalu, 2 CV, 0,1 M HCI tirpalu, 2 CV, vandeniu, iki pH reikšmė viršys 5,0 ir įkraunama Cu(ll) jonais, pridėjus 0,2 M CU2SO4 tirpalo, 2 CV. Kolonėlė plaunama vandeniu ir nupusiausvirinama 20 mM TrisHCI buferiu (pH 7,0), kurio sudėtyje yra 0,5 M NaCI, esant mažam srauto greičiui 10 ml/min. 3250 ml baltymo tirpalo (pH 7,0), iš kurio pašalintos druskos, pakrauna į kolonėlę. Nesurišti baltymai išplaunami su 20 mM TrisHCI, 0,5 M NaCI, pH 7,0, 2 CV. Eliuavimą pradeda su 20 mM TrisHCI, 0,5 M NaCI, 15 CV, gradientu į 100 mM imidazolą, pH 7,0. Surinktas frakcijas, patikrinus ar jose yra sulietų baltymų, pakrauna j Q-Sefarozės FF terpę. Ši kolonėlė nupusiausvirinama su 20 mM TrisHCI, 70 mM NaCI, pH 9,0, 10 CV. Nesurištų baltymų išplovimas: 20 mM TrisHCI, 70 mM NaCI, pH 9,0, 2 CV; ir eliuavimas atliekamas su 20 mM TrisHCI, 10 CV gradientu iki 300 mM NaCI, pH 9,0. Baigiamajam gryninimo etapui pasirenka CM Sefarozę. Kolonėlę nupusiausvirinama su 20 mM natrio acetatu, 50 mM NaCI, pH 5,5, 10 CV. Galutinį baltymo eliuavimą atlieka su 20 mM natrio acetatu, 15 CV gradientu iki 500 mM NaCI, pH 5,5. Apjungtos frakcijos, turinčios sulietų baltymų, dedamos j 1 dalį (10:1 pagal tūrį) koncentruoto fosfatinio buferio (250 mM fosfato, 150 mM NaCI, pH 7,0), pH koreguojamas iki 7,0 ir tirpalas koncentruojamas, naudojant Millipore Ultracel (10 MWC0) centrifūgos filtrus. Po koncentravimo buferį pakeičia į PBS (25 mM fosfato, 150 mM NaCI, pH 7,0). Pakeitus buferį, bendras baltymo kiekis nustatomas naudojant baltymų tyrimo rinkinį Pierce 660. Baltymo tirpalą nufiltruoja naudojant Mustang E filtrą, ir sterilioje aplinkoje (laminarinio oro srauto gaubtas) išpūsto alikvotinėmis dalimis j 1 ml indelius (galutinė koncentracija - 1,005 mg/ml). Indelius užšaldo ir laiko -80 °C temperatūroje. Paimami mėginiai RP-, SEC-HPLC, bendram baltymo ir endotoksinų

Atskirtų intarpinių kūnelių preliminarų plovimą atlieka pagal keturių pakopų procedūrą naudojant: I plovimo buferiu 10 mM Tris-HCI buferį, kurio sudėtyje yra 1 M NaCI, 0,1% polisorbato-80, pH 7,4; II plovimo buferiu 10 mM Tris-HCI buferį, kurio sudėtyje yra 6 M karbamido, pH 8,0; III plovimo buferiu 10 mM Tris-HCI buferį, pH 8,0.

Tirpinimo buferis susideda iš 25 mM Gly/NaOH buferio, kurio sudėtyje yra 2 mM EDTA, 6 M GdmHCI, 20 mM DTT, pH 9,6, 0-10°C. Tirpinimo santykis: intarpiniai kūneliai (IB), išskirti iš 1 g biomasės, buvo tirpinami 2 vai. +4°C temperatūroje 6 ml tirpinimo buferio, ir po šios stadijos buvo 30 min. centrifuguojami 9500 aps./min. greičiu.

Intarpinių kūnelių (IB) plovimas buvo atliekamas tokiu būdu:

a) intarpiniai kūneliai du kartus plaunami I plovimo buferiu (turinčiu 1 M NaCI ir 0,1 % polisorbato 80 priedų);

b) Trečiąjį plovimą atlieka naudojant II buferį (turintį 6 M karbamido priedą);

c) Ketvirtąjį plovimą atlieka su III buferiu, 10 mM Tris-HCI buferiu (neturinčiu priedų, pH 8,0). Tai paskutinė intarpinių kūnelių preliminaraus plovimo stadija;

d) Po kiekvieno iš šių plovimo etapų intarpinius kūnelius 30 min. centrifuguoja 4 °C temperatūroje 9500 aps. / min. greičiu su Beckman J-10 rotorių.

Preliminaraus plovimo santykis: IB, išskirtiems iš 1 g drėgnos biomasės naudojama 10 ml buferio.

Tolimesniam gryninimo schemos tobulinimui kaip pagrindinė procedūra buvo pasirinktas sulietų baltymų persivyniojimas, pridedant 0,5 M amonio sulfato ir laikantis 32 x skiedimo koeficiento. Nors su natrio sulfato priedais iš fenil-Sefarozės FF kolonėlės galima gauti daugiau baltymo, natrio sulfato naudojimo buvo atsisakyta dėl polinkio kristalizuotis šaltomis kambario sąlygomis. Chromatografijos su fenil-Sefaroze FF procesas buvo atliktas kaip anksčiau aprašyta dėl IFNa2b-IFNa5 gryninimo. DEAE chromatografijai atlikti naudota dviejų buferių sistema: A buferis (20 mM Tris-HCI, pH 8,8, laidumas 243 pS/cm) ir B buferis (20 mM Tris-HCI, 1M NaCI, pH 8,8, laidumas 84,4 mS/cm). Kolonėlė nupusiausvirinama naudojant 20 mM Tris-HCI, 0,05 M NaCI, pH 8,8, laidumas 7 mS/cm, 25°C, 5 CV. Eliuavimas buvo atliktas su 20 mM TrisHCI gradientu nuo 0,05 iki 0,4 M NaCI, pH 8,8.

Plovimas: 20 mM TrisHCI, 0,05 M NaCI, pH 8,8, laidumas 7 mS/cm, 25 °C, 2 CV. Baigiamajame chromatografijos etape naudotas CHT keraminis hidroksiapatito I tipo sorbentas. Šioje chromatografijoje kaip A buferis naudotas dejonizuotas vanduo, ir kaip B buferis - 500 mM H3PO4, pH 6,4. Kolonėlė nupusiausvirinama su 5 mM H3PO4, pH 6,4. Frakcijos po DEAE chromatografijos buvo praskiestos iki galutinės 5 mM fosfato koncentracijos naudojant 500 mM fosfatinj buferį (60 : 0,6), pH koreguotas iki 6,4. Desorbcija atlikta fosfato gradientu nuo 5 mM iki 250 mM, pH 6,4. Apjungtos frakcijos, turinčios sulietų baltymų, pridėtos j 1 dalies (10:1 pagal tūrį) koncentruotą acetatinį buferį (150 mM acetato, 150 mM NaCI, pH 5,2), pH koreguotas iki 5,2 ir tirpalas buvo koncentruotas, naudojant Millipore Ultracel (10 MVVCO) centrifūgos filtrus. Baltymo tirpalą nufiltruoja naudojant Mustang E filtrą ir sterilioje aplinkoje (laminarinio oro srauto gaubtas) išpūsto alikvotinėmis dalimis į 1 ml indelius (galutinė koncentracija - 1,005 mg/ml). Indelius užšaldo ir laiko -80°C temperatūroje. Paimami mėginiai RP-, SEC-HPLC, bendram baltymo ir endotoksinų kiekiui nustatyti.

Analizę sudarė proceso kontrolės būdai (tokie kaip SDS-PAGE, VVestern blot,

RP-HPLC) ir galutinio produkto savybių nustatymas (kaip RP-HPLC, SE-HPLC, peptidų žemėlapių sudarymas, aminorūgščių sekoskaita TOF masių spektrometrija ir biologinio aktyvumo įvertinimas).

PAVYZDŽIAI pavyzdys. IFNA5-IFNA5 homodimero klonavimo schema

Įprastoms klonavimo schemoms, naudojamoms genams sulieti, kai tikslas yra homodimerinis genas, būdingi keli neigiami aspektai. Šiuo konkrečiu atveju negalima panaudoti skirtingų geno A ir geno B savybių, ir taikant daugumą strategijų prarandamas tam tikras geno fragmentas. Šiame pavyzdyje taikoma speciali klonavimo schemą (Fig.1), kuri gali būti panaudota panašiais homodimerinių genų suliejimo atvejais.

IFNa5 geno kaip N galinės dalies paruošimą suliejimui sudaro keli etapai. Pirmiausia PGR būdu atliekama genų amplifikacija, jo 5' gale pridedant Ndel vietą, ir iš jo 3' galo pašalinant TAG pabaigos (stop) kodoną (naudojami pradmenys IFNA5FOR-NDE ir IFNA5-REV-(-STOP)). Antra, amplifikuotas ir išgrynintas IFNA5/N genas sukarpomas naudojant Acll restrikcijos endonukleazę, iš geno 3’ galo pašalinant 22 bazių porų. Acll vieta naudojama lipniojo galo ligavimui su IFNa5/C geno 3’ galu.

IFNa5 geno kaip C galinės dalies paruošimą suliejimui sudaro PGR būdu atliekama genų amplifikacija, pridedant HindiII vietą jo 3’ gale ir pašalinant iš 5’ galo ATG pradžios (start) kodoną (naudojami pradmenys IFNA5-FOR-A5 ir IFNA5-REVHIND). Naudojant tų pačių pradmenų porą prieš skaitymo rėmelio kryptį pridedama papildoma 30 bazių porų seka su komplementariąja IFNa5/N geno 3’ galo seka (žr. 3 lentelę). Paskui amplifikuotas ir išgrynintas IFNa5/C genas sukarpomas Acll restrikcijos endonukleaze. Jo pirmasis taikinys yra pridėtojoje IFNa5/N sekoje, o antrasis taikinys - jo 3’ gale. Abu Acll sukarpytus genus ekvimoliniu santykiu ligavus tarpusavyje gauna sulieto geno konstruktą, kurį paskui ekstrahuoja iš agarozės gelio.

3 lėni	elė
Pradmuo	Seka (5’—>3’)	Restrikcijos endonukleazė s vieta	Tm
IFNA5- FOR-NDE	ATTATCATATGTGTGATCTGCCGCAGA	Ndel (CATATG)	63,9 °C
IFNA5- REV-(-stop)	TTCCTTACGACGTAAACGTTCTTGC	Acll (AACGTT)	60,8 °C
IFNa5-A5- FOR	TTCCTTACGACGTAAACGTTCTTGC TGTGATCTGCCGCAGA	Acll (AACGTT)	>75,0 °C
IFNa5-REV- HIND	GACGTAAACGTTCTTGCTAAAAGCTTT TAA	Acl, Hindlll	>75,0 °C

lentelėje pabrauktos sekos yra tiesioginio pradmens (CA^ATATG) Ndel atpažinimo ir skaldymo vieta, o Hindlll - atvirkštinių pradmenų (A^AAGCTT) ir Acll (AA^ACGTT) vietos, naudojamos genams sujungti. Paryškintoji seka - tai 24 bazės, koduojančios IFNa5/N geno galą, pridėtos prie IFNa5/C geno iš priekio.

Po ligavimo, jeigu klono parinkimo etape pašalinami konkatamerai, gaunamas sulieto geno produktas, kuriam trūksta 22 bazių porų (7 aminorūgščių ir nėra STOP kodono). Norint atkurti visą seką, atliekamas antrasis etapas, kurį sudaro sekos sukarpymas-ligavimas. pET21b+ plazmidė, jau turinti IFNa5 geną, sukarpoma naudojant specialią restrikcijos endonukleazę, esančią IFNa5 gene - Bsu36l. Naudojant Bsu36l panašiai sukarpomas ir IFNa5-Acll-IFNa5 ligatas, ir 500 bazių porų vidinis geno fragmentas išgryninamas iš gelio. Paskui IFNa5/pET21b+ karkasas liguojamas su 500 bazių porų Bsu36l IFNa5-IFNa5 fragmentu ir transformuojamas j tarpinį E.coli JM109 kamieną. Kaip matyti klonavimo schemoje (Fig.1), šiuo būdu atkuriamas viso ilgio geno dimeras su pradžios (start) ir pabaigos (stop) kodonais. Teigiami klonai papildomai patikrinami atliekant pilną restrikcijos schemos analizę. Patvirtintieji klonai retransformuojami į BL21(DE3) E.coli kamieną, patikrinama jų ekspresija ir atliekama sekoskaita.

pavyzdys. Sulietos IFNA2B-IFNA5 heterostruktūros klonavimo schema

IFNa2b geno paruošimą suliejimui sudaro PGR būdu atliekama genų amplifikacija, Ndel vietos pridėjimas 5’ gale irTAA pabaigos (stop) kodono pašalinimas iš 3’ galo. Šiuo atveju PGR atliekama naudojant pradmenis IFNA2b-FOR-NDE ir

IFNa2B-REV-(-stop). Klonavimo schema pateikta Fig. 2. Amplifikuotas ir išgrynintas IFNA2b genas po to sukarpomas, naudojant Pstl restrikcijos endonukleazę, ir iš geno 3’ galo pašalinama 10 bazių porų. Pstl vieta panaudojama lipniojo galo ligavimui su IFNa5 genu. Analogiškai, IFNa5 geno paruošimą suliejimui sudarė PGR amplifikacija, Hindlll vietos pridėjimas geno 3’ gale, ir 22 bazių porų ilgio IFNa2b geno fragmento galo sujungiamas su Pstl taikiniu (naudojant pradmenis IFNa5-FOR-A2b ir IFNa5REV-HIND). Paskui amplifikuotas ir išgrynintas IFNa5 genas pridėtojoje IFNa2b sekoje karpomas naudojant Pstl taikinį.

lentelė

Pradmuo	Seka (5’—>3’)	Restrikcijos endonukleazės vieta	Tm
IFNA2b- FOR-NDE	TTAACATATGTGTGATCTGCCGCA	Ndel (CATATG)	61,8°C
IFNa2B- REV-(- stop)	TTCCTTAGAACGCAGAGATTCCTGCAG GTT	Pstl (CTGCAG)	67,0°C
IFNa5- FOR-A2b	TTTCTGCAGGAATCTCTGCGTTCTAAG GAATGTGATCTGCCGCAGACC	Pstl (CTGCAG)	75,8°C
IFNa5- REV-HIND	AATTAAGCTTTTATTCCTTACGAC	Hindlll (AAGCTT)	51,3°C

lentelėje pabrauktos sekos yra tiesioginio pradmens (CA^ATATG) Ndel atpažinimo ir skaldymo vieta, o Hindlll - atvirkštinių pradmenų (A^AAGCTT), Pstl (CTGCA^AG) vietos buvo naudotos geno sujungimui. Paryškintoji seka - tai 30 bazių, koduojančių IFNa2b geno galą, kurios pridėtos prie IFNa5 geno iš priekio.

Pstl sukarpyti produktai ekvimoliniais santykiais liguojami kartu su T4 DNR ligaze. Gautas mišinys gryninamas, iš gelio ištraukiant 1000 bazių porų ilgio fragmentą. Kadangi šis fragmentas yra bukais galais, jis buvo klonuotas į tarpinį vektorių pJET 1.2, ir po to - į E.coli JM109 kamieną. Toks plazmidės ir kamieno derinys leido pJET plazmidėje sukurti teigiamus klonus, kurie paskui dukart sukarpomi, naudojant NdelHindlll. Dvigubai sukarpyto sulieto geno produktas pakartotinai išgryninamas su PGR gryninimo rinkiniu, ir paskui paruošiamas klonuoti į pasirinktą sukarpytą ir defosforilintą ekspresijos plazmidę pET21b+. Siekiant užtikrinti klono stabilumą, pirmasis liguotų produktų transformavimo etapas buvo atliktas į E.coli JM109 kamieną. Po pirmojo klonavimo įtarpos dydis patikrinamas plazmidės DNR sukarpant Ndel-Hindlll restrikcijos endonukleazėmis. Teigiami klonai papildomai patikrinami atliekant pilną restrikcijos schemos analizę. Patvirtintieji klonai retransformuojami į BL21(DE3) E.coli kamieną ir patikrinamas jų ekspresijos lygis. Atliekama patvirtintų klonų sekoskaita.

pavyzdys. Sulietos IFNA5-IFNA2B heterostruktūros klonavimo schema

IFNa5 geno paruošimą suliejimui sudaro PGR būdu atliekama genų amplifikacija, Ndel vietos pridėjimas 5' gale ir stop-kodono pašalinimas iš 3' galo, naudojant pradmenis IFNA5-FOR-NDE ir IFNA5-REV-(-stop). Panašiai ir IFNa2b geno paruošimą suliejimui sudaro geno amplifikacija PGR būdu, Hindlll vietos pridėjimas geno 3’ gale, ir prijungimas 14 bazių porų ilgio IFNa5 geno fragmento (naudojant pradmenis IFNa2b-FOR-A5 ir IFNa2b-REV-HIND). Šiuo atveju persidengianti PGR atliekama per nurodytą 14 bazių porų sritį, dėl ko gaunamas sulietų genų produktas. Pradmenys nurodyti toliau pateiktoje lentelėje.

lentelė

Pradmuo	Seka (5’—>3’)	Restrikcijos endonukleazes vieta	Tm
IFNA5- FOR-NDE	ATTATCATATGTGTGATCTGCCGCA GA	Ndel (CATATG)	63,9°C
IFNA5- REV-(-stop)	TTCCTTACGACGTAAACGTTCTTGC	Acll (AACGTT)	60,8°C
IFNA2B- FOR-A5	TACGTCGTAAGGAATGTGATCGCC GCA	nėra	68,9‘C
IFNA2B- REV-HIND	AAAAAGCTTCTATTCCTTAGAAC	Hindlll (AAGCTT)	50,2°C

Persidengianti PGR atliekama dviem etapais: vienas etapas su mažos išeigos PGR, reakciją atliekant be pradmenų (persidengianti sritis veikia kaip laisvų 3’-OH grupių donorė), apimant tik IFNa5 ir IFNa2b PGR produktus. Sulietų genų produktą išgavus iš gelio, naudojant pradmenis IFNA5-FOR-NDE ir IFNA2B-REV-HIND atliekama pakartotinė amplifikacija. Po šio antrojo PGR etapo, produktas sukarpomas naudojant restrikcijos endonukleazes Ndel ir Hindlll ir klonuojamas į sukarpytą ir defosforilintą ekspresijos plazmidę pET21b+. Siekiant užtikrinti klono stabilumą, pirmasis liguotų produktų transformavimo etapas atliekamas į E.coli JM109 kamieną.

Po pirmojo klonavimo įtarpos dydis patikrinamas, plazmidės DNR sukarpant NdelHindlll restrikcijos endonukleazėmis. Teigiami klonai papildomai patikrinami atliekant pilną restrikcijos schemos analizę. Patvirtintieji klonai retransformuojami į BL21(DE3)

E.coli kamieną ir patikrinamas jų ekspresijos lygis. Atliekama patvirtintų klonų sekoskaita.

pavyzdys. Sulietos IFNa5-OSM heterostruktūros klonavimo schema

IFNa5 geno paruošimą suliejimui sudaro PGR genų amplifikacija, Ndel vietos pridėjimas 5' gale ir TAG stop-kodono pašalinimas iš 3' galo (naudojami pradmenys IFNA5-FOR-NDE ir IFNA5-REV-(-stop)). Paskui amplifikuotas ir išgrynintas IFNa5 genas sukarpomas, naudojant Acll restrikcijos endonukleazę, iš geno 3’ galo pašalinama 10 bazių porų. Acll vieta panaudojama lipniojo galo ligavimui su OSM(196) genu.

OSM(196) geno paruošimą suliejimui sudaro PGR amplifikacija, Hindlll vietos pridėjimas geno 3’ gale ir 22 bazių porų ilgio IFNa5 geno fragmento galo sujungimas su Acll taikiniu. Po to amplifikuotas ir išgrynintas OSM(196) genas pridėtoje IFNa5 sekoje sukarpomas naudojant Acll taikinį.

lentelė

Pradmuo	Seka (5’—>3’)	Restrikcijos endonukleazės vieta	Tm
IFNA5- FOR-NDE	ATTATCATATGTGTGATCTGCCGCA GA	Ndel (CATATG)	63,9 °C
OSM- RSRR- REV-HIND	TTTAAGCTTCTATCTCCGGCTCCGG TT	Hindlll (AAGCTT)	65,1 °C
IFNA5- REV-(-stop)	TTCCTTACGACGTAAACGTTCTTGC	Acll (AACGTT)	60,8 °C
OSM-AAI- ACL	TTAACGTTTACGTCGTAAGGAAGC GGCTATAGGCAGCT	Acll (AAGCTT)	71,5 °C

Pabrauktos sekos yra tiesioginio pradmens (CA^ATATG) Ndel atpažinimo ir skaldymo vieta, Hindlll - atvirkštinio (A^AAGCTT) ir Acll (AA^ACGTT) vietos, naudojamos genams sujungti. Paryškintoji seka - tai 24 bazių, koduojančių IFNa5 geno galą, kurios pridėtos prie OSM(196) geno iš priekio.

Acll sukarpyti produktai ekvimoliniais santykiais liguojami kartu su T4 DNR ligaze. Gautas mišinys gryninamas, iš agarozės gelio ištraukiant 1100 bazių porų ilgio fragmentą. Pagrindinis skirtumas nuo 2 pavyzdžio yra tas, kad dėl skirtingų suliejamų genų dydžių iš korektiškos formos galima išskirti konkatamerines struktūras (veidrodinius IFNa5-IFNa5 ir OSM-OSM). Todėl tarpinio pJET1.2 klonavimo etapo nebereikia ir jj galima praleisti. Iš agarozės gelio ištrauktas DNR fragmentas sukarpomas naudojant Ndel ir Hindlll, klonuojamas j atitinkamai sukarpytą pET21b+ plazmidę ir transformuojamas j JM109 E.coli kamieną. Jtarpos dydžio analizei pasirenkami ampicilinui atsparūs klonai. Pasirinkti klonai pakartotinai transformuojami j E.coli kamienus BL21(DE3), o pilnos restrikcijos schemos analizė atliekama su jų plazmidžių DNR. Nustatoma patvirtintųjų klonų seka.

pavyzdys Sulietos OSM-IFNa5 heterostruktūros klonavimo schema

OSM geno paruošimą suliejimui sudaro PGR būdu atliekama genų amplifikacija, Ndel vietos pridėjimas 5’ gale ir TAG stop-kodono pašalinimas iš 3’ galo. PGR produkto amplifikacija atliekama naudojant tiesioginį pradmenį OSM-FOR-NDE ir atvirkštinį pradmenį OSM-REV-(-STOP). Paskui amplifikuotas ir išgrynintas OSM genas sukarpomas, naudojant BsaVVI restrikcijos endonukleazę, iš geno 3’ galo pašalinama 10 bazių porų. BsaVVI vieta panaudojama lipniojo galo ligavimui su IFNa5 genu.

IFNa5 geno paruošimą suliejimui sudaro PGR amplifikacija, Hindlll vietos pridėjimas geno 3’ gale ir 25 bazių porų ilgio OSM geno fragmento galo sujungimas su BsaVVI taikiniu. PGR produkto amplifikacija atliekama naudojant tiesioginį pradmenį IFNA5-FOR-BSA ir atvirkštinį pradmenį IFNA5-REV-HIND. Paskui amplifikuotas ir išgrynintas IFNa5 genas pridėtojoje OSM sekoje sukarpomas naudojant BsaVVI taikinį.

7 lente	ė
Pradmuo	Seka (5’—>3’)	Restrikcijos endonukleazė s vieta	Tm
OSM-FOR- NDE	AAACATATGGCGGCTATAGGCAG C	Ndel (CATATG)	66,2°C
OSM-REV- (-STOP)	TCTCCGGCTCCGGTTCGG	BsaVVI (ACCGGA)	65,7ŪC
IFNA5- FOR-BSA	AGAGCCCGAACCGGAGCCGGAG ATGTGATCTGCCGCAGA	BsaVVI (ACCGGA)	>75°C
IFNA5- REV-HIND	AATTAAGCTTTTATTCCTTACGAC	Hindlll (AAGCTT)	51,3°C

BsaVVI sukarpyti produktai ekvimoliniais santykiais liguojami kartu su T4 DNR ligaze. Gautas mišinys gryninamas, iš agarozės gelio iškerpant 1100 bazių porų ilgio fragmentą. Iš agarozės gelio ištrauktas DNR fragmentas sukarpomas naudojant Ndel ir Hindlll, klonuojamas j atitinkamai sukarpytą pET21b+ plazmidę ir transformuojamas j JM109 E.coli kamieną. Atliekama ampicilinui atsparių klonų jtarpos dydžio analizė. Pasirinkti klonai pakartotinai transformuojami j E.coli kamienus BL21(DE3), o pilnos restrikcijos schemos analizė atliekama su jų plazmidžių DNR. Nustatoma patvirtintųjų klonų seka.

pavyzdys. IFNA2B-IFNA5/PET21B+/E.COLI BL21(DE3) BIOSINTEZĖ BIOREAKTORIUJE

Visais tirtais atvejais E. coli BL21(DE3) / pET21b+ / IFNa2b-IFNa5 serijinė biosintezė atlikta naudojant 1,4 I darbinio tūrio fermentatorių „Biostat M“, kai pH 6,87,0, pO2 - 30 %, su automatiškai valdomais prisijungus (on-line) kintamaisiais (temperatūra, maišymas, pH, pO2) ir valdomu neprisijungus (off-line) kintamuoju optiniu tankiu (santrumpa OD, matuojamas ties bangų ilgiu 600 nm Ependorfo spektrofotometru).

Ląstelėms auginti naudotos dvi terpės: M9 ir modifikuota M9m. M9 terpės, skirtos fermentavimui, sudėtis (g/l): mielių ekstraktas - 20,0, amonio chloridas - 5,0, magnio sulfato heptahidratas - 0,5, dinatrio vandenilio fosfatas - 4,7, kalio divandenilio fosfatas -4,5, gliukozės monohidratas - 22. M9m terpės, skirtos inokuliacijai, sudėtis (g/l) tokia: mielių ekstraktas - 10, amonio chloridas -1, magnio sulfato heptahidratas

- 0,5, dinatrio vandenilio fosfatas - 6,6, kalio divandenilio fosfatas - 2,7, gliukozės monohidratas - 5. M9m terpės, skirtos fermentavimui, sudėtis (g/l): mielių ekstraktas

- 20,0, amonio chloridas - 5,0, magnio sulfato heptahidratas - 0,5, dinatrio vandenilio fosfatas - 7, kalio divandenilio fosfatas - 6,8, gliukozės monohidratas - 15.

Fermentavimo procesų šiose abiejose terpėse palyginimas pateiktas 8 lentelėje ir Fig. 4. Pastebėtina, kad visi valdomi modifikuotos M9m terpės parametrai yra kur kas geresni nei M9 terpės. Pradinė biosintezės eksperimento trukmė buvo 5,5 vai., indukciją taikant trečią auginimo valandą.

lentelė

Valdomi parametrai	M9 terpė	M9m terpė
Darbinis tūris, I	1.4	1.4
Galutinė IPTG koncentracija, mM	0.5	0.5
Fermentacijos trukmė, h	5.5	5.5
Indukcijos laikas, h	3.0	3.0
Indukcijos OD	1.5	8.9
Galutinis OD	2.9	23.9
Drėgnos biomasės išeiga, g/l	4.6	39.3
Bendras baltymų kiekis, mg/g drėgnos biomasės	86.6	99.6
IFNa2b-IFNa5, % nuo viso baltymų kiekio	66.0	62.5
IFNa2b-IFNa5, mg/g biomasės (apskačiuota pagal bendrą baltymų kiekj)	57.1	62.2
IFNa2b-IFNa5, mg/l ląstelių suspensijos (pagal bendrą baltymų kiekj)	262.8	2445.9

Deja, per 5,5 vai. trukusios biosintezės paskutiniąją valandą sumažėjo plazmidės stabilumas, galiniame taške jis siekė tik 60 %. Plazmidžių neturinčių ląstelių kaupimasis yra nepageidautinas, kadangi gryninimo metu padidėja baltymų apkrova. Siekiant išvengti šios problemos, buvo pakeistas biosintezės proceso grafikas: indukcijos taškas perkeltas j antrąją auginimo valandą, auginimui po indukcijos paliekant tik 2 valandas. Analizuojant proceso valdymą gauti tokie optimizuoti biosintezės M9m terpėje rodikliai:

lentelė

Valdomi parametrai	Reikšmė
Drėgnos biomasės išeiga, g/l	28,5+0,9

Bendras baltymų kiekis, mg/g drėgnos biomasės	73,4±7,6
IFNa2b-IFNa5, % nuo bendro baltymų kiekio (SDS-PAGE)	65,1±10.2
IFNa2b-IFNa5, mg/g biomasės (apsikačiuota pagal bendrą baltymų kiekį)	47,7±8,5
IFNa2b-IFNa5, mg/l ląstelių suspensijos (pagal bendrą baltymų kiekį)	1364,1 ±72,8

pavyzdys. SULIETŲ IFN ALFA-2B - IFN ALFA-5 BALTYMŲ IŠSKYRIMAS IR GRYNINIMAS

Chromatografinis gryninimas vykdytas tokiomis pakopomis: hidrofobines sąveikos chromatografija per fenil-Sefarozės kolonėlę, toliau - anijonų ir katijonų mainų chromatografija; tačiau kiekviena šių pakopų buvo atitinkamai koreguota pagal sulietų baltymų elgesį.

Procesui vykdyti kaip pradinė medžiaga imta 10 g biomasės. 10 g biomasės suspendavo buferiniame tirpale, sudarytame iš 89,6 ml 0,1 M Tris-HCI buferio, pH 8,0, 2 mM EDTA ir 25 mM DTT, 400 μΙ 250 mM PMSF ir 10 ml 0,1 % TritonX-100. Pridedant 6 M HCI, pH reikšmė koreguota iki 7,5. Ląstelės suardytos, 30 min. veikiant ultragarso aparatu Sonios Vibra, impulsais po 1 sekundę (įjungta) ir 2 sekundes (išjungta), 40 % galingumu. Po to tirpieji ir netirpieji baltymai buvo atskirti, centrifuguojant 30 min. +4 °C temperatūroje 12000 aps./min. greičiu. Intarpiniai kūneliai dukart plauti šaltu (+4 °C) I buferiu, turinčiu 1 M NaCI ir 0,1 % polisorbato-80 priedų. Trečiam plovimui naudotas II buferis, turintis 6 M karbamido, ir plovimo procedūra užbaigta III buferiu. Po kiekvieno preliminaraus plovimo ciklo IB buvo suspenduoti 100 ml atitinkamo buferio, santykiu 10 ml buferio intarpinių kūnelių kiekiui, išskirtam iš 1 g biomasės, ir centrifuguoti. Plovimo buferių sudėtis tokia: I buferis -10 mM Tris-HCI, 1 M NaCI, 0,1% polisorbatas80, pH 7,4; II buferis - 10 mM Tris-HCI, 6 M karbamidas, pH 8,0; III buferis - 10 mM Tris-HCI, pH 8,0. Po preliminaraus plovimo intarpiniai kūneliai buvo suspenduoti 60 ml 25 mM Gly/NaOH buferio, pH 9,6, kurio sudėtyje buvo 6 M guanidino hidrochlorido (GdmCI) ir 20 mM DTT. Tirpinama (soliubilizuojama) nuolat maišant 2 vai. +4 °C temperatūroje. Paskui intarpinių kūnelių soliubilizatas centrifuguotas 30 min. +4 °C temperatūroje 12000 aps./min. greičiu.

Visais tirtais atvejais persivyniojimas vyko, skiedžiant intarpinių kūnelių tirpalą iš viso 16 kartų. Tam tikslui 56 ml IB tirpalo išpilama j refoldavimo buferį, nustatytą laiką (40-120 vai.) švelniai maišant gautą tirpalą +4 °C temperatūroje. Refoldavimo buferis buvo sudarytas iš 25 mM glicino/NaOH buferio, pH 9,6, turinčio 1,2 M NaCI, 0,5 M LArg ir pasirinktą redukuoto/oksiduoto glutationo porą GSH / GSSG santykiu 5,0 mM :

0,25 mM.

Pirmoji chromatografinio gryninimo pakopa - persivyniojusio sulieto baltymo chromatografija per fenil-Sefarozės FF kolonėlę. Šis chromatografijos etapas iš esmės skirtas korektiškai susivyniojusį baltymą atskirti nuo likutinio (0,375 M) GdmCI, kurio buvimas riboja galimybes panaudoti kitą įprastinę rekombinantiniu baltymų chromatografinio gryninimo procedūrą. Taigi, po persivyniojimo stadijos sulieto baltymo tirpalas pakraunamas į fenil-Sefarozės FF kolonėlę su 20 mM TrisHCI buferio, pH 8,2, kurio sudėtyje yra 1,5 M NaCI, ir išplaunamas iš kolonėlės, naudojant 10 mM TrisHCI buferį, pH 9,2, į kurį nepridėta druskų. Toliau išplauto baltymo chromatografija atliekama per anijonitus. Buvo patikrinta Q-Sefarozės FF terpė ir DEAE-Sefarozės FF anijonitas. Trečiai chromatografinio gryninimo pakopai buvo pasirinkta SP-Sefarozės FF kolonėlė, pH 5,5. Iš šios kolonėlės gauto sulieto baltymo porcija buvo perskirta į dvi dalis, iš kurių viena buvo acetatinio buferio sistemoje, o kitoje buferis pakeistas į PBS. Abi baltymo turinčios dalys koncentruotos iki 1 mg/ml, steriliai filtruotos ir išpilstytos alikvotinėmis dalimis stabilumui įvertinti, užšaldant -80 °C temperatūroje ir užšaldymoatitirpinimo ciklo metu. Abu preparatai pasirodė esą stabilūs.

Masių spektrometru gauti duomenys patvirtino, kad IFN alfa-2b ir IFN alfa-5 partnerių suliejimo polipeptidinė grandinė buvo taisyklinga, su IFN alfa-2b seka Ngaluose. Nustatytoji suliejimo molekulinė masė gerai atitiko apskaičiuotą molekulinę masę. Abu suliejimo partneriai atpažino atitinkamus specifinius antikūnus (Fig. 5), kas parodo, kad abu jie yra korektiškai susivynioję. Apibendrinant, šiame pavyzdyje pateikti duomenys įrodo, kad genetinis IFN alfa-2b ir IFN alfa-5 suliejimas duoda naują darinį, kurį galima gaminti išlaikant priimtinos kokybės požymius koncepcijos įrodymo tyrimams.

pavyzdys. CHIMERINIO BALTYMO GRYNUMO NUSTATYMAS SE-HPLC

BŪDU

Chimeros monomero lygis išgrynintame mėginyje buvo nustatytas pusiau kiekybiniu metodu, naudojant SE-HPLC būdą. Jokių specialių mėginių paruošimo veiksmų nesiimta.

Įleidžiamo mėginio kiekis įvertintas pagal chromatografinės frakcijos sugerties vidurkį. Pagrindinė chimeros smailė nustatyta naudojant MS analizę.

SE-HPLC eksperimentiniai rodikliai:

Judančioji fazė: A - 50 mM natrio fosfato, pH 7,0, 0,4 M natrio chlorido

Kolonėlė: Tosoh TSKgel30 WXL, 7,8 x 300 mm, dalelių dydis - 5 pm

Chromatografijos sistema: VValters HPLC sistema Alliance

Aptikimo bangų ilgis: 280 nm

Srauto greitis: 1 ml/min.

Išgryninto IFNa2b-IFNa5 sulieto baltymo SE-HPLC rezultatai pateikti Fig. 6. Iš šio chromatografinio vaizdo matyti, kad sulieto baltymo monomerų kiekis yra daugiau nei 98 %.

pavyzdys. PEPTIDŲ ŽEMĖLAPIAI pi tiriamo tirpalo (1 mg/ml) įpilama į 200 pi mėgintuvėlį su 2,8 pi 1,0 mg/ml tripsino tirpalo. Įpilama 1,6 pi 1,0 M kalio fosfato buferio, pH 8,0, paskui 3,6 pi vandens, ir mėgintuvėlio turinys kruopščiai išmaišomas. 5 sekundes centrifuguojama 6000 aps./min. greičiu, paskui tirpalai 18 valandų inkubuojami 37 °C temperatūroje aparate Thermomixer Comfort. Po inkubavimo 100 pi 6,0 M Gu-HCI tirpalo įpilama į mėgintuvėlį ir pridedama 7 pi 1,0 M DTT tirpalo. Mėgintuvėlį 1 minutei pamerkia į verdantį vandenį, o paskui paruošti mėginiai paliekami aušti iki kambario temperatūros.

lentelė

Parametras	Reikšmė (pastabos)
UV detektorius	Bangų ilgis	214 nm
Temperatūra	Kolonėlė	30 °C
Mėginio laikymo sąlygos	6 °C
Tirpiklio tvarkymo priemonė	A judančiosios fazės kanalas	A judančioj! fazė (dejonizuotas vanduo su 0,1 % TFA)
B judančiosios fazės kanalas	B judančioj! fazė (acetonitrilas su 0,1 % TFA)
Judančiosios fazės Judančios fazės srauto nraitis	1 ml/min

lentelė

HPLC sistemos programa

N r.	Laikas, min.	A, %	B, %	Pastabos
1	0,01	100,0	0,0	Paleidimas
2	8,00	100,0	0,0	Izokratinė
3	68,00	40,0	60,0	Linijinis gradientas
4	72,00	40,0	60,0	Izokratinė
5	75,00	100,0	0,0	Linijinis gradientas
6	90,00	100,0	0,0	Pusiausvirinimas

HPLC kolonėlė: VVaters Symmetry 3000 C18 4,6 x 250 mm

Peptidų žemėlapių sudarymo rezultatai pateikti Fig. 8. Iš HPLC chromatogramų akivaizdu, kad naujas sulietų baltymų darinys pasižymi visomis smailėmis, kurios yra atskirų partnerių peptidų žemėlapiuose.

pavyzdys. PASIRINKTŲ SULIETŲ IFNa-5 BALTYMŲ BIOLOGINIS AKTYVUMAS

Iš ATCC kultūrų kolekcijos buvo gauti negroidų gimdos kaklelio karcinomos ląstelės Hep2c ir pelių encefalomiokardito virusas (EMCV). Hep2c ląstelės augintos RPMI 1640 terpėje, papildytoje 10 % karščiu inaktyvuoto naujagimių veršelių serumo ir 1,5 g/l natrio bikarbonato. Ląstelių laikymo tankis - (5-6) χ 10⁵. EMCV buvo daugintas pelės fibroblastų L-929 ląstelėse.

Interferono alfa 5 ir jo sulietų baltymų biologinis antivirusinis aktyvumas nustatytas atliekant EMCV citopatinio poveikio (CPE) tyrimą. Virusas titruotas iš sankaupų ant Hep2c ląstelių. Šio būdo principas yra aprašytas Armstrong (1971). Visi viruso skiedimai atlikti RPMI 1640 terpėje, papildytoje 2 % karščiu inaktyvuoto naujagimių veršelių serumo. Hep2c ląstelės pasėtos 96 šulinėlių plokštelėje 1 dieną prieš užkrėtimą (koncentracija 5-6 χ 10⁵ ląstelių/ml); tuo pat metu ląstelės apdorotos (trim egzemplioriais) su 50 pL mitybos terpės, turinčios įvairių koncentracijų chimerinių IFNa preparatų. Po 20-24 vai. inkubavimo 37 °C temperatūroje, 5 % CO2, Hep2c buvo užkėstos su dvidešimčia sankaupas sudarančių EMCV vienetų. Kontroliniai šulinėliai apdoroti EMCV ir Hep2c be IFN, tik su Hep2c ir tik su terpe. Po 24 vai. inkubavimo kontroliniuose virusų mėginiuose stebint mikroskopu turėtų matytis 90-100 % CPE, ir inkubavimą galima nutraukti. Kartais gali prireikti ilgesnio inkubavimo. Terpė iš kiekvieno šulinėlio ištraukiama, ir ląstelės nudažomos 0,05 % (m/t 20 % etanolyje) kristalinio violetinio tirpalo. Po 30 min. kristalinio violetinio tirpalas dekantuojamas ir šulinėliai atsargiai praplaunami vandeniu, džiovinami ir pridedama eliuavimo tirpalo (50 % etanolio su 0,05 % acto rūgšties). Kristaliniu violetiniu dažytų šulinėlių sugertis nustatoma mikroplokšteliniu skaitytuvu (yOuant, BioTek) ties 570 nm.

Įvairių IFNa5 preparatų biologinis aktyvumas buvo apskaičiuotas pagal tarptautinį interferono alfa-2b (gauto iš žmogaus rDNR) standartą, NIBSC produkto Nr. 95/566,70000 TV/ampulėje, ir išreikštas tarptautiniais vienetais (TV). Kontrolei (be IFN ir be EMCV) buvo priskirtos 0 % ir 100 % apsaugos reikšmės, atitinkamai. Indeliuose, kur degeneracija buvo 50 % mažesnė, negu kontroliniuose viruso mėginiuose, pripažintas interferono efektas.

Citopatinio poveikio sumažinimo tyrimo rezultatai iš esmės atitiko sigmoidinę dozės-atsako kreivę, kai interferono koncentracija (interferono skiedimo atvirkštinis logaritmas) buvo pavaizduota priklausomai nuo dėmes sugerties. Interferono koncentracija (skiedimo atvirkštinis logaritmas) buvo išreikšta kreive priklausomai nuo dėmės sugerties interferono etaloniniam preparatui, kalibruotam tarptautiniais vienetais, ir interferono tirtiems tirpalams. Naudojant linijinę kreivės dalį, interferono koncentracija mėginyje buvo apskaičiuota palyginus tiriamojo ir etaloninio tirpalų atsakus. Statistinės programos PLA 2,0 versija naudota lygiagretiems tyrimams skaičiuojant visų eksperimentinių pavyzdžių biologinį potencialą. Visi skaičiavimai atlikti tyrimų rezultatų, gautų per 2 dienas x iš 2 plokštelių per dieną pagrindu, kur standartinio ir tiriamojo tirpalų titravimas atliktas tris kartus. Rezultatai pateikti lentelėje žemiau. Galima matyti, kad visiems trims sulietiems variantams buvo būdingas toks pat biologinis aktyvumas, kaip ir IFNa5 baltymui.

lentelė

Interferono a preparatas	Koncentracija, mg/ml	Antivirusinis bioaktyvumas, χ 108TV/mg
IFNa2b	8,11	1,77
IFNa5	8,79	0,72
IFNa5 ir IFNa2b mišinys	8,45	1,24
IFNa2b-IFNa5	1,30	0,07
IFNa5-IFNa5	1,53	0,29
IFNa5-OSM	0,98	0,21

Kartu su sulietų IFNa5 baltymų biologinio aktyvumo išsaugojimu buvo tiriamas sulietų baltymų aktyvumas kaip antivirusinių agentų užkrėstų žiurkių organizme. Šiuose tyrimuose vienas vienetas buvo apibrėžtas kaip interferono kiekis mililitrui, reikalingas virusinės infekcijos citopatiniam poveikiui sumažinti 50 %. Pavyzdžiui, IFNa5 žiurkių kraujo serume, ITV/ml, stebėtas 6 vai., buvo intervale nuo 208 TV/ml praėjus 0,5 vai. po injekcijos iki 61,22 TV/ml praėjus šešioms valandoms. Sulieto IFNa2b-IFNa5 baltymo kiekis buvo intervale nuo 191 TV/ml (0,5 vai.) iki 54 TV/ml (6 vai.), o IFNa5-IFNa5 homodimeras, stebėtas 2 valandomis ilgiau, iki 8 valandų, demonstravo pastovų 40-46 TV/ml aktyvumą per visą tirtąjį 0,5-8 vai. laikotarpį.

Iš šio tyrimo matyti, kad sulieti IFNa5 baltymai pasižymi netgi geresnėmis savybėmis, lyginant su IFNa5 baltymais. Pavyzdžiui, IFNa2b-IFNa5 antivirusinis aktyvumas žiurkių organizme buvo toks pat, nors in vitro biologinis aktyvumas buvo gana žemas. IFNa5-IFNa5 parodė ilgai trunkantį antivirusinį aktyvumą žiurkėse.

Pramoninis pritaikomumas

Šiame patente siūloma universali virusinių infekcijų ir vėžinių ligų gydymo platforma - sulieti IFNa5 baltymai. Priklausomai nuo kito kartu dalyvaujančio citokino, šiuos baltymus galima panaudoti gydant platų ligų spektrą, įskaitant virusines infekcijas, kepenų ligas ir vėžį. Pateiktas išradimas apima visumą būdų, tinkamų baltymui klonuoti, kultivuoti, gryninti ir formuluoti taip, kad jj būtų galima panaudoti įvairiuose bandymuose su gyvūnais ir ikiklinikiniuose tyrimuose.

SEKŲ SĄRAŠAI <110> UAB Biotechnologinės farmacijos centras BIOTECHPHARMA <120> SULIETI INTEREFERONO-ALFA 5 BALTYMAI SU KITU CITOKINŲ

IR JŲ GAMYBOS BŪDAS <130> 2830 <160> 24 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 333 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 1

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu 15 10 15

Met Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys 20 25 30

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln 35 40 45

Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Vai Leu His Glu Met Ile Gln Gln 50 55 60

Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu 65 70 75 80

Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp 85 90 95

Leu Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Vai Gly Vai Glu Asp Thr Pro Leu 100 105 110

Met Asn Vai Asp Ser Ile Leu Thr Vai Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile 115 120 125

Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai 130 135 140

Vai Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ala Asn Leu Gln 145 150 155 160

Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 165 170 175

Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser

180 185 190

Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu

195 200 205

Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Vai Leu 210 215 220

His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser 225 230 235 240

Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu 245 250 255

Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Vai Gly 260 265 270

Vai Glu Asp Thr Pro Leu Met Asn Vai Asp Ser Ile Leu Thr Vai Arg 275 280 285

Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser 290 295 300

Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser 305 310 315 320

Leu Ser Ala Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu 325 330 <210> 2 <211> 332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu 15 10 15

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys 20 25 30

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe 35 40 45

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Vai Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile 50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

90 95

Glu Ala Cys Vai Ile Gln Gly Vai Gly Vai Thr Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110

Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Vai Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai 130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser 165 170 175

Asn Arg Arg Thr Leu Met Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro 180 185 190

Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu 195 200 205

Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Vai Leu His 210 215 220

Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser 225 230 235 240

Ala Thr Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr 245 250 255

Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Vai Gly Vai 260 265 270

Glu Asp Thr Pro Leu Met Asn Vai Asp Ser Ile Leu Thr Vai Arg Lys 275 280 285

Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro 290 295 300

Cys Ala Trp Glu Vai Vai Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu 305 310 315 320

Ser Ala Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu 325 330 <210> 3 <211> 332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu

10 15

Met Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys 20 25 30

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln 35 40 45

Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Vai Leu His Glu Met Ile Gln Gln 50 55 60

Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu 65 70 75 80

Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp 85 90 95

Leu Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Vai Gly Vai Glu Asp Thr Pro Leu 100 105 110

Met Asn Vai Asp Ser Ile Leu Thr Vai Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile 115 120 125

Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai 130 135 140

Vai Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ala Asn Leu Gln 145 150 155 160

Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 165 170 175

Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser 180 185 190

Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu 195 200 205

Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Vai Leu His 210 215 220

Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser 225 230 235 240

Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr 245 250 255

Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Vai lle Gln Gly Vai Gly Vai 260 265 270

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser lle Leu Ala Vai Arg Lys 275 280 285

Tyr Phe Gln Arg lle Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro 290 295 300

Cys Ala Trp Glu Vai Vai Arg Ala Glu lle Met Arg Ser Phe Ser Leu 305 310 315 320

Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu 325 330 <210> 4 <211> 363 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu 15 10 15

Met lle Met Ala Gln Met Gly Arg lle Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys 20 25 30

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln 35 40 45

Phe Gln Lys Ala Gln Ala lle Ser Vai Leu His Glu Met lle Gln Gln 50 55 60

Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu 65 70 75 80

Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp 85 90 95

Leu Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Vai Gly Vai Glu Asp Thr Pro Leu 100 105 110

Met Asn Vai Asp Ser lle Leu Thr Vai Arg Lys Tyr Phe Gln Arg lle 115 120 125

Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai 130 135 140

Vai Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ala Asn Leu Gln 145 150 155 160

Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser Lys Glu 165 170 175

Tyr Arg Vai Leu Leu Gly Gln Leu Gln Lys Gln Thr Asp Leu Met Gln 180 185 190

Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp Pro Tyr Ile Arg Ile Gln Gly Leu Asp 195 200 205

Vai Pro Lys Leu Arg Glu His Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro 210 215 220

Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gln Thr 225 230 235 240

Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys Vai Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu 245 250 255

Gln Arg Leu Pro Lys Ala Gln Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu Asn Ile 260 265 270

Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gln Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu Gly Leu 275 280 285

Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met Ala Gln Leu Leu Asp Asn Ser Asp Thr 290 295 300

Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly Arg Gly Ala Ser Gln Pro Pro Thr Pro 305 310 315 320

Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe Gln Arg Lys Leu Glu Gly Cys Arg Phe 325 330 335

Leu His Gly Tyr His Arg Phe Met His Ser Vai Gly Arg Vai Phe Ser 340 345 350

Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn Arg Ser Arg Arg 355 360 <210> 5 <211> 363 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Met Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Vai Leu Leu Gly 15 10 15

Gln Leu Gln Lys Gln Thr Asp Leu Met Gln Asp Thr Ser Arg Leu Leu 20 25 30

Asp Pro Tyr Ile Arg Ile Gln Gly Leu Asp Vai Pro Lys Leu Arg Glu 35 40 45

His Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg 50 55 60

Gly Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gln Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly 65 70 75 80

Cys Vai Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gln Arg Leu Pro Lys Ala 85 90 95

Gln Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu 100 105 110

Gln Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys 115 120 125

Met Ala Gln Leu Leu Asp Asn Ser Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala 130 135 140

Gly Arg Gly Ala Ser Gln Pro Pro Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala 145 150 155 160

Phe Gln Arg Lys Leu Glu Gly Cys Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg 165 170 175

Phe Met His Ser Vai Gly Arg Vai Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro 180 185 190

Asn Arg Ser Arg Arg Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn 195 200 205

Arg Arg Thr Leu Met Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe 210 215 220

Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe 225 230 235 240

Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Vai Leu His Glu 245 250 255

Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala

260 265 270

Thr Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln 275 280 285

Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Vai Gly Vai Glu 290 295 300

Asp Thr Pro Leu Met Asn Vai Asp Ser Ile Leu Thr Vai Arg Lys Tyr 305 310 315 320

Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys 325 330 335

Ala Trp Glu Vai Vai Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser 340 345 350

Ala Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu 355 360 <210> 6 <211> 1002 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinė koduojanti seka <400> 6 atgtgtgatc tgccgcagac ccactccctg tctaaccgtc gtactctgat gatcatggca 60 cagatgggtc gtatctctcc tttctcctgc ctgaaggaca gacatgactt tggatttcct 120 caggaggagt ttgatggcaa ccagttccag aaggctcaag ccatctctgt cctccatgag 180 atgatccagc agaccttcaa tctcttcagc acaaaggact catctgctac ttgggatgag 240 acacttctag acaaattcta cactgaactt taccagcagc tgaatgacct ggaagcctgt 300 atgatgcagg aggttggagt ggaagacact cctctgatga atgtggactc tatcctgact 360 gtgagaaaat actttcaaag aatcactctc tatctgacag agaagaaata cagcccttgt 420 gcatgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatccttct ctttatcagc aaacttgcaa 480 gaacgtttac gtcgtaagga atgtgatctg ccgcagaccc actccctgtc taaccgtcgt 540 actctgatga tcatggcaca gatgggtcgt atctctcctt tctcctgcct gaaggacaga 600 catgactttg gatttcctca ggaggagttt gatggcaacc agttccagaa ggctcaagcc 660 atctctgtcc tccatgagat gatccagcag accttcaatc tcttcagcac aaaggactca 720 tctgctactt gggatgagac acttctagac aaattctaca ctgaacttta ccagcagctg 780 aatgacctgg aagcctgtat gatgcaggag gttggagtgg aagacactcc tctgatgaat 840 gtggactcta tcctgactgt gagaaaatac tttcaaagaa tcactctcta tctgacagag 900 aagaaataca gcccttgtgc atgggaggtt gtcagagcag aaatcatgag atccttctct 960 ttatcagcaa acttgcaaga acgtttacgt cgtaaggaat aa 1002 <210> 7 <211> 999 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinė koduojanti seka <400> 7 atgtgtgatc tgccgcagac ccactccctg tctaaccgtc gtactctgat gatcatggca 60 cagatgggtc gtatctctcc tttctcctgc ctgaaggaca gacatgactt tggatttcct 120 caggaggagt ttgatggcaa ccagttccag aaggctcaag ccatctctgt cctccatgag 180 atgatccagc agaccttcaa tctcttcagc acaaaggact catctgctac ttgggatgag 240 acacttctag acaaattcta cactgaactt taccagcagc tgaatgacct ggaagcctgt 300 atgatgcagg aggttggagt ggaagacact cctctgatga atgtggactc tatcctgact 360 gtgagaaaat actttcaaag aatcactctc tatctgacag agaagaaata cagcccttgt 420 gcatgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatccttct ctttatcagc aaacttgcaa 480 gaacgtttac gtcgtaagga atgtgatctg ccgcagactc actctctggg ttctcgtcgt 540 actctgatgc tgctggctca gatgcgtcgt atctctcttt tctcttgcct gaaagaccgt 600 catgacttcg gtttcccgca ggaagagttc ggtaaccagt tccagaaagc tgaaactatc 660 cctgttctgc atgaaatgat ccagcaaatc ttcaacctgt tctctactaa agactcttct 720 gctgcttggg acgaaaccct gctggacaaa ttctacactg aactgtacca gcaactcaac 780 gacctcgagg cttgtgttat tcagggcgtt ggtgttaccg aaactccgct gatgaaagag 840 gatagcatcc tggctgttcg caagtatttc cagcgtatca ctctttacct gaaggaaaag 900 aagtatagcc cgtgtgcttg ggaagttgtt cgtgctgaga tcatgcgttc cttctccctg 960 tctactaacc tgcaggaatc tctgcgttct aaggaatag 999 <210> 8 <211> 999 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinė koduojanti seka <400> 8 atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60 cagatgcgtc gtatctctct tttctcttgc ctgaaagacc gtcatgactt cggtttcccg 120 caggaagagt tcggtaacca gttccagaaa gctgaaacta tccctgttct gcatgaaatg 180 atccagcaaa tcttcaacct gttctctact aaagactctt ctgctgcttg ggacgaaacc 240 ctgctggaca aattctacac tgaactgtac cagcaactca acgacctcga ggcttgtgtt 300 attcagggcg ttggtgttac cgaaactccg ctgatgaaag aggatagcat cctggctgtt 360 cgcaagtatt tccagcgtat cactctttac ctgaaggaaa agaagtatag cccgtgtgct 420 tgggaagttg ttcgtgctga gatcatgcgt tccttctccc tgtctactaa cctgcaggaa 480 tctctgcgtt ctaaggaatg tgatctgccg cagacccact ccctgtctaa ccgtcgtact 540 ctgatgatca tggcacagat gggtcgtatc tctcctttct cctgcctgaa ggacagacat 600 gactttggat ttcctcagga ggagtttgat ggcaaccagt tccagaaggc tcaagccatc 660 tctgtcctcc atgagatgat ccagcagacc ttcaatctct tcagcacaaa ggactcatct 720 gctacttggg atgagacact tctagacaaa ttctacactg aactttacca gcagctgaat 780 gacctggaag cctgtatgat gcaggaggtt ggagtggaag acactcctct gatgaatgtg 840 gactctatcc tgactgtgag aaaatacttt caaagaatca ctctctatct gacagagaag 900 aaatacagcc cttgtgcatg ggaggttgtc agagcagaaa tcatgagatc cttctcttta 960 tcagcaaact tgcaagaacg tttacgtcgt aaggaataa 999 <210> 9 <211> 1092 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinė koduojanti seka <400> 9 atgtgtgatc tgccgcagac ccactccctg tctaaccgtc gtactctgat gatcatggca 60 cagatgggtc gtatctctcc tttctcctgc ctgaaggaca gacatgactt tggatttcct 120 caggaggagt ttgatggcaa ccagttccag aaggctcaag ccatctctgt cctccatgag 180 atgatccagc agaccttcaa tctcttcagc acaaaggact catctgctac ttgggatgag 240 acacttctag acaaattcta cactgaactt taccagcagc tgaatgacct ggaagcctgt 300 atgatgcagg aggttggagt ggaagacact cctctgatga atgtggactc tatcctgact 360 gtgagaaaat actttcaaag aatcactctc tatctgacag agaagaaata cagcccttgt 420 gcatgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatccttct ctttatcagc aaacttgcaa 480 gaacgtttac gtcgtaagga agcggctata ggcagctgct cgaaagagta ccgcgtgctc 540 cttggccagc tccagaagca gacagatctc atgcaggaca ccagcagact cctggacccc 600 tatatacgta tccaaggcct ggatgttcct aaactgagag agcactgcag ggagcgcccc 660 ggggccttcc ccagtgagga gaccctgagg gggctgggca ggcggggctt cctgcagacc 720 ctcaatgcca cactgggctg cgtcctgcac agactggccg acttagagca gcgcctcccc 780 aaggcccagg atttggagag gtctgggctg aacatcgagg acttggagaa gctgcagatg 840 gcgaggccga acatcctcgg gctcaggaac aacatctact gcatggccca gctgctggac 900 aactcagaca cggctgagcc cacgaaggct ggccgggggg cctctcagcc gcccaccccc 960 acccctgcct cggatgcttt tcagcgcaag ctggagggct gcaggttcct gcatggctac 1020 catcgcttca tgcactcagt ggggcgggtc ttcagcaagt ggggggagag cccgaaccgg 1080 agccggagataa 1092 <210> 10 <211> 1092 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinė koduojanti seka <400> 10 atggcggcta taggcagctg ctcgaaagag taccgcgtgc tccttggcca gctccagaag 60 cagacagatc tcatgcagga caccagcaga ctcctggacc cctatatacg tatccaaggc 120 ctggatgttc ctaaactgag agagcactgc agggagcgcc ccggggcctt ccccagtgag

180 gagaccctga gggggctggg caggcggggc ttcctgcaga ccctcaatgc cacactgggc 240 tgcgtcctgc acagactggc cgacttagag cagcgcctcc ccaaggccca ggatttggag 300 aggtctgggc tgaacatcga ggacttggag aagctgcaga tggcgaggcc gaacatcctc 360 gggctcagga acaacatcta ctgcatggcc cagctgctgg acaactcaga cacggctgag 420 cccacgaagg ctggccgggg ggcctctcag ccgcccaccc ccacccctgc ctcggatgct 480 tttcagcgca agctggaggg ctgcaggttc ctgcatggct accatcgctt catgcactca 540 gtggggcggg tcttcagcaa gtggggggag agcccgaacc ggagccggag atgtgatctg 600 ccgcagaccc actccctgtc taaccgtcgt actctgatga tcatggcaca gatgggtcgt 660 atctctcctt tctcctgcct gaaggacaga catgactttg gatttcctca ggaggagttt 720 gatggcaacc agttccagaa ggctcaagcc atctctgtcc tccatgagat gatccagcag 780 accttcaatc tcttcagcac aaaggactca tctgctactt gggatgagac acttctagac 840 aaattctaca ctgaacttta ccagcagctg aatgacctgg aagcctgtat gatgcaggag 900 gttggagtgg aagacactcc tctgatgaat gtggactcta tcctgactgt gagaaaatac 960 tttcaaagaa tcactctcta tctgacagag aagaaataca gcccttgtgc atgggaggtt 1020 gtcagagcag aaatcatgag atccttctct ttatcagcaa acttgcaaga acgtttacgt 1080 cgtaaggaataa 1092 <210> 11 <211> 27 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinis pradmuo <400> 11 attatcatat gtgtgatctg ccgcaga 27 <210> 12 <211> 25 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinis pradmuo <400> 12 ttccttacga cgtaaacgtt cttgc 25 <210> 13 <211> 41 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinis pradmuo <400> 13 ttccttacga cgtaaacgtt cttgctgtga tctgccgcag a 41 <210> 14 <211> 30 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinis pradmuo <400> 14 gacgtaaacg ttcttgctaa aagcttttaa 30 <210> 15 <211> 24 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinis pradmuo <400> 15 ttaacatatg tgtgatctgc cgca 24 <210> 16 <211> 30 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinis pradmuo <400> 16 ttccttagaa cgcagagatt cctgcaggtt 30 <210> 17 <211> 48 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinis pradmuo <400> 17 tttctgcagg aatctctgcg ttctaaggaa tgtgatctgc cgcagacc <210> 18 <211> 27 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinis pradmuo <400> 18 tttaagcttc tatctccggc tccggtt 27 <210> 19 <211> 38 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinis pradmuo <400> 19 ttaacgttta cgtcgtaagg aagcggctat aggcagct 38 <210> 20 <211> 24 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinis pradmuo <400> 20 aaacatatgg cggctatagg cagc 24 <210> 21 <211> 18 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinis pradmuo <400> 21 tctccggctc cggttcgg 18 <210> 22 <211> 39 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinis pradmuo <400> 22 agagcccgaa ccggagccgg agatgtgatc tgccgcaga 39 <210> 23 <211> 28 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinis pradmuo <400> 23 tacgtcgtaa aggaatgtga tcgccgca 28 <210> 24 <211> 23 <212> DNR <213> Dirbtinė seka <220>

<223> Sintetinis pradmuo <400> 24 aaaaagcttc tattccttag aac

Claims (20)

1. Sulietas baltymas, apimantis interferoną alfa 5 (IFNa5), kurio bendroji formulė (I) arba (II)

IFNa5-X X-IFNa5 (D d') kur suliejimo partneris X yra kitas interferonas alfa arba citokinas.

Išradimo apibrėžtis

2. Sulietas baltymas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad IFNa5 yra žmogaus rekombinantinis interferonas-alfa 5, ir X yra pasirinktas iš grupės, susidedančios iš IFNa5, INFa2b ir onkostatino.

3. Sulietas baltymas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad IFNa5 yra homodimeras, kurio aminorūgščių seka yra SEQ ID No: 1 arba seka, kurios identiškumas bent 95 %.

4. Sulietas baltymas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra IFNa2b-IFNa5 heterodimeras, kurio aminorūgščių seka yra SEQ ID No: 2 arba seka, kurios identiškumas bent 95 %.

5. Sulietas baltymas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra IFNa5-IFNa2b heterodimeras, kurio aminorūgščių seka yra SEQ ID No: 3 arba seka, kurios identiškumas bent 95 %.

6. Sulietas baltymas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra IFNa5-OSM heterodimeras, kurio aminorūgščių seka yra SEQ ID No: 4 arba seka, kurios identiškumas bent 95 %.

7. Sulietas baltymas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra 0SM-IFNa5 heterodimeras, kurio aminorūgščių seka yra SEQ ID No: 5 arba seka, kurios identiškumas bent 95 %.

8. Sulietas baltymas pagal bet kurį iš 1-7 punktų, besiskiriantis tuo, kad jis pasižymi būdingu IFNa5 biologiniu aktyvumu kartu su prailgintu pasišalinimo iš organizmo laiku.

9. DNR fragmentas, koduojantis sulietą baltymą pagal bet kurį iš 1-8 punktų, kur koduojanti seka yra pasirinkta iš grupės, susidedančios iš SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 arba sekos, koduojančios tą patį baltymą.

10. Vektorius, apimantis DNR fragmentą pagal 9 punktą, koduojantį sulietą baltymą pagal 1-8 punktą, kur minėtas vektorius yra pasirinktas iš grupės, susidedančios iš pET21b+, pET28a+, pUC57/T ir pT7, geriau pET21b+.

11. Sulieto baltymo pagal 1-8 punktus gamybos būdas, kuriame:

a) paruošia ląstelę šeimininkę, galinčią produkuoti minėtą IFNa5 sulietą baltymą;

b) kultivuoja ląsteles šeimininkes sąlygomis, efektyviomis ekspresuoti minėtą IFNa5 sulietą baltymą tinkamoje fermentacijos terpėje; ir

c) išskiria ir grynina ekspresuotą IFNa5 sulietą baltymą, besiskiriantis tuo, kad

- minėtas išskyrimas yra išskyrimas iš b) stadijoje gauto mišinio, apimančio tikslinį sulietą baltymą intarpinių kūnelių pavidalu, vykdant jų tirpinimą ir po to - oksidacinę renatūraciją; ir

- minėtas gryninimas yra trijų pakopų chromatografinis gryninimas, kuriame:

minėtą mišinį, apimantį renatūruotą IFNa5 sulietą baltymą, apdoroja hidrofobinės sąveikos chromatografija;

po to gautą prieš tai einančioje pakopoje mišinį veikia anijonų mainų chromatografija;

ir toliau gautą ankstesnėje pakopoje tirpalą grynina katijonų mainų chromatografija.

12. Būdas pagal 11 punktą, kur ląstelė šeimininkė yra pasirinkta iš grupės, susidedančios iš E.coli, S.cerevisiae, K.lactis, optimaliai E.coli, geriau proteazių neturinčio E.coli kamieno, tokio kaip E.coli BL21 ir Rosetta gami-2, geriausiai - E.coli BL21, ir kur tinkama fermentacijai terpė yra bet kuri sudėtinė terpė, apimanti mielių ekstraktą kaip azoto šaltinį ir gliukozę kaip anglies šaltinį, optimaliai M9m terpė.

13. Būdas pagal 11-12 punktus, kur efektyvios ekspresuoti minėtą IFNa5 sulietą baltymą sąlygos apimą indukciją, optimaliai su ΐζορΓορϋ-β-ϋtiogalaktopiranozidu (IPTG), optimaliai esant 0,1mM - 1mM IPTG koncentracijai, geriausiai 0,5 mM, ir indukcija nebūtinai yra perkelta j ankstyvą auginimo stadiją.

14. Būdas pagal 11-13 punktus, kur minėtą tirpinimą atlieka chaotropiniame ir denatūruojančiame tirpale, kuris apima 6-8 M karbamidą arba 4-6 M guanidino hidrochloridą, optimaliai 6 M guanidino hidrochloridą, nebūtinai turintį 20 mM DTT.

15. Būdas pagal 11-14 punktus, kur minėtą oksidacinę renatūraciją vykdo glicino/NaOH buferyje pH intervale 7,0 - 9,6 ir esant redukuotojo/oksiduotojo glutationo poros GSH/GSSG santykiui 5-20:1 su buferinę talpą turinčiais priedais, pasirinktais iš grupės, susidedančios iš natrio chlorido, natrio sulfato ir amonio sulfato.

16. Būdas pagal 11-15 punktus, kur minėtame 3 pakopų chromatografinio gryninimo hidrofobinės sąveikos chromatografijos sorbentas yra pasirinktas iš grupės, susidedančios iš butil-Sefarozės, oktil-Sefarozės, fenil-Sefarozės, optimaliai yra fenilSefarozė, pH esant intervale 8,2-9,2; ir anijonų mainų chromatografijos sorbentas yra pasirinktas iš grupės, susidedančios iš ΑΝΧ -Sefarozės, Q-Sefarozės, DEAE-Sefarozės, QAE-Sefarozės, optimaliai QSefarozės arba DEAE-Sefarozės, pH esant intervale 8,6-9,0; ir katijonų mainų chromatografijos sorbentas yra pasirinktas iš grupės, susidedančios iš

S-Sefarozės, SP-Sefarozės ir CM-Sefarozės, optimaliai SP-Sefarozės arba CMSefarozės, pH esant intervale 5,2-5,6.

17. Sulietas baltymas pagal 1-8 punktus, gautas būdu pagal 11-16 punktus.

18. Preparatas, apimantis sulietą baltymą pagal 17 punktą stabilaus tirpalo formoje.

19. Sulietas baltymas pagal 17 punktą arba preparatas pagal 18 punktą, skirti naudoti terapijoje.

20. Farmacinė kompozicija, apimanti sulieto baltymo pagal 1-8 punktus arba preparato pagal 18 punktą terapiškai veiksmingą kiekį, ir farmaciniu požiūriu priimtiną nešiklį, ekscipientą ir/arba pagalbines medžiagas.