JPS60226821A - 化学修飾リンホカインおよびその製造法 - Google Patents
化学修飾リンホカインおよびその製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、化学修飾リンホカインおよびその製造法に関
する。
する。
従来の技術
従来から、インタ−フェロン（以下ＩＦＮと略記するこ
とがある）あるいはインターロイキン〜２（以下ＩＬ−
２と略記することがある）など有用なリンホカインが知
られていたが、近年、遺伝子組み換え技術の発展にとも
ない、これらリンホカインを大量に合成することが可能
になってきた。
とがある）あるいはインターロイキン〜２（以下ＩＬ−
２と略記することがある）など有用なリンホカインが知
られていたが、近年、遺伝子組み換え技術の発展にとも
ない、これらリンホカインを大量に合成することが可能
になってきた。
しかしながら、生体に投与されたリンホカインの生体内
におけるクリアランスは、一般に非常に早いことが知ら
れている。またリンホカインが異種動物から得られたも
のである場合には、場合により、抗体が産生され、重篤
な症状を引き起こす危険が予想される。従って、これら
を医薬として用いるに際しては、その活性を保持したま
ま、クリアランスを遅延させ、さらにその抗原性を減弱
させる技術の開発が望まれている。この目的を達成する
ために、リンホカインを化学的に修飾する方法はきイつ
めて有効な手段である。すなわち化学修飾によって、上
記の生体内におけるクリアランスの遅延、抗原性の減弱
、さらには生理活性の増強が期待され、リンホカインの
化学修飾の実用的意義はきわめて大きい。
におけるクリアランスは、一般に非常に早いことが知ら
れている。またリンホカインが異種動物から得られたも
のである場合には、場合により、抗体が産生され、重篤
な症状を引き起こす危険が予想される。従って、これら
を医薬として用いるに際しては、その活性を保持したま
ま、クリアランスを遅延させ、さらにその抗原性を減弱
させる技術の開発が望まれている。この目的を達成する
ために、リンホカインを化学的に修飾する方法はきイつ
めて有効な手段である。すなわち化学修飾によって、上
記の生体内におけるクリアランスの遅延、抗原性の減弱
、さらには生理活性の増強が期待され、リンホカインの
化学修飾の実用的意義はきわめて大きい。
発明が解決しようとする問題点
一般に生理活性蛋白質の化学修飾を行うにあたっては、
それらの生理活性を保持したまま、化学修飾を行ない得
る方法が必要である。ポリエチレングリコールメチルエ
ーテルは、このもの自体か抗原性を有しないと考えられ
ているため、蛋白質の化学修飾に用いられているが、該
物質の蛋白質への導入は塩化シアヌルを用いる方法が一
般的である。しかしながら、同時に結合基として導入さ
れる塩化シアヌルはそれ自体安全性に問題があり、かつ
またその生体内における分解物の安全性？こついても解
明されておらず、その使用は慎重を期す必要がある。ま
た反応に際しても、アルカリ側のｐＨを必要とし、アル
カリ性で失活しやすい蛋白質に関しては、本法を適用で
きない欠点がある。
それらの生理活性を保持したまま、化学修飾を行ない得
る方法が必要である。ポリエチレングリコールメチルエ
ーテルは、このもの自体か抗原性を有しないと考えられ
ているため、蛋白質の化学修飾に用いられているが、該
物質の蛋白質への導入は塩化シアヌルを用いる方法が一
般的である。しかしながら、同時に結合基として導入さ
れる塩化シアヌルはそれ自体安全性に問題があり、かつ
またその生体内における分解物の安全性？こついても解
明されておらず、その使用は慎重を期す必要がある。ま
た反応に際しても、アルカリ側のｐＨを必要とし、アル
カリ性で失活しやすい蛋白質に関しては、本法を適用で
きない欠点がある。
また米国特許第４，００２，５３１号は酵素のモノアル
キルポリエチレングリコール誘導体の製造法を開示して
いるか、そこに開示されたｐＨ８，５で水素化ホウ素ナ
トリウムを用いる方法をリンホカインに適用すると、そ
の生理活性を失活されるおそれがあり有効な製造法とは
なり得ず、さらに該特許文献は酵素誘導体の生体内にお
けるクリアランスの遅延効果に関し示唆すらなく、その
効果については不明である。
キルポリエチレングリコール誘導体の製造法を開示して
いるか、そこに開示されたｐＨ８，５で水素化ホウ素ナ
トリウムを用いる方法をリンホカインに適用すると、そ
の生理活性を失活されるおそれがあり有効な製造法とは
なり得ず、さらに該特許文献は酵素誘導体の生体内にお
けるクリアランスの遅延効果に関し示唆すらなく、その
効果については不明である。
さらに、生理活性蛋白質にホルムアルデヒド。
アセトアルデヒド、ベンツアルデヒド、ピリドキサール
などの低分子のアルデヒドをホウ素系還元剤の存在下に
導入する方法［メソッド イン エンザイモロジー、第
４７巻、４６９−４７８頁（１９７７）コ；特開昭５８
−１５４５９６号公報］が知られている。しかしながら
当該方法をリンホカイン？こ適用しても有効なりリアラ
ンスの遅延化は達成されず、抗原性の低下は期待されな
いのみならず、導入された低分子のアルデヒドがハプテ
ンとして作用して咳リンホカインに免疫原性を与える可
能性がある。
などの低分子のアルデヒドをホウ素系還元剤の存在下に
導入する方法［メソッド イン エンザイモロジー、第
４７巻、４６９−４７８頁（１９７７）コ；特開昭５８
−１５４５９６号公報］が知られている。しかしながら
当該方法をリンホカイン？こ適用しても有効なりリアラ
ンスの遅延化は達成されず、抗原性の低下は期待されな
いのみならず、導入された低分子のアルデヒドがハプテ
ンとして作用して咳リンホカインに免疫原性を与える可
能性がある。
本発明者らは、これらの欠点を解決すべく、鋭意研究を
行′ない、本発明を完成した。
行′ない、本発明を完成した。
問題を解決するための手段
本発明は、分子中の少なくとも１個の一部アミノ基に、
Ｒ−（０−ＣＨ２＝ＣＨｒ）基（Ｉ ：Ｒは末端酸素の
保護基、ｎは任意に変わりうる正の整数）を直接結合し
てなる化学修飾リンホカインおよびその製造法を提供す
るものである。
Ｒ−（０−ＣＨ２＝ＣＨｒ）基（Ｉ ：Ｒは末端酸素の
保護基、ｎは任意に変わりうる正の整数）を直接結合し
てなる化学修飾リンホカインおよびその製造法を提供す
るものである。
本願明細書において、リンホカインは、リンパ球から遊
離する細胞性免疫に関与する可溶性因子およびそれらと
同等の生理活性を有する物質を総称する。
離する細胞性免疫に関与する可溶性因子およびそれらと
同等の生理活性を有する物質を総称する。
すなわち、リンホカインは遺伝子工学産物、ヒトを含む
各種動物由来のもの１合成品等いずれでもよく、さらに
これらと類似構造を有し、同様の生理活性を有する物質
をも包含する。
各種動物由来のもの１合成品等いずれでもよく、さらに
これらと類似構造を有し、同様の生理活性を有する物質
をも包含する。
例えば、各種ＩＦＮ［インターフェロン−α（ＩＦＮ−
α）、インターフェロン−β（ＩＩ”Ｎ−β）。
α）、インターフェロン−β（ＩＩ”Ｎ−β）。
インターフェロン−γ（ＩＦＮ−７）］、ＩＬ−２゜マ
クロファージ分化因子（ＭＤＦ）、マクロファージ活性
化因子（ＭＡＰ）、テッンユプラスミノーゲン活性化因
子（ＴＰＡ）やこれら物質に構造が類俯しかつ同様の生
理活性を有する物質が挙げられる。
クロファージ分化因子（ＭＤＦ）、マクロファージ活性
化因子（ＭＡＰ）、テッンユプラスミノーゲン活性化因
子（ＴＰＡ）やこれら物質に構造が類俯しかつ同様の生
理活性を有する物質が挙げられる。
上記リンホカインに構造が類似しかつ同様の生理活性を
有する物質として、例えばＩＦ’Ｎ−γにおいてはその
Ｎ末端アミノ酸が２〜４個欠損したもの（Ｐ ＣＴ ／
Ｊ Ｐ ８４１００２９２明細書、 １９８４年６月
６日出願）やＣ末端部分を欠いた各種ＩＦＮ−γフラグ
メント（１５にスピーシーズなど）［特願昭５９−１９
６４９８号明細書、昭和５９年９月１９日出願］、また
ＩＬ−２においてはそのＮ末端から１個のアミノ酸（Ｅ
ＰＣ公開９１５３９号公報）または４個のアミノ酸（特
願昭５８−２３５６３８号明細書、昭和５８年１２月１
３日出願）を欠損したちのさらにその構成アミノ酸の一
部が欠損しているか他のアミノ酸に置換されたもの、例
えば１２５位のシスティンがセリンに置換されたもの（
特開昭５９−９３０９３号公報）などが挙げられる。
とりわけリンホカインがＩＦＮ−α。
有する物質として、例えばＩＦ’Ｎ−γにおいてはその
Ｎ末端アミノ酸が２〜４個欠損したもの（Ｐ ＣＴ ／
Ｊ Ｐ ８４１００２９２明細書、 １９８４年６月
６日出願）やＣ末端部分を欠いた各種ＩＦＮ−γフラグ
メント（１５にスピーシーズなど）［特願昭５９−１９
６４９８号明細書、昭和５９年９月１９日出願］、また
ＩＬ−２においてはそのＮ末端から１個のアミノ酸（Ｅ
ＰＣ公開９１５３９号公報）または４個のアミノ酸（特
願昭５８−２３５６３８号明細書、昭和５８年１２月１
３日出願）を欠損したちのさらにその構成アミノ酸の一
部が欠損しているか他のアミノ酸に置換されたもの、例
えば１２５位のシスティンがセリンに置換されたもの（
特開昭５９−９３０９３号公報）などが挙げられる。
とりわけリンホカインがＩＦＮ−α。
ＩＦＮ−γ ［１４６個のアミノ酸からなり、たとえば
ＲＰＣ公開第００８９６７６号公報に開示されているも
の１またはそのＮ末端アミノ酸が２個欠損したもの（Ｉ
ＦＮ−γｄ２）もしくは３個欠損したもの（ＩＦ’Ｎ−
γｄ３）、またはｒｌ、−２，であることが好ましい。
ＲＰＣ公開第００８９６７６号公報に開示されているも
の１またはそのＮ末端アミノ酸が２個欠損したもの（Ｉ
ＦＮ−γｄ２）もしくは３個欠損したもの（ＩＦ’Ｎ−
γｄ３）、またはｒｌ、−２，であることが好ましい。
本発明のリンホカインはその分子量が５千〜５万とりわ
け１万〜３万であることが好ましい。
け１万〜３万であることが好ましい。
リンホカインの一部アミノ基として、Ｎ末端のα−アミ
ノ基およびリジン残基のε−アミノ基が挙げられる。
ノ基およびリジン残基のε−アミノ基が挙げられる。
上記（１）で表わされる基に関し、Ｒで示される末端酸
素の保護基としては、アルキル、アルカノイルなどが挙
げられ、アルキルとして具体的には、Ｃ１−１ｓのもの
、とりわけメチル、エチル、プロピル。
素の保護基としては、アルキル、アルカノイルなどが挙
げられ、アルキルとして具体的には、Ｃ１−１ｓのもの
、とりわけメチル、エチル、プロピル。
ｉ−プロピル、ブチル、ｉ−ブチル、５ｅｃ−ブチル、
１−ブチルなど低級（ＣＩ−、）アルキルが好ましい。
１−ブチルなど低級（ＣＩ−、）アルキルが好ましい。
アルカノイルとして具体的には、Ｃ１−６のもの、とり
わけホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、１
−ブチリル、カプロイルなど低級（ｃ＋−ｅ）アルカノ
イルが好ましい。ｎで表わされる正の整数は、５００以
下、とりわけ７〜１２０が好ましい。
わけホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、１
−ブチリル、カプロイルなど低級（ｃ＋−ｅ）アルカノ
イルが好ましい。ｎで表わされる正の整数は、５００以
下、とりわけ７〜１２０が好ましい。
式（Ｉ）で表わされる基の分子量として２．５万以下、
とりわけ３５０〜６０００のものが好ましい。生理活性
の維持およびクリアランス遅延化効果の面からリンホカ
インの分子量の１〜１０％、とりわけ２〜５％の分子量
を有する式（Ｉ）で表わされる基か好ましい。
とりわけ３５０〜６０００のものが好ましい。生理活性
の維持およびクリアランス遅延化効果の面からリンホカ
インの分子量の１〜１０％、とりわけ２〜５％の分子量
を有する式（Ｉ）で表わされる基か好ましい。
本発明の化学修飾リンホカインは、リンホカインの一部
アミノ基の少なくとも一部に直接結合した式（ｒ）で表
わされる基を有するものである。
アミノ基の少なくとも一部に直接結合した式（ｒ）で表
わされる基を有するものである。
−級アミノ基としてＮ末端α−アミノ基のみを有する場
合は、そのアミノ基に直接結合した式（■）で表わされ
る基を有するものである。またリンホカイン分子中に１
個以上のリジンを有する場合は、そのε−アミノ基の一
部に、好ましくはそれらε−アミノ基の１５〜８０％（
平均）に、直接結合した式（Ｉ）で表わされる基を有す
るものであり、この場合、Ｎ末端α−アミノ基は、直接
結合した式ＣＩ）で表わされる基を有しても、有しなく
てもよい。
合は、そのアミノ基に直接結合した式（■）で表わされ
る基を有するものである。またリンホカイン分子中に１
個以上のリジンを有する場合は、そのε−アミノ基の一
部に、好ましくはそれらε−アミノ基の１５〜８０％（
平均）に、直接結合した式（Ｉ）で表わされる基を有す
るものであり、この場合、Ｎ末端α−アミノ基は、直接
結合した式ＣＩ）で表わされる基を有しても、有しなく
てもよい。
本発明の化学修飾リンホカインは、例えばリンホカイン
とＲ榊０−ＣＨ，０８μｍ、０−ＣＨ２ＣＨＯ（Ｕ：Ｒ
およびｎは前記と同意義）で示されるアルデヒドとを還
元剤の存在下反応させることにより製造することができ
る。本反応に用いるホウ素系還元剤としては、水素化ホ
ウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどが
挙げられるが、中でもシアノ水素化ホウ素ナトリウムが
反応の選択性や中性付近で反応が行なえる点でより好ま
しい。
とＲ榊０−ＣＨ，０８μｍ、０−ＣＨ２ＣＨＯ（Ｕ：Ｒ
およびｎは前記と同意義）で示されるアルデヒドとを還
元剤の存在下反応させることにより製造することができ
る。本反応に用いるホウ素系還元剤としては、水素化ホ
ウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどが
挙げられるが、中でもシアノ水素化ホウ素ナトリウムが
反応の選択性や中性付近で反応が行なえる点でより好ま
しい。
反応に際しては、アルデヒド（ＩＩ）をリンホカインに
対して、１〜１０，０００倍モル程度、ホウ素系還元剤
はアルデヒド（ＩＩ）に対して１−１００倍モル程度用
いればよく、リンホカインとアルデヒド（ＩＩ）のモル
比を増減することによって修飾の程度を任意に選択する
ことができる。反応に用いる溶媒は、反応を妨害しない
ものであればいずれでもよいが、例えばリン酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液などの緩衝液が挙げられる。また、リンホ
カインを失活させず、反応の支障にならない低級アルカ
ノール（例、メタノール、エタノール、ｉ−プロパツー
ル）、アセトニトリルなどの有機溶媒を添加してもよい
。反応のＩＩＨは３〜１４の広い範囲で可能であるが、
中性付近（ｐ）−１６，５〜７５）が望ましい。反応温
度はθ。
対して、１〜１０，０００倍モル程度、ホウ素系還元剤
はアルデヒド（ＩＩ）に対して１−１００倍モル程度用
いればよく、リンホカインとアルデヒド（ＩＩ）のモル
比を増減することによって修飾の程度を任意に選択する
ことができる。反応に用いる溶媒は、反応を妨害しない
ものであればいずれでもよいが、例えばリン酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液などの緩衝液が挙げられる。また、リンホ
カインを失活させず、反応の支障にならない低級アルカ
ノール（例、メタノール、エタノール、ｉ−プロパツー
ル）、アセトニトリルなどの有機溶媒を添加してもよい
。反応のＩＩＨは３〜１４の広い範囲で可能であるが、
中性付近（ｐ）−１６，５〜７５）が望ましい。反応温
度はθ。
〜８０℃でリンホカインが変性しない温度であれば、い
ずれでもよいが、０°〜５０℃の範囲がより好ましい。
ずれでもよいが、０°〜５０℃の範囲がより好ましい。
反応時間は０．５〜１００時間、通常は１０〜８０時間
程度で十分である。反応液は、透析、塩析、イオン交換
クロマトグラフィー、ゲルろ過、高速液体クロマトグラ
フィー、電気泳動等通常の蛋白質の精製法で精製し、所
望の化学修飾リンホカインを得ることかできる。またア
ミノ基の修飾の程度は、例えば酸分解のあと、アミノ酸
分析を行なって算出することができる。
程度で十分である。反応液は、透析、塩析、イオン交換
クロマトグラフィー、ゲルろ過、高速液体クロマトグラ
フィー、電気泳動等通常の蛋白質の精製法で精製し、所
望の化学修飾リンホカインを得ることかできる。またア
ミノ基の修飾の程度は、例えば酸分解のあと、アミノ酸
分析を行なって算出することができる。
前記したアルデヒド（ｎ）は、例えばト÷０−ＣＨ，Ｃ
Ｈ，う一０Ｈ（Ｉ［［二Ｒおよびｎは前記と同意義）で
示されるエチレングリコール誘導体から製造できるが、
下記の方法は、対応するカルボン酸の副成が少なく有利
な製造法である。
Ｈ，う一０Ｈ（Ｉ［［二Ｒおよびｎは前記と同意義）で
示されるエチレングリコール誘導体から製造できるが、
下記の方法は、対応するカルボン酸の副成が少なく有利
な製造法である。
すなわち、化合物（Ｉ［［）を塩化メチレン、クロロホ
ルムなどハロゲン化アルキル溶媒中、クロルクロム酸ピ
リジニウムで酸化する。この場合、クロルクロム酸ピリ
ジニウムを化合物（ＩＩＩ）に対し１〜３モル里用い、
−１０°〜５０℃、好ましくは室温で、１〜３０時間反
応させる。
ルムなどハロゲン化アルキル溶媒中、クロルクロム酸ピ
リジニウムで酸化する。この場合、クロルクロム酸ピリ
ジニウムを化合物（ＩＩＩ）に対し１〜３モル里用い、
−１０°〜５０℃、好ましくは室温で、１〜３０時間反
応させる。
また化合物（ＩＩｌ、但しｎ−１）をｔ−ブタノール中
でカリウムｔ−ブトキシドで処理した後、ブロモアセタ
ールを反応させ、ついで有機酸（トリフルオロ酢酸など
）または無機酸（塩酸、硫酸など）などの酸で処理すこ
とにより化合物（ＩＩＩ）より −〇Ｃ１−（、ＣＨ、
−鎖長の長い対応するアルデヒド（ＩＩ）を製造するこ
とができる。この場合、まずカリウムｔ−ブトキシドを
上記化合物（ＩＩＩ）に対し１０〜３０モル量を加えて
溶解させ、これにブロモアセタールを化合物（ＩＩＩ）
に対し３〜１５モル量加えて、１０゜〜８０℃で０．５
〜５時間反応させ、常法により後処理後、上記酸の希薄
水溶液に溶かし、５分へ・２時間加熱する。
でカリウムｔ−ブトキシドで処理した後、ブロモアセタ
ールを反応させ、ついで有機酸（トリフルオロ酢酸など
）または無機酸（塩酸、硫酸など）などの酸で処理すこ
とにより化合物（ＩＩＩ）より −〇Ｃ１−（、ＣＨ、
−鎖長の長い対応するアルデヒド（ＩＩ）を製造するこ
とができる。この場合、まずカリウムｔ−ブトキシドを
上記化合物（ＩＩＩ）に対し１０〜３０モル量を加えて
溶解させ、これにブロモアセタールを化合物（ＩＩＩ）
に対し３〜１５モル量加えて、１０゜〜８０℃で０．５
〜５時間反応させ、常法により後処理後、上記酸の希薄
水溶液に溶かし、５分へ・２時間加熱する。
上記いずれの反応液も、抽出、濃縮、再結晶、再沈澱、
クロマトグラフィー、蒸留など通常の化学的処理により
精製することができる。
クロマトグラフィー、蒸留など通常の化学的処理により
精製することができる。
本発明の化学修飾リンホカインは、対応する公知の非修
飾リンホカインと同様の有用な生理活性を有し、医薬品
などとして有用である。
飾リンホカインと同様の有用な生理活性を有し、医薬品
などとして有用である。
本発明の化学修飾リンホカインは、対応する公知の非修
飾リンホカインに比し、生体内におけるクリアランスが
遅延され、長時間有効にその活性を示すのみならず、毒
性、抗原性も低く、公知のリンホカインと同様の目的に
、同様の用法で安全に使用することができる。
飾リンホカインに比し、生体内におけるクリアランスが
遅延され、長時間有効にその活性を示すのみならず、毒
性、抗原性も低く、公知のリンホカインと同様の目的に
、同様の用法で安全に使用することができる。
本発明の化学修飾リンホカインは、通常自体公知の担体
、希釈剤等を用い適宜の医薬組成物として経口的または
非経口的に哺乳動物（サル、イヌ。
、希釈剤等を用い適宜の医薬組成物として経口的または
非経口的に哺乳動物（サル、イヌ。
ブタ、ウサギ、マウス、ヒト）に投与することができる
。
。
例えば、本発明の化学修飾ＩＦＮ−αを抗ウィルス剤と
して使用する場合、成人１日１回ｌ×１０４〜ｌＸＩＯ
３国際単位を静注により投与するのがよい。
して使用する場合、成人１日１回ｌ×１０４〜ｌＸＩＯ
３国際単位を静注により投与するのがよい。
本明細書中、アミノ酸に関し略号で表示する場合は、
Ｉ ＵＰＡＣ−Ｉ ＵＢ（Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ ｏｆ
Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）
による略号に基づくものである。
Ｉ ＵＰＡＣ−Ｉ ＵＢ（Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ ｏｆ
Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）
による略号に基づくものである。
なお下記参考例に開示している形質転換体エンエリヒア
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ）２９４／
ｐＨｆＴｌ、ｒｌ） １．１０１−ｄ２は財団法人発酵
研究所（ｌｎｓｔｉ−ｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎ、Ｏ５ａｋａ）に寄言七番号Ｉ Ｆ Ｏ−
１４３５０として、昭和５９年６月６日から通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所（ＰＲＩ）に受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−７０３として寄託されている。
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ）２９４／
ｐＨｆＴｌ、ｒｌ） １．１０１−ｄ２は財団法人発酵
研究所（ｌｎｓｔｉ−ｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎ、Ｏ５ａｋａ）に寄言七番号Ｉ Ｆ Ｏ−
１４３５０として、昭和５９年６月６日から通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所（ＰＲＩ）に受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−７０３として寄託されている。
またエンエリヒア コリ Ｄ、Ｉ（ｌ／ｐＴＦ４は財団
法人発酵研究所に寄託番号Ｉ Ｆ Ｏ−１４２９９とし
て、昭和５９年４月６日からＦＲＩにＦＥＲＭＢ Ｐ−
６２８として寄託されている。
法人発酵研究所に寄託番号Ｉ Ｆ Ｏ−１４２９９とし
て、昭和５９年４月６日からＦＲＩにＦＥＲＭＢ Ｐ−
６２８として寄託されている。
作用および実施例
以下実施例および参考例によって本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。
実施例１ ポリエチレングリコールメチルエーテル修飾
ＩＦＮ−αの製造 （ｉ） ＩＦＮ−α（ＩＩＦＮ−ａＡ）の溶液５ ｍｌ
（蛋白質量にして４．ｇｍｇ）をとり、０．２Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）→−０，１５Ｍ食塩に対し、４℃
で１２時間透析した。透析液を取り出し、これに参考例
１で得たポリエチレングリコールメチルエーテルアルデ
ヒド（平均分子量１９００８２６０ｍｇ）、ついでソア
ノ水素化ホウ素ナトリウム（１４０＋ｎｇ）を加え、３
７℃で４０時間かきまぜた。反応液をセファデックスＧ
−７５のカラム（３，ＯＸ ４３．ＯＣｍ）に注ぎ込み
、２５ ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５，０）
＋ ０．１５Ｍ食塩で展開した。 ５ｍｌづつ分取し、
目的物を含むフラクション（１００〜１５０ｍ’ｌ）を
集めた。このフラクンヨ、りの蛋白質含量は牛血清アル
ブミンを標準としてローリ−（１，ｏｗｒｙ）法で測定
すると８４μｇ／ｍｌであった。
ＩＦＮ−αの製造 （ｉ） ＩＦＮ−α（ＩＩＦＮ−ａＡ）の溶液５ ｍｌ
（蛋白質量にして４．ｇｍｇ）をとり、０．２Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）→−０，１５Ｍ食塩に対し、４℃
で１２時間透析した。透析液を取り出し、これに参考例
１で得たポリエチレングリコールメチルエーテルアルデ
ヒド（平均分子量１９００８２６０ｍｇ）、ついでソア
ノ水素化ホウ素ナトリウム（１４０＋ｎｇ）を加え、３
７℃で４０時間かきまぜた。反応液をセファデックスＧ
−７５のカラム（３，ＯＸ ４３．ＯＣｍ）に注ぎ込み
、２５ ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５，０）
＋ ０．１５Ｍ食塩で展開した。 ５ｍｌづつ分取し、
目的物を含むフラクション（１００〜１５０ｍ’ｌ）を
集めた。このフラクンヨ、りの蛋白質含量は牛血清アル
ブミンを標準としてローリ−（１，ｏｗｒｙ）法で測定
すると８４μｇ／ｍｌであった。
また酸分解物（６Ｎ塩酸、１１０℃２４時間）中のアミ
ノ酸分析値は以下の如くであった。：Ａｓｐ、 １２．
２（１２）； Ｔｈｒ、 １０．４（１０）； Ｓｅｒ
、 １６．０（１４）； Ｇｌｕ、 ２４８（２６）；
Ｐｒｏ、 ８．０ （５）； Ｇｌｙ、 ６Ｊ（５）
； Ａｌａ ８．６（８）； Ｖａｌ、 ６．５（７）
： Ｍｅｔ、 ４．５（５）＋ Ｉ ｌｅ、７．６（８
）；Ｌｅｕ、 ２１．０（２＋）； Ｔｙｒ、 ５．２
（５）； Ｐｈｅ、 ９．９（１０）；Ｌｙｓ、 ６．
５； Ｈｉｓ、 ３．８（３）； Ａｒｇ、 ９．１（
９）； Ｃｙｓ。
ノ酸分析値は以下の如くであった。：Ａｓｐ、 １２．
２（１２）； Ｔｈｒ、 １０．４（１０）； Ｓｅｒ
、 １６．０（１４）； Ｇｌｕ、 ２４８（２６）；
Ｐｒｏ、 ８．０ （５）； Ｇｌｙ、 ６Ｊ（５）
； Ａｌａ ８．６（８）； Ｖａｌ、 ６．５（７）
： Ｍｅｔ、 ４．５（５）＋ Ｉ ｌｅ、７．６（８
）；Ｌｅｕ、 ２１．０（２＋）； Ｔｙｒ、 ５．２
（５）； Ｐｈｅ、 ９．９（１０）；Ｌｙｓ、 ６．
５； Ｈｉｓ、 ３．８（３）； Ａｒｇ、 ９．１（
９）； Ｃｙｓ。
Ｔｒｐ、分解、ｒｌＦＮ−ａＡには１１個のＬｙｓが含
まれているので、上記の結果から、インターフェロンα
中のＬｙｓのε−アミ゛ノ基の約４１％がポリエチレン
グリコールメチルエーテル（平均分子量１．９００）で
修飾されていることが分かった。水晶は酵素免疫測定法
［メソッド インエンザイモロジー。
まれているので、上記の結果から、インターフェロンα
中のＬｙｓのε−アミ゛ノ基の約４１％がポリエチレン
グリコールメチルエーテル（平均分子量１．９００）で
修飾されていることが分かった。水晶は酵素免疫測定法
［メソッド インエンザイモロジー。
第７９巻、５８９−５９５頁（１９８１）］で測定した
結果１．５１×１０７国際単位／ｍｇで、ジャーナル
オブ ピロロノー、第３７巻 ７５５−７５８頁（１９
８１）に記載の方法に従い測定した抗ウィルス活性は０
．５７Ｘ １０’国際単位／ｍｇであった。水晶（ＩＦ
Ａ−３）を後述のラットにおけるクリアランスの実験に
供した。
結果１．５１×１０７国際単位／ｍｇで、ジャーナル
オブ ピロロノー、第３７巻 ７５５−７５８頁（１９
８１）に記載の方法に従い測定した抗ウィルス活性は０
．５７Ｘ １０’国際単位／ｍｇであった。水晶（ＩＦ
Ａ−３）を後述のラットにおけるクリアランスの実験に
供した。
（ＩＩ）参考例１で得た平均分子量７５０のポリエチレ
ングリコールメチルエーテルアルデヒド１００ｍｇ。
ングリコールメチルエーテルアルデヒド１００ｍｇ。
シアノ水素化ホウ素ナトリウム１００ｍｇを用いて、（
ｉ）と同様に＋１ＦＮ−ａＡを処理すると１３０μｇ／
ｍｌの蛋白質量のポリエチレングリコールメチルエーテ
ル修飾ｒＦＮ−αの溶液３０ｍ１が得られた。酸分解物
（６Ｎ塩酸、１１０°０２２４時間）中のアミノ酸分析
値は以下の如くであった。＋Ａｓｐ、１２．１（１２）
； Ｔｈｒ。
ｉ）と同様に＋１ＦＮ−ａＡを処理すると１３０μｇ／
ｍｌの蛋白質量のポリエチレングリコールメチルエーテ
ル修飾ｒＦＮ−αの溶液３０ｍ１が得られた。酸分解物
（６Ｎ塩酸、１１０°０２２４時間）中のアミノ酸分析
値は以下の如くであった。＋Ａｓｐ、１２．１（１２）
； Ｔｈｒ。
１０．１（１０）； Ｓ ｅｒ、１３．６（１４）；Ｇ
Ｉｕ、２６．７（２６）； Ｐ ｒｏ。
Ｉｕ、２６．７（２６）； Ｐ ｒｏ。
５．５（５）； Ｇｌｙ、 ５．６（５）； Ａｌａ
、 ８．４（８）； Ｖａｌ、 ６７（７）； Ｍｅｔ
、 ５．５（５）； Ｉ Ｉｅ、 ７．４（８）； Ｌ
ｅｕ、 ２１．０（２１）； Ｔｈｒ、５．１（５）；
Ｐｈｅ、 ９．６（１０）； Ｌｙｓ、 ４．７；Ｉ
−（ｉｓ、 ３．５（３）；Ａｒｇ、９．１（９）；Ｔ
ｒｐ、１．８（２）； Ｃｙｓ、分解、この結果から、
水晶は約５７％のＬｙｓのε−アミノ基が修飾されてお
り、（１）と同様に酵素免疫法で測定した結果５Ｘ１０
’国際単位／ｍｇで、抗ウィルス活性は０．１４Ｘ １
０８国際単位／ｍｇであった。
、 ８．４（８）； Ｖａｌ、 ６７（７）； Ｍｅｔ
、 ５．５（５）； Ｉ Ｉｅ、 ７．４（８）； Ｌ
ｅｕ、 ２１．０（２１）； Ｔｈｒ、５．１（５）；
Ｐｈｅ、 ９．６（１０）； Ｌｙｓ、 ４．７；Ｉ
−（ｉｓ、 ３．５（３）；Ａｒｇ、９．１（９）；Ｔ
ｒｐ、１．８（２）； Ｃｙｓ、分解、この結果から、
水晶は約５７％のＬｙｓのε−アミノ基が修飾されてお
り、（１）と同様に酵素免疫法で測定した結果５Ｘ１０
’国際単位／ｍｇで、抗ウィルス活性は０．１４Ｘ １
０８国際単位／ｍｇであった。
（ｉｉｉ） 参考例１で得た平均分子量７５０のポリエ
チレングリコールメチルエーテルアルデヒド２７ｍｇ。
チレングリコールメチルエーテルアルデヒド２７ｍｇ。
シアノ水素化ホウ素ナトリウム２７ｍｇを用いて（１）
と同様に処理すると、４５μｇ／ｍｌの蛋白質量のポリ
エチレングリコールメチルエーテ修Ｉｆ ＦＮ−ａ ５
０ｍ１が得られた。酸分解物（６Ｎ塩酸、１１００Ｃ。
と同様に処理すると、４５μｇ／ｍｌの蛋白質量のポリ
エチレングリコールメチルエーテ修Ｉｆ ＦＮ−ａ ５
０ｍ１が得られた。酸分解物（６Ｎ塩酸、１１００Ｃ。
２４時間）中のアミノ酸分析値は以下の如くであった。
：Ａｓｐ、 １３．６（１２）；Ｔｈｒ、 １０．４（
１０）； Ｓｅｒ、１４゜９（１４）；Ｇｌｕ、２６．
６（２６）；Ｐｒｏ、 ５．５（５）；Ｇｌｙ、 ６．
１（５）；Ａｌａ、 ８．３（８）；Ｖａｌ、 ６．６
（７）；Ｍｅｔ、 ５．２（５）； Ｉ Ｉｅ。
１０）； Ｓｅｒ、１４゜９（１４）；Ｇｌｕ、２６．
６（２６）；Ｐｒｏ、 ５．５（５）；Ｇｌｙ、 ６．
１（５）；Ａｌａ、 ８．３（８）；Ｖａｌ、 ６．６
（７）；Ｍｅｔ、 ５．２（５）； Ｉ Ｉｅ。
７．４（８）； Ｌｅｕ、 ２１．０（２１）； Ｔｙ
ｒ、 ５．３（５）： Ｐｈｅ。
ｒ、 ５．３（５）： Ｐｈｅ。
１０．２（１０）；Ｌｙｓ、９．０；Ｈｉｓ、３．６（
３）；Ａｒｇ、９．１（９）；Ｔｒｐ、２．３（２）；
Ｃｙｓ、分解、この結果から、水晶は約１８％のＬｙ
ｓのε−アミノ基が修飾されており、（１）と同様に酵
素免疫法で測定した結果１．０９ｘ１０８国際単位／ｍ
ｇで抗ウィルス活性は１．５３ｘ １０８国際単位／ｍ
ｇであった。
３）；Ａｒｇ、９．１（９）；Ｔｒｐ、２．３（２）；
Ｃｙｓ、分解、この結果から、水晶は約１８％のＬｙ
ｓのε−アミノ基が修飾されており、（１）と同様に酵
素免疫法で測定した結果１．０９ｘ１０８国際単位／ｍ
ｇで抗ウィルス活性は１．５３ｘ １０８国際単位／ｍ
ｇであった。
（ｉｖ） Ｊｚ記（１）で得た本発明の化学修飾ＩＦ’
Ｎ−α（ＩＦＡ−３）を、１．２７４ＸＩ０６単位づつ
、雌性７週令のＳＤラットの大腿部筋肉に１群３匹づつ
注射した。一定時間後に、尾部静脈より採血し、血漿中
の■ＦＮ−α力価を実施例２（Ｉ）に記載の酵素免疫法
および抗ウィルス活性により測定した。
Ｎ−α（ＩＦＡ−３）を、１．２７４ＸＩ０６単位づつ
、雌性７週令のＳＤラットの大腿部筋肉に１群３匹づつ
注射した。一定時間後に、尾部静脈より採血し、血漿中
の■ＦＮ−α力価を実施例２（Ｉ）に記載の酵素免疫法
および抗ウィルス活性により測定した。
非修飾のインターフェロンα（ｒｌＦＮ−ａＡ）を１．
２５９Ｘ １．０６単位づつを投与した群に比較して明
らかなりリアランスの遅延化が認められた。
２５９Ｘ １．０６単位づつを投与した群に比較して明
らかなりリアランスの遅延化が認められた。
これらの結果を第１図に示す。
実施例２
実施例１（１）で得た本発明の化学修飾Ｉ ＦＮ−α（
ＩＰＮ−３）の溶液５ｍｌに２５０ｍｇのヒト血清ア＋
ｌ−ｆ’ Ｓ ’、九／も４−欧裁十 士歓体九Ｊ・フ
イニ・７フイルター（ポアーサイズ５０．２μｍ）でろ
過し、５個のバイアルに小分けする。無菌的に凍結乾燥
して保存し、使用直前に注射用蒸留水１ｍｌに溶かして
使用に供する。
ＩＰＮ−３）の溶液５ｍｌに２５０ｍｇのヒト血清ア＋
ｌ−ｆ’ Ｓ ’、九／も４−欧裁十 士歓体九Ｊ・フ
イニ・７フイルター（ポアーサイズ５０．２μｍ）でろ
過し、５個のバイアルに小分けする。無菌的に凍結乾燥
して保存し、使用直前に注射用蒸留水１ｍｌに溶かして
使用に供する。
実施例３ ポリエチレングリコールメチルエーテル修飾
ＩＦＮ−α、およびアルカノイルポリエチレングリコー
ル修飾ＩＦＮ−αの製造（１）参考例１および参考例２
で得たポリエチレングリコ−ルメヂルエーテルアルデヒ
ド、またはアルカノイルポリエチレングリコールアルデ
ヒドを用い、実施例１で述へた方法で題記化合物を合成
１．た。合成した誘導体の各種データを第１表に、アミ
ノ酸分析値を第２表に示した。
ＩＦＮ−α、およびアルカノイルポリエチレングリコー
ル修飾ＩＦＮ−αの製造（１）参考例１および参考例２
で得たポリエチレングリコ−ルメヂルエーテルアルデヒ
ド、またはアルカノイルポリエチレングリコールアルデ
ヒドを用い、実施例１で述へた方法で題記化合物を合成
１．た。合成した誘導体の各種データを第１表に、アミ
ノ酸分析値を第２表に示した。
（ＩＩ）上記（ｉ）で得た本発明の化学修飾Ｉ ＦＮ−
α（化合物ＮＯ，２及び８）を３．ｌ２ＸＩ０６単位及
び２６６ Ｘ １０６単位づつ、雌性７ａ令のＳＤラッ
トの大腿部筋肉に一群３匹づつ注射した。一定時間後に
、尾部静脈より採血し、血漿中のＩＦＮ−α力価を酵素
免疫法により測定した。非修飾のＩＦＮ−αを３．８２
Ｘ １０ｅ単位づつ投与した肝に比較して明らかなりリ
アランスの遅延化が認められた。
α（化合物ＮＯ，２及び８）を３．ｌ２ＸＩ０６単位及
び２６６ Ｘ １０６単位づつ、雌性７ａ令のＳＤラッ
トの大腿部筋肉に一群３匹づつ注射した。一定時間後に
、尾部静脈より採血し、血漿中のＩＦＮ−α力価を酵素
免疫法により測定した。非修飾のＩＦＮ−αを３．８２
Ｘ １０ｅ単位づつ投与した肝に比較して明らかなりリ
アランスの遅延化が認められた。
これらの結果を第２図に示す。
第１表−１
ポリエチレングリコールメチルエーテル修ｉインターフ
ェロンαおよびアルカノイルポリエチレングリコール修
飾インターフェロンαチルエーテル、（）の数字は平均
分子量を示す。ＮａＢ）ｌａｃＮ：ンアノ水素化ホウ素
ナトリウム、Ｅｌ＾：酵素免疫測定法、＾ｖＡ；抗Ａ；
ルス活性 第２表 一：検出できず 実施例４ ポリエチレングリコールメチルエーテル修飾
・インターフェロン−γの製造（１）遺伝子組換え技術
で製造されたインターフェロン−γ蛋白質（以下ｒＩ
ＰＮ−γと略記する：ＥＰＣ公開第１１００４４号公報
参照）の溶液５ａ＋１（蛋白質量にして５．９５ｍｇ）
をとり、セファデックスＧ−２５のカラム（２，０Ｘ
６０．０ｃｍ）に注ぎ込み、０．２Ｍリン酸緩衝液（１
）Ｈ７，０）で展開した。５ＩＩｌづつ分取し、フラク
ションＮＯ，１１〜１３を集めた。同じ緩衝液で１００
ｍ１に希釈し、これにポリエチレングリコールメチルエ
ーテルアルデヒド（平均分子量７５０）（２２５ｍｇ）
、ついでシアノ水素化ホウ素ナトリウム（３００ｍｇ）
を加え、３７℃で、７２時時間表プした。生成する沈澱
を遠心により除いた。上清はグイアフロ−（アミコン社
製）を用いて１０ｍ１まで濃縮した。これをセファデッ
クスＧ−７５のカラム（３，Ｏｘ ４３． Ｏｃｍ）に
注ぎ込み、２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６，
０）＋ ０．１５Ｍ食塩＋１０ｍＭグルタチオンで展開
した。
ェロンαおよびアルカノイルポリエチレングリコール修
飾インターフェロンαチルエーテル、（）の数字は平均
分子量を示す。ＮａＢ）ｌａｃＮ：ンアノ水素化ホウ素
ナトリウム、Ｅｌ＾：酵素免疫測定法、＾ｖＡ；抗Ａ；
ルス活性 第２表 一：検出できず 実施例４ ポリエチレングリコールメチルエーテル修飾
・インターフェロン−γの製造（１）遺伝子組換え技術
で製造されたインターフェロン−γ蛋白質（以下ｒＩ
ＰＮ−γと略記する：ＥＰＣ公開第１１００４４号公報
参照）の溶液５ａ＋１（蛋白質量にして５．９５ｍｇ）
をとり、セファデックスＧ−２５のカラム（２，０Ｘ
６０．０ｃｍ）に注ぎ込み、０．２Ｍリン酸緩衝液（１
）Ｈ７，０）で展開した。５ＩＩｌづつ分取し、フラク
ションＮＯ，１１〜１３を集めた。同じ緩衝液で１００
ｍ１に希釈し、これにポリエチレングリコールメチルエ
ーテルアルデヒド（平均分子量７５０）（２２５ｍｇ）
、ついでシアノ水素化ホウ素ナトリウム（３００ｍｇ）
を加え、３７℃で、７２時時間表プした。生成する沈澱
を遠心により除いた。上清はグイアフロ−（アミコン社
製）を用いて１０ｍ１まで濃縮した。これをセファデッ
クスＧ−７５のカラム（３，Ｏｘ ４３． Ｏｃｍ）に
注ぎ込み、２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６，
０）＋ ０．１５Ｍ食塩＋１０ｍＭグルタチオンで展開
した。
５ｍｌづつ分取し、目的物を含むフラクションＮＯ。
１？−２４を集めた。このフラクションの蛋白含量は牛
血清アルブミンを標準として、ブラッドフォード（Ｂ
ｒａｄｆｏｒｄ）法で測定すると７．’／３１１ ｇ／
ｍｌであった。また酸分解物（６Ｎ塩酸、１１０℃、２
４時間）中のアミノ酸分析値は以下の如くであった。Ａ
ｓｐ、１９゜６（２０）； Ｔｈｒ、 ４．７（５）；
Ｓｅｒ、 ８．３（１１）； Ｇｌｕ、 １８゜５（
１ｇ）； Ｐｒｏ、２．１（２）； Ｇｌｙ、 ５．４
（５）；Ａｌａ、７．５（８）； Ｖａｌ、 ８．４（
８）； Ｍｅｔ、 ３．７（４）； Ｉ ｌｅ、 ７．
１（７）；Ｌｅｕ、 ９．７（１０）； Ｔｙｒ、 ５
’、３（５）； Ｐｈｅ、 ９．７（１０）；Ｌｙｓ、
１７．６； Ｈｉｓ、 ２．０（２）； Ａｒｇ、
５．０（８）； Ｃｙｓ。
血清アルブミンを標準として、ブラッドフォード（Ｂ
ｒａｄｆｏｒｄ）法で測定すると７．’／３１１ ｇ／
ｍｌであった。また酸分解物（６Ｎ塩酸、１１０℃、２
４時間）中のアミノ酸分析値は以下の如くであった。Ａ
ｓｐ、１９゜６（２０）； Ｔｈｒ、 ４．７（５）；
Ｓｅｒ、 ８．３（１１）； Ｇｌｕ、 １８゜５（
１ｇ）； Ｐｒｏ、２．１（２）； Ｇｌｙ、 ５．４
（５）；Ａｌａ、７．５（８）； Ｖａｌ、 ８．４（
８）； Ｍｅｔ、 ３．７（４）； Ｉ ｌｅ、 ７．
１（７）；Ｌｅｕ、 ９．７（１０）； Ｔｙｒ、 ５
’、３（５）； Ｐｈｅ、 ９．７（１０）；Ｌｙｓ、
１７．６； Ｈｉｓ、 ２．０（２）； Ａｒｇ、
５．０（８）； Ｃｙｓ。
Ｔｒｐ、分解、ｒＩＦＮ−７には２０個のＬｙｓが含ま
れているので、上記の結果から、ｒＩ ＦＮ−γ中のＬ
ｙｓのε−アミノ基の約１２％がポリエチレングリコー
ルメチルエーテル（平均分子ｆｉ ７５０）で修飾され
ていることが分った。本島の抗ウィルス活性は１．３Ｘ
１０’国際単位／ｍｇであった。また本島をラットに
投与すると、明らかな血中クリアランスの遅延化が認め
られた。一方、沈澱は６Ｍ塩酸グアニジンにとかし、つ
いで２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，０）＋ ０．
１５Ｍ食塩＋１０ｍＭグルタチオンに対して、４℃で一
晩透析し、上記と同様にセファデックスＧ−７５のゲル
ろ過で精製した。この画分（２５ｍｌ）の蛋白質含量は
１２６μｇ／ｍｌで、酸分解物（６Ｎ塩酸、１００℃、
２４時間）のアミノ酸分析値は以下の如くであった。Ａ
ｓｐ、 ２０．０（２０）； Ｔｈｒ、 ５．２（５）
； Ｓｅｒ、 ９．５（１１）； Ｇｌｕ、 ２７．８
（１８）； Ｐｒｏ、２．７ （２）； Ｇｌｙ、 １
４．６（５）； Ａｌａ、 ８．１（８）； Ｖａｌ、
８．５（８）；Ｍｅｔ、 ４．３（４）；Ｉｌｅ、７
．２（７）； Ｌｅｕ、 １０．２（１０）；Ｔｙｒ、
５．８（５）； Ｐｈｅ、 １０．１（１０）； Ｌｙ
ｓ、１４．７；Ｈｉｓ。
れているので、上記の結果から、ｒＩ ＦＮ−γ中のＬ
ｙｓのε−アミノ基の約１２％がポリエチレングリコー
ルメチルエーテル（平均分子ｆｉ ７５０）で修飾され
ていることが分った。本島の抗ウィルス活性は１．３Ｘ
１０’国際単位／ｍｇであった。また本島をラットに
投与すると、明らかな血中クリアランスの遅延化が認め
られた。一方、沈澱は６Ｍ塩酸グアニジンにとかし、つ
いで２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，０）＋ ０．
１５Ｍ食塩＋１０ｍＭグルタチオンに対して、４℃で一
晩透析し、上記と同様にセファデックスＧ−７５のゲル
ろ過で精製した。この画分（２５ｍｌ）の蛋白質含量は
１２６μｇ／ｍｌで、酸分解物（６Ｎ塩酸、１００℃、
２４時間）のアミノ酸分析値は以下の如くであった。Ａ
ｓｐ、 ２０．０（２０）； Ｔｈｒ、 ５．２（５）
； Ｓｅｒ、 ９．５（１１）； Ｇｌｕ、 ２７．８
（１８）； Ｐｒｏ、２．７ （２）； Ｇｌｙ、 １
４．６（５）； Ａｌａ、 ８．１（８）； Ｖａｌ、
８．５（８）；Ｍｅｔ、 ４．３（４）；Ｉｌｅ、７
．２（７）； Ｌｅｕ、 １０．２（１０）；Ｔｙｒ、
５．８（５）； Ｐｈｅ、 １０．１（１０）； Ｌｙ
ｓ、１４．７；Ｈｉｓ。
２．０（２）； Ａｒｇ、 ７．３（８）； Ｔｈｒ、
０．７（１）； Ｃｙｓ、分解、ＧｌｕとＧｌｙの値
が理論値より高いのはゲルタデオンの混入のためと思わ
れる。ｒＩＦＮ−γには２０個のＬｙｓのε−アミノ基
が含まれているので、」―記の結果から、ｒｌ ＦＮ−
γ中のＬｙｓのε−アミノ基の約２６．５％がポリエチ
レングリコールメチルエーテルで修飾されていることが
分っｊこ。
０．７（１）； Ｃｙｓ、分解、ＧｌｕとＧｌｙの値
が理論値より高いのはゲルタデオンの混入のためと思わ
れる。ｒＩＦＮ−γには２０個のＬｙｓのε−アミノ基
が含まれているので、」―記の結果から、ｒｌ ＦＮ−
γ中のＬｙｓのε−アミノ基の約２６．５％がポリエチ
レングリコールメチルエーテルで修飾されていることが
分っｊこ。
（１１）平均分子量７５０のポリエチレングリコ−ルメ
ヂルエーテルアルデヒド２２５ｎ＋ｇ、シアノ水素化ホ
ウ素ナトリウム１２０ｍｇを用い、２−メルカプトエタ
ノール（２％）の存在下、（１）と同様にｒＩＦＮ−γ
を処理すると２３６μｇ／ｍｌの蛋白質量のポリエチレ
ングリコールメチルエーテル修飾ｒｌＦＮ−γの溶液３
０ｍ１が得られた。酸分解物（６Ｎ塩酸、１００℃、２
４時間）のアミノ酸分析値は以下の如くであった。 Ａ
ｓｐ、 ２０．０’（２０）； Ｔｈｒ、５．２（５）
； Ｓｅｒ。
ヂルエーテルアルデヒド２２５ｎ＋ｇ、シアノ水素化ホ
ウ素ナトリウム１２０ｍｇを用い、２−メルカプトエタ
ノール（２％）の存在下、（１）と同様にｒＩＦＮ−γ
を処理すると２３６μｇ／ｍｌの蛋白質量のポリエチレ
ングリコールメチルエーテル修飾ｒｌＦＮ−γの溶液３
０ｍ１が得られた。酸分解物（６Ｎ塩酸、１００℃、２
４時間）のアミノ酸分析値は以下の如くであった。 Ａ
ｓｐ、 ２０．０’（２０）； Ｔｈｒ、５．２（５）
； Ｓｅｒ。
９．６（１１）； Ｇｌｕ、 ３３．６（１８）；Ｐｒ
ｏ、１．８（２）； Ｇｌｙ。
ｏ、１．８（２）； Ｇｌｙ。
１９．９（５）； Ａｌａ、 ８．２（８）； Ｖａｌ
、 ８．９（８）； Ｍｅｔ。
、 ８．９（８）； Ｍｅｔ。
４．６（４）； Ｉ ｌｅ、 ７．４（７）； Ｌｅｕ
、 １０．２（１０）； Ｔｙｒ。
、 １０．２（１０）； Ｔｙｒ。
５．９（５）； Ｐｈｅ、 １０．７（１０）： Ｌｙ
ｓ、１０．２； Ｈｉｓ、 ２．３（２）； Ａｒｇ、
７．９（８）； Ｔｒｐ、 ０．６（１）； Ｃｙｓ
、分解、ＧｌｕとＧｌｙの値が理論値より高いのはグル
タチオンの混入のためと思われる。ｒｌＦＮ−γには２
０個のＬｙｓのε−アミノ基が含まれているので、上記
の結果から、ｒＩ ＦＮ−γの中のＬｙｓのε−アミノ
基の約５０％がポリエチレングリコールメチルエーテル
で修飾されていることが分った。
ｓ、１０．２； Ｈｉｓ、 ２．３（２）； Ａｒｇ、
７．９（８）； Ｔｒｐ、 ０．６（１）； Ｃｙｓ
、分解、ＧｌｕとＧｌｙの値が理論値より高いのはグル
タチオンの混入のためと思われる。ｒｌＦＮ−γには２
０個のＬｙｓのε−アミノ基が含まれているので、上記
の結果から、ｒＩ ＦＮ−γの中のＬｙｓのε−アミノ
基の約５０％がポリエチレングリコールメチルエーテル
で修飾されていることが分った。
実施例５ ポリエチレングリコールメチルエーテル修飾
ＩＦ’Ｎ−γｄ２の製造 （ｉ） 参考例３で得られたＩＦＮ−γｄ２の溶液５
ｍｌ（蛋白量にして４．９５ｍｇ）をとり、セファデッ
クスＧ−２５のカラム（２，ＯＸ ６０．Ｏｃｍ）に注
ぎ込み、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で展開す
る。５ｍｌづつ分取し、フラクションＮＯ，１１〜Ｉ３
を集める。同じ緩衝液で１００ｍ１に希釈し、これにポ
リエチレングリコールメチルエーテルアルデヒド（平均
分子量７５０）（２００ｍｇ）、ついでシアノ水素化ホ
ウ素ナトリウム（３００ｍｇ）を加え、３７℃で、７２
時時間表うする。生成する沈澱を遠心により除く。上清
はダイアフロー（アミコン社製）を用いてｌ０ｍ１まで
濃縮する。これをセファデックスＧ−７５のカラム（３
，０Ｘ４３、Ｏｃｍ）ｌど注ぎ込み、２５ｍＭ酢酸アン
モニウム緩衝液（ｐＨ６，０） ＋ ０．１５Ｍ食塩＋
１０ｍＭグルタチオンで展開する。５ｍｌづつ分取し、
分子中のＬｙｓのε−アミノ基がポリエチレングリコー
ルメチルエーテルで修飾されたＩＦＮ−γｄ２を含む画
分を集める。水晶をラットに投与すると明らかな血中ク
リアランスの遅延化が認められる。
ＩＦ’Ｎ−γｄ２の製造 （ｉ） 参考例３で得られたＩＦＮ−γｄ２の溶液５
ｍｌ（蛋白量にして４．９５ｍｇ）をとり、セファデッ
クスＧ−２５のカラム（２，ＯＸ ６０．Ｏｃｍ）に注
ぎ込み、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で展開す
る。５ｍｌづつ分取し、フラクションＮＯ，１１〜Ｉ３
を集める。同じ緩衝液で１００ｍ１に希釈し、これにポ
リエチレングリコールメチルエーテルアルデヒド（平均
分子量７５０）（２００ｍｇ）、ついでシアノ水素化ホ
ウ素ナトリウム（３００ｍｇ）を加え、３７℃で、７２
時時間表うする。生成する沈澱を遠心により除く。上清
はダイアフロー（アミコン社製）を用いてｌ０ｍ１まで
濃縮する。これをセファデックスＧ−７５のカラム（３
，０Ｘ４３、Ｏｃｍ）ｌど注ぎ込み、２５ｍＭ酢酸アン
モニウム緩衝液（ｐＨ６，０） ＋ ０．１５Ｍ食塩＋
１０ｍＭグルタチオンで展開する。５ｍｌづつ分取し、
分子中のＬｙｓのε−アミノ基がポリエチレングリコー
ルメチルエーテルで修飾されたＩＦＮ−γｄ２を含む画
分を集める。水晶をラットに投与すると明らかな血中ク
リアランスの遅延化が認められる。
一方、沈澱は６Ｍ塩酸グアニジンにとかし、ついで２５
ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，０）＋０．１５Ｍ食塩
＋ＬＯｍＭグルタチオンに対して、４℃で一晩透析し、
上記同様にセファデックスＧ−７５のゲルろ過て精製し
、分子中のＬｙｓのε−アミノ基がポリエチレングリコ
〜ルメチルエーテで修飾された■ＦＮ−γｄ２を含む両
分を得る。
ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，０）＋０．１５Ｍ食塩
＋ＬＯｍＭグルタチオンに対して、４℃で一晩透析し、
上記同様にセファデックスＧ−７５のゲルろ過て精製し
、分子中のＬｙｓのε−アミノ基がポリエチレングリコ
〜ルメチルエーテで修飾された■ＦＮ−γｄ２を含む両
分を得る。
実施例６ ポリエチレングリコールメチルエーテル修飾
ＩＰＮ−γｄ３の製造 （ｉ）参考例４で得られたＩＦＮ−γｄ３の溶液５ｍ１
（蛋白質量にして ５．５ｍｇ）をとり、セファデック
スＧ−２５のカラム（２，Ｏｘ ６０．Ｏｃｍ）に注ぎ
込み、０゜２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で展開する
。５ｍｌづつ分取し、フラクションＮＯ，ｌｌ〜１３を
集める。これにポリエチレングリコールメチルエーテル
アルデヒド（平均分子１！７５０８２２５ｍｇ）、つい
でシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１２０ｍｇ）を加え
、３７℃で、２４時時間表うする。反応液をセファデッ
クスＧ−７５のカラム（３，Ｏｘ ４３．Ｏｃｍ）に注
ぎ込み、２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，０）で展
開し、分子中のＬｙｓのε−アミノ基がポリエチレング
リコールメチルエーテルで修飾されたＩＦＮ−γｄ３を
含む両分を得る。
ＩＰＮ−γｄ３の製造 （ｉ）参考例４で得られたＩＦＮ−γｄ３の溶液５ｍ１
（蛋白質量にして ５．５ｍｇ）をとり、セファデック
スＧ−２５のカラム（２，Ｏｘ ６０．Ｏｃｍ）に注ぎ
込み、０゜２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で展開する
。５ｍｌづつ分取し、フラクションＮＯ，ｌｌ〜１３を
集める。これにポリエチレングリコールメチルエーテル
アルデヒド（平均分子１！７５０８２２５ｍｇ）、つい
でシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１２０ｍｇ）を加え
、３７℃で、２４時時間表うする。反応液をセファデッ
クスＧ−７５のカラム（３，Ｏｘ ４３．Ｏｃｍ）に注
ぎ込み、２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，０）で展
開し、分子中のＬｙｓのε−アミノ基がポリエチレング
リコールメチルエーテルで修飾されたＩＦＮ−γｄ３を
含む両分を得る。
水晶をラットに投与すると、明らかな血中クリアランス
の遅延化が認められる。
の遅延化が認められる。
実施例７ ポリエチレングリコールメチルエーテル修飾
ＩＬ−２の製造 （１）参考例５で得られたインターロイキン−２（ｒｌ
Ｌ−２と略称する）の溶液５ ｍｌ（蛋白質量にして５
．０ｍｇ）をとり、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，１
５）に対して、１２時間透析した。透析液にポリエチレ
ングリコールメチルエーテルアルデヒド（平均分子［７
５０）（９７ｍｇ）、ついでシアノ水素化ホウ素ナトリ
ウム（１００ｍｇ）を加え、３７℃で２４時間かきまぜ
た。
ＩＬ−２の製造 （１）参考例５で得られたインターロイキン−２（ｒｌ
Ｌ−２と略称する）の溶液５ ｍｌ（蛋白質量にして５
．０ｍｇ）をとり、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，１
５）に対して、１２時間透析した。透析液にポリエチレ
ングリコールメチルエーテルアルデヒド（平均分子［７
５０）（９７ｍｇ）、ついでシアノ水素化ホウ素ナトリ
ウム（１００ｍｇ）を加え、３７℃で２４時間かきまぜ
た。
生成した沈澱を遠心により除いた。上清を５ｍＭ酢酸ア
ンモニウム緩衝液（ｐＨ５，０）に対して５時間透析し
た。透析した液をそのままセファデックスＧ−７５のカ
ラム（３，Ｏｘ４３．Ｏｃ＋ｎ）にかけ、同じ溶媒系で
展開した。５ｍｌづつ分取し、目的物を含むフラクショ
ンＮＯ，２１〜２９を集めた。このフラクションの蛋白
質含量は牛血清アルブミンを標檗として、ブラッドフォ
ード（Ｂ ｒａｄ４ｏｒｄ）法で測定すると２５μｇ／
ｍｌであった。また酸分解物（６Ｎ塩酸、１１０℃。
ンモニウム緩衝液（ｐＨ５，０）に対して５時間透析し
た。透析した液をそのままセファデックスＧ−７５のカ
ラム（３，Ｏｘ４３．Ｏｃ＋ｎ）にかけ、同じ溶媒系で
展開した。５ｍｌづつ分取し、目的物を含むフラクショ
ンＮＯ，２１〜２９を集めた。このフラクションの蛋白
質含量は牛血清アルブミンを標檗として、ブラッドフォ
ード（Ｂ ｒａｄ４ｏｒｄ）法で測定すると２５μｇ／
ｍｌであった。また酸分解物（６Ｎ塩酸、１１０℃。
２４時間）のアミノ酸分析値は以下の如くであった。
Ａｓｐ、１２．０（１２）； Ｔｈｒ、 １２．５（１
３）； Ｓｅｒ、 ７．１（８）；Ｇｌｙ、１８．６（
１ｇ）；Ｐｒｏ、５．５（５）；Ｇｌｙ、２．２（２）
；Ａｌａ、 ５．０（５）； Ｖａｌ、 ３．７（４）
； Ｍｅｔ、 ３．９（４）； ｒＩｅ、 ８．１ （
８）； Ｌｅｕ、 ２２．２（２２）； Ｔｙｒ、 ３
．０（３）；Ｐｈｅ、６．０（６）； Ｌｙｓ、７．３
；Ｈ４ｓ、３．０（３）； Ａｒｇ。
３）； Ｓｅｒ、 ７．１（８）；Ｇｌｙ、１８．６（
１ｇ）；Ｐｒｏ、５．５（５）；Ｇｌｙ、２．２（２）
；Ａｌａ、 ５．０（５）； Ｖａｌ、 ３．７（４）
； Ｍｅｔ、 ３．９（４）； ｒＩｅ、 ８．１ （
８）； Ｌｅｕ、 ２２．２（２２）； Ｔｙｒ、 ３
．０（３）；Ｐｈｅ、６．０（６）； Ｌｙｓ、７．３
；Ｈ４ｓ、３．０（３）； Ａｒｇ。
３．９（４）； Ｃｙｓ、’ｌ’ ｒｐ、分解、ｒ、Ｉ
Ｌ−２には１１個のＬｙｓが含まれているので、上記の
結果から、百Ｌ−２中のＬｙｓのε〜ルアミノの約３３
．６％がポリエチレングリコールメチルエーテルで修飾
されていることが分った。水晶について、Ｉ Ｌ −２
依存性マウスナチユラルキラ一細胞株（ＮＫＣ３）の生
育を［３Ｈ］−チミジンのＤＮＡへの取り込みを指標と
して測定する日沼ら［バイオケミカルアンドバイオフイ
ジカリリサーチコンミュニケインヨン１０９巻３６３〜
３６９頁（１９８２）］の方法に従って、ｒＬ−２活性
をめると２２９９８単位／ｍｇであった。ｒＩＬ−２を
４００００単位／ｍｇとすると５７．７％の活性を保持
していることになる。また水晶をラットに投与すると、
明らかな血中クリアランスの遅延化が認められた。
Ｌ−２には１１個のＬｙｓが含まれているので、上記の
結果から、百Ｌ−２中のＬｙｓのε〜ルアミノの約３３
．６％がポリエチレングリコールメチルエーテルで修飾
されていることが分った。水晶について、Ｉ Ｌ −２
依存性マウスナチユラルキラ一細胞株（ＮＫＣ３）の生
育を［３Ｈ］−チミジンのＤＮＡへの取り込みを指標と
して測定する日沼ら［バイオケミカルアンドバイオフイ
ジカリリサーチコンミュニケインヨン１０９巻３６３〜
３６９頁（１９８２）］の方法に従って、ｒＬ−２活性
をめると２２９９８単位／ｍｇであった。ｒＩＬ−２を
４００００単位／ｍｇとすると５７．７％の活性を保持
していることになる。また水晶をラットに投与すると、
明らかな血中クリアランスの遅延化が認められた。
参考例１ ポリエチレングリコールメチルエーチルアル
デヒドの合成 （１）ポリエチレングリコ−ルメヂルエーテル（５ｇ、
平均分子量５，０００）を塩化メチレン（１００ｍｌ）
に溶かし、クロルクロム酸ピリジニウム（３３０ｍｇ）
を加え、室温で１２時間かきまぜた。反応液を２倍量の
塩化メチレンでうすめて、フロリジルのカラム（６Ｘ
ＩＯｃｍ）に注ぎ込み、カラムを塩化メチレン、ついで
クロロポルムで洗ったのち、メタノール−クロロホルム
（１・９）で溶出した。２．４−ジニトロフェニルヒド
ラジンテストで陽性の画分ヲ集めて、溶媒を減圧留去し
、結晶性のワックスを得た。収量１．５ｇ（３０％）、
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．０８（クロロホル
ム：メタノール：酢酸−９＝１ ：０．５．シリカゲル
）、１３Ｃ−ＮＭＲで９６．２ＰＰＭに水和した型（ｑ
Ｈ（ＯＨ）Ｊでアルデヒド基の吸収を認めた。
デヒドの合成 （１）ポリエチレングリコ−ルメヂルエーテル（５ｇ、
平均分子量５，０００）を塩化メチレン（１００ｍｌ）
に溶かし、クロルクロム酸ピリジニウム（３３０ｍｇ）
を加え、室温で１２時間かきまぜた。反応液を２倍量の
塩化メチレンでうすめて、フロリジルのカラム（６Ｘ
ＩＯｃｍ）に注ぎ込み、カラムを塩化メチレン、ついで
クロロポルムで洗ったのち、メタノール−クロロホルム
（１・９）で溶出した。２．４−ジニトロフェニルヒド
ラジンテストで陽性の画分ヲ集めて、溶媒を減圧留去し
、結晶性のワックスを得た。収量１．５ｇ（３０％）、
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．０８（クロロホル
ム：メタノール：酢酸−９＝１ ：０．５．シリカゲル
）、１３Ｃ−ＮＭＲで９６．２ＰＰＭに水和した型（ｑ
Ｈ（ＯＨ）Ｊでアルデヒド基の吸収を認めた。
（１１）ポリエチレングリコールメチルエーテル（１０
ｇ、平均分子量５，０００）を三級ブタノール（１００
ｍｌ）に溶かし、カリウム三級ブトキシド（４，１７ｇ
）を加え、ついでブロムアセタール（２，５６ｍ１）を
加え、４０℃で２時間かきまぜた。三級ブタノールを減
圧下留去し、残留物に水を加え、ついでクロロホルム（
２００ｍｌ Ｘ ２ ）で抽出した。水で洗い、無水硫
酸ナトリウムで乾燥した。クロロホルムを減圧下留去し
、残留物に石油ベンジンを加え、生ずる結晶性残渣をろ
取し、エーテルで洗浄して対応するポリエチレングリコ
−ルメヂルエーテルジエチルアセクール９．５ｇ（９５
％）が得られた。この内５ｇを取り、０．０５Ｍ ）リ
フルオロ酢酸５０ｍ１に溶かし、沸とう水中で３０分間
処理したあと凍結乾燥し、（ｉ）で得たものよりも一〇
−ＣＨ２ＣＨ２だけ鎖長の長いポリエチレングリコール
メチルエーテルアルデヒドが得られた。
ｇ、平均分子量５，０００）を三級ブタノール（１００
ｍｌ）に溶かし、カリウム三級ブトキシド（４，１７ｇ
）を加え、ついでブロムアセタール（２，５６ｍ１）を
加え、４０℃で２時間かきまぜた。三級ブタノールを減
圧下留去し、残留物に水を加え、ついでクロロホルム（
２００ｍｌ Ｘ ２ ）で抽出した。水で洗い、無水硫
酸ナトリウムで乾燥した。クロロホルムを減圧下留去し
、残留物に石油ベンジンを加え、生ずる結晶性残渣をろ
取し、エーテルで洗浄して対応するポリエチレングリコ
−ルメヂルエーテルジエチルアセクール９．５ｇ（９５
％）が得られた。この内５ｇを取り、０．０５Ｍ ）リ
フルオロ酢酸５０ｍ１に溶かし、沸とう水中で３０分間
処理したあと凍結乾燥し、（ｉ）で得たものよりも一〇
−ＣＨ２ＣＨ２だけ鎖長の長いポリエチレングリコール
メチルエーテルアルデヒドが得られた。
（ｉｉｉ） ポリエチレングリコールメチルエーテル（
５，７ｇ、平均分子量１，９００）を塩化メチレン（１
００ｍｌ）に溶かし、クロルクロム酸ピリジニウム（９
７０ｍｇ）を加え、室温で１２時間かきまぜた。反応液
を塩化メチレンで希釈し、フロリジルのカラム（６，０
ＸＩＯ。
５，７ｇ、平均分子量１，９００）を塩化メチレン（１
００ｍｌ）に溶かし、クロルクロム酸ピリジニウム（９
７０ｍｇ）を加え、室温で１２時間かきまぜた。反応液
を塩化メチレンで希釈し、フロリジルのカラム（６，０
ＸＩＯ。
Ｏｃｍ）に注ぎ込み、カラムを塩化メチレン、ついでク
ロロホルムで洗ったあと、１０％メタノール／クロロホ
ルムで溶出した。２．４＝ジニトロフエニルヒドラジン
テストで陽性の両分を集めて、溶媒を留去すると結晶性
のワックスを得た。収１１１．８ｇ（３０％）、薄層ク
ロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．１０（クロロホルム、メ
タノール：酢酸−９： ｌ ：０．５．シリカゲル）”
Ｃ−ＮＭＲで９６．２Ｐ Ｐ Ｍに水和した形（−ＣＨ
（ＯＨ）２）でアルデヒド基の吸収を認めた。
ロロホルムで洗ったあと、１０％メタノール／クロロホ
ルムで溶出した。２．４＝ジニトロフエニルヒドラジン
テストで陽性の両分を集めて、溶媒を留去すると結晶性
のワックスを得た。収１１１．８ｇ（３０％）、薄層ク
ロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．１０（クロロホルム、メ
タノール：酢酸−９： ｌ ：０．５．シリカゲル）”
Ｃ−ＮＭＲで９６．２Ｐ Ｐ Ｍに水和した形（−ＣＨ
（ＯＨ）２）でアルデヒド基の吸収を認めた。
（ｉｖ） ポリエチレングリコールメチルエーテル（１
９，５ｇ、平均分子＠ １９００）を三級ブタノール（
１００ｍｌ）に溶かし、カリウム三級ブトキシド（１０
，４ｇ）を、ついでブロムアセクール（６，４ｍ１）を
加え、４０℃で２時間かきまぜた。三級ブタノールを減
圧で留去し、残留物に水を加え、ついでクロロホルム（
２００ｍｌ；ｘ２）で抽出した。反応液を水洗、ついで
無水硫酸ナトリウムで乾燥した。クロロホルムを減圧下
留去し、残留物に石油ベンジンを加え、生ずる結晶性残
留物をろ取し、エーテルで洗浄しアセタール８．５ｇ（
８９，５％）を得た。この内３ｇを０．０５Ｍトリフル
オロ酢酸に溶かし、沸とう水中で３０分間処理したあと
、凍結乾燥し、（ｉｉｉ）で得たものよりも−０−ＣＨ
，ＣＨｔ−だけ鎖長の長いポリエチレングリコールメチ
ルエーテルアルデヒドが得られた。
９，５ｇ、平均分子＠ １９００）を三級ブタノール（
１００ｍｌ）に溶かし、カリウム三級ブトキシド（１０
，４ｇ）を、ついでブロムアセクール（６，４ｍ１）を
加え、４０℃で２時間かきまぜた。三級ブタノールを減
圧で留去し、残留物に水を加え、ついでクロロホルム（
２００ｍｌ；ｘ２）で抽出した。反応液を水洗、ついで
無水硫酸ナトリウムで乾燥した。クロロホルムを減圧下
留去し、残留物に石油ベンジンを加え、生ずる結晶性残
留物をろ取し、エーテルで洗浄しアセタール８．５ｇ（
８９，５％）を得た。この内３ｇを０．０５Ｍトリフル
オロ酢酸に溶かし、沸とう水中で３０分間処理したあと
、凍結乾燥し、（ｉｉｉ）で得たものよりも−０−ＣＨ
，ＣＨｔ−だけ鎖長の長いポリエチレングリコールメチ
ルエーテルアルデヒドが得られた。
（ｖ）平均分子量７５０．５５０．３５０のポリエチレ
ングリコールメチルエーテルを上記と同様の方法で対応
するアルデヒドに導いた。
ングリコールメチルエーテルを上記と同様の方法で対応
するアルデヒドに導いた。
参考例２ アルカノイルポリエチレングリコールアルデ
ヒドの合成 （ｉ） 平均分子量１５００のポリエチレングリコール
１５４０ （和光純薬製）１５ｇをピリジン５０ｍ１に
溶かし無水酢酸１．８５ｍ１を添加し、かきまぜながら
４０℃で２時間、さらに室温で１６時間反応させ、反応
後、溶媒を減圧留去した。クロロホルムに溶解し、水洗
後、クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、クロ
ロホルムを減圧留去した。残留物を少量のクロロホルム
に溶解し、石油ヘンノン−エーテル（２：１）混液を加
えて放置し、結晶性のワックス１４ｇ（９０％）を得た
。この内１．４ｇをとり５０ｍ１の塩化メチレンに溶解
、クロルクロム酸ピリジニウム３００ｍｇを加えて室温
で１８時間かきまぜながら反応させた。反応液をシリカ
ゲルＣ−２００（和光紬薬製）のカラム（３ｘ ５０ｃ
ｍ）に通し、５％メタノール−クロロポルム（２００ｍ
ｌ）で洗ったのち、１０％メタノール−クロロホルムで
溶出した。２．４−ジニトロフェニルヒドラジンテスト
陽性画分を集めて溶媒を減圧留去して、結晶性ワックス
を得た。収１１５８０ｍｇ（４１％） （１１）平均分子量１０００のポリエチレングリコール
１０００（和光紬薬製）２０ｇを塩化メチレン５０ｍ１
に溶解、無水ｎ−カプロン酸５．１５ｇを加えて７０℃
で２時間反応させた。溶媒を留去し、シリカゲルＣ−２
００（３ｘ５０ｃｍ） カラムを用いて、酢酸エチル−
メタノール（４：Ｉ）で溶出して精製し、冷蔵庫中では
固化する油状物１４．９ｇ（６０％）を得た。（ｉ）と
同様にクロルクロム酸ピリジニウムで酸化してアルデヒ
ド体を得た。
ヒドの合成 （ｉ） 平均分子量１５００のポリエチレングリコール
１５４０ （和光純薬製）１５ｇをピリジン５０ｍ１に
溶かし無水酢酸１．８５ｍ１を添加し、かきまぜながら
４０℃で２時間、さらに室温で１６時間反応させ、反応
後、溶媒を減圧留去した。クロロホルムに溶解し、水洗
後、クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、クロ
ロホルムを減圧留去した。残留物を少量のクロロホルム
に溶解し、石油ヘンノン−エーテル（２：１）混液を加
えて放置し、結晶性のワックス１４ｇ（９０％）を得た
。この内１．４ｇをとり５０ｍ１の塩化メチレンに溶解
、クロルクロム酸ピリジニウム３００ｍｇを加えて室温
で１８時間かきまぜながら反応させた。反応液をシリカ
ゲルＣ−２００（和光紬薬製）のカラム（３ｘ ５０ｃ
ｍ）に通し、５％メタノール−クロロポルム（２００ｍ
ｌ）で洗ったのち、１０％メタノール−クロロホルムで
溶出した。２．４−ジニトロフェニルヒドラジンテスト
陽性画分を集めて溶媒を減圧留去して、結晶性ワックス
を得た。収１１５８０ｍｇ（４１％） （１１）平均分子量１０００のポリエチレングリコール
１０００（和光紬薬製）２０ｇを塩化メチレン５０ｍ１
に溶解、無水ｎ−カプロン酸５．１５ｇを加えて７０℃
で２時間反応させた。溶媒を留去し、シリカゲルＣ−２
００（３ｘ５０ｃｍ） カラムを用いて、酢酸エチル−
メタノール（４：Ｉ）で溶出して精製し、冷蔵庫中では
固化する油状物１４．９ｇ（６０％）を得た。（ｉ）と
同様にクロルクロム酸ピリジニウムで酸化してアルデヒ
ド体を得た。
参考例３ ＩＦＮ−γｄ２の製造
（１）形質転換体の製造
ＩＰＮ−７発現プラスミドｐＨＩ Ｔｔｒｐ ｌ１ｏｌ
［Ｅｐｃ公開第１１００４４号公報実施例２（ｉｉｉ
）参照］を制限酵素Ａｖａｉｌ、ＰｓｔＩで消化し、Ｉ
ＦＮ−７遺伝子部分を含むＡｖａ［［−Ｐｓｔ Ｉｋｂ
ＤＮＡ断片を分取した。このＤＮＡ断片に、トリエステ
ル法によって化学合成した蛋白合成開始コドンを含むオ
リゴヌクレオチドアダプター ＣＧＡＴＡＡＴＧＴＧＣＣＡＧ ＴＡＴＴＡＣＡＣＧＧＴＣＣＴＧ をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてＡｖａＵののりしろ部分
に結合させた。
［Ｅｐｃ公開第１１００４４号公報実施例２（ｉｉｉ
）参照］を制限酵素Ａｖａｉｌ、ＰｓｔＩで消化し、Ｉ
ＦＮ−７遺伝子部分を含むＡｖａ［［−Ｐｓｔ Ｉｋｂ
ＤＮＡ断片を分取した。このＤＮＡ断片に、トリエステ
ル法によって化学合成した蛋白合成開始コドンを含むオ
リゴヌクレオチドアダプター ＣＧＡＴＡＡＴＧＴＧＣＣＡＧ ＴＡＴＴＡＣＡＣＧＧＴＣＣＴＧ をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてＡｖａＵののりしろ部分
に結合させた。
プラスミドＰｔｒｐ７７１上記公開公報実施例２（１υ
参照］を制限酵素Ｃ］ａ１．Ｐｓｔｌで切断し、て得た
ＤＮＡ断片のｔｒｐプロモーターの下流に上記アダプタ
ーを結合させた上記遺伝子を挿入して、−ドする発現プ
ラスミドｐＨＩ Ｔｔｒｐ １１旧−ｄ２を構築した（
第３図）。
参照］を制限酵素Ｃ］ａ１．Ｐｓｔｌで切断し、て得た
ＤＮＡ断片のｔｒｐプロモーターの下流に上記アダプタ
ーを結合させた上記遺伝子を挿入して、−ドする発現プ
ラスミドｐＨＩ Ｔｔｒｐ １１旧−ｄ２を構築した（
第３図）。
このプラスミドｐｌ（Ｉ ’ｒｔｒｐ ｔｔｏｔ−ｄ２
を用いてＣｏｈｅｎらの方法［プロシージング オプ
ナショナル アカデミ−オブ サイエンスＵＳＡ、第６
９巻、２１１０頁（１９７２）］に従って大腸菌２９４
を形質転換し、このプラスミドを含む形質転換体エシェ
リヒア コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ＝
Ｅ、 ｃｏｌｉ）２９４／ｐＨＴ Ｔｔｒｐ １１０１
−ｄ２を得た。
を用いてＣｏｈｅｎらの方法［プロシージング オプ
ナショナル アカデミ−オブ サイエンスＵＳＡ、第６
９巻、２１１０頁（１９７２）］に従って大腸菌２９４
を形質転換し、このプラスミドを含む形質転換体エシェ
リヒア コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ＝
Ｅ、 ｃｏｌｉ）２９４／ｐＨＴ Ｔｔｒｐ １１０１
−ｄ２を得た。
（ｉｉ） 形質転換体の培養
上記（１）で構築したプラスミドを含む菌株Ｅ。
ｃｏｌｉ ２９４／ｐＨｒ Ｔｔｒｌ）１１０１−ｄ２
を８μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、０．４％カザミノ
酸、１％グルコースを含むＭ９培地を用いて３７℃で培
養し、生育ｈ（ＫＵ２２０に達した時に３βインドリル
アクリル酸（ＩＡＡ）を２５μｇ／ｍｌになるように加
えて更１こ４時間培養した。培養後、遠心分離して菌体
を集め、これを１／１０量の１０％蔗糖を含む０．０５
Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ ｐＨ７，６に懸濁した。この
懸濁液にフェニルメチルスルフォニルフルオライド、Ｎ
ａＣ１，エチレンジアミンテトラアセテ−）（ＥＤＴＡ
）、スペルミンン、リゾチームをそれぞれＩ ｍＭ 、
ｌｏｍＭ 、 ４０ｍＭおよび２００μｇ／ｍｌとな
るように加えて、０℃で１時間放置したのち、３７℃で
３分処理して溶菌液この溶菌液を４℃、 ２０００Ｏｒ
ｐｍ （サーノ（ル遠心機ＳＳ〜３４０−ターで３０分
間遠心分離して、ＩＰＮ−γｄ２ポリペプチドを含む上
清を得た。この上清の抗ウィルス活性を測定すると、２
．８７ Ｘｌ０８Ｕ／ 培養液であった。
を８μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、０．４％カザミノ
酸、１％グルコースを含むＭ９培地を用いて３７℃で培
養し、生育ｈ（ＫＵ２２０に達した時に３βインドリル
アクリル酸（ＩＡＡ）を２５μｇ／ｍｌになるように加
えて更１こ４時間培養した。培養後、遠心分離して菌体
を集め、これを１／１０量の１０％蔗糖を含む０．０５
Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ ｐＨ７，６に懸濁した。この
懸濁液にフェニルメチルスルフォニルフルオライド、Ｎ
ａＣ１，エチレンジアミンテトラアセテ−）（ＥＤＴＡ
）、スペルミンン、リゾチームをそれぞれＩ ｍＭ 、
ｌｏｍＭ 、 ４０ｍＭおよび２００μｇ／ｍｌとな
るように加えて、０℃で１時間放置したのち、３７℃で
３分処理して溶菌液この溶菌液を４℃、 ２０００Ｏｒ
ｐｍ （サーノ（ル遠心機ＳＳ〜３４０−ターで３０分
間遠心分離して、ＩＰＮ−γｄ２ポリペプチドを含む上
清を得た。この上清の抗ウィルス活性を測定すると、２
．８７ Ｘｌ０８Ｕ／ 培養液であった。
（ｉｉｉ） ＩＦＮ−γｄ２の精製
上記（１１）と同様の方法で得た凍結菌体５．９ｇを７
Ｍ塩酸グアニジンおよび２ｍＭフェニルメチルスルホニ
ルフルオライドを含む０．１Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）１ｇＩＩｌｌに懸濁し、４℃で１時間攪拌し
たのち１０，０００Ｘｇで３０分間遠心分離にかけて上
清２０ｍ１を得た。この上清に１３７ｍＭ塩化ナトリウ
ム、２゜７ｍＭ塩化カリウム、８．１ｍＭリン酸二ナト
リウムおよび１ 、５ｍＭリン酸−カリウムから成る緩
衝液（ｐＨ７，４）（以下ＰＢＳと略す）２６０ｍｌを
加えて希釈し、抗体カラム（Ｍｏ７２−１１．１．カラ
ム容量１２ｍ１）に流速１ｍ１／分でかけた。そののち
、０．５Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７゜０）６０ｍｌでカラムを洗浄し、
ついで、２Ｍ塩酸グアニジンを含む２０＋ａＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７０）３６ｍｌで溶出し、抗ウィ
ルス活性を有する画分２０ｍ１を得た。
Ｍ塩酸グアニジンおよび２ｍＭフェニルメチルスルホニ
ルフルオライドを含む０．１Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）１ｇＩＩｌｌに懸濁し、４℃で１時間攪拌し
たのち１０，０００Ｘｇで３０分間遠心分離にかけて上
清２０ｍ１を得た。この上清に１３７ｍＭ塩化ナトリウ
ム、２゜７ｍＭ塩化カリウム、８．１ｍＭリン酸二ナト
リウムおよび１ 、５ｍＭリン酸−カリウムから成る緩
衝液（ｐＨ７，４）（以下ＰＢＳと略す）２６０ｍｌを
加えて希釈し、抗体カラム（Ｍｏ７２−１１．１．カラ
ム容量１２ｍ１）に流速１ｍ１／分でかけた。そののち
、０．５Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７゜０）６０ｍｌでカラムを洗浄し、
ついで、２Ｍ塩酸グアニジンを含む２０＋ａＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７０）３６ｍｌで溶出し、抗ウィ
ルス活性を有する画分２０ｍ１を得た。
この両分２０ｍ１をあらかじめＩＲＩＭエチレンジアミ
ン四酢酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、 １０ｍＭシス
ティンおよび２Ｍ塩酸グアニジンを含む２５ｍＭ酢酸ア
ンモニウム緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したセファク
リルＳ’−２００（ファルマシア社製）のカラム（２゜
６Ｘ ９４ｃｍ、カラム容量５００ｍ１）にかけ、同一
緩衝液で溶出して抗ウィルス活性を有する画分３７ｍ１
を得た。
ン四酢酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、 １０ｍＭシス
ティンおよび２Ｍ塩酸グアニジンを含む２５ｍＭ酢酸ア
ンモニウム緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したセファク
リルＳ’−２００（ファルマシア社製）のカラム（２゜
６Ｘ ９４ｃｍ、カラム容量５００ｍ１）にかけ、同一
緩衝液で溶出して抗ウィルス活性を有する画分３７ｍ１
を得た。
２
ここで得られたＣｙｓ−Ｔｙｒ欠落ＩＦＮ−γのポリペ
プチド（ＩＦＮ−γｄ２）は５．９ｍｇであり比活性は
（１，ＯＸ １０７Ｕ／ｍｇ）であった。
プチド（ＩＦＮ−γｄ２）は５．９ｍｇであり比活性は
（１，ＯＸ １０７Ｕ／ｍｇ）であった。
参考例４ １ＦＮ−γｄ３の製造
（ｉ） 形質転換体の製造
ＩＦＮ−７発現プラスミドルＲＣ２３／ ｌ Ｆ Ｉ
−９００［ＲＰＣ公開第００８９６７６号公報実施例７
参照］を制限酵素ＮｄｅＩ、Ｎｃｏｌで消化し、ＩＦＮ
−７遺伝子部分を含むＮｄｅｌ −ＮｃｏＴ ７１０ｂ
ｐ ＤＮＡ断片（Ａ）を分取した。一方、プラスミドｐ
Ｒ０２３を制限酵素Ｂｇｌ Ｉｔ 、ＥｃｏＲＩで消化
し、λＰＬ、プロモーターを含む２６５ｂｐのＤＮＡ断
片（Ｂ）を分取した。（Ａ）、（Ｂ）と化学合成して得
た蛋白合成開始フトンを含むオリゴヌクレオチドアダプ
ター ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＡ （、Ｔ Ａ ＣＧ Ｔ ＣＣＴ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ａ
ＴをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてＮｄｅｌとＥｃｏＲＩ
ののりしろ部分に結合させた。得られたＤＮＡ断片をＮ
Ｃ０ＩとＢｇｌ ＩＩで処理して得たプラスミドＣｙｓ
欠落ＩＦＮ−γのポリペプチドをコードする発現プラス
ミドｐｔ、ｃ２を構築した。（第４図）このプラスミド
ｐｌ、Ｃ２を用いてＣｏｈｅｎらの方法［館山］に従っ
て大腸菌ＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ ｃｌｔｓ）を形質転換
し、形質転換体 エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ＝Ｅ、 ｃｏｌｉ） ＲＲＩ （ｐ
ＬＣ２、ｐＲＫ２４＆ ｃＩ ｔｓ）を得た。
−９００［ＲＰＣ公開第００８９６７６号公報実施例７
参照］を制限酵素ＮｄｅＩ、Ｎｃｏｌで消化し、ＩＦＮ
−７遺伝子部分を含むＮｄｅｌ −ＮｃｏＴ ７１０ｂ
ｐ ＤＮＡ断片（Ａ）を分取した。一方、プラスミドｐ
Ｒ０２３を制限酵素Ｂｇｌ Ｉｔ 、ＥｃｏＲＩで消化
し、λＰＬ、プロモーターを含む２６５ｂｐのＤＮＡ断
片（Ｂ）を分取した。（Ａ）、（Ｂ）と化学合成して得
た蛋白合成開始フトンを含むオリゴヌクレオチドアダプ
ター ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＡ （、Ｔ Ａ ＣＧ Ｔ ＣＣＴ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ａ
ＴをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてＮｄｅｌとＥｃｏＲＩ
ののりしろ部分に結合させた。得られたＤＮＡ断片をＮ
Ｃ０ＩとＢｇｌ ＩＩで処理して得たプラスミドＣｙｓ
欠落ＩＦＮ−γのポリペプチドをコードする発現プラス
ミドｐｔ、ｃ２を構築した。（第４図）このプラスミド
ｐｌ、Ｃ２を用いてＣｏｈｅｎらの方法［館山］に従っ
て大腸菌ＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ ｃｌｔｓ）を形質転換
し、形質転換体 エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ＝Ｅ、 ｃｏｌｉ） ＲＲＩ （ｐ
ＬＣ２、ｐＲＫ２４＆ ｃＩ ｔｓ）を得た。
（ｉｉ） 形質転換体の培養
上記（１）で構築したプラスミドを含む菌株Ｅ。
ｃｏｌｉ ＲＲＩ （ｐＬ Ｃ２、ｐＲＫ２４８ ｃｌ
ｔｓ）を１％バクトドリプトン、０５％酵母エキス、
０．５％食塩、７μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む液
体培地５０ｍ１中で、３５℃、１２時間振とう培養を行
った。培養液を０゜５％カザミノ酸、０．５％グルコー
ス、７μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＭ９培地２
．５ に移し、３５℃で４時間、ついで４２℃で３時間
培養した。遠心分離して菌体を集め、−８０℃で保存し
た。
ｔｓ）を１％バクトドリプトン、０５％酵母エキス、
０．５％食塩、７μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む液
体培地５０ｍ１中で、３５℃、１２時間振とう培養を行
った。培養液を０゜５％カザミノ酸、０．５％グルコー
ス、７μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＭ９培地２
．５ に移し、３５℃で４時間、ついで４２℃で３時間
培養した。遠心分離して菌体を集め、−８０℃で保存し
た。
（ｉｉｉ） ＩＦＮ−γｄ３の精製
上記（１１）と同様の方法で得た凍結菌体７．１ｇを７
Ｍ塩酸グアニジンおよび２ｍＭフェニルメチルスルフォ
ニルフルオライドを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）２２ｍｌに懸濁し、４℃で１時間攪拌したの
ち１０．ＯＱＯＸｇで３０分間遠心分離にかけて上清２
４ｍ１を得た。この上清に１３７ｍＭ塩化ナトリウム。
Ｍ塩酸グアニジンおよび２ｍＭフェニルメチルスルフォ
ニルフルオライドを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）２２ｍｌに懸濁し、４℃で１時間攪拌したの
ち１０．ＯＱＯＸｇで３０分間遠心分離にかけて上清２
４ｍ１を得た。この上清に１３７ｍＭ塩化ナトリウム。
２．７ｍＭ塩化カリウム、８．１ｍＭリン酸二ナトリウ
ムおよび１．５ｍＭリン酸−カリウムから成る緩衝液（
ｐＨ７，４）３００ｍｌを加えて希釈し、抗体カラム（
Ｍｏ ７２−１１．１．カラム容量１５ｍ１）に流速１
ｍ１／分でかけた。そののち、０．５Ｍ塩酸グアニジン
を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）
６０＋ｎｌてカラムを洗浄し、ついで、２Ｍ塩酸グアニ
ジンを含む２０＋ｎＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
，０）４５ｍｌで溶出し、抗ウィルス活性を有する両分
２５ｍ１を得た。この両分２５ｍ１をあらかじめｌ＋ｎ
Ｍエチレンジアミン四酢酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウム
、 １０ｍＭシスティンおよび２Ｍ塩酸グアニジンを含
む２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６，０）で平
衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）
のカラム（２６Ｘ ９４ｃｍ）、カラム容量５００ｍ１
にかけ、同一緩衝液で溶出して抗ウィルス活性を有する
両分４０ｍ１を得た。
ムおよび１．５ｍＭリン酸−カリウムから成る緩衝液（
ｐＨ７，４）３００ｍｌを加えて希釈し、抗体カラム（
Ｍｏ ７２−１１．１．カラム容量１５ｍ１）に流速１
ｍ１／分でかけた。そののち、０．５Ｍ塩酸グアニジン
を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）
６０＋ｎｌてカラムを洗浄し、ついで、２Ｍ塩酸グアニ
ジンを含む２０＋ｎＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
，０）４５ｍｌで溶出し、抗ウィルス活性を有する両分
２５ｍ１を得た。この両分２５ｍ１をあらかじめｌ＋ｎ
Ｍエチレンジアミン四酢酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウム
、 １０ｍＭシスティンおよび２Ｍ塩酸グアニジンを含
む２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６，０）で平
衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）
のカラム（２６Ｘ ９４ｃｍ）、カラム容量５００ｍ１
にかけ、同一緩衝液で溶出して抗ウィルス活性を有する
両分４０ｍ１を得た。
のポリペプチド（ＩＦＮ−γｄ３）は、７．０ｍｇであ
り比活性は２．７２ｘ１０７Ｕ／ｍｇであった。
り比活性は２．７２ｘ１０７Ｕ／ｍｇであった。
参考例５ 非グリコジル化ヒトＩＬ−２の製造（１）形
質転換体の培養 形質転換体Ｅ、 ｃｏｌｉ ＤＨＩ／ｐＴＦ ４ ［特
顧昭５８−２２５０７９（昭和５８年１１月２８日出願
）明細書参照］を２５０ｍ１容三角フラスコ内のバクト
・トリプトン（ディフコ・ラボラトリーズ、゛アメリカ
月％、バクトイ−ストエキス（ディフコ・ラボラトリー
ズ、アメリカ）０．５％１食塩０．５％およびテトラサ
イクリン７μｇ／ｍ＋を含む液体培地（ｐＨ７，０）５
０ｍｌに接種して３７℃で１晩回転振盪培養した。この
培養液をカザミノ酸０．５％、グルコース０．５％およ
びテトラサイクリン７μｇ ／ ｍ ｌを含むＭ９培地
２．５の入った５容ジャーファーメンタ−に移し３７℃
で４時間、ついで３−β−インドリルアクリル酸（２５
μｇ／ｍｌ）を添加して、さらに４時間通気攪拌培養し
て培養液２．５を得た。この培養液を遠心分離し、菌体
を集め、−８０℃で凍結して保存した。
質転換体の培養 形質転換体Ｅ、 ｃｏｌｉ ＤＨＩ／ｐＴＦ ４ ［特
顧昭５８−２２５０７９（昭和５８年１１月２８日出願
）明細書参照］を２５０ｍ１容三角フラスコ内のバクト
・トリプトン（ディフコ・ラボラトリーズ、゛アメリカ
月％、バクトイ−ストエキス（ディフコ・ラボラトリー
ズ、アメリカ）０．５％１食塩０．５％およびテトラサ
イクリン７μｇ／ｍ＋を含む液体培地（ｐＨ７，０）５
０ｍｌに接種して３７℃で１晩回転振盪培養した。この
培養液をカザミノ酸０．５％、グルコース０．５％およ
びテトラサイクリン７μｇ ／ ｍ ｌを含むＭ９培地
２．５の入った５容ジャーファーメンタ−に移し３７℃
で４時間、ついで３−β−インドリルアクリル酸（２５
μｇ／ｍｌ）を添加して、さらに４時間通気攪拌培養し
て培養液２．５を得た。この培養液を遠心分離し、菌体
を集め、−８０℃で凍結して保存した。
（１１）抽出
上記で得た凍結保存菌体１２．１ｇを７Ｍ塩酸グアニジ
ン、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含む抽出液（ｐＨ７
゜０）１００ｍｌに均一に懸濁し、４℃で１時間攪拌し
た。
ン、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含む抽出液（ｐＨ７
゜０）１００ｍｌに均一に懸濁し、４℃で１時間攪拌し
た。
この溶菌液を２８．ＯＯＯＸｇで２０分間遠心分離して
上清９３ｍ１を得た。
上清９３ｍ１を得た。
（ｉｉｉ）ＩＬ−２蛋白質の精製
上記で得た上清を０．ＯＩＭ Ｔ ｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝
液（ｐＨ８，５）に対して透析後１９，０００ｘｇで１
０分間遠心分離して透析上清９４ｍ１を得た。この透析
上清を０、ＯＩＭ Ｔ ｒｉｓ −ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ
８，５）で平衡化したＤ Ｅ ５２（Ｄ Ｅ Ａ Ｅ−
セルロース、ワットマン社製。
液（ｐＨ８，５）に対して透析後１９，０００ｘｇで１
０分間遠心分離して透析上清９４ｍ１を得た。この透析
上清を０、ＯＩＭ Ｔ ｒｉｓ −ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ
８，５）で平衡化したＤ Ｅ ５２（Ｄ Ｅ Ａ Ｅ−
セルロース、ワットマン社製。
イギリス）カラム（５０ｍｌ容）に通して蛋白を吸着後
、ＮａＣ１濃度直線勾配（０〜０．１５Ｍ ＮａＣ１，
ｌ ）を作成してＩＬ−２を溶出させ、活性画分５３ｍ
１を得た。
、ＮａＣ１濃度直線勾配（０〜０．１５Ｍ ＮａＣ１，
ｌ ）を作成してＩＬ−２を溶出させ、活性画分５３ｍ
１を得た。
上記の活性画分５３ｍ１をＹＭ−５メンプラン（アミコ
ン社製、アメリカ）を用いて４．８ｍｌに濃縮し、０゜
１Ｍ Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ（ｐＨ８，０）−１Ｍ Ｎａ
Ｃ１緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−２００（ファ
ルマシア社製、スエーアン）カラム（５００ｍｌ容）を
用いてゲルろ過を行った。活性画分２８ｍ１をＹＩｖＬ
−５メンプランで２５ｍ１に濃縮した。得られた濃縮液
をウルトラポアＲＰ Ｓ Ｃ（アルテックス社製、アメ
リカ）カラムに吸着させ、トリフルオロ酢酸〜アセトニ
トリル系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフィー
を行った。カラム、ウルトラボアＲＰＳＣ（４，６ｘ７
５ｍ＋ｎ）；カラム温度、３０℃：溶出溶媒Ａ、０．１
％トリフルオロ酢酸−９９，９％水：溶出溶媒Ｂ 、０
．１％トリフルオロ酢酸−９９，９％アセトニトリル；
溶出プログラム、０分（６８％Ａ＋３２％Ｂ）−２５分
（５５％Ａ＋ ４５％Ｂ）−３５分（４５％Ａ＋５５％
Ｂ）−４５分（３０％Ａ＋７０％Ｂ）−４８分（１００
％Ｂ）；溶出速度、０．８ｍｌ／ｍｉｎ；検出波長、
２３０ｎｍ。本条件で保持時間約３９分の活性画分を集
め、非グリコジル化ヒトＩＬ−２蛋白質０．５３ｍｇ［
比活性、４０，０ＯＯＵ／ｍｇ、出発材料からの活性回
収率、 ３０．６％；蛋白質の純度、９９％（デンシト
メトリーによる）］を含む溶液１０ｍ１を得た。
ン社製、アメリカ）を用いて４．８ｍｌに濃縮し、０゜
１Ｍ Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ（ｐＨ８，０）−１Ｍ Ｎａ
Ｃ１緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−２００（ファ
ルマシア社製、スエーアン）カラム（５００ｍｌ容）を
用いてゲルろ過を行った。活性画分２８ｍ１をＹＩｖＬ
−５メンプランで２５ｍ１に濃縮した。得られた濃縮液
をウルトラポアＲＰ Ｓ Ｃ（アルテックス社製、アメ
リカ）カラムに吸着させ、トリフルオロ酢酸〜アセトニ
トリル系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフィー
を行った。カラム、ウルトラボアＲＰＳＣ（４，６ｘ７
５ｍ＋ｎ）；カラム温度、３０℃：溶出溶媒Ａ、０．１
％トリフルオロ酢酸−９９，９％水：溶出溶媒Ｂ 、０
．１％トリフルオロ酢酸−９９，９％アセトニトリル；
溶出プログラム、０分（６８％Ａ＋３２％Ｂ）−２５分
（５５％Ａ＋ ４５％Ｂ）−３５分（４５％Ａ＋５５％
Ｂ）−４５分（３０％Ａ＋７０％Ｂ）−４８分（１００
％Ｂ）；溶出速度、０．８ｍｌ／ｍｉｎ；検出波長、
２３０ｎｍ。本条件で保持時間約３９分の活性画分を集
め、非グリコジル化ヒトＩＬ−２蛋白質０．５３ｍｇ［
比活性、４０，０ＯＯＵ／ｍｇ、出発材料からの活性回
収率、 ３０．６％；蛋白質の純度、９９％（デンシト
メトリーによる）］を含む溶液１０ｍ１を得た。
発明の効果
本発明の化学修飾リンホカインは、リンホカインの生理
活性を維持し、生体内でのクリアランスが遅延化され、
抗原性も低下している。
活性を維持し、生体内でのクリアランスが遅延化され、
抗原性も低下している。
第１図は実施例１（ｉｖ）に開示したラット血漿中のク
リアランス遅延化効果を示す。○（酵素免疫測定法）お
よび口（抗ウィルス活性）は実施例１（ｉ）で得た本発
明の化学修飾Ｉ ＦＮ−αの・（酵素免疫測定法）およ
び■（抗ウィルス活性）は対照としたｒｌ ＦＮ−αＡ
の測定結果をそれぞれ示す。 第２図は実施例３（ｉｉ）に開示したラット血漿中のク
リアランス遅延化効果を示す。△および口はそれぞれ第
１表の化合物Ｎ０１８およびＮＯ１２の、・は対照とし
てのｒＩＦＮ−αＡの酵素免疫測定の結果を示す。 第３図は参考例３（１）に開示した発現プラスミドｐＨ
Ｉ Ｔ ｔｒｐ １１０１−ｄ２の構築図を、第４図は
参考例４（ｉ ）ｉ開示した発現プラスミドｐＬＣ２の
構築図をそれぞれ示す。 第１図 １ ３ ５ ７ ２４ 時間 第２図 時間
リアランス遅延化効果を示す。○（酵素免疫測定法）お
よび口（抗ウィルス活性）は実施例１（ｉ）で得た本発
明の化学修飾Ｉ ＦＮ−αの・（酵素免疫測定法）およ
び■（抗ウィルス活性）は対照としたｒｌ ＦＮ−αＡ
の測定結果をそれぞれ示す。 第２図は実施例３（ｉｉ）に開示したラット血漿中のク
リアランス遅延化効果を示す。△および口はそれぞれ第
１表の化合物Ｎ０１８およびＮＯ１２の、・は対照とし
てのｒＩＦＮ−αＡの酵素免疫測定の結果を示す。 第３図は参考例３（１）に開示した発現プラスミドｐＨ
Ｉ Ｔ ｔｒｐ １１０１−ｄ２の構築図を、第４図は
参考例４（ｉ ）ｉ開示した発現プラスミドｐＬＣ２の
構築図をそれぞれ示す。 第１図 １ ３ ５ ７ ２４ 時間 第２図 時間
Claims (4)
- （１）分子中の少なくとも１個の一級アミノ基に、Ｒイ
ｏ ＣＨ２ＣＨ２）基（Ｒは末端酸素の保護基。 ｎは任意に変わりうる正の整数）を直接結合してなる化
学修飾リンホカイン。 - （２）リンホカインとＲイ０−ＣＨｚＣＨｔ←−〇−１ ＣＨ、ＣＩ−１０（Ｒは末端酸素の保護基、■は任意に
変イつりうる正の整数）で示されるアルデヒドを還元剤
の存在下反応させることを特徴とする分子中の少なくと
も１個の１級アミノ基に、Ｒ−ｆ：０−ＣＨ，ＣＨ，升
基（Ｒおよびｎは前記と同意義）を直接結合してなる化
学修飾リンホカインの製造法。 - （３）反応を中性付近で行うことを特徴とする特許請求
の範囲第２項記載の製造法。 - （４）還元剤がノアノ水素化ホウ素ナトリウムで
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|---|---|---|---|
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| WO84/00085 | 1984-12-05 | ||
| WO84/00575 | 1984-12-05 |
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| JPH0696599B2 JPH0696599B2 (ja) | 1994-11-30 |
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| JP60037936A Expired - Lifetime JPH0696599B2 (ja) | 1984-03-06 | 1985-02-26 | 化学修飾リンホカインおよびその製造法 |
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Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62503171A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-12-17 | シタス コ−ポレイシヨン | ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化 |
| JPH04501260A (ja) * | 1988-10-20 | 1992-03-05 | ロイヤル・フリー・ホスピタル・スクール・オブ・メデイシン | 分画化方法 |
| JPH06192300A (ja) * | 1992-08-26 | 1994-07-12 | F Hoffmann La Roche Ag | インターフエロン抱合体 |
| US5880255A (en) * | 1988-10-20 | 1999-03-09 | Polymasc Pharmaceuticals Plc | Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct of PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| JP2001508783A (ja) * | 1997-01-29 | 2001-07-03 | ポリマスク・ファーマシューティカルズ・パブリック・リミテッド・カンパニー | Ｐｅｇ化法 |
| WO2007102562A1 (ja) * | 2006-03-01 | 2007-09-13 | Keio University | 新規抗血栓薬 |
| JP2008508310A (ja) * | 2004-07-29 | 2008-03-21 | ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド | がんおよび自己免疫障害を治療するためのｉｌ−２８およびｉｌ−２９の使用法 |
| US7691975B2 (en) | 2003-08-25 | 2010-04-06 | Toray Industries, Inc. | Interferon-β complex |
| JP2010215657A (ja) * | 1994-10-12 | 2010-09-30 | Amgen | Ｎ末端化学修飾タンパク質組成物および方法 |
| JP2016014022A (ja) * | 2002-01-18 | 2016-01-28 | バイオゲン エムエー インコーポレイテッド | 生物学的に活性な化合物の結合のための部分を有するポリアルキレングリコール |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2958019B2 (ja) * | 1988-05-06 | 1999-10-06 | 住友製薬株式会社 | ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法 |
| US5214131A (en) * | 1988-05-06 | 1993-05-25 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof |
| JP2997004B2 (ja) * | 1989-05-26 | 2000-01-11 | 住友製薬株式会社 | ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法 |
| US5342940A (en) * | 1989-05-27 | 1994-08-30 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Polyethylene glycol derivatives, process for preparing the same |
| FR2675807B1 (fr) * | 1991-04-23 | 1994-07-01 | Medgenix Group Sa | Conjugue de calcitonine et de polyethylene glycol. |
| US5359030A (en) * | 1993-05-10 | 1994-10-25 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
| ES2344679T3 (es) | 2000-08-11 | 2010-09-03 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Polipeptidos que controlan el metabolismo del acido fosforico, el metabolismo del calcio, el metabolismo de la calcificacion y de la vitamina d y moleculas de adn que los codifican. |
| EP1466925B1 (en) | 2001-12-28 | 2009-09-02 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Antibodies against fibroblast growth factor 23 |
| BR0317752A (pt) * | 2002-12-26 | 2005-11-22 | Mountain View Pharmaceuticals | Conjugados poliméricos de citocinas, quimiocinas, fatores do crescimento, hormÈnios polipeptìdicos e seus antagonistas com atividade de ligação a receptores conservada |
| EP1667708B9 (en) | 2002-12-26 | 2012-10-31 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | POLYETHYLENE GLYCOL CONJUGATES OF INTERFERON-BETA-1b WITH ENHANCED IN VITRO BIOLOGICAL POTENCY |
| EP1676862B1 (en) | 2003-09-24 | 2010-12-22 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Recombinant antibody against human insulin-like growth factor |
| RU2395294C2 (ru) * | 2004-06-18 | 2010-07-27 | Дженентек, Инк. | Способы применения агонистов аро-2l-рецепторов и активаторов nk-клеток |
| JPWO2006080171A1 (ja) | 2005-01-31 | 2008-06-19 | 株式会社 エフェクター細胞研究所 | 免疫増強剤 |
| WO2007066698A1 (ja) | 2005-12-06 | 2007-06-14 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | 抗ｐｅｒｐ遺伝子組換え抗体 |
| US7883705B2 (en) | 2007-02-14 | 2011-02-08 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Anti FGF23 antibody and a pharmaceutical composition comprising the same |
| EP2138576A4 (en) | 2007-03-16 | 2011-02-23 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | ANTI-CLAUDIN-4 ANTIBODY |
| KR20100097674A (ko) | 2007-12-05 | 2010-09-03 | 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 | 헤파린 결합 상피 세포 증식 인자 유사 증식 인자에 결합하는 단일 클론 항체 |
| CA2729567C (en) | 2008-06-30 | 2018-04-24 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Anti-cd27 antibody |
| CN103145835B (zh) | 2008-07-17 | 2014-10-29 | 协和发酵麒麟株式会社 | 抗-系统asc氨基酸转运蛋白2 (asct2)抗体 |
| ES2602459T3 (es) | 2008-12-26 | 2017-02-21 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Anticuerpo anti-CD4 |
| PT2423228E (pt) | 2009-04-20 | 2016-02-26 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | Anticorpo contendo igg2 em que foram introduzidas mutações de aminoácidos |
| ES2602971T3 (es) | 2010-03-02 | 2017-02-23 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Composición de anticuerpo modificado |
| ES2682078T3 (es) | 2010-06-11 | 2018-09-18 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Anticuerpo anti-TIM-3 |
| AU2012274461A1 (en) | 2011-06-20 | 2014-01-16 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Anti-erbB3 antibody |
| EP2868667B1 (en) | 2012-07-02 | 2019-01-30 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Therapeutic agent for anemia including renal anemia and cancer-induced anemia which contains anti-bmp9 antibody as active ingredient |
| CA2893378A1 (en) | 2012-12-07 | 2014-06-12 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Anti-folr1 antibody |
| CN110959014B (zh) | 2017-07-18 | 2024-01-16 | 协和麒麟株式会社 | 抗人ccr1单克隆抗体 |
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| AU2018384239A1 (en) | 2017-12-12 | 2020-07-02 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | Anti-BMP10 antibody, and therapeutic agent for hypertension and hypertensive diseases comprising said antibody as active ingredient |
| US20220017635A1 (en) | 2018-12-28 | 2022-01-20 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | BISPECIFIC ANTIBODY BINDING TO TfR |
| EP3971293A4 (en) | 2019-05-15 | 2023-02-08 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | BISPECIFIC ANTIBODIES CAPABLE OF BINDING TO CD40 AND GPC3 |
| US20220259328A1 (en) | 2019-05-15 | 2022-08-18 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | Bispecific antibody binding to cd40 and fap |
| WO2023027177A1 (ja) | 2021-08-26 | 2023-03-02 | 協和キリン株式会社 | Ｃｄ１１６およびｃｄ１３１に結合するバイスペシフィック抗体 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4002531A (en) * | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
| JPS57118789A (en) * | 1981-01-13 | 1982-07-23 | Eisai Co Ltd | Modified streptokinase and its preparation |
| JPS58154596A (ja) * | 1982-03-09 | 1983-09-14 | Toray Ind Inc | インタ−フエロンの修飾方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2433883C2 (de) * | 1973-07-20 | 1986-03-27 | Research Corp., New York, N.Y. | Verwendung von physiologisch aktiven Polypeptiden |
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| DE2930542A1 (de) * | 1979-07-27 | 1981-02-12 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate und verfahren zu ihrer herstellung |
| JPS57192435A (en) * | 1981-05-20 | 1982-11-26 | Toyobo Co Ltd | Modified polypeptide |
-
1984
- 1984-03-06 WO PCT/JP1984/000085 patent/WO1985003934A1/ja unknown
- 1984-05-14 AU AU28677/84A patent/AU2867784A/en not_active Abandoned
- 1984-12-05 WO PCT/JP1984/000575 patent/WO1985003868A1/ja unknown
-
1985
- 1985-02-13 JP JP60027283A patent/JPH0676439B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-02-26 JP JP60037936A patent/JPH0696599B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-05 KR KR1019850001381A patent/KR920007681B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-04-05 US US07/519,280 patent/USH1662H/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4002531A (en) * | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
| JPS57118789A (en) * | 1981-01-13 | 1982-07-23 | Eisai Co Ltd | Modified streptokinase and its preparation |
| JPS58154596A (ja) * | 1982-03-09 | 1983-09-14 | Toray Ind Inc | インタ−フエロンの修飾方法 |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62503171A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-12-17 | シタス コ−ポレイシヨン | ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化 |
| JPH04501260A (ja) * | 1988-10-20 | 1992-03-05 | ロイヤル・フリー・ホスピタル・スクール・オブ・メデイシン | 分画化方法 |
| EP0727437A2 (en) * | 1988-10-20 | 1996-08-21 | PolyMASC Pharmaceuticals plc | Covalent PEG-protein adducts |
| EP0439508B1 (en) * | 1988-10-20 | 1998-04-08 | PolyMASC Pharmaceuticals plc | Polyethylene glycolcol (peg)-protein adducts and process for their fractionation |
| US5880255A (en) * | 1988-10-20 | 1999-03-09 | Polymasc Pharmaceuticals Plc | Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct of PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| US6384195B1 (en) | 1988-10-20 | 2002-05-07 | Polymasc Pharmaceuticals Plc. | Process for fractionating polyethylene glycol (PEG) —protein adducts and an adduct of PEG and granulocyt-macrophage colony stimulating factor |
| JPH06192300A (ja) * | 1992-08-26 | 1994-07-12 | F Hoffmann La Roche Ag | インターフエロン抱合体 |
| JP2010215657A (ja) * | 1994-10-12 | 2010-09-30 | Amgen | Ｎ末端化学修飾タンパク質組成物および方法 |
| US8258262B2 (en) | 1994-10-12 | 2012-09-04 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| JP2001508783A (ja) * | 1997-01-29 | 2001-07-03 | ポリマスク・ファーマシューティカルズ・パブリック・リミテッド・カンパニー | Ｐｅｇ化法 |
| JP2016014022A (ja) * | 2002-01-18 | 2016-01-28 | バイオゲン エムエー インコーポレイテッド | 生物学的に活性な化合物の結合のための部分を有するポリアルキレングリコール |
| US7691975B2 (en) | 2003-08-25 | 2010-04-06 | Toray Industries, Inc. | Interferon-β complex |
| JP2008508310A (ja) * | 2004-07-29 | 2008-03-21 | ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド | がんおよび自己免疫障害を治療するためのｉｌ−２８およびｉｌ−２９の使用法 |
| US8361954B2 (en) | 2004-07-29 | 2013-01-29 | Zymogenetics, Inc. | Use of IL-28 and IL-29 to treat cancer and autoimmune disorders |
| WO2007102562A1 (ja) * | 2006-03-01 | 2007-09-13 | Keio University | 新規抗血栓薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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