DE2433883C2 - Verwendung von physiologisch aktiven Polypeptiden - Google Patents

Verwendung von physiologisch aktiven Polypeptiden

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Description

O O
O —O M OH
Vv /Ν_ -OC-CH-
-OCH2C-. I J
15 N N \/~· —OC-CH-.
-h/V
y γ ■
I r>
20 ι ο
"ζ)_. -NH.C-
besteht, wobei die mit—. bezeichneten Bindungen an das Polypeptid angefügt sind, mit der Ausnahme, daß dann, wenn der Kopplungsteil
-NH O
y
c—
ist. der Teil
O
.C —
ein Teil der Polypeptidcarboxygruppe ist.
|{ 45 Die Erfindung betrifft physiologisch aktive Polypeptide, insbesondere solche, die an Polyäthylenglycol mit || einem Molekulargewicht zwischen 500 und 5000 mit Hilfe eines Kopplungsteiles gekoppelt sind.
Durch die Veröffentlichung »Advances in Immunology 5, 30 (1966)« sind solche Polypeptide bekanntgewor-
den.
Erfindungsgemäß wird nun vorgeschlagen, derartige Polypeptide pharmazeutisch, nämlich als im wesenl-5(i liehen nicht immunogene Polypeptide einzusetzen. Eine solche Verwendung der wasserlöslichen Polypeptid-Kopplungsteil-Polymer-Verbindungen ist durch den Stand der Technik nicht nahegelegt worden.
Erfindungsgemäß sollen diese physiologisch aktiven Polypjptide also zur weitgehenden Unterdrückung der Immunogenizität dieser Peptide eingesetzt werden.
Dabei wird die physiologische Aktivität der Polypeptide erhalten.
55 Vorzugsweise wird vorgeschlagen, daß zwischen 10 und 100 Polymerteile pro Molekül Polypeptid vorhanden sind.
Weiterhin wird vorgeschlagen, daß der Kopplungsteil aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus
O —O x, OH
— OC-CH
-OCH2C-. Tl I —Ν
N N \y ■ — OC- CH-. I
Y Y Ii I
1 <~> ο I
NO2
—NH.C —
besteht, wobei die mit —. bezeichneten Bindungen an das Polypeptid angefügt sind. Dabei ist vorausgesetzt, daß dann, wenn der Kopplungsteil
O ίο
— NH.C —
ist, der Teil
ein Teil derPolypeptidcarboxygruppe ist. Nachdem bei Erhaltung der physiologischen Aktivität acr Polypeptide gleichzeitig kein immunogenes Ansprechen im Kreislaufsystem entsteht, ist es nunmehr möglich, ditse Verbindungen im Kreislaufsystem von Mensch und Säugetier ohne die bekannten Nachteile - nämlich Bildung von Antikörpern zu den Polypeptiden und Zerstörung dieser Polypeptide sowie Auftreten allergischer Wirkungen anzuwenden, und zwar in weit geringeren Mengen, als das bisher möglich erschien.
Die erfindungsgemäßen Maßnahmen sind allgemein für Polypeptide anwendbar; sie sind aber von besonderem Interesse für Anwendungsfälle, bei denen Enzyme und Insulin vorkommen.
Die Nichtimmunogenizität der erfindungsgemäß verwendeten Produkte kann durch Standard-Immunologie-Techniken demonstriert werden. Beispielsweise wird das nicht geschützte Polypeptid in ein Versuchstier injiziert, und das damit erzeugte Antisemit! wird gegen das geschützte Polypeptid auf antigenes Ansprechen durch Techniken wie Geldiffusion, Komplementärfixierung oder dergleichen getestet. Intradermale Injektionen des geschützten Polypeptids zeigen ebenfalls keine sofortig.: oder verzögerte Hypersensitivität. Wenn umgekehrt Versuchstiere mit dem geschützten Polypeptid injiziert wurden, zeigten die erhaltenen »Antisera« von den Versuchstieren keine Reaktion im Geldiffusionstest oder im Komplementärfixierungstest, und die Injektion mit dem ungeschützten Polypeptid zeigte keine sofortige oder verzögerte Art Hypersensilivitätsreaktion.
Wie vorstehend erwähnt, kann die Art des Schutzes in zwei Kategorien fallen. In der ersten Kategorie wird eine Kopplungsgruppe der Endgruppe des Polymers hinzugefügt. In der anderen bevorzugten Methode wird die Gruppe am End kohlenstoffatom, beispielsweise an der Hydroxygruppe, durch Umwandlung beispielsweise in eine Aminogruppe modifiziert, die dann mit dem Polypeptid gekoppelt wird, indem mit Kopplungsmitteln gearbeitet wird, die für diesen Zweck bekannt sind.
Inder ersten Kategorie können als geeignete Kopplungsgrupp'' Cyanurchlorid oder -fluorid genannt werden. Dabei wird Polyäthylenglycol (nachstehend PÄG) in einem geeigneten reaktionsinerten Lösungsmittel wie einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, zweckmäßigerweise wasserfreies Benzol mit einem geringen Anteil einer schwachen Base wie Natriumcarbonat und Cyanurchlorid in Zugabe dazu aufgenommen. Das Reaktronsgemisch wird dann mit Wasser abgeschreckt, unlösliches Material wird entfernt, und daran schließt sich die Entfernung des Lösungsmittels an, vorzugsweise unter reduziertem Druck, damit 2-PÄG-4-Hydroxy-6-ChIor-1,3,5-Triazin entsteht. Die in dieser Weise hergestellten aktivierten Polymere werden dann mit einer Lösung von Polypeptid in einer geeigneten Pufferlösung zur Reaktion gebracht. Nach vollständiger Reaktion wird das keine Reaktion eingegangene aktivierte Polymer entfernt, vorzugsweise dadurch, daß ein Kontakt mit einem Gelpermeationsgel wie Sephadev.G-50 hergestellt wird, und das geschützte Polypeptid wird entfernt und in der üblichen Weise gereinigt. Da diese Produkte als Polypeptide angesehen werden müisen, muß während des Reinigungsverfahrens darauf gecchtet werden, daß sie nicht denaturiert werden. Es ist deshalb wünschenswert, sie entweder in einer gepufferten wässerigen Lösung zu belassen oder, wenn das als wichtig angesehen wird, sie im festen Zustand zu isolieren, wobei diese isolierung durch das bekannte Verfahren wie die Lyophilisierung durchgeführt wird.
Eine andere geeignete Endgruppe ist die Acylazidendgruppe. Bei deren Herstellung wird das Enrlhydroxyl des Polymers mit Chloressigsäureanhydrid zur Reaktion gebracht, und anschließend mit Diazomethan, um den Mcthylcster des Carbomcthoxyäthers zu erhalten. Eine Behandlung mit Hydrazin führt zum entsprechenden llydrazid, das bei Behandlung mit Nitryisäure das gewünschte Acylazid ergih*..
Die Succinatgruppe kann ebenfalls als eine Kopplungsgruppe verwendet werden. In dieser Variante wird das Glycol, beispielsweise PAG oder PPG (Polypropylenglyeol) in einer geeigneten reaktionsinerten Lösung in m> Cicgenwart einer milden Base wie Natriumbicarbonat aufgenommen und mit einem Dihalosuccinsäi-reanhydrid wie Dibromsuccinsäureanhydrid behandelt. Das auf diese Weise hergestellte PÄG-Dihalosuccinat - als Beispiel - steht dann zur Reaktion mit einem Polypeptid zur Verfügung.
l-erncr steht die Anthranilatart zur Verfügung. In dieser Variante wird das Glycol wiederum in einem reaklionsinertcn Lösungsmittel aufgenommen und mit Isatosäureanhydrid behandelt, um den Anthranilatestcrzu ro erhalten, das ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe verwendet wird, bestehend aus der Diazotisierung. Die Dia/otisierung wird in der üblichen Weise durchgeführt, beispielsweise wird der Anthranilatester in Wasser aufgenommen, die Lösung wird sauer gemacht, zweckmäßigerweise mit Eisessigsäure, gekühlt, und es wird
Natriumnitrit zugesetzt. Das In dieser Weise hergestellte Diazoniumsalz steht zur Reaktion mit Polypeptiden zur Verfugung.
Eine interessante andere Variante unter Verwendung von Azidogruppen sieht die Anfügung einer A/.id-Kopplungsgruppe vor. Beispielsweise wird das Glycol in einer Pufferlösung mit 4-Fluor-3-Nitrophenylazid behandelt, das unreagierte Azid wird dann entfernt, vorzugsweise durch Dialyse.
Das fragliche Enzym, beispielsweise Lysozym, wird in Wasser aufgenommen, mit dem Reaktionsmittel zur Reaktion gebracht und erneut bestrahlt, damit beispielsweise PÄG-2-Nitrophenylloysozym entsteht.
In der vorstehenden Erörterung ist das Kohlenstoffatom des Polymers, an dem das Kopplungsmittel angefügt wird, das, das die Endhydroxygruppe trägt. Im Falle beispielsweise von PPG und PAG gibt es keine Probleme, ίο 'uei PVA gibt es jedoch potentielle Probleme. Zu beachten ist, daß PVA sekundäre (Rückgrat-)Hydroxylc und primäre (End-)Hydroxyle enthält. Die Reaktivität der primären Hydroxyle ist wesentlich stärker als die der sekundären Hydroxyle. Vorausgesetzt also, daß die Reaktion mit der aktivierenden Gruppe, beispielsweise Cyanurchlorid, in Gegenwart von überschüssigem Polymer vonstattengeht, erfolgt der größte Teil der Reaktion mit den Fndhydroxylen. Das ist erstrebenswert. Wenn jedoch eine Rückgratreaktion erwünscht wird, kann das durch Erhöhen der Menge an Aktivierungsmittel erreicht werden (z. B. Cyanurchlorid), mit dem gearbeitet wird. Das tatsächliche Verhältnis von primärer zu sekundärer Reaktion wird natürlich genauso durch die anderen Reaktionsbedingungen bestimmt.
Alternativ kann die Endhydroxylgruppe in eine Aminogruppe umgewandelt werden. Bei diesem Verfahren wird das Polymer an seiner Endhydroxylgruppe entweder mit einem Suifonierungsmittei wie Toiuoisuiibnyi- :» chlorid oder mit einem Halogenisierungsmittel wie Triphenylphosphin in KohlenstolTtetrachlorid oder Triphenylphosphin und einem geeigneten N-Halosuccimid zur Reaktion gebracht. Das aul diese Weiso hergestellte Ilalid oder Tosylat wird dann mit Natriumazid behandelt und mit Lithiumaluminiumhydrid reduziert, um die entsprechende Endaminoverbindung zu liefern.
Das Polymer, das die Endaminogruppe trägt, wird dann mit einer Carboxygruppe des Polypeptids unter :? Anwendung bekannter Verfahren gekoppelt. Die Verwendungeines wasserlöslichen Carbodiimids wie I-Cyclohexyl-3-(2-Morpholinäthyl)-Carbodiimid kommt dabei in Betracht. Es entsteht dabei eine Amidoverbindung, bestehend aus dem Stickstoff des Polymers und der entsprechenden Carbonylgruppe des Enzyms.
Anstelle einer direkten Kopplung der Aminogruppe zur Bildung oner Amidobindung mit dem Polypeplid kann die Kopplung über eine Maleimidgruppe vonstattengehen. In dieser Variante wird Omega-Amino-PÄG-Maleinsäureanhydrid zur Reaktion gebracht, und das entstehende N-PÄG-Maleimid wird mit dem gewünschten Polypeptid zur Reaktion gebracht.
Nachstehend bezeichnet die angefügte Zahl (z. B. PAG 750) das Molekulargewicht in Dalton des in Frage stehenden Polymers.
., - B e i s ρ i e I I
Uricase-PAG-Carbomethyl-Konjugation
a) Herstellung von PAG
->" 1. Herstellung \on PAG-Methyl-Carbomethoxyester
PAG 750 (2,0 g! wird in flüssigem Ammoniak (30 ml) aufgelöst, und die Lösung wird mit Natrium behandelt, bis die blaue Farbe 5 Minuten lang bestehenbleibt. Das Ammoniak läßt man mit einem Strom trockenen Stickstoffs verdampfen. Der Rest wird mit Methylchloracetat (5 ml) behandelt, und das Gemisch läßt man über -i- Nacht bei Raumtemperatur stehen, und schließlich wird es eine Stunde lang bei 1ÜO° erhitzt. Das überschüssige Reaktionsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt, um PÄG-Methylcarbomethoxyester zu erhalten.
2. Herstellung von PAG-Methoxycarbohydrazid
5Ί PÄG-Methylcarbomethoxyester (2,0 g), Methanol (300 ml) und Hydrazinhydrat (15 ml) werden über Nacht in Rücklauf versetzt, und die Lösung wird unter reduziertem Druck verdampft, um PAG-Methoxycarbohydrazid zu erhalten.
3. Herstellung von PÄG-Carboxymethylazid
Das vorstehende Hydrazid (1.0 g) wird η 2%iger Salzsäure (150 ml) aufgelöst, und 5%ige Natriumnitrillösung (9 m!) w ird langsam unier Rühren zugesetzt, und man läßt die Lösung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen, um eine Lösung aus PÄG-Carboxymethylazid zu erhalten, das in der Kopplungsphase verwendet wird.
wi b) Kopplung von Uricase (1.7.3.3) mit PÄG-Carboxymethylazid
Die das Azid enthaltende Lösung (16 ml, wie in Teil 3 vorstehend hergestellt) wird auf einen pH-Wert von 8,7
durch das Zusetzen von Natriumphosphat eingestellt. Uricase (25 mg) wird zugesetzt, und die Lösung wird zwei Stunden lang bei Raumtemperatur umgerührt. Die Lösung wird dialysiert, und das modifizierte Enzym wird
(.^ durch Chromatographie mit Sepnadex G-50 isoliert. Gegeber.enfaüs ergibt die Lyophiüsierung das gekoppelte Fn/ym in trockener Form.
Entsprechend den vorstehenden Veriahrensschritten. jedoch unter Verwendung von Asparaginase anstelle von Lricase. erhält man die entsprechende PAG-Asparaginase-Konjugation.
Beispiel II
C'aUilase-2-PÄG-4-llyclroxy-l,3,5-Triiizin-6-yl-Konjugation a) Herstellung von PÄG-4-Hydroxy-6-Chlor-l,3,5-Triazin
PÄCi 750 (30 g, 0,04 Mol) oder PAG 2000 (80 g, 0,04 Mol) wird in 150 ml wasserfreies Benzol aufgelöst, das 8 g Na2Ci)ι enthält. Die Lösung wird auf 10°abgekühlt, und es wird Cyanurchlorid (7,38 g,0,04 Mol) zugesetzt. Die Lösung wird über Nacht bei 10° umgerührt. Wasser (5 ml) wird zugesetzt, und die Lösung wird dann auf Raumtemperatur für mehrere Stunden gebrach·, und dem schließt sich eine Erwärmung auf40° über Nacht an. Unlös- u> lichcs Material wird abgeschleudert, und Lösungsmittel wird durch reduzierten Druck in einem Rotationsverdampfer bei 40° entfernt. Ein kleiner Anteil Niederschlag, der mitunter während der Konzentration erscheint, wird durch das Zusetzen einer kleinen Menge Benzol entfernt, um die Viskosität zu senken, gefolgt von einem Schleudern und einer Wiederkonzentrierung. Das PÄG-t-Hydroxy-o-Chlor-M^-Triazin. eine viskose Flüssigkeit bei 40°, wird im Gefrierfach gelagert.
b) Herstellung von PÄG-HTA-Catalase-Konjugation
Catalase (1.11.1.6) (60 mg, 8,7 χ 10'7MoI) wird in 3 ml 0,05M-BoratpulTerlösung aufgelöst, die einen pH-Wert von 9,0 hat. PAG 750 (470 mg) wird zugesetzt. Nach drei Stunden wird der pH-Wert auf 9,0 mit :» Natriumhydroxid erneut eingestellt, und die Lösung wird bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen. Der pH-Wert wird erneut auf 9,0 eingestellt. Nicht in Reaktion getretenes PAG wird entfernt, indem die Lösung durch eine Säule Sephadex G-50 geleitet wird. Die PÄG-HTA-Catalase-Konjugation wird in einem Rotationsverdampfer bis auf I mg Protein/ml konzentriert und im Gefrierfach gelagert (HTA = -4-HyCIrOXy-1,3,5-Triazin-6-yl). ~ :>
Entsprechend dem vorstehenden Verfahren, jedoch unter Verwendung von Carbowax 2000 wird ein ähnlich gekoppeltes Produkt erhalten. Wenn entsprechend nach dem vorstehenden Verfahren, jedoch anstelle von Catalase, D-Xyloseketolisomerase iXyloseisomerase) oder Insulin verwendet wird, erhält man die entsprechenden PÄG-HTA-Xyloseisomerase- und PÄG-HTA-lnsulin-Konjugationen.
Beispiel III
1.14.1.9; Cholesterol-20-Hydroxylase-N-PÄG-Maleimid-Konjugation
a) Herstellung von N-PÄG-Maleimid
Maieinsäureanhydrid (i,0g, 1/100 Mol), Benzol (50 ml) und Omega-Amino-PÄG (1/200 Mol) werden zwei Stunden lang in Rückfluß versetzt. Die Lösung wird unter reduziertem Druck verdampft und bei 2000C in einem Strom trockenen. Stickstoffs für die Dauer von zwei Stunden erhitzt.
b) Reaktion von N-PÄG-Maleimid mit Cholesterol-20-Hydroxylase (1.14.1.9)
Das Enzym (25 mg) wird oiner Lösung N-PÄG-Maleimid (70 mg) in O.lM-Phosphat-PulTerlösung (pH-Wert 7,0,10 ml) zugesetzt. Die Lösung läßt man bei Raumtemperatur eine Stunde lang stehen. Die Lösung wird dialysiert, und das gewünschte Produkt wird von dem Dialysat durch Chromatographie aul'Sephadex G-50 isoliert, um eine Lösung der Fnzym-PÄG-Konjugation zu erhalten, die gegebenenfalls iyophilisiert werden kann.
Beispiel IV
UDP-G lycuronyltransferase-PÄG-Succinat-Konjugation a) Herstellung von PÄG-Dibromsuccinat
PÄG (1,0 g) wird in trockenem Benzo! (10 ml) aufgelöst, das Natriumbicarbonat (1,0 g) enthält. Dibromsuccinsäureanhydrid (0,5 g) wird zugesetzt, und die Lösung wird über Nacht umgerührt. Die Lösung wird gefiltert, und das Filtrat wird unter reduziertem Druck konzentriert, um das PÄG-Dibromsuccinat zu erhalten.
Entsprechend dem vorstehenden Verfahren wird bei Verwendung von Diodosuccinsäureanhydrid anstelle von Dibromsuccinsäureanhydrid das entsprechende PÄG-Diodosuccinat erhalten.
b) UDP-GIucuronyltransferase-PÄG-Succinat
Das Enzym (2.4.1.17) (50 mg) in einer Pufferlösung (10 ml, pH-Wert 7,0) wird langsam mit PÄG-Dibromsuccinut (100 mg) in Wasser (5 ml) bei Raumtemperatur behandelt. Der pH-Wert wird zwischen 7-8 gehalten. Die gewünschte PÄG-Enzym-Konjugalion wird durch Chromatographie auf Sephadex G-50 isoliert. Gegebenenfalls kann das Produkt durch Lyophilisierung isoliert werden.
Beispiel V
Lysozym-4-Azido-2-Nitrophenyl-PÄG a) 4-Azido-2-Nitrophenyl-PÄG
PAG (!,Og) wird in einer BoratpufTerlösung mit einem pH-Wert von 9,8 (100 ml) aufgelöst, und die Lösung wird mit 4-Fluor-3-Nitrophenylazid (1,0 g) in Aceton (10 ml) behandelt. Das Reaktionsgemisch wird bei 40° über Nacht umgerührt und gefiltert. Das Filtrat wird gegen Wasser dialysiert, gefiltert und gefriergetrocknet.
b) Photochemische Bindung von Lysozym (3.2.1.17) mit 4-Azido-2-Nitrophenyl-PAG
Lysozym (60 mg) wird in 3 ml Wasser aufgelöst, und es wird 4-Azido-2-Nitrophenyl-PÄG (50 mg) zugesetzt. Die Lösung wurde 18 Stunden lang bei 4O0C mit zwei 125-Watt-Wolframlampen bestrahlt, die in einer Lösung i; Natriumnitrit eingetaucht waren (um alle Strahlen aufzufangen, die eine kürzere Wellenlänge als 400 ηm haben). Das Präparat wurde durch Chromatographie auf Sephadex G-50 gereinigt um PÄG-2-Nitrophenyllysozym-Konjugation bei Eluierung zu erhalten. Gegebenenfalls kann die feste Konjugation durch Lysophilisierung isoliert werden.
2Ii Beispiel VI
Trypsin-PÄG-Amid-Konjugation
Omega-Amino-PÄG (siehe Beispiel VII)(IOO mg) wird in einer Pufferlösung (10 ml, pH-Wert 6,0) aufgelöst. Trypsin (50 mg) wird zugesetzt, gefolgt von Äthyldimethylaminopropylcarbodiimid (200 mg). Der pH-Wert wird auf 6 gehalten. Nach einer Stunde wird die Reaktion durch Zugabe von Überschußacetat-Puflerlösung mit einem pH-Wert von 6 gestoppt. Die Konjugation wird durch Chromatographie auf Sephadex G-50 isoliert.
Entsprechend dem vorstehenden Verfahren wird anstelle von Trypsin bei Verwendung von L-Ciirullin : L-Aspartatligase (AMP) (6.3.4.5) L-Citrullin-L-Aspartatligase (AMP)-PAG-Amid-Konjugat crhal-.1Ii ten.
Beispiel VII
Herstellung von Omega-Amino-PÄG a) Verfahren (1) Tosylation
PÄG (Molekulargew. 6000) (50 g) wird in Toluol (400 ml) autgelöst. Toluol (60 ml) wird aus dem Gemisch destilliert, um Spuren von Feuchtigkeit zu entfernen. Die Lösung wird gekühlt, und wasserfreies Triäthylamin 4(i (5,5 ml) wird zugesetzt, gefolgt von p-Toluolsulfonylchlorid (3,4 g). Die Lösung wird über Nacht auf Raumtemperatur gehalten und dann filtriert. Das Filtrat wird auf 5° gekühlt, und der Niederschlag wird gesammelt. Das Polymer wird in absoluterr>Äthanol (200 ml) aufgelöst, und Natriumazid (1,0 g) wird zugesetzt. Die Lösung wird unter Rückfluß für die Dauer von 36 Stunden gekocht, um PÄG-Omega-Azid zu erhalten.
Verfahren (2) Halogenierung
Das vorstehende Verfahren wird für PÄG-Tosylat angewendet, außer daß Thionylbromid (2,5 ml) anstelle von p-Toluolsulfonylchlorid verwendet wird. Die Lösung wird 15 Minuten lang im Rücknuß gehalten, nachdem das Thionylbromid zugesetzt worden ist, um PÄG-Omega-Bromid zu erhalten, das wiederum entsprechend in PAG-Omega-Azid umgewandelt wird.
b) Umwandlung in Omega-Amino-PÄG
Der äthanolischen Lösung des Omega-Aiido-PÄG wird Adams-Katalysator zugesetzt, und die Lösung wird mit Wasserstoff behandelt, bis kein Wasserstoff mehr aufgenommen wird. Die Lösung wird filtriert und unter reduziertem Druck auf in'kleines Volumen konzentriert. Trockener Äther (150 ml) wird zugegeben, und das Polymer läßt man über Nacht bei 3° niederschlagen. Das Polymer wird durch Filtrierung aufgefangen.
Beispiel VIII
Fructose-Uo-Diphosphat-D-GlyceraldehydO-Phosphatlyase-PAG-Amid
Das Enzym (4.1.2.13) (30 mg) wird in 2M-Natriumacetat (3 ml),0,lM-Natriumglyoxylat(l,5 ml) und 10MM-Kupfersulfat (1 ml) aufgelöst. Es wird genug 0,4M-Essigsäure zugesetzt, um den pH-Wert auf 5,5 zu bringen. Die Lösung wird eine Stunde lang auf 20° gehalten. Das modifiz'-erte Protein wird durch Gelfiltrierung auf Sephadex isoliert Das modifizierte Protein mit 2M-Natriumacetat (3 ml) und 2M-tssigsäure (1 ml) und Omega-Amino-PÄG (100 mg) bei 37° über Nacht zur Inkubation gebracht. Das gewünschte Produkt wird durch Chromatographie auf Sephadex G-50 isoliert.
Beispiel IX
Insulin-PÄG-4-rlydro,\y-l,3,5-Triazin-6-yl-Konjugation a) Herstellung von PÄG^-Hydroxy-o-Chlor-l^.S-Triazin
PAG 750(3Og, 0,04 Mol) oder PAG 2000 (80 g, 0,04 Mol) wird in 150 ml wasserfreien Benzols aufgelöst, das 8 g Na2COi enthält. Die Lösung wird auf 10° gekühlt, und Cyanurchlorid (7,38 g, 0,04 Mol) wird zugesetzt. Die Lösung wird über Nacht bei 10° gerührt. Wasser (5 ml) wird zugesetzt, und die Lösung wird dann auf Raumtemperatur tür die Dauer einiger Stunden gebracht, gefolgt von einer Erhitzung bei 40° über Nacht. Unlösliches lü Material wird abgeschleudert, und das Lösungsmittel wird durch Unterdruck in einem Rotationsverdampfer bei 40° entfernt. Eine kleine Menge Niederschlag, der mitunter während der Konzentration erscheint, wird durch Zugabe einer kleinen Menge Benzol entfernt, um die Viskosität zu senken, gefolgt von einem Schleudern und einer Wiederkonzentration. Das PÄG^-Hydroxy-o-Chlor-l^.S-Triazin, eine viskose Flüssigkeit bei 40°, wird im Gefrierfach gelagert.
b) Herstellung von PAG-HTA-Insulin-Konjugation
Insulin (IC mg) wird in 1 ml Ο,ΙΜ-Borat-PulTerlösung aufgelöst, deren pH-Wert 9,2 beträgt. PAG 2000 (179 mg) wild zugesetzt. Nach zwei Stunden wird nicht in Reaktion get;etenes PAG dadurch entfernt, daß die :o Lösung durch eine Säule Sephadex G-10 geleitet und eingestellt wird. Die PAG-HTA-Insulin-Konjugation wird in einem Rotationsverdampfer auf 10 mg Protein/ml konzentriert und in dem Gefrierfach gelagert. (HTA - -4-IIydroxy-l,3,5-Triazin-6-yl).
Entsprechend dem vorstehenden Verfahren wird bei Verwendung von PÄG 750 ein entsprechendes Produkt erhalten.
Entsprechend dem vorstehenden Verfahren, jedoch bei Durchführung der Reaktion bei einem pH-Wert von 8,5 und bei einem pH-Wert von 10 werden entsprechende Produkte erhalten.
Enzymatische Aktivitäten von PÄG-Catalase
Catalase - getestet durch die Methode nach Beers und Sizer (J. Biol. Chem., 195, 133 (1952) Sowohl PÄG 750-Catalase als auch PÄG 2000-Catalase war etwas stärker aktiv als nicht modifizierte Catalase:
Nicht modifizierte Catalase: 41 500 Einheiten/mg Protein
PÄG 750-Catalase: 43 750 Einheiten/mg Protein
PAG 2000-Catalase: 43 500 Einheiten/mg Protein
Die Würmestabilitäten von unmodifizierter und PAG-75O-Catalase waren bei 37° und 60° ähnlich.
Antigenprüfung von PÄG-Catalase Immunisierung
Weiße ausgewachsene weibliche Newsealand-Kaninchen vurden intravenös mit einer 1,5 mg/ml-Lagerlösung Rindleber-Catalase für die Dauer von vier Wochen immunisiert, und bis zu dieser Zeit erhielten sie insgesamt 55 mg Catalase. Den Kaninchen wurden durch Herzpunktur sieben und vierzehn Tage nach Abschluß des Immunisierungszeitplans Blut abgezapft. Etwa einen Monat später wurde den Kaninchen 5 mg des entsprechenden Antigens injiziert, und ihnen wurde durch Herzpunktur eine Woche nach Empfang der Stützinjektion Blut abgezapft.
In-vivo- und in-vitro-Tests
In Anschluß an die letzte Blutentnahme wurde ein Bereich am Rücken der Kaninchen mit elektrischen Scheren rasiert, und der Rest mit einem Haarentfernungsmittel entfernt. Am nächsten Tag wurde den Kaninchen intradermisch 0,1 ml des entsprechenden Antigens und der boratgepufferten Sole (Verdünnung) injiziert, um auf die mögliche Entwicklung von sofortigen - und/oder verzögerten - Hypersensitivitäten zu prüfen. Alle Tiere wurden für eine Dauer von 96 Stunden nach der Injektion auf Hautreaktionen beobachtet.
Nach der ersten bzw. stützenden Immunisierung erhaltene Kaninchen-Antisera wurde in vitro auf Niederschlag und auf Komplementärfixierungsaktivitäten hin untersucht. Jedes Antiserum (unverdünnt, 1/10, 1/50) wurde in Geldiffusionsplatten (1,0% Nobel Agar in physiologischer Sole mit Zugabe von 1,0% Azid als Konservierungsmittel) sowohl gegen Catalase, als auch gegen PÄG-HTA-Catalase-Lösungen gestellt (wobei die Konzentrationen von 5 bis 1000 y/ml gingen). Die Platten wurden für die Dauer von 48 Stunden bei Raumtemperatur und bei 4°C für die Dauer von 3 bis 4 Tagen inkubiert. Die Komplementärfixierungsaktivität der wärmeinaktivierten, schaf-rotblutzellenabsorbierten Antisera wurde unter Arbeiten nach dem Microtiter-Complement- <ö \ ixation-Test bestimmt (Cooke Engineering Co., Alexandria, Virginia, USA). Die Antisera wurden in Verdünnungen von 1 : 1 und 1 : 10 gegen Catalase- und PÄG-HTA-Catalase-Verdünnungen getestet, die von 15-1000 y/ml gingen. Die Platten wurden auf Vorhandensein oder Fehlen einer Hämolvse in Anschluß an
Inkubation bei 37°C für die Dauer von 30 Minuten geprüft.
Intravenöse Immunisierung mit Catalase
«* Analyse von Kaninchen-Antiserum nach Immunisierung mit Catalase
Geldiffusion
Ant'serum, unverdünnt und 1/10 getestet, war positiv zum Ausfällen von Antikörpern gegen Catalase. Wichiw tig war, daß bei der Prüfung dieses Antiserums, hergestellt gegen natives Enzym, gegen das Enzym, das durch Poiyoxyäthylenreste modifiziert war, kein Nachweis irgendwelcher Querreaktionen vorhanden war.
Komplementärfixierung
Sowohl die ersten als auch die stützenden Sera waren positiv für Komplementärfixierungsaktivität bei der Prüfung gegen native Catalase. Bei Verwendung der modifizierten Catalase als das reagierende Antigen waren die Ergebnisse negativ.
PÄG-Insulin-Immunoprüfung
20
PÄG-HTA-Insulin wurde entsprechend Beispiel II hergesieiit und auf antigene Aktivität geprüft.
Probe (1) (2)
25
Insulin-Aktivität Insulin-Antikörper
;i-Einheiten/ml Aktivität
(Tierprüfung) μ-Einheiten/m!
vXadioimmunprüfung)
30
Unmodifiziertes Insulin 137 127
PÄG-HTA-Insulin (750) 72*) 0
PÄG-HTA-Insulin (2000) 90*) 0
*) Diese Zahlen erhält man als eine Verdünnungszahl, und es handelt sich dabei nicht um tatsächliche PrüfuftgSZähien.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß das PÄG-HTA-Insulin keine Antigenaktivität gegenüber Insulin-Antiserum hat.
4(>
PÄG-HTA-Insulin-Prüfung
Präliminär-Insulin und PÄG-HTA-Insulin, das die gleiche Menge Insulin enthielt, wurden in Testkaninchen injiziert, und es wurden die Blutzuckerwerte durch die »Glucostat«-Methode gemessen (Worthington Biochcmical Corporation, Freehold, N. J.).
Nach 3 Stunden Blutglucosewert
5(1
PAG-HTA-Insuiin 50% von Normal Insulin 20% von Normal
Diese Tests zeigen an, daß das PÄG-HTA-Insulin eine Insulinaktivität bei etwa 50% von Insulin hat, bezogen auf das Gewicht konjugierten Insulins, das verabreicht wird.
PÄG-Insulin-Rattenprüfung
Normale Laborrauen (220/225 g) wurden nach dem Verfahren nach Goldner diabelisch gemacht (Bull. N. Y. Acad. Med. 21,44 (1945)), indem Alloxan-Injektionen verwendet wurden. Den Testtieren wurden während der Testzeit keine Nahrung gegeben. Insulin- und PÄG-2000-HTA-Insulinrezepturen, die bei einem pH-Wert von 9,2 und 10.5 hergestellt wurden, wurden den Testratten verabreicht. Das Produkt mit dem pH-Wert 10,5 zeigte keine Senkung der Blutglucosespiegel.
Die Ergebnisse sind tabellarisch nachstehend angegeben und in der Figur zusammengefaßt.
Insulin (intramuskulär)
Zeit Blutglucosespiegel Abfall gegen Anfangsspiegel 520 305 0 % Abfall gegenüber
(Std.) (mg/100 ml) (mg/100 ml) 510 72,5 10 Kontrolle
O 410 490 101,5 30
1 295 135 470 50 32,9
2 270 140 395 125 34,1
4 290 120 PÄG-HTA-Insulin (pH-Wert 9,2) (Intravenös) 29,2
6 400 10 0 - 2,4
Kontrolle (kein Futter während der Testzeit) 2 232
0 4 203,5 0
2 1,9
4 5,7
6 9,6
10 24,0
-
76,2
66,7
8 230 75 24,6
*) Tiere wurden nach diesem Punkt gefüttert.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verwendung von physiologisch aktiven Polypeptiden, welche an Polyäthylenglycol mit einem Molekulargewicht zwischen 500 und 5000 mit Hilfe eines Kopplungsteiles gekoppelt sind, zur weitgehenden Unter-
5 drückung der Immunogenizität dieser Polypeptide.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen 10 und 100 Polymerteile pro Molekül Polypeptid vorhanden sind.
3. Verwendung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Kopplungsteil aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus
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