DE1276650B

DE1276650B - Verfahren zur Herstellung von als Blutplasmaersatzmittel geeigneten, modifizierten Proteinzubereitungen

Info

Publication number: DE1276650B
Application number: DEB67212A
Authority: DE
Inventors: Dr Klaus Bonhard; Dr Alfred Riedel
Original assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Current assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Priority date: 1962-05-11
Filing date: 1962-05-11
Publication date: 1968-09-05
Also published as: GB1013577A; FR7006M; SE326795B

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND DEUTSCHES WWW PATENTAMT Int. Cl.:

C08h

AUSLEGESCHRIFT

	A61k
Deutsche Kl.:	12p-16
	30 h-2/36
Nummer:	1276650
Aktenzeichen:	P 12 76 650.6-44 (B 67212)
Anmeldetag:	11. Mai 1962
Auslegetag:	5. September 1968

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von als Blutplasmaersatzmittel geeigneten, modifizierten Proteinzubereitungen.

Bei starken Blutungen oder im Schockzustand, z. B. nach Unfällen, ist es primär von besonderer Bedeutung, den Kreislauf des Betroffenen durch Zuführung von Lösungen, die den gleichen kolloidosmotischen Druck wie das Blutplasma besitzen, aufzufüllen. Man hat hierfür ursprünglich Lösungen von Gummiarabicum oder von unveränderter Gelatine eingesetzt, welche jedoch eine Reihe unerwünschter Nebenerscheinungen aufweisen. Einen Fortschritt bedeutet die Einführung von Polyvinylpyrrolidon- und Dextranpräparaten. Entscheidende Vorteile brachte jedoch erst die Verwendung von modifizierten Gelatinelösungen, deren physikalische Eigenschaften durch chemische Umsetzungen verändert worden waren.

Um klinisch brauchbar zu sein, müssen Blutplasmaersatzmittel außer der bloßen Auffüllung des Kreislaufes auch den kolloid-osmotischen Druck aufrechterhalten. Im Hinblick auf die physikalischen Eigenschaften der Produkte muß deren Molekulargewicht groß genug sein, um eine ausreichende Verweildauer im Blutkreislauf zu garantieren, wobei die Zubereitungen bis zu tiefen Temperaturen flüssig, in einem weiten Temperaturbereich, sowie bei Lagern stabil und leicht sterilisierbar sein sollen. Das Mittel soll nicht pyrogen oder antigen und für das Gewebe weder akut noch chronisch toxisch sein, d. h., es soll, ohne organische Störungen hervorzurufen, ausgeschieden oder verwertet aber nicht abgelagert werden. Darüber hinaus sollen die Präparate in beliebigen Mengen reproduzierbar und billig hergestellt werden können. Um diesen Anforderungen zu entsprechen, wurde nach den bisherigen Methoden Gelatine in Form wäßriger Lösungen entweder durch kontrolliertes Erhitzen oder durch chemische oder enzymatische Behandlung abgebaut und anschließend mit Aldehyden bzw. Polycarbonsäureanhydriden oder den entsprechenden Chloriden wieder kondensiert. Es sind ferner Verfahren bekannt, denen zufolge die Gelatine zunächst mit Aldehyden, Dialdehyden, Diisocyanaten oder Chinonen vernetzt und anschließend mit Wasserstoffperoxyd partiell oxydiert werden. Man hat auch versucht, geeignete Produkte dadurch zu erhalten, indem man die Gelatinemoleküle oder deren Reaktionsprodukte an den Aminogruppen blockiert, um dadurch den isoelektrischen Punkt zu erniedrigen und den kolloid-osmotischen Druck zu erhöhen.

Diesen Verfahren haftet eine Reihe von Nachteilen an. So mußte teilweise in Kauf genommen werden, Verfahren zur Herstellung von als Blutplasmaersatzmittel geeigneten, modifizierten Proteinzubereitungen

Anmelder:

»BIOTEST«-Serum-Institut G. m. b. H., 6000 Frankfurt-Niederrad

Als Erfinder benannt: Dr. Alfred Riedel, 8000 München; Dr. Klaus Bonhard, 6450 Hanau

daß bei einigen Teilschritten die Reaktion unspezifisch und dadurch schwierig zu kontrollieren und zu reproduzieren war. Außerdem waren die resultierenden Lösungen sehr heterogen, und es mußte zum Teil in Lösungen gearbeitet werden, deren Applikation bei bestimmten, z. B. nephrotischen Erkrankungen kontraindiziert ist. Fast durchweg kamen unphysiologische Chemikalien zur Anwendung, und es mußte der Überschuß an Reagens zerstört oder durch Aus- und Umfallen des Proteins von diesem abgetrennt werden. Das Vorhandensein unphysiologischer Brückenglieder stellt ebenfalls einen erheblichen Nachteil dar, zumal in solchen Fällen Ablagerungen im Gewebe zu befürchten sind und damit gerechnet werden muß, daß der Körper nicht im Stande ist, derartige Brückenbildungen wieder zu öffnen.

Ziel der Erfindung ist es deshalb, die Vernetzung der Proteine, z. B. der fadenförmigen Gelatinemoleküle, so zu lenken, daß zwischen den Ketten ohne Zusatz von Brückengliedern physiologische Peptidbindungen geknüpft werden, und dann das entsprechende Makromolekül innerhalb der Peptidketten spezifisch und bis zu einem gewünschten Grade abzubauen. Dadurch ist es möglich, von den hochviskosen und leicht gelierenden Fadenmolekülen zu niedrigviskosen und trotzdem relativ hochmolekularen sphärischen Molekülen zu kommen, deren wäßrige Lösungen in einem weiten Temperaturbereich flüssig sind.

Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, daß man bei der Herstellung von als Blutplasmaersatzmittel geeigneten, modifizierten Proteinzubereitungen

IM Hl/81

durch Vernetzung und anschließend partiellen Abbau von Proteinen die Vernetzung unter Verwendung nativer oder partiell abgebauter Proteine durch bekannte Aktivierung der Carboxylgruppen unter Bildung neuer Peptidbindungen durchführt und anschließend einen Teil der ursprünglichen Peptidbindungen des Proteinmoleküls in an sich bekannter Weise enzymatisch, thermisch oder durch saure Hydrolyse spaltet.

Die Aktivierung der freien Carboxylgruppen des Proteins kann mit Carbodiimiden, vorzugsweise mit Ν,Ν'-disubstituierten Carbodiimiden, vorgenommen werden, z.B. mit Dicyclohexyl- und Cyclohexylmorpholinyläthyl-carbodiimid.

Die Aktivierung der freien Carboxylgruppen, also auch der seitständigen Carboxylgruppen von Glutamin- und Asparaginsäure, kann analog der in der Peptidsynthese bekannten Methode von S h e e h e η und Hess erfolgen (Journal of the American Chemical Society, 79 [1957], S. 4528 und 4529).

Die aktivierten Carboxylgruppen vermögen darauf unter milden Bedingungen mit primären Aminogruppen, z. B. mit den N-terminalen α- und den seitständigen f-Aminogruppen des Lysins und Hydroxylysins, zu reagieren. ■

Im Gegensatz zu den meisten anderen Methoden, die zur Aktivierung der Carboxyl- oder Aminogruppe von Aminosäuren herangezogen werden können, erfolgt die Reaktion mit Carbodiimid schon bei Zimmertemperatur oder wenig erhöhter Temperatur. Sie ist ziemlich unempfindlich gegen Feuchtigkeit, so daß sie auch in wäßriger Lösung durchgeführt werden kann. Dabei können auch wasserunlösliche Carbodiimide, z. B. Dicyclohexyl-carbodiimid, verwendet werden, die dann zur Vermeidung organischer Lösungsmittel in emulgierter Form (z. B. Aufnehmen der Schmelze mit warmem emulgatorhaltigem Wasser) verwendet werden. Hierbei tritt die Hydratisierung des Carbodiimids zum entsprechenden Harnstoffderivat bei Zimmertemperatur auch nach Tagen nur zögernd und in geringem Maße ein.

Das Carbodiimid bzw. dessen Emulsion läßt man zum Vernetzungsansatz, z. B. etwa 80" C warme Gelatinelösung, frisch bereitet und bei guter Durchmischung einlaufen. Es entsteht eine homogene Gelatinebereitung stark erhöhter Viskosität, aus der sich Dicyclohexylharnstoff in feinen Flocken praktisch quantitativ ausscheidet.

Neben dem Vorteil der Durchführbarkeit in wäßrigem Milieu ist die Reaktion außerdem sehr selektiv, so daß Acylhydroxyaminosäuren und -arginin ohne zusätzliche Schutzgruppe umgesetzt werden können und keine Gefahr für nennenswerte Racemisierung besteht.

Das aus Carbodiimid entstehende Harnstoffderivat ist meist schwer löslich bis unlöslich, so daß es durch einfache Filtration entfernt werden kann.

Anschließend wird das erhaltene Produkt durch Spaltung eines Teiles der ursprünglichen Peptidbindungen des Proteinmoleküls abgebaut. Der Abbau kann z. B. enzymatisch erfolgen. Er kann auch durch Hitzeeinwirkung oder auf chemischem Wege oder Kombination beider Maßnahmen vorgenommen werden. Der chemische Abbau kann in Form der sauren Hydrolyse erfolgen.

So kann in einer beispielsweisen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens 5- bis 10%ige Gelatinelösung oder eine andere geeignete Proteinlösung, die bereits tryptisch oder durch eine saure Hydrolyse partiell abgebaut sein kann, bei pH-Werten von 3 bis 6 und 40 bis 8O⁰C mit Ν,Ν'-disubstituiertem Carbodiimid zu einem hochviskosen Vernetzungsprodukt umgesetzt und dann mit einem tryptischen Enzym bei pH-Wert 7 bis 8 und 30 bis 40° C spezifisch an der Carboxylseite von Arginin und Lysin gespalten werden, soweit die Seitenketten dieser Aminosäuren frei und unvernetzt vorliegen. Der Abbaugrad kann durch Wahl von Inkubationszeit und Enzymart und -menge beliebig variiert und die Enzymwirkung durch Zusatz von Kallikreininhibitor gestoppt werden. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen Harnstoffderivats und Sterilisieren sind die Lösungen gebrauchsfertig. Je nach Verwendungszweck kann die Reaktion in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt werden, oder es können vor der Sterilisation die niedermolekularen Peptide abdialysiert oder therapeutisch wertvolle Stoffe zugesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß durch vollkommen spezifische Aktivierung der freien Carboxylgruppen von Proteinen, vorzugsweise von Gelatine, unter milden Bedingungen inter- und intramolekulare physiologische Peptidbindungen geknüpft werden, wodurch es sich unter anderem von allen bisher bekannten Verfahren unterscheidet. Die erfindungsgemäß erhaltenen modifizierten Proteinzubereitungen-enthalten keinerlei Fremdbindeglieder und haben deshalb besonders günstige physiologische Eigenschaften. Das erfindungsgemäße Verfahren hat weiterhin den Vorteil, daß durch spezifischen enzymatischen Abbau der vernetzten Produkte niedrigviskose und trotzdem relativ hochmolekulare sphärische Moleküle resultieren, deren Lösungen in einem weiten Temperaturbereich flüssig sind und die im Blutkreislauf eine genügend lange Verweildauer haben.

Die Überlegenheit der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Präparate gegenüber vergleichbaren Handelspräparaten ergibt sich aus der folgenden Tabelle:

Bezeichnung

Halbwertzeit (Minuten) Relative
Viskosität
bei 37 C

Gelierpunkt
C

g Protein
in 100 ml

pH-Wert

Modifizierte Gelatine nach deutscher Patentschrift 945 650 *.

Produkt nach deutscher Auslegeschrift 1 118 792...

Mittelwert aus sechs Präparaten (J^{e em} Präparat nach erfindungsgemäßen Beispielen L 2, 3. 5. 6 und 7)

Mittelwert aus drei Präparaten (je ein Präparat nach Beispielen 1, 2 und 6)

345 213

550 580 2,2
1,8

2,1
2,1

+ 8.0
+ 1.5

-0.5
±0

5.35
3.0

3.8
3.8

6.9

7.4

7.0
6.9

5 6

Besonders hervorzuheben ist die wesentlich größere Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, Halbwertzeit, mit der das erfindungsgemäß erhaltene daß durch Wahl der Reaktionsbedingungen bei VerProdukt im Blut kreist. Das wird erreicht bei Ein- netzung und Abbau das Verhältnis von hoch- zu haltung einer niedrigen Viskosität und ohne daß das niedermolekularen Anteilen an Umsetzungsprodukt Präparat geliert. 5 variiert werden kann. Das Verfahren hat außerdem

Das Präparat ist gut verträglich, es ist frei von den Vorteil, daß außer dem Aktivierungsreagens

Pyrogenen nach DAB 6, frei von Antigenen nach keine unphysiologischen Chemikalien zur Anwendung

der Methode gemäß Journal Immunol., 72 (1954), kommen und aus diesem Grunde die umgesetzten

S. 360 bis 367 (54), und Zeitschrift für Immunitäts- Produkte nicht aus- und umgefällt werden müssen,

forschung, 124 (1962), S. 478 bis 492 (insbesondere io Das Umsetzungsprodukt der. Aktivierungssubstanz

Ziffer 5, S. 478). Die akute Verträglichkeit liegt bei kann wegen seiner Schwerlöslichkeit leicht z. B. durch

über 100 ml/kg bei intravenöser Injektion an 20 g Filtration entfernt werden,

schweren Mäusen nach DAB 6. Ein Vorteil des Verfahrens ist schließlich, daß, je

Zur Bestimmung der Verweildauer, des Gelier- nach Verwendungszweck, die Reaktion in Wasser

punktes und der Viskosität wurden folgende Methoden 15 oder physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt

angewendet: werden kann und der Zusatz therapeutisch wertvoller

1. Bestimmung der Verweildauer ^{Stoffe die Stabilität der Lösun}g^{en nicht} beeinträchtigt,

Etwa 3 kg schwere Kaninchen erhalten 15 ml modi- Beispiel 1

fizierte Gelatine pro kg Körpergewicht intravenös in- 20

jiziert. Diesen Tieren werden aus der Ohrvene sieben 1 1 einer 7,5%igen Knochengelatinelösung in

Blutproben entnommen: 0,9%iger Natriumchloridlösung wird auf einen pH-

1 D „k„ „~r. A^ τ™^;™ ^{Wert von 4}'⁵ eingestellt. Bei 60°C läßt man unter

1. Probe vor der Injektion _{Rühren innerhalb von 5 bis 10 Minuten eine Lösung}

3 b^7_rr? Stundet 23 Aden nach der ^{25 VOn 7}'⁵ * KN'-Dicyclohexyl-carbodiimid in 100 ml 3. bis 7. Probe /₂ Stunde, 1,2, 3, 5 Stunden nach der _{absolutem Äth}anol zufließen.

¹¹J⁶ " Um das hochviskose Reaktionsprodukt homogen

Die Proben werden mit Trichloressigsäure entei- zu halten, verdünnt man innerhalb der nächsten 30 bis weißt, mit Salzsäure hydrolysiert, und anschließend 40 Minuten mit 350 ml O,9^u/oiger Natriumchloriderfolgt die Hydroxyprolinbestimmung nach Neu- 30 lösung.

mann — Logan: Journal Biological Chemistry, Nach einer Stunde, gerechnet von Reaktionsbeginn,

184 (1950), S. 299 bis 306, und Stegemann: wird die Lösung auf 37° C gekühlt, der pH-Wert mit Zeitschrift physiol. Chem., 311 (1958), S. 41 bis 45. n-NaOH-Lösung auf 7 bis 8 gebracht und die Lösung Aus der Abnahme des Hydroxyprolingehaltes mit mit 5 mg Trypsin, gelöst in 10 ml physiologischer der Zeit, bezogen auf den Ausgangswert (Probe 2), 35 Kochsalzlösung unter Zusatz einiger Tropfen n-HCl, wird die Verweildauer im Kreislauf berechnet. versetzt. Nach weiteren 20 Minuten wird der Enzym-

„ „ _, ,. , abbau durch Zugabe von 10 ml Kallikreininhibitor

2. Bestimmung des Geherpunktes gestoppt und die Lösung durch Zusatz von 1,4 g

In einem Reagensglas werden 10 ml sterilisiertes festem Natriumchlorid und eventuell anderer Salze Produkt, in das ein Thermometer eingetaucht ist, in 40 isotonisch gemacht. Die Proteinkonzentration beträgt ein Bad von — 20⁰C gestellt. Im Augenblick der be- 5%. Vom ausgefallenen Harnstoffderivat wird abginnenden und der vollständigen Gelierung wird die filtriert und bei 120⁰C sterilisiert.
Temperatur gemessen; anschließend wird die Probe _R . -19

bei Zimmertemperatur gehalten und bei Beginn und Beispiel

bei vollständiger Wiederverflüssigung die Temperatur 45 50 g Knochengelatine mit einem isoelektrischen gemessen. Punkt von pH-Wert etwa 5 werden mit 800 ml

, „ .. , ,,. , ..... Wasser versetzt, quellengelassen und bei 40⁰C gelöst.

3. Bestimmung der Viskosität Unter Rühren werden 5 g N.N'-Dicyclohexyl-carbodi-

Sterilisiertes Produkt wird im Ubbelohde-Viskosi- imid, gelöst in 50 ml absolutem Äthanol, zugetropft meter mit hängendem Kugelniveau bei 37' C ge- 50 und 1 Stunde weiter gerührt.

messen. Das Viskosimeter ist gegen Wasser geeicht. Der pH-Wert wird auf 7 bis 8 eingestellt, an

schließend wird mit dem tryptischen Enzym, Trypsin

4 Bestimmune der Halbwertzeit ^{aus Pankreas}' ²⁰ Minuten abgebaut. Durch Zugabe

° von Kallikreininhibitor wird die Reaktion abge-

Ein Kaninchen erhält 15 ml/kg des jeweiligen 55 brochen. Das Harnstoffderivat wird abfiltriert und

Plasmaexpanders intravenös injiziert, nachdem die- das Filtrat mit Wasser auf 1 1 aufgefüllt. Durch Zugabe

selbe Menge Blut vorher entnommen wurde. von Salzen wird die Lösung isotonisch gemacht und

Vor der Infusion sowie 1, 3, 5 und 7 Stunden danach sterilisiert.

werden Blutproben entnommen und darin Hydroxy- d . . . .,

prolin bestimmt. Trägt man den Logarithmus der 60 ^p

erhaltenen Hydroxyprolinkonzentration gegen die Eine Lösung von 60 g mit Trypsin abgebauter Zeit auf, verbindet die Meßpunkte und extrapoliert Knochengelatine in etwa 800 ml Wasser wird auf den linearen Teil der erhaltenen Kurve nach der einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und mit 6 g Di-Zeit 0. dann läßt sich die Zeitstrecke abgreifen, cyclohexyl-carbodiimid, gelöst in 80 ml absolutem innerhalb der die Hydroxyprolinkonzentration auf 65 Äthanol, unter Rühren vernetzt,
die Hälfte der Ausgangskonzentration abgesunken Nach 3 Stunden wird der pH-Wert auf 7,5 eingestellt ist. Diese Zeitstrecke in Minuten stellt die Halbwert- und das Reaktionsgemisch 10 Minuten lang mit 4 mg zeit dar. Trypsin abgebaut. Nach Zugabe von 8 ml Kallikrein-

inhibitor wird die Lösung filtriert, auf 1 1 aufgefüllt, isotonisch gemacht und sterilisiert.

Die Ausgangslösung der mit Trypsin abgebauten Knochengelatine wurde folgendermaßen hergestellt:

60 g Knochengelatine mit einem isoelektrischen Punkt von etwa pH-Wert 5 läßt man in 800 ml Wasser quellen und löst sie bei 40⁰C. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,5 eingestellt. Die Gelatine wird mit 4 mg Trypsin 10 Minuten lang abgebaut.

Beispiel 4

Eine Lösung von 50 g mit Trypsin abgebautem Humanglobin in etwa 800 ml Wasser wird auf einen pH-Wert von, 4,5 gebracht. 8 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml absolutem Äthanol werden zugegeben. Nach 3 Stunden Inkubationszeit, während der zu Beginn die Vernetzung, später der Abbau infolge saurer Hydrolyse dominiert, wird der pH-Wert wieder auf 7,5 gebracht, mit Wasser auf 11 aufgefüllt, filtriert und sterilisiert.

Die Ausgangslösung des mit Trypsin abgebauten Humanglobins wurde folgendermaßen hergestellt:

50 g Humanglobin werden in 800 ml Wasser gelöst und der pH-Wert auf 7,5 eingestellt. Bei 4O⁰C läßt mal). Man stellt dann mit Kochsalz auf einen isotonischen Elektrolytgehalt nach der Endauffüllung mit destilliertem Wasser auf 100 1 ein. Die Zubereitung wird anschließend bei 122° C 35 Minuten dampfsterilisiert.

Die warme Reagensmischung stellt man folgendermaßen her:

85 g Dicyclohexyl-carbodiimid werden im Wärmebad bei 60° C geschmolzen. 200 ml destilliertes Wasserder gleichen Temperatur, die 2 g eines physiologisch verträglichen Emulgators gelöst enthalten (polyoxyäthyliertes Rizinusöl oder Polyäthylenglykol-cetyläther), werden zugemischt. Das teilweise noch inhomogene Gemisch wird im Mixer zur vollkommenen Emulsion gebracht und mit destilliertem Wasser von 6O⁰C auf 31 aufgefüllt.

Beispiel 7

In eine Lösung von 180 g hydrolytisch abgebauter 20. Hautgelatine wird eine Emulsion von Dicyclohexylcarbodiimid wie unten angegeben innerhalb von 3 Minuten eingerührt. Anschließend wird 30 Minuten auf 95°C gehalten (Abbau bei pH-Wert 4,1 bis 4,3). Filtration und Endeinstellung auf 3 1, 0,9% Kochman 2 mg Trypsin 10 Minuten lang einwirken und 25 Salzgehalt und pH-Wert 7,8 sowie Autoklavierung versetzt anschließend mit 4 ml Kallikreininhibitor. werden wie im Beispiel 5 angegeben vorgenommen. . . Die Ausgangslösung der hydrolytisch abgebauten

Beispiel 5 -Hautgelatine wurde wie folgt hergestellt:

In eine Lösung von 120 g hydrolytisch abgebauter 180 g einer Hautgelatine werden bei 20 bis 6O⁰C

Hautgelatine wird bei 85° C innerhalb von 5 Minuten 30 in 21 destilliertem Wasser klar gelöst. Mit Salzsäure eine Lösung von 6 g Dicyclohexyl-carbodiimid in wird auf pH-Wert 4,0 eingestellt. Zum hydrolytischen

Abbau wird 25 Minuten auf 95° C gehalten.

Zur Herstellung der Dicyclohexyl - carbodiimid-Emulsion werden 4,8 g Dicyclohexyl-carbodiimid in gemisch bei pH-Wert 4,0 bis 5,0 zu etwa 80 bis 90% 35.12 ml unvergälltem Äthanol gelöst. 200 ml 0,9%ige zurückgewonnen, wobei die Proteinbereitung partielle Kochsalzlösung, die 0,24 g Rizinusemulgator (vgl.

Beispiel 6) enthalten, werden auf 55° C angewärmt und von Hand zugemischt. Es bildet sich sofort eine stabile gebrauchsfertige Emulsion. 40

220 ml 78%iges Äthanol eingerührt (Vernetzung unter Peptidbildung). Das organische Lösungsmittel wird anschließend durch Destillation aus dem Reaktionshydrolytische Peptidspaltung erleidet.

In 10 Minuten bei 97° C sinkt die kinematische Viskosität (gemessen bei 37° C) dabei von 15 auf etwa 7 cSt. Unter Zusatz von 10 g mineralischer Filterhilfe wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff durch Asbestfilterschichten abfiltriert. Die klare Proteinbereitung wird mit Natronlauge auf pH-Wert 7,8 eingestellt, auf 31 und einen Kochsalzgehalt von 0,9% aufgefüllt und 35 Minuten bei 122° C autoklaviert. Dabei stellt sich ein End-pH-Wert von 7,1 bis 7,3 ein.

Die Ausgangslösung der hydrolytisch abgebauten Hautgelatine wurde folgendermaßen hergestellt:.

120 g einer Hautgelatine werden bei 20 bis 60°C in 1,8 1 destilliertem Wasser klar gelöst. Mit Salzsäure wird auf pH-Wert 4,0 eingestellt. Durch indirekte Dampfbeheizung wird die Temperatur rasch auf 97⁰C gebracht und 5 Minuten bei dieser Temperatur gerührt.

Beispiel 6

Es werden 601 einer 6,5%igen Gelatinelösung durch Auflösen des Gelatinepulvers bei pH-Wert 4,0 bis 4,5 bei erhöhter Temperatur (60 bis 97⁰C) in Wasser hergestellt. In diese Zubereitung läßt man eine warme Reagensmischung des Vernetzungsmittels unter kräftigem Rühren innerhalb 3 Minuten einlaufen. Man hält 30 Minuten auf 95° C. Zunächst dominiert die Vernetzung (5 bis 10 Minuten), dann

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von als Blutplasmaersatzmittel geeigneten, modifizierten Proteinzubereitungen durch Vernetzung und anschließend partiellen Abbau von Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vernetzung unter Verwendung nativer oder partiell abgebauter Proteine durch bekannte Aktivierung der Carboxylgruppen unter Bildung neuer Peptidbindungen durchführt und anschließend einen Teil der ursprünglichen Peptidbindungen des Proteinmoleküls in an sich bekannter Weise enzymatisch, thermisch oder durch saure Hydrolyse spaltet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die freien Carboxylgruppen des Proteins mit wasserunlöslichem N,N'-Dicyclohexyl-carbodiimid aktiviert.

In Betracht gezogene Druckschriften: Deutsche Patentschrift Nr. 946 061; deutsche Auslegeschrift Nr. 1 118 792; schweizerische Patentschrift Nr. 315 463;

Journal of the American Chemical Society, Bd. 79 der hydrolytische Abbau (Viskositätsverlauf als Merk- 65 (1957),'S. 4528 und 4529.

W» Mi/551 S. <l 9 Bundetdruckerel Berlin