FR2606638A1 - Procede d'hydrolyse enzymatique de gelatines et solutes de remplissage obtenus - Google Patents
Procede d'hydrolyse enzymatique de gelatines et solutes de remplissage obtenus Download PDFInfo
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
- A61K38/012—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
- A61K38/014—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals from connective tissue peptides, e.g. gelatin, collagen
-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE D'HYDROLYSE ENZYMATIQUE DE GELATINES POUR OBTENIR DES SOLUTES DE REMPLISSAGE PRESENTANT NOTAMMENT UNE POLYDISPERSITE DES MASSES MOLECULAIRES REDUITE ET DES CARACTERISTIQUES ANALYTIQUES PROCHES DES NORMES SANGUINES. LE PROCEDE D'HYDROLYSE ENZYMATIQUE EST REALISE AVANTAGEUSEMENT DANS UN REACTEUR EN CONTINU A LIT FIXE, L'ENZYME ETANT IMMOBILISEE SUR UN SUPPORT NEUTRE PAR LIAISON COVALENTE.
Description
Le domaine technique de la présente invention est celui des substituts du plasma sanguin ou "solutés de remplissage", médicaments liquides injectables par voie veineuse (et éventuellement sous-cutanée), autres que le sang, destinés à lutter efficacement et pendant un temps suffisamment long contre l'hypovolémie et les troubles organiques qui lui sont associés, accompagnant fréquemment l'état de choc chez l'homme.
Certains sont fabriqués à partir de colloldes naturels comme les dextranes ou la gélatine.
L'intérêt des gélatines en tant que solutés de remplissage réside dans leur origine animale. Leur structure et leurs propriétés chimiques sont voisines de celles des protéines plasmatiques. De plus, les risques antigéniques et anaphylactiques sont faibles.
Par contre, les inconvénients majeurs des solutions de gélatine sont leur viscosité élevée, leur gélification à température ambiante et leur composition variable selon les lots.
Aussi a-t-on cherché à modifier ces gélatines de façon à obtenir des gélatines liquides à température ambiante et de compositions et masses molaires plus homogènes.
Ces améliorations sont obtenues par des méthodes d'hydrolyse et de recombinaison chimique conduisant à des solutions de gélatines dites "modifiées". Leur masse molaire moyenne doit être suffisamment importante pour que les molécules et la solution ne puissent pas être éliminées de la circulation dans l'organisme pendant un temps raisonnablement long et perdre ainsi de leur efficacité en tant que soluté de remplissage.
Si la masse molaire moyenne est trop élevée, les risques antigéniques augmentent. Une valeur moyenne correcte est de 35 000 daltons.
De nombreuses méthodes de modification des gélatines "brutes" sont décrites dans la littérature. Il s'agit dans la majorité des cas d'une dépolymérisation thermique de la protéine, parfois accompagnée d'une oxydation suivie d'une recombinaison chimique des peptides obtenus ou inversement. L'agent réticulant peut être l'anhydride acétique, un polychloroformiate, des glycols, I'anhydride succinique, l'hexaméthylène di-isocyanate, le glyoxal.
Il existe également des méthodes impliquant uniquement un traitement thermique en milieu alcalin.
Les gélatines modifiées actuellement utilisées en thérapeutique sont obtenues par trois méthodes chimiques différentes. Il s'agit de l'oxypolygélatine ou OPG (glyoxal), de la gélatine fluide modifiée ou MFG (anhydride succinique) et de la polygélatine (hexaméthylène di-isocyanate).
Toutes ont une masse molaire moyenne voisine de 35 000.
Ces traitements imposent plusieurs étapes de purification destinées à éliminer les réactifs et catalyseurs utilisés ainsi que les acides aminés libérés, de trop faible masse moléculaire. Enfin, l'analyse de la polydispersité des gélatines modifiées par hydrolyse chimique fait apparaître une distribution en masse molaire assez hétérogène. Or une masse molaire moyenne appropriée n'est pas suffisante pour prévoir la vitesse à laquelle le colloîde va être éliminé, la polydispersité et la conformation de molécules sont également importantes. En outre, une macromolécule physiologiquement utile doit aussi posséder des propiriétés intéressantes quant à sa valeur osmotique qui doit être équivalente à celle du plasma.
C'est pourquoi la présente invention propose un nouveau procédé d'hydrolyse de la gélatine pour soluté de remplissage, à savoir un procédé d'hydrolyse enzymatique contrôlée.
La modification de certaines propriétés particulières à la gélatine impliquant l'utilisation de protéases est classiquement employée dans les domaines agro-alimentaires, la photographie ou la pharmacie, mais jamais jusqu'alors pour la préparation de succédanés du plasma.
Dans ces procédés, la protéolyse vise simplement à solubiliser la gélatine ou diminuer sa viscosité.
Alors que le procédé selon l'invention est contrôlé de manière à obtenir une solution présentant les propriétés physico-chimiques requises pour une utilisation en tant que soluté de remplissage et notamment donc une distribution en masse molaire appropriée. La répartition des masses molaires des hydrolysats obtenus par le procédé selon l'invention apparaît plus homogène que celle des solutés actuellement disponibles dans le commerce, diminuant ainsi, entre autres, les risques antigéniques.
En outre, on obtient par cette voie des hydrolysats non contaminés par des réactifs chimiques par rapport aux procédés de recombinaisons chimiques et ne nécessitant donc pas de traitements de purification destinés à éliminer ces réactifs chimiques.
Selon une caractéristique essentielle, le procédé d'hydrolyse enzymatique contrôlée selon l'invention utilise une protéase immobilisée sur un support neutre.
Ainsi, les hydrolysats ne sont pas non plus contaminés par le biocatalyseur employé, ce qui évite les étapes de purification, offre la possibilité de réutilisation répétée du biocatalyseur, et multiplie sa durée de vie, celui-ci n'étant pas détruit à la fin de l'hydrolyse.
Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, on opère avec un réacteur en continu. Par le biais du temps de passage du substrat dans le réacteur, la maîtrise du processus d'hydrolyse devient parfaite.
Cela permet également la fabrication en continu de lots de grande taille dans de strictes conditions de reproductibilité et autorise la production automatique en chaîne stérile.
De préférence, on réalise l'hydrolyse à pH neutre ou légèrement basique.
On obtient ainsi un produit final que l'on équilibre plus facilement aux pH physiologiques en maintenant des compositions ioniques conformes à celles du sang humain.
I1 faut en effet noter que les solutes du commerce ont souvent des caractéristiques analytiques assez différentes des normes sanguines en raison des pH de départ extrêmes chez les hydrolysats obtenus par voie chimique.
L'invention concerne donc également les produits obtenus par ce procédé. Ceux-ci présentent en effet des caractéristiques nouvelles par rapport aux solutés de remplissage obtenus par les procédés traditionnels.
Leur répartition des masses molaires apparaît moins dispersée et leur pH est plus conforme à celui du sang humain.
Les pH des solutés de remplissage obtenus selon l'invention sont compris entre 6,4 et 7,4.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lumière de la description qui va suivre présentée sous forme d'exemples et en référence à des figures qui présentent
- figure I : les profils d'élution de solutés de remplissage et
gélatine brute
- figure 2 : le schéma réactionnel de greffage d'une enzyme sur
rafle de maTs
- figure 3 : un schéma de réacteur à lit fixe
- figures 4, 5 et 6 : des profils d'élution des hydrolysats obtenus.
- figure I : les profils d'élution de solutés de remplissage et
gélatine brute
- figure 2 : le schéma réactionnel de greffage d'une enzyme sur
rafle de maTs
- figure 3 : un schéma de réacteur à lit fixe
- figures 4, 5 et 6 : des profils d'élution des hydrolysats obtenus.
EXEMPLE 1: Préparation de gélatine "brute" utilisée comme substrat
Protéine fibreuse, le collagène est la plus abondante de toutes les protéines des vertébrés supérieurs. C'est le principal constituant de la peau, des os et des tendons. L'ébullition dans l'eau transforme le collagène en gélatine, mélange de polypeptides. On pratique donc l'extraction de la gélatine à partir du collagène.
Protéine fibreuse, le collagène est la plus abondante de toutes les protéines des vertébrés supérieurs. C'est le principal constituant de la peau, des os et des tendons. L'ébullition dans l'eau transforme le collagène en gélatine, mélange de polypeptides. On pratique donc l'extraction de la gélatine à partir du collagène.
La préparation de la gélatine est largement décrite dans la littérature. La gélatine est extraite de peaux de porcs, de bovins, d'ovins, ou d'os, ayant préalablement subi un traitement acide ou alcalin. Le traitement acide consiste en une macération dans une solution d'acide minéral pendant 10 à 30 heures ; le traitement alcalin est un chaulage de 70 à 120 jours. L'extraction est ensuite obtenue par chauffage de la matière première dans l'eau, entre 55 et 650C.-Plusieurs extractions successives sont possibles en changeant l'eau et en augmentant la température. Les premières extractions, effectuées à basse température, donnent les gélatines de meilleure qualité. Les dernières donnent des gélatines plus colorées et de force en gelée et viscosité plus faibles. Après extraction, les liqueurs de gélatine sont filtrées, déminéralisées par échange d'ions, concentrées sous vide pour éviter toute dégradation thermique, pasteurisées, séchées, broyées et enfin tamisées.
Les différents lots de gélatine "brute" étaient tels que
- les propriétés physico-chimiques des lots étaient reproductibles
entre deux fabrications ;
- les gélatines étaient de qualité alimentaire.
- les propriétés physico-chimiques des lots étaient reproductibles
entre deux fabrications ;
- les gélatines étaient de qualité alimentaire.
Les propriétés physico-chimiques des quatre lots utilisés figurent dans le Tableau 1:
TABLEAU I
Propriétés physico-chimiques des lots de gélatine
TABLEAU I
Propriétés physico-chimiques des lots de gélatine
<tb> <SEP> Caractéristiques <SEP> à
<tb> <SEP> 6,67 <SEP> g/100g <SEP> d'eau
<tb> <SEP> N <SEP> Lot <SEP> Origine <SEP> extrac
<tb> <SEP> échan- <SEP> tion <SEP> force <SEP> visco <SEP> con
<tb> <SEP> tillon <SEP> en <SEP> sité <SEP> à <SEP> pH <SEP> ducti
<tb> <SEP> gelée <SEP> 60 C <SEP> métrie
<tb> <SEP> (Bloom) <SEP> (mP)
<tb> <SEP> 2 <SEP> 7342 <SEP> VAVS2 <SEP> Veau <SEP> Acide <SEP> 2e <SEP> 200 <SEP> 28,6 <SEP> 5,1 <SEP> 8,2
<tb> <SEP> bouillon
<tb> <SEP> 4 <SEP> 7363 <SEP> VAVS2 <SEP> Veau <SEP> Acide <SEP> 3e <SEP> 122 <SEP> 23,2 <SEP> 5,1 <SEP> 6,8
<tb> <SEP> bouillon
<tb> <SEP> Alcaline
<tb> <SEP> 5 <SEP> 7102 <SEP> VVS2 <SEP> Veau <SEP> 2e <SEP> 180 <SEP> 45,8 <SEP> 5,8 <SEP> 4,8
<tb> <SEP> bouillon
<tb> <SEP> Alcaline
<tb> <SEP> 6 <SEP> 7303 <SEP> VVS2 <SEP> Veau <SEP> 3e <SEP> 128 <SEP> 33,5 <SEP> 5,35 <SEP> 4,25
<tb> <SEP> bouillon
<tb>
Ensuite les solutions de gélatine sont préparées de la manière suivante
La gélatine sèche est d'abord mise à gonfler pendant environ 15 minutes dans l'eau ou dans une solution de chlorure de calcium 20 mM, puis elle est dissoute par chauffage à 500C pendant 15 minutes.
<tb> <SEP> 6,67 <SEP> g/100g <SEP> d'eau
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<tb> <SEP> Alcaline
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<tb> <SEP> bouillon
<tb>
Ensuite les solutions de gélatine sont préparées de la manière suivante
La gélatine sèche est d'abord mise à gonfler pendant environ 15 minutes dans l'eau ou dans une solution de chlorure de calcium 20 mM, puis elle est dissoute par chauffage à 500C pendant 15 minutes.
EXEMPLE 2 : Solutés de remplissage de référence
Les gélatines modifiées actuellement utilisées se classent en trois grandes catégories : les oxypolygélatines (OPG), les gélatines fluides modifiées (GFM) et les polygélatines.
Les gélatines modifiées actuellement utilisées se classent en trois grandes catégories : les oxypolygélatines (OPG), les gélatines fluides modifiées (GFM) et les polygélatines.
II a été pris comme référence des GFM, c'est-à-dire des gélatines modifiées préparées par dégradation thermique de la gélatine et traitement par l'anhydride succinique en milieu alcalin.
Deux solutés de remplissage ont servi de référence. II s'agit de deux gélatines fluides modifiées désignées par GFMl et GFM2. Leurs compositions respectives figurent dans le Tableau II ci-après. La masse molaire moyenne de la gélatine modifiée est de 35 000 et le pH de chacun des solutés est égal à 6,25.
<tb> <SEP> GFM1 <SEP> GFM2
<tb> Gélatine <SEP> modifiée <SEP> 3 <SEP> g <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,7 <SEP> g <SEP> 0,538 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> anhydre <SEP> 0,014 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> @ <SEP> 0,037 <SEP> g
<tb> Lactate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> anhydre <SEP> 0,336 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> calcium <SEP> à <SEP> 2H2O <SEP> 0,2 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> q.s.p. <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> q.s.p.<SEP> 100 <SEP> ml <SEP>
<tb>
La composition ionique GFM2 est la suivante
Na+ : 150 mmoles/l
K+ : 5 mmolestl
Mg ++ : 1,5 mmoles/l
Cl : 100 mmoles/l
Lactate : 30 mmoles/l
EXEMPLE 3 : Analyse de la polydispersité des gélatines brutes et modifiées
par filtration sur gel
La gélatine contenant très peu d'acides aminés aromatiques, son absorption à 280 nm est faible. Elle est donc détectée à 237 nm (liaison peptidique), longueur d'onde pour laquelle elle présente une absorption équivalente à celle de la sérum albumine bovine à 280 nm, dans des conditions expérimentales identiques. Le détecteur utilisé est un analyseur
Holochrome H/MD (Gilson).
<tb> Gélatine <SEP> modifiée <SEP> 3 <SEP> g <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,7 <SEP> g <SEP> 0,538 <SEP> g
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<tb> Eau <SEP> q.s.p. <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> q.s.p.<SEP> 100 <SEP> ml <SEP>
<tb>
La composition ionique GFM2 est la suivante
Na+ : 150 mmoles/l
K+ : 5 mmolestl
Mg ++ : 1,5 mmoles/l
Cl : 100 mmoles/l
Lactate : 30 mmoles/l
EXEMPLE 3 : Analyse de la polydispersité des gélatines brutes et modifiées
par filtration sur gel
La gélatine contenant très peu d'acides aminés aromatiques, son absorption à 280 nm est faible. Elle est donc détectée à 237 nm (liaison peptidique), longueur d'onde pour laquelle elle présente une absorption équivalente à celle de la sérum albumine bovine à 280 nm, dans des conditions expérimentales identiques. Le détecteur utilisé est un analyseur
Holochrome H/MD (Gilson).
Les gélatines brutes, GFM1 et GFM2 sont analysés par filtration sur gel à moyenne pression (système FPLC Pharmacia) en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS). La colonne utilisée est la Superose 6 (agarose) de zone de fractionnement 5.103 à 5.106.
Les conditions expérimentales sont les suivantes
- température ambiante
- débit : 18 ml/h
- éluant : SDS 0,1% + NaCI 50 mM
- détection à 237 nm (liaison peptidique)
- volume de l'échantillon : 200 1ll
- concentration de l'échantillon-: 0,85 mg de protéine par ml.
- température ambiante
- débit : 18 ml/h
- éluant : SDS 0,1% + NaCI 50 mM
- détection à 237 nm (liaison peptidique)
- volume de l'échantillon : 200 1ll
- concentration de l'échantillon-: 0,85 mg de protéine par ml.
Avant analyse, les échantillons sont incubés pendant 1 heure à température ambiante dans un volume de solution de SDS à 2% tel que le rapport massique SDS-protéines soit égal à 5. Ils sont ensuite dilués dans l'éluant pour obtenir la concentration en protéines désir6e puis injectés.
Les différentes fractions éluées sont caractérisées par la valeur du paramètre Kav calculé de la façon suivante :
Kav = Ve-Vo
Vt-Vo
Ve = volume d'élution de la fraction
Vo = volume mort de la colonne
Vt = volume total du lit de gel.
Kav = Ve-Vo
Vt-Vo
Ve = volume d'élution de la fraction
Vo = volume mort de la colonne
Vt = volume total du lit de gel.
Kav représente la fraction du volume de gel stationnaire où diffuse une molécule de taille donnée. Le calcul de Kav a été préféré à la caractérisation des fractions par un étalonnage de la colonne en protéines globulaires, ce dernier conduisant à des résultats éloignés de la réalité du fait du volume hydrodynamique important des molécules de gélatine comparé à celui des protéines globulaires.
Des gélatines de caractéristiques physico-chimiques différentes et deux solutés de remplissage, GFM1 et GFM2, ont été analysés dans des conditions identiques.
Les profils d'élution obtenus dans chaque cas sont représentés sur la figure 1, les valeurs du paramètre Kav calculé pour chacun des pics numérotés sur ces figures sont portés dans le Tableau III.
La caractérisation des hydrolysats est réalisée par simple comparaison de leurs profils d'élution.
La valeur de Kav est inversement proportionnelle à la masse moléculaire et la taille des molécules correspondantes.
La largeur d'un pic témoigne d'une distribution en masse molaire hétérogène.
Les valeurs de Kav portées dans le tableau III représentent la valeur centrale de la distribution pour chaque pic.
<tb> <SEP> Pic
<tb> Echantillon <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> GFM <SEP> 1 <SEP> 0,38 <SEP> 0,44 <SEP> 0,70 <SEP> 0,79
<tb> GFM2 <SEP> 0,36 <SEP> 0,45 <SEP> 0,73 <SEP> 0,80
<tb> Gélatine <SEP> n02 <SEP>
<tb> (Acide <SEP> 2e <SEP> bouillon) <SEP> 0,004 <SEP> 0,38 <SEP> 0,47 <SEP> 0,72 <SEP> 0,80
<tb> Gélatine <SEP> n"4 <SEP>
<tb> (Acide <SEP> 3e <SEP> bouillon) <SEP> 0,01 <SEP> 0,17 <SEP> 0,32 <SEP> 0,38 <SEP> 0,48 <SEP> 0,72 <SEP> 0,82
<tb> Gélatine <SEP> n 5
<tb> (Alcaline
<tb> <SEP> 2e <SEP> bouillon) <SEP> 0,02 <SEP> 0,12 <SEP> 0,21 <SEP> 0,36 <SEP> 0,46 <SEP> 0,72 <SEP> 0,82
<tb> Gélatine <SEP> n 6
<tb> (Alcaline
<tb> <SEP> 3e <SEP> bouillon) <SEP> 0 <SEP> 0,36 <SEP> 0,46 <SEP> 0,71 <SEP> 0,81
<tb>
EXEMPLE 4 : Enzymes utilisées
Les molécules de gélatine en solution ont une configuration facilitant l'accessibilité des sites actifs des protéases. Ainsi, la gélatine est sensible à presque toutes les enzymes protéolytiques, telles que la pepsine, la trypsine, la chymotrypsine, la papaïne, etc.
<tb> Echantillon <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 9
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<tb> <SEP> 3e <SEP> bouillon) <SEP> 0 <SEP> 0,36 <SEP> 0,46 <SEP> 0,71 <SEP> 0,81
<tb>
EXEMPLE 4 : Enzymes utilisées
Les molécules de gélatine en solution ont une configuration facilitant l'accessibilité des sites actifs des protéases. Ainsi, la gélatine est sensible à presque toutes les enzymes protéolytiques, telles que la pepsine, la trypsine, la chymotrypsine, la papaïne, etc.
De manière non limitative pour l'hydrolyse contrôlée de la gélatine, deux protéases de référence ont été choisies : il s'agit de la subtilisine Carlsberg (commercialisée par Novo Industrie sous la marque Alcalase 0,6 L) et de la protéase neutre de bacillus subtilis (commercialisée par Novo Industrie sous la marque Neutrase# 0,5 L).
EXEMPLE 5 : Immobilisation des protéases
La méthode choisie est une méthode d'immobilisation par lien covalent car les hydrolysats ne doivent pas être contaminés par les protéases, leurs propriétés devant rester constantes au cours du temps après leur préparation. Le support employé est la fraction ligno-cellulosique des rafles de mals, broyée telle que dans le FR-A-3 831 382.
La méthode choisie est une méthode d'immobilisation par lien covalent car les hydrolysats ne doivent pas être contaminés par les protéases, leurs propriétés devant rester constantes au cours du temps après leur préparation. Le support employé est la fraction ligno-cellulosique des rafles de mals, broyée telle que dans le FR-A-3 831 382.
C'est à partir des résidus de glucose des chaînes cellulosiques du support que s'effectue le greffage de l'enzyme. Les différentes étapes de la méthode d'immobilisation, optimisées pour l'invertase par MONSAN et coll.(l984) (Biotechnal. Bioeng.,26,658-664), sont résumées sur la figure 2.
Les rafles de malus constituent, après activation, un support de coût faible et d'utilisation facile.
Le Tableau IV ci-après résume le protocole d'activation des rafles. Le volume de réactif mis en contact avec 20g de rafles est de 400 ml. Toutes les étapes, à l'exception de celle d'amination, sont effectuées dans les conditions optimales déterminées par MONSAN et coll.(l984). La réaction d'amination modifie la consistance des rafles, aussi ne dépasse-telle pas 40 heures ici, alors que le temps de contact optimal est de 60 heures. Ainsi, les rafles conservent de bonnes propriétés mécaniques.
Avant activation, le support est abondamment lavé à l'eau distillée afin d'en éliminer les constituants solubles. Plusieurs lavages sont également effectués entre chaque étape d'activation, à l'eau pour les deux premières, au tampon pyrophosphate 50 mM pH 8,6 après fixation du glutaraldéhyde.
Les rafles utilisées présentaient une granulométrie de 0,8 mm.
Avant greffage, le support est lavé deux fois au tampon dans lequel la solution enzymatique est préparée. Après greffage, il est également lavé avec le même tampon, de façon abondante, afin d'éliminer toute trace d'enzyme libre. Quatre lavages de 15 minutes au chlorure de sodium 1M sont ensuite effectués afin d'enlever l'enzyme adsorbée sur le support; les rafles sont enfin lavées à l'eau distillée et conservées à 40C.
Une fois l'enzyme immobilisée, les lavages sont faits au froid.
Immobilisation de l'Alcalase
Les conditions suivantes sont utilisées (pour 20g de support):
- solution enzymatique : 34 g/l
- volume de solution : 400 ml
- pH 8,0 (tampon Tris-Hcl 50 mM)
- température: 4"C
- temps de contact : 18 heures.
Les conditions suivantes sont utilisées (pour 20g de support):
- solution enzymatique : 34 g/l
- volume de solution : 400 ml
- pH 8,0 (tampon Tris-Hcl 50 mM)
- température: 4"C
- temps de contact : 18 heures.
Avant greffage, les rafles sont lavées deux fois au tampon de pH 8,0. Après greffage, elles sont abondamment lavées au tampon pour éliminer toute trace d'enzyme libre. Quatre lavages de 15 minutes au chlorure de sodium 1M sont ensuite effectués afin d'enlever l'enzyme adsorbée sur le support. Les rafles sont enfin lavées à l'eau distillée et conservées à 4"C. Tous les lavages sont effectués au froid.
Immobilisation de la Neutrase
Les conditions suivantes sont utilisées (pour 20 g de support):
- solution enzymatique : 13 g/l
- volume de solution : 400 ml
- pH 7,0 (tampon tris-maléate 50 mM)
- température : 4"C
- temps de contact : 18 heures.
Les conditions suivantes sont utilisées (pour 20 g de support):
- solution enzymatique : 13 g/l
- volume de solution : 400 ml
- pH 7,0 (tampon tris-maléate 50 mM)
- température : 4"C
- temps de contact : 18 heures.
Les lavages sont effectués de la même manière que pour l'Alcalase. Les rafles sont également conservés à 4"C dans de l'eau distillée.
<tb> <SEP> Réaction <SEP> Réactif <SEP> Durée <SEP> rTaetmulPe~ <SEP> par <SEP> condition <SEP>
<tb> <SEP> Metaperiodate <SEP>
<tb> Oxydation <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 24 <SEP> h <SEP> ambiante <SEP> Abri <SEP> de <SEP> la
<tb> <SEP> 0,2 <SEP> M <SEP> lumière
<tb> <SEP> Ethylene <SEP>
<tb> Amination <SEP> diamine <SEP> I <SEP> M <SEP> 40 <SEP> h <SEP> ambiante <SEP>
<tb> <SEP> Glutaraldéhyde <SEP> 5 <SEP> h
<tb> Fixation <SEP> du <SEP> à <SEP> 1,25% <SEP> dans <SEP> + <SEP> ambiante <SEP>
<tb> glutaraldéhyde <SEP> tampon <SEP> pyro- <SEP> 2 <SEP> jours <SEP> de
<tb> <SEP> phosphate <SEP> conservation
<tb> <SEP> 50 <SEP> mM <SEP> pH <SEP> 8,6 <SEP> au <SEP> froid
<tb>
EXEMPLE 6 : Mise en oeuvre des hydrolyses
L'hydrolyse enzymatique d'une liaison peptidique provoque la libération d'un proton et donc une acidification du milieu réactionnel. Si pendant toute l'hydrolyse on maintient le pH constant par un ajout continu de soude de normalité connue, on peut déterminer la concentration des protons ainsi libérés. A pH constant, la consommation de soude est proportionnelle au norr. re de liaisons peptidiques coupées.
<tb> <SEP> Metaperiodate <SEP>
<tb> Oxydation <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 24 <SEP> h <SEP> ambiante <SEP> Abri <SEP> de <SEP> la
<tb> <SEP> 0,2 <SEP> M <SEP> lumière
<tb> <SEP> Ethylene <SEP>
<tb> Amination <SEP> diamine <SEP> I <SEP> M <SEP> 40 <SEP> h <SEP> ambiante <SEP>
<tb> <SEP> Glutaraldéhyde <SEP> 5 <SEP> h
<tb> Fixation <SEP> du <SEP> à <SEP> 1,25% <SEP> dans <SEP> + <SEP> ambiante <SEP>
<tb> glutaraldéhyde <SEP> tampon <SEP> pyro- <SEP> 2 <SEP> jours <SEP> de
<tb> <SEP> phosphate <SEP> conservation
<tb> <SEP> 50 <SEP> mM <SEP> pH <SEP> 8,6 <SEP> au <SEP> froid
<tb>
EXEMPLE 6 : Mise en oeuvre des hydrolyses
L'hydrolyse enzymatique d'une liaison peptidique provoque la libération d'un proton et donc une acidification du milieu réactionnel. Si pendant toute l'hydrolyse on maintient le pH constant par un ajout continu de soude de normalité connue, on peut déterminer la concentration des protons ainsi libérés. A pH constant, la consommation de soude est proportionnelle au norr. re de liaisons peptidiques coupées.
Les degrés d'hydrolyses étaient compris entre 0,1 et 2,2% de gélatines "brutes". De même le rapport massique enzyme/gélatine "brute" était compris entre 0,002% et 2%.
Le domaine de température se situait entre 30 et- 800C, et de préférence entre 40 et 60"C. De même le pH était compris entre 6 et 9, et de préférence entre 7 et 8, ainsi que la concentration en gélatine de 50 à 100 g/l.
Hydrolyses discontinues
Les hydrolyses sont effectuées sur des solutions de gélatine à 80 g/l. Cette concentration permet de plus une dilution facile jusqu'à 30 g/l lorsque l'on veut obtenir une solution semblable aux solutés de remplissage.
Les hydrolyses sont effectuées sur des solutions de gélatine à 80 g/l. Cette concentration permet de plus une dilution facile jusqu'à 30 g/l lorsque l'on veut obtenir une solution semblable aux solutés de remplissage.
Enfin, aux températures de travail, la viscosité des solutions est suffisamment faible pour ne pas gêner les manipulations.
La température est fixée à 50 C, et le pH à 7,0 pour la Neutrase et à 8,0 pour l'Alcalase.
Le volume réactionnel est de 20 ml. Si des prélèvements sont effectués, ce volume est porté à 50 ml.
Les solutions d'enzyme sont préparées par dilution dans l'eau de telle façon que la quantité ajoutée, au milieu réactionnel préalablement ajusté au pH voulu, donne un rapport massique enzyme-substrat (E/S) final de 0,02%, 0,2% ou 2% suivant le cas. Dans le cas d'une enzyme immobilisée, cette dernière est simplement ajoutée au milieu préalablement ajusté au pH désiré.
Dès que la gélatine a atteint la température et le pH voulus, un peu de complexe enzyme-support, préalablement égoutté, est ajouté.
L'agitation du milieu, pendant toute la durée de l'hydrolyse, est assurée par une pale de façon à ne pas broyer le support. La réaction est arrêtée par filtration sur acétate de cellulose (porosité 8 lim) afin d'ôter l'enzyme immobilisée du milieu.
Au laboratoire, les hydrolyses sont effectuées au pH-stat pour connaître l'évolution du degré d'hydrolyse (DH) en fonction du temps. Lors de la préparation des hydrolysats "in vivo", ce dispositif n'est pas employé car il suffit de connaître la quantité d'enzyme immobilisée et le temps de réaction requis pour obtenir l'hydrolysat recherché. De plus, dans ce cas, le volume de solution à hydrolyser a été porté à 500 ml.
Réacteur à lit fixe
La gélatine est préparée à une concentration de 80 g/l (gélatine n05), la solution est préalablement ajustée à pH 8,0 par une quantité connue de soude, l'enzyme utilisée ici étant l'Alcalase. Le réacteur est constitué d'une colonne C10/20 Pharmacia contenant un lit de rafles de mals sur lesquelles l'enzyme est immobilisée, surmonté d'une couche de ouate de verre servant de filtre. La colonne est maintenue à 40"C par immersion dans un bain thermostaté. L'alimentation en substrat est assurée par une pompe Masterflux (Bioblock). Un schéma du dispositif est représenté sur la figure 3.
La gélatine est préparée à une concentration de 80 g/l (gélatine n05), la solution est préalablement ajustée à pH 8,0 par une quantité connue de soude, l'enzyme utilisée ici étant l'Alcalase. Le réacteur est constitué d'une colonne C10/20 Pharmacia contenant un lit de rafles de mals sur lesquelles l'enzyme est immobilisée, surmonté d'une couche de ouate de verre servant de filtre. La colonne est maintenue à 40"C par immersion dans un bain thermostaté. L'alimentation en substrat est assurée par une pompe Masterflux (Bioblock). Un schéma du dispositif est représenté sur la figure 3.
EXEMPLE 7 : Alcalase immobilisée, hydrolyses discontinues
La figure 4 représente les profils d'élution d'hydrolysats obtenus à partir des gélatines 2 et 5. Ils sont superposés à celui de GFM2 afin de pouvoir comparer les hydrolysats avec le soluté de remplissage. Dans le
Tableau V sont portées les valeurs du paramètre Kav calculées pour chacun des pics numérotés sur cette figure. Ces hydrolysats ont été obtenus en 10 et 15 min. avec 0,94 mg de complexe enzyme-support sec/ml de milieu dans le cas de la gélatine n"2, et 1,38 mg de complexe enzyme-support sec/ml de milieu, dans le cas de la gélatine n"5.
La figure 4 représente les profils d'élution d'hydrolysats obtenus à partir des gélatines 2 et 5. Ils sont superposés à celui de GFM2 afin de pouvoir comparer les hydrolysats avec le soluté de remplissage. Dans le
Tableau V sont portées les valeurs du paramètre Kav calculées pour chacun des pics numérotés sur cette figure. Ces hydrolysats ont été obtenus en 10 et 15 min. avec 0,94 mg de complexe enzyme-support sec/ml de milieu dans le cas de la gélatine n"2, et 1,38 mg de complexe enzyme-support sec/ml de milieu, dans le cas de la gélatine n"5.
<tb>
<SEP> temps <SEP> Pic <SEP> Pic <SEP> Pic <SEP> Pic <SEP> Pic
<tb> <SEP> de <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> <SEP> réaction
<tb> <SEP> GFM2 <SEP> 0,38 <SEP> 0,47 <SEP> 0,73 <SEP> 0,82
<tb> <SEP> gélatine <SEP> 2 <SEP> DH <SEP> = <SEP> 0,35% <SEP> 10 <SEP> min. <SEP> 0,39 <SEP> 0,48 <SEP> 0,72 <SEP> 0,82
<tb> <SEP> DH <SEP> = <SEP> 0,50% <SEP> 15 <SEP> min. <SEP> 0,39 <SEP> 0,48 <SEP> 0,72 <SEP> 0,82
<tb> <SEP> gélatine <SEP> 5 <SEP> DH <SEP> = <SEP> 0,22% <SEP> 10 <SEP> min. <SEP> 0,32 <SEP> 0,37 <SEP> 0,47 <SEP> 0,73 <SEP> 0,82
<tb> <SEP> DH <SEP> = <SEP> 0,36% <SEP> 15 <SEP> min. <SEP> 0,38 <SEP> 0,47 <SEP> 0,73 <SEP> 0,82
<tb>
EXEMPLE 8 : Neutrase immobilisée, hydrolyses discontinues
La figure 5 représente les profils d'élution d'hydrolysats obtenus à partir des gélatines 2 et 5. Ils sont également superposés à celui de
GFM2.Dans le Tableau VI sont portées les valeurs du paramètre Kav calculées pour chacun des pics numérotés sur cette figure 5.
<tb> <SEP> de <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> <SEP> réaction
<tb> <SEP> GFM2 <SEP> 0,38 <SEP> 0,47 <SEP> 0,73 <SEP> 0,82
<tb> <SEP> gélatine <SEP> 2 <SEP> DH <SEP> = <SEP> 0,35% <SEP> 10 <SEP> min. <SEP> 0,39 <SEP> 0,48 <SEP> 0,72 <SEP> 0,82
<tb> <SEP> DH <SEP> = <SEP> 0,50% <SEP> 15 <SEP> min. <SEP> 0,39 <SEP> 0,48 <SEP> 0,72 <SEP> 0,82
<tb> <SEP> gélatine <SEP> 5 <SEP> DH <SEP> = <SEP> 0,22% <SEP> 10 <SEP> min. <SEP> 0,32 <SEP> 0,37 <SEP> 0,47 <SEP> 0,73 <SEP> 0,82
<tb> <SEP> DH <SEP> = <SEP> 0,36% <SEP> 15 <SEP> min. <SEP> 0,38 <SEP> 0,47 <SEP> 0,73 <SEP> 0,82
<tb>
EXEMPLE 8 : Neutrase immobilisée, hydrolyses discontinues
La figure 5 représente les profils d'élution d'hydrolysats obtenus à partir des gélatines 2 et 5. Ils sont également superposés à celui de
GFM2.Dans le Tableau VI sont portées les valeurs du paramètre Kav calculées pour chacun des pics numérotés sur cette figure 5.
<tb>
<SEP> temps <SEP> Pic <SEP> Pic <SEP> Pic <SEP> Pic <SEP> Pic
<tb> <SEP> de <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> <SEP> réaction <SEP> (*)
<tb> GFM2 <SEP> 0,36 <SEP> 0,45 <SEP> 0,72 <SEP> 0,78
<tb> <SEP> Gélatine <SEP> 2 <SEP> DH <SEP> = <SEP> 0,20% <SEP> 5 <SEP> min. <SEP> 0,32 <SEP> 0,38 <SEP> 0,47 <SEP> 0,71 <SEP> 0,81
<tb> <SEP> DH <SEP> = <SEP> 0,40% <SEP> 10 <SEP> min. <SEP> 0,32 <SEP> 0,38 <SEP> 0,47 <SEP> 0,71 <SEP> 0,81
<tb> <SEP> Gélatine <SEP> 5 <SEP> DH <SEP> = <SEP> 0,28% <SEP> 15 <SEP> min. <SEP> 0,30 <SEP> 0,36 <SEP> 0,46 <SEP> 0,72 <SEP> 0,82
<tb> (*) le Pic 8 ici correspond à l'élution de l'EDTA qui a été ajouté aux
échantillons prélevés pendant les hydrolyses.
<tb> <SEP> de <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> <SEP> réaction <SEP> (*)
<tb> GFM2 <SEP> 0,36 <SEP> 0,45 <SEP> 0,72 <SEP> 0,78
<tb> <SEP> Gélatine <SEP> 2 <SEP> DH <SEP> = <SEP> 0,20% <SEP> 5 <SEP> min. <SEP> 0,32 <SEP> 0,38 <SEP> 0,47 <SEP> 0,71 <SEP> 0,81
<tb> <SEP> DH <SEP> = <SEP> 0,40% <SEP> 10 <SEP> min. <SEP> 0,32 <SEP> 0,38 <SEP> 0,47 <SEP> 0,71 <SEP> 0,81
<tb> <SEP> Gélatine <SEP> 5 <SEP> DH <SEP> = <SEP> 0,28% <SEP> 15 <SEP> min. <SEP> 0,30 <SEP> 0,36 <SEP> 0,46 <SEP> 0,72 <SEP> 0,82
<tb> (*) le Pic 8 ici correspond à l'élution de l'EDTA qui a été ajouté aux
échantillons prélevés pendant les hydrolyses.
Ces hydrolysats ont été obtenus en 5, 10 et 15 minutes à l'aide de 1,50 mg de complexe enzyme-support sec/ml de milieu pour la gélatine n" 2, et de 1,42 mg de complexe sec/ml de milieu pour la gélatine n"5.
EXEMPLE 9 : Alcalase immobilisée, réacteur à lit fixe
Le volume du lit de rafles est de 3 ml. Le réacteur contient 234,1 mg de complexe enzyme-support sec. La figure 6 représente les profils d'élution de deux hydrolysats produits à l'aide du réacteur à partir de la gélatine n05, ainsi que celui de GFM2. Dans le Tableau VII sont portées les valeurs du paramètre Kav calculées pour chacun des pics
numérotés sur cette figure.
Le volume du lit de rafles est de 3 ml. Le réacteur contient 234,1 mg de complexe enzyme-support sec. La figure 6 représente les profils d'élution de deux hydrolysats produits à l'aide du réacteur à partir de la gélatine n05, ainsi que celui de GFM2. Dans le Tableau VII sont portées les valeurs du paramètre Kav calculées pour chacun des pics
numérotés sur cette figure.
<tb> <SEP> Pic <SEP> Pic <SEP> Pic <SEP> ~ <SEP> Pic <SEP> Pic
<tb> <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> GFM2 <SEP> 0,36 <SEP> 0,45 <SEP> 0,72 <SEP> 0,80
<tb> <SEP> t <SEP> = <SEP> 13s <SEP> 0,30 <SEP> 0,37 <SEP> 0,46 <SEP> 0,72 <SEP> 0,81
<tb> <SEP> = <SEP> = <SEP> 26s <SEP> 0,37 <SEP> 0,46 <SEP> 0,71 <SEP> 0,81
<tb>
Les deux hydrolysats ont été obtenus pour des temps de passage (%) de 13 à 26 secondes soit des débits de 14,2 et 7,1 ml/min.
<tb> <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> GFM2 <SEP> 0,36 <SEP> 0,45 <SEP> 0,72 <SEP> 0,80
<tb> <SEP> t <SEP> = <SEP> 13s <SEP> 0,30 <SEP> 0,37 <SEP> 0,46 <SEP> 0,72 <SEP> 0,81
<tb> <SEP> = <SEP> = <SEP> 26s <SEP> 0,37 <SEP> 0,46 <SEP> 0,71 <SEP> 0,81
<tb>
Les deux hydrolysats ont été obtenus pour des temps de passage (%) de 13 à 26 secondes soit des débits de 14,2 et 7,1 ml/min.
En conclusion, quelle que soit la protéase utilisée, c'est à la gélatine n 5 qui permet d'obtenir les hydrolysats présentant les distributions en masses molaires les plus convenables dépourvus notamment de fractions de trop grandes tailles moléculaires susceptibles de provoquer des réactions allergiques. Ils possèdent en effet une meilleure homogénéité que ceux qui sont produits avec d'autres gélatines.
Avec l'Alcalase immobilisée, on obtient un hydrolysat possédant une distribution en masses molaires convenable en 10 minutes, avec la gélatine n05, pour un degré d'hydrolyse de 0,22%. Avec la Neutrase, on produit l'hydrolysat recherché en 15 minutes à partir de la même gélatine, pour un degré d'hydrolyse de 0,28%.
Lorsque la gélatine n 5 est utilisée comme substrat, la différence de mode d'action des deux protéases immobilisées apparaît peu; elles permettent toutes deux d'obtenir la modification que l'on recherche.
Lorsque l'Alcalase immobilisée est utilisée en continu en réacteur à lit fixe, et dans les conditions expérimentales choisies, un temps de passage très court (compris entre 13 et 26 secondes) suffit pour obtenir le taux d'hydrolyse recherché. En faisant varier entre ces deux valeurs, il est en effet possible de modifier légèrement la distribution en masses molaires de l'hydrolysat produit de façon à en améliorer, si nécessaire, les caractéristiques.
Dans tous les cas, la quantité d'enzyme et le temps de réaction requis pour transformer la gélatine de façon adéquate sont peu importants.
EXEMPLE 10 : Solutés de remplissage
Pour pouvoir utiliser les hydrolysats ainsi produits comme solutés de remplissage, il suffit de les diluer, d'ajouter les sels nécessaires et d'en ajuster le pH.
Pour pouvoir utiliser les hydrolysats ainsi produits comme solutés de remplissage, il suffit de les diluer, d'ajouter les sels nécessaires et d'en ajuster le pH.
Afin d'obtenir des substituts du plasma, les hydrolysats sont employés à une concentration en gélatine égale à 30 g/l. Les sels suivants sont rajoutés en quantités adéquates:
NaCI-chlorure de magnésium anhydre-chlorure de potassium-lactate de sodium anhydre, le pH est ajusté par NaOH.
NaCI-chlorure de magnésium anhydre-chlorure de potassium-lactate de sodium anhydre, le pH est ajusté par NaOH.
Le Tableau VIII qui suit présente les constantes analytiques mesurées de plusieurs hydrolysats destinés à couvrir des gammes de concentration ioniques et de pH variés, ceci en comparaison d'un soluté de remplissage commercialisé. Les échantillons I,II et III provenaient de gélatine n02 et l'échantillon IV provenait de gélatine n"5.
Ces différents lots ont été l'objet d'une expérimentation pharmacologique destinée à sélectionner les substituts ayant le meilleur pouvoir de remplissage. L'essai est réalisé selon la technique de BALCAZO,
CARY, MILLER & PARKINS, Surgery (1971) vol.70, p. 555-560, et permet de mesurer chez le rat la fréquence cardiaque, le débit cardiaque et la pression artérielle au cours d'un choc hémorragique que l'on compense par l'administration intraveineuse de substituts du plasma. Ces essais ont permis de sélectionner parmi les échantillons un type de soluté possédant un pouvoir de remplissage et assurant une restauration des chiffres tensionnels supérieurs à celui des composés du commerce.
CARY, MILLER & PARKINS, Surgery (1971) vol.70, p. 555-560, et permet de mesurer chez le rat la fréquence cardiaque, le débit cardiaque et la pression artérielle au cours d'un choc hémorragique que l'on compense par l'administration intraveineuse de substituts du plasma. Ces essais ont permis de sélectionner parmi les échantillons un type de soluté possédant un pouvoir de remplissage et assurant une restauration des chiffres tensionnels supérieurs à celui des composés du commerce.
<SEP> type <SEP> soluté <SEP> HYDROLYSAT <SEP> Constantes
<tb> caract. <SEP> de <SEP> sanguines
<tb> analytique <SEP> réf. <SEP> I <SEP> II <SEP> III <SEP> IV <SEP> IVa <SEP> IVb <SEP> IVc <SEP> normales
<tb> <SEP> pH <SEP> 6.25 <SEP> 6.84 <SEP> 6.40 <SEP> 6.52 <SEP> 6.50 <SEP> 7.2 <SEP> 7.4 <SEP> 7.4 <SEP> 7.41 <SEP> # <SEP> 0.02
<tb> Na+ <SEP> (mEq) <SEP> 150 <SEP> 135 <SEP> 130 <SEP> 133 <SEP> 131 <SEP> 132.5 <SEP> 133 <SEP> 138 <SEP> 137 <SEP> à <SEP> 143
<tb> K+ <SEP> (mEq) <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 3,7 <SEP> à <SEP> 5
<tb> Mg++ <SEP> (mEq) <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 1,6 <SEP> à <SEP> 2,1
<tb> Cl- <SEP> (mEq) <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 105 <SEP> 90 <SEP> à <SEP> 110
<tb> Réserve <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 28 <SEP> # <SEP> 2
<tb> slcaline
<tb>
<tb> caract. <SEP> de <SEP> sanguines
<tb> analytique <SEP> réf. <SEP> I <SEP> II <SEP> III <SEP> IV <SEP> IVa <SEP> IVb <SEP> IVc <SEP> normales
<tb> <SEP> pH <SEP> 6.25 <SEP> 6.84 <SEP> 6.40 <SEP> 6.52 <SEP> 6.50 <SEP> 7.2 <SEP> 7.4 <SEP> 7.4 <SEP> 7.41 <SEP> # <SEP> 0.02
<tb> Na+ <SEP> (mEq) <SEP> 150 <SEP> 135 <SEP> 130 <SEP> 133 <SEP> 131 <SEP> 132.5 <SEP> 133 <SEP> 138 <SEP> 137 <SEP> à <SEP> 143
<tb> K+ <SEP> (mEq) <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 3,7 <SEP> à <SEP> 5
<tb> Mg++ <SEP> (mEq) <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 1,6 <SEP> à <SEP> 2,1
<tb> Cl- <SEP> (mEq) <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 105 <SEP> 90 <SEP> à <SEP> 110
<tb> Réserve <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 28 <SEP> # <SEP> 2
<tb> slcaline
<tb>
Claims (18)
1/ Procédé de préparation de gélatines "modifiées" utile notamment pour solutés de remplissage, caractérisé en ce que l'on effectue une hydrolyse enzymatique contrôlée de gélatine "brute" pour obtenir des gélatines "modifiées".
2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise une enzyme immobilisée sur un support neutre.
3/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'hydrolyse est réalisée dans un réacteur en discontinu.
4/ Procédé selon la revendication I ou 2, caractérisé en ce que l'hydrolyse est réalisée dans un réacteur en continu.
5/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'hydrolyse est réalisée à pH entre 6 et 9.
6/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'hydrolyse est réalisée à pH entre 7 et 8.
7/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise comme enzyme une protéase alcaline telle que la subtilisine Carlsberg ou une protéase neutre telle que celle de Bacillus subtilis.
8/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise une gélatine "brute" extraite de peaux de porcs, de bovins, d'ovins ou d'os ayant subi un traitement acide ou alcalin, plusieurs extractions successives étant possibles.
9/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise une gélatine "brute" de veau extraite par voie acide ou alcaline.
10/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que l'on utilise une enzyme immobilisée sur son support par liaison covalente.
11/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que l'enzyme est immobilisée sur support de rafle de mals.
12/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'hydrolyse est réalisée à partir de solution de gélatine dans l'eau à des concentrations de 50 g/I à 100 g/l.
13/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'hydrolyse est réalisée à une température comprise entre 30 et 80"C.
14/ Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'hydrolyse est réalisée à une température comprise entre 40 et 60"C.
15/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le rapport massique enzyme/gélatine "brute" est compris entre 0,02% et 2%.
16/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le degré d'hydrolyse est compris entre 0,10 et 2,2% des gélatines "brutes".
17/ Solutés de remplissage obtenus à partir d'une gélatine hydrolysée par un procédé selon l'une des revendications précédentes.
18/ Solutés de remplissage selon la revendication 17, caractérisés en ce que leur pH est compris entre 6,4 et 7,4, qu'ils présentent la composition ionique suivante
Na+ compris entre 137 et 143 mmoles/l
K+ compris entre 3,7 et 5 mmoles/l
Mg++ compris entre 1,6 et 2,1 mmoles/l
Cl compris entre 90 et 110 mmoles/l
réserve alcaline (lactate) 28 i 2 mmoles/l, et qu'ils sont obtenus à partir d'hydrolysats à une concentration en gélatine égale à 30 g/l.
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US5147787A (en) * | 1988-08-05 | 1992-09-15 | Isp Investments Inc. | Recovery of imageable polyacetylenes from binder containing aqueous dispersions |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE1276650B (de) * | 1962-05-11 | 1968-09-05 | Iabiotestia Serum Inst G M B H | Verfahren zur Herstellung von als Blutplasmaersatzmittel geeigneten, modifizierten Proteinzubereitungen |
-
1986
- 1986-11-17 FR FR8615943A patent/FR2606638B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
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DE1276650B (de) * | 1962-05-11 | 1968-09-05 | Iabiotestia Serum Inst G M B H | Verfahren zur Herstellung von als Blutplasmaersatzmittel geeigneten, modifizierten Proteinzubereitungen |
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Title |
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US5147787A (en) * | 1988-08-05 | 1992-09-15 | Isp Investments Inc. | Recovery of imageable polyacetylenes from binder containing aqueous dispersions |
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