DE60028965T2

DE60028965T2 - Materialen zur vermehrung von weichgewebe und deren herstellungs- und verwendungsmethoden

Info

Publication number: DE60028965T2
Application number: DE60028965T
Authority: DE
Inventors: Norman New York ORENTREICH; A. Rozlyn Poughquag KRAJCIK
Original assignee: Orentreich Foundation for Advancement of Science Inc
Current assignee: Orentreich Foundation for Advancement of Science Inc
Priority date: 1999-05-11
Filing date: 2000-04-13
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2020-04-14
Also published as: CA2371265A1; EP1178816A2; ATE330621T1; WO2000067774A3; US7015198B1; EP1178816B1; AU4348800A; DE60028965D1; WO2000067774A2

Description

Technischer Hintergrund der Erfindung
Vermehrung von Weichgewebe ist ein allgemeiner Ausdruck, der sich zusammenfassend auf Verfahren bezieht, die zur Verminderung der Sichtbarkeit von Hautdefekten angewendet werden können. Das schließt gewöhnlich die Injektion oder Implantation von etwas Material in die Haut des Patienten ein. Injektionen und Implantationen können in unterschiedlicher Tiefe unter der Epidermis angebracht werden, darunter intradermale und subkutane (hierin weiter allgemein als "dermal" bezeichnet) Tiefen, je nach der Art des behandelten Defekts, der gewünschten Wirkung und dem verwendeten Material. Defekte wie Linien, Falten, Narben und dergleichen können durch solche Verfahren zumindest vorübergehend beträchtlich vermindert und in einigen Fällen völlig unsichtbar gemacht werden.
Vermehrung von Weichgewebe kann auf unterschiedlichen Wegen durchgeführt werden. Zwei der üblicheren Arten der Weichgewebevermehrung umfassen die dermale Insertion von halbfesten oder festen Implantaten biokompatibler Materialien und die dermale Injektion biokompatibler Materialien, welche die Form von Gel oder viskoser Flüssigkeit haben können.
Viele Stoffe unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung und Derivate wurden als injizierbare Materialien zur Weichteilvermehrung vorgeschlagen und verwendet. Zu den in der langen Geschichte der Weichgewebevermehrung verwendeten Materialien gehören Silikonprodukte, Paraffine und autologe Fettstoffe. Die zurzeit anscheinend am meisten verwendeten injizierbaren Materialien zur Weichgewebevermehrung sind jene mit Kollagen oder auf Basis von Kollagen. Kollagen bedeutet allgemein eine breite Vielfalt von Faserprodukten, die in Haut, Muskeln, Sehnen, Knorpeln und Knochen von Tieren zu finden sind. Kollagen, das gewöhnlich einen großen Anteil von Prolin- und Hydroxyprolin-Aminosäureresten enthält, existiert in vielen Dreifachhelixformen mit leicht unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften.
Ein Überblick des Standes der Technik ist in POLLACK S.: "Silicon, Fibrel and Collagen Implantation for Facial Lines and Wrikles", J. Dermatol. Surg. Oncol. 16, 957–961, und COLEMAN et al.: "Combining Skin Resurfacing with Soft Tissue Augmentation", Skin Resurfacing, Baltimore 1996, 217–234, gegeben.
Bei der Beurteilung eines injizierbaren Materials zur Weichgewebevermehrung sind viele Faktoren zu berücksichtigen. Diese Faktoren fallen grob in vier Kategorien, darunter medizinische Eigenschaften, ästhetische Eigenschaften, praktische Eignung und wirtschaftliche Erwägungen. Medizinische Eigenschaften, die ein Material zur Weichgewebevermehrung idealerweise besitzen sollte, umfassen Nicht-Antigenität, Dauerhaftigkeit der Behandlung und Stabilität gegen Wanderung. So sollten die Materialien keine Reaktionen wie Erythem, Ulzeration, Entzündung, Nekrose, Hypo- oder Hyperpigmentierung, Ödem, Granulom und/oder Infektion hervorrufen. Die Materialien sollten bei der Injektion minimalen Schmerz verursachen und minimale Erholungszeit erfordern. Ästhetisch sollten die Materialien ein natürliches Aussehen und Gefühl haben, nachdem sie in den Körper eingesetzt wurden. Ein Material mit einigen oder allen der bevorzugten medizinischen und ästhetischen Qualitäten sollte auch insofern praktisch brauchbar sein, als daß ein Arzt es durch feine Kanülen injizieren und nötigenfalls die Injektion entfernen kann. Andere praktische Erwägungen umfassen die Lagerfähigkeit des Materials, die Lagerbedingungen, die das Material erfordert und die ggf. notwendige Vorbehandlung vor der Injektion. Natürlich wird wenig Vorbehandlung bevorzugt. Schließlich sind die Gesamtkosten des Materials zu berücksichtigen.
Silikonmaterialien sind häufig für die Weichgewebevermehrung schwierig richtig zu injizieren.
Lange bekannt und untersucht sind Injektionen von autologem Fett und von Paraffin. Diese Materialien haben auch Nachteile. Fettinjektionen können unter gewissen Umständen gefährlich sein und sind hinsichtlich des Ergebnisses und der Dauerhaftigkeit der Behandlung sehr wenig vorhersehbar. In Gesichtslinien und -falten injiziertes Fett kann bei einigen Patienten Verlust des Sehvermögens (Amaurose) und sogar Embolie verursachen. Paraffininjektionen, die nicht biokompatibel sind, können zu chronischer Entzündung und Granulom führen. Ferner wird ein wechselnder Anteil einer Fettinjektion leicht vom Körper absorbiert. So ist die Gesamtwirkung einer injizierten Fettmenge schwer vorherzusagen.
In den letzten etwa zehn bis zwanzig Jahren kam Rinderkollagen und neuerdings autologes Kollagen zu breiter Anwendung als injizierbares Material zur Weichgewebevermehrung. Rinderkollagenprodukte können jedoch allergische Reaktionen bei Patienten, denen diese injiziert wurden, auslösen. Es ist üblich, den Patienten einem oder manchmal zwei Tests mit einem Rinderkollagenprodukt als Indikator einer möglichen allergischen Reaktion zu unterziehen. Einige Patienten, die negative Testergebnisse zeigen, können trotz solcher Vorsorgemaßnahmen danach eine allergische Reaktion entwickeln.
Ebenso wurden auch autologes Kollagen aus dem Körper des Patienten selbst, gewöhnlich aus seiner Haut, und heterologes Humankollagen aus menschlichen Leichen als Materialien zur Weichgewebevermehrung vorgeschlagen und eingeführt. Während autologes Kollagen das Vorkommen allergischer Reaktionen bei manchen Patienten vermindert hat, weist dieses Material auch Nachteile auf. Ausgangsmaterial für die Herstellung von autologem Kollagen ist gewöhnlich die Haut des Patienten selbst. Daher erhält man das Ausgangsmaterial gewöhnlich durch chirurgische Exzision der Haut des Patienten.
Ein anderes für die Weichgewebevermehrung vorgeschlagenes Material ist ein Gel mit einem vernetzten Derivat der Hyaluronsäure. Hyaluronsäure ist ein Polymer hohen Molekulargewichts mit Acetylglykosamin und Glukuronsäure als abwechselnden Einheiten. Der Vorteil der Hyaluronsäuregele gegenüber den injizierbaren Materialien des Standes der Technik besteht darin, daß sie aus Polysacchariden aufgebaut sind, die gewöhnlich keine nachteiligen immunologischen Wirkungen beim Patienten hervorrufen. So werden, wie mit autologem Kollagen, die nachteiligen Reaktionen weitgehend vermieden, aber die Verwendung der Haut des Patienten selbst wird vermieden. Leider zeigen Hyaluronsäuregele einige der Nachteile der anderen Materialien des Standes der Technik, insbesondere verminderte Beständigkeit wegen geringen Widerstands gegenüber natürlichen Proteasen im Patientenkörper. Allgemein sind die bekannten Materialien zur Weichgewebevermehrung kurzlebig und erfordern häufige Wiederholung der Injektionen, um das Maß der Hautdefektkorrektur aufrechtzuerhalten.
Andere zur Weichgewebevermehrung vorgeschlagene und verwendete Gelmaterialien sind von Blut abgeleitete Gele, die durch Blutentnahme vom Patienten, Kombination der Blutproteine mit Ascorbinsäure (Vitamin C) und Wärmegelieren des Gemischs erhältlich sind. Während diese Materialien relativ leicht erhältlich sind und wenn überhaupt nur geringe nachteilige Reaktion beim Patienten bewirken, sind sie ebenfalls nach Injektion nur kurzlebig.
Es wurden viele unterschiedliche Lösungswege eingeschlagen, um die Beständigkeit der Materialien zur Weichgewebevermehrung zu steigern, indem man versuchte, die Widerstandsfähigkeit des Materials gegen proteolytische Spaltung zu erhöhen. Die Versuche zur Steigerung der Beständigkeit der bekannten injizierbaren Materialien konzentrierten sich im Allgemeinen auf chemische Modifikation der Materialien. Injizierbare Materialien mit Kollagen wurden mit chemischen Modifikatoren, wie Acylierungs- und Veresterungsmitteln, behandelt, um ihre Beständigkeit gegen proteolytische Spaltung zu erhöhen. Auch die zusätzliche Vernetzung von Kollagenmaterialien und Hyaluronsäure wurde zur Steigerung der Viskosität und möglicherweise der Beständigkeit des Materials gegen proteolytische Spaltung vorgeschlagen. Zur Vernetzung von Kollagenmaterialien vorgeschlagene Verfahren umfassen thermische, chemische und Bestrahlungsverfahren. Die Vernetzung dieser Materialien führte jedoch nicht zu einem überlegenen Produkt, das beträchtlich besser in seiner Beständigkeit gegen den proteolytischen Angriff durch natürliche Enzyme ist. Jedenfalls haben die bekannten injizierbaren Materialien zur Weichgewebevermehrung oft viele der von solchen Materialien erwarteten erwünschten Eigenschaften nicht erfüllen können.
Daher besteht immer noch ein Bedürfnis nach sicheren, nicht antigenen, nicht reizenden, beständigen und ästhetisch gefälligen injizierbaren Materialien zur Weichgewebevermehrung, die relativ leicht erhältlich und/oder herstellbar sind.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass Blutplasmaproteine unter Bildung von Materialien vernetzt werden können, die leicht injiziert werden, überraschend widerstandsfähig gegen proteolytische Spaltung, nicht antigen und ästhetische ansprechend sind, wenn sie zur Weichgewebevermehrung benutzt werden. Diese Materialien sind wesentlich stabiler hinsichtlich des Angriffs durch natürliche Proteasen als andere injizierbare Materialien. Ferner wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Materialien gereinigt und sterilisiert werden können, was noch größere Widerstandsfähigkeit gegen proteolytischen Angriff ergibt.
Erfindungsgemäß umfasst ein injizierbares Material zur Vermehrung von Weichgewebe bei Säugetieren vernetzte Blutplasmaproteine, wobei die Vernetzungen mindestens eine intermolekulare Amidbindung umfassen. Bevorzugt werden die Blutplasmaproteine mit einem Nullängen-Vernetzungsmittel vernetzt und die vernetzten Blutplasmaproteine wahlweise gereinigt und/oder sterilisiert. Ebenfalls bevorzugt werden die Blutplasmaproteine aus einer autologen Blutprobe erhalten.
Ebenfalls erfindungsgemäß umfasst ein Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Materials zur Weichgewebevermehrung bei einem Säugetier die Schritte a) Fällen eines Proteinanteils aus einer Blutplasmaprobe und b) Vernetzung des Proteinanteils unter Bildung eines vernetzten Blutplasmaproteinanteils, der das injizierbare Material darstellt. Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform kann der Proteinanteil mit einem Nullängen-Vernetzungsmittel vernetzt werden und das Verfahren kann zusätzlich umfassen, daß das vernetzte Blutplasmaprotein einer Dialyse und Autoklavierung unterzogen wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorstehende Zusammenfassung wie auch die folgende eingehende Beschreibung der Erfindung ist besser verständlich, wenn sie zusammen mit den beigefügten Zeichnungen gelesen wird. Zur Veranschaulichung sind in den Zeichnungen Ausführungsform(en) gezeigt, die zurzeit bevorzugt sind. Man verstehe aber, dass die Erfindung durch diese Ausführungsform(en), die zur Gewinnung der in den Zeichnungen gezeigten Daten verwendet wurden, nicht beschränkt wird. In den Zeichnungen ist:
1 ein Graph über der in Tagen gemessenen Zeit für die subjektive Wirkung des proteolytischen Abbaus und der Phagozytose (Biodegradation) in vivo der nach Herstellungsbeispiel 1 und Herstellungsvergleichsbeispiel 1 erzeugten injizierbaren Materialien, wie sie in Anwendungsbeispiel 1 und Anwendungsvergleichsbeispiel 1 verwendet wurden,
2 eine graphische Darstellung über der in Tagen gemessenen Zeit für die subjektive Wirkung des proteolytischen Abbaus und der Phagozytose (Biodegradation) in vivo der injizierbaren Materialien, wie sie in Anwendungsbeispiel 1 und Anwendungsvergleichsbeispielen 2 und 3 verwendet wurden,
3 eine graphische Darstellung der quantitativen Wirkung des proteolytischen Abbaus in vitro für die nach den Herstellungsbeispielen 1 und 2 und dem Herstellungsvergleichsbeispiel 1 erzeugten injizierbaren Materialien, gemessen durch Fluoreszenzassay der vorhandenen freien Amine, wie in den Analysebeispielen 1 und 2 und im Analysevergleichsbeispiel 1 beschrieben.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Obwohl die vorliegende Erfindung allgemein bei Säugetieren anwendbar ist, wird sie mit besonderem Bezug auf Menschen beschrieben.
Erfindungsgemäße injizierbare Materialien zur Weichgewebevermehrung enthalten vernetzte Blutplasmaproteine. Die Blutplasmaproteine werden gewöhnlich aus Blutplasma erhalten, das autolog oder heterolog sein kann. So können die Blutplasmaproteine aus Blut erhalten werden, das direkt vom Patienten entnommen wurde oder sie können aus gemischtem (pooled) Blut entnommen wurde. Das Blut kann dem Patienten nach Labor-Standardverfahren entnommen werden, wie z.B. das von Davidsohn und Nelson in Clinical Diagnosis by Laboratory Methods, Kapitel 4, 15. Aufl. (1974) offenbarte Verfahren. Im Allgemeinen ist es weder wichtig, wie das Blut entnommen oder erhalten wurde, noch wie das Blutplasma vom Vollblut getrennt wurde. Jedes medizinisch oder klinisch zulässige Verfahren, mit dem Blut entnommen oder anderweitig erhalten werden kann, und jedes medizinisch oder klinisch zulässige Verfahren der Plasmaabtrennung kann erfindungsgemäß angewendet werden.
Das vom Patienten oder anderen Spendern entnommene Blut sollte in Röhren oder Gläsern gesammelt werden, die keine Ethylendiamintetraessigsäure ("EDTA") oder ein anderes aminhaltiges Mittel als Antikoagulans enthalten, das die Wirkung des Vernetzungsmittels nachteilig beeinflussen könnte. Bevorzugt enthält das Sammelgefäß eine ACD-Lösung ("saure Citrat-Dextrose") in einer Menge von etwa 1,5 ml als Antikoagulans. Auch Heparin ist ein zulässiges Antikoagulant. Eine ACD-Lösung enthält im allgemeinen Trinatriumcitrat, Zitronensäure und Dextrose. Beispielsweise sind Sammelröhrchen mit glyzerinierten Stopfen und 8,5 ml Entnahmekapazität, die 1,5 ml einer Lösung von 22 g/l Trinatriumcitrat, 8 g/l Zitronensäure und 24,5 g/l Dextrose enthalten, für die Verwendung beim Sammeln von Blut vom Patienten oder einem anderen Spender erfindungsgemäß geeignet. Zwei Behälter mit je 8,5 ml Blut ergeben normalerweise eine angemessene Menge Blutplasma, etwa 10 ml.
Ein bevorzugtes Verfahren, mit dem Plasma vom Blut getrennt werden kann, ist Zentrifugieren. Beispielsweise können Sammelröhrchen mit Vollblut etwa 10 min bei 1500 min^–1 bei jeder geeigneten Temperatur einschließlich Zimmertemperatur zentrifugiert werden. Das Plasma kann aus den Sammelröhrchen mittels einer sterilen Pipette oder anderer geeigneter Mittel entfernt werden. Das Plasma kann sofort erfindungsgemäß verwendet oder gelagert werden.
Das Plasma kann gelagert werden. Es bleibt hinsichtlich der erfindungsgemäßen Verwendung durch die Lagerung bis zu etwa 2 Wochen bei 4°C oder unbegrenzt bei einer Temperatur von etwa –20°C oder darunter im Wesentlichen unbeeinträchtigt. Über lange Zeit gelagertes Plasma sollte bevorzugt noch einmal zentrifugiert werden, um koaguliertes Material oder andere Trümmer zu entfernen, die zum Absetzten neigen.
Heterologes gemischtes menschliches Blutplasma, wie solches, das vom amerikanischen Roten Kreuz erhältlich ist, kann ebenso gut erfindungsgemäß verwendet werden. Wenn heterologes Blut von anderen Spendern oder gemischtes menschliches Blutplasma verwendet wird, sollte bevorzugt die Qualität des Blutplasmas durch Einsatz aller bekannten medizinischen Untersuchungsmethoden, einschließlich der richtigen Analysenverfahren und jeglicher notwendiger Behandlungen gesichert werden, um jedes wesentliche Infektionsrisiko auszuschließen.
Menschliches Blut ist ein komplexes chemisches System, das hauptsächlich Wasser, eine breite Vielfalt von Proteinen, anorganischen Salzen organischen Metaboliten und Zellmaterial, darunter weiße und rote Blutkörperchen und Thrombozyten, enthält. Blutplasma, das aus dem Vollblut beispielsweise durch Zentrifugieren wie oben beschrieben, abgetrennt werden kann, enthält im allgemeinen Wasser, eine wesentliche Menge jener Proteine und die anderen Blutbestandteile außer dem Zellmaterial. Blutplasma kann weiter aufgetrennt werden in einen Anteil, der einen wesentlichen Teil der Proteine enthält (hierin "Proteinanteil") und einen anderen Anteil, der Wasser und die anderen Plasmabestandteile enthält, indem man die Proteine denaturiert oder ihre Fällung anderweitig verursacht (beispielsweise über pH-Steuerung, Derivatbildung, Lösungsmittelfällung, Ammoniumsulfatfällung usw. wie beispielsweise in Putnam, F. W., The Plasma Proteins, Band 1, Kapitel 2 (1960) beschrieben). Der Proteinanteil des Blutplasmas enthält gewöhnlich im wesentlichen alle im Blut vorhandenen Plasmaproteine, darunter Serumalbumin, Lipoproteine sehr niedriger Dichte (VLDLs), Lipoproteine geringer Dichte (LDLs), Lipoproteine hoher Dichte (HDLs), viele verschiedene Immunglobuline, Fibrinogen, Prothrombin, Transferrin und andere Transportproteine.
Der Proteinanteil des Blutplasmas ist erfindungsgemäß vernetzt. Der Proteinanteil des Blutplasmas kann beispielsweise mit chemischen Reagentien oder Enzymen oder durch Verfahren wie Wasserabspaltung oder Erhitzen, Anwendung hohen Drucks durch Verwendung von beispielsweise einer Vorrichtung mit Parr-Bombe, oder durch UV-Bestrahlung mit oder ohne Initiatoren vernetzt werden. Erfindungsgemäß besonders geeignete Vernetzungsmittel sind jene, die in Kapitel 2 und 6 von Shan Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, (1991), beschrieben sind, dessen gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird der Proteinanteil mit einem Nullängen-Vernetzungsmittel vernetzt. Nullängen-Vernetzungsmittel sind eine Klasse von Verbindungen, welche die direkte Bindung und Erzeugung stabiler Bindungen zwischen zwei inneren chemischen Gruppen einer oder mehrerer Polypeptidketten ohne Einführung von äußerer Materie herbeiführen können. Daher ist zu verstehen, dass jedes Vernetzungsmittel, das keine äußere Materie in den vernetzten Proteinanteil einführt, als Nullängen-Vernetzungsmittel angesehen werden soll, ungeachtet eines spezifischen Begriffs, der zur Beschreibung oder Identifizierung des Vernetzungsmittels verwendet wird. Nullängen-Vernetzungsmittel können beispielsweise

1. die Bildung von Disulfidbrücken zwischen zwei Thiolgruppen,
2. die Bildung von Esterbindungen zwischen Hydroxyl- und Carboxylgruppen und
3. die Bildung von Amidbindungen zwischen Carboxyl- und primären Aminogruppen katalysieren.

Erfindungsgemäß verwendbare Nullängen-Vernetzungsmittel umfassen ohne Beschränkung Carbodiimide, Isoxazoliniumverbindungen, Chlorformiate, Carbonyldiimidazole, N-Carbalkoxydihydrochinoline, Tetranitromethan, Kaliumnitrosyldisulfonat und Diethylpyrocarbonat. Die bevorzugten Nullängen-Vernetzungsmittel sind Carbodiimide, besonders bevorzugt 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (hierin weiter "EDAC"). Man nimmt an, dass Carbodiimide stabile Amidbindungen zwischen Lysin-Aminosäureresten und entweder Glutamin- oder Asparaginsäureresten bilden.
Das Ausmaß der Vernetzung zwischen den Proteinen des Proteinanteils des Blutplasmas kann durch Einstellen mehrerer Faktoren gesteuert werden, darunter Menge und Art des Vernetzungsmittels, Reaktionstemperatur und -zeit. Auch Konkurrenzreaktionen wie die Hydrolyse mancher Carbodiimide, die den Vernetzungsgrad beeinflussen können, können durch Einstellen von Temperatur, pH und Pufferkonzentration gesteuert werden. Im Allgemeinen wird ein molarer Überschuss des Vernetzungsmittels angewendet. Bei EDAC wird beispielsweise für die Vernetzungsreaktion bevorzugt ein siebenfacher oder höherer molarer Überschuss verwendet. Der molare Überschuss basiert auf Äquivalenten EDAC zu Äquivalenten Asparagin/Glutaminsäureresten im Proteinanteil, wobei man für die Berechnung annimmt, dass der gesamte Proteinanteil Albumin ist (tatsächlich etwa 60% Albumin). Es kann der Proteinanteil einer Blutplasmaprobe mit einem Überschuss EDAC unter Bildung eines erfindungsgemäßen vernetzten Blutplasmaprodukts umgesetzt werden, wobei ein wesentlicher Anteil der Glutamin- und Asparaginsäurereste mit Lysin vernetzt sind. Die erfindungsgemäßen mit Nulllänge vernetzten Blutplasmaproteine enthalten bevorzugt mindestens eine Amidvernetzung. Mehr bevorzugt enthalten sie mindestens eine Amidvernetzung, die eine Lysin-Glutaminsäure- oder Lysin-Asparaginsäurebindung ist. Meist bevorzugt führt ein Überschuss von Carbodiimid zu nulllängenvernetzten Blutplasmaproteinen, bei denen im Wesentlichen alle Glutaminsäure- oder Asparaginsäurereste über eine Amidbindung an Lysinreste gebunden sind. In diesem Zusammenhang wird "im wesentlichen alle" so verstanden, dass mindestens etwa 95% aller verfügbaren Lysinreste eine Amidvernetzung mit Seitenkettencarboxylgruppen gebildet haben.
Erfindungsgemäße injizierbare Materialien umfassen im allgemeinen vernetzte Blutplasmaproteine wie oben beschrieben, eine physiologisch zulässige Flüssigkeit und wahlweise ein Anästhetikum. Typischerweise umfassen die vernetzten Blutplasmaproteine von etwa 1 bis etwa 10 Gewichtsprozent des injizierbaren Materials. Mehr bevorzugt umfassen die Blutplasmaproteine von etwa 3 bis etwa 7 Gewichtsprozent des Materials und meist bevorzugt von etwa 5,5 bis etwa 6,5 Gewichtsprozent des Materials, wobei alle Prozentwerte auf dem Gewicht des trockenen Proteins beruhen.
Physiologisch zulässige Flüssigkeiten, die Träger oder Fähren für die erfindungsgemäßen injizierbaren Materialien sein können, umfassen beispielsweise physiologische Kochsalzlösung, Dextroselösungen, gepufferte Salzlösungen einschließlich phosphatgepufferter Salzlösungen, isotonische (balanced) Salzlösungen und jegliche andere inaktive injizierbare Träger. Die Inkorporierung der erfindungsgemäßen vernetzten Blutplasmaproteinmaterialien in solche physiologisch zulässige Flüssigkeiten ergibt ein injizierbares Material mit einer Viskosität, die bei Injektion als Weichgewebevermehrungsmaterial ein ästhetisch ansprechendes Aussehen und ein natürliches Gefühl ergibt. Nach der Injektion kann ein Teil der in die erfindungsgemäßen injizierbaren Materialien inkorporierten physiologisch zulässigen Flüssigkeit vom Körper absorbiert werden. Daher kann es notwendig sein, dem Patienten eine Menge injizierbaren Materials größer als das Volumen des zu heilenden Hautdefekts zu injizieren, wie unten hinsichtlich der Injektionsverfahren beschrieben. Die physiologisch zulässigen Flüssigkeiten enthalten im Allgemeinen von etwa 99 bis etwa 90 Gewichtsprozent des erfindungsgemäßen injizierbaren Materials. Bevorzugt enthalten die physiologisch zulässigen Lösungen von etwa 97 bis etwa 93 Gewichtsprozent des Materials und meist bevorzugt von etwa 94,5 bis etwa 95,5 Gewichtsprozent des Materials.
In das erfindungsgemäße injizierbare Material können Anästhetika eingeschlossen sein, um jeglichen Schmerz in Verbindung mit der Injektion des erfindungsgemäßen Materials zu mildern. Solche Anästhetika umfassen beispielsweise Lidocain, Procain, Tetracain, Prilocain, Mepivacain, Etidocain, Bupivacain und andere Amid- und Esteranästhetika. Das Anästhetikum kann im injizierbaren Material in einer Menge von bis zu etwa 2 Gewichtsprozent des Materials vorhanden sein. Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen injizierbaren Materialien ein Anästhetikum in einer Menge von etwa 0,25 bis 2 Gewichtsprozent des Materials.
Ferner können die erfindungsgemäßen injizierbaren Materialien zur Weichgewebevermehrung auch einen oder mehrere aus einer breiten Vielfalt von zusätzlichen Bestandteilen enthalten. Beispielsweise können die Materialien mit vernetzten Blutplasmaproteinen auch Vitamine, Wachstumsfaktoren, Enzyminhibitoren wie Chelatbildner, wie auch jegliche andere Zusätze enthalten, welche die Fähigkeit des Materials, der proteolytischen Spaltung zu widerstehen, steigern, oder anderweitig den Abbau des Materials inhibieren, ohne eine nachteilige Reaktion des Patienten zu verursachen. Beispiele solcher Zusätze umfassen Vitamin C, den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, EDTA (nach vollständiger Vernetzung zugesetzt), Dinatriumcalciumedetat, Desferoxaminmesylat, Penicillamin, Trientine-HCl, Dimercaptobernsteinsäure.
In bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann das Verfahren zur Herstellung injizierbarer Materialien zur Weichgewebevermehrung ferner eines oder mehrere des Folgenden umfassen: Unterziehen des vernetzten Blutplasmaproteinprodukts einer Dialyse, Autoklavieren des dialysierten Produkts, Homogenisieren des autoklavierten Proteinprodukts und Einfüllen des Proteinprodukts in eine Spritze zur Lagerung oder zum Gebrauch.
Zusätzlich ist beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung injizierbarer Materialien zur Weichgewebevermehrung bevorzugt, dass das Bereitstellen des Proteinanteils der Blutplasmaprobe die Bereitstellung einer Blutplasmaprobe und die Abtrennung des Proteinanteils umfasst. Ein bevorzugtes Trennverfahren umfasst die Fällung des Proteinanteils der Blutplasmaprobe.
In einer noch mehr bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird der Schritt der Fällung des Proteinanteils der Blutplasmaprobe durch Ansäuern der Blutplasmaprobe und Mischen der angesäuerten Blutplasmaprobe mit einem nichtwäßrigen Lösungsmittel ausgeführt. Bevorzugt wird die Blutplasmaprobe auf einen pH von angenähert 4,5 angesäuert. Zur Ausführung dieses Schritts kann eine saure Lösung zugesetzt werden. Es können Säuren wie Salz-, Schwefel-, Perchlor-, Salpeter-, Phosphor-, Essigsäure und andere verwendet werden. Die bestimmte verwendete Säure ist nicht kritisch und jeder Überschuss kann jedenfalls später durch Zusatz einer Base neutralisiert werden. Der pH wird nahe beim isoelektrischen Punkt des Serumalbumins, eines Hauptproteins im Blutplasma, eingestellt. Durch Annäherung an den isoelektrischen Punkt des Serumalbumins kann die Fällung eines größeren Anteils der Proteine erreicht werden. Das mit der angesäuerten Blutplasmaprobe gemischte nichtwäßrige Lösungsmittel kann jegliches Lösungsmittel sein, welches möglichst wenig Wasser enthält und ist bevorzugt wasserfrei. Vor der Vernetzung ist Wasser zu vermeiden, weil es die Vernetzungsmittel hydrolysieren und deren Fähigkeit zur Vernetzung vermindern kann. Bevorzugte Lösungsmittel sind wasserfreie Alkanole und besonders bevorzugt ist wegen seiner leichten Erhältlichkeit, seines Siedepunkts, seiner Dielektrizitätskonstanten und der dermatologischen Verträglichkeit wasserfreier Ethanol. Die angesäuerte Blutplasmaprobe wird bevorzugt in ein Gefäß gegeben (z.B. Becherglas, Röhrchen, Kolben usw.), welches ein nichtwäßriges Lösungsmittel enthält. Das Volumen des mit der angesäuerten Blutplasmaprobe zu mischenden nichtwäßrigen Lösungsmittels ist wegen der Verdünnung bevorzugt größer als das Volumen der angesäuerten Blutplasmaprobe, seine genaue Menge aber nicht kritisch.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst bevorzugt den Schritt des Vorheizens des nichtwäßrigen Lösungsmittels vor der Zugabe der angesäuerten Blutplasmaprobe. Erfindungsgemäß ist auch bevorzugt, dass das Verfahren ferner das Halten des nichtwäßrigen Lösungsmittels bei einer möglichst hohen Temperatur, jedoch unterhalb von dessen Siedepunkt, während der Zugabe der angesäuerten Blutplasmaprobe. Im Fall wasserfreien Ethanols ist ein Temperaturbereich von 70 bis 78°C angemessen, wobei 74°C eine bevorzugte Temperatur ist. Durch Steigerung der Fällungstemperatur der Proteine kann die resultierende Teilchengröße der gefällten Proteine vermindert werden. Kleinere Teilchengrößen erlauben die Injektion mit feineren Kanülen (kleineren Innendurchmessers). Das Blutplasmaproteingemisch aus nichtwäßrigem Lösungsmittel/angesäuerter Blutplasmaprobe/gefällten Blutplasmaproteinen kann so wie es ist mit einem Vernetzungsmittel umgesetzt werden, oder es kann ein Teil der Flüssigkeit im Gemisch beispielsweise durch Dekantieren oder Trocknen entfernt werden. Es ist nicht notwendig, an dieser Stelle das nichtwäßrige Lösungsmittel oder die Säure zu entfernen. Man braucht nur die Anwesenheit von Wasser im Gemisch zu minimieren, weil Wasser gewisse Vernetzungsmittel wie Carbodiimide hydrolysieren kann.
Das Vernetzungsmittel kann mit dem gefällten Proteinanteil in einer Menge von mindestens 0,1% Gewicht je Volumen ("w/v") gemischt werden. Es ist bevorzugt in einer Menge von mindestens 1% w/v und meist bevorzugt in einer Menge von mindestens 2% w/v vorhanden. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird EDAC in einer Menge von etwa 2,0% bis etwa 3,0% w/v zugesetzt. Die Reaktion mit dem Vernetzungsmittel wird bevorzugt bei erhöhter Temperatur im Bereich von etwa 40 bis etwa 60°C, bevorzugt bei etwa 45 bis etwa 55°C, ausgeführt. Die Vernetzung kann im Grunde über jede Zeitdauer ausgeführt werden, wobei mindestens eine Stunde bevorzugt ist. Mehr bevorzugt wird die Reaktion während einer Zeitdauer von etwa 4 bis etwa 6 Stunden ausgeführt, um die Vernetzungsreaktion so weit wie möglich vollständig zu machen. Für den Vernetzungsgrad sind sowohl Temperatur als auch Zeit und Menge des Vernetzungsmittels wichtig. Während die Temperatur bei der Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit hilft und längere Zeiten die Vervollständigung der Reaktion ermöglichen können, ist ein (molarer) Überschuss des Vernetzungsmittels ebenfalls hilfreich, insbesondere bei Carbodiimiden. Während Carbodiimide im Allgemeinen nicht in die resultierenden vernetzen Amidbindungen eingebunden sind, nimmt man an, dass sie während der Vernetzungsreaktion verändert werden (zu Harnstoffderivaten werden) und daher ihre Fähigkeit zur Vernetzung verlieren. Daher ist es vorteilhaft, einen molaren Überschuss des Carbodiimid-Vernetzungsmittels zuzusetzen, um sicherzustellen, dass im wesentlichen alle Glutamin- und Asparaginsäurereste über eine Amidbindung mit Lysinresten verbunden sind.
Nachdem die Plasmaproteine mit dem Vernetzungsmittel reagieren konnten, kann das Plasma mit einer Base wie Natriumbicarbonat oder -hydroxid neutralisiert werden. Die pH-Einstellung auf einen in etwa neutralen Wert (~7,0) vermindert im Allgemeinen eine potentielle Reizung, die durch saure Zusammensetzungen hervorgerufen werden könnte. Die Art der Base ist nicht kritisch. Zusätzlich kann eine Substanz zugegeben werden, um einen Überschuss des Vernetzungsmittels zu binden. Beispielsweise kann im Fall von EDAC Glycin, Hydroxylamin oder eine andere aminhaltige Verbindung zugesetzt werden. Auch β-Mercaptoethanol kann zur Bindung überschüssigen EDAC zugegeben werden. Es ist kein bestimmtes Mittel zur Bindung bevorzugt, jedoch wird gewöhnlich aus Bequemlichkeit Glycin benutzt. Geeignete Mittel zur Bindung stellen im Allgemeinen ungebundene reaktive Gruppen bereit, die gewöhnlich vom Vernetzungsmittel angegriffen werden, und werden daher entsprechend dem gewählten Vernetzungsmittel gewählt.
Das resultierende vernetzte Blutplasmaproteinprodukt, das in Form einer Suspension vernetzter Proteine in einem Lösungsmittelgemisch, umfassend Alkanol, Säure, Base, Bindungsmittel usw., vorliegen kann, kann einer Vielfalt von Behandlungen nach der Vernetzung, darunter Spülen, Dialyse, Autoklavieren und Homogenisieren, unterzogen werden.
Das Spülen sollte ungeachtet von nachfolgender Sterilisation und Reinigung durchgeführt werden. Es kann durch Waschen mit einem Ethanol/Wasser-Gemisch, beispielsweise 50/50, Schleudern und Dekantieren der Waschflüssigkeit ausgeführt werden. Dies kann so oft gewünscht wiederholt werden und sollte von wenigstens einem Spülschritt mit reinem Wasser abgeschlossen werden.
Bevorzugt wird das Proteinprodukt zur Reinigung einer Dialyse über einen längeren Zeitraum unterzogen. Bevorzugt wird das Produkt mindestens 8 Wochen dialysiert. Die lange Dialysezeit kann eine potentielle Reizung vermindern, die durch verbliebenes Vernetzungsmittel in mikromolarer Konzentration hervorgerufen werden könnte. Die Dialyse kann mit bekanntem Dialysegerät nach bekannten Dialyseverfahren ausgeführt werden.
Das gereinigte Produkt kann dann durch Autoklavieren sterilisiert werden. Das Autoklavieren kann mit bekanntem Gerät ausgeführt werden. Das erfindungsgemäß hergestellte Material wird bevorzugt ungefähr 45 min in einem Flüssigkeitszyklus (~140°C) autoklaviert und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.
Das Produkt kann homogenisiert werden, indem man durch fortlaufend engere Kanülen (d.h. zunehmender Gauge-Zahl) führt. Die Homogenisierung der Teilchengröße kann erreicht werden, indem man das erfindungsgemäße vernetzte Blutplasmaprodukt durch Kanülen mit fortlaufen höherer Gauge-Zahl führt. Bevorzugt wird das Produkt zum Schluss durch eine Kanüle mit hoher Gauge-Zahl, etwa 27G oder 30G (~190 μm bzw. ~150 μm Innendurchmesser), hindurchgeführt. Alternativ können automatische Verfahren mit Maschinen im Produktions- oder Labormaßstab angewendet werden, welche für die Homogenisierung und das Mahlen von Proben ausgestaltet sind.
Vernetzte Blutplasmaproteine können durch Kanülen in intradermale Abschnitte der Haut eines Patienten injiziert werden, um die Sichtbarkeit von Hautdefekten zu vermindern. Erfindungsgemäß behandelbare Hautdefekte sind Falten, Mimikfältchen (expression lines), Pockennarben, Aknenarben usw.
Wie bei jedem medizinischen Verfahren sollte die Injektion von Materialien zur Weichgewebevermehrung von erfahrenen Ärzten ausgeführt werden, die sich mit Weichgewebevermehrung auskennen.
Der zu korrigierende Defekttyp bestimmt häufig die Stärke der zu verwendenden Kanülen. Je feiner oder schmaler der Defekt, desto höher sollte die Gauge-Zahl der Kanüle sein. Das entspricht dem Bedürfnis nach weniger Material für kleinere Hautdefekte. Die Injektionsstelle sollte oberflächlich sein und ist bevorzugt ein intradermaler Abschnitt der Haut zwischen der epidermalen und der dermalen Hautschicht. Flüssigkeitsverlust, wie er gewöhnlich innerhalb der ersten 24 bis 48 h nach Injektion auftritt, kann durch Injektion von etwa 25 bis etwa 50% mehr Material als der Hautdefekt benötigt, berücksichtigt werden (d.h. Überkorrektur).
Die vorliegende Erfindung wird nun eingehender mit Bezug auf die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele veranschaulicht.
Herstellungsbeispiel 1
Ein erfindungsgemäßes injizierbares Material wurde wie folgt hergestellt: Venöses Blut wurde einem Patienten nach einem Standardverfahren mit Kanüle entnommen. Das Blut befand sich in zwei Sammelröhrchen mit einer Aufnahmekapazität von 8,5 ml mit glyzerinierten Stopfen, von denen jedes 1,5 ml einer wäßrigen Lösung mit 22 g/l Trinatriumcitrat, 8 g/l Zitronensäure und 25 g/l Dextrose enthielt. Die Sammelröhrchen enthielten kein EDTA und waren evakuierte Vacutainer^®-Probenröhrchen mit Hemogard^TM-Verschlüsseen. Diese Röhrchen sind von Becton-Dickinson oder von Händlern zu beziehen.
Die Röhrchen mit dem entnommenen Blut wurden bei Raumtemperatur 10 min mit 1500 min^–1 mit einer Sorvall RC3C-Zentrifuge in einem Schwingbecherrotor zentrifugiert (relative Zentrifugalkraft ("RCF" 654), um das Plasma vom Zellmaterial zu trennen. Mit einer sterilisierten Pipette wurden etwa 10 ml Plasma aus den Röhrchen entnommen und in ein kleines steriles Becherglas gegeben.
Zum Plasma wurden 700 μl 1 n-Salzsäure zugefügt. Die angesäuerte Lösung wurde mit der Hand geschwenkt und in eine 10 ml-Spritze gezogen. Der pH des angesäuerten Plasmas war etwa 4,5. In einer sterilen Flasche mit Deckel wurden 100 ml reinen, nicht denaturierten Ethanols und ständigem Rühren mit einem Rührstäbchen auf etwa 72°C erhitzt.
An die Spritze mit dem angesäuerten Plasma wurde eine feine Kanüle (27G) angesetzt, und das Plasma wurde unter ständigem Rühren langsam zum Ethanol gegeben. Während der Zugabe wurde die Temperatur aufrechterhalten. Die Flasche wurde dann verschlossen und Heizen und Rühren etwa 10 min fortgesetzt.
Dann wurden 2,2 g reines EDAC, entsprechend 2 Gewichtsprozent auf das Gesamtvolumen bezogen (w/v), zugesetzt. Nach Zugabe des EDAC wurde die Flasche verschlossen und bei geringerer Temperatur (ungefähr mittlere Einstellung bei den meisten Standardheizplatten) und ständigem Rühren etwa 4,5 h stehengelassen. Nach Abschalten der Wärmequelle und unter ständigem Rühren wurden 1,4 ml einer 5%-Natriumbicarbonatlösung zur Neutralisation der Salzsäure zugegeben. Auch 2 g Glycin zur Bindung des EDAC-Überschusses wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht etwa 14–16 h weitergerührt.
Der Inhalt der Flasche wurde dann in zwei 50 ml-Spitzröhrchen gegossen. Die Röhrchen wurden bei 1200 min^–1 etwa 8 min zentrifugiert. Der Überstand wurde sorgfältig dekantiert. Das zurückbleibende zentrifugierte Produkt wurde mit einer 50% Lösung von Ethanol in Wasser gespült, zentrifugiert und wieder dekantiert. Das Spülen wurde dreimal mit Milli-Q-Wasser wiederholt.
Das so erhaltene vernetzte Blutplasmaproteinprodukt wurde dann in ein Dialysegerät gegossen und 8 Wochen bei 4°C behandelt. Das Wasser wurde jeden zweiten Tag gewechselt, und als Konservierungsmittel wurde 0,1% Benzylalkohol verwendet; jedoch könnte jedes nicht-toxische antimikrobielle Konservierungsmittel benutzt werden. Das Material wurde dann 45 min im Flüssigkeitszyklus autoklaviert und abkühlen gelassen. Der Inhalt wurde in ein 50 ml-Spitzröhrchen übertragen und wiederum bei 1200 min^–1 etwa 10 min zentrifugiert und der Überstand dekantiert, wobei sich etwa 10 ml vernetzte Blutplasmaproteine ergaben.
40 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit pH 7,4 und 0,5 ml einer sterilen 50%-Vorratslösung von Lidocain- HCl (um eine Endkonzentration von 0,5% zu ergeben) wurden mit dem Produkt gemischt und schnell gemischt. Der Inhalt wurde wieder bei 1200 min^–1 etwa 10 min zentrifugiert und der Überstand sorgfältig dekantiert. Man ließ etwa 1 ml Lidocain/phosphatgepufferte Salzlösung im Röhrchen zurück, um die nachfolgende Homogenisierung zu erleichtern.
Das zentrifugierte Produkt wurde in eine sterile 10 ml-Spritze gefüllt und eine Kanüle niedriger Gauge-Zahl (19G) angesetzt. Das Produkt wurde in den Zylinder einer anderen sterilen 10 ml-Spritze injiziert, an die eine Kanüle mit höherer Gauge-Zahl (23G) angesetzt wurde. Dann wurde das Produkt in den Zylinder der ersten Spritze injiziert und die 19G-Kanüle gegen eine 25G-Kanüle ausgetauscht und das Produkt wieder in die zweite Spritze wie zuvor injiziert. Mit dem Spritzenkolben wurde eingefangene Luft entfernt und das Produkt wurde in 1 ml-Spritzen abgefüllt, verschlossen, etikettiert und bei 4°C gelagert.
Herstellungsbeispiel 2
Es wurde ein injizierbares Material zur Weichgewebevermehrung nach Beispiel 1 hergestellt, jedoch wurden 1,1 g reines EDAC, entsprechend 1% EDAC w/v, zugesetzt.
Herstellungsbeispiel 3
Es wurde ein injizierbares Material zur Weichgewebevermehrung nach Beispiel 1 hergestellt, jedoch wurden 0,11 g reines EDAC, entsprechend 0,1% EDAC w/v, zugesetzt.
Herstellungsbeispiel 4
Es wurde ein injizierbares Material zur Weichgewebevermehrung nach Beispiel 1 hergestellt, jedoch wurden 4,4 g reines EDAC, entsprechend 4% EDAC w/v, zugesetzt.
Herstellungsbeispiel 5
Es wurde ein injizierbares Material zur Weichgewebevermehrung nach Beispiel 1 hergestellt, jedoch wurden 5,5 g reines EDAC, entsprechend 5% EDAC w/v, zugesetzt.
Herstellungsvergleichsbeispiel 1
Unter Verwendung von autologem Blutplasma, das in einem normalen, EDTA enthaltenden Gefäß gesammelt worden war, wurde ein injizierbares Material zur Weichgewebevermehrung hergestellt. Vitamin C (0,2% Natriumascorbat) wurde zum Blutplasma zugefügt. Das Plasma wurde dann in 1 ml-Spritzen 5 min bei 70°C in einem heißen Wasserbad und 2 min bei 95°C wärmegeliert. Dann ließ man die Spritzen auf Raumtemperatur abkühlen. Es wurde keine Vernetzung ausgeführt.
Anwendungsbeispiel 1
Mehrere haarlose Mäuse erhielten Injektionen des im Herstellungsbeispiel 1 erzeugten Materials zur Weichgewebevermehrung. Jede haarlose Maus wurde durch Inhalation von Metofane^TM-Anästhetikum (erhältlich von Schering-Plough Corp., Union, New Jersey) leicht anästhesiert. Dann erhielt jede Maus vier bis sechs intradermal-subkutane Injektionen mit 27G-Kanülen. Das Volumen je Injektionsstelle war etwa 0,1 ml.
Jede Injektionsstelle wurde in wöchentlichen bis monatlichen Intervallen auf Zeichen einer Reizung (Erythem, Ulzeration usw.) untersucht und mit einer Note auf Basis der visuellen Untersuchung versehen. Dem ursprünglichen Injektionsvolumen wurde die Note 4 zugeordnet. Abnehmende Erscheinungsgrade erhielten Werte von 3, 2, 1 und 0. Die Durchführung der Prüfung mit haarlosen Mäusen ermöglicht eine leichte Untersuchung der Injektionsstellen. Am Ende zeigten zwei Injektionsstellen Erythem und Ulzeration. Die Ergebnisse der Prüfung sind in Tabelle I unten aufgeführt und in 1 und 2 graphisch veranschaulicht.
Anwendungsvergleichsbeispiel 1
Eine getrennte Gruppe mehrerer haarloser Mäuse erhielt Injektionen (insgesamt 192 Injektionen) nach Herstellungsbeispiel 3, außer dass das Material des Herstellungsvergleichsbeispiels 1 verwendet wurde. Am Ende zeigten acht Injektionsstellen Erythem und Ulzeration. Die Ergebnisse der Prüfung sind in Tabelle I unten aufgeführt und in 1 graphisch veranschaulicht.
Anwendungsvergleichsbeispiel 2
Eine getrennte Gruppe mehrerer haarloser Mäuse erhielt Injektionen (insgesamt 9 Injektionen) nach Anwendungsbeispiel 1, außer dass ein injizierbares Rinderkollagenmaterial verwendet wurde, das als Zyderm^®-Kollagen durch Collagen Corp., Palo Alto, Kalifornien, vermarktet wird. Das Material zeigte eine fortschreitende Abnahme des Volumens über 550 Tage. Nach dem natürlichen Tod der Mäuse war das Material in der Autopsie nicht sichtbar. Die Ergebnisse der Prüfung sind in Tabelle I unten aufgeführt und in 2 graphisch veranschaulicht.
Anwendungsvergleichsbeispiel 3
Eine getrennte Gruppe mehrerer haarloser Mäuse erhielt Injektionen (insgesamt 9 Injektionen) nach Anwendungsbeispiel 1, außer dass ein injizierbares glutaraldehydvernetztes Rinderkollagenmaterial verwendet wurde, das als Zyplast^®-Kollagen durch Collagen Corp., Palo Alto, Kalifornien, vermarktet wird. Auch dieses Material zeigte eine fortschreitende Abnahme des Volumens über 550 Tage. Nach dem natürlichen Tod der Mäuse war das Material in der Autopsie auch nicht sichtbar. Nach etwa einem Jahr zeigten zwei der neun Injektionsstellen Anzeichen für eine Entzündung mit geringfügigem Erythem. Die Ergebnisse der Prüfung sind in Tabelle I unten aufgeführt und in 2 graphisch veranschaulicht.
Tabelle I
Analysebeispiel 1
Die quantitative Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Vernetzung hinsichtlich der Steigerung der Widerstandsfähigkeit des Materials gegen proteolytischen Angriff wurde durch die in vitro-Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Proteinase gemessen. Zu den Proteinasen, für die der Proteolysewiderstand gemessen wurde, gehörten Trypsin, Proteinase K, Papain, Pronase E, Pepsin, Cathespin G und Leucinaminopeptidase. Der in diesem Beispiel angewendete in vitro-Empfindlichkeitstest wurde aus der Bestimmung freier Amine nach Udenfriend et al., "Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins, and Primary Amines in the Picomole Range", Science 178, 871–872 (November 1972) entwickelt, dessen gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.
In jedes von 7 Reagenzgläsern (6 × 50 mm) wurden 250 mg des nach Herstellungsbeispiel 1 erzeugten Materials injiziert. Dann wurden je 250 μl einer Proteinase (in jedem Glas eine andere) mit der nach der vom Hersteller angegebenen Enzymaktivität angemessenen Konzentration in die Reagenzgläser gegeben. Die Gläser wurden dann 10 min bei 1000 g zentrifugiert und bei 37°C inkubiert. Nach 30 min wurden je 150 μl des Überstands (alternativ 10 μl verdünnt mit 140 μl Pufferlösung) in ein 1,5 ml-Eppendorf-Zentrifugenröhrchen überführt. Die Proteine in jedem 1,5 ml-Röhrchen wurden mit 38 μl 100% Trichloressigsäure ("TCA") während 10 min unter Eiskühlung gefällt. Die Röhrchen wurden dann in einer Eppendorf Modell 5415C-Mikrozentrifuge 10 min bei 12000 g zentrifugiert. 150 μl jedes resultierenden Überstands wurden in ein Kulturglas überführt und mit 1,49 ml 0,2 m-Borsäure kombiniert, was zu einem End-pH von etwa 9 führte. Nach dem Mischen wurden je 0,5 ml Fluorescamin (0,015% in Azeton von HPLC-Reinheit) zugesetzt und die Röhrchen 10 s kräftig schnellgerührt.
Dann wurde mit einem Foci Fluorometer (erhalten von Optical Technology Devices Inc., Elmsford, NY) mit Filtern entsprechend 390 nm Anregung und 475 nm Emission die Fluoreszenz gemessen. Leerproben ohne Protein sowie jede der Proben wurden dreifach gemessen. Zwischen der Glycinkonzentration und der Fluoreszenz besteht eine lineare Beziehung, die es ermöglicht, auf der Basis von Vergleichen zur Eichkurve für bekannte Glycinkonzentrationen die Enzymaktivitäten zu berechnen.
Alle geprüften Proteinasen hatten wesentlich verminderte Spaltungsaktivitäten, wie durch die verminderte Menge des vorhandenen freien Amins bewiesen wurde. Die Ergebnisse der Bestimmung des freien Amins in diesem Beispiel sind in Tabelle II aufgeführt. Wie man an den Daten sieht, bewirkt die Vernetzung der Blutplasmaproteine eine wesentliche Verminderung der proteolytischen Spaltung.
Analysebeispiel 2
Das im Herstellungsbeispiel 2 erzeugte Material wurde der Prüfung der in vitro-Empfindlichkeit nach dem Analysebeispiel 1 unterzogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt. Wie man an diesen Daten sieht, hat das nach dem Herstellungsbeispiel 2 erzeugte Material, das mehr Vernetzungsmittel zum Erreichen eines höheren Vernetzungsgrads benutzte, eine noch geringere Empfindlichkeit gegenüber proteolytischer Spaltung.
Analysevergleichsbeispiel 1
Das im Herstellungsvergleichsbeispiel 1 erzeugte Material wurde der Prüfung der in vitro-Empfindlichkeit nach dem Analysebeispiel 1 unterzogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt. Wie man an den Daten sieht, hat das nach dem Herstellungsvergleichsbeispiel 1 erzeugte Material wesentlich geringere Widerstandsfähigkeit gegen proteolytische Spaltung.
Tabelle II
Analysebeispiel 3
Mehrere haarlose Mäuse erhielten Injektionen nach dem Anwendungsbeispiel 1, wobei das nach Herstellungsbeispiel 1 erzeugte injizierbare Material verwendet wurde. 24 h, 72 h, 7 d, 14 d, 30 d, 6 m und 18 m nach der Injektion wurden die Mäuse durch CO₂-Inhalation getötet und die Injektionsstellen einschließlich der umgebenden Haut und des darunter liegenden Gewebes entfernt. Die entfernten Injektionsstellen wurden in gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und in 5 μm-Schnitte geschnitten. Jeder Schnitt wurde mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt und bei 60- und 100-facher Vergrößerung untersucht. Die nach 24 und 72 h nach der Injektion (p.i.) entfernten Injektionsstellen zeigten die erwarteten geringfügigen Entzündungen. Die nach 7 d, 14 d und 30 d p.i. entfernten Injektionsstellen zeigten die Bildung einer fibrösen Schicht um das injizierte Material. Die nach 6 m und 18 m p.i. entfernten Injektionsstellen zeigten keine Entzündung in der Nähe des injizierten Materials.

Claims

Injizierbares Material zur Vermehrung von Weichgewebe von Säugetieren, enthaltend vernetzte Blutplasmaproteine, wobei die Vernetzungen mindestens eine intermolekulare Amidbindung umfassen.
Material nach Anspruch 1, wobei die Vernetzungen Nulllängenvernetzungen sind.
Material nach Anspruch 1, wobei mindestens eine Amidbindung aus einer Lysin-Glutamat-Amidbindung und einer Lysin-Aspartat-Amidbindung ausgewählt ist.
Material nach Anspruch 1, wobei die vernetzten Blutplasmaproteine in einer Menge von etwa 1% bis etwa 10%, bezogen auf das Gesamtgewicht des injizierbaren Materials, vorhanden sind.
Material nach Anspruch 1, ferner eine physiologisch akzeptable Flüssigkeit umfassend.
Material nach Anspruch 1, wobei die physiologisch akzeptable Flüssigkeit in einer Menge von etwa 99% bis etwa 90%, bezogen auf das Gewicht des injizierbaren Materials, vorhanden ist.
Material nach Anspruch 1, ferner einen Bestandteil umfassend, der aus der aus anästhetischen Verbindungen, Vitaminen, Wachstumsfaktoren und Enzyminhibitoren bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Materials zur Vermehrung von Weichgewebe bei Säugetieren, umfassend die Bildung von intermolekularen Vernetzungen zwischen und unter den Blutplasmaproteinen.
Verfahren nach Anspruch 8, umfassend die Schritte: a) Fällen eines Proteinanteils aus einer Blutplasmaprobe, b) Bildung intermolekularer Vernetzungen zwischen und unter den Blutplasmaproteinen des Proteinanteils, wobei die Vernetzungen mindestens eine Amidbindung umfassen.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Schritt a) das Ansäuern der Blutplasmaprobe und das Mischen der angesäuerten Blutplasmaprobe mit einem nichtwässrigen Lösungsmittel umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Blutplasmaprobe auf einen pH-Wert von etwa 4,5 angesäuert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das nichtwässrige Lösungsmittel ein wasserfreies Alkanol ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei Schritt b) die Bildung von Vernetzungen unter Verwendung eines Mittels für Nulllängenvernetzungen ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Mittel für Nulllängenvernetzungen aus der aus Carbodiimiden, Isoxazoliniumverbindungen, Chlorformiaten, Cabonyldiimidazolen, N-Carbalkoxydihydrochinolinen, Tetranitromethan, Kaliumnitrosyldisulfonat und Diethylpyrocarbonat bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Mittel für Nulllängenvernetzungen 1-Ethyl-3-(3-dimethylanilinopropyl)carbodiimid umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Schritt b) das Mischen des Mittels für Nulllängenvernetzungen mit dem Proteinanteil in einer Menge von mindestens 0,1 Volumenprozent des Proteinanteils umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 9, ferner den nachfolgenden Schritt der Dialyse des vernetzten Blutplasmaproteins umfassend.
Verfahren nach Anspruch 9, ferner den nachfolgenden Schritt der Autoklavierung des vernetzten Blutplasmaproteins umfassend.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das injizierbare Material für die Behandlung eines einzelnen Säugetiers bestimmt und die Blutplasmaproteine für dieses Säugetier autolog sind.