DE69009748T2

DE69009748T2 - Fgf enthaltende stabilisierte zubereitungen.

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Publication number: DE69009748T2
Application number: DE69009748T
Authority: DE
Inventors: Denis Barritault; Jean-Pierre Caruelle; Jose Courty; Jacqueline Jozefonvicz; Faouzi Slaoui; Michele Tardieu
Original assignee: Therapeutiques Subtitutives Groupement dInteret Public
Current assignee: Therapeutiques Subtitutives Groupement dInteret Public
Priority date: 1989-03-09
Filing date: 1990-03-09
Publication date: 1994-09-22
Anticipated expiration: 2010-03-10
Also published as: JP3236916B2; WO1990010456A1; CA2048638A1; JPH04505756A; EP0462194A1; ES2057544T3; CA2048638C; EP0462194B1; AU5283890A; DK0462194T3; ATE106743T1; FR2644066A1; FR2644066B1; DE69009748D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel mit zell- und gewebsregenerierender Wirkung, die aus Dextranen gebildet sind, und stabilisierte die genannten Mittel in Verbindung mit Wachstumsfaktoren von Fibroblasten (FGFs) enthaltende Präparate sowie ihre Anwendungen in vitro, wie Lagerung der FGFs und der Zellkulturen, und in vivo als therapeutisches Mittel, insbesondere bei der Narbenbildung und bei der Gewebsregeneration sowie als kosmetisches Mittel.
Die Wachstumsfaktoren der Fibroblasten (FGFs) sind durch zahlreiche Arbeitskreise infolge der Untersuchungen der biologischen Aktivitäten der Wachstumsfaktoren, die aus Extrakten einer großen Anzahl von Geweben oder Organen (Gehirn, Hypophyse, Retina, Glaskörperflüssigkeit, Aderhaut, Iris, Knorpel, Niere, Leber, Placenta, Corpus Luteum, Prostata, Knochen, Muskel usw. . ..) erhalten wurden, nachgewiesen werden.
Die Verschiedenartigkeit selbst der untersuchten Gewebe und der durch diese Faktoren in vitro und in vivo stimulierten Zellen sowie die große Zahl der Arbeitskreise, die unabhängig voneinander zu der vollständigen Charakterisierung, Isolierung und Identifizierung dieser Faktoren beigetragen haben, erklärt die Vielzahl der Namen und Abkürzungen, die ihnen von verschiedenen Autoren zur Bezeichnung gegeben wurden.
Es scheint, daß alle diese Extrakte Wachstumsfaktoren aus der Familie der FGFs enthalten und daß diese Familie in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden kann.
Die erste Gruppe ist unter den Namen basischer FGF, basischer Wachstumsfaktor der Fibroblasten oder vom Typ 2 mit Heparinaffinität oder "Heparin Binding Growth Factor II" (HBGF II), aus dem Gehirn stammender Wachstumsfaktor oder Brain-Derived-Growth-Factor (BDGF), aus dem Auge stammender Wachstumsfaktor oder Eye-Derived Growth Factor II (EDGF II), Wachstumsfaktor der Astrocyten II oder AGF II, aus Knorpel stammender Wachstumsfaktor (CDGF) usw. ... beschrieben worden, während die zweite Gruppe der FGF-Familie unter den Namen saurer FGF oder Faktor vom Typ II mit Affinität für Heparin (HBGF I), aus dem Gehirnstammender Faktor oder BDGF I, usw. beschrieben worden sind.
Diese Faktoren wurden entweder nach dem Typ der verwendeten Zielzellen (Wachstumsfaktoren der Fibroblasten, Astrocyten oder Endothelzellen mit den Abkürzungen FGF, AGF, ECGF) oder nach der Quelle, aus der dieser Faktor extrahiert wird (z.B.: aus dem Gehirn, der Retina oder den Augen, den Knorpeln, kultivierten Hepatocyten stammende Wachstumsfaktoren mit den entsprechenden Abkürzungen BDGF, RDGF, EDGF, CDGF, HDGF ...) oder nach einer biochemischen oder biologischen Eigenschaft bezeichnet (Wachstumsfaktoren mit Affinität für Heparin (HBGF) oder angiogener Tumorfaktor (TAF)); die beiden Hauptgruppen der Familie werden mit diesen Abkürzungen, denen die Wörter sauer, basisch oder Typ I oder Typ II folgen oder vorausgehen, bezeichnet.
Indem die biologische Aktivität auf kultivierten Zellen verfolgt wurde, konnten diese Faktoren gereinigt werden. Die ersten physiko-chemischen Eigenschaften (Molekulargewicht und isoelektrischer Punkt) wurden bereits 1975 für die basische Form (GOSPODAROWICZ, J. Biol. Chem. 250, 2515) und für die saure Form 1982 (BARRITAULT et al., J. Neurosci. 8, 477-490) veröffentlicht.
Die Reinigung bis zur Homogenität der beiden FGF-Formen gestattete es, ihre Primärstrukturen aufzuklären (ESCH. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. US, 82, 6507 für die basische Form und GIMENEZ G. et al., 1985, Science, 230, 1385-1388 für die saure Form).
Die Isolierung der beiden Formen ist sehr stark durch den Nachweis einer hohen Affinität dieser Faktoren für das Heparin und die sich daraus ergebende Anwendung einer Affinitätschromatographie auf immobilisiertem Heparin begünstigt worden (SHING et al., 1984, Science, 223, 1296-1299).
Es ist bekannt, daß die FGFs in vitro in der Lage sind, die Proliferation und die Differenzierung einer großen Zahl von Zellen, die von Geweben und von verschiedenen Arten stammen, zu stimulieren.
Man kann insbesondere die Fibroblastenzellen, die Endothelialzellen, die Epithelzellen, die Keratinzellen, die Chondrocyten, Myoblasten, Astrocyten usw. sowie das Weiterwachsen der Neuronen anführen.
Es ist auch bekannt, daß die FGFs in vivo neurotroph, angiogene und narbenbildende Eigenschaften besitzen.
Insbesondere kann das französische Patent 79 18282 angeführt werden, das ein Verfahren zur Stimulierung des Wachstums der Epidermiszellen beschreibt. Dieses Verfahren zeigt insbesondere die Rolle eines wäßrigen Retinaextrakts, der teilweise gereinigt worden ist und FGF enthält, für die Stimulierung der genannten Epidermiszellen.
Des weiteren ist die amerikanische Patentschrift US-A-4 477 435 bekannt, die ein Verfahren zur Vernarbung des cornealen Epithels mit Hilfe eines einen wäßrigen Retinaextrakt enthaltenden Präparats beschreibt.
Es sind auch zahlreiche Arbeiten bekannt, die den Nachweis und die Charakterisierung der FGFs und ihre Rolle bei der Regenerierung und der Narbenbildung der Haut, der Gefäße, der Nerven, der Knochen, der Muskeln usw. sowohl in vitro als auch in vivo betreffen.
Insbesondere kann die amerikanische Patentschrift US-A-4 444 760 erwähnt werden, die einen sauren, aus dem Gehirn stammenden Wachstumsfaktor, das Verfahren zu seiner Extraktion und seine Verwendung für die Vernarbung von Wunden beschreibt und die europäische Patentanmeldung EP- A-186 084 erwähnt werden, die ein Verfahren zur Stimulierung des Wachstums von vaskulären Endothelzellen mit Hilfe eines dem sauren aus dem Gehirn stammenden vorher beschriebenen Wachstumsfaktor enthaltenden Präparats beschreibt.
Die oben beschriebenen FGFs werden durch Reinigung erhalten. Aus der PCT-Anmeldung U.S. 86/01879 sind übrigens FGFs bekannt, die durch genetische Rekombination erhalten wurden.
Ein weiteres narbenbildendes Präparat auf der Basis mindestens eines FGFs wird in der europäischen Patentanmeldung EP-A-243 179 beschrieben, und umfaßt zusätzlich Collagen und Heparin und/oder ein Glycoaminoglycan.
In diesen verschiedenen Dokumenten wird die topische Anwendung des FGFs allein oder mit zusätzlichen Wirkstoffen mit Hilfe von üblichen Formulierungen, wie Cremen, Pasten, Lösungen, Gelen oder in Verbindung mit polymeren Schwämmen und Pumpen, die eine langsame Freisetzung der FGFs gestatten, durchgeführt, wie das insbesondere in der PCT-Anmeldung U.S. 86/01879 beschrieben ist, in der näher ausgeführt wird, daß Formulierungen, die rekombinante FGFs und Exzipientien oder geeignete Transportmoleküle enthalten wie hergestellt werden können, insbesondere Lotionen, Gele, Retard-Formen oder Cremen , wobei die genannten Formulierungen gegebenenfalls mit anderen Wirkstoffen, wie Antibiotika, versetzt sein können. Die in dieser Anmeldung beschriebenen Retard-Formen enthalten insbesondere Polymere.
Die erhaltenen Präparate können insbesondere als Mittel zur Vernarbung, zur Kontrolle der Coagulation, zur Behebung neurologischer Schäden und zur Regeneration von harten Geweben eingesetzt werden.
Es scheint dennoch, daß der FGF nicht systematisch eine Stimulierung der Narbenbildung zeigt. Es ist insbesondere in J. Dermatol. Sing. Oncol. beschrieben worden, daß keine Stimulierung erfolgte. Daher muß die topische Anwendung des sauren oder basischen FGFs oftmals wiederholt erfolgen, damit die maximalen Wirkungen erzielt werden, obwohl gewisse, im Stand der Technik bekannte Präparate, wie Polyvinylalkohol-Schwämme, die mit FGFs getränkt sind, und unter der Haut eingesetzt werden, eine Fibroblasten- und Myoblastenproliferation bewirken.
Das liegt an einer thermischen Instabilität des Moleküls, an einer mit dem pH-Wert verbundenen Inaktivierung des Moleküls und an einer Proteolyse durch Enzyme, sowie an einer Wechselwirkung zwischen den FGFs und den Glycoaminoglycanen, wie das Heparansulfat oder das Proteoheparansulfat der Zellmembranen oder Basalmembranen, was eine Immobilisierung der FGFs mit sich bringt, was ihren Zugang zu den Zellrezeptoren verhindern kann.
Solche Nachteile begrenzen die Möglichkeiten der Lagerung und der Anwendung der FGFs.
Zur Überwindung dieses Nachteils ist in der europäischen Patentanmeldung 267 015 ein Präparat vorgeschlagen worden, das einen Polypeptid- Wachstumsfaktor, insbesondere EGF, und eine für die Stabilisierung des genannten Faktors gegenüber dem Verlust der biologischen Aktivität, insbesondere in Gegenwart von Wasser, eine ausreichende Menge eines in Wasser löslichen Polysaccharids enthält. In dieser Anmeldung wird näher ausgeführt, daß die in Wasser löslichen Polysaccharide, die verwendet werden können, Cellulosederivate, Amidon, Agar, Alginsäure, Gummi arabicum, Dextrane, Fructane, Inulin, Mannane, Xylane, Arabinane, Chitosane, Glycogen und Glucane einschließen.
In ihrer Arbeit über die Dextrane haben die Erfinder neue Eigenschaften von substituierten funktionalisierten Dextranen nachgewiesen. Es hat sich gezeigt, daß die genannten Dextrane eine charakteristische zell- und gewebsregenerierende Aktivität aufweisen und außerdem nicht nur eine stabilisierende Wirkung auf ein FGF-Präparat ausüben, sondern auch zusammen mit dem FGF bei dessen biologischer Aktivität mitwirken.
Die Anmelderin hat sich deshalb die Aufgabe gestellt, ein Mittel mit zell- und gewebsregenerierender Aktivität und das genannte Mittel zusammen mit FGFs enthaltende Präparate bereitzustellen, die auf denselben Zweck gerichtet den Erfordernissen der Praxis besser entsprechen, als die Präparate des Stands der Technik, insbesondere dahingehend, daß die erfindungsgemäßen Präparate eine deutlich verbesserte Stabilität besitzen, eine leichtere Lagerung gestatten und deshalb eine den Präparaten des Stands der Technik überlegene therapeutische Wirkung besitzen und dahingehend, daß ihre Anwendungshäufigkeit somit deutlich herabgesetzt wird.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung mindestens eines substituierten, durch die funktionellen Gruppen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carboxymethyl, Benzylamid und Benzylamidsulfonat, funktionalisierten Dextrans zur Herstellung eines Arzneimittels für die therapeutische Wirkung einer Zell- und Gewebsregeneration.
Gemäß dieser Verwendung werden die substituierten funktionalisierten Dextrane aus der Gruppe, die lösliche Dextrane und unlösliche Dextrane umfaßt, ausgewählt.
Unter löslichen substituierten funktionalisierten Dextranen werden solche verstanden, die insbesondere in dem französischen Patent FR-A-2 555 589 oder in dem französischen Patent FR-A-2 461 724 beschrieben sind, verstanden.
Unter unlöslichen, substituierten Dextranen werden solche verstanden, die insbesondere in der französischen Patentanmeldung Nr. 82 01641 (FR-A-2 555 589) oder in dem französischen Patent Nr. 2 461 724 beschrieben sind.
Solche Dextrane sind stabil und verlieren ihre Eigenschaften mit der Zeit nicht.
Außerdem besitzen sie die unerwartete Eigenschaft, in schwachen Dosen eine charakteristische zell- und gewebsregenerierende Wirkung und insbesondere eine narbenbildende Wirkung zu zeigen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein stabilisiertes Präparat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein wie oben definiertes Mittel mit zell- und gewebsregenerierender Wirkung zusammen mit mindestens einem sauren FGF und/oder einem basischen FGF und/oder einem Derivat und/oder einem Analogon und/oder einem Fragment davon, das eine biologische Aktivität aufweist, umfaßt, wobei dieses Mittel gleichzeitig in der Lage ist, die biologische Aktivität von sauren und/oder basischen FGF-Faktor(en), die durch eine Lagerung von langer Dauer oder durch die Temperatur inaktiviert worden sind, teilweise oder ganz wiederherzustellen und mit dem FGF in dessen biologischer Aktivität zusammenzuwirken.
Ein solches Präparat weist im Vergleich zu den Präparaten des Stands der Technik eine erhöhte zell- und gewebsregenerierende Aktivität und insbesondere eine erhöhte narbenbildende Wirkung auf.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Präparats enthält dieses 0,1 bis 1000 ug/ml mindestens eines wie oben definierten zell- und gewebsregenerierenden Mittels und 0,01 ng/ml bis 300 ug/ml mindestens eines FGFs, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus sauren FGFs, basischen FGFs, ihren Derivaten, ihren Analoga und ihren eine biologische Aktivität aufweisenden Fragmenten.
Erfindungsgemäß können die stabilisierten Präparate, die das Mittel mit zell- und gewebsregenerierender Aktivität allein oder in Verbindung mit mindestens einem FGF enthalten, mit anderen Wirkstoffen und/oder mindestens einem pharmazeutisch annehmbarem Vehikel und/oder einem physiologisch annehmbarem Träger verbunden werden.
Die zusätzlichen Wirkstoffe sind aus der Gruppe, die insbesondere Lokalanästhetika, infektionsverhindernde Mittel, Serumproteine und Collagen umfaßt, ausgewählt.
Als Lokalanästhetika können insbesondere Lidocain, als bakteriostatische Substanzen Natriumsalze, Silbersalze, ihre Derivate oder Sulfadiazine angeführt werden. Als Antibiotika kann Streptomycin genannt werden. Als Serumprotein kann Serumalbumin oder Fibronectin genannt werden; es können auch lösliche Collagene und Elastin angeführt werden.
Wenn das Vehikel Wasser ist, enthält das genannte Präparat erfindungsgemäß zusätzlich Puffer und/oder geeignete Salze, um die Mischung in etwa bei einem pH zwischen 6,8 und 7,4 und einer Ionenstärke zwischen beispielsweise 0,1 und 0,2, ausgedrückt als NaCl-Äquivalent, zu halten.
Solche erfindungsgemäßen Kombinationen werden im weiteren als "Stammpräparat" bezeichnet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des genannten Präparats wird dieses mit Liposomen kombiniert.
Solche erfindungsgemäßen Präparate werden im weiteren als Liposom- funktionalisiertes Dextran-FGF-Präparat und Liposom-funktionalisiertes Dextran-Präparat bezeichnet.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des genannten Präparats ist der Träger aus der Gruppe, die insbesondere Verbandsmaterial und Biomaterialien umfaßt, ausgewählt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Präparats liegt dieses in Form eines Aerosols vor, wenn das Vehikel ein geeignetes Gas ist.
Das "Stammpräparat" wird vorteilhafterweise direkt als Lösung oder als Aersol angewendet.
Erfindungsgemäß ist das genannte Präparat, insbesondere das genannte "Stammpräparat" in eine galenische Form, wie eine Salbe, Creme, Paste, Lotion, eingeschlossen oder tränkt ein Gel, insbesondere ein Collagengel.
Das genannte Präparat, insbesondere das genannte "Stammpräparat" ist erfindungsgemäß in einen geeigneten Träger, wie Verbandsmaterial oder Biomaterial, das die Zellreparatur direkt oder indirekt begünstigt (z.B. ein chirurgischer Nähfaden oder Korallenmaterial für die Knochentransplantation) eingeschlossen oder tränkt ihn.
Das genannte "Stammpräparat" kann insbesondere für Anwendungen auf der Haut in herkömmliche verwendete Cremes oder Lotionen eingeschlossen sein, insbesondere in Cremes auf Lanolinbasis, wie "SILVEADENE", "MARIO", "AQUAPHOR", "EQUALIA", es kann auch in Verbandsmaterialien, wie Verbandsmaterialien aus Textilien, synthetischen Geweben oder Schwämmen bzw. Tupfern oder in Naturprodukten, die zur Wundabdeckung dienen, z.B. Collagengele oder Lederhäute tierischen Ursprungs, eingeschlossen sein oder diese tränken.
Das erfindungsgemäße "Stammpräparat" muß diese verschiedenen Arten von Verbandsstoffen in der Weise tränken, daß der FGF-Faktor und/oder das substituierte funktionalisierte Dextran mit den Zielgeweben in Kontakt stehen oder dorthin diffundieren können.
Das erfindungsgemäße Präparat wird insbesondere an dem Ort der Wunde und auf den offenen Wunden in der Weise gehalten, daß die Hydratation gemäß den fachmännischen, insbesondere auf dem Gebiet der Hauttransplantationen ausgearbeiteten Techniken aufrechterhalten wird.
Okklusive Verbände können in der gleichen Weise getränkt oder adsorbiert werden, oder einen natürlichen oder synthetischen Träger bedecken.
Für Anwendungen auf der Hornhaut muß das Vehikel mit der Augenverträglichkeit der Salzlösungen (z.B. das unter dem Namen "LACRIBULE" vertriebene Produkt), der isotonischen Lösungen (z.B. "NEOCADRON" (Merck-Sharp- Dohme) kompatibel sein.
Diese Vehikel können auch Konservierungsmittel, wie Benzyldimethylalkylammoniumchloride oder Natriumethylendiamintetraacetat (EDTA) enthalten.
Erfindungsgemäß wird das Liposom/funktionalisiertes Dextran/FGF- Präparat oder das Liposom/funktionalisiertes Dextran-Präparat in eine galenische Form, wie eine Salbe, Creme, Paste, Lotion, eingeschlossen oder tränkt ein Gel, insbesondere ein Collagengel.
Im Fall von unlöslichen funktionalisierten Dextranen können diese auch einzeln oder zusammen mit dem FGF in Träger, wie Cremes, Gelatinen oder Collagengelen, oder auf synthetischen oder natürlichen Fasern oder üblichen Verbandsmaterialien zur Wundabdeckung enthalten bzw. eingeschlossen sein. Der Einschluß von unlöslichen funktionalisierten Polymeren kann durch Zugabe von Collagenlösung und durch Gelbildung erfolgen. Die in einer Reihe von Patenten von YANNAS beschriebenen Verfahren können eingesetzt werden. In diesen Patentschriften (US-A-4 060 081) wird ein laminares Verbundpräparat beschrieben, das eine äquivalente Haut ergibt, in der der mit der Wunde in Kontakt stehende Teil durch mit einem Glycosaminoglycan vernetzten Collogen bedeckt ist, wobei die Mischung durch Zugabe von Glycosaminoglycanen zu solubulisiertem Collagen erhalten und das Ganze ausgefällt oder durch Glutaraldehyd vernetzt worden ist (US-A-4 418 691).
Das erfindungsgemäße Präparat wird insbesondere durch Vermischen mindestens eines geeigneten FGFs mit mindestens einem Mittel mit regenerierender und stabilisierender Wirkung hergestellt.
Die genannten FGFs werden durch Extraktion und Reinigung, aus natürlichen Quellen, durch chemische Synthese oder auch durch geeignete Verfahren genetischer Kombination erhalten.
Die genannten FGFs sind menschlichen Ursprungs oder stammen aus anderen Tieren, insbesondere anderen Säugetieren.
Zahlreiche Reinigungsverfahren zur Extraktion und Isolierung der beiden FGF-Formen, ausgehend von natürlichen Quellen (Retina, Gehirn, Hypophyse, Placenta, Niere usw. ...) sind im Stand der Technik beschrieben.
Die bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung sind die in Biochimie, 1986 (COURTY et al.) beschriebenen oder das in der französischen Patentanmeldung 2 613 936 beschriebene, bei dem die Affinitätschromatographie auf substituierten biospezifischen Polystyrolen eingesetzt wird.
Diese bevorzugten Verfahren schließen eine Stufe der Behandlung des Gewebeextrakts bei sehr saurem pH, was somit jedwedes Risiko einer Kontamination durch Viren ausschließt, und des Einsatzes einer Chromatographie auf immobilisiertem Heparin oder substituiertem Polystyrol ein.
Die beiden FGF-Formen können somit zusammen mit den anderen Proteinen oder einzeln mit einem Reinheitsgrad, der eine hinreichende Freiheit von signifikanten Mengen anderer verunreinigender Materialien gewährleistet, isoliert und abgetrennt werden.
Zusätzlich zu den vorausgehenden Ausführungsformen umfaßt die Erfindung noch andere Ausführungsformen, die aus der nachfolgenden Beschreibung hervorgehen, die sich auf Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie auf Beispiele bezieht, die die Wirkung der funktionalisierten substituierten Dextrane auf den Schutz der biologischen Aktivität der FGFs zeigen.
Es sollte dennoch selbstverständlich sein, daß die Beispiele lediglich zur Illustration des Gegenstands der Erfindung dienen, den sie auf keine Weise einschränken.

Beispiele

Beispiel 1: Verfahren zur Stabilisierung der FGFs

1) Herstellung eines substituierten funktionalisierten Dextrans (zell - und gewebsregenerierenden Mittels)

30 g Dextran T40 (0,185 mol) werden in 146 ml destilliertem Wasser aufgelöst und in einem Eisbad auf 4ºC abgekühlt. 59,2 g NaOH (1,48 mol) werden in 100 ml destilliertem Wasser aufgelöst und anschließend auf 4ºC abgekühlt. Die Salzlösung wird langsam in die Dextranlösung unter Rühren eingegossen, und das Ganze 20 Minuten lang bei 4ºC gehalten. Anschließend gibt man 61 g ClCH&sub2;COOH (0,647 mol) schrittweise zu, so daß die Temperatur nach 5 Minuten 20ºC erreicht. Anschließend wird das Reaktionsgemisch auf 40ºC innerhalb von 10 Minuten gebracht und 90 Minuten lang bei dieser Temperatur gehalten. Anschließend kühlt man auf 20ºC ab. Der pH-Wert wird mit konzentrierter Essigsäure auf 7 abgesenkt. Das Ganze wird in 2 l Methanol ausgefällt, filtriert und zweimal mit 1 l Ethanol gewaschen und anschließend im Vakuum bei 40ºC getrocknet.
10 g des vorstehend beschriebenen modifizierten Polymeren werden in 55 ml destilliertem, auf einen pH von 3 angesäuertem Wasser aufgelöst. 60 ml Dimethylformamid werden unter Rühren schrittweise zugesetzt, wobei der pH- Wert bei einem Wert von 3 gehalten wird. Die Temperatur wird auf -15ºC abgesenkt und 12,3 ml N-Methylmorpholin werden zusammen mit 14,5 ml Chlorisobutylformiat zugesetzt. Anschließend gibt man 12,2 ml Benzylamin zu. Nach 30 Minuten wird das Polymere in 800 ml Methanol ausgefällt, filtriert und getrocknet.
9 g des vorstehend beschriebenen modifizierten Polymeren werden in 25 ml wasserfreiem Dichlormethan dispergiert. Eine Mischung aus 0,26 ml HSO&sub3;Cl und 2,5 ml Dichlormethan werden in den Reaktor eingebracht, und das Ganze wird 4 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Nach der Filtration und dem Waschen mit Dichlormethan wird das Produkt getrocknet, in 30 ml Wasser aufgelöst, und der pH-Wert wird auf einen Wert von 7,0 eingestellt. Die Lösung wird zuerst gegen eine Pufferlösung und anschließend gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Anschließend wird die Lösung bis zum Erhalt des trockenen Polymeren gefriergetrocknet.
Zur Herstellung eines substituierten funktionalisierten Dextrans kann auch ein anderes Verfahren, wie das in der EP-0 023 854 beschriebene angewendet werden.

2) Herstellung des/der FGF(s)

Man behandelt den/die Zellextrakt(e) über Nacht in Gegenwart von Essigsäure bei einem pH von 3 und trennt anschließend die FGFs durch Chromatographie auf immobilisiertem Heparin oder substituiertem Polystyrol.

3) Herstellung eines erfindungsgemäßen stabilen FGF-Präparats

Ausgehend von den unter 1) erhaltenen trockenen Polymeren stellt man eine Dextranlösung her, indem man es mit einem isotonischen Phosphatpuffer (PBS) in Lösung bringt, so daß eine Konzentration von 400 ug/ml erhalten wird.
Man bringt die unter 2) extrahierten FGFs in diesen Puffer, der die geeigneten substituierten Dextrane enthält, in Lösung, so daß eine Konzentration von FGFs von 100 ug/ml erhalten wird.

Beispiel 2: Erfindungsgemäße stabilisierte Salbe

FGF 10 ug
DF 5 mg
Carboxymethylcellulose 2,5 g
steriles pyrogenfreies gereinigtes Wasser 100 ml
DF = funktionalisiertes Dextran vom Typ E, wie in der nachstehenden Tabelle III definiert.
Die erhaltene Creme kann auf eine Wunde vom Skarifikationstyp bei einer Ratte über einen Zeitraum von 3 Tagen angewendet werden.

Beispiel 3: Erfindungsgemäßer stabilisierter Verband

Der Träger des Verbands besteht aus einem Collagenfilm "Pangil" der Laboratoires FOURNIER, der durch passive Adsorption einer Mischung aus FGF und funktionalisiertem Dextran in den folgenden Verhältnissen:
FGF 10 ug
DF 500 ug
physiologisches Serum 10 ml
getränkt ist.
Nach einer 30minütigen Inkubation des Collagenfilms bei 4ºC in der oben beschriebenen Lösung erhält man einen Verband, der in Fällen von verschiedenen Geschwürbildungen, oberflächlichen und tiefen Wunden angewendet werden kann.
Dieser Verband kann vakuumverpackt gelagert werden.

Untersuchung der Wirkung der funktionalisierten biospezifischen Polymeren auf den Schutz der biologischen Aktivität der FGFs in vitro

Angewendete Methode zur Messung der biologischen Aktivität der FGFs in vitro

Die Methoden zur in-vitro-Beurteilung der biologischen Aktivität der FGFs sind in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben und basieren alle entweder auf einer Messung der Zunahme der Anzahl der Zellen, die durch zunehmende Dosen an den dem Kulturmedium der Zellen zugesetzten Faktoren induziert wird, oder auf einer Zunahme des Einbaus von mit Tritium markiertem Thymidin in die DNA der durch den Wachstumsfaktor stimulierten Zellen. Bei den beiden genannten Verfahren sind die Zunahmen von der zugesetzten Faktordosis abhängig, und man kann deshalb Dosiswirkungen und Dosis-Antwort- Kurven mit einer maximalen Stimulationswirkung aufstellen. Durch Vereinfachung definiert man eine Stimulationseinheit, wie die Dosis an Wachstumsfaktor, die, wenn sie zu einem Milliliter des Kulturmediums auf den Zielzellen zugesetzt wird, in der Lage ist, eine Zunahme der Zellzahl oder des Einbaus von mit Tritium markiertem Thymidin hervorzurufen, die der Hälfte (50%) des Maximalwerts dieser Zunahme, der in der Dosis-Antwort-Kurve gemessen wurde, entspricht. Diese Definition und die Nacharbeitbarkeit dieser Maßnahmen sind insbesondere in PLOUET et al, 1984, Cellular and Molecular Biology 30, S. 105 beschrieben

Beispiel A: Schutzwirkung des substituierten Dextrans gegenüber der sauren und basischen Inaktivierung der FGFs durch saure und alkalische pH- Werte

Bei diesen Versuchen befinden sich die FGFs in einem isotonischen Phosphatpuffer (PBS), der kein Dextran (Referenz) oder 400 ug/ml an substituiertem Dextran enthielt, in einer Konzentration von 100 ug/ml in Lösung. 10 ul dieser verschiedenen Lösungen werden entnommen und entweder mit 1 ml PBS-Puffer, verdünnter, auf einen pH-Wert von 2 eingestellter Essigsäure (CH&sub3;COOH) (ungefähr 1 N) oder verdünnter, auf einen pH-Wert von 9,0 eingestellter Natronlauge (NaOH) vermischt. Diese Proben werden 2 Stunden lang bei 20ºC inkubiert und anschließend wird 1 ul zur Dosierung der biologischen Aktivität entnommen.
Die Figur 1 zeigt die Kurve, in der die Dosis und die Antwort des bFGF auf die Fibroblasten CCL39 aufgetragen sind.
In dieser Figur sind der Logarithmus der bFGF-Konzentration in pg/ml und die prozentuale Stimulation auf der Ordinate aufgetragen.
Die Kurve 1 entspricht der Referenz; die Kurve 2 entspricht dem bFGF allein bei einem pH-Wert von 2; die Kurve 3 entspricht dem bFGF in Anwesenheit von Dextran bei einem pH-Wert von 2; die Kurve 4 entspricht dem bFGF in Anwesenheit von Dextran bei einem pH-Wert von 9; die Kurve 5 entspricht dem bFGF bei einem pH-Wert von 9; und die Kurve 6 entspricht der Referenz in Anwesenheit von Dextran.
Die Zunahme des Einbaus von mit Tritium markiertem Thymidin stellt den Wert der Anzahl an Treffern pro Minute (cpm) dar, die auf der Dosis-Antwort-Kurve des bFGF allein, verringert um den in cpm ausgedrückten Wert des in die Zellen in Abwesenheit von FGF eingebauten und in dem gleichen Versuch bestimmten, mit Tritium markierten Thymidins erhalten wurde.
Die Kurven 3 und 4 zeigen, daß der bFGF in Anwesenheit von Dextran seine Fähigkeit zur Stimulierung sowohl in einem sauren als auch in einem basischen Medium beibehält.
Die Tabelle I faßt die mit den sauren und basischen FGFs erhaltenen Ergebnisse zusammen. Die Einheit der Stimulation wird willkürlich für den 2 Stunden lang bei 20ºC inkubierten FGF oder den bFGF zu Beginn auf 1 festgelegt. Tabelle I
Df = funktionalisiertes Dextran: in diesem Beispiel handelt es sich um das Dextran E, so wie es in der Tabelle III nachstehend definiert ist.
H.S. = Heparansulfat: (Societé BIOVALORIS Plouhermel (IIe-et-Villaine, FRANCE).
Diese Tabelle zeigt die Schutzwirkung des DF (des funktionalisierten Dextrans) gegenüber der sauren und basischen durch saure und alkalische pH-Werte hervorgerufenen Inaktivierung der FGFs.
Die 2stündige Inkubierung des basischen FGF bei 20ºC in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 2 bis 9, ruft eine Inaktivierung der biologischen Aktivität des basischen FGF hervor.
In der Tat wird 53mal mehr an Produkt bei einem sauren pH-Wert und 13mal mehr bei einem basischen pH-Wert benötigt, um eine biologische Wirkung an dem Anfangsprodukt hervorzurufen.
Der Zusatz von DF zu diesem Gemisch schützt die biologische Aktivität des basischen FGF völlig gegen Inkubationen bei einem pH-Wert von 2 oder 9.
Ähnliche Ergebnisse werden in dem Falle des sauren FGF hinsichtlich der beiden Behandlungstypen beobachtet.

Beispiel B: Kurzzeit- und Langzeitwirkung des funktionalisierten Dextrans (DF) auf die Inaktivierung der FGFs durch die Temperatur

In diesem Beispiel wird der wie in dem Beispiel A hergestellte FGF über verschiedene Zeiträume in Gegenwart oder Abwesenheit von 400 ug von wie in der nachstehenden Tabelle III definiertem funktionalisiertem Dextran (DF) bei 4ºC, 20ºC, 37ºC oder 60ºC inkubiert und anschließend dosiert.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II gezeigt. Tabelle II
DF = funktionalisiertes Dextran
H.S. = Heparansulfat
Die Einheit der anfänglichen Stimulation wird willkürlich auf einen Wert von 1 festgelegt.
Man beobachtet in dieser Tabelle eine starke Inhibierung der Aktivierung des sauren oder basischen FGFs, die durch eine einwöchige Behandlung bei 37ºC hervorgerufen wird. Die Anwesenheit des DF in dem Inkubationsmedium schützt die beiden FGF-Typen gegen die thermische Denaturierung.
Ähnliche Ergebnisse werden beobachtet, wenn das HS (Heparansulfat), das biologische Äquivalent des DF, verwendet wird.

Beispiel C: Wirkung der verschiedenen funktionalisierten Dextrane auf die Dosis-Antwort-Wirkungen des FGF

Die Wirkung verschiedener funktionalisierter Dextrane wird in der nachstehenden Tabelle III quantitativ gemessen. Tabelle III Dextranderivate
Prozentsatz:
D: Dextran
W: Carboxymethyl
X: Benzylamid
Y: Benzylamidsulfonat
R/us ist der Wert des Verhältnisses der Werte der Einheiten der Stimulation des aFGF ohne funktionalisiertes Dextran geteilt durch die Einheit der Stimulation in Gegenwart von funktionalisiertem Dextran.
* Untersuchung der Wirkung von funktionalisierten biospezifischen Polymeren auf den Schutz der biologischen Aktivität der FGFs in vivo

Beispiel D: Kinetischen planimetrische und histologische Untersuchung der narbenbildenden Wirkung der Kombination FGF/funktionalisiertes Dextran

Versuchsprotokoll:

Die Versuche werden an männlichen Wistarratten von 300 bis 400 g vorgenommen. Jedes Experiment wird mit einer Reihe von 5 Tieren durchgeführt.
Zwei Arten von Hautverletzungen werden den Tieren auf ihrer vorher rasierten Rückenseite beigebracht.
Die Entnahmen werden mit einer Lochzange (0,6 cm Durchmesser) bis zum Muskelboden vorgenommen.
Hautritzungen von 1 cm Länge werden mit dem Skalpell vorgenommen. Die dermoepidermische Region wird dabei nicht beeinträchtigt.

Verfahrensweise:

Dem Typ der Wunden entsprechend werden die Verletzungen mit unterschiedlichen Produktgemischen, die in gepuffertem (pH 7,4) sterilisiertem Serum gelöst sind, behandelt.
Diese Lösungen werden für die durch die Lochzange hervorgerufenen Wunden in einem Collagentupfer (GINGESTAT) aufgenommen, der entsprechend den exakten Maßen der Gewebsexzision vorher zugeschnitten worden ist.
Im Fall der Hautritzungen werden die Produkte direkt in flüssiger Form auf die Wunde aufgebracht.
Die Wirkungen der Kombination von FGF (basisch oder sauer oder ein Gemisch in einer Lösung von 1 ng bis 10 ug/ml) und funktionalisierten Dextranen (in einer Lösung von 100 ng bis 1 mg/ml) werden bewertet und mit der Wirkung von einem funktionalisierten substituierten Dextran allein oder von jedem der Bestandteile, die als Reaktionsteilnehmer angesehen werden (Collagen, Verdünnungslösung, FGF) verglichen.
Jede Versuchsreihe von Tieren wird im Intervall von 24 Stunden getötet und die verletzten Zonen werden für zwei Arten von Untersuchungen entnommen:
- eine externe morphologische Analyse mit Planimetrie der Wunde;
- eine histologische Untersuchung.

Ergebnisse:

I - Stabilisierende Wirkungen der funktionalisierten Dextrane:

Mit ¹²&sup5;I radioaktiv markierter FGF wird in Gegenwart oder Abwesenheit von funktionalisiertem Dextran auf einen Collagentupfer aufgebracht.
Die Änderung der Radioaktivität in dem getränkten Collagen wird als Funktion der Zeit aufgezeichnet.
Die Ergebnisse sind in der Figur 2 dargestellt, in der auf der Abszisse die Zeit in Stunden und auf der Ordinate der Prozentsatz an Radioaktivität aufgetragen sind. Die Kurve 7 entspricht dem FGF in Gegenwart von Dextran und die Kurve 8 entspricht dem einzeln eingesetzten FGF.
Die Radioaktivität wird in dem Collagengel und in den mittels einer der ursprünglichen entsprechenden Lochzange an der Peripherie der Wunde, 2 cm von dieser entfernt, entnommenen Gewebeproben gemessen.

II - Morphologische und histologische Untersuchungen:

A) Morphologische Untersuchung:

Die Beobachtung des Wundverlaufs mit bloßem Auge erlaubt die Feststellung einer sehr deutlichen Wirkung einer Kombination von FGF plus funktionalisiertem Dextran auf die Geschwindigkeit und die Güte der oberflächlichen Vernarbung (Epidermisbildung + Lyse des Gerinsels).
1) Nach 24 Stunden hängen die Collagentupfer, die mit dieser Kombination getränkt worden waren, vollständig an den Wundrändern und konnten nur durch Läsion der regenerierten Gewebeteile abgehoben werden. Die Vergleichsversuche zeigen erst ein vollständiges Verwachsen der Collagene nach 36 bis 48 Stunden.
2) Die Neubildung von Epithelgewebe ist mit dem bloßen Auge in Gegenwart der Kombination von FGF + funktionalisiertem Dextran nach 3 Tagen sichtbar, während ein identisches Bild bei den Kontrollversuchen eine Versuchsdauer von 5 bis 7 Tagen erfordert.
3) Planimetrische Analyse: die planimetrische Analyse der externen Oberfläche der Wunden zeigt die völlige Abwesenheit einer Retraktion der sich in Regeneration befindlichen Gewebeteile.
Die Rate der Narbenretraktion wird als Funktion der Zeit ausgewertet, wobei die Beziehung P/A, worin P den Umfang der Wunde und A die Oberfläche der Narbe bezeichnen, berücksichtigt wird.
Die Größenordnung dieser Beziehung P/A ist vom Typ K/R, worin K eine Konstante und R der Radius der ursprünglichen kreisförmigen Wunde ist.
Je mehr diese Beziehung als Funktion der Zeit klein und konstant ist, umso mehr bewahrt die Narbe eine der ursprünglichen Läsion verwandte Planimetrie. Je kleiner folglich die Beziehung P/A ist, umso begrenzter ist die Rate der Narbenrestrukturierung. Die Qualität der Vernarbung kann so durch die Abwesenheit einer Kontraktion wiedergegeben werden.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Figur 3 dargestellt, in der auf der Abszisse die Zeit in Tagen und auf der Ordinate die Beziehung P/A aufgetragen sind. Die Retraktionsrate wird für die Referenz durch ; für den bFGF durch ; für die FGFs in Gegenwart von Heparansulfat durch und für die FGFs in Kombination mit den funktionalisierten Dextranen durch dargestellt.
Die Ergebnisse sind ebenfalls nachstehend in Tabellen IV und V dargestellt; die Tabelle IV gibt den Prozentsatz der Vernarbungsfläche als Funktion der Menge an funktionalisiertem Dextran (DF) in Gegenwart oder Abwesenheit von bFGF an; die Tabelle V gibt das Verhältnis P/A unter denselben Bedingungen an. Tabelle IV Referenz bFGF 1 ug DF in unterschiedlichen Konzentrationen Tabelle V bFGF 1 ug + DF in unterschiedlichen Konzentrationen 500 ug 50 ug 5 ug
Die Wirkungen der funktionalisierten Dextrane auf diese Retraktion sind insbesondere am 4. und 8. Tag nach der Operation sichtbar.
Die vorstehenden Tabellen zeigen die charakteristische narbenbildende Wirkung der Dextrane. In der Tat liegt in der Tabelle IV der Prozentsatz der Fläche in Gegenwart von 5 ug von DF nahe an der in Gegenwart von 1 ug von bFGF allein, die ihrerseits unterhalb der Referenz liegen.
Die Retraktion ist im Vergleich zu denjenigen, die bei den Vergleichsversuchen oder in Gegenwart der FGFs allein oder in Kombination mit Heparansulfaten beobachtet werden, sehr gering, wobei die Bedingungen bereits deutlich günstiger als die der Referenz sind.

B) Histologische Untersuchung

Die behandelten Zonen werden entnommen, fixiert und mit Paraffin imprägniert. Die histologische Untersuchung wird auf Schnitten von 7 um durchgeführt. Die verwendeten Färbungen erlauben topographische und histochemische Untersuchungen.
Die histologische Untersuchung zeigt, daß die Kombination FGF + DF die üblichen Stufen der dermoepidermischen Narbenbildung beschleunigt und die Qualität der wiederhergestellten Gewebsteile erhöht.
Das imprägnierte Collagen erlaubt, ausgehend von den umgebenden gesunden Gewebsteilen und insbesondere ausgehend von der Bindehaut des darunterliegenden quergestreiften Muskelbodens eine sehr rasche Koloniebildung (1 Tag) der umgebenden Zellkategorien (Fibroblasten, glatte Muskeln).
Gleichzeitig erlaubt eine Neoangiogenese dem sich bildenden Gewebe durch eine hohe Dichte von Blutkapillaren kolonisiert zu werden. Nach 3 Tagen (gegenüber 5 bis 6 für die Referenzen) gelangt die Reepihtelisierung, ausgehend von der Epidermis der Wundränder in das Stadium des Aneinanderliegens der Wundränder. Am 4. Tag ist die Epidermis vollständig wiederhergestellt und die darunterliegenden völlig neu gestalteten Gewebsteile weisen eine normale Dichte im Vergleich zu den Referenzen mit einer wesentlich niedrigeren Dichte auf. Die gleichen Bilder zeigen die Abwesenheit einer Retraktion der Wundränder bei den mit einer Lochzange erzeugten Wunden, die mit der Kombination aus FGF + funktionalisierten Dextranen behandelt worden sind, im Gegensatz zu den Referenzen, die durch Extraktion die herausgeschnittenen Gewebsteile auffüllen.
Die Wirkungen der Kombination der bFGFs und der funktionalisierten Dextrane auf die Güte der Narbenbildung sind im Vergleich zu einer natürlichen Narbenbildung ohne den Zusatz der Produkte in den Figuren 4 und 5 gezeigt. Die Figur 4 stellt eine Photographie eines histologischen Schnitts einer Vergleichsvernarbung (keine Behandlung) 4 Tage nach der Erzeugung der Wunde dar (x 40). Die Figur 5 stellt die Photographie eines histologischen Schnitts einer Vernarbung nach der Behandlung mit einem Collagentupfer, der mit einer Lösung von bFGF in einer Konzentration von 1 ug/ml und von funktionalisierten Dextranen in einer Konzentration von 50 ug/ml getränkt wurde, 4 Tage nach der Erzeugung der Wunde dar, und zwar in der gleichen Vergrößerung von 40.
Die Figur 5 zeigt die vollständig wiederhergestellte Epidermis (E), während sie in der Figur 4 nicht wiederhergestellt ist. Eine Retraktion der umgebenden Gewebsteile auf die Vergleichswunde wird auf der behandelten Wunde nicht registriert. Während dieser Narbenraum in der Figur 4 relativ ungeordnet ist, zeigt sich bei der behandelten Wunde (Figur 5) eine zufriedenstellende Zellorganisation und -dichte. Er ist durch die Gegenwart von Blutgefäßen gekennzeichnet, was die lokale angiogene Wirkung der Kombination der Produkte dieser Erfindung zum Ausdruck bringt.
Es scheint somit, daß die Kombination von bFGF + funktionalisiertem Dextran sich als sehr wirksames narbenbildendes Mittel in vivo erweist, das einerseits die natürlichen Regenerationsprozesse beschleunigt und andererseits eine erhöhte Qualität der Vernarbung durch die Abwesenheit jeglichen Retraktionsphänomens, sowie die rasche Mobilisierung der verschiedenen Zellkategorien, die für die Wiederherstellung des Gewebes notwendig sind, erlaubt.

Beispiel E: Planimetrische und histologische Untersuchungen der narbenbildenden Wirkung von funktionalisierten Dextranen

Das Versuchsprotokoll, das in allen Punkten mit dem im Rahmen von Beispiel D ausgeführten identisch ist, wird durchgeführt, um die narbenbildenden Wirkungen der funktionalisierten Dextrane zu beurteilen. Die untersuchten Dextrane sind in der Tabelle III des Beispiels C verzeichnet. Die narbenbildenden Wirkungen der funktionalisierten Dextrane oder ihrer Kombination wurden durch Vergleich mit zwei Referenzversuchen, in denen nur das Vehikel, der Collagentupfer oder der mit einem nicht-substituierten Dextran getränkte Collagentupfer (als Produkt A bezeichnet) vorhanden waren, beurteilt.

A - Morphologische Untersuchung

Die Beobachtung der Wundentwicklung mit bloßem Auge erlaubt es, eine sehr deutliche Wirkung der funktionalisierten Dextrane auf die Geschwindigkeit und die Qualität der oberflächlichen Vernarbung festzustellen.
Hinsichtlich der Vergleichsversuche wird das Verwachsen mit dem Träger für die mit den funktionalisierten Dextranen behandelten Wunden beschleunigt.
Die Reepithelbildung folgt einer Kinetik, die jener vergleichbar ist, die unter der Wirkung der FGFs beobachtet wird.
Die Beziehung P/A, worin P den Durchmesser der Wunde und A die Oberfläche der Wunde bezeichnen, drückt eine sehr signifikante Verringerung der Rate der Narbenretraktion aus. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle VI dargestellt.
Diese Versuche bestätigen die spezifische Rolle der funktionalisierten Dextrane auf die Inhibierung der Narbenretraktion und die Deformation der umgebenden Hautfläche, wie das bereits voranstehend in dem Beispiel D ausgeführt worden ist.

B - Histologische Untersuchung

Die Analyse ist mit der in dem voranstehenden Beispiel durchgeführten identisch.
Sie zeigt durch Vergleich mit den Beobachtungen der Referenzversuche eine von den die Wunde umgebenden verschiedenen Zelltypen raschere und intensivere Kolonisierung des mit den funktionalisierten Dextranen getränkten Collagens.
Die Neoangiogenese ist deutlich, aber weniger ausgeprägt als diejenige in Gegenwart der FGFs beobachtete.
Die Epidermisfortsätze legen sich um den 4. Tag herum aneinander, was der bei den Referenzen beobachteten Reepithelbildung um mindestens 24 Stunden vorausgeht.
Es zeigt sich somit ein für die Wirkung der funktionalisierten Dextrane charakteristischer Effekt, der sich in einer harmonischen bzw. gleichmäßigen Vernarbung an den Rändern manifestiert, was eine Verringerung der natürlichen Kontraktion der Wundränder und eine erhöhte und rasche Mobilisierung der die Collagene kolonisierenden Zellen ausdrückt, was zu einem Regenerationsgewebe führt, das dichter und vaskularisierter als das bei den Referenzversuchen beobachtete ist. Ein solcher Effekt könnte vielleicht durch die Tatsache erklärt werden, daß die substituierten funktionalisierten Dextrane auf der Höhe der Gewebsteile die Wirkung der in situ durch die umgebenden Gewebsteile abgegebenen FGFs potenzieren. Tabelle VI Die Retraktionsraten P/A sind für die Vergleichscollagene allein, für das mit Dextran vom Typ A getränkte Collagen und für verschiedene vorher aufgelistete Dextrane dargestellt. Alle diese Moleküle wirken in einer Verdünnung von 3 ug/ml. (1): Collagen (2): Collagen + A
Wie sich das aus dem Voranstehenden ergibt, ist die Erfindung in keiner Weise auf diese Formen der Ausführung, Verwirklichung und Anwendung beschränkt, die näher beschrieben worden sind. Sie umfaßt im Gegenteil sämtliche Varianten, die sich für den Fachmann ergeben, ohne sich dabei vom Rahmen oder dem Umfang der vorliegenden Erfindung zu entfernen.

Claims

1. Verwendung mindestens eines substituierten, durch die funktionellen Gruppen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carboxymethyl, Benzylamid und Benzylamidsulfonat funktionalisierten Dextrans zur Herstellung eines Arzneimittels für die therapeutische Wirkung einer Zell- und Gewebsregeneration.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die substituierten, funktionalisierten Dextrane aus der Gruppe bestehend aus löslichen Dextranen und unlöslichen Dextranen ausgewählt sind.

3. Stabilisiertes Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mittel mit zell- und gewebsregenerierender Wirkung nach einem der Ansprüche 1 und 2 zusammen mit mindestens einem sauren FGF und/oder einem basischen FGF und/oder einem Derivat und/oder einem Analogen und/oder einem Fragment davon, das eine biologische Aktivität besitzt, enthält, wobei das Mittel gleichzeitig in der Lage ist, die biologische Aktivität des/der sauren und/oder basischen, durch eine lange Lagerung oder durch die Temperatur inaktivierten FGF-Faktoren ganz oder teilweise wiederherzustellen, und mit dem FGF bzgl. dessen biologischer Aktivität mitzuwirken.

4. Präparat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,1 bis 1000 ug/ml mindestens eines Mittels mit zell- und gewebsregenerierender Wirkung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 und 0,01 ng/ml bis 300 g/ml mindestens eines FGF ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus sauren FGFs, basischen FGFs, ihren Derivaten, ihren Analogen und ihren Fragmenten, die eine biologische Aktivität besitzen, enthält.

5. Präparat enthaltend ein Mittel mit zell- und gewebsregenerierender Wirkung nach einem der Ansprüche 1 und 2, oder Präparat enthaltend das genannte Mittel zusammen mit einem FGF nach Anspruch 3 oder nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich andere beigefügte Wirkstoffe enthält.

6. Präparat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die beigefügten Wirkstoffe aus der Gruppe, die insbesondere Lokalanästhetika, infektionsverhindernde Mittel, Serumproteine und Collagen umfaßt, ausgewählt sind.

7. Präparat nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mindestens ein geeignetes, pharmazeutisch annehmbares Vehikel und/oder einen physiologisch annehmbaren Träger enthält.

8. Präparat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Vehikel Wasser ist, und daß das Präparat zusätzlich Puffer und/oder Salze, um die Mischung ungefähr bei einem pH-Wert zwischen 6,8 und 7,4 und bei einer Ionenstärke zwischen 0,1 und 0,2, ausgedrückt als NaCl-Äquivalent, zu halten, enthält.

9. Präparat nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es in geeignete Liposomen eingearbeitet ist.

10. Präparat nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus der Gruppe, die insbesondere Verbandsmaterialien und Biomaterialien umfaßt, ausgewählt ist.

11. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form eines Aerosols vorliegt, wenn das Vehikel ein geeignetes Gas ist.

12. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer galenischen Form, wie in einer Salbe, Creme, Paste, Lotion, eingeschlossen ist oder ein Gel, insbesondere ein Collagengel, tränkt.

13. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem geeigneten Träger, wie Verbandsmaterial oder Biomaterial, der direkt oder indirekt die Zellreparatur begünstigt, eingeschlossen ist und/oder ihn tränkt.