FR2781375A1 - Composition anti-fibrotique contenant des polymeres ou biopolymeres et leurs utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP, comme le CMDBS ou l'un de ses dérivés, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ ou à la prévention des fibroses.L'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques comprenant au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP utilisable dans le traitement et/ ou la prévention des lésions et souffrances tissulaires provoquées par les maladies fibrotiques.

Description

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COMPOSITION ANTI-FIBROTIQUE CONTENANT DES

POLYMERES OU BIOPOLYMERES ET LEURS UTILISATIONS.

La présente invention concerne l'utilisation de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP et

notamment de dérivés de dextrane carboxyméthyl-

benzylamide-sulfonate pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des fibroses. L'invention concerne aussi des compositions anti-fibrotiques comprenant au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP, avantageusement associé dans la dite composition à un

véhicule pharmaceutiquement acceptable.

On connaît dans l'art antérieur des dérivés de dextrane carboxyméthylbenzylamide-sulfonate, désignés CMDBS, dont certains miment les propriétés de l'héparine et peuvent être utilisés en tant que produits

de substitution du plasma grâce à leurs propriétés anti-

coagulante et anti-complémentaire. D'autres de ces dérivés miment une propriété différente de l'héparine qui consiste en une stabilisation, une protection et une potentialisation de l'activité biologique in vitro des facteurs de croissance de la famille des FGF (Tardieu et coll., Journal of Cellular Physiology, 1992, 150, Pages 194 à 203). Ces dérivés, leur préparation et leur utilisation sont décrits dans le brevet français No. 2 461 724 ainsi que dans le brevet US No. 4 740 594. Ils sont obtenus par substitution par des résidus carboxyméthyle, carboxyméthyle - benzylamide

et carboxyméthyle - benzylamide - sulfonate.

Par ailleurs, le brevet français No. 2 644 066 décrit l'utilisation de certains CMDBS, seuls ou

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associés aux FGFs, pour la cicatrisation de la peau et

de la cornée.

Un autre biopolymère, le dextrane sulfate, a également été proposé dans le brevet japonais No. 13890 en association avec des FGF, comme stabilisateur et protecteur Plus récemment, il a été proposé dans les brevets français No. 2 718 023, No. 2 718 025 et No. 2 718 023 d'utiliser des polymères capables de protéger, stabiliser et potentialiser les facteurs de croissance à affinité pour l'héparine, tels les facteurs de croissance des fibroblastes ou FGF et du Transforming Growth Factor bêta (TGFf), comme médicament pour le traitement des lésions respectivement du tractus

digestif, du système nerveux, des tissus musculaires.

Pour illustrer cet effet protecteur des CMDBS, ces brevets rapportent les résultats de la digestion protéolytique par de la trypsine du FGF1, du FGF2 ou du TGFP. Ces propriétés de protection, de stabilisation et de potentialisation des facteurs de croissance à affinité pour l'héparine ont permis de caractériser une nouvelle classe de polymères, désignés HBGFPP pour "Heparin-Binding Growth Factor Protector and Potentiator", présentant une activité cicatrisante et réparatrice des tissus musculaires, nerveux et du tractus digestif et dépourvus, aux doses utilisées, d'activités anti- coagulantes. Les polymères ou biopolymères HBGFPP sont définis par les propriétés suivantes: - ils protègent sécifiquement les facteurs de croissance des familles FGF et TGF bêta de la dégradation trypsique, - ils n'inhibent pas de manière

significative la coagulation.

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Outre, les applications des HBGFPP ci-

dessus, le brevet français No. 2 718 024 propose l'utilisation de ces polymères comme médicament pour le

traitement des inflammations. Cette activité anti-

inflammatoire est illustrée par l'activité d'inhibition in vitro d'enzymes protéolytiques impliquées dans la réaction inflammatoire comme l'élastase leucocytaire ou la plasmine et in vivo par des études histologiques démontrant une réaction cellulaire inflammatoire réduite dans les tissus traités par des dérivés de dextrane

CMDBS.

Les applications des HBGFPP et plus particulièrement du CMDBS proposées dans les brevets cités ci-dessus, dont l'enseignement est incorporé à la présente demande par référence, sont donc limitées à la réparation et à la cicatrisation de certains tissus seulement. Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence de nouvelles propriétés des HBGFPP comme agents anti-fibrotiques. En conséquence, l'invention concerne l'utilisation de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP comme le CMDBS, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention

des fibroses, tant chez l'homme que l'animal.

Les propriétés des CMDBS se caractérisent par une activité d'agent antifibrotique qui se manifeste par des effets régulateurs sur la prolifération des cellules mésenchymateuses comme les cellules musculaires lisses, les fibroblastes ou les cellules hépatiques et la qualité du type de collagène qu'elles sécrètent mais aussi et surtout par leurs effets sur la qualité phénotypique des collagènes synthétisés par ces cellules mésenchymateuses. Par

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ailleurs, les CMDBS, exercent des effets protecteurs

contre les effets délétères des rayonnements ionisants.

Ces activités permettent d'envisager l'utilisation des polymères CMDBS pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des maladies fibrotiques, des fibroses associées aux maladies dégénératives ou parasitaires, des séquelles fibrotiques dans le cas par exemple de mauvais processus cicatriciels ou des réactions fibrotiques consécutives à des radiations accidentelles ou appliquées à des fins thérapeutiques. Elles permettent également d'envisager leur utilisation dans

le domaine de la cosmétologie.

La formation d'un tissu fibreux ou fibrotique est une étape physiologique essentielle, associée aux processus de réparation et de remodelage tissulaire. Le tissu fibrotique est un tissu de comblement, normalement transitoire, visant à conserver l'intégrité structurale et fonctionnelle des tissus et organes. Il se caractérise par la richesse en collagènes

de la matrice extra-cellulaire.

Lorsque cette situation persiste ou se développe, elle correspond à une pathologie illustrant un dérèglement de l'homéostasie structurale et fonctionnelle des tissus et se traduit par une

accumulation anormalement élevée de matrice extra-

cellulaire qui engendre une fibrose. Une fibrose, quelle que soit son origine se caractérise par: - la présence d'un infiltrat inflammatoire permanent, l'existence d'un déséquilibre dans la balance entre un état prolifératif et quiescent des cellules conjonctives ou mésenchymateuses comme les fibroblastes ou les cellules musculaires lisses,

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- la destruction progressive du tissu envahi qui se renouvelle peu ou de façon défectueuse, - l'existence d'un déséquilibre de la balance entre la synthèse et la dégradation de la matrice extra-cellulaire. Une fibrose peut être induite soit à la suite d'un traumatisme d'origines variées (infectieux, mécanique, toxique, etc...) soit à la suite de radiations ionisantes (notamment par des rayons y). Il s'agit dans ce cas des fibroses radioinduites comme c'est fréquemment le cas chez les patients ayant subi

une radiothérapie.

Les collagènes sont les composants majeurs de la matrice extra- cellulaire des tissus normaux comme des tissus fibrotiques. Ils sont synthétisés par toutes les cellules mais essentiellement par les cellules mésenchymateuses comme les fibroblastes et les cellules musculaires lisses. Dans le compartiment intersticiel le collagène s'organise en fibrilles hétérotypiques composées d'un noyau de collagène V entouré de collagène I. Le collagène III se situe à la périphérie de cet édifice. Dans un tissu fibreux, le collagène total est quantitativement augmenté, en raison de modifications affectant aussi bien, sur le plan quantitatif que qualitatif, la synthèse et/ou la dégradation des collagènes, c'est à dire la dynamique du remodelage. Les fibroses se caractérisent par une augmentation du collagène de type III, et ceci

préférentiellement lors de fibroses radio-induites.

Cette augmentation de collagène de type III est associée à une augmentation mais dans une moindre importance du rapport entre le collagène de type III et le collagène

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de type I. Un autre collagène, le collagène de type V, est associé à la qualité de l'organisation des fibres de collagènes dans la matrice c'est à dire la fibrillogenèse. La quantité de collagène de type V traduit la qualité de l'organisation de la fibrillogenèse. Dans les tissus fibrotiques, l'effondrement du taux de collagène de type V est une des origines de la déstructuration des fibres de

collagène de la matrice extracelulaire.

Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont montré que les CMDBS régulent d'une part la croissance des cellules mésenchymateuses fibroblastiques comme musculaires lisses, et d'autre part qu'ils rétablissent le phénotype normal de sécrétion des collagènes. En effet le taux de synthèse global des collagènes est significativement diminué en présence des CMDBS. Sur le plan qualitatif, ces polymères diminuent la quantité de collagène de type III sécrété et augmentent la synthèse de collagène de type V. Ces polymères normalisent donc la biosynthèse des collagènes. L'invention concerne bien entendu aussi les compositions pharmaceutiques anti- fibrotiques comprenant au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP, avantageusement associé dans la dite composition à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Comme indiqué précédement ces compositions sont utiles pour traiter et/ou prévenir des lésions et souffrances tissulaires, telles que celles rencontrées dans les maladies fibrotiques, les fibroses associées aux maladies dégénératives ou parasitaires, les séquelles fibrotiques dans le cas par exemple de mauvais processus cicatriciels ou les réactions fibrotiques consécutives à des radiations accidentelles ou appliquées à des fins thérapeutiques. L'invention concerne aussi les compositions cosmétiques comprenant au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP, avantageusement associé dans la dite composition à un véhicule

cosméologiquement acceptable.

L'invention se rapporte donc à toute composition pharmaceutique ou cosmétologique dans laquelle les HBGFPP, sont associés à un véhicule pharmaceutique sous une forme permettant l'administration per os, per cutanée, sous cutanée, topique, intramusculaire, intraveineuse ou intra artérielle ou dans tous les compartiments liquidiens de l'organisme. Les travaux menés dans le cadre de la présente invention ont permis de mettre en évidence que le CMDBS agit plus particulièrement dans des fenêtres de doses en dehors desquelles des effets biologiques toujours satisfaisants ne sont pas obtenus. Selon les voies d'administration et le type de lésion, les doses

efficaces optimales sont celles définies ci-dessous.

Avantageusement, de manière à recouvrir toute la surface d'une plaie ou à remplir le volume d'une lésion tissulaire, les compositions pharmaceutiques de l'invention sont dosées de façon à permettre une administration de 0,001 à 1 milligramme de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP par centimètre carré ou de 0,005 à 1 milligramme de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP par centimètre cube de tissu à traiter. Ainsi, les compositions de l'invention contiennent de préférence entre 0,01 et 10 milligramme de HBGFPP par millilitre de solution

physiologique de dissolution.

Pour une administration par voie systémique (veineuse, artérielle), par voie intra-péritonéale,

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intra-oculaire, dans le liquide céphalorachidien, dans le liquide intracochléaire ou dans tous fluides péri ou intra-tissulaires, les compositions de l'invention sont dosées de façon à permettre une administration de 0,1 et 100 milligrammes de HBGFPP par kilogramme de poids

d'homme ou d'animal à traiter.

Pour une administration par voie intramusculaire, les compositions de l'invention sont dosées de façon à permettre une administration comprises entre 0,2 et 500 milligrammes de HBGFPP par kilogramme de poids d'homme ou d'animal à traiter, et de préférence

entre 1 et 50 mg par kg.

Pour une administration per os, les compositions de l'invention sont dosées de façon à permettre une administration comprise entre 1 et 5000 milligrammes de HBGFPP par kilogramme de poids d'homme ou d'animal à traiter, et de préférence entre 10 et 500

mg par kg.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant d'une part la préparation de CMDBS, et d'autre part leur propriétés anti-fibrotiques et les

applications qui en découlent.

Exemple 1: Préparation de CMDBS.

Les CMDBS utilisés dans les exemples donnés ci après ont été préparés et sélectionnés comme décrits dans les précédents brevets. A titre de rappel leur formule générale est présentée figure 1. Deux polymères particuliers ont été utilisés dans les exemples présentés. Le CMDBS 192 et le CMDBS 282. Ces deux CMDBS se définissent respectivement par leur taux de substitutions en motifs carboxyméthyle CM,

carboxyméthyle-benzylamide CMB et carboxyméthyle-

benzylamide-sulfonate CMBS présentés dans le tableau I

ci dessous.

Tableau I

Polymères Motifs CM Motifs CMB Motifs CMDBS carboxyméthyle benzylamide CMBS sulfonate

CMDBS 192 110 2,5 38

CMDBS 282 90 0 36,5

Ils appartiennent à la famille des HBGFPP en ce qu'ils ont été sélectionnés sur des critères in vitro pour avoir une activité anticoagulante faible qui est respectivement de 2 et 4 UI/mg, pour stabiliser et potentialiser l'activité mitogène du FGF2 sur des cellules 3T3, pour protéger le FGF1 et le TGFO d'une attaque par la trypsine, pour inhiber l'activité de l'élastase leucocytaire et de la plasmine et sur des critères in vivo en stimulant la régénération du muscle squelettique dans le modèle présenté dans le brevet français nO 2 718 026 EXEMPLE 2: Action des CMDBS comme agents antifibrotiques en modulant la croissance des cellules mésenchymateuses comme les cellules musculaires lisses, les fibroblastes ou les cellules hépatiques et la

qualité du tvpe de collaqène qu'elles sécrètent.

La fibrose traduit une altération de la croissance des cellules mésenchymateuses associée à une modification de la quantité et de la qualité des

collagènes synthétisés.

Cet exemple utilise le modèle cellulaire que

sont les cellules musculaires lisses d'aorte de porc.

Ces cellules sont obtenues selon la méthode des explants à partir d'aortes. L'aorte est composée de 3 couches

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cellulaires: l'adventice (couche externe) qui contient les cellules fibroblatiques, la média (couche centrale) qui contient les cellules musculaires lisses (CML) et l'intima (couche interne) qui contient les cellules endothéliales. La média, après prélèvement est dilacérée en petits morceaux. Les explants sont mis en culture en flasque 25 cm2 contenant du DMEM 1 g/L de glucose, avec rouge de phénol, additionné de 20% de sérum de veau

foetal (SVF), 1% de L-glutamine et 1% de pénicilline-

streptomycine. Les cellules se détache de ces explants et vont coloniser le milieu (stade P0). Au bout de 2 semaines de mise en culture, les cellules sont congelées à une densité cellulaire de 2 millions de cellules dans

du DMSO 10 % et DMEM 20% SVF.

Les cellules sont cultivées en milieu DMEM contenant 1 g/l de glucose, 1% de L-glutamine, 1% pénicilline-streptomycine et 10% de sérum de veau foetal et conservées dans un incubateur à 37 C sous une atmosphère saturée à 5% de CO2 et 95 % d'humidité relative, dans des flasques 75 cm2. Les cellules CML sont ensemencées sur plaques 24 puits à fond plat à raison de 20 000 cellules par puits. Le volume de chaque puits est complété à 2 milliL de milieu. Plusieurs cinétiques de croissance sont réalisées en présence ou non de CMDBS à différentes concentrations allant de 0,4

à 400 microgrammes/milliL.

Les cinétiques de croissance sont effectuées en évaluant le nombre de cellules par puits à l'aide du compteur automatique de particules (Coulter Counter ZM, Coultronics) étalonné préalablement par une évaluation du diamètre des cellules à l'aide d'une cellule de Malassez. Chaque comptage est réalisé sur une moyenne de 4 puits à partir desquels les cellules sont détachées à Il

l'aide de 500 microL/puits d'une solution de trypsine-

EDTA (lOmM).

Le pourcentage d'inhibition de la prolifération est calculé selon la formule suivante: I% = 100 x (1 - croissance nette avec polymères)/croissance nette témoin) o la croissance nette représente la différence entre la quantité de cellules dénombrées lorsqu'elles sont à confluence avec le nombre de

I0 cellules ensemencées en début de mise en culture.

Le témoin correspond aux cultures de CML en absence de polymères. L'héparine et les CMDBS représentent les différents effecteurs testés, susceptibles de modifier l'activité biologique de la

cellule.

Pour l'étude de la biosynthèse et du typage des collagène par les CML, les cellules arrivées à post confluence sont incubées dans un milieu dépourvu de sérum en présence de proline tritiée (10 microCi/mL) et d'acide ascorbique (50 microgrammes/mL) pendant 24 heures. Le surnageant est alors prélevé et la couche cellulaire récupérée à l'aide d'un grattoir à cellules en caoutchouc dans un volume final de 18 mL. Les milieux de culture et les couches cellulaires récupérées sont extensivement dialysées (seuil de coupure de 6 à 8 kDa) contre de l'eau courante (24 heures à 4 C) pour éliminer les petites molécules des macromolécules. Après dialyse, des fractions aliquotes sont prélevées et hydrolysées (HC1 6M, 105 C, 24 h) pour déterminer la radioactivité de l'hydroxy(3H)proline, marqueur spécifique des collagènes A ce stade, une fraction aliquote est utilisée pour quantifier par comptage de la

radioactivité, la synthèse totale de collagènes.

Le volume restant est à nouveau dialysé en présence de pepsine et de collagène I contre de l'acide

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acétique 0,5 M pendant 24 h à 4 C. La pepsine va digérer les contaminants non collagèniques qui seront éliminés dans le dialysat sous forme de peptides. Du collagène de type I est ajouté afin d'augmenter la proportion de collagène qui est faible dans chaque échantillon et de tendre vers un rapport enzyme/substrat de 1/5. Les conditions de réaction sont les suivantes: 1 mL de solution de pepsine (0,5 M) + 1 mL de solution de collagène I (0,5 M) + 0,514 mL d'acide acétique pour avoir une concentration finale en acide acétique de 0,5M, dans un échantillon de 18 mL. Chaque dialysat ainsi obtenu est lyophilisé à froid (-50 C) et conservé

à -20 C jusqu'à utilisation.

Les différentes chaînes a de collagène sont séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) selon la méthode de Leammli, après réduction avec du f mercaptoéthanol. La radioactivité incorporée dans chaque collagène est déterminée par hydrolyse des chaînes a issues du découpage des bandes de gel correspondant à chaque chaîne de collagène d'un type précis. Celles-ci sont ensuite dissoutes dans de l'eau oxygénée à 60 C et la radioactivité contenue dans les différentes bandes dissoutes est comptée au compteur à scintillation

liquide ou par autoradiographie directe des gels.

La séparation électrophorétique est réalisée avec 5 microlitres de collagène V et 50 microlitres de

chaque échantillon réduit.

Ces gels permettent plusieurs types d'exploitation: - La détermination des différents types de

collagène par analyse de la radioactivité incorporée.

- La quantification de ces différents types de collagène par analyse densitométrique après

autoradiographie.

Les fractions aliquotes prélevées après la dialyse contre de l'eau courante sont hydrolysées (HC1 6M, 105 C, 24 h) en ampoules scellées. L'acide acétique est ensuite évaporé, puis le contenu de l'ampoule est resuspendu dans 1 ml d'eau distillée. La proline et l'hydroxyproline sont séparés par la méthode de Rojkind et Gonzales (Rojkind M et Gonzalez E, An improved method for determining specific radioactivities of proline-14C and hydroxyproline-14C in collagen and in noncollagenous

proteins dans "Analytical Biochemistry 1974;57(1):1-7)".

Le principe consiste à oxyder la proline et l'hydroxyproline par la chloramine T. La proline est transformée en pyrroline carboxylate soluble dans le toluène alors que l'hydroxyproline est transformée en carboxylate soluble dans l'eau. Après traitement, les deux fractions proline et hydroxyproline sont récupérées pour chaque échantillon et quantifiées par mesure de la radioactivité.

La figure 2 présente les résultats obtenus.

Les données représentent la moyenne ( SEM) de six déterminations indépendantes. Les différences significativement recevables à p<0. 05; *p<0.01; **p<0.001 par rapport aux témoins ont été établies en

utilisant le test de Student.

Les CMDBS exercent un effet inhibiteur sur la prolifération des cellules musculaires lisses comparable à celui de l'héparine utilisée comme molécule contrôle. Les CMDBS diminuent de façon significative le taux de sécrétion des collagènes par rapport à la synthèse protéique globale. A la différence de l'héparine, ces polymères rétablissent le profil d'un phénotype normal de sécrétion des collagènes. En plus de la baisse du taux de synthèse des collagènes fibrillaires ils diminuent, de façon significative, sur

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le plan qualitatif, le taux de synthèse de collagènes de type I et surtout de type III alors qu'ils augmentent la sécrétion de collagène de type V. Ces effets démontrent les propriétés

antifibrotiques des polymères de l'invention.

EXEMPLE 3: Effets des CMDBS sur la protection des cellules musculaires lisses intestinales humaines soumises à des radiations ionisantes: effets sur leur survie et sur leurs effets antifibrotiques évalués à travers la quantité et la qualité des

collaqènes sécrétés.

Le modèle cellulaire considéré dans cet exemple est celui des cellules HISM, Human Intestinal Smooth Muscle cells, (American Type Culture Condition, Rockville, Maryland ATCC CRL 192), issues de la muscularis propria de jéjunum humain (Graham M.,Diegelmann R., Elson C., Bitar K. and Ehrlich H. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 176 (1984) 503.). Cette lignée de cellules musculaires lisses intestinales humaines a été utilisée pour apprécier les effets des radiations sur la survie cellulaire et l'induction de phénomènes fibrotiques analysés à travers la quantité et la qualité des types de collagène sécrétées par des cellules normales ou en situation d'inflammation ou de

processus de réparation par une fibrose.

Les cellules sont cultivées en milieu DMEM contenant 1 g/1 de glucose, 1% de L-glutamine, 1% pénicilline-streptomycine et 10% de sérum de veau foetal et conservées dans un incubateur à 37 C sous une atmosphère saturée à 5% de CO2 et 95 % d'humidité relative, dans des flasques 75 cm2. Les cellules HISM sont ensemencées sur plaques 24 puits à fond plat à raison de 20 000 cellules par puits. Le volume de chaque puits est complété à 2 milliL de milieu. Plusieurs cinétiques de croissance sont réalisées en présence ou non de CMDBS à différentes concentrations allant de 0,4 à 400 microgrammes/milliL. L'irradiation est effectuée à partir d'une source d'irradiation de 60 Cobalt dans un incubateur o les plaques de culture sont disposées. Deux boites sont soumises simultanément à cette irradiation dont la source est verticale et dont les doses sont évaluées en fonction de la surface irradiée. Le débit de l'irradiateur est de 1 Gy/mn. Les doses absorbées sont de 10 Gy pour un temps d'irradiation par boîte de 10 minutes. Différents protocoles sont utilisés pour apprécier le rôle des CMDBS selon qu'ils sont ajoutés au milieu de culture avant, pendant ou après l'irradiation c'est à dire sur un plan préventif, curatif ou les deux à la fois. Le tableau II ci-dessous précise les différents protocoles dont les symboles sont repris dans

les figures correspondantes.

Tableau II

Séquence CMDBS irradiation CMDBS

Témoin (T)_ _-

Irradiation (IR) - + Curatif (C) - + + Préventif (P) + + Préventif et curatif (P+C) + + + L'effet préventif est évalué par adjonction de CMDBS (+) à la dose de 400 microgrammes/mL dans le

milieu de culture, 48 heures avant l'irradiation.

L'effet curatif est apprécié par adjonction de CMDBS, 2 heures après l'irradiation aux mêmes doses que pour l'effet préventif. Pour les effets cumulés préventifs et curatifs, les cellules sont continuellement cultivées en

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présence des mêmes doses de CMDBS. 96 heures après

l'irradiation, la numération des cellules est effectuée.

L'étude de la biosynthèse des collagènes est réalisée

selon les procédures décrites dans l'exemple précédent.

Les résultats obtenus avec le CMDBS 192

illustrent les effets des CMDBS.

La numération des cellules HISM 3 jours après l'irradiation montrent que ces polymères n'exercent pas d'effet significatif sur la population cellulaire (figure 3) alors qu'ils diminuent de façon significative le taux de synthèse global des collagènes exprimé par les dpm incorporés dans l'3H hydroxyproline (figure 4). Les collagènes sécrétés sont essentiellement accumulés dans la couche cellulaire, comme montré dans le tableau III ci-dessous, à l'inverse de ce qui est observé dans les conditions témoins. Cet effet est en faveur d'un effet d'organisation de la matrice à partir

de collagènes non dénaturés.

Tableau III Série T T+IR C IR+C P P+IR P+C P+IR+C % de collagènes 1911815 12 15 dans le milieu 89 88 19 1815 12 15 14 Dans des conditions normales, le collagène majoritaire sécrété par les cellules HISM est le collagène de type I. Les collagènes de type III et de type V sont minoritaires. L'irradiation provoque un effondrement de la synthèse du collagène de type V et une augmentation très importante de la sécrétion du collagène de type III. Ces caractéristiques valident le modèle d'une fibrose radio induite car le collagène de type III est un "collagène d'alerte", synthétisé en théorie de façon transitoire dans le cas d'une réaction à un stress mais de façon permanente et intense dans le cas d'une fibrose. La quantité proportionnelle de collagène de type III par rapport au collagène de type I augmente de façon importante dans les situations de réponse à une lésion tissulaire, un stress ou une agression et en particulier en réponse à des radiations ionisantes. Le collagène de type III devient prépondérant dans les matrices des tissus présentant une réaction fibrotique aiguë comme chronique. Ce collagène peut être considéré comme un composant signalétique de

la réaction fibrotique radio induite.

Si le CMDBS diminue l'excès de synthèse de collagène I aussi bien lorsqu'il agit à titre préventif que curatif (figure 5), l'effet le plus marquant est celui qui concerne son action sur la diminution de la biosynthèse du collagène de type III. Aussi bien pour les séries o le CMDBS est présent avant ou après l'irradiation c'est à dire à titre curatif et encore plus à titre préventif, le CMDBS permet le retour à la normale du niveau de synthèse du collagène III (Figure 6). Par contre, ce CMDBS n'a pas d'effet significatif sur la biosynthèse du collagène V. Enconclusion, les CMDBS s'il sont présents avant et après l'irradiation (séries P+C et P+IR+C), provoquent un retour quasiment à la normale de l'expression phénotypique des collagènes I et III sans corriger cependant aussi précisément celle du collagène V. Ces résultats confirment donc que les HBGFPP normalisent la biosynthèse des collagènes et par la même

exercent un pouvoir anti-fibrotique.

Claims (13)

REVENDICATIONS

1) Utilisation d'un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention

des fibroses.

2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polymère ou biopolymère de la

famille des HBGFPP est le CMDBS ou l'un de ses dérivés.

3) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP utilisable dans le traitement et/ou la prévention des lésions et souffrances tissulaires provoquées par les maladies fibrotiques. 4) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP utilisable dans le traitement et/ou la prévention des fibroses associées

aux maladies dégénératives ou parasitaires.

5) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP utilisable dans le traitement et/ou la prévention des séquelles fibrotiques

survenant lors de mauvais processus cicatriciels.

6) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP utilisable dans le traitement et/ou la prévention des réactions fibrotiques consécutives à des radiations accidentelles ou

appliquées à des fins thérapeutiques.

7) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP pour être utilisée dans un procédé de régulation de la prolifération des cellules mésenchymateuses comme les cellules musculaires

lisses, les fibroblastes ou les cellules hépatiques.

8) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP pour être utilisée dans un procédé de régulation de la qualité du type de collagène sécrétées par les cellules mésenchymateuses comme les cellules musculaires lisses, les fibroblastes

ou les cellules hépatiques.

9) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP utilisable dans le traitement et/ou la prévention des effets délétères des

rayonnements ionisants.

10) Composition pharmaceutique selon l'une

quelconque des revendications 3 à 9, caractérisée en ce

que le polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP est associé dans la dite composition à un véhicule pharmaceutique sous une forme permettant l'administration per os, per cutanée, sous cutanée, topique, intramusculaire, intraveineuse ou intra artérielle ou dans tous les compartiments liquidiens de l'organisme. 11) Composition pharmaceutique selon la revendication 10, caractérisée en ce que son dosage permet une administration de 0,001 à 1 milligramme de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP par centimètre carré ou de 0,005 à 1 milligramme de polymère ou biopolymère de la famille

des HBGFPP par centimètre cube de tissu à traiter.

12) Composition pharmaceutique selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle contient entre 0,01 et 10 milligramme de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP par millilitre de solution

physiologique de dissolution.

13) Composition pharmaceutique selon la revendication 10, caractérisée en ce que son dosage

permet une administration par voie systémique, intra-

péritonéale, intra oculaire, dans le liquide céphalorachidien, dans le liquide intracochléaire ou dans tous fluides péri ou intra tissulaires, de 0,1 et milligrammes de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP par kilogramme de poids d'homme ou

d'animal à traiter.

14) Composition pharmaceutique selon la revendication 10, caractérisée en ce que son dosage permet une administration par voie intramusculaire, comprise entre 0,2 et 500 milligrammes de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP par kilogramme de poids d'homme ou d'animal à traiter, et de préférence

entre 1 et 50 mg par kg.

) Composition pharmaceutique selon la revendication 10, caractérisée en ce que son dosage permet une administration per os comprise entre 1 et 5000 milligrammes de polymère par kilogramme de poids d'homme ou d'animal à traiter, et de préférence entre 10

et 500 mg par kg.

16) Composition cosmétique comprenant au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP, avantageusement associé dans la dite composition

à un véhicule cosméologiquement acceptable.