DE68905342T2 - Verwendung von minoxidil zur wundheilung. - Google Patents

Description

Hintergrund der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Minoxidil zur Unterstützung und Regulierung der Wundheilung. Im allgemeinen eignet sich die vorliegende Erfindung zur Verbesserung oder Beschleunigung der Wundheilung.
• Minoxidil ist eine Synthetische Chemikalie mit nachgewiesener Wirksamkeit als blutdrucksenkendes Mittel und Stimulanz für das Haarwachstum. Somit wirkt es auf verschiedene Arten von Zellen und induziert verschiedene Phänomene. Diese besitzen ausnutzbare Konsequenzen bei der Behandlung von Bluthochdruck und zur Steigerung des Haarwachstums.
• Die Wundheilung ist ein komplexes Verfahren. Bestimmte Reaktionen einschließlich der Blutgerinnung und der Blutplättchenaggregation setzen nahezu augenblicklich nach der Verwundung ein. Diese Stufen sind wichtig, da sie das Bluten stoppen und die ersten Stufen beim Reparaturverfahren in Gang setzen. Innerhalb des ersten oder zweiten Tages werden mit der Ankunft phagozytischer Zellen, z.B. von Neutrophilen und Makrophagen, Zellenwanderungen beobachtet. Einen oder zwei Tag(e) später dringen fibroblastische Zellen in die Wunde ein und beginnen mit der Produktion von Bindegewebekomponenten, einschließlich von Kollagen, die zur Wiederherstellung des Hautgewebes erforderlich sind. Ferner dringen auch Endothelzellen in die Wunde ein und bilden die Kapillaren, die die Blutzufuhr zu dem betreffenden Bezirk wiederherstellen.
• Nach der Bildung des Klumpens beginnen die Epidermiszel len an den Wundrändern sowie die Epithelzellen und Organellen, z.B. Haarfollikeln, aus der Ecke der Wunde und aus den Überresten der Haarfollikel in den Wundbezirk auszuwandern. Bei kleineren Wunden und in den meisten sonstigen Wundheilungs Situationen setzt sich diese Wanderung von Epithelzellen fort, bis der Wundbezirk vollständig mit den Epidermiszellen bedeckt ist. Diese Zellen sind auch als Keratinozyten bekannt.
• Einige Untersuchungen haben gezeigt, daß das Heranführen exogener Faktoren zu der Wunde die Wundheilung beschleunigt. Diese wundstimulatorenden Faktoren bestehen aus Poypeptiden und vermögen die Bildung von Fasergewebe zu steigern.
• Von einem solchen Wachstumsfaktor, nämlich TGFα, haben Schultz und Mitarbeiter in "Epithelial Wound Healing Enhances by Transforming Growth Factor-alpha and Vaccinia Growth Factor" in "Science" 235:350-2 (1987) berichtet, daß er die Epithelisierung von Versuchswunden steigert. Klinisch wird die Wundheilung unter den verschiedensten Umständen einschließlich Diabetes, Alter, nach Verbrennungen und beim Wundliegen, die Wundheilung beeinträchtigt oder abnormal. Die Bedeutung einer geeigneten Beendigung jeder Stufe im Laufe des Wundheilungsprozesses zeigt sich bei Verbrennungen, bei denen bei verzögerter Epidermisabdeckung der Verbrennung die Infektion, ein Fluidumverlust und eine abnormale Narbenbildung eintreten.
• Die Lieferanten von an der Hautheilung beteiligten Zellen sind Fibroblasten, glatte Muskelzellen und Endothelzellen in der Dermis und assoziierten Gebilden. Keratinozyten aus den Wundgrenzen sowie Epithelzellen aus Haarfollikeln sind die Hauptlieferanten von die Epidermis wiederherstellenden Zellen. Bei einer kleinen Schnittwunde erfolgt die Narbenbildung aus Fibroblasten, Endothelzellen und Epidermiszellep, die aus dem normalen Gewebe rund um die Wunde einwandern. Bei einer Verbrennung können glatte Muskelzellen den Hauptteil der Dermis liefern, während Epithelzellen aus Haarfollikeln zu einem Großteil für die Epidermisabdeckung über dem Gewebe Sorgen können.
Informationshinweis
• Von Minoxidil wird berichtet, daß es selektiv die Lysylhydroxylaseaktivität in kultivierten Menschenhautfibroblasten unterdrückt (S. Murad und Mitarbeiter "Selective Depression of Lysyl Hydroxylase Activity in Human Skin Fibroblasts", "J. Invest. Derm.", Band 36, Seite 4963 (1986)). Diese Erkenntnis legt nach Pinnell und Kollegen nahe, daß Minoxidil als antifibrotisches Mittel verwendbar ist (S. Murad und Mitarbeiter, "Suppression of Fibroblast Proliferation and Lysyl Hydroxylase Activity by Minoxidil", "J. Biol. Chem.", Band 262, Seiten 11973-78 (1987) und Pinnell und Mitarbeiter in "Effects of Minoxidil on Cultured Human Fibroblasts", "Dermatologica", Band 175, Ergänzung 2, Seiten 12-18 (1987)) und folglich bei durch eine Überproliferation von Bindegewebe gekennzeichneten Zuständen von therapeutischem Wert sein müßte. Da niemals darüber berichtet wurde, daß die Lysylhydroxylaseaktivität zelluläre Chemotaxie beeinflußt oder dazu in irgendeiner Weise beiträgt, vermitteln die Veröffentlichungen von Pinnell und Kollegen dem Fachmann auch nicht den geringsten Hinweis darauf, daß Minoxidil eine direkte Wanderung von Hautkeratinozyten oder -fibroblasten Stimulieren könnte oder daß Minoxidil den Wundschluß beschleunigt.
• Topische Minoxidilpräparate sind aus den US-PS 4 139 619 und 4 596 812 zur Behandlung von Haarlosigkeit bekannt. Weiterhin sind aus den US-PS 3 382 247, 3 461 461, 3 644 364 und 4 287 338 und der Veröffentlichung von J.M. McCall und Mitarbeitern in "Journal of Organic Chemistry", Band 40, Seite 3304 (1975) die verschiedensten Salze und Derivate von Minoxidil sowie einschlägige Verfahren bekannt.
Zusammenfassung der Erfindung
• In einer Ausführungsform besteht die Erfindung in einem Verfahren zur Verbesserung oder Beschleunigung der Wundheilung durch Behandeln mit Minoxidil. Die Behandlung kann darin bestehen, daß eine topische Minoxidilzubereitung direkt auf die Wunde appliziert wird. Vorzugsweise enthält das topische Präparat etwa 0,01% bis etwa 1% Minoxidil. Die Behandlung kann auch in der Injektion von Minoxidil in einer zur Beschleunigung der Wundheilung wirksamen Menge oder in einer oralen Verabreichung von Minoxidil bestehen. In der Regel beträgt bei oraler Verabreichung die Minoxidildosis etwa 5 bis etwa 100 mg/Tag.
• Weiterhin kann die Behandlung in einer Kombination aus topischer, Injektions- oder oraler Verabreichung von Minoxidil bestehen.
• Gemäß einer weiteren Ausführungsform besteht die vorliegende Erfindung in einem Verfahren zur Förderung der Wanderung von Epithelzellen durch Behandlung solcher Epithelzellen mit Minoxidil. Das Verfahren kann in einer direkten Applikation einer topischen Minoxidilzubereitung auf die Epithelzellen oder in deren Nachbarschaft bewerktstelligt werden. In der Regel enthält die topische Zubereitung etwa 0,01% bis etwa 1% Minoxidil. Das Verfahren kann auch in einer Injektion von Minoxidil in einer zur Förderung der Wanderung der Epithelzellep wirksamen Menge oder in einer oralen Verabreichung von Minoxidil bestehen. In der Regel beträgt die Dosis bei oraler Verabreichung etwa 5 bis etwa 100 mg Minoxidil/Tag. Weiterhin kann die Behandlung in einer beliebigen Kombination aus topischer, Injektions- oder oraler Verabreichung von Minoxidil bestehen.
• Erfindungsgemäß hat es sich gezeigt, daß Minoxidil für Keratinozyten und für Fibroblasten chemotaktisch ist. Darüber hinaus besitzt Minoxidil die Fähigkeit zur Stimulierung der allgemeinen Mobilität dieser Zellen. Es konnte belegt werden, daß diese Zellen an Minoxidil haften und daß die Zellen folglich auf ihren Oberflächen Minoxidilrezeptorep oder -bindungsgruppen aufweisen.
• Figur 1 zeigt die Wanderung von menschlichen Keratinozyten (Epidermis)-Zellen bei Chemotaxie-Assays bezüglich des Ansprechens auf BSA (Rinderserumalbumin), EGF (Epidermiswachstumsfaktor 10 ng/ml), TFGα (Transformationswachstumsfaktor alpha 10 ng/ml), TGFβ (Transformationswachstumsfaktor beta 10 ng/ml), PDFG (von Plättchen stammender Wachstumsfaktor 10 ng/ml), ECGF (Endothelzellenwachstumsfaktor 10 ng/ml), und FGF (Fibroblastenwachstumsfaktor 10 ng/ml).
• Figur 2 zeigt das chemotaktische Ansprechen von menschlichen Keratinozyten (Epidermiszellen) auf Minoxidil, Minoxidil sulfat und ein Minoxidilanaloges. BSA zeigt die Wanderung der Zellen als Antwort auf dieses Protein, das sämtlichen Proben zugesetzt wurde. EGF wurde in einer Menge von 100 ng/ml als bekanntes positives Chemoattraktans zugesetzt.
• Figur 3 zeigt das Ansprechen von menschlichen Keratinozyten (Epidermiszellen) bei Chemotaxie-Assays in Boyden-Kammern.
• Minoxidil wurde bei einigen Versuchen im Bodenteil, bei anderen im oberen Teil und bei wieder anderen sowohl im Bodenteil als auch im oberen Teil untergebracht.
• Figur 4 zeigt Untersuchungen, die sich auf den Wirkmechanismus von Minoxidil bei der Förderung der Chemotaxie beziehen. Neben Minoxidil wurden einigen Proben EGF und BSA, zyklisches AMP plus IBMX und bei noch anderen Proben Verapamil (ein Calciumkanalblocker), BAY K8644 (ein Calciumagonist) zugesetzt.
• Figur 5 zeigt, daß menschliche Keratinozyten die Fähigkeit zur Bindung an Minoxidil und in geringerem Maße an ein-Minoxidilanaloges besitzen. Bei diesen Untersuchungen wurden die Verbindungen auf einer Kunstoffpetrischale getrocknet, worauf die Fähigkeit dieser Substrate eine Bindung der Zellen an unbeweglich gemachtes Minoxidil zu gestatten, getestet wurde.
• Figur 6 zeigt, daß zunehmende Mengen an Calciumionen die Keratinozyten an einer Wanderung in Richtung auf die anziehenden Substanzen verhindern. Dazu kommt es ungeachtet der Kammer bzw. des Teils, in welcher (welchem) das Calcium untergebracht ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Minoxidil zur Einleitung der Wanderung von Epidermis- und sonstigen Zellen und somit zur Verbesserung der Heilung und Wiederherstellung von Haut und sonstiger durch Traumen, Verbrennungen, Altern, Umweltfaktoren und dergleichen geschädigten Geweben. Die genannten Epidermiszellen umfassen Keratinozyten und Epithelzellen in Haarfollikeln, die als Lieferanten oder Quelle für Zellen zur Abdeckung von Läsionen der Haut und Sonstiger Organe, z.B. der Kornea, dienen.
• Die aktive Komponente der erfindungsgemäßen Zubereitungen besteht aus Minoxidil, bei dem es sich chemisch um 6-Amino- 1,2-dihydrohoxy-2-imino-4-piperidinopyrimidin und dessen Analoge handelt. Die Herstellung dieser Verbindungen ist aus den US-PS 3 382 247, 3 461 461 und 3 644 364 sowie aus J.M.McCall und Mitarbeiter, "Journal of Organic Chemistry", Band 40, Seite 3304 (1975) bekannt. Auf diese Veröffentlichungen wird hierin Bezug genommen. Verwandte Verbindungen sind Sulfoxypyrimidinium, -pyridinium und - triazinlum, die aus der US-PS 4 287 338, auf die hierin ebenfalls Bezug genommen wird, bekannt sind. Im vorliegenden Fall bedeutet der Ausdruck "Minoxidil" irgendeine der verschiedenen Formen von 6-Amino-1,2dihydrohydroxy-2-imino-4-piperidino- pyrimidin, dessen Derivaten und Analogen.
• In einer bevorzugten Zubereitung sind die von The Upjohn Company, Kalamazoo, MI, synthetisierten verschiedenen Minoxidilverbindungen in Aceton plus physiologischer Kochsalzlösung 0,15M NaCl, plus 0,05M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,4, gelöst. In Aceton gelöste Proben werden mit Medien auf ein Maximum von 1% Aceton verdünnt.
• Menschliche Karatinozyten wurden in einem bei 37ºC unter 95% Luft/5% CO&sub2; gehaltenem Inkubator wachsengelassen. Die Keratinozytenkulturen wurden nahezu zum Zeitpunkt des Zusammenfließens mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung PBS gespült und aus der Schale mit Trypsin (0,025%) in PBS entnommen.
• Zur Bestimmung der Zellenwanderung wurden Chemotaxie- Assays durchgeführt. Polycarbonatfilter (12 um Porengröße) wurden mit Kollagen vom Typ IV (10 ug/Filter) beschichtet und in eine modifizierte Boydan-Kammer gestellt. Zellen (menschliche Keratinozyten) wurden geerntet und - wie beschrieben - präpariert und 3,0 x 10&sup5; Zellen in 0,8 ml wurden in den unteren Teil der Boyden-Kammer eingebracht. Der untere Teil der Boyden-Kammer enthielt die Chemoattraktionsmittel einschließlich verschiedener Wachstumsfaktoren, Minoxidil oder verwandte Verbindungen, gelöst in Serumfreiem Eagles Nr.2- Medium mit 0,1% BSA (0,2 ml). Die Kammern wurden dann 6 h bei 37ºC unter 5% CO&sub2; und 95% Luft inkubiert. Die an der Oberseite des Filters haften gebliebenen Zellen wurden mechanisch entfernt. Die Zellen, die zur Unterseite des Filters gewandert waren, wurden in Methanol fixiert und dann mit Hematoxylin und Eosin angefärbt. Jede Probe wurde vierfach getestet. Die Zellen in mindestens 10 mikroskopischen Feldern pro Filter wurden gezählt.
• Wie aus Fig. 1 hervorgeht, besitzen menschliche Keratinozyten die Fähigkeit, eine direkte Bewegung als Antwort auf bestimmte Wachstumsfaktoren, insbesondere TGFα, PDGF und FGF zu erfahren. Andere Wachstumsfaktoren EGF, ECGF und TGFβ zeigen eine geringe Aktivität zur Mobilisierung der Zellen. Bei höhe-5rer EGF-Spiegeln, d.h. 100 ng/ml, ließ sich eine vergleichbare positive Aktivität beobachten (Fig. 2). Wurde Minoxidil auf seine chemotaktische Aktivität hin getestet, führte es eine dosisabhängige Wanderung der Keratinozyten über den Bereich von 10 - 1000 ug/ml herbei. Ein Minoxidilanaloges, nämlich 6- Amino-1,2-dihydro-1-hydroxy-2-iminopyridimidin, zeigte eine Aktivität bei 10 und 100 ug/ml.
• Es wurde die Wanderung von Keratinozyten als Antwort auf Minoxidil getestet, um die Chemoattraktivitätsaktivität (Fig. 3) zu ermitteln. Bei diesem Test wurde das Ansprechen der Zellen auf Minoxidil nach dem Einbringen in die obere Kammer, die untere Kammer oder beide Kammern getestet. In sämtlichen Fällen wurden die Keratinozyten im oberen Teil bzw. in der oberen Kammer untergebracht. Wurde das Minoxidil im unteren Teil bzw. in der unteren Kammer untergebracht, induzierte es die erwartete Wanderung der Zellen (vgl. Fig. 2). Wurde Minoxidil in gleichen Mengen in beiden Kammern bzw. beiden Teilen untergebracht, war nur eine geringe oder überhaupt keine Wanderung feststellbar, was darauf hindeutet, daß in Abwesenheit eines Gradienten keine Wanderung eintritt.
• Ein gewisses Ansprechen wurde durch Minoxidil induziert, wenn es zusammen mit den Zellen im oberen Teil bzw. in der oberen Kammer untergebracht wurde. Ein solches Ansprechverhalten ist typisch für chemotaktische Faktoren, die die Fähigkeit zur Stimulierung einer willkürlichen Zellenbewegung besitzen. Diese Ergebnisse stimmen für Minoxidil als sowohl chemotaktisch wirksam als auch ein Stimulator für willkürliche Zellenwanderungen.
• Aus Fig. 5 geht hervor, daß das Haftenbleiben von Keratinozyten durch Beschichten der Kunststoffschale mit verschiedenen Minoxidilkonzentrationen verstärkt wird. Das Minoxidilanaloge besitzt eine ähnliche, jedoch etwas geringere Aktivität. Die Tatsache, daß eine Bindung der Keratinozyten an Minoxidil stattfindet, zeigt, daß sie auf ihrer Oberfläche Bindungsgruppen für Minoxidil aufweisen. Da eine Chemotaxie oftmals über Zellenoberflächenrezeptoren, die das anziehende Mittel binden, vermittelt wird, dürften das Haftenbleiben und die Chemotaxie durch dieselben Zellenrezeptoren vermittelt werden.
• Aus Fig. 6 geht hervor, daß Calcium in hohem Maße die Wanderungsantwort der Zellen inhibiert. Diese Wirkungen treten rasch ein. Die Zellen verlieren ihre Wanderungsfähigkeit bei relativ niedrigen Calciumkonzentrationen. Wie jedoch aus Fig. 5 hervorgeht, besitzt Verapamil, ein Calciumkanalblocker, keine Wirkung auf die Antwort der Zellen auf Minoxidil, während ein Calciumagonist (BAY K8644) das Ansprechen der Zellen verminderte. Folglich können solche Kombinationen von Arzneimittel das Ansprechen der wandernden Epidermiszellen modulieren oder verstärken.
• Die Zellenhaftung wurde durch Zugabe verschiedener Mengen Minoxidil zu 33 mm Gewebekulturschalen und 1 ml serumfreien Eagles Nr.2-Medium mit 0,5% BSA getestet. Menschliche Keratinozyten wurden - wie beschrieben - präpariert und in jede Schale überführt. Danach wurde 2 h lang bei 37ºC in 5% CO&sub2;/95% Luft inkubiert. Am Ende dieses Zeitraums wurden die Platten dreimal schwach mit PBS gewaschen, um nicht haftengebliebene Zellen zu entfernen. Die haftengebliebenen Zellen wurden mit 0,025% Trypsin, 0,025% EDTA trypsinisiert und elektronisch gezählt.
• Es können medizinische Vorrichtungen derart ausgestaltet werden, daß Minoxidil in verschiedenen Konzentrationen direkt auf Wunden abgegeben wird. Hierzu gehören beispielsweise direkt auf die Oberfläche der Wunde applizierte Pasten, Gele oder Emulsionen oder in ein Material zur Abdeckung einer Oberfläche eingearbeitete Materialien oder Injektionslösungen. Im allgemeinen gelangt Minoxidil bei topischer Applikation in Konzentrationen von 0,01% bis 1% zum Einsatz. Verfahren zur Zubereitung und Rezeptierung topischer Minoxidilpräparate finden sich in den US-PS 4 139 619 und 4 596 812. In anderen Situationen kann eine orale Verabreichung in einer Menge von 5 - 100 mg/Tag alleine oder in Kombination mit einer topischen Behandlung erfolgen.
• Minoxidil kann erfindungsgemäß in Form einer Flüssigkeit, z.B. als Augentropfen oder Lotionen, oder als Salbe oder Gel zur Applikation, zur Förderung der Zellenwanderung oder des Haftenbleibens der Zellen oder in irgendeiner Sonstigen geeigneten Form zum Einsatz gebracht werden. Folglich kann die Verbindung in einem beliebigen pharmazeutisch akzeptablen Träger, der für die jeweils vorgesehene Abgabemaßnahme geeignet ist, enthalten sein.

Claims (8)

1. Verwendung von Minoxidil zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Beschleunigung der Wundheilung.

2. Verwendung von Minoxidil zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von Epithelzellen zur Förderung ihrer Wanderung.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem Medikament um ein direkt auf die Wunde oder Epithelzellen oder in deren Nachbarschaft zu applizierendes topisches Minoxidilpräparat handelt.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei das topische Präparat 0,01% bis 1% Minoxidil enthält.

5. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Medikament für die Injektion von Minoxidil vorbereitet ist.

6. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Medikament für eine orale Verabreichung vorbereitet ist.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die orale Verabreichung 5 - 100 mg Minoxidil pro Tag umfaßt.

8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Behandlung aus einer Kombination einer beliebigen topischen, Injektions- und oralen Verabreichung von Minoxidil besteht.