DE60202474T2 - Antarticine-nf3 zur behandlung und reepithelialisierung von wunden - Google Patents

Description

• Aufgabe der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines als Antarticin-NF3 bekannten Glykoproteins zur Herstellung pharmazeutischer veterinärer und kosmetischer Zusammensetzungen für die Behandlung und Re-Epithelisierung von Wunden.
• Stand der Technik
• Antarticin-NF3 ist ein Glykoprotein, das durch Pseudoalteromonas antartica, einem aus dem Antarktischen Ozean isolierten Gramnegativen Bakterium erzeugt wird. Dieses aerobe heterotrophe Bakterium weist ein einziges polares Flagellum auf und erzeugt ein hexapolymeres Glykoprotein (Antarticin-NF3), das aus 14% Kohlenhydraten und 86% Protein zusammengesetzt ist, welches diese vollständig umschließt. Pseudoalteromonas antartica ist perfekt auf die tiefen Temperaturen der antarktischen Umgebungen angepasst und widersteht hohen Salzkonzentrationen.
• Antarticin-NF3 in Lösung bildet regelmäßige Aggregate durch Selbstgruppierung aus. Ein gradueller Anstieg der Konzentration einer Lösung dieses Glykoproteins verursacht eine graduelle Verringerung der Oberflächenspannung der Lösung. Darüber hinaus ist Antarticin-NF3 für seine große Affinität zu Phosphatidylcholin-Liposomen bekannt, welche diese bedecken und vor der permeabilisierenden Wirkung von Weichmachern wie SDS schützen, so wie dies in der WO98/42731 beschrieben ist. Darüber hinaus ist Antarticin-NF3 für das Induzieren der Keimbildung von Eis und für das Verhindern des Wachstums großer hexagonaler Eiskristalle bekannt. Diese Daten legen nahe, dass Antarticin-NF3 für die Anpassung des Pseudoalteromanas antartica an die Umgebungsbedingungen seines antarktischen Lebensraumes verantwortlich ist.
• Weiterhin stellen Keratinozyten einen in der Epidermis auffindbaren Zelltypen dar, der deren unterste Schicht ausbildet. Keratinozyten erzeugen die äußerste Hautschicht (Stratum croneum), indem sie sich vermehren und ihre Struktur modifizieren, bis sie schließlich die fertig ausgebildete Schicht aus Keratinozytenzellen an der Oberfläche der Haut ausbilden. Die Geschwindigkeit der Wundheilung wird unter anderem durch den Grad der Proliferation und Migration der Keratinozyten beeinflusst. Jeder Faktor, der einen dieser Prozesse steigert, begünstigt den Heilungs- und Narbenbildungsprozess von Wunden.
• Beschreibung der Erfindung
• Als Ergebnis der Untersuchungen konnte überraschenderweise ermittelt werden, dass das lösliche als Antarticin-NF 3 bekannte Glykoprotein von Pseudoalteromonas antartica, das zu 14% aus Kohlenhydraten und 86% Protein besteht, das Zusammenwachsen menschlicher Hautfibroblasten selektiv verbessert und das zellulare Wachstum menschlicher epidermaler Keratinozyten fördert. Aus diesem Grunde hat sich Antarticin-NF3 als solches überraschenderweise als ein guter Wirkstoff zur Verbesserung der Wundnarbenbildung herausgestellt.
• Daher liegt die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, in der Verwendung von Antarticin-NF3 bei der Herstellung von Lösungen oder von verträglichen galenischen Formulierung für eine Verwendungen bei der Behandlung und Re-Epithelisierung von Wunden im pharmazeutischen und veterinären Bereich sowie bei kosmetischen Regenerationsbehandlungen. Die eingesetzten Konzentrationen von Antarticin-NF3 liegen zwischen 100 mg/l und 1 fg/ml und insbesondere zwischen 10 mg/ml und 0,1 ng/ml.
• Als Ergänzung der Beschreibung, die zum besseren Verständnis der Eigenschaften der Erfindung gegeben wurde, werden nachfolgend einige Ausführungsbeispiele ausschließlich zur Verdeutlichung der Erfindung in nicht beschränkender Weise verdeutlicht. Die Erfindung wird durch die beschriebenen Ausführungsformen nicht begrenzt.
• Beispiel 1: In vitro Zytotoxizität
• Die Experimente wurden mit Hilfe des WST-1-Tests durchgeführt, welcher die Aktivität der Dehydrogenase in den Mitochondrien in einem nicht radioaktiven Kalorimetertest unter Verwendung von Formazan-Salzen bestimmt.
• Es wurden verschiedene Konzentrationen des Glykoproteins (zwischen 1 mg/ml und 0,01 μg/ml) getestet. 0,01 M NaCl wurde als Negativkontrolle verwendet und 0,02%iges SDS wurde als Positivkontrolle eingesetzt.
• Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt:
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• Wie aus der vorangehenden Tabelle ersichtlich ist, geht aus den Tests der Zytotoxizität hervor, dass Antarticin-NF3 weder in menschlichen epidermalen Keratinozyten (HEK) noch in menschlichen Hautfibroblasten (HDF) toxisch wirkt.
• Beispiel 2: Wirkung auf das zellulare Wachstum:
• Zellulare in vitro Tests des Zusammenwachsens ergaben, dass Antarticin-NF3 eine spezifische Wirkung auf das Zusammenwachsen von HDF entfaltet. HDF-Zellen zeigen ein signifikantes Wachstum beim zellularen Zusammenwachsen, wenn das Wachstum auf Substraten stattfindet, die mit 1 mg/ml Antarticin-NF3 beschichtet sind und zwar nach Kulturzeiten von 2 und 5 Stunden. Die für HDF erhaltenen Ergebnisse sind der nachfolgenden Tabelle aufgezeigt.
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• Die für HEK erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt:
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• Es ist erkennbar, dass die auf HEK beobachtbare Wirkung unter ähnlichen Kulturbedingungen statistisch nicht signifikant ist.
• Beispiel 3: Wirkung auf das Zellwachstum
• In vitro Experimente des Zellwachstums, die mit dem Kristallviolettverdünnungsverfahren durchgeführt wurden, ergaben, dass Antarticin-NF3 bei unterschiedlichen Konzentrationen in Abwesenheit oder bei Anwesenheit einer geringfügigen Menge von fötalem Kuhserum (2% FCS) das Wachstum von HEK-Zellen fördert, wie in der nachfolgenden Tabelle verdeutlicht ist.
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• Ähnliche Experimente, die mit HDF Zellen durchgeführt wurden, führten zu keinen relevanten Ergebnissen, wie in der nachfolgenden Tabelle gezeigt ist.
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• Beispiel 4: Wirkung auf die in vitro Wundregeneration
• In vitro Experimente zur Wundregenerierung wurden an Kulturen differenzierter HEK-Zellen sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von FCS durchgeführt. Die Dauer der Tests betrug 7 Tage.
• Konzentrationen von Antarticin-NF3 über 0,01 ng/ml zeigten im Vergleich zu den Kontrollkulturen einen positiven Einfluss auf die Wundregeneration. Diese Wirkung von Antarticin-NF3 auf die in vitro Wundregeneration ist in 1 für eine Konzentration von 0,1 μg/ml verdeutlicht.

Claims (4)

1. Verwendung des Glykoproteins Antarticin-NF3, das durch Pseudoalteromonas antartica erzeugt wird und aus 14% Kohlenhydraten und 86% Protein besteht, in pharmazeutischen, veterinären und kosmetischen Zusammensetzungen für die topische Anwendung oder für die Schleimhautanwendung zur Behandlung und Re-Epithelisierung von Wunden.
2. Verwendung des Glykoproteins nach Anspruch 1 bei der Herstellung von kosmetischen Zusammensetzungen zur Behandlung der Haut, der Haare oder der Nägel.
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das besagte Glykoprotein in Konzentrationen zwischen 100 mg/ml und 1 fg/ml eingesetzt wird.
4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei das besagte Glykoprotein bevorzugt in Konzentrationen zwischen 10 mg/ml und 0,1 ng/ml eingesetzt wird.