DE69534309T2

DE69534309T2 - Medizinische verwendung von matrixmetallproteine-inhibitoren zur hemmung von gewebekontraktion

Info

Publication number: DE69534309T2
Application number: DE69534309T
Authority: DE
Inventors: Peng Tee Khaw; Gregory Scott Schultz
Original assignee: Institute of Ophthalmology; University of Florida
Current assignee: Institute of Ophthalmology; Moorfields Eye Hospital NHS Trust
Priority date: 1994-03-16
Filing date: 1995-03-16
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2015-03-17
Also published as: US6759432B2; EP0750512B1; US6379667B1; EP0750512A1; DE69534309D1; AU1898595A; WO1995024921A1; US6093398A; GB9405076D0; US20020164319A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Matrixmetalloproteinase (MMP) Inhibitoren, insbesondere Kollagenase-Inhibitoren und deren Verwendung bei der Herstellung von Medikamenten.
Es gibt viele verschiedene Typen von Kollagenen, die im Körper gefunden werden, und die zusammen mit anderen extrazellulären Matrixkomponenten, beispielsweise Elastin, Gelatin, Proteoglycan und Fibronektin einen großen Teil des extrazellulären Gewebes des Körpers ausmachen Matrixmetalloproteinasen (MMPs) sind Enzyme, die in den Abbau und die Denaturierung von Komponenten der extrazellulären Matrix involviert sind. Beispielsweise sind Kollagenasen Matrixmetalloproteinasen, die Kollagen abbauen oder denaturieren.
Es ist bekannt, dass eine große Anzahl unterschiedlicher Kollagenasen existiert. Diese umfassen interstitielle Kollagenasen, Typ IV-spezifische Kollagenasen und kollagenolytische Proteinasen. Kollagenasen sind im Allgemeinen spezifisch für Kollagene die, in ihrer vollständigen Tripelhelixstruktur, extrem resistent sind gegenüber anderen Enzymen.
Andere MMPs sind in den Abbau und die Denaturierung von anderen Komponenten der extrazellulären Matrix involviert, beispielsweise Elastin, Gelatin und Proteoglycan. Manche MMPs sind fähig, einige unterschiedliche Arten von Kollagenen abzubauen oder zu denaturieren und ebenso andere Komponenten der extrazellulären Matrix. Beispielsweise baut Stromelysin Typ IV-Kollagen, welches in der Basalmembran gefunden wird, ab, und es wirkt ebenso auf andere Komponenten der extrazellulären Matrix wie Elastin, Fibronectin und Knorpelproteoglycane.
Es gibt für MMPs ein Klassifizierungssystem, siehe Nagase et al. 1992. Beispielsweise ist MMP 1 eine Kollagenase, die manchmal "Kollagenase" genannt wird, MMP2 eine 72kD Gelatinase, MMP3 ist Stromelysin und MMP9 ist eine 92kD Gelatinase. Vorliegend werden die offiziellen Bezeichnungen verwendet.
Bei einer Reihe von Erkrankungen, beispielsweise der rheumatoiden Arthritis, [Mullins, D. E. et al. 1993), der periodontalen Erkrankung und der Epidermolysis bullosa, wird eine Rolle von Kollagenasen vermutet und es wurde vorgeschlagen, bei der Behandlung dieser Erkrankungen MMP-Inhibitoren zu verwenden.
Die U.S. Patentbeschreibungen Nr. 5,183,900, Nr. 5,189,178 und Nr. 5,114,953 beschreiben die Synthese von N-[2(R)-2-(Hydroxamidcarbonylmethyl)-4-Methylpentanoyl)-L-Tryptophanmethylamid, ebenso als GM6001 bekannt, Galardin oder Galardin-MPI (Handelsnamen) und anderen MMP-Inhibitoren und deren Verwendung bei der Vorbeugung und Behandlung der Hornhaut Ulzeration. Die Behandlung von Hornhautgeschwüren mit Peptid-Hydroxamsäure-Inhibitoren stellte sich als unterstützend hilfreich bei dem Heilen solcher Geschwüre heraus. Weitere Details solcher Verwendungen werden in Schult et al. 1992 offenbart.
In den oben erwähnten U.S. Patentbeschreibungen wird auch die Verwendung von Kollagenase-Inhibitoren in Situationen beschrieben, wo bakterielle Enzyme für das Gewebe schädlich sein könnten, beispielsweise bei der bakteriellen Ulzeration.
Andere auf Hydroxamsäure basierende Kollagenase-Inhibitoren sind in WO 90/05716, WO 90/05719 und WO 92/13831 offenbart. Es wird offenbart, dass diese Kollagenase-Inhibitoren bei dem Management von Erkrankungen, bei denen ein Gewebeabbau eine Rolle spielt, insbesondere Erkrankungen umfassend den Kollagenabbau und/oder die Förderung der Wundheilung, verwendet werden.
Andere synthetische MMP-Inhibitoren und insbesondere Kollagenase-Inhibitoren die entwickelt wurden, umfassen die, welche in EP-A-126,974 und EP-A-159,396 und in den U.S. Patentbeschreibungen mit den Nrn. 4,599,361 und 4,743,587 beschrieben sind.
Ein in klinischen Versuchen befindlicher Inhibitor ist BB-94, ebenso bekannt als Batimastat (British Bio-technology Ltd.). Potentielle Verwendungen von BB-94 für die Kontrolle der Krebsmetastase sind in EP-A-276436 beschrieben. Es wurde vorgeschlagen, eine orale Formulierung von BB-94 für die Behandlung von Knochenkrebs zu verwenden.
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Kontraktion von Geweben, beispielsweise Narben. Die Kontraktion von Geweben, die Komponenten der extrazellulären Matrix umfassen, insbesondere von Kollagen umfassenden Geweben, kann in Verbindung mit vielen unterschiedlichen pathologischen Zuständen und mit operativen oder kosmetischen Verfahren auftreten. Eine Kontraktur beispielsweise von Narben kann physikalische Probleme verursachen, die eine medizinische Behandlung nötig machen können, oder sie kann Probleme rein kosmetischer Natur verursachen.
Es wurde vorgeschlagen, dass die Kontraktion zellvermittelt ist und eine Reihe von Studien haben mögliche Mechanismen für eine zellvermittelte Kollagenkontraktion vorgeschlagen [Gabbiani et al. 1972, Ehrlich & Rajaratnam 1990]. Es wurden Untersuchungen hinsichtlich der fraglichen Rolle der MMPs beim Prozess der Kontraktur angestellt. Folgt man einer Behauptung, werden MMPs während der Kontraktion nicht produziert [Schor et al. 1980]. Einer anderen Behauptung zufolge werden MMPs während der Netzkontraktion produziert, sind jedoch nicht in den kontraktiven Prozess verwickelt [Nakagawa et al. 1989, Mauch et al. 1989, Lambert 1992]. Im Gegensatz dazu wurde vorgeschlagen, dass die Kontraktion abhängig ist von der Anzahl der Zellen des extrazellulären Netzwerks, von der Tatsache, ob ein intaktes Actincytoskelett vorhanden ist und von der Anhaftung der Zellen an die extrazelluläre Matrix.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Beobachtung, dass während Experimenten mit in vitro-Modellen der Narbenkontraktion Kollagen (der Hauptbestandteil des Narbengewebes) scheinbar von Fibroblasten besiedelt und permanent umgebildet wird, und dass diese Besiedlung und Umbildung von Kollagenase-Inhibitoren inhibiert wird. Die Umbildung erscheint im Allgemeinen als Kontraktion des Kollagens, wobei diese Kontraktion durch Inhibition der Kollagenase inhibiert wird. Darüber hinaus resultiert die Inhibition von anderen MMPs ebenfalls in der Inhibition der Kontraktion. Die Beobachtung, dass in die Kontraktion des Gewebes MMPs involviert sind, ist insbesondere überraschend, da frühere Untersuchungen gezeigt haben, dass MMPs während der Kontraktion nicht produziert werden, während andere Untersuchungen darauf hingedeutet haben, dass MMPs zwar produziert werden, jedoch in den kontraktiven Prozess nicht verwickelt sind (siehe oben).
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines MMP-Inhibitors für die Herstellung eines Medikaments zur Einschränkung, Verhinderung oder Vorbeugung der Kontraktion eines Bestandteile der extrazellulären Matrix umfassenden natürlichen oder künstlichen Gewebes bereit, insbesondere die Kontraktion, welche aus einem pathologischen Zustand oder einer chirurgischen oder kosmetischen Behandlung resultiert.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Reduktion, Verhinderung oder Vorbeugung der Kontraktion in vitro oder ein Bestandteile der extrazellulären Matrix umfassendes natürliches oder künstliches Gewebe bereit, welches die Verabreichung eines MMP-Inhibitors an das Gewebe während und/oder nach dessen Bildung umfasst. Es sollte eine therapeutisch wirksame Menge des MMP-Inhibitors verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung eines Kollagenase-Inhibitors für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Gewebe, welches Kollagen umfasst, um die Kontraktion des Gewebes, welche aus der Kontraktion des Kollagens resultiert, zu inhibieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin insbesondere die Inhibition der Kontraktion des Gewebes umfassend Kollagen, welche aus der Kontraktion des Kollagens resultiert, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Kollagenase-Inhibitors an das Gewebe. Es sollt eine therapeutisch wirksame Menge des MMP-Inhibitors verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung kann in Verbindung mit einem medizinischen oder einer kosmetischen Behandlung verwendet werden.
Die Erfindung betrifft die Inhibition einer Entstellung, welche durch die Kontraktion von Gewebe umfassend Komponenten der extrazellulären Matrix bewirkt wird, für kosmetische Zwecke, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Matrixmetalloproteinase-Inhibitors an das Gewebe umfasst.
Kosmetische Behandlungen wie die chemische oder physikalische dermale Abschleifung, welche als Anti-Alterungsbehandlungen verwendet werden, bewirken eine Verletzung der Haut. Die Verwendung von MMP-Inhibitoren während des Heilungsprozesses, der nach der anfänglichen Abschürfung auftritt, ist eine kosmetische Verwendung von MMP-Inhibitoren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Verwendung eines MMP-Inhibitors zur Inhibition, d. h. Restriktion, Verhinderung oder Vorbeugung, der Invasion von Zellen, insbesondere Fibroblasten, in Gewebe, welches eine extrazelluläre Matrix umfasst, und/oder die Wanderung von Zellen, insbesondere Fibroblasten, in oder durch Gewebe umfassend eine extrazelluläre Matrix.
Wie vorliegend verwendet, bedeutet der Betrifft "MMP-Inhibitor" jede Substanz, welche fähig ist, die Wirkung einer MMP zu inhibieren, d. h. einzuschränken, zu verhindern oder vorzubeugen. Der Ausdruck "Kollagenase-Inhibitor" wird vorliegend verwendet, um jede Substanz zu beschreiben, die fähig ist, die Wirkung einer Kollagenase zu inhibieren, d.h. einzuschränken, zu verhindern oder vorzubeugen. Ein Kollagenase-Inhibitor kann spezifisch für eine bestimmte Kollagenase sein oder kann einige unterschiedliche Kollagenasen inhibieren. Ein Kollagenase-Inhibitor kann auch andere MMPs inhibieren, wobei er in diesem Fall auch als MMP-Inhibitor definiert werden kann.
Der Ausdruck "Inhibitor" wie vorliegend verwendet umfasst Mittel, die indirekt über die Inhibition der Produktion des entsprechenden Enzyms wirken, beispielsweise ein Antisensemolekül, wie auch Mittel, die direkt durch Inhibition der Enzymaktivität des relevanten Enzyms wirken, wie beispielsweise ein konventioneller Inhibitor.
Ein MMP-, z. B. ein Kollagenase-Inhibitor kann natürlicherweise auftreten oder synthetisch sein. Ein MMP-, z. B. ein Kollagenase-Inhibitor kann ein Anti-MMP, z. B. Anti-Kollagenase-Antikörper sein, der entweder polyklonal oder monoklonal ist. Die inhibitorische Aktivität eines möglichen MMP-Inhibitors kann über jede geeignete Methode bestimmt werden, mit der die inhibitorische Aktivität einer Verbindung hinsichtlich eines Enzyms bestimmt werden kann. Solche Methoden sind in Standardtextbüchern der Biochemie beschrieben. Eine genauere Beschreibung eines MMP-, z. B. Kollagenase-Inhibitors, wird unten geliefert.
Kollagen ist der Hauptbestandteil einer Narbe und anderer kontrahierter Gewebe, und ist als solches die wichtigste Strukturkomponente, die untersucht werden muss. Nichtsdestotrotz umfassen Narben und andere kontrahierte Gewebe andere strukturelle Bestandteile, insbesondere andere extrazelluläre Matrixkomponenten, beispielsweise Elastin, welche ebenso zur Kontraktion des Gewebes beitragen können. MMPs sind in die Synthese und den Abbau von solchen Komponenten verwickelt. Im Allgemeinen wird in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung als MMP-Inhibitor ein Kollagenase-Inhibitor verwendet, es kann jedoch günstig sein, stattdessen einen Inhibitor eines MMPs, welches nicht Kollagenase ist, zu verwenden. Es kann insbesondere vorteilhaft sein, eine Kombination aus einem Kollagenase-Inhibitor und einem oder mehrer Inhibitoren für andere MMPs zu verwenden oder einen Inhibitor zu verwenden, der sowohl Kollagenase als auch mindestens ein oder mehrere MMPs inhibiert.
Der Mechanismus und die Kontrolle der Kontraktion von Geweben, welche Komponenten der extrazellulären Matrix umfassen, beispielsweise Kollagen umfassenden Geweben, ist bisher noch immer wenig verstanden. Ein bestimmtes Ausmaß der Kontraktion scheint Teil des Heilungsprozesses zu sein, aber der Auslöser für die Kontraktion ist nicht bekannt. Die Rolle der MMPs bei der Kontraktion von Geweben, beispielsweise Narbengewebe, und die Verwendbarkeit von MMP-Inhibitoren in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung bei der Inhibition, d. h. der Vorbeugung, Einschränkung und Verhinderung der Kontraktion wurde durch die folgenden experimentellen Daten bestätigt:
Werden Fibroblasten in einem in vitro-Kollagengelmodell der Narbenkontraktion einer Behandlung mit antiproliferativen Mitteln unterworfen, nachdem die Kontraktion aufgetreten ist, findet keine signifikante Ausdehnung des Kollagengels statt, d. h. keine Relaxation der Kontraktion, selbst wenn die Fibroblastzellen getötet wurden, und das stützende Zyklusskelett der Zellen entfernt wurde. Das Umbilden des Kollagens, welches zur Kontraktion führt, scheint daher aus der Aktivität von einem oder mehreren enzymatischen Systemen der Fibroblasten zu resultieren.
Fibroblasten, welche in die Kontraktion von Kollagen involviert sind, stellen größere Mengen an Matrixmetalloproteinase-mRNA und -Proteinen her als Kontrollfibroblasten. Dies geht einher mit einer zellulären Besiedlung des Kollagens. Die Besiedlung des Kollagens und die Kontraktion werden durch die Verwendung von Inhibitoren, welche für die MMPs spezifisch sind, die von den mRNAs kodiert werden, die in den Zellen, die im Gegensatz zu Kontrollzellen mit der Kontraktion zu tun haben, in höheren Spiegeln vorhanden sind, inhibiert:
Die quantitative kompetitive Reserve Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (QCRT-PCR) Technik (Tarnuzzer & Schultz 1994] wurde verwendet, um die Spiegel an MMP mRNA zu untersuchen, welche von menschlichen okularen Fibroblasten in kontrahierenden Kollagen-Typ I-Netzwerken hergestellt wurden, im Vergleich mit menschlichen okularen Fibroblasten in Monolayerkulturen. Es wurde gefunden, dass die Fibroblasten in den Kollagennetzen mehr mRNA für Kollagenase (MMP1), 72kD Gelatinase (MMP2) und Stromelysin (MMP3), aber nicht für die 92kD Gelatinase (MMP9) herstellten, als es die Kontrollzellen in den Monolayerkulturen taten. Es wurde gefunden, dass die Spiegel an mRNA für die MMPs 1, 2 und 3 in den Netzwerken größer war als in den Monolayerkulturen; während des Kontraktionsprozesses teilweise mehr als 100fach höher (siehe Beispiel 4 unten). Eine Gelatinzymographie [Heussen & Dowdle 1980] wurde verwendet, um die Herstellung von gelatinolytischen Komponenten der Zellen zu analysieren und zu vergleichen. Es wurde gefunden, dass die gelatinolytische Aktivität verglichen mit Kontrollen erhöht war. Es scheint daher so zu sein, dass die erhöhte mRNA-Produktion mit einer erhöhten Proteinproduktion einher geht.
Antikörper gegen MMPs 1, 2, 3 und 9 wurden als Kontraktionsinhibitoren getestet. Es wurde gefunden, dass Antikörper gegen die MMPs 1, 2 und 3 eine signifikante Inhibition der Kontraktion der Kollagengele durch menschliche okulare Fibroblasten hervorriefen, dass jedoch der Antikörper gegen MMP9 nicht in einer Inhibition der Kontraktion resultierte.
In der vorliegenden Beschreibung umfasst der Ausdruck "Kontraktion von Kollagen" nicht nur das Schrumpfen von Kollagen, sondern auch jedes Umbauen von Kollagen, das zu einer Kontraktion des das Kollagen enthaltenden Gewebes führt. Er umfasst ebenso Beiträge anderer Bestandteile des Gewebes, insbesondere anderer Bestandteile der extrazellulären Matrix, beispielsweise Elastin.
Wie oben angegeben, kann die Kontraktion von Geweben, die Komponenten der extrazellulären Matrix umfassen, insbesondere von Kollagen umfassenden Geweben, in Verbindung mit vielen unterschiedlichen pathologischen Zuständen und mit chirurgischen und kosmetischen Verfahren auftreten. Die Kontraktur kann physikalische Probleme bewirken, die eine medizinische Behandlung notwendig machen können oder sie kann Probleme rein kosmetischer Natur verursachen. Es ist daher sehr wertvoll, Medikamente zur Verfügung zu haben, die eine solche Kontraktion inhibieren, d. h. einschränken, verhindern oder vorbeugen können. Wichtige Verwendungen für solche Medikamente sind unten beschrieben. Es sollte jedoch klar sein, dass die erfindungsgemäßen Verwendungen nicht auf die Herstellung von für die unten beschriebenen Zustände geeigneten Medikamenten, seien sie medizinisch oder kosmetisch, beschränkt sind. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung für die Herstellung von Medikamenten, welche zur Verwendung in allen Fällen geeignet sind, bei denen die Kontraktion von Gewebe, welches Komponenten der extrazellulären Matrix umfasst, im Wesentlichen aus der Kontraktion des Bestandteils der extrazellulären Matrix resultiert, auftritt oder auftreten kann.
Obwohl die Diskussion unten sich spezifisch auf die Kollagenkontraktion und die Verwendung von Kollagenase-Inhibitoren bezieht, können Breitspektrum-MMP-Inhibitoren und/oder Inhibitoren von MMPs, die nicht Kollagenase sind, für die Inhibition der Kontraktion der Bestandteile des extrazellulären Matrix enthaltenden Gewebes verwendet werden, und die vorliegende Erfindung soll so aufgefasst werden, dass sie die Verwendung von solchen MMP-Inhibitoren als Alternative zur Verwendung von Kollagenase spezifischen Inhibitoren bei der Behandlung von Gewebe umfassend Komponenten der extrazellulären Matrix einschließt. Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls die Verwendung von MMP-Inhibitoren eines breiten Spektrums und/oder Inhibitoren von MMPs, die nicht Kollagenasen sind, zusätzlich zu der Verwendung von Kollagenase-Inhibitoren, beispielsweise bei der Behandlung von Gewebe umfassend extrazelluläre Komponenten und insbesondere Kollagen umfassendes Gewebe, ein.
Die Kontraktion von Kollagen enthaltendem Gewebe, welches auch andere Komponenten der extrazellulären Matrix umfassen kann, tritt häufig bei der Heilung von Verbrennungen auf. Die Verbrennungen können chemische, thermische oder Bestrahlungsverbrennungen sein und können das Auge betreffen, die Oberfläche der Haut oder die Haut und die darunter liegenden Gewebe. Es kann auch der Fall sein, dass innen liegende Gewebe beispielsweise durch Strahlungsbehandlung verbrannt sind. Die Kontraktion von verbrannten Geweben ist oft ein Problem und kann zu physikalischen und/oder kosmetischen Problemen führen, beispielsweise zu einem Verlust der Beweglichkeit und/oder zur Entstellung. Die vorliegende Erfindung umfasst daher die Verwendung von MMP-Inhibitoren, beispielsweise eines Kollagenase-Inhibitors, z. B. in Form eines Medikaments zur Inhibition der Kontraktion von verbrannten Gewebe während der Heilung.
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist die Inhibition der Kontraktion von Hauttransplantaten. Hauttransplantate werden aus einer ganzen Reihe von Gründen verpflanzt und kontrahieren nach der Verpflanzung oft. Wie bei der Heilung von verbrannten Geweben kann die Kontraktion sowohl zu physikalischen als auch kosmetischen Problemen führen. Dies ist ein besonders ernstes Problem, wenn beispielsweise bei schweren Verbrennungswunden viele Hauttransplantate benötigt werden. Ein verwandtes Gebiet, in dem die Medikamente und Verfahren der vorliegenden Erfindung von großer Nützlichkeit sind, ist die Herstellung einer künstlichen Haut. Um eine reine künstliche Haut herzustellen ist es nötig, eine Epidermis zu besitzen, welche von epithelialen Zellen (Keratinocyten) hergestellt wird und eine Dermis, welche aus mit Fibroblasten besiedeltem Kollagen hergestellt wird. Es ist wichtig, über beide Zelltypen zu verfügen, da sie sich gegenseitig unter Verwendung von Wachstumsfaktoren Signale senden und stimulieren. Bis heute war eines der Hauptprobleme, dass der Kollagenanteil der künstlichen Haut sich oft bis auf ein Zehntel seiner ursprünglichen Fläche kontrahierte, wenn er mit Fibroblasten besiedelt wird. MMP-Inhibitoren, beispielsweise Kollagenase-Inhibitoren, können verwendet werden, um die Kontraktion in einem solchen Ausmaß zu inhibieren, dass die künstliche Haut in einer praktikablen Größe erhalten werden kann.
Ein Gebiet von besonderem Interesse ist die Verwendung von MMP, z. B. Kollagenase-Inhibitoren, um die Kontraktur von Narbengeweben, welches aus einer Augenoperation resultiert, zu verhindern oder zu reduzieren. Die Glaukoma-Operation, durch die neue Drainagekanäle eröffnet werden sollen, misslingt wegen des Vernarbens und der Kontraktion von Geweben oft. Ein Verfahren zur Verhinderung der Kontraktion von Narbengewebe, welches im Auge gebildet wird, wie beispielsweise die Gabe eines geeigneten Mittels, wäre daher von unschätzbarem Wert. Ein solches Mittel könnte auch bei der Kontrolle der Kontraktion von Narbengewebe, welches nach einer Verletzung der Cornea oder nach einer Cornea-Operation gebildet wird, beispielsweise nach einer Laserbehandlung oder einer operativen Behandlung der Kurzsichtigkeit oder Refraktionsfehlern, bei denen die Kontraktion von Geweben zu nicht zufrieden stellenden Resultaten führen kann. Es ist ebenso in Fällen nützlich, bei denen ein Narbengewebe auf oder in dem Glaskörper oder der Retina gebildet wird, beispielsweise solches, dass bei manchen Diabetikern unter Umständen Blindheit verursacht und solches, welches nach einer Operation einer Ablösung, einer so genannten proliferativen Vitreoretinopathie, gebildet wird. Andere Verwendungen schließen Fälle ein, bei denen das Narbengewebe in der Augenhöhle oder an Augen- oder Augenlidmuskeln nach der Operation des Schielens, der Augenhöhle oder der Augenlider oder aufgrund der Schilddrüsen-Augenerkrankung gebildet wird, und wo eine Narbenbildung in der Konjunktiva auftritt, wie es nach einer Glaukoma-Operation oder bei der cicatriziellen Erkrankung, bei entzündlichen Erkrankungen wie beispielsweise dem Pemphigoid oder bei einer infektiven Erkrankung wie beispielsweise dem Trachoma der Fall sein kann. Ein weiteres Augenproblem, welches mit der Kontraktion von Kollagen umfassenden Geweben assoziiert ist, für welches die Verfahren und die Medikamente der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, ist die Opakifikation und Kontraktur der Linsenkapsel nach Katarakt Extraktion.
Die cicatrizielle Kontraktion, eine Kontraktion aufgrund des Schrumpfens vom fibrösem Gewebe der Narbe, ist häufig. In manchen Fällen kann die Narbe eine bösartige Cicatrix werden, eine Narbe, bei der die Kontraktion ernsthafte Deformierung verursacht. Der Magen eines Patienten kann durch Kontraktion von Narbengewebe, welches gebildet wird, wenn ein Magengeschwür heilt, effektiv in einer eieruhrförmigen Kontraktur in zwei getrennte Kammern aufgeteilt werden. Der Verschluss von Passagen und Gängen, die cicatrizielle Stenose, kann aufgrund der Kontraktion von Narbengewebe auftreten. Die Kontraktion von Blutgefäßen kann aufgrund eine primären Obstruktion oder aufgrund eines operativen Traumas beispielsweise nach chirurgischen Eingriff oder einer Angioplastie auftreten. Die Stenose von anderen hohlen Viscera, beispielsweise den Harnleitern, kann auch auftreten. Sobald irgendeine Art von Narbenbildung stattfindet, können Probleme auftreten, entweder resultierend aus Unfallwunden als auch aus chirurgischen Wunden. Medikamente, die MMP-Inhibitoren umfassen, z. B. Kollagenase-Inhibitoren , können verwendet werden sobald es wahrscheinlich ist, dass Narbengewebe gebildet wird oder gebildet wurde.
Zustände der Haut oder der Sehen, welche die Kontraktion von kollagenumfassenden Geweben beinhalten, schließen posttraumatische Zustände, die aus Operationen oder Unfällen resultieren, mit ein, beispielsweise Hand- oder Fußsehnenverletzungen, Zustände nach einer Transplantation und pathologische Zustände wie Skleroderma, Dupuytren's Kontraktur und die Epidermolysis bullosa. Eine Narbenbildung und eine Gewebekontraktion im Auge kann bei verschiedenen Zuständen auftreten, beispielsweise als Folge einer Retinaablösung oder der diabetischen Augenerkrankung (wie oben erwähnt). Kontraktionen der Höhlen, welche im Schädel für die Augäpfel gefunden werden und von assoziierten Strukturen einschließlich extraokularer Muskeln und der Augenlider können auftreten, falls eine Verletzung oder eine entzündliche Erkrankung vorliegt. Die Gewebe innerhalb der Höhlen kontrahieren, was eine Reihe von Problemen hervorruft einschließlich des Doppelsehens und eines hässlichen Erscheinungsbilds.
Obwohl die obige Diskussion insbesondere Menschen betrifft, können Tiere doch auch die beschriebenen Zustände oder ähnliche oder analoge Zustände aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft daher in analoger Weise auch Medikamente und Verfahren für die Verwendung in der Veterinärmedizin zur Behandlung und zur Vorsorge bei Tieren und insbesondere zur Verwendung in der Behandlung und Vorsorge von Säugetieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft das Behandeln eines Menschen oder eines anderen Säugetieres zur Inhibition der Kontraktion von einen Bestandteil der extrazellulären Matrix umfassenden Gewebes, insbesondere der Kontraktion, welche mit chemischen Verbrennungen, einer thermischen Verbrennung oder einer Verstrahlungsverbrennung, einer Hauttransplantation, einem posttraumatischen Zustands resultierend aus einer Operation oder einem Unfall, der Glaukomoperation, der Diabetes assoziierten Augenerkrankung, dem Skleroderma, der Dupytren's Kontraktur, der Epidermolysis bullosa oder einer Verletzung der Hand- oder Fußsehne einhergeht, durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines MMP-Inhibitors an den Mensch oder ein anderes Säugetier.
Es scheint, dass MMP-Inhibitoren, z. B. Kollagenase-Inhibitoren, die Kontraktion von Geweben, die extrazelluläre Komponenten, beispielsweise Kollagen, enthalten, und die über Zellen wie Fibroblasten bewirkt wird, inhibieren, sie scheinen jedoch nicht fähig zu sein, eine signifikante Umkehr der Kontraktion zu bewirken. Daher sollte betroffenes Gewebe im Allgemeinen zu dem Zeitpunkt behandelt werden, wenn die Kontraktion stattfindet. Vorzugsweise sollte die Behandlung so früh wie möglich stattfinden, vorzugsweise sobald und insbesondere bevorzugt bevor die ersten Anzeichen einer Kontraktion beobachtet werden. Bei Behandlungen, Zuständen oder Heilungsprozessen, bei denen die Kontraktion eines extrazellulären Bestandteils, z. B. von Kollagen umfassendem Gewebe verbreitet ist, können MMP-Inhibitoren, z. B. Kollagenase-Inhibitoren, als ein routinemäßiges prophylaktisches Mittel verwendet werden, bevor irgendwelche Anzeichen für eine Kontraktion tatsächlich beobachtet werden.
Da eine aktive Kontraktion mit einer aktiven Produktion von MMPs einherzugehen scheint, sollte die Behandlung, die verwendet wird, um die Kontraktion zu verhindern, mindestens über die Zeitdauer fortgeführt werden, während derer es wahrscheinlich ist, dass eine Kontraktion auftritt. Dies kann sehr oft eine längere Zeitdauer sein, beispielsweise mehrere Jahre oder sogar länger.
Die Kontraktion kann sogar noch auftreten nachdem eine anfänglich offene Wunde geheilt zu sein scheint, beispielsweise bei Patienten mit Verbrennungen. Auch Zustände wie die Handsehnenkontraktion umfassen eine Kontraktion, selbst wenn hier nicht einmal eine Wunde vorhanden ist.
Wie oben betont, umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung von MMP-Inhibitoren, insbesondere Kollagenase-Inhibitoren.
Sowohl natürliche als auch synthetische MMP-Inhibitoren (Inhibitoren der Enzymaktivität) einschließlich Kollagenase-Inhibitoren sind bekannt. Natürlich auftretende MMP-Inhibitoren umfassen α₂-Macroglobulin, welches der Haupt-Kollagenase-Inhibitor ist, der im menschlichen Blut gefunden wird [Eisen et al. 1970]. Natürlicherweise auftretende MMP-Inhibitoren werden ebenfalls in Geweben gefunden. Das Auftreten von Gewebe-Inhibitoren von MMPs wurde in einer Reihe von Explantaten und in Monolayerkulturen von Gewebszellen aus Säugern beobachtet [Vater et al. 1979 und Stricklin und Wegus 1983]. Es werden nicht nur Kollagenase-Inhibitoren, sondern auch Inhibitoren anderer MMPs wie beispielsweise Gelatinase und Proteoglycanase gefunden. Im Allgemeinen sind MMP-Inhibitoren nicht fähig, die inaktiven (Zymogen) Formen des entsprechenden Enzyms zu binden, bilden jedoch schnell Komplexe mit den aktiven Formen [Murphy et al. 1981]. Gewebe-MMP-Inhibitoren werden beispielweise in dermalen Fibroblasten, menschlicher Lunge, Zahnfleisch, Sehnen und Cornea-Fibroblasten, menschlichen Osteoblasten, glatten Muskelzellen aus dem Uterus, in alveolaren Makrophagen, in der Amnionflüssigkeit, Plasma, Serum und den α-Granula von humanen Plättchen gefunden [Stricklin und Wegus 1983; Welgus et al. 1985; Welgus und Stricklin 1983; Bar-Sharvit et al. 1985; Wooley et al.; 1976; und Cooper et al. 1985].
Synthetische Kollagenase-Inhibitoren und Inhibitoren für andere MMPs wurden und werden entwickelt. Verbindungen wie EDTA, Cystein, Tetracyklin und Ascorbat sind Inhibitoren von Kollagenase, sind jedoch relativ unspezifisch. Wie oben angegeben, werden in der Literatur synthetische Inhibitoren, die eine definierte Spezifität für MMPs-, einschließlich Kollagenase-Inhibitoren, aufweisen beschrieben. Beispielsweise beschreiben di U.S.-Patentbeschreibungen mit den Nrn. 5,183,900, 5,189,178 und 5,114,953 die Synthese von N-[2(R)-2-(Hydroxamidocarbonylmethyl)-4-Methylpentanoyl]-L-Tryptophanmethylamid, ebenso als GM6001 oder Galardin (Handelsname) bekannt, und von anderen MMP-Inhibitoren. Andere auf Hydroxamsäure basierende Kollagenase- Inhibitoren sind in WO 90/05716, WO 90/05719 und WO 92/13831 offenbart. Weitere bereits entwickelte synthetische MMP-Inhibitoren und insbesondere Kollagenase-Inhibitoren umfassen solche, wie sie in EP-A-126,974 und EP-A-159,396 sowie in den U.S.-Patentbeschreibungen mit den Nrn. 4,599,361 und 4,743,587 beschrieben sind. Ein weiterer Inhibitor ist BB-94, ebenso bekannt als Batimastat (British Bio-technology Ltd.), siehe beispielsweise EP-A-276436. Bezüglich [4-(N-Hydroxyamino)-2R-Isobutyl-3S-(Thio-Phenyl-Thiomethyl)Succinyl]-L-Phenylalanine-N-Methylamide (besonders gut) und [4-(N-Hydroxyamino)-2R-Isobutyl-3S-(Thiomethyl)Succinyl)-L-Phenylalanine-N-Methylamid wird in WO 90105719 offenbart, dass diese besonders starke Kollagenase inhibierende Eigenschaften aufweist, und dito in WO 90/05716 [4-(N-Hydroxyamino)-2R-Isobutylsuccinyl)-L-Phenylalanine-N-(3-Aminomethylpyridine)Amid und [4-N-Hydroxyamino)-2R-Isobutyl-3S-Methylsuccinyl]-L-Phenylalanine-N-[4-(2-Aminoethyl)-Morpholino]Amid.
Wie oben ausgeführt, können sich die Eigenschaften von natürlichen und synthetischen Kollagen-Inhibitoren unterscheiden. Individuelle Inhibitoren weisen oft unterschiedliche Spezifitäten und Wirkungsgrade auf. Manche Inhibitoren sind reversibel, andere irreversibel. Im Allgemeinen ist es besser je stärker die inhibitorischen Wirkungen eines Inhibitors auf eine Kollagenase sind. Bei manchen Anwendungen kann ein Inhibitor, welcher für eine bestimmte Kollagenase spezifisch ist, erforderlich sein, aber im Allgemeinen wird ein Breitspektrum MMP-Inhibitor, beispielsweise GM6001 (Galardin (Handelsname)) bevorzugt.
GM6001 (Garlardin (Handelsname)) ist ein sehr potenter MMP-Inhibitor, welcher gegen Kollagenase wirkt. Es hat folgende Struktur
Eine detaillierte Darstellung seiner Fähigkeit, Kollagenase aus menschlichen Hautfibroblasten, Thermolysin und die Pseudomonas aeruginosa-Elastase zu inhibieren ist in Grobelny et al., 1992, dargestellt. Seine Inhibitionskonstanten mit drei Arten von MMPs werden wie folgt berechnet:

Kollagenase ki = 0,4 nmol/l

Gelatinase ki = 0,4 nmol/l

Stromelysin ki = 20 nmol/l
Für die erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugte MMP-Inhibitoren umfassen GM6001 (Galardin) und die oben beschriebenen und Bezug genommenen synthetischen Inhibitoren. Bevorzugte Inhibitoren umfassen Peptidhydroxansäwen oder pharmazeutisch annehmbare Derivate hiervon. Insbesondere bevorzugt sind Verbindungen wie sie in den U.S.-Patentbeschreibungen Nr. 5,189,178; Nr. 5,183,900 oder Nr. 5,114,953 beschrieben und beansprucht sind und die Kollagenase-Inhibitoren sind. Diejenigen mit niedrigen Ki-Werten, d. h. mit hohem pKi-Werten, werden im Allgemeinen bevorzugt. GM6001 (Galardin (Handelsname)) ist ein MMP-Inhibitor, der besonders bevorzugt ist, da er eine der stärksten Kollagenase-Inhibitoren ist, die zurzeit bekannt sind. Für bestimmte Anwendungen kann es jedoch bevorzugt sein, einen etwas weniger starken (schwächeren) Inhibitor zu verwenden.
Der zur erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugte Breitspektrum-MMP-Inhibitor ist GM6001 (Galardin (Handelsname)). Dieser kann nicht nur die Wirkung von Kollagenase, sondern auch von anderen MMPs inhibieren.
Ebenso bevorzugt sind Inhibitoren die wirksam sind, MMPs 1, 2 und 3 (Kollagenase, 72 kD Gelatinase bzw. Stromelysin) zu inhibieren. Diese können individuell oder in Kombination verwendet werden.
Wie oben ausgeführt, kann ein polyklonaler oder monoklonaler Anti-MMP-Antikörper, insbesondere ein Anti-Kollagenase-Antikörper als ein Inhibitor verwendet werden. Ein MMP-Antigen kann in Immunisierungsprotokollen verwendet werden, um für dieses Enzym immunospezifische polyklonale Antiseren zu erhalten. Das Antigen kann ein Hapten sein, welches aus einer MMP erhalten wird, insbesondere aus der Gegend des aktiven Zentrums oder es kann ein MMP vollständiger Länge oder ein Fragment hiervon sein. Unter Verwendung von Standardprotokollen und Säugetieren, wie Kaninchen oder Mäusen, können polyklonale Antikörper erhalten werden. Solche können dann als Inhibitoren verwendet werden. Monoklonale Antikörper können entsprechend Standardverfahren beispielsweise unter Verwendung eines geeigneten MMP-Antigens, beispielsweise einem Kollagenase-Antigen, hergestellt werden.
Antikörper, die für eine ausgewählte MMP spezifisch sind, können hergestellt werden und die Verwendung solcher spezifischer Inhibitoren kann unter bestimmten Umständen bevorzugt sein. Beispielsweise kann ein Antikörper gegen MMP1, MMP2 oder MMP3 (Kollagenase, 72 kD Gelatinase bzw. Stromelysin) oder ein Gemisch aus zwei oder mehr dieser Antikörper verwendet werden.
Ein alternatives Verfahren zur Inhibition der Wirkung einer MMP ist es, die Menge der MMP zu reduzieren, indem deren Produktion verhindert wird. Ein Verfahren, die Proteinproduktion zu verhindern, ist die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuremolekülen. Ein Antisensemolekül muss nicht lang sein; oft sind 20 Basenpaare ausreichend. Falls das Molekül klein ist, sollte es in die Zellen ohne weitere Hilfe eindringen können, es können jedoch falls nötig Liposome verwendet werden, um den Zelleintritt zu erleichtern. Normalerweise wird ein Antisensemolekül so ausgestaltet sein, dass es sich an die MMP mRNA anheftet, es kann jedoch auch so ausgestaltet sein, dass es sich an die entsprechende DNA während der Replikation und der Transkription anheftet.
Obwohl Antikörper normalerweise an Proteine binden ist es möglich, Antikörper herzustellen, die Nukleinsäuren binden. Entsprechend kann als ein Inhibitor entsprechend der vorliegenden Erfindung ein Antikörper verwendet werden, der an die mRNA oder die DNA der ausgewählten MMPs bindet und so die Produktion der MMP verhindert.
Die Inhibition über die Reduzierung der Produktion einer MMP bietet den Vorteil, dass es möglich sein sollte, eine geringere Menge an Inhibitor zu verwenden, als es für die direkte Inhibition der MMP-Enzymaktivität benötigt würde, da jedes MMP mRNA Molekül und die MMP DNA für die Produktion von vielen MMP-Enzymmolekülen verantwortlich ist.
Inhibitoren die erfindungsgemäß verwendet werden sollen, müssen in Konzentrationen und Dosierungen verwendbar sein, die hoch genug sind, eine adäquate Inhibition zu ergeben, ohne auf die Zellen mit denen sie in Berührung kommen, toxisch zu wirken.
Zur Behandlung von bestimmten Zuständen kann es bevorzugt sein, ein Medikament zu verwenden, welches einen Kollagenase-Inhibitor und mindestens einen weiteren Enzyminhibitor enthält. Dieser zusätzliche Inhibitor kann auch Kollagenase inhibitorische Eigenschaften aufweisen und/oder er kann inhibitorische Eigenschaften für ein unterschiedliches Enzym, beispielsweise für eine unterschiedliche MMP aufweisen. Werden zwei oder mehr Inhibitoren verwendet, weist der zweite und jeder zusätzliche Inhibitor vorzugsweise inhibitorische Eigenschaften für ein Enzym das nicht Kollagenase ist, auf. Zusätzlich Inhibitoren können beispielsweise Inhibitoren anderer MMPs wie Gelatinase oder Stromelysin oder Inhibitoren von anderen Enzymen, welche Gewebe abbauen wie Serinproteasen sein, beispielsweise kann ein Serinproteinase-Inhibitor wie Aprotinin verwendet werden.
In der Umgebung von Kollagen umfassendem Gewebe können Cytokine wie beispielsweise Interleukin-1 die Kollagenaseproduktion stimulieren und es kann daher auch bevorzugt sein, einen Cytokin-Inhibitor bei der Herstellung der Medikamente oder in erfindungsgemäßen Behandlungsverfahren zu verwenden.
Erfindungsgemäße Medikamente werden im Allgemeinen in einer pharmazeutischen Zubereitung dargeboten, welche für die topische Verabreichung beispielsweise als Emulsion, Suspension, Creme, Lotion, Salbe, Tropfen, Schaum oder Gel geeignet ist. Solche Zubereitungen sind im Allgemeinen konventionelle Formulierungen, wie sie beispielsweise in Standardtextbüchern der Pharmazie wie der britischen Pharmacopeia beschrieben sind. Andere geeignete pharmazeutische Formen für die topische Verabreichung schließen trockene Pulver, Aerosole und Sprays ein, welche für die Applikation an Wunden besonders geeignet sein können. Weitere geeignete pharmazeutische Zubereitungen umfassen solche, die für die Verabreichung per Injektion oder Infusion geeignet sind, beispielsweise sterile parenterale Lösungen oder Suspensionen, insbesondere für die direkte Verabreichung in oder in das Gebiet der extrazellulären Matrixkomponente, z. B. das Kollagen umfassende Gewebe, beispielsweise über subkonjunktivale, subkutane, interpertioneale oder intraperitoneale Injektion und ebenso Systeme für die verzögerte Freisetzung wie beispielsweise Liposom-Systeme.
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung, die im Gegensatz zu einer Zubereitung, die für die Anwendung im Auge geeignet ist, für die Anwendung an einer Wunde (einschließlich eines Geschwürs, einer Verbrennung oder eines Hauttransplantats geeignet ist, umfassend einen Matrixmetalloproteinase-Inhibitor, vorteilhaft liegt die Zubereitung in Form einer Lösung, einer Suspension, einer Creme, einer Salbe oder eines Gels vor, worin der MMP-Inhibitor in einer Konzentration von 0,4 μg/ml bis 400 μg/ml vorliegt. Der MMP-Inhibitor ist vorzugsweise ein Kollagenase-Inhibitor.
Orale Formulierungen können ebenso verwendet werden. Diese können in Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern, Granulat, Tabletten oder flüssigen oder gelförmigen Zubereitungen vorliegen. Die Tabletten können über in der normalen pharmazeutischen Übung bekannte Verfahren beschichtet werden. Flüssige Formulierungen umfassen Sirupe. Orale Formulierungen können verwendet werden, um direkt Zustände wie Magengeschwüre behandeln zu können und können auch verwendet werden, um Zustände systemisch zu behandeln.
Der (die) Inhibitor(en) kann in einem Verdünnungsmittel oder Träger gelöst oder dispergiert vorliegen. Die Wahl des Trägers hängt von der Natur des Inhibitors, dessen Löslichkeit und anderen physikalischen Eigenschaften ab und von dem Verfahren und dem Ort der Anwendung. Beispielsweise sind nur bestimmte Trägermittel geeignet für Zubereitungen zur Verwendung im Auge.
Trägermittel umfassen Ethylenglykol, Silbersulphadiazincreme und Hypromellose. Diese können in Cremes und Tropfen verwendet werden. Ein Azetatpuffersystem kann ebenfalls verwendet werden. Weitere pharmazeutisch geeignete Materialien, die in pharmazeutische Zubereitungen eingebaut werden können, schließen Absorptionsverstärkungsmittel, pH-Regulatoren und -Puffer, Osmolaritätsregulatoren, Emollientien, Dispergiermittel, Befeuchtungsmittel, oberflächenaktive Agenzien, Verdickungsmittel, Mittel für die Opakifikation, Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel und Antioxidantien, Aufschäummittel und Flockungsmittel, Schmiermittel, farbgebende Mittel und Düfte (im Allgemeinen nur in kosmetischen Zubereitungen) ein.
Gele und Liposomen können die bevorzugte Verabreichungsmethode sein, wenn der Inhibitor ein Antisensemolekül ist.
Ein erfindungsgemäßes Medikament wird vorzugsweise direkt auf eine offene Wunde appliziert oder wird direkt an die Stelle der Gewebekontraktion injiziert. Geeignete Medikamente können jedoch auch auf der Hautoberfläche angewendet werden, falls das zu behandelnde Gewebe unter diese Oberfläche liegt, wobei das aktive Mittel von der Haut absorbiert wird und diese durchdringt. Penetrationsverstärkungsmittel sind bei solchen Medikamenten vorzugsweise mit aufgenommen.
Erfindungsgemäße Medikamente, welche MMP-Inhibitoren wie beispielsweise Kollagenase-Inhibitoren für die Verwendung bei der Inhibition der Kontraktion von Geweben, welche Komponenten der extrazellulären Matrix umfassen, beispielsweise Kollagen umfassende Gewebe, umfassen, können weitere pharmazeutische Bestandteile enthalten, beispielsweise Antibiotika, Antipilzmittel, Steroide und weitere Enzyminhibitoren, wie beispielsweise Serinprotease-Inhibitoren (wie oben beschrieben). Weitere Bestandteile für bestimmte Indikationen umfassen Wachstums- oder Heilungsförderungsmittel wie den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibronektin und Aprotinin. Wie oben erwähnt, können auch Cytokin-Inhibitoren eingeschlossen sein.
Die Inhibitoren können in flüssigen und anderen nicht festen Formulierungen in Konzentrationen von um 0,4 bis 400 μg/ml verwendet werden. In manchen Fällen können jedoch höhere Konzentrationen erforderlich sein. Die verwendete Gesamtmenge und die verabreichte Dosis werden von der Schwere und der Fläche der Kontraktion abhängen, der sie verursachenden Krankheit und den physischen Eigenschaften des Patients und dem Ort und dem Verfahren der Verabreichung.
Die folgenden nicht begrenzenden Beispiele illustrieren die Erfindung. Die Beispiele betreffen Experimente die in vitro aufgeführt wurden; die Lehren daraus sind jedoch direkt in vivio anwendbar, beispielsweise auf die Behandlung von Menschen und Säugetieren z. B. wie in der Beschreibung beschrieben.
Die Beispiele illustrieren die Verwendung von MMP-Inhibitoren in in-vitro-Modellen der Narbenkontraktion und von künstlicher Haut. Sie umfassen ebenso Experimente, welche das Fehlen der Toxizität der MMP-Inhibitoren auf Zellen und deren Wirkung auf die Zellmorphologie illustrieren. Weitere Experimente untersuchen den Spiegel an ausgewählter MMP mRNA und von ausgewählten MMPs, die in den Zellen während der Kontraktion vorhanden sind.
1 ist eine diagrammatische Darstellung der Resultate der in Beispiel 1 beschriebenen Experimente. Es ist ein Graph, der die Fläche an mit Fibroblasten bewachsenem Kollagengel über die Zeit für eine Reihe von verschiedenen Kulturbedingungen zeigt.
2 ist ein diagrammatische Darstellung der Resultate der in Beispiel 2 beschriebenen Experimente. Es ist ein Histogramm, welches die Zählimpulse Strahlung pro Minute zeigt, welche von Zellen emittiert werden, die unter einer Reihe von unterschiedlichen Bedingungen kultiviert wurden.
3A ist eine diagrammatische Darstellung der Resultate der in Beispiel 3(a) beschriebenen Experimente. Es ist ein Graph, welcher die durchschnittliche Netzfläche an mit Fibroblasten bewachsenen Kollagengelen über die Zeit für verschiedene Kulturbedingungen zeigt.
3B ist eine diagrammatische Darstellung der Resultate der in Beispiel 3(a) beschriebenen Experimente. Es ist ein Graph, der die mittlere Netzfläche an mit Fibroblasten bewachsenen Kollagengelen über die Zeit für verschiedene Kulturbedingungen zeigt.
3C ist eine diagrammatische Darstellung der in Beispiel 3(b) beschriebenen Experimente. Es ist ein Graph, welcher die mittlere Netzfläche an mit Fibroblasten bewachsenen Kollagengelen über die Zeit für verschiedene Kulturbedingungen zeigt.
3D ist eine diagrammatische Darstellung der in Beispiel 3(c) beschriebenen Experimente. Es ist ein Graph, welcher die mittlere Netzfläche an mit Fibroblasten bewachsenen Kollagengelen über die Zeit für verschiedene Kulturbedingungen zeigt.
3E ist eine diagrammatische Darstellung der in Beispiel 3(c) beschriebenen Experimente. Es ist ein Graph, welcher die mittlere Anzahl von Zellen pro Vertiefung über die Zeit unter einer Reihe von verschiedenen Kulturbedingungen zeigt.
3F ist eine diagrammatische Darstellung der Resultate der in Beispiel 3(c) beschriebenen Experimente. Es ist ein Graph, welcher den Prozentsatz an lebenden Zellen über die Zeit unter einer Reihe von verschiedenen Kulturbedingungen zeigt.
3G ist eine diagrammatische Darstellung der Resultate der in Beispiel 3(d) beschriebenen Experimente. Es ist ein Graph, welcher die mittlere Netzfläche an mit Fibroblasten bewachsenen Kollagengelen über die Zeit für verschiedene Kulturbedingungen zeigt.
3H ist eine diagrammatische Darstellung der in Beispiel 3(c) beschriebenen Experimente. Es ist ein Graph, welcher die mittlere Netzfläche an mit Fibroblasten bewachsenen Kollagengelen über die Zeit für verschiedene Kulturbedingungen zeigt.
4A ist eine diagrammatische Darstellung der Resultate der in Beispiel 5(i) beschriebenen Experimente. Es ist ein Graph, welcher die mittlere Netzfläche an Fibroblasten bewachsenen Kollagengelen über die Zeit unter zwei verschiedenen Kulturbedingungen zeigt.
4B ist eine diagrammatische Darstellung der Resultate der in Beispiel 5(ii) beschriebenen Experimente. Es ist ein Graph, welcher die mittlere Netzfläche an mit Fibroblasten bewachsenen Kollagengelen über die Zeit unter zwei verschiedenen Kulturbedingungen zeigt.
4C ist eine diagrammatische Darstellung der Resultate der in Beispiel 5(iii) beschriebenen Experimente. Es ist ein Graph, welcher die mittlere Netzfläche mit Fibroblasten bewachsenen Kollagengelen über die Zeit unter zwei verschiedenen Kulturbedingungen zeigt.
5 ist eine diagrammatische Darstellung der Resultate der in Beispiel 6 beschriebenen Experimente. Es ist ein Graph, welcher die mittlere Netzfläche mit Fibroblasten bewachsenen Kollagengelen über die Zeit unter zwei verschiedenen Kulturbedingungen zeigt.
6 ist die Reproduktion eines Fotos, welches die Resultate der in Beispiel 4 beschriebenen Gelatinzymographie Analyse zeigt.
Die 8A und 8B sind jeweils die Reproduktion einer Fotographie eines Kollagengels, welches mit Fibroblasten bewachsen ist und welches den Grad an Kontraktion wie in Beispiel 8 beschrieben zeigt. 8A zeigt ein Kontrollgel und 8B zeigt ein Gel, welches mit Inhibitor behandelt wurde.
9A und 9B sind jeweils eine Reproduktion einer Fotografie eines Kollagengels, welches mit Fibroblasten bewachsen ist und die Entwicklung von Actinstressfasern auf der Oberfläche der Zellen wie in Beispiel 8 beschrieben zeigt. 9A zeigt ein Kontrollgel und 9B zeigt ein Gel, welches mit Inhibitor behandelt wurde.
10A und 10B sind jeweils eine Reproduktion einer Fotografie von Fibroblasten, die in Monolayer-Kulturen wachsen und die Gegenwart von Stressfasern wie in Beispiel 8 beschrieben zeigen. 10A zeigt ein Kontrollgel und 10B zeigt eine Monolayer-Kultur, die mit Inhibitor behandelt wurde.
11A und 11B sind jeweils eine Reproduktion einer Fotografie eines Kollagengels, welches mit Fibroblasten bewachsen ist, und welches zelluläre Anhaftungen wie in Beispiel 8 beschrieben zeigt. 11A zeigt ein Kontrollgel und 11B zeigt ein Gel, welches mit Inhibitor behandelt wurde.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung von Materialien
(a) Kollagenlösungen
Lösungen an Typ1-Kollagen wurden durch Lösen von 100 mg Kollagen in 20 ml 0,1 % (v/v) Eisessig in destilliertem Wasser hergestellt. Das Kollagen war Sigma Typ1-Kollagen und wurde über das Verfahren von Bornstein MB Lab Invest 7134 1958 hergestellt.
(b) Konzentriertes Kulturmedium
Ein konzentriertes Gewebe-Kulturmedium wurde durch Mischen der folgenden Bestandteile hergestellt:

35 ml destilliertes Wasser
15 ml 10x MEM (Eagle's minimal essentielles Medium)
1,5 ml Glutamin
1,5 ml Fungizon (Amphotericin B 250μg/ml Wasser)
1,5 ml 10.000 Einheiten Penicillin/10mg Streptomycin pro ml Lösung (Lösungsmittel ist Wasser)
4 ml 7,5 % (Gew./v) Natriumbikarbonatlösung

Lösungen von 4,9 ml des konzentrierten Kulturmediums in 180 μl einer 0,1 M Natriumhydroxidlösung wurden für die Herstellung von Kollagengelen verwendet.
(c) Kollagenase-Inhibitorlösungen und Kontrolllösungen
Lösungen mit drei unterschiedlichen Kollagenase-Inhibitorkonzentrationen (400, 40 und 4 μg/ml), eine Pufferlösung (Kontrolle 1) und eine normale Wachstumsmediumlösung (Kontrolle 2) wurden wie unten beschrieben hergestellt. Der verwendete Kollagenase-Inhibitor war GM6001 (Galardin (Handelsname)).
50 μl Eisessig wurde zu 11 mg Kollagenase-Inhibitor zugefügt und der Inhibitor zur Lösung gebracht. Der pH von 24,875 ml serumfreien, mit HEPES (N-[2-Hydroxyethylpiperazin-N'-[2-Ethansulfonsäure]) gepuffertem DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagles's Medium) wurde auf pH 8 unter Verwendung von steriler 1M Natriumhydroxidlösung eingestellt, und das Aliquot wurde dann zu der Inhibitorlösung hinzugefügt. Die resultierende Lösung wies eine Inhibitorkonzentration von 400 μg/ml auf.
Die 400 μg/ml Lösung wurde seriell mit serumfreiem HEPES-DMEM verdünnt, woraus Lösungen erhalten wurden, die den Kollagenase-Inhibitor in Konzentrationen von 40 und 4 μg/ml enthielten.
Die Lösung all dieser drei Konzentrationen wurden dann mit 10 % (v/v) neugeborenem Kälberserum supplementiert.
Die Pufferlösung (Kontrolle1) wurde durch Hinzufügen von 50 μl Eisessig zu einem 24,875 ml Aliquot von serum-freiem, mit HEPES gepuffertem DMEM pH 8 (pH eingestellt mit steriler 1M Natriumhydroxidlösung wie oben) hergestellt, und dann wurde der pH mit 1M steriler Natriumhydroxidlösung auf 7,4 neu eingestellt und schlussendlich mit 10 % (v/v) neugeborenem Kälberserum (NCS) supplementiert.
Die normale Wachstumsmediumlösung (Kontrolle 2) wurde durch Supplementieren eines Aliquots von serum-freien, mit HEPES gepuffertem DMEM mit 10 % (v/v) neugeborenem Kälberserum hergestellt.
Der pH-Wert und die Osmolarität der Test- und der Kontrolllösungen wurden gemessen, siehe Tabelle 1, Behandlung von Gelen mit Testlösungen.
(d) Zellkulturen
Kulturen von humanen okularen Fibroblasten wurden auf normale Art kultiviert (siehe Khaw P.T. et al 1992 für die Kultivierungsmethode), bis die Monolayer (einzelne Schichten von Zellen auf einer Plastikkulturschale, nicht in eine Matrix eingebettet) gerade subkonfluent waren. Sie wurden dann über Trypsinierung von ihrem Substrat abgelöst und mittels Zentrifugation bei 3000 × g 8 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 1,1 ml neugeborenem Kälberserum resuspendiert. 100 μl der Suspension wurden entfernt und in einer Coulter Zählvorrichtung (Modell ZF) gezählt.
(e) Kollagengele
Jedes Kollagengel besaß ein Endvolumen von 1,1 ml bestehend aus 0,6 ml einer Lösung von Typ 1 Kollagen erhalten nach (a) oben, 0,35 ml des konzentrierten Kulturmediums hergestellt nach (b), und 0,15 ml der Zellsuspension enthaltend 100.000 Zellen hergestellt wie in (d) oben beschrieben.
Gele in dreifacher Ausführung wurden hergestellt durch Hinzufügen von 1,05 ml des konzentrierten Mediums zu 1,8 ml der Typ 1 Kollagenlösung, schnellem Mischen und nachfolgendem Hinzufügen von 0,45 ml der Zellsuspension enthaltend 300.000 Zellen und schnellem Mischen.
1 ml Aliquots dieses Gels wurde dann zu Petrischalen (Fläche = 8 cm2) hinzugefügt und die Schalen wurden dann rotiert, so dass die Gele sich gleichförmig über die Fläche der Schalen verteilten. Die Gele wurden dann bei 37 °C in 5 % CO2 in Luft inkubiert, bis sie sich verfestigt hatten (normalerweise 3 bis 5 Minuten). Ein Teil des Gels wurde dann von der Ecke einer jeden Petrischale abgelöst und 3 ml normale Wachstumsmediumslösung (Kontrolle 2), Inhibitortestlösung oder Pufferlösung (Kontrolle 1) wurden hinzugefügt. Jedes Gel wurde dann vollständig von den Ecken und der Fläche der Petrischale abgelöst, so dass freischwimmende Gele erhalten wurden.
Behandlung der Gele mit Testlösungen
Die Gele wurden nach der Verfestigung 24 Stunden mit 3 ml einer der folgenden Testlösungen behandelt:
Tabelle 1
Die Test- und die Kontrolllösungen wurden durch 3 ml der entsprechenden frischen Lösung nach 24 Stunden ersetzt. Fotografien der Gele wurden an den Tagen 1 und 2 aufgenommen und dann digitalisiert. Die resultierenden Daten wurden mit Hilfe eines Computers verarbeitet und die Gelflächen wurden errechnet. Von der Oberseite und der Mitte eines jeden Gels wurden nach 1 bzw. 2 Tagen Phasenkontrastfotografien aufgenommen.
Resultate
Die bei den Kollagengelen über die zwei Tage Testperiode beobachteten Oberflächenänderungen sind 1 gezeigt. (In 1 mcg steht für Mikrogramm.) Aus den Resultaten wird klar, dass alle Kollagenase-Inhibitorlösungen die Kontraktion der Kollagengele inhibierten verglichen mit der Pufferlösung (Kontrolle 1) und der normalen Wachstumsmediumlösung (Kontrolle 2). Das beobachtete Ausmaß der Inhibition war dosisabhängig; die Lösung mit der höchsten Inhibitorkonzentration zeigte die stärkste Inhibition der Gelkontraktion. Die Pufferlösung (Kontrolle 1) zeigte auch ein gewisses Ausmaß an Inhibition im Vergleich mit der normalen Mediumslösung (Kontrolle 2), dieser Effekt war jedoch verglichen mit der Wirkung, die von der gepufferten Kollagenase-Inhibitorlösung sogar der geringsten Konzentration gezeigt wurde, nicht signifikant. Am Ende der Tests lebten die Zellen in den Kollagengelen noch und die Phasenkontrastmikroskopie zeigte, dass sie teilungsfähig zu sein schienen.
Diskussion
Es erscheint so zu sein, dass MMPs in die Fibroblasten vermittelte Kontraktion von Kollagen involviert sind, und dass die Verwendung eines Inhibitors die Kontraktion beschränken kann, ohne die Zellen abzutöten. Außerdem ist das Ausmaß der Inhibition dosisabhängig.
Beispiel 2
Die Toxizität von GM6001 (Galardin(Handelsname)) und eines zweiten Kollagenase-Inhibitors GM1489 (ein Derivat von GM6001) auf Fibroblasten wurde in verschiedenen Konzentrationen untersucht.
Die Toxizität von den Inhibitoren wurde durch Messen der DANN-Synthese über den Einbau von mit Tritium markiertem Thymidin untersucht. Der Test wurde angepasst ausgehend von einem vorher beschriebenen Verfahren Woost, P.G. et al 1992.
Humane okulare Fibroblasten (Sehnenkapsel-Fibroblasten) wurden in Trimix Zellkulturmedium (DMEM/F-10/M-199) (erhältlich von GIBCO/BRL) und supplementiert mit 10 % Rinderkälberserum kultiviert und bis zur Konfluenz in T-75 Gewebekulturflaschen kultiviert. (Das sind Flaschen mit einer Oberfläche von 75 cm2.) Die Zellen wurden aufgeteilt und in 24 Wellplatten in einer Dichte von 1×104/Well in 1,0 ml Medium mit 10 % Rinderkälberserum ausgesät. Die Zellen wurden für 24–36 Stunden inkubiert bis sie eine 60–70 %ige Konfluenz erreicht hatten. Das Medium wurde dann mit serum-freiem Trimix ersetzt, und die Zellen wurden weitere 24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann in Quadruplikat-wells 24 Stunden mit 1,0 μCi/Well 3H-Thymidin unter den folgenden Bedingungen inkubiert: serum-freies Medium (Trimix), Medium mit 10 % Serum, Medium mit 10 % Serum und Vehikel, alleine oder mit den Inhibitoren. Das Vehikel war gepufferte Acetatlösung. Die Lösungen umfassend Medium mit 10 % Serum und Vehikel, entweder alleine oder mit Inhibitoren, wurden nach dem Verfahren wie es in Beispiel 1, Abschnitt (c), oben, beschrieben ist, hergestellt unter Verwendung von Trimix anstelle von mit HEPES gepuffertem DMEM. Die Inhibitoren GM6001 und GM 1489 wurden jeweils in Konzentrationen von 80,0, 8,0 und 0,8 μg/ml getestet. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Wells dreimal mit PBS gewaschen und mit 12,5 % TCA 10 Minuten fixiert gefolgt von Methanol 10 Minuten. Die Platten wurden an der Luft getrocknet und die Zellen in 1,0 ml 0,2 N NAOH bei 37°C eine Stunde solubilisiert. Die Radioaktivität wurde durch Flüssig-Szintillationszählung 900 ml der solubilisierten Zellen bestimmt. Die Experimente zeigen, dass bei keiner der getesteten Konzentrationen eine signifikante Toxizität vorkommt. Die Resultat sind in 2 gezeigt. In 2 steht SF1 und SF2 für serum-freies Medium, 10 % für Medium plus 10 % Serum, V1 und V2 für Medium plus 10% Serum und Vehikel und die anderen Resultate sind für die Inhibitorlösungen (umfassend ebenso Medium plus 10 % Serum und Vehikel).
2 zeigt den Thymidineinbau der okularen Fibroblasten bei unterschiedlichen Konzentrationen jeden Kollagenaseinhibitors.
Diskussion
Es wird klar, dass selbst mit den höchsten Konzentrationen der Inhibitoren keine signifikante Reduktion im Thymidineinbau stattfand. Dies zeigt, dass die Reduktion der Kollagenkontraktion, die unter Verwendung von Kollagenaseinhibitoren gefunden wurde nicht aufgrund der Inhibition einer Zellproliferation auftrat.
In den folgenden Beispielen werden Verfahren und Materialien verwendet, die im Wesentlichen gleich sind zu denen, die in Beispiel 1 beschrieben sind, außer wenn dies anders angegeben ist.
Beispiel 3
Dieses Experiment wurde ausgestaltet, um die Wirkung der folgenden MMP-Inhibitoren zu untersuchen: Galardin, BB-94 und Antikörper gegen die MMPs 1, 2 3 und 9, auf okulare Fibroblasten vermittels der Kollagenkontraktion.
Die Herstellung der Materialien war wie für Beispiel 1 oben beschrieben außer wo dies anders angezeigt ist. Die Testlösungen wurden in etwa 3 ml Dosen verwendet. Bei allen Kontraktionsexperimenten wurde die Zellmorphologie über Phasenkontrastmikroskopie überwacht und das Wachstumsmedium wurde alle 3 bis 4 Tage gewechselt.
a) Zellzahlabhängigkeit
Kollagengele wurden mit entweder 100.000 oder 500.000 Zellen ausgesät. Sie wurden mit Inhibitor und Kontrolllösungen umfassend 40 μg/ml und 4 μg/ml Galardin oder äquimolare Menge an Hydroxansäure (Kontrolle) in einem Äquivalent zu 40 μg/ml Galardin (100 μM) (hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1 (c) oben) behandelt. Die Gele wurden 7 Tage überwacht.
Die Resultate siehe 3a und 3b.
3a zeigt die Resultate für die Kollagennetze (Gele), welche mit 500.000 Zellen pro Netz ausgesät wurden. Die mittlere Netzfläche ist gegen die Zeit (in Tagen) aufgetragen, für die Gele, welche wie Gele der drei Lösungen behandelt wurden. Wie man erkennen kann, ist die Kontraktion der Gele, die mit Inhibitorlösungen behandelt wurden, wesentlich geringer als die von Gelen, die mit Kontrolllösung behandelt wurden. 3b zeigt die Resultate für die Kollagennetze, die mit 100.000 Zellen pro Netz ausgesät wurden. Wieder ist die mittlere Netzfläche gegen die Zeit für jedes der drei Strategien aufgetragen. Wie erkannt werden kann, ist die Kontraktion der Gele, die mit Inhibitorlösungen behandelt wurden, viel geringer als die von Gelen, die mit Kontrolllösungen behandelt wurden. Ein Vergleich der 3a und 3b zeigt, dass die Kontraktion von Netzen, die mit 500.000 Zellen pro Netz ausgesät wurden, größer ist als die von Netzen, die mit 100.000 Zellen unter den gleichen Bedingungen ausgesät wurden.
Diskussion
Die Experimente zeigten, dass die Kontraktion stärker ist, wenn eine höhere Zellkonzentration vorhanden ist und das die gleiche Dosis an Inhibitor nicht eine gleich gute Inhibition bereitstellen kann, wenn eine geringere Zellkonzentration vorhanden ist.
(b) Reversibilität
Kollagengele wurden hergestellt und Fibroblasten (1 × 10⁵ Zell/Gitter (Gel)) ausgesät wie in Beispiel 1 oben beschrieben. Sie wurden mit Inhibitor- und Kontrolllösungen auf folgende Arten behandelt:

(i) kontinuierliche Behandlung mit Kontrolllösung (Medium enthaltend Hydroxansäure);
(ii) kontinuierliche Behandlung mit Inhibitorlösung (Medium enthaltend 4 μg/ml Galardin);
(iii) kontinuierliche Behandlung mit Inhibitorlösung (wie (b)) ist Tag 14 nach dem Aussäen und dann Ersetzen durch Kontrolllösung (wie (a));
(iv) Gitter wurden 5 Tage kontrahieren gelassen und dann kontinuierlich mit Kontrolllösung behandelt (wie (a)) für 25 Tage;
(v) Gitter wurden 5 Tage kontrahieren gelassen und dann kontinuierlich mit Inhibitorlösung behandelt (wie (b)) für 25 Tage;
(vi) Gitter wurden 5 Tage kontrahieren gelassen und wurden dann kontinuierlich mit Inhibitorlösung (Medium enthaltend 40 μg/ml Garladin) für 25 Tage behandelt.

Die Testlösungen wurden in Übereinstimmung mit dem Beispiel 1(c) hergestellt und das Wachstumsmedium in den Kulturen wurden alle 3 bis 4 Tage gewechselt.
Die Resultate aus (i), (ii) und (iii) sind in den 3C gezeigt und die Resultate aus (iv), (v) und (vi) sind in 3D gezeigt.
3C ist ein Plot der durchschnittlichen Gitterfläche gegen die Zeit und zeigt die Resultate der Experimente (i), (ii) und (iii). Wie man erkennen kann, nimmt die mittlere Fläche der Gitter, die mit Kontrolllösung behandelt werden, vom Tag 0 an ab; die Kontraktion findet über die gesamte Zeitdauer statt. Bei den anfänglich mit Inhibitorlösungen behandelten Gittern tritt nur eine sehr geringe Kontraktion auf und in den Falle der Gitter, die weiterhin mit Inhibitor behandelt werden (ii) ist die Reduktion der Durchschnittsfläche sogar nach 40 bis 50 Tagen gering. Bei den Gittern, die mit Inhibitorlösung bis Tag 14 behandelt wurden (als * in 3C gezeigt) und die danach mit Kontrolllösung behandelt wurden (Experiment (iii)) tritt ein signifikanter Anstieg der Kontraktion von Tag 14 aufwärts auf.
3D ist der Plot der mittleren Gitterfläche gegen die Zeit für jedes Experiment (iv), (v) und (vi). Wie erkannt gesehen wird, fand in den ersten 5 Tagen der Experimente, wo die Gitter nicht Testlösungen ausgesetzt waren, eine wesentliche Kontraktion der Gitter statt. Nach Tag 5 (markiert als * in 3D) wurden die Gitter mit Testlösungen behandelt. Die Kontraktion lief weiter (es gab keine Umkehr), allerdings mit reduzierter Geschwindigkeit. Sowohl die 4 μg/ml als auch die 40 μg/ml Lösungen Galardin inhibierten die Kontraktion im Vergleich mit der Kontrolllösung. Die 40 μg/ml Galardin-Lösung ergab jedoch einen stärkeren inhibitorischen Effekt als die 4 μg/ml Lösung.
Diskussion
Die Experimente (i), (ii) und (iii) zeigten, dass die Behandlung mit Inhibitorlösung die Kontraktion im Vergleich zur Behandlung mit Kontrolllösung inhibierte, und dass die Ersetzung der Inhibitorlösung mit Kontrolllösung die Geschwindigkeit der Kontraktion erhöhte, d. h. die Inhibition stoppte. Die Inhibition ist also reversibel.
Die Experimente (iv), (v) und (vi) zeigten, dass selbst wenn die Kontraktion der Gele fünf Tage ohne irgendeiner Art von Inhibitation gestoppt wurde, der Zusatz von Inhibitorlösungen immer noch eine Inhibition der Kontraktion ergab. Je konzentrierter die Inhibitorlösung war, desto größer war die Inhibition.
c) Zytotoxizität
Dieses Experiment wurde im Wesentlichen entsprechend dem Verfahren von Beispiel 2 ausgeführt, außer dass die Zellen mit 2×10⁴-Zellen pro Well ausgesät wurden, ohne radioaktives Material kultiviert wurden und mit Kontrollmedium (DMEM/10% NCS) oder Galardin mit 40 μg/ml bzw. 4 μg/ml Konservation behandelt wurden. Es wurde jeweils etwa 1 ml Testlösung hinzugefügt. Die Wells wurden abgeerntet und die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt, siehe 3E für die Resultate, und der Prozentsatz von teilungsfähigen Zellen in jedem Well wurde unter Verwendung von des Trypanblautests gemessen, siehe 3F bezüglich der Resultate. Es wird deutlich, dass Galardin die Zellteilungsfähigkeit und -anzahl verglichen mit den Kontrollen nicht negativ beeinflusste.
Diskussion
Es scheint so zu sein, dass die MMP-Inhibitoren in Mengen und Konzentrationen verwendet werden können, die hoch genug sind, um die Kontraktion ohne signifikante Toxizität zu begrenzen.
d) BB-94
Das Experiment wurde wie (a) oben mit 1×10⁵-Zellen pro Gitter durchgeführt und die verwendeten Testlösungen waren BB-94 4 μg/ml, BB-94 0,4 μg/ml und Kontrolle mit weniger (0,1 % vol/vol DMSO). Die Entwicklung der Gitter wurde für einen Zeitraum von sieben Tagen nach dem Aussehen beobachtet. Bezüglich der Resultate siehe 3G, woraus klar wird, dass BB-94 eine signifikante Inhibition der Kontraktion ergab.
e) Antikörper
Das Experiment wurde wie (d) oben durchgeführt, außer dass die Testlösungen, die verwendet wurden, 1:50 (vol/vol) Antikörper im Wachstumsmedium waren. Die verwendeten Antikörper waren Antikörper gegen MMPs 1, 2, 3 und 9, erhalten von Biogenesis Ltd., (Poole, U. K.). Eine Kontrolllösung mit 0,1 % Natriumazid und 0,14 % Kaninchenserum in PBS verdünnt 1:50 im Wachstumsmedium wurde ebenso verwendet. Bezüglich der Resultate siehe 3H.
3H ist ein Plot der mittleren Gitterfläche gegen die Zeit für Gitter, die mit jeder der Testlösungen behandelt wurden. Wie ersichtlich wird, zeigten die Gitter, die mit Kontrolllösung und mit der Lösung des Antikörpers gegen MMP9 behandelt wurden, eine signifikante Kontraktion. Die Gitter, die mit einem der Antikörper gegen MMP1, MMP2 oder MMP3 behandelt wurden, zeigten keine signifikante Kontraktion.
Diskussion
Wie aus 3H ersichtlich wird, konnte eine signifikante Inhibition mit den Antikörpern gegen MMP 1, 2 und 3, aber nicht mit dem Antikörper gegen MMP9 sichergestellt werden. Dies zeigt daher, dass Antikörper als zufrieden stellende MMP-Inhibitoren zur Verwendung bei der Inhibition der Kontraktion wirken können. Es scheint so zu sein, dass während die MMPs 1, 2 und 3 alle in den Kontraktionsprozess verwickelt sein können, dies bei MMP9 nicht der Fall ist.
Beispiel 4
Es wurden eine Serie von Experimenten ausgeführt, in denen die MMP mRNA und Proteinproduktion von humanen Sehnenkapselnfibroblasten unter einer Reihe von Bedingungen untersucht wurde.
Die Fibroblastenzellen wurden sowohl in Monolayerkulturen gezogen als auch in Kollagengittern ausgesät. Gesamt-RNA wurde von Proben enthaltend 3×10⁶-Zellen unter Verwendung der Methode wie sie in Chomczynski & Sacchi 1987 beschrieben ist, isoliert. Die Proben wurden von Zellen in Monolayerkulturen am Tag 0 des Experiments genommen und Proben wurden auch von Zellen genommen, welche Kollagengitter nach 9 Stunden, 1 Tag und 7 Tagen kontrahierten.
1 μg/mg Proben der RNA wurden mit bekannten Kopienzahlen eines synthetischen RNA-Template (0,1 bis 100.000 Kopien), welche Sequenzen enthielten, die zu den Primern für die Sequenzen der MMPs 1, 2, 3 und 9 komplementär waren, enthielten. Mit den Gemischen wurde eine reverse Transkriptase-Reaktion vor der Amplifikation über PCR unter Verwendung von spezifischen Primern für MMPs 1, 2, 3 und 9 durchgeführt. Während der PCR-Reaktion kompetetieren sowohl die Proben-RNA als auch die synthetische Templat-RNA um das Binden der Primer.
Die Intensität von Bandeln wurden bildlich analysiert und das Verhältnis von amplifizierten synthetischen Templat zu der Intensität der amplifizierten Proben wurde kalkuliert. Diese Werte wurden gegen die anfängliche Templatkopienzahl aufgetragen. Ist das Verhältnis von amplifiziertem synthetischem Templat zur Probe 1, ist die anfängliche Kopienanzahl des synthetischen Templats und der Probe gleich. Dies erlaubte eine Berechnung der Kopienanzahl der mRNA pro Zelle in allen Proben.
Proben des konditionierten Mediums und von Kollagengittern (1×10⁵-Zellen/Gitter) wurden am Tag 1, 3 und 7 nach Aussaat gesammelt. Die Gitter wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 3×3 ml) vor der Homogenisation in 0,5 & (vol/vol) Triton-X100 in PBS ergibt [Hunt et al. 1993] gewaschen. Es wurde dann eine Gelatinzymographie [Heussen & Dowdle 1980] mit diesen Proben durchgeführt. Im Prinzip wurden Proben und vorgefärbte Molekulargewichtsstandards auf 10 % Tris-Glycin-Gelen enthaltend 0,1 % Gelatin (Novex, R&D Systems, Oxford, U.K.) aufgetrennt. Die Gele wurden dann 30 Minuten in Renaturierungspuffer, 30 Minuten in Entwicklungspuffer gefolgt von weiteren 18 Stunden im Entwicklungspuffer bei 37° C (alle Novex) inkubiert. Die Gele wurden dann in 0,5 % (wt/vol) Commassieblue in 45 % (vol/vol) Wasser, 45 % (vol/vol) Methanol und 10 % (vol/vol) Eisessig gefärbt, gefolgt von einem Entfärben in 45 % (vol/vol) Wasser, 45 % (vol/vol) Wasser, 45 % (vol/vol) Methanol und 10 % (vol/vol) Eisessig. Die MMP-Aktivität erschien als klare Banden auf einen blauen Hintergrund.
Resultate
Die Experimente zeigten, dass die RNA, die aus Zellen die Kollagen kontrahierten extrahiert wurde erhöhte Spiegel an mRNA für MMPs 1, 3 und 3 aber nicht 9 enthielten, verglichen mit der, welche aus Zellen aus Monolayerkulturen entnommen wurde. Sie zeigten ebenso, dass die Spiegel an MMP mRNA über die 7tägige Kulturdauer abnahmen.
Siehe auch 6 bezüglich der Resultate. 6 ist die Darstellung einer Fotografie der Resultate der PCR-Reaktion. Sie zeigt die Proben- und Templatebanden am Tag 0, 9 Stunden, 1 Tag und 7 Tage für mRNA, welche jeweils MMPs 1, 2, 3 und 9 kodiert.
Die Gelatinzymographie zeigte, dass aktiv kontrahierende Zellen verglichen mit Zellen aus Monolayerkulturen vier proteolytisch aktive Spezies herstellten (Mr etwa 100.000; 90.200; 72.000 und 57.000), von denen zwei (die mit Mrs 72.000 und 57.000) über die Siebentageperiode zuzunehmen scheinen. Siehe 7 bezüglich der Resultate. Eine davon wurde durch Inkubation mit Aminophenylquecksilberazetat (Mr 100.000 reduziert auf 57.000) aktiviert.
Diskussion
Die Experimente zeigten, dass sowohl die MMP mRNA als auch Proteinherstellung durch okulare Fibroblasten bei Kultur innerhalb und während der Kontraktion des dreidimensionalen Kollagenmatrix dramatisch erhöht wurde. Es scheint daher so zu sein, dass während des kontraktilen Prozesses eine aktive Herstellung von MMPs auftritt.
Weitere Experimente zeigten, dass die Behandlung von besiedelten Gittern mit Galardin in einer Beseitigung der vier proteolytisch aktiven Spezies resultierte.
Beispiel 5
Diese Untersuchungsserie untersuchte die Wirkung von MMP-Inhibitoren auf das Ausmaß der Kontraktion von Kollagengittern durch Fibroblasten aus verschiedenen Gewebestellen und Arten.
Die Kollagengitter (Gele) wurden wie vorher für Beispiel 1 beschrieben hergestellt und mit einmal 1×10⁵-Zellen pro Gitter der folgenden Zellen besiedelt:

i) humanen Hautfibroblasten;
ii) Ratten-Parietalplatten-Fibroblasten; oder
iii) Ratten-Endotendon-Fibroblasten.

Die Gitter wurden dann mit Wachstumsmedium enthaltend Glardin in einer Konzentration von 40 μg/ml oder Hydroxansäure in einer Konzentration von 100 μM (Kontrolle) behandelt. Die Teste wurden wie in Beispiel 3 oben hergestellt und eine etwa 3 ml Dose der entsprechenden Testlösungen wurde verwendet. Die Fläche jedes Gitters wurde über 7 Tage gemessen und die Resultate sind in den 4A, 4B und 4C gezeigt.
Die 4A, 4B und 4C sind Plots der mittleren Gitterfläche über die Zeit für Gitter, die mit Fibroblasten und Behandlung mit einer der entweder der Kontrolllösung oder der Inhibitorlösung bewachsen sind. 4A für humane dermale Fibroblasten, 4B für Rattenparietalplatten-Fibroblasten und 4C für Rattenendotendonfibroblasten. Wie ersichtlich wird, war die Kontraktion der Gitter, die mit einem der drei Arten von Fibroblasten besiedelt waren, deutlich reduziert, wenn sie mit Inhibitorlösungen behandelt wurden, verglichen mit Gittern, die mit derselben Art von Fibroblasten besiedelt war und mit Kontrolllösung behandelt wurden.
Diskussion
Die Behandlung mit dem Inhibitor resultierte in einer signifikanten Ausmaß an Inhibition der Kontraktion verglichen mit den Kontrollen bei allen Zelltypen. In jedem Fall war die Inhibition der Kontraktion begleitet von einer verminderten zellulären Invasion in und Migration durch die umgebende Matrix verglichen durch den Kontrollen. Es scheint daher so zu sein, dass die Inhibition der zellulären Invasion ein wichtiger Mechanismus der MMP-Inhibitorwirkung ist.
Beispiel 6
Die Wirkung eines MMP-Inhibitors auf die Kontraktion einer künstlichen Hautäquivalenz wurde getestet. Ein Kollagengitter (Gel) wurde hergestellt wie in Beispiel 1 und sowohl mit humanen Keratinocyten und humanen Hautfibroblasten besät, um eine Haut nachzuahmen. Dieses Gitter wurde dann mit Wachstumsmedium enthaltend Galardin in einer Konzentration von 40 μg/ml oder Hydroxansäure in einer Konzentration von 100 μM (Kontrolle) behandelt. Die Lösungen wurden hergestellt wie in Beispiel 3(a) oben beschrieben und es wurden jeweils etwa 3 ml Portionen der entsprechenden Lösungen verwendet. Die Gitterfläche wurde 7 Tage gemessen und die Resultate sind in 5 gezeigt.
5 ist ein Plot der mittleren Gitterfläche über die Zeit (in Tagen) für Gitter, die mit Kontrolllösung und Gitter die mit Inhibitorlösung behandelt wurden. Wie ersichtlich wird, trat bei den Gittern, die mit Inhibitorlösung behandelt wurden eine geringere Kontraktion auf als bei denen, die mit Kontrolllösung behandelt wurde.
Diskussion
Es ist daher möglich, die Kontraktion eines Kollagengels mit Fibroblasten und epithelialen Zellen, d. h. in etwa einem Modell der Haut, zu inhibieren.
Beispiel 7
In dieser Reihe von Experimenten wurden die Wirkungen von MMP-Inhibitoren auf okulare Fibroblastenmorphologie innerhalb von Kollagengittern untersucht.
Kollagengitter wurden mit okularen Fibroblasten hergestellt und mit MMP-Inhibitoren behandelt, sowohl mit synthetisch-chemikalischen und mit Antikörpern, wie in Beispiel 3 oben beschrieben. Die zelluläre Morphologie wurde über eine Phasenkontrastmikroskopie untersucht.
7 Tage nach Aussäen zeigten Zellen, die Kontrollkollagengitter bewuchsen, eine sternförmige (S) und eine bipolare (B) Morphologie. Zellen, die mit 4 μg/ml Galardin, 4 μg/ml BB-94, einem Antikörper gegen MMp 1 oder MMP2 behandelt wurden, zeigten 7 Tage nach Aussäen kleine zytoplasmatische Vorsprünge. Zellen, die mit Antikörper gegen MMP3 behandelt wurden, zeigten gar keine zytoplasmatischen Vorsprünge in die umgebende Matrix. Die Behandlung mit einem Antikörper gegen MMP9 beeinflusste die Morphologie verglichen mit den Kontrollen nicht.
Diskussion
Diese Resultate zeigten, dass Zellen, die Gitter besiedeln, welche mit Galardin, BB-94 und Antikörper gegen MMPs 1, 2 und 3 behandelt wurden, eine verringernde Invasion in die umgebende Kollagenmatrix verglichen mit Kontrollen zeigten und verglichen mit Zellen, die einem Antikörper gegen MMP9 behandelt wurden. Diese Abnahme an Invasion in die Matrix war jeweils begleitet von der Inhibition sowohl der Gitterkontraktion als auch der Migration durch die Matrix. Dies zeigte wiederum, dass die Inhibition der Invasion wichtig ist.
Beispiel 8
Diese Serie an Experimenten wurde geplant, um die Wirkungen eines MMP-Inhibitors (Galardin) auf zelluläre Vorgänge in Sehnenkapselnfibroblasten zu untersuchen, die für die Kollagenkontraktion erforderlich sind.
Monolayerkulturen von Fibroblasten und Kollagengittern (Gelen), die mit 1×10⁵-Zellen pro Gitter ausgesät wurden, wurden hergestellt (wie beschrieben in Beispiel 1).
Das Ausmaß an Kontraktion von Kollagengelen, die mit Kontrolllösung und mit Inhibitorlösung enthaltend 40 μg/ml Galardin behandelt wurden, die Lösungen wurden hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben und es wurden in etwa 3 ml Portionen der Lösungen verwendet (wurde wie oben beschrieben gemessen). 8A zeigt des Ausmaß der Gitterkontraktion eines Kontrollgels 7 Tage nach Aussaat und 8B zeigt das Ausmaß der Kontraktion des Gels, welches mit Inhibitorlösung behandelt wurde.
Das Actincytoskelett von Zellen in Gittern und in Monolayerkulturen wurde mit FITC-Phalloidin [Martin & Lewis 1992] immunofluorescenz gefärbt. Siehe 9A (Kontrolle) und 9B (Behandlung mit Inhibitor). Die Zeilen zeigen Actinstressfasern auf der Oberfläche der Zelle, die Kollagengele bewuchsen. Diese Fasern sind in der Kontrolle eindeutig vorhanden, sind jedoch nicht in dem Gitter, welches mit Inhibitorlösung behandelt wurde, vorhanden.
Es wurden Unterschiede zwischen den Kontrollen und den denen, die mit Inhibitor (40 μg/ml Galardin) behandelt wurden, ersichtlich. Um zu untersuchen, ob diese Differenz aufgrund einer direkten Wirkung des Inhibitors oder aufgrund von Unterschieden im Ausmaß der Invasion in die Matrix abhängt, wurden Zellen in Monolayerkulturen mit dem Inhibitor behandelt und das Zytoskelett wurde angefärbt. Siehe 10A (Kontrolle) und 10B (behandelt mit Inhibitor). Die Pfeile zeigen Stressfasern auf den Zellen in der Monolayerkultur. Wie ersichtlich wird, sind diese sowohl in der Kontrollmonolayerkultur als auch in der Monolayerkultur, die mit Inhibitorlösung behandelt wurde, vorhanden.
In Monolayerkulturen scheint der Inhibitor das Actinzytoskelett verglichen mit Kontrollen nicht zu beeinflussen.
Gitter für die Transmissionselektronenmikroskopie wurde drei Tage nach Aussaat geerntet, mit PBS (3×3 ml) gewaschen und über Nacht bei 4° C in 2,5 % (vol/vol) Glutaraldehyd mit 0,5 % (wt/vol) Tanninsäure in 0,07 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,0) fixiert. Nach einer Spülung in 0,01 M Cycodylat-HCl-Puffer (pH 7,3) wurde eine Nachfixierung zwei Stunden in 1 % (wt/vol) wässrigem Osmiumtetroxid bei 4° C durchgeführt, die Gitter wurden in aufsteigenden Alkoholreihen dehydriert und in Propylendioxid gebleicht. Die Proben wurden dann mit Propylendioxid/Araldit (1:1 vol/vol) eine Stunde infiltriert, gefolgt von einer 12stündigen Invasion in Araldit (Handelsname) alleine. Die Proben wurden in frisches Araldit eingebettet, ultradünne Schnitte durchgeführt und mit gesättigtem Uranacetat gefolgt von Reynolds Bleizitrat sequenziell angefärbt. Siehe 11A (Kontrolle) und 11B (behandelt mit Inhibitor). Die Pfeilköpfe zeigen die zellulären Befestigungen an die Kollagenmatrix. Es ist eindeutig, dass die Befestigung der Fibroblasten an die umgebende Kollagenmatrix durch den Inhibitor nicht beeinflusst wurde.
Diskussion
Diese Experimente zeigten, dass Galardin die Befestigung des Cytoskeletts oder der Zellmatrix der Fibroblasten nicht beeinflusste. Effekte auf das Zytoskelett oder auf die Zellmatrixbefestigung waren mögliche Erklärungen für die Wirkung des Galardins auf die Kontraktion und daher für die Wirkung von MMP-Inhibitoren auf die Kontraktion.
Allgemeine Diskussion
Eine Reihe von Untersuchungen haben mögliche Mechanismen für die zellvermittelte Kollagenkontraktion vorgeschlagen. Eine Reihe von Arbeitern schlugen vor, dass MMPs nicht hergestellt werden oder zwar während der Gitterkontraktion hergestellt werden, jedoch in den kontraktilen Prozess nicht impliziert sind. Die oben beschriebenen Experimente zeigen, dass eine zellulär erhaltende MMP-Aktivität entscheidend ist für den Prozess der Kollagenkontraktion. Erfordernis der MMP-Aktivität für die Kontraktion scheint bei allen untersuchten Fibroblasten gleich zu sein.
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Claims

Verwendung eines Matrix-Metallproteinase-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Begrenzung, Verhinderung oder Vorbeugung der Kontraktion eines natürlichen oder künstlichen Gewebes aufweisend extrazelluläre Matrixkomponenten.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe Collagen aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Kontraktion in Verbindung mit einem pathologischen Zustand oder mit einem chirurgischen oder kosmetischen Verfahren ereignet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe Narbengewebe ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur Begrenzung, Verhinderung oder Vorbeugung der Kontraktion von Gewebe dient, welches in Verbindung mit einer thermischen Verbrennung oder einer Strahlenverbrennung, einer Hauttransplantation, Schilddrüsen-Augen-Erkrankung (thyroid eye disease), Sklerodermie oder Dupytren Kontraktur (Dupytren's contracture) steht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur Begrenzung, Verhinderung oder Vorbeugung der Kontraktion von Gewebe dient, das in Verbindung mit einem posttraumatischen Zustand steht, der von einer Operation oder einem Unfall resultiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur Begrenzung, Verhinderung oder Vorbeugung der Kontraktion von Gewebe dient, welches in Verbindung mit einem posttraumatischen Zustand steht, der von einer Augenoperation oder aus einem Trauma des Auges oder der Augenhöhle resultiert.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Augenoperationen Glaukomoperation, Silberblick (squint), orbitale Operation oder Augenlidoperation, Hornhautoperation (corneal surgery), Netzhautablösungsoperation oder Grauer Star Operation (cataract surgery) ist, und wobei das Augentrauma ein Trauma der Hornhaut (cornea) ist.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Hornhautoperation eine Laserbehandlung oder chirurgische Behandlung der Kurzsichtigkeit oder eines Brechungsfehlers ist.
Verwendung nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die kosmetische Behandlung eine kosmetische Operation ist.
Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die kosmetische Operation eine dermale Abrasion ist.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die thermische oder Strahlenverbrennung am Auge ist, der Oberfläche der Haut, der Haut und den darunter liegenden Geweben, oder inneren Geweben.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur Begrenzung, Verhinderung oder Vorbeugung der Kontraktion von Gewebe dient, welches einhergeht mit einer chirurgischen Behandlung eines Magenkrebses oder mit einer chirurgischen Behandlung involvierend eine Passage, einen Ductus oder ein Blutgefäß.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur Begrenzung, Verhinderung oder Vorbeugung der Kontraktion von Gewebe dient, welches mit einem posttraumatischen Zustand einhergeht, der nach einer Hand- oder Fußsehnenverletzung resultiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament dazu dient, dem Gewebe zu einer Zeit verabreicht zu werden, bevor irgendwelche Zeichen der Kontraktion ersichtlich sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament dazu dient, dem Gewebe zu einer Zeit verabreicht zu werden, zu der die Kontraktion stattfindet und ggf. ebenso für eine Zeitdauer, während der die Kontraktion nach offensichtlicher Heilung geschehen darf.
Verfahren zur Begrenzung, Verhinderung oder Vorbeugung der Kontraktion eines natürlichen oder künstlichen Gewebes in vitro aufweisend extrazelluläre Matrixkomponenten, bei welchem man dem Gewebe während und/oder nach seiner Bildung einen Matrix-Metallproteinase-Inhibitor verabreicht.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe natürliche Haut oder künstliche Haut ist.
Verfahren zur Herstellung einer künstlichen Haut, bei welchem man ein Collagengel mit menschlichen Keratinozyten und menschlichen Hautfibroblasten ansetzt und das Gel einem Wachstumsmedium aussetzt, welches einen Matrix-Metallproteinase-Inhibitor aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Inhibitor ein Breitbandmatrix-Metallproteinase-Inhibitor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei welchem der Inhibitor in der Lage ist, ein oder mehrere der Matrix-Metallproteinasen 1, 2 und 3 zu inhibieren.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei welchem der Matrix-Metallproteinase-Inhibitor ein Collagenase-Inhibitor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor N-[2(R)-2-(Hydroxamido-carbonyl-methyl)-4-methylpentanoyl]-L-tryptophanmethylamid ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei welcher der Inhibitor ein Hydroxamidsäurepeptid oder ein pharmazeutisch akzeptierbares Derivat davon ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei welcher der Inhibitor ein Mittel ist, welches die Produktion von Matrix-Metallproteinasen inhibiert.
Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor ein Antisensemolekül ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei welcher der Inhibitor ein monoklonaler oder ein polyklonaler Anti-Matrix-Metallproteinase Antikörper ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 und 20 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament mehr als einen Inhibitor aufweist, wobei ein Inhibitor ein Matrix-Metallproteinase-Inhibitor ist und wenigstens ein anderer Inhibitor Inhibitoreigenschaften für ein anderes Enzym als eine Matrix-Metallproteinase hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 und 20 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament mehr als einen Inhibitor aufweist, wobei ein Inhibitor ein Collagenase-Inhibitor ist und wenigstens ein anderer Inhibitor Inhibitoreigenschaften für ein anderes Matrix-Metallproteinase-Enzym als Collagenase hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 und 20 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ebenfalls einen Cytokininhibitor aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 und 20 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ebenfalls einen weiteren pharmazeutisch wirksamen Bestandteil aufweist ausgewählt aus der Gruppe von Antibiotika, Antimykotika, Steroiden, Enzyminhibitoren, Wachstumspromotoren und Heilungspromotoren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Matrix-Metallproteinase-Inhibitor und jegliche weitere Substanzen wie in einem der Ansprüche 20 bis 31 definiert sind.