ES2239787T3 - Inhibicion de invasion remodeladora. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A NUEVOS PROCEDIMIENTOS PARA PREVENIR O DETENER EL REMODELADO INVASIVO EN LOS MAMIFEROS, UTILIZANDO UNA COMBINACION DE INHIBICION IN VIVO DE PLASMINA Y DE INHIBICION IN VIVO DE DETERMINADAS ENZIMAS PROTEOLITICAS, EN ESPECIAL LAS METALOPROTEASAS. ESTE PROCEDIMIENTO SE PUEDE UTILIZAR, POR EJEMPLO, COMO UNA NUEVA ALTERNATIVA A LOS PROCEDIMIENTOS DE CONTRACEPCION ASI COMO A LOS TRATAMIENTOS ANTIFUNGICOS Y ANTIBACTERIANOS. LAS REALIZACIONES PREFERIDAS DE ESTA INVENCION SE REFIEREN AL TRATAMIENTO Y LA PREVENCION DE TRASTORNOS NEOPLASTICOS UTILIZANDO ESTAS COMBINACIONES. ADEMAS, ESTA INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVAS COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN INHIBIDORES DE PLASMINA MEZCLADOS CON UN INHIBIDOR DE OTRA ENZIMA PROTEOLITICA, PREFERENTEMENTE UN INHIBIDOR DE METALOPROTEASA.

Description

Inhibición de invasión remodeladora.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de nuevas composiciones para la fabricación de un medicamento para prevenir o detener la invasión remodeladora de tejidos en mamíferos por medio de la utilización in vivo de una combinación de inhibición de plasmina y de la inhibición in vivo de ciertas otras enzimas proteolíticas, en particular metalo-proteasas. Esta composición puede, por ejemplo, ser usada como un medio novedoso para el tratamiento de desórdenes neoplásticos malignos, pero también como una alternativa a los métodos actuales de anticoncepción, así como también de tratamiento antifúngico, antibacterial, antiprotozoario, y antiviral. Además, la invención se refiere al uso antes mencionado de composiciones novedosas que comprenden un inhibidor de plasmina conjuntamente con un inhibidor de otra enzima proteolítica.

Antecedentes generales Remodelamiento invasivo de tejidos

Una cantidad de procesos fisiológicos y patológicos hacen uso del remodelamiento invasivo de tejidos, incluyendo, por ejemplo, la curación de una herida de piel en la cual queratinocitos migran a la herida causando re-epilelialización, la invasión cancerosa, un proceso en el cual las células cancerosas migran a los tejidos normales, que luego son reemplazadas por tejido canceroso, y la invasión de trofoblastos en el útero luego de la implantación del huevo, que lleva a la formación de la placenta. Estos procesos de remodelación invasiva comparten características como la migración de células, degradación de la matriz extracelular que constituye el andamiaje celular, y la formación de un nuevo andamiaje. Últimamente, los datos apuntan a que los mecanismos moleculares implicados son también muy similares. El mismo repertorio de enzimas degradantes de proteínas está, así, involucrado en la degradación de matriz extracelular en diferentes procesos de remodelación invasiva (Dano et al, 1985; Hewitt y Dano, 1996), y existen grandes similitudes en la manera en que las células epiteliales interactúan con células de tejidos conectivos estromales en los diferentes procesos (Hewitt y Dano, 1996; Rombo- Jessen et al, 1996). Las similitudes entre el proceso de curación de la herida de piel y el cáncer son particularmente llamativas. En su estudio clásico de este tema, Harold Dvorak ha llamado a los cánceres como "heridas que no curan" (Dvorak, 1996).

Con respecto al rol de las enzimas degradadoras de proteínas existen también grandes similitudes entre los procesos de remodelación de tejido invasivo y otros procesos de remodelación, como la involución de la glándula mamaria luego de la finalización de la lactancia, la involución uterina luego del parto, y la descamación epitelial en el lumen del tracto gastrointestinal (Dano et al, 1985; Hewitt y Dano, 1996; Lund et al, 1996).

Las células estromales no-neoplásticas están altamente implicadas en la generación y regulación de la actividad proteasa degradadora de la matriz en la invasión cancerosa (Hewitt y Dano, 1996). El patrón de implicamiento de la célula estromal es característico de cada tipo de cáncer, y es particularmente notorio que haya grandes similitudes no sólo en cuanto a las proteasas involucradas, sino también en los patrones de expresión celular de estas proteasas, entre un cáncer que se origina de cierto tejido y procesos específicos de remodelación de tejidos no malignos en el mismo tejido, (revisado por Hewitt y Dano, 1996).

Un ejemplo de tal similitud se observa cuando se compara tejido mamario que sufre el proceso normal de la involución post- lactancia, con tejido mamario canceroso; los ARNm que codifican para uPA (activador plaminógeno de uroquinasa), la gelatinasa A y la estromelisina-3 están expresadas en ambos casos y en los mismos los tres ARNm están localizados en células estromales tipo-fibroblasto que rodean las células epiteliales.

También se observan similitudes entre los patrones de expresión proteasa degradadora de la matriz asociados con el proceso normal de descamación epitelial en el lumen del tracto gastrointestinal y los patrones de expresión de proteasa degradadores de la matriz en el cáncer de colon. En el cáncer de colon uPAR (receptor del activador de plasminógeno de tipo uroquinasa) está expresado por las células epiteliales neoplásticas y uPA se expresa en células adyacentes tipo fibroblasto. De igual modo, en el tracto gastrointestinal normal, uPAR se expresa en células epiteliales luminales, y uPA se expresa en células adyacentes tipo fibroblasto en la lamina propria. Esta similitud sugiere que en ambos casos la generación de plasmina está siendo controlada por la cooperación entre células epiteliales y células adyacentes tipo fibroblasto.

Las similitudes también se pueden ver entre patrones de expresión de proteasa degradadora de la matriz en la curación de heridas de la piel y en carcinomas de piel: la expresión de uPA, PAI-1 (inhibidor del activador de plasminógeno, tipo I), uPAR, colagenasa intersticial y estromelisina-2 en las células epiteliales neoplásticas de cáncer escamoso se asemejan al patrón de expresión de todas estas moléculas durante la re-epitelialización y cura de heridas de piel. Todas se expresan en el frente de crecimiento del epitelio regenerador, lo que sugiere que están involucrados en la degradación de la matriz extracelular durante la migración de queratinocitos. Las similitudes entre la curación de heridas de piel y el cáncer escamoso de piel también se extiende a la estromelisina-3, que se expresa en células fibroblásticas en ambos casos.

Las similitudes entre invasión cancerosa y la remodelación de tejido no neoplástico con respecto a los mecanismos proteolíticos también están reflejadas en estudios recientes con ratones que han sido convertidos en plasminógeno deficientes por medio de una inactivación dirigida de genes. En estos ratones existe una discapacidad en la curación de herida de piel (Romer et al, 1996), involución de glándula mamaria (Bjorn et al, 1997), y metástasis de cáncer (Bugge et al, 1997). Estos 3 procesos están demorados pero eventualmente siguen su curso.

Las similitudes discutidas más arriba, sostienen fuertemente la noción de que los mismos mecanismos proteolíticos o muy similares al nivel fenotípico están involucrados en la remodelación del tejido no-neoplástico e invasión cancerosa. Las diferencias más importantes parecen estar en la regulación genética de los procesos. En la curación de heridas de piel, los queratinocitos detienen la migración cuando las heridas cierran, mientras que en el cáncer de piel, las células epiteliales malignas continúan su migración/invasión. No obstante, los mecanismos proteolíticos per se son prácticamente los mismos. La invasión cancerosa puede, en este sentido, ser considerada como un proceso remodelador no-neoplástico que ha escapado a la regulación normal. Los datos sobre los mecanismos proteolíticos involucrados en el proceso remodelador de tejido no-neoplástico pueden, por lo tanto, brindar una información invalorable a nuestro entendimiento de la invasión cancerosa.

Enfermedades Dianas

Existen un número de enfermedades en las cuales la patogénesis incluye una contribución importante de la remodelación de tejido invasivo. Los neoplasmas malignos son particularmente importantes entre estas enfermedades (Dano et al, 1985 y Hewitt y Dano, 1996). Debido a que la enfermedad metastática es la principal causa de morbosidad y mortalidad del paciente de cáncer, existe una fuerte necesidad de proveer nuevos fármacos efectivos y métodos para interferir en la remodelación de tejido invasivo que caracteriza la diseminación del tumor. También están incluidas entre estas enfermedades ciertas enfermedades crónicas inflamatorias (por ej. artritis reumatoide; Dano et al, 1985), y enfermedades infecciosas causadas por ciertas bacterias (por ej. la enfermedad de Lyme; Coleman et al, 1997) y hongos que tienen una patogénesis en donde la remodelación de tejido invasivo es un factor fundamental. Además, la destrucción de cartílago articular en la artritis reumatoide ocurre, en parte, como resultado del crecimiento del panus invasivo sobre la superficie del cartílago.

Otras dianas

Debe mencionarse que existen procesos fisiológicos bastante normales, como el embarazo, que involucran la remodelación invasiva. Para que el embrión se adhiera a la pared uterina y que le llegue un suministro de sangre favorable, debe invadir y remodelar sustancialmente el endometrio. Actualmente, los anticonceptivos farmacéuticos utilizados se basan en hormonas (por ej. la píldora anticonceptiva), pero éstos pueden causar una diversidad de efectos secundarios indeseables en el que los usa, tanto a nivel físico como psicológico. Así, también existe una necesidad definida de métodos anticonceptivos alternativos y fármacos que puedan ser utilizados en la vida diaria con la misma facilidad y conveniencia como por ej. la píldora anticonceptiva, pero sin someter a los que la utilizan a los efectos secundarios indeseables a veces asociados con la misma.

Tumores Malignos

El proceso invasivo por medio del cual los tumores malignos se diseminan ahora pueden ser descriptos con mayor precisión como un proceso de remodelación de tejido no-regulado, continuo, donde progresivamente el tejido normal es incluido en el estroma tumoral por las células tumorales neoplásticas. En este proceso las barreras que normalmente definen la homeostasis del tejido diferenciado se pierden por la nueva señalización de células neoplásticas que se des-diferencian y que proliferan. La inclusión y reorganización de las células de tejidos normales progresivamente interrumpen o alteran la estructura del órgano, ya que las células neoplásticas se desarrollan y continuamente remodelan un estroma de sostén, completo con una nueva red capilar de sangre. La remodelación de tejido tumoral también está acompañada por el desprendimiento de células tumorales y su invasión activa de vasos sanguíneos y linfáticos, desde donde pueden provocar metástasis para formar nuevos tumores en lugares distantes, alejados.

Lo distintivo de la invasión remodeladora de tejidos es la degradación de la matriz extracelular existente, la estructura o el andamiaje que normalmente mantiene la integridad de estructuras de tejidos organizados. En especial, la membrana basal es una forma especializada de la matriz que normalmente forma una frontera adyacente a los tejidos epiteliales donde los carcinomas pueden aparecer. La membrana basal consiste en numerosas glicoproteínas, como proteoglicanos, fibronectina, laminina y colágeno tipo IV. Para degradar y atravesar la primera barrera representada por la membrana de base, es pre-requisito que los carcinomas que surjan en tejidos epiteliales adquieran la habilidad por sí mismos de secretar enzimas proteolíticas que puedan degradar proteínas de las membranas de base o inducir las proteasas requeridas en las células de tejido normal que son progresivamente incluidas dentro el estroma tumoral. Además, la proteólisis de la matriz extracelular puede, a su vez, estimular el crecimiento de tumores por la liberación y/o activación de factores de crecimiento y citoquinas (Mignatti, 1993). De ese modo, ciertas proteasas están altamente expresadas en tejido tumoral, incluyendo miembros de ambas familias de serinas-proteasas, por ej. el activador plasminógeno tipo uroquinasa (Dano, 1985) y de la familia de las metalo-proteasas (Liotta, 1990). El nivel de expresión de las diferentes enzimas, así como también de la distribución de tejido o patrón de expresión son importantes en la invasión. Se ha demostrado que una expresión aumentada de serinas-proteasas y metalo-proteasas es responsable de la invasión tumoral en varios modelos invasivos diferentes, tanto in vitro como in vivo. También es significativo que en el examen del patrón de expresión, ambas clases de enzimas se encuentran comúnmente juntas en tumores in vivo, incluso en los casos como por ej. carcinoma de colon, donde las células estromales (tejido normal incluido) han demostrado ser la fuente principal de proteasas (Pyke, 1991; Nielsen, 1996). Además el nivel de ambas uroquinasas (Ganesh, 1994) y colagenasas cuentan con valor prognóstico significativo al predecir aquellos pacientes que tendrán peor progreso de su tumor, por eso los niveles de ambas proteasas se refieren a la capacidad invasiva del tumor in vivo. El rol de las proteasas extracelulares en el crecimiento tumoral y metástasis es un tema de interés actual y de investigación. Sin embargo, no existen conclusiones en el arte concerniente a la relativa importancia de las diversas proteasas en la remodelación de tejidos dirigida al tumor (para publicaciones de recopilación, véase Hewitt y Dano, 1996; DeClerk, 1996; Mignatti 1993; Liotta 1990). La tarea se torna más compleja con el descubrimiento de un número aún mayor de clases de metalo-proteasas así como también de nuevos miembros de clases, por ej. las metalo-proteasas de la matriz (MT-MMPs) y de la familia de disintegrinas ADAM.

Curación de Heridas

Un modelo experimental útil especialmente para el estudio de la remodelación invasiva que tiene lugar en tumores es la remodelación de tejidos de una herida en proceso de cura (por ej. en la piel del ratón, Romer, et al, 1996). De hecho, los tumores han sido llamados "heridas que no curan" (Dvorak, 1986). En una herida de piel en proceso de cura la migración de los queratinocitos puede ser claramente observada, disectándose su paso a través de una matriz rica en fibrina (Romer et al, 1996). Esto está acompañado por neutrofilos infiltrados y macrófagos y formación de tejido de granulación que contiene capillares de sangre en formación (angiogénesis), todos procesos que se conocen que requieren la acción de enzimas proteolíticas, y necesarias para la remodelación de tejidos que cierra la herida (Martín, 1997). Varias de las enzimas proteolíticas expresadas están tanto en la curación de heridas como en la remodelación de tejido dirigido por el tumor, por ej. la gelatinasa B (MMP-9), estromelisina 1 (MMP-3) y uroquinasa (uPA). Además, la examinación del patrón de la expresión de proteasas en los tejidos ha reforzado el concepto de que la curación de heridas se asemeja en gran medida a la remodelación de tejidos en el cáncer. Como el proceso de cura de una herida puede iniciarse en animales adultos simplemente, por ejemplo al hacer una simple incisión en la piel de un largo definido, y puede ser medido por el monitoreo del cierre de la abertura en la superficie externa del animal, es un modelo muy adecuado para estudios cuantitativos del efecto en la remodelación de tejidos invasivo de las drogas seleccionadas en las distintas dosis y esquemas de administración (ver debajo). Los estudios en ratones con una deficiencia de plasminógeno por inactivación génica han demostrado pérdida en la capacidad de curación de heridas en aquellos ratones en comparación con ratones de tipo salvaje (Romer et al., 1996) debido a una disminución en la habilidad de los queratinocitos migratorios en disectar su paso a través de la matriz rica en fibrina (Romer et al., 1996 y Bugge et al., 1996). Estos estudios por primera vez demostraron inequívocamente el rol importante del plasminógeno en un proceso de remodelación invasiva de tejidos. Sin embargo, no existen conclusiones en el arte que se refiere a la importancia relativa de diversas proteasas degradadoras de la matriz en la curación de heridas. En este contexto es importante aclarar que la fibrina puede ser degradada por, por ej la estromelisina-1 (Bini 1996), y no sólo por plasmina.

Un caso especial de curación de heridas es aquel que se produce por una agresión química, una infección u otra agresión a la córnea del ojo, donde la degradación de matriz extracelular por enzimas proteolíticas producidas por células inflamatorias que se infiltran retrasa en lugar de promover el recrecimiento del epitelio sobre la superficie de la córnea. Este efecto se debe al requerimiento de un sustrato de matriz para posibilitar la adhesión y migración de las células epiteliales sobre la superficie de la herida. Inhibidores de enzimas proteolíticas han sido exitosamente utilizados en este caso para proteger el sustrato de la matriz de proteólisis mediada por células inflamatorias y por lo tanto realmente promueve la re-epitelialización de córnea (Schultz et al, 1992). De hecho, se ha comprobado que es más efectivo para estos fines la aplicación tópica de una mezcla que comprende un inhibidor metalo-proteasa (GM-6001, ver debajo), el factor de crecimiento epitelial, fibronectina (un componente de la matriz pericelular) y aprotinina (un inhibidor de serina-proteasa) sobre la superficie del ojo. La efectividad de esta mezcla sugiere que las metalo-proteasas y serina-proteasas pueden estar involucradas en la destrucción inflamatoria del sustrato de la matriz que retrasa la migración epitelial y la curación de la córnea, sin embargo, no se han realizado estudios contundentes de la importancia relativa de las diversas proteasas de las células inflamatorias en este modelo. Como se describe en WO 95/24921, la combinación de GM6001 y la Aprotinina también ha sido utilizada exitosamente para inhibir la contracción del tejido.

La invasión del trofoblasto

Otro ejemplo de remodelación invasiva se puede observar en la invasión del trofoblasto que tiene lugar luego de que el huevo fertilizado entra en el útero. En este proceso existe una rápida proliferación de células embrionarias que invaden el útero y la pared uterina donde forman la placenta (Harvey, 1995). El paralelo entre la remodelación de tejidos en la invasión trofoblástica e invasión tumoral está establecido en la existencia de un cono de trofoblastos que se forma en el blastocisto luego de la adhesión al epitelio uterino. Los trofoblastos penetran en la decidua uterina, atraviesan las estructuras de la membrana del primer tercio del miometrium y llegan a los vasos sanguíneos maternos, donde la invasión se detiene y la placentación aparece dominante, para que una nueva red de capilares sea formada para sostener el rápido crecimiento del embrión en desarrollo.

Como las células invasivas en los tumores, los trofoblastos invasivos expresan altos niveles de uroquinasa (Hofmann, 1994) y metalo-proteasas (Salamonsen, 1995), y los moduladores hormonales y los inhibidores de proteasas pueden inhibir la implantación. Algunos informes han reivindicado que tanto la uroquinasa como metalo-proteasas contribuyen de igual manera a la invasión trofoblástica in vitro (Yagel, 1988), otros informes reivindican que la actividad metalo-proteásica (MMp-9) contribuye más (Librach, 1991), y aún otros dicen que la uroquinasa no cumple ninguna función (Behrendtsen, 1992). Mientras existen indicios de que la hormona gonadotrofina coriónica retrasa la invasión trofoblástica en un modelo in vitro por medio de la reducción de la actividad tanto de la uroquinasa como de la colagenasa (Yagel, 1993), no existen indicios en cuanto a la relativa importancia de estos dos sistemas en la invasividad de los trofoblastos, mucho menos de los neoplasmas malignos.

Otros ejemplos de remodelación de tejido fisiológico incluyen la involución de la glándula mamaria luego de la lactancia (Feng, 1995), y la involución uterina luego del parto. Estos procesos también han demostrado ser dependientes del aumento de los niveles de expresión de proteasas degradadoras de la matriz, como en la remodelación invasiva de los tumores malignos.

Técnica anterior Tratamientos Experimentales utilizando Inhibidores de Proteasas

El uso tópico exitoso de la mezcla de un inhibidor de proteasa para curar heridas oculares ha sido mencionado en lo anterior (Schultz et al, 1992). Sin embargo, el uso tópico exitoso de dicha mezcla de inhibidor de proteasa para proteger el sustrato de la matriz depende de la posibilidad de acceso inmediato al sitio de su acción deseada. Debe aclararse que los métodos de arte previo que utilizan aplicación tópica no posibilitan, ni mucho menos sugieren ni hacen probable, la interferencia exitosa con la remodelación invasiva generalmente en un animal cuando dicha remodelación ocurre internamente en la víscera del cuerpo y compartimientos; acceso inmediato en dichos casos (por ej tumores) sólo puede obtenerse a través de la sangre circulante. De este modo, diferentes métodos de administración, dosis y programas de aplicación de inhibidores de proteasas seleccionados de especificidad apropiada deben definirse con el objeto de ofrecer una inhibición exitosa de la remodelación invasiva de tejidos a través de la administración sistémica de tratamiento. En este contexto, es instructivo repasar brevemente la literatura extensa acerca del tratamiento sistémico con inhibidores de proteasas en los modelos experimentales de tumores en animales.

El inhibidor de serina-proteasa aprotinina (Trasylol^{TM}, Bayer) y el inhibidor de plasmina ácido tranexámico
(Cyclokapron^{TM}, Kabi) han recibido mucha atención en el pasado, ya que ellos bloquean efectivamente los efectos de la activación plasminógena y tienen poco o ningún efecto tóxico secundario sistémico sobre una amplia variedad de dosage. La aprotinina en bajas concentraciones forma complejos de alta afinidad con la plasmina de tal manera que la enzima es inactivada, mientras que el ácido tranexámico bloquea la unión del plasminógeno y la plasmina a la fibrina y a la superficie de la célula, de manera que la activación plasminógena, la activación de la pro-uroquinasa mediada por plasmina y en última instancia de la fibrinólisis pueden potencialmente ser inhibidos.

Se ha informado en muchas oportunidades que la aprotinina reduce la tasa de crecimiento y/o la diseminación de las células tumorales transplantables en varios modelos tumorales de animales in vivo (por ej. Lage, 1978; Ohkoshi, 1980). Sin embargo, es notorio que en estos informes nunca se encontró que el tratamiento sistémico con aprotinina pudo completamente detener el crecimiento del tumor in vivo, mucho menos bloquear la formación de metástasis. De hecho, se observó que en algunos casos la aprotinina aumentó el número de metástasis.

El ácido tranexámico también ha sido testeado como un tratamiento sistémico en modelos experimentales de tumores animales, y con frecuencia se ha informado inhibición de crecimiento, a veces, asociado a la deposición de fibrina (Tanaka, 1982), pero nunca una completa detención de la progresión tumoral. El ácido tranexámico también ha sido usado para tratamiento sistémico en pacientes humanos con tumores malignos, principalmente en los estudios de Astedt y sus compañeros de trabajo (Astedt, 1977). En un principio, algunos resultados exitosos fueron obtenidos, que incluyen la encapsulación fibrosa de tumores de ovario (Astedt, 1980), pero, evidentemente, estos efectos positivos en unos pocos pacientes no siempre fueron obtenidos o sostenidos y el ácido tranexámico no fue recomendado para el tratamiento generalizado del cáncer. De igual manera, algunos intentos para inhibir el uPA, y la inhibición de la interacción del uPA con su receptor específico han producido algún control sobre el tumor, aunque no se obtuvieron completos controles de tumores in vivo (véase Dano et al., 1985 y 1994).

Recientemente, un método poderoso ha sido puesto a disposición para dilucidar los roles fisiológicos y patológicos de proteínas específicas en el organismo vivo. Este método poderoso es la inactivación dirigida de genes que da lugar a animales que específicamente totalmente carecen la expresión de una proteína de interés (llamados animales "knock out"). Por ejemplo, se han producido ratones que carecen completamente de plasminógeno (Plg-/- ratones; Bugge, 1995). El mero hecho de que ratones homocigotas Plg-/- nazcan es evidencia definitiva que la plasmina no es en sí misma esencial para el proceso de la invasión trofoblástica, un descubrimiento que no es sorprendente teniendo en cuenta el conocimiento del efecto limitado de la inhibición de la plasmina en la invasividad de los tumores y de las similitudes entre la invasión trofoblástica y la invasión tumoral (véase arriba). Por lo tanto, para muchos, la existencia de estos Plg-/- ratones ha quitado aún más el foco de atención del sistema plasminógeno/plasmina en las investigaciones en curso de las propiedades invasivas de los neoplasmas malignos.

Inhibidores apropiados de las metalo-proteasas con potencia suficiente y baja toxicidad para uso in vivo aparentan no haber estado disponibles hasta el advenimiento de N-{2R-2-(hidroxiamidocarbonimetil)-4-metilpentanoil)}-L-triptofan metilamida (a continuación: Galardin^{TM}; también conocido como GM-6001: Grobelny, 1992), que ha hecho posible por primera vez inhibir la acción de las metalo-proteasas in vivo. GM-6001 fue primeramente estudiado como un tratamiento tópico para la herida de córnea (Schultz et al, 1992; ver arriba).

Se ha descubierto, desde entonces, que Galardin^{TM} inhibe tanto las propiedades invasivas de una línea de células gliales tumorales productoras de gelatinasa in vitro (Boghaert, 1994) y la neo angiogénesis de la córnea promovida por extracto del tumor (Galardy, 1994) in vivo luego de la administración sistémica de Galardin^{TM}. Sin embargo, su habilidad potencial para inhibir el crecimiento del tumor y metástasis de manera sistémica en animales no ha sido reportada todavía, por la información con que contamos.

Otros inhibidores de metalo-proteasa sintéticos han sido preparados utilizando el método de la quelación de zinc, y resultados prometedores ya han sido obtenidos en la inhibición sistémica de la metástasis de un carcinoma mamario experimental (Eccles, 1996), así como también en la inhibición sistémica de neo- angiogénesis inducida por tumor. Estos resultados han conllevado a los desarrollos prometedores en la fase I-II de los ensayos clínicos con Batismastat (BB-94, "British Biotech") (Wojtowicz-praga, 1996), y en ensayos en fase I-II con una droga disponible relacionada, de suministro oral, Marimastat (BB-2516, Biotécnico Británico; Gore, 1996).

De nuestro conocimiento, el tratamiento combinado de tumores animales experimentales ya sea con BB-94 o BB-2516 e inhibidores de otros tipos de proteasas no han sido informados. La validez del descubrimiento anterior (Werb, 1977) que la plasmina activa la pro- colagenasa ha sido desde entonces mantenida y extendida para incluir la activación de pro- estromelisina (Murphy, 1992), pero mecanismos adicionales plasmina- independientes, que involucran metalo-proteasas del tipo membranoso (MT-MMPs), y que se aplican a otros miembros de la familia de metalo-proteasa (por ej la gelatinasa A) también existen.

Como conclusión, a pesar de las décadas de investigaciones acerca de la participación de ambas proteasas serinas y de metalo-proteasas, no se ha llegado a conclusiones en cuanto a la importancia de estas clases de enzimas y su posible relación en el desarrollo de la remodelación de tejido invasivo. La creencia general parece ser que ambas clases de enzimas están hasta cierto punto involucradas, pero su relativo grado de importancia no ha sido establecido.

Además, en el presente, la gran mayoría de los fármacos utilizados en el tratamiento sistémico de las enfermedades invasivas como son los cánceres son o bien altamente tóxicos y/o someten a los pacientes a efectos secundarios adversos en gran escala, y existe, por lo tanto, una fuerte necesidad de nuevos y alternativos enfoques en el tratamiento de dichas enfermedades.

Objeto de la invención

Es objeto de la invención proveer composiciones farmacológicas relativamente no- tóxicas para la inhibición de remodelación de tejido invasivo. Dichos fármacos podrán, de acuerdo con las enseñanzas referidas arriba, ser efectivas en el tratamiento de tumores malignos, pero ellos también constituirán alternativas interesantes a los conocidos métodos anticonceptivos farmacológicos. Por lo tanto, es también objeto de la invención proveer dichos fármacos antineoplásticos y anticonceptivos.

Resumen de la invención

Como se mencionó arriba, se han producido ratones que carecen totalmente de plasminógeno (plg-/- ratones). Los inventores han usado dichos ratones plg-/- como un sistema modelo con el objeto de investigar una posible relación entre las funciones del plasminógeno/plasmina y los sistemas de metalo-proteasa en la remodelación de tejido invasivo.

En el transcurso de este extenso trabajo, los inventores han descubierto sorprendentemente que el inhibidor de metalo-proteasa Galardin^{TM} no sólo inhibe, sino que totalmente bloquea la remodelación de tejido invasivo asociada con la curación de heridas en ratones Plg-/-, una observación que no puede ser duplicada en ratones de tipo salvaje (ratones plg+/+); mientras que los ratones deficientes en plasminógeno no tratados (plg-/-) así como también ratones de tipo salvaje (plg+/+) tratados con Galardin^{TM} son siempre capaces de curar heridas de piel, a pesar de que existen en ambos casos una fuerte demora, ratones plg-/- tratados con Galardin^{TM} pierden toda capacidad de reparación de la herida, véase Ejemplo 1. En otras palabras, se ha demostrado sorprendentemente que la ausencia simultánea de las acciones de la plasmina y de las metalo-proteasas inhibidas por Galardin^{TM} claramente inhiben la curación de heridas, es decir, producen un efecto sinérgico importante en una situación donde no se esperaba más que un efecto de adición. Además, efectos similares han sido demostrados en los otros procesos de remodelación de tejidos, donde, gestaciones normales, involución de la glándula mamaria post lactancia, e involución uterina luego del parto, fueron práctimamente eliminados en ratones plg-/- post administración de una dosis apropiada del inhibidor de metalo-proteasa galardin.

Al respecto, debe observarse que como los ratones plg-/- exhiben una fertilidadque es aproximadamente la misma que aquella de los ratones de tipo salvaje, se ha comprobado que un completo bloqueo de las acciones de la plasmina sola no posee una influencia detectable en la invasión trofoblástica, véase arriba. Además, como se muestra en el Ejemplo 2, la inhibición por Galardin^{TM} de metalo-proteasas en ratones de tipo salvaje no tiene un efecto significativo en su fertilidad. Por lo tanto, no era esperable a priori que la inhibición combinada de plasmina y metalo-proteasas tuviera un efecto significativo en la invasión trofoblástica.

Los nuevos descubrimientos por los inventores proveen no sólo la primera evidencia de la redundancia con respecto a las funciones de la plasmina, es decir que al menos uno de los efectos fisiológicos de la plasmina es duplicado por otras enzimas proteolíticas (es decir, el efecto fisiológico relacionado con la remodelación de tejido invasivo) a nivel molecular, pero también abre las puertas a un número de métodos terapéuticos para el tratamiento de tumores malignos en los que inhibidores de enzimas relativamente no- tóxicos serán utilizados en lugar de los agentes quimioterapéuticos tradicionales altamente tóxicos.

Para resumir, los inventores actuales han descubierto sorpresivamente que las acciones proteolíticas de la plasmina parecen ser duplicadas por ciertas metalo-proteasas y que por inhibir simultáneamente las acciones tanto de la plasmina como de las metalo-proteasas en cuestión, resulta posible obtener un efecto sinérgico que es de mucho mayor alcance que un simple efecto aditivo de los dos tipos de inhibición (véanse los ejemplos).

En otra extensión del descubrimiento, los inventores han imitado el efecto de la deficiencia del plasminógeno por medio de tratamiento con una combinación de dos inhibidores de plasmina que encuentran que retrasa sustancialmente la curación de la herida en piel, aunque no en el mismo grado que la deficiencia plasminógena. Estudios acerca de la farmacoquinesis de uno de estos inhibidores de plasmina sugieren que esto al menos se debe, en parte, a la muy corta vida media de este inhibidor y estudios subsiguientes del programa de administración apoyan esta presunción ya que ésta misma dosis total dividida en hasta cinco administraciones diarias retrasa el proceso de curación de heridas significativamente más que cuando ésta se divide en tres o cuatro administraciones diarias.

De acuerdo con estos descubrimientos se encontró que la combinación del inhibidor de metalo-proteasa y los inhibidores de plasmina conllevan a un retraso en la curación de heridas que era al menos aditiva, pero, por otro lado, no completa. Esto fue interpretado como que la actividad de plasmina residual era suficiente para completar la curación de una herida en la presencia del inhibidor de metalo-proteasa. La combinación de los inhibidores de metalo-proteasa con inhibidores de plasmina no llevó a una detectable disminución en la tasa normal de gestaciones en oposición a la completa eliminación observada con una combinación del inhibidor metalo-proteasa y una deficiencia plasminógena; la conclusión es que la actividad de plasmina residual fue suficiente para una normal implantación aún en la presencia de un inhibidor de metalo-proteasa.

Además, el tratamiento del tumor de pulmón de Lewis trasplantado, altamente metástico, con el inhibidor de metalo-proteasa y con los dos inhibidores de plasmina mostraron que cada uno de estos dos regímenes de tratamiento conllevan a un retraso sustancial en el crecimiento del tumor, y que cuando se combinaron, hubo un fuerte efecto aditivo de los dos regímenes en este parámetro. Ambos regímenes, también por su cuenta, prolongaron la supervivencia de los ratones, un efecto que también fue observado en el grupo de ratones que recibió la combinación de los regímenes. En este último grupo, hubo sorpresivamente tres de 17 ratones que fueron sobrevivientes a largo plazo (más de 300 días) en oposición a ningún sobreviviente a largo plazo en cualquiera de los dos grupos tratados con sólo un tipo de inhibidor y similarmente no hubo sobrevivientes a largo plazo en el grupo control (tratado mock). El tratamiento combinado con los dos tipos de inhibidor, en consecuencia, conlleva a un claro efecto sinérgico con respecto a la supervivencia. Se contempla que, de acuerdo con los estudios de curación de heridas, la supervivencia de todos los ratones puede ser obtenida por una combinación de inhibición de metalo-proteasa y una completa eliminación de actividad de plasmina, por ej. utilizando un número suficiente de ratones criados especialmente con deficiencia plasminógena, cuando dichos ratones estén disponibles.

Por lo tanto, en un sentido amplio y general, la invención concierne al uso de una composición para la elaboración de un medicamento con el fin de prevenir o detener la remodelación invasiva en el mamífero. La composición logra 1) la inhibición o abolición del acciones proteolíticas in vivo de la plasmina, así como también de los derivados activos del mismo en el mamífero y 2) simultáneamente con el mismo inhibe o suprime las acciones proteolíticas in vivo, de al menos, una enzima proteolítica que es diferente de la plasmina, así como también de los derivados activos del mismo que ejerce su acción en, al menos, una proteína extracelular, dicha al menos una enzima proteolítica es/son análoga/s no murina (incluyendo humana) de las enzimas murinas que aisladas, o en combinación, es/son esenciales para la implantación embrionaria y/o curación de heridas en Plg-/- ratones pero no en ratones de tipo salvaje.

Se prefiere que las acciones proteolíticas in vivo de la plasmina (y los derivados activos de la misma) y/o de al menos una enzima proteolítica diferente de la plasmina, sean sustancialmente eliminadas, ya que hasta una pequeña actividad residual puede lograr que la remodelación invasiva pueda llevarse a cabo.

Como se detallará más abajo, la inhibición y/o eliminación de las acciones proteolíticas de ambas clases de enzimas pueden lograrse de diversas maneras, aunque un embodimento interesante de la invención es el uso de la composición para la fabricación de un medicamento que puede ser usado para administrarle al mamífero, preferentemente de manera sistémica, una cantidad efectiva de una combinación de 1) al menos una primera sustancia que, en el mamífero, logrará la inhibición de las acciones proteolíticas in vivo de la plasmina, así como también de los derivados activos de la misma, y 2) al menos una segunda sustancia, que, en el mamífero, logra la inhibición de las acciones proteolíticas in vivo de, al menos, una enzima proteolítica que es diferente de la plasmina, así como de los derivados activos de la misma y que ejerce su acción en, al menos, una proteína extracelular; dicha segunda sustancia siendo una sustancia que administrándose en una cantidad efectiva, dará como resultado una inhibición significativamente mayor de implantación embrionaria y/o curación de heridas en Plg-/- ratones que en los ratones de tipo salvaje, la primera y la segunda sustancia siendo administrada preferentemente de manera sistémica, ya sea simultáneamente o con un intervalo tal que ambas estén simultáneamente presentes en las concentraciones que logran la inhibición sustancial in vivo, preferentemente bloqueando, sus respectivas proteasas dianas.

El término "prevenir" indica un acontecimiento profiláctico, es decir, las células que podrían haber exhibido una remodelación invasiva si no se hubiera ejercido el método de invención, no exhibirían la remodelación invasiva en la instigación efectiva de la composición de la invención, mientras que el término "detener" se utiliza en lo que se refiere a la remodelación que ya es invasiva, pero que se frena como consecuencia de la aplicación de la composición de la invención.

El término "inhibición" tiene su uso actual en el contexto siguiente, es decir, un bloqueo total o parcial de la actividad proteolítica de la enzima pertinente. Por el contrario, cuando se "elimina" la actividad proteolítica en cualquiera de los dos grupos de enzimas, no se debería detectar actividad enzimática residual al instigarse el tratamiento inventivo. Como se explicó arriba, este es un embodimento que se prefiere en las composiciones utilizadas, ya que los experimentos revelados en el presente demuestran sin ambigüedades que con el objeto de obtener una prevención/detención de la remodelación invasiva en dos sistemas de modelos (implantación y curación de heridas), se precisa que, al menos, las actividades de la plasmina y sus derivados activos sean eliminados.

Si una de las actividades enzimáticas es de hecho eliminada, notablemente aquella de la plasmina o sus derivados, se espera que ocurran efectos secundarios, por ej conjuntivitis leñosa (ligneous conjunctivitis). Por lo tanto, en dicha situación, se deberán tomar precauciones para aliviar estos efectos secundarios, por ej administrando plasminógeno local al paciente. Un ejemplo sería suministrar plasminógeno directamente en el ojo para evitar conjuntivitis leñosa o en aerosol a las vías respiratorias para evitar obstrucciones respiratorias debido a que el moco se torna demasiado viscoso. De todas maneras, se ha demostrado que los efectos secundarios son reversibles.

El término "remodelación invasiva" (o "remodelación de tejido invasivo") se refiere, en general, a procesos que se caracterizan por la migración de células, activación y/o liberación de factores de crecimiento, invasión y degradación de tejido, tales como las asociadas con el crecimiento de tumores malignos, la invasión de endometrio uterino por los trofoblastos de un embrión implantado, la migración de queratinocitos reparadores en una herida en curación, y la infiltración de un sitio de inflamación crónica por macrófagos, neutrófilos y T- linfocitos, y ciertas infecciones bacterianas y/o hongos y/o protozoos y/o virales que están acompañadas de degradación de tejido (por ej. fascietis necrotizante causado por ciertas líneas de Streptococcus strains así como también de la enfermedad de Lyme causada por la Borrelia burgdorferi sensu lato).

Por inhibición/supresión "simultánea" se entiende aquí que ambos tipos de actividad enzimática están inhibidos al mismo tiempo. En esencia, se prefiere que dicha inhibición/supresión simultánea se sostenga por un período continuo más largo con el fin de asegurar que las células de remodelación invasivas no encontrarán "ventana en el tiempo" donde la remodelación invasiva pueda reanudarse. Por lo tanto, es necesario determinar las dosis y concentraciones farmacológicamente efectivas de por ejemplo las sustancias utilizadas con el objeto de lograr los efectos y a partir de allí es también necesario asegurarse que dichas concentraciones sean mantenidas en el nivel necesario para sostener la acción simultánea. Para mayores detalles, véase el comentario posterior de la determinación de las concentraciones efectivas de sustancias utilizadas de acuerdo con la invención.

Cuando se discute sobre "los derivados activos" de la plasmina se refiere a los derivados de la plasmina que tienen lugar naturalmente, que pueden ser encontrados in vivo. La mayor parte de estos son productos proteolíticos de la plasmina y un ejemplo notable es la miniplasmina.

El término "proteína extracelular" significa una proteína que constituye parte de la fase extracelular. Ejemplos preferidos son los de las proteínas de la matriz extracelular presente en la matriz extracelular en donde las células están insertadas, la fibrina y los factores de crecimiento. Dichas proteínas son muy conocidas en el arte y comprenden varias formas de colágeno, elastina, y proteoglicanos. Ejemplos preferidos de proteínas extracelulares, cuyas proteólisis deben ser inhibidas son la fibrina, la fibronectina, laminina, que transforman el factor de crecimiento \beta(TGF\beta), TNF\alpha el factor básico de crecimiento del fibroblasto, y los precursores TGF\beta o de otros factores de crecimiento.

Los "al menos una enzima proteolítica que es diferente de la plasmina así como también de los derivados activos de la misma" es cualquier otra enzima proteolítica que ejerce un efecto proteolítico in vivo en las proteínas extracelulares que también son proteolizados o cortados por la plasmina. Se detallan más abajo ejemplos específicos de dichas enzimas proteolíticas.

Las "análogas no-murina (incluyendo humana) de enzimas murinas" mencionados arriba son aquellas proteínas homólogas que se encuentran en un sistema no murino. Por lo tanto, si la enzima proteolítica no murina en cuestión es por ej. la metalo-proteasa MMP-3, entonces la analogía humana del mismo es la metalo-proteasa que en el hombre comparte el mismo grupo de sustratos y que, al mismo tiempo, cuenta con una homología de secuencia (y está codificada por un gen homólogo) que lo definiría como el homólogo más cercano en el sistema humano que aquél un ratón.

Cuando se afirma que una análoga murina de la enzima proteolítica en cuestión es "esencial" para la curación de heridas o implantación en un Plg-/- ratón simplemente se quiere decir que un cierto nivel de actividad de la enzima proteolítica análoga murina es/son necesarias para la curación de heridas o implantación en dicho ratón. Como se demostró en los ejemplos, las metalo-proteasas inhibidas por Galardin^{TM} son necesarias para la implantación y curación de heridas, respectivamente, en Plg-/- ratones, pero no en los ratones en estado natural (Plg+/+). En otras palabras, cuando la plasmina está totalmente ausente, el rol de las metalo-proteasas inhibidas por Galardin^{TM} se convierte en primordial para que estos dos acontecimientos fisiológicos de invasión de células tengan lugar.

Según entienden los inventores, nunca se ha demostrado antes que una combinación de inhibición sustancialmente total, por un lado, del sistema del plasminógeno/plasmina y por otro, un conjunto de metalo-proteasas pueden conducir a una supresión total de la remodelación invasiva y como tal supresión, en el caso del cáncer, convierte al tumor maligno en benigno, este enfoque novedoso se cree que es prometedor para futuras estrategias para combatir el cáncer.

Descripción detallada de esta invención

Como se mencionó anteriormente, se prefiere administrar sustancias que inhibirán y o eliminarán los efectos proteolíticos por la plasmina y sus derivados, por un lado, y otras enzimas proteolíticas por el otro. Se entenderá, sin embargo, que dicho conjunto de efectos farmacológicos podrán ser incorporados en una sola sustancia y por lo tanto, la invención también concierne el uso para la manufactura de un medicamento de la composición de la invención en el que una cantidad efectiva deberá ser administrada, de al menos una tercera sustancia que, en el mamífero, logra la inhibición tanto de las acciones proteolíticas in vivo de la plasmina, como de los derivados activos de la misma y de las acciones proteolíticas in vivo de al menos una enzima proteolítica como se define arriba, dicha al menos una tercera sustancia/s siendo una/s que al administrarse en una cantidad efectiva, resulte en una inhibición significativamente mayor de implantación embrionaria y/o curación de herida en Plg-/- ratones que en los ratones de tipo salvaje. Por consiguiente, la primera y la segunda de las sustancias mencionadas arriba pueden ser tal tercer sustancia, lo importante es que una inhibición sustancial se logre tanto en el sistema plasminógeno/plasmina como en el sistema que comprende la otra enzima proteolítica.

Como se evidencia en los ejemplos revelados aquí, los principales candidatos para inhibir dentro de las enzimas proteolíticas, aparte de la inhibición obligatoria de la plasmina (y sus derivados activos) son las metalo-proteasas, es decir. las enzimas proteolíticas que son únicamente activas en la presencia de ciertos iones metales, notablemente iones de zinc. Preferentemente, la metalo-proteasa es seleccionada de un grupo que consiste en una colagenasa, una estromelisina, una gelatinasa, una elastasa, y una metalo-proteasa de tipo membranoso.

Ejemplos preferidos de colagenasas son MMP-1, MMP-8, y MMP-13. Los ejemplos preferidos de estromelisinas son MMP-3, MMP-7, MMP-10, y MMP-11. Además, la gelatinasa es preferentemente MMP-2 o MMP-9. La elastasa es convenientemente MMP-12. Por último, la metalo-proteasa de tipo membranoso es preferentemente MMP-14, MMP-15, y MMP-16.

A pesar de que las metalo-proteasas, como se menciona más arriba, son las primeras candidatas para inhibir de las proteasas, puede haber otras enzimas como posibilidad práctica. Las proteasas de cisteína, notablemente catepsina B y catepsina H son ejemplos importantes de no- metalo-proteasas. La invención no está, sin embargo, limitada a la inhibición de los ejemplos específicos mencionados arriba. Se sobreentiende que aquellas proteasas que deben ser inhibidas de acuerdo con la invención se prevee que serán aquellas que a nivel del sustrato tienen, por lo menos, una acción en común con la familia de plasmina de las proteasas, o en otras palabras, que sean capaz de reemplazar a la plasmina cuando la concentración de plasmina se torne un factor limitante vis a vis el potencial proteolítico total.

Como se menciona más arriba, una cantidad de condiciones son conocidas en donde la remodelación invasiva juega un rol predominante. De acuerdo con la invención es posible interferir con el progreso de estas condiciones como consecuencia de la interferencia con la habilidad general de las células en cuestión para cortar proteínas extracelulares.

El grupo de condiciones más importante a tratar por medio de la utilización de composiciones de la invención es el grupo de neoplasmas malignos. Como bien se sabe, el motivo mas importante para la letalidad de los neoplasmas malignos es el carácter invasivo de las células neoplásticas que se refleja en su habilidad para cruzar los bordes entre los distintos tipos de tejidos (tanto por remodelación invasiva directa en el sitio del tumor primario como durante la metástasis).

Por lo tanto, de acuerdo con la invención, la remodelación invasiva que es inhibida/detenida es preferentemente a aquella con un neoplasma maligno.

Dicho neoplasma maligno puede ser cualquier tumor sólido conocido o tumor del sistema hematopoyético, la patogénesis del cual se caracteriza por una remodelación invasiva. Neoplasmas malignos preferidos a ser tratados por las composiciones de acuerdo con la invención son seleccionados del grupo que consiste en carcinomas como el adenocarcinoma y carcinoma de célula escamosa, y sarcoma tales como el liposarcoma, fibrosarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma, leiomiosarcoma, rhabdomiosarcoma, glioma, neuroblastoma, meduloblastoma, melanoma maligno, neurofibrosarcoma, hemangiosarcoma, y linfogiosarcoma. También los teratomas, disgerminomas, seminomas, y coriocarcinomas malignos, así como también ciertos neoplasmas sistémicos (es decir, de origen hematopoyético) son interesantes como objeto de tratamiento, en particular la leucemia, como la leucemia aguda (AL), leucemia crónica (CL), leucemia aguda de células T, T-cell (T-ALL), leucemia aguda de celulas B-cell (B-All), leucemia crónica de T-cell (T-CLL), leucemia crónica de B-cell (B-CLL), leucemia prolimfocítica (PLL), leucemia aguda indiferenciada (AUL), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia mielomonosítica crónica (CMML), leucemia promielocítica aguda (APL), pre-B-ALL, y pro-B-All;

Linfoma tal como el linfoma de Burkitt (BL), linfoma no- Hodgkins (NHL), linfoma de Hodgkins (HL), linfoma folicular (FL), linfoma de célula grande difusa (DLCL), linfoma de T-cell, linfoma de B-cell; y mielodisplasia.

Los neoplasmas preferidos para ser tratados por la composición, de acuerdo con la invención, son los carcinomas y adenocarcinomas, preferentemente de pulmón, de mama, de próstata, y de colon, pero obviamente existen otros neoplasmas invasivos y/o metastásicos que son candidatos para los tratamientos de acuerdo con la invención.

Otras enfermedades se caracterizan por tener un elemento de remodelación invasiva. Algunos miembros destacables de este grupo son las enfermedades inflamatorias crónicas como la enfermedad inflamatoria de intestino (por ej. la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, y las artritis inflamatorias, como la artritis reumatoide; algunas condiciones de la piel, como la psoriasis y pemphigus bullosa; condiciones/enfermedades que se caracterizan por la invasión de macrófagos, la demielinización de tejido nervioso (por ej. la esclerosis múltiple y la encefalitis) y arteriosclerosis; desórdenes degenerativos del sistema nervioso central (ej. la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson); infecciones fúngicas como la Candida albicans; y ciertas infecciones bacteriales con agentes infecciosos como Clostridium perfringens, Cryptococcus neoformans, y varias líneas y aislamientos de Yersinia spp. y Streptococcus spp. Existen aspectos interesantes de la invención que conciernen al uso para la manufactura de un medicamento con la composición de la invención para el tratamiento de las enfermedades indicadas arriba.

Por último, como se demostró en el Ejemplo 2, la composición de la invención es un método anticonceptivo remarcablemente eficaz que utiliza una estrategia totalmente diferente de la disponible en la actualidad, basada en un anticonceptivo hormonal. Por lo tanto, una importante incorporación a la invención es el uso de los métodos de la invención en la anticoncepción.

Como se comentó arriba, una incorporación preferida de la invención incluye la administración, preferentemente sistémica, de al menos una primera sustancia y al menos una segunda sustancia (y opcionalmente al menos una tercera sustancia, que puede o no ser idéntica, a la al menos una primera sustancia o al menos una segunda sustancia).

Ejemplos preferidos de al menos una primera sustancia son la aprotinin, tranexamic acid, N\alphatrans-4-aminometilci-clohexane carbonyllysine 4 benzoylanilide, N\alphatrans-4-aminometilciclohexane carbonyl-o-bromobenzyloxycarbonyltyrosine-4-acetylanide, 1-(ethoxy-carbonyloxy)ethyl trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxylate hydrochloride (KABI 2161), alpha-2-antiplasmin, alpha-2-makroglobulin, inhibidor de tripsina urinaria, leupeptin, pyroglutamyl-Leu-Arg-CHO, 6-aminocaproic acid, p-aminobenzamidine, bis (5-amidino-2-benzimidazolyl) methane, alpha-N-acetyl-L-lysine methyl ester, tosyl-lysine chloromethyl ketone, o Boc-D-Phe-ProBoro-Arg-OH, es decir, todos los inhibidores conocidos del sistema plasminógeno/plasmina que pueden ser usados in vivo con toxicidad aceptable.

Ejemplos preferidos de al menos una segunda sustancia son inhibidores de tejido de metalo-proteasas (como ser TIMP-1, TIMP-2, y TIMP-3), alpha-2-macroglobulin, Galardin tm, N-{2R-2-(hydroxamidocarbonylmethyl)-4-methylpentanolyll-L-tryptophanmethylamide, batimastat, marimastat, Gl 129471, Gl168, Gl 173, Gl 179, Gl 184, CL-A, Cl-B, RP59794, SC-44463, Ro31-4724, CT1746, SCH 47890, un peptide hydroxamate (tal como Pro-Leu-Gly-NHOH), LMHKPRCGVPDVGG, inhibidor de la proteasa de liberación de TNF\alpha, Zincov, Pro- Ileu, phosphoramidon, thiorphan, tiopronin, una tetraciclina, N-acetilcisteína, EDTA, o 1,10 phenanthrolene, es decir, inhibidores conocidos de metalo-proteasas que pueden ser usados in vivo con toxicidad aceptable. Además, varios profármacos de Galardin^{TM} también serían candidatos interesantes.

La al menos una tercera sustancia incluye ambas actividades de inhibición proteolítica de la primera y segunda sustancia dentro de la misma entidad química. Ejemplos preferidos son una conjugación de Galardin^{TM} con aprotinina (por ej. un éster de un sitio activo lisina carboxi terminal de aprotinina con una función hidroxamato de Galardin^{TM}, véase Mehlich et al. 1988, Biochim. Biophys. Acta, 957 (3): 420-429), una conjugación de Galardin^{TM} con ácido tranexámico (ej. Un espaciador entre una amida de Galardin^{TM} y un grupo amino de ácido tranexámico), y una conjugación de Galardin^{TM} con leupeptina (por ej. una amida formada de una función carboxi de Galardin^{TM} y el amino terminus de leupeptina). De acuerdo con la invención, no sólo es una posibilidad interesante lograr la abolición o inhibición por medio de la inhibición directa de las mismas proteasas, pero también inhibir posibles proenzimas de las mismas (por ej. proMMP), inhibiendo la posible activación de las proteasas (por ej. la inhibición de uPA o tPA, activador plasminógeno del tipo de tejido), inhibiendo la transcripción de ARNm que codifica las enzimas/proenzimas, y inhibiendo la transcripción de ADN a ARN que codifican las enzimas proenzimas. Todas estas estrategias pueden ser utilizadas solas o combinadas.

Específicamente, la inhibición de la producción de las enzimas/proenzimas puede ser lograda en un número de maneras que pueden, de hecho, ser más efectivas al producir un bloqueo total de la producción de las enzimas relevantes o sus formas activas (tanto de la familia de plasmina y de otras enzimas proteolíticas a ser bloqueadas). Los ejemplos que se destacan serían el bloqueo de la formación de la plasmina por la activación del plasminógeno, este bloqueo se lograría por medio de la inhibición ya sea de uPA o tPA o notablemente por la inhibición de la interacción entre uPA y su receptor en la superficie de la célula, uPAR (Dano et al. (1994), Fibrinólisis 8: 189-203, WO 90/12091, EP-A-O 691 350, WO 92/07083). En este contexto, es interesante destacar que los ratones totalmente deficientes en uPAR no exhiben efectos secundarios visibles.

Por ejemplo, la aplicación de tecnología antisentido en el que los fragmentos nucleótidos antisentido (o hasta los fragmentos PNA) que bloquearán la transcripción de ARNm a la proteína son utilizados se cree que proveerá un bloqueo efectivo de los efectos proteolíticos de las proteínas relevantes. Debido a que la información secuencial existe prácticamente para todas las metalo-proteasas conocidas y como los componentes del sistema plasminógeno/plasmina son muy conocidos, es cuestión de un mero trabajo de rutina por parte de una persona capacitada proveer los fragmentos de ácido nucleico antisentido relevantes a fin de instrumentar un bloqueo de transcripción de la proteína en cuestión.

De igual manera, la tecnología ribozyme puede proveer los mismos resultados dirigiendo una RNase para la secuencia ARNm relevante y, de ese modo, romper el objetivo ARNm y asegurar que la transcripción no sucederá.

Además, varias técnicas de transferencia de genes pueden ser empleadas. Por ejemplo, la introducción de un represor inducible (por ej. que actúa a nivel de actividad de los factores de transcripción) que controla un gen de interés que codifica una de las enzimas proteolíticas que proveerá la opción de en forma selectiva detener la producción de la enzima proteolítica. O bien, la introducción de una secuencia de un gen inducible que codifica un ARN antisentido para una de las enzimas proteolíticas relevantes es también una posibilidad interesante.

Otra parte de la invención concierne a las composiciones, por ej. las composiciones farmacéuticas, que comprenden 1) al menos una primera sustancia como se define arriba y 2) al menos una segunda sustancia como se lo define arriba, las cantidades relativas de al menos la primera y al menos la segunda sustancia estando así relacionadas que la administración simultánea o secuencial de una cantidad efectiva de la misma al mamífero conllevará a una prevención efectiva o detención de la remodelación invasiva en dicho mamífero. Por supuesto que la composición de la invención puede también comprender al menos una tercera sustancia como se define y comenta arriba.

Por último, la primera, segunda y tercera sustancia definidas arriba pueden, de acuerdo con la invención, ser utilizadas en la producción de composiciones adaptadas para el tratamiento de cualquiera de las condiciones comentadas arriba, notablemente para el tratamiento de los neoplasmas malignos, así como en la producción de composiciones para contracepción.

Además de las sustancias específicas mencionadas arriba, los derivados de las mismas que muestran una actividad del mismo tipo como la sustancia específicamente mencionada son también útiles para los fines de la invención presente. El tipo de derivados que se tienen en cuenta dependerán, obviamente, del carácter específico de la sustancia en cuestión, pero como ejemplos generales de los derivados que pueden ser relevantes para muchas de las sustancias pueden ser mencionadas la introducción o cambio de los sustituyentes de alquil (típicamente con un largo de cadena de uno a cinco átomos de carbono) en las cadenas alifáticas, cicloalcanos, sistemas de anillos aromáticos y heterocíclicos, introducción o cambio de los sustituyentes como los halógenos o grupos nitro, cambio en el tamaño del anillo de los cicloalcanos, cambio en los sistemas de anillos aromáticos o heterocíclicos, cambio en los sustituyentes de alquil en los átomos O y N, cambio en la parte de alcohol de los grupos éster, y reemplazo bioisostérico de grupos funcionales, especialmente el uso de bioisosteres de ácido carboxylico, tales como los ácidos fosfónicos, ácidos fosfínicos, tetrazoles, 3-hidroxi-isioxazoles, sulfonamidas y ácidos hidroxámicos. Las sales de compuestos ácidos o básicos serán igualmente útiles comparados con los ácidos libres o bases libres. En caso de compuestos racémicos, los racematos, así como también los enantiomeros puros y diastereoisomeros pueden ser usados, y se requieren en el caso de sustancias que interactúan con la acción antagónica. De hecho, los derivados a ser utilizados deben ser derivados que, además de su actividad deseada, demuestren una aceptable baja toxicidad, y, en general, los derivados deben ser farmacológicamente aceptables, tal como las sustancias mismas.

La sustancia utilizada de acuerdo con la invención puede ser administrada como tal o en la forma de un profármaco adecuado del mismo. El término "profármaco" indica un derivado biorreversible del fármaco, el derivado biorreversible es sustancialmente y terapéuticamente inactivo per se pero que es capaz de convertirse en el cuerpo en una sustancia activa por un proceso enzimático o no enzimático.

De ese modo, ejemplos de profármacos adecuados de las sustancias utilizadas de acuerdo con la invención incluyen compuestos obtenidos por la derivación biorreversible apropiada de uno o más grupos reactivos o derivados de la sustancia madre que resultará en un derivado biorreversible. La derivación puede ser realizada para obtener una biodisponibilidad mayor de la sustancia activa, con el fin de estabilizar una sustancia activa que en su defecto sería inestable, para incrementar la lipofilicidad de la sustancia administrada, etc.

Ejemplos de tipos de sustancias que pueden ventajosamente ser administradas en la forma de profármacos son ácidos carboxílicos, otros grupos ácidos y aminas, que pueden hacer que resulte más lipofilico por una adecuada derivatización biorreversible. Como ejemplos de grupos adecuados se pueden mencionar los ésteres biorreversibles o amidas biorreversibles. Los aminoácidos son ejemplos típicos de sustancias que, en su forma no modificada, pueden tener una baja absorción al administrarse. Derivados de profármacos adecuados de los aminoácidos serán uno o ambos de los tipos mencionados arriba de los derivados biorreversibles.

Para la administración a un paciente, una sustancia que tiene cualquiera de las actividades como se definen arriba o un profármaco del mismo es preferentemente formulada en una composición (farmacéutica) que contiene una o más sustancias que tienen cualquiera de las actividades definidas arriba o profármacos del mismo y uno o más excipientes farmacéuticos aceptables.

La composición que comprende una combinación de sustancias de acuerdo con la invención sirve como un sistema para la administracion de la droga. En este contexto, el término "sistema de administración de droga" indica una composición (una forma farmacéutica o una forma de dosificación) que al administrarse presenta la sustancia activa al cuerpo del humano o del animal. De ese modo, el término "sistema de administración de droga" adopta composiciones simples, así como también, las formulaciones más sofisticadas y la composición puede estar presentada de la siguiente manera, por ej un líquido, un spray, una solución, una dispersión, una suspensión, una emulsión, comprimidos/ tabletas, cápsulas, píldoras, polvos, granulados, geles que incluyen hidrogeles, lociones, pastas, ungüentos, cremas, esparadrapos, vendajes, vendajes de hidrogel, vendajes hidrocoloides, films, espumas, láminas, apósitos, yesos, sistemas de administración, supositorios, enemas, implantes, aerosoles, microcápsulas, microesferas, nanopartículas, liposomas y otras formas adecuadas.

La elección de excipiente/s apto/s para uso farmacéutico en una composición de acuerdo con la invención y la concentración óptima del mismo no puede generalmente ser pronosticada y debe estar determinada sobre la base de una evaluación experimental de la composición final. Sin embargo, los métodos para ello son generalmente conocidos y las composiciones pueden estar formuladas de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional, véase, por ej., "Las Ciencias Farmacéuticas de Remington" y la "Enciclopedia de la Tecnología Farmacéutica" editada por Swarbrick, J. & J. C. Boylan, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1988.

De ese modo, la sustancia o sustancias y/o profármacos del mismo a ser administrados pueden estar formuladas en las composiciones en medios farmacéuticos aceptables, el carácter de los cuales están adaptados al carácter químico de la sustancia. Las composiciones pueden estar adaptadas para la administración por cualquier método apropiado, por ejemplo el parenteral (tal como el intravenoso e intraarterial), intraperitoneal, intramuscular, subcutáneo, intradérmico, oral, bucal, sublingual, nasal, rectal o la administración transdérmica.

En una composición de acuerdo con la invención, la combinación de sustancias están generalmente presentes en una concentración comprendida desde alrededor de 0.01% hasta alrededor de 99.9% p/p.

La concentración de la combinación en una composición depende de la naturaleza del segundo compuesto en cuestión, su potencia, la gravedad de la enfermedad a ser prevenida o tratada, la edad y condición del paciente, y los efectos secundarios potenciales. Los métodos aplicables para seleccionar concentraciones relevantes de la combinación en una composición son muy conocidos para una persona capacitada en el arte farmacéutico y pueden ser realizados de acuerdo con las pautas para la buena práctica clínica (GCP) o Investigational New Drug Exemption (regulaciones "IND") como se describe por ej en Drug Applications, Nordic Guidelines, NLN Publication Nº 12, Nordic Council on Medicines, Uppsala 1983. Una persona capacitada en el arte, por medio del uso de los métodos descriptos en textos estándares, pautas y regulaciones tales como se describen arriba así como también conocimiento general dentro del campo, podría ser capaz de seleccionar el régimen de dosis exacto a implementarse para cualquier combinación y/o sustancia activa seleccionada y forma de dosis utilizando meros procedimientos de experimentación rutinarios.

Sin embargo, es relativamente simple titular la dosis útil de las sustancias utilizadas de acuerdo con la invención. Si uno comienza con la primera sustancia, y por el uso de técnicas conocidas en el arte determina la concentración máxima farmacológicamente aceptable, se prefiere que al menos una primera sustancia se administre en una cantidad que de lugar a una concentración que se encuentra en la máxima concentración farmacológicamente aceptable de dicha primera sustancia sola (tanto sistémicamente como localmente) o por debajo de la misma, y, cuando la concentración esté por debajo de la concentración máxima farmacológicamente aceptable de la primera sustancia sola, dicha concentración es una que conlleva sustancialmente a la misma inhibición que la de la concentración máxima farmacológicamente aceptable de la primera sustancia sola, y, frente a una titulación similar, la al menos una segunda sustancia se administra en una cantidad que da lugar a una concentración que, cuando la segunda sustancia se administra simultáneamente con la administración de al menos una primera sustancia o luego de la misma, se encuentra en la máxima concentración farmacéuticamente aceptable, o por debajo de la concentración apta para uso farmacéutico (sistémicamente y localmente), y que si se encuentra por debajo de la concentración farmacológicamente aceptable es una concentración que sustancialmente da lugar a la misma inhibición que la máxima farmacológicamente aceptable.

Una consideración similar puede, obviamente, ser aplicada cuando comenzamos desde al menos una segunda sustancia y desde allí titulando la cantidad óptima de la primera sustancia.

Para al menos una tercera sustancia definida arriba, debe preferentemente ser administrada, basados en una titulación similar, en una cantidad que dé lugar a una concentración al nivel de la concentración máxima farmacológicamente aceptable de la tercera sustancia sola o por debajo de la misma (tanto sistémicamente como localmente), y cuando la concentración está por debajo de la máxima concentración farmacológicamente aceptable de la tercera sustancia sola, dicha concentración es aquella que da lugar sustancialmente a la misma inhibición que la concentración máxima farmacológicamente aceptable de la tercera sustancia sola.

Al utilizar el esquema indicado arriba para determinar las concentraciones útiles de la primera y segunda sustancia, se asegura que el efecto farmacológico de cualquiera de las sustancias siempre será sustancialmente el mismo que aquél logrado cuando se utiliza la concentración máxima farmacologicamente aceptada. Se sobreentiende, sin embargo, que luego de la titulación de las sustancias de acuerdo con estas reglas, podrá todavía obtenerse un efecto farmacológicamente máximo de la "sustancia inicial" en la titulación. Por ejemplo, cuando se comienza con la primera sustancia, y habiendo titulado una cantidad útil de concentración de la segunda sustancia como se indica arriba, la primera sustancia también puede ser administrada en una cantidad que cuando se administre simultáneamente con la administración de la segunda sustancia o luego de la misma, dé lugar a una concentración que resulte en la misma inhibición sustancial que la máxima farmacológicamente aceptable. De hecho, este esquema también puede ser invertido con respecto a la sustancia inicial en la titulación.

En general, Las sustancias fisiológicamente aceptables o profármacos son normalmente administrados en una dosis diaria de entre 1 mg y 1000 mg para una persona adulta, normalmente está entre de los 10 mg y 800 mg, por ejemplo en forma oral entre 10 mg y 400 mg; o la dosis intravenosa, subcutánea o intramuscular está entre 0.1 mg y 100 mg, preferentemente entre 0.1 mg y 100 mg, preferentemente entre 0.1 y 50 mg, como por ejemplo entre 1 mg y 25 mg de la sustancia. La sustancia o profármaco es preferentemente administrada de 1 a 4 veces por día. Como se mencionó arriba, la administración normalmente apunta a mantener una concentración terapéuticamente efectiva de la sustancia en el plasma por al menos un mes, preferentemente por al menos dos o tres meses. Composiciones de liberación controlada con frecuencia serán apropiados para mantener una concentración efectiva en suero con pocas unidades de dosis diarias. Como puede observarse de los ejemplos en la aplicación presente, las vidas medias in vivo de la aprotinina y del ácido tranexámico son relativamente cortas, y por lo tanto, los regímenes de dosis efectivos para estas inhibiciones parecen ser de gran importancia. Los métodos conocidos para una persona capacitada para preparar composiciones de liberación controlada posibilitarán, así, un esquema de dosis razonable y de ese modo evitarán por ej. la necesidad de una administración continua o a intervalos cortos de los inhibidores de corta vida. Un enfoque alternativo atractivo para asegurar un nivel de concentración mantenido efectivo es utilizar una administración continua de los inhibidores o sus precursores: esto puede hacerse proveyendo una bomba drug pump (como se conoce en el arte de la entrega de insulina) que administrará la droga al sujeto necesitado de la misma en forma continua.

Cuando las composiciones de la invención están en la forma de unidad de dosis (como ser un comprimido/ una tableta, una cápsula o una ampolla), dichas formas de unidad de dosis normalmente contendrán entre 1 y 1000 mg (y para la administración parenteral entre 0.1 y 25 mg) de la sustancia o profármaco utilizado de acuerdo con la invención, calculada como la sustancia activa libre.

A continuación se presenta una revisión general sobre las composiciones relevantes de acuerdo con la invención. Esta revisión está basada en las formas particulares de administración. Sin embargo, se aprecia que en aquellos casos en donde un excipiente farmacéutico aceptable puede ser empleado en diferentes formas de dosis o composiciones, la aplicación de un excipiente particular apto para uso farmacéutico no se limita a una forma de dosis particular de una función particular del excipiente.

Composiciones para uso parenteral

Ejemplos para la administración parenteral son soluciones o suspensiones de las sustancias o profármacos en un excipiente acuoso estéril o un excipiente oleoso apto para la administración parenteral, tales como polietilenglicol, polivinilpirrolidona, lecitina, aceite de maní o aceite de sésamo. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares aptas para uso farmacéutico como las requeridas para aproximar condiciones fisiológicas, tales como agentes buffer, agentes líquidos, detergentes o similares. Los aditivos también pueden incluir ingredientes activos adicionales, por ej. agentes bactericidas, o estabilizadores. Si se desea, la solución o suspensión puede ser liofilizada y reconstituida con un excipiente apropiado tal como un medio estéril acuoso previo a la administración.

Composiciones para el uso oral

Las sustancias que son apropiadas para la administración oral pueden ser formuladas en formas de dosis sólidas tales como, por ejemplo, los polvos granulados, sachets, comprimidos/ tabletas, cápsulas, comprimidos efervescentes, tabletas masticables, pastillas comprimidos de liberación rápida, y comprimidos de liberación modificada, así como también en fluidos o formulaciones líquidas como por ej. polvos, polvos dispersables, o granulados apropiados para la preparación de una suspensión acuosa por medio de la adición de un medio acuoso, emulsiones, dispersiones, y mezclas.

Para la administración oral, una composición no-tóxica apta para uso farmacéutico puede ser formada por la incorporación de excipientes normalmente usados, tales como aquellos transportadores, carriers, mencionados abajo, y generalmente 1-95% de ingrediente activo, es decir, una sustancia utilizada de acuerdo con la invención o un profármaco del mismo, preferentemente, en general, 25-75% de la sustancia del profármaco.

Una composición líquida normalmente comprende una suspensión o solución de la sustancia en un medio líquido apropiado o líquidos apropiados, por ejemplo un solvente acuoso, tal como el agua, etanol, o glicerol o un solvente no-acuoso, tal como el polietilen glicol o un aceite. La composición puede también contener un agente para suspensión, un conservante, aromatizante o colorante.

En la forma farmacéutica sólida, la composición contiene la combinación y cualquier otra sustancia activa opcionalmente en la mezcla con uno o más excipientes aptos para uso farmacéutico. Estos excipientes son, por ejemplo,

diluentes inertes o rellenos, como sucrosa, sorbitol, azúcar, manitol, celulosa microcristalina, almidones que incluyen el almidón de papa, carbonato de calcio, cloruro de sodio, lactosa, fosfato de calcio, sulfato de calcio, o fosfato de sodio; agentes granulados y desintegradores, por ejemplo, los derivados de la celulosa que incluyen la celulosa microcristalina, almidones que incluyen el almidón de papa, croscarmelosa sódica, alginatos, o ácido algínico;

agentes ligantes, por ejemplo, sucrosa, glucosa, sorbitol, acacia, ácido algínico, alginato de sodio, gelatina, almidón, almidón pregelatinizado, celulosa microcristalina, silicato de aluminio y magnesio, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropril metilcelulosa, etilcelulosa, polivinilpirrolidona tales como, por ej., PVP K12, PVP K15, PVP K17, PVP K25, PVP K30, PVP K60, PVP K90, o PVP K120, o combinaciones del mismo, polivinilacetato, o polietilenglicol; y

agentes lubricantes que incluyen glidantes y antiadhesivos, por ej. estearato de magnesio, estearato de zinc, ácido esteárico, sílice, aceites vegetales hidrogenados, o talco.

Otros excipientes farmacéuticos pueden ser los colorantes, agentes aromatizantes, plastificantes, humectantes, agentes buffer, etc.

En aquellos casos en donde la composición para el uso oral está en forma de dosis sólida, en forma unitaria de dosis (ej. un comprimido/ una tableta o una cápsula), la forma de dosis unitaria puede ser provista con una cobertura como una o más de las coberturas mencionadas abajo.

En aquellos casos donde la composición se presenta en forma de comprimidos/ tabletas, cápsulas o una composición múltiple de unidad, la composición o las unidades individuales o un comprimido o cápsula que contiene unidades individuales puede ser cubierta ya sea con una cobertura de azúcar, una cobertura de film (por ej. basada en hidroxipropil metilcelulosa, metilcelulosa, metil hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, acrylate copolimers (Eudragit), polietilenglicol y/o polivinilpirrolidona) o una cobertura entérica (por ej. basada en un copolímero del ácido metacrílico (Eudragit), acetato de ftalato de celulosa, ftalato de hidroxipropil metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa acetato succinato, polivinil acetato ftalato, shellac y/o etilcelulosa). Además, materiales para acción demorada tal como, por ejemplo, el monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo pueden ser
empleados.

Composiciones para la aplicación a superficies mucosas

Para la aplicación a la mucosa nasal, los sprays nasales y aerosoles para inhalar son composiciones adecuadas de acuerdo con la invención. En una composición típica nasal, la combinación está presente en la forma de una formulación particular opcionalmente dispersa en un vehículo apropiado. En el caso de los aerosoles, la sustancia o profármaco es preferentemente provista en forma atomizada con un surfactante y propelente. En general, los vehículos farmacéuticamente aceptables y excipientes y opcionalmente otros materiales farmacéuticos presentes en la composición como los diluentes, estimuladores enhancers, agentes aromatizantes, conservantes, etc están seleccionados de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional, de tal manera que se entiende para las personas capacitadas en el arte de las formulaciones farmacéuticas.

Los porcentajes típicos de la sustancia o profármaco en una composición nasal son 0.01-20% por peso, preferentemente 1-10%. El surfactante debe ser, por supuesto, no-tóxico, y preferentemente soluble en el propelente. Ejemplos de dichos surfactantes son los ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como el ácido caproico, ácido octanoico, ácido láurico, palmitato, ácido esteárico, ácido linoleico, acido linolenico, acido olesterico, ácidos oleicos con cadena alifatica polyhydric alcohol o sus cyclic anhydridos como, por ejemplo, etilienglicol, glicerol, eritritol, arbitol, manitol, sorbitol, anhydridos hixitol derivados del sorbitol, y el polioxietileno y derivados de polioxipropileno de éstos ésteres. Los ésteres mezclados, tales como los glicéridos naturales o mezclados pueden ser empleados. El surfactante puede constituir 0.1-20% por peso de la composición, preferentemente 0.25-5%. El balance de la composición es normalmente propelente. Los propelentes líquidos son generalmente gases en condiciones ambientales, y son condensados bajo presión. Entre los propelentes líquidos apropiados están los de bajos alcanos que contienen hasta 5 carbonos, tales como el butano y el propano; y preferentemente los alcanos fluorinados o fluorochlorinados. Mezclas de lo mencionado arriba también pueden ser empleadas. Al producir el aerosol, un contenedor equipado con una válvula apropiada se llena con un propelente adecuado, que contiene la sustancia de acuerdo con la invención y el surfactante. Los ingredientes son mantenidos, de ese modo, a una presión elevada hasta ser liberados por la acción de la válvula.

Luego de la administración de la composición nasal, de acuerdo con la invención, la sustancia activa puede ser absorbida en la mucosa nasal. La absorción en la mucosa se cree que conlleva a un menor efecto de irritación que, por ejemplo, cuando se emplea un vehículo líquido que contiene un mejorador de la penetración o promotor.

Las composiciones para la administración bucal o sublingual son, por ejemplo, los comprimidos/ tabletas, lozengues, y las pastillas en donde la sustancia o el profármaco se formula con un excipiente como el azúcar y la acacia, el tragacanto, o gelatina y glicerol. Las composiciones para la administración rectal son apropiadas en forma de supositorios cuya base es la manteca de cacao. Las composiciones para la aplicación transdérmica son, por ejemplo, los ungüentos, los geles, y los parches transdérmicos.

Para la aplicación en la mucosa rectal o vaginal, las composiciones adecuadas, de acuerdo con la invención, son: los supositorios (en forma de emulsión o suspensión), enemas y cápsulas de gelatina rectales (soluciones o suspensiones). Las bases de supositorios farmacéuticamente aceptables incluyen la manteca de cacao, ácidos grasos esterificado, gelatina glicerinada, y varias bases solubles al agua o dispersantes, tales como: polietilenglicol y ésteres de ácidos grasos de polioxietetilen sorbitan. Pueden incorporarse aditivos tales como los estimuladores enhancers o surfactantes.

Composiciones para la aplicación tópica

Para la aplicación en piel, las formulaciones pueden contener carriers y excipientes, farmacéuticos convencionalmente no tóxicos que incluyen micrósferas y liposomas. Las composiciones incluyen cremas, ungüentos, ungüentos hidrófilicos, lociones, linimentos, geles, hidrogeles, soluciones, suspensiones, sticks, sprays, pastas, yesos, films, polvos, jabones, shampoos, jaleas, vendajes tales como: absorbentes, almohadilla, vendas, espumas, yesos, y sistemas de administración de drogas transdérmicos.

Los excipientes farmacéuticos pueden incluir: emulsionantes, antioxidantes, agentes buffer, conservantes, humectantes, estimuladores de la penetración enhancers, agentes quelantes, agentes formadores de gel, bases de ungüentos, perfumes, y agentes protectores de piel.

Ejemplos de emulsionantes son gomas naturales, por ejemplo la goma de acacia o goma de tragacanto: fosfátidos naturales, como ser la lecitina de soja; derivados de sorbitan monooleate; grasas de lana; alcoholes de lana; ésteres de sorbitan; monoglicéridos; y alcoholes grasos.

Ejemplos de antioxidantes son butylated hydroxy anisole (BHA), ácido ascórbico y derivados, tocoferol y derivados, butylated hydroxi anisole, y cisteína.

Ejemplos apropiados de conservantes para el uso en composiciones de acuerdo con la invención son los parabenes, tales como: metil, etil, propil p-hidroxibenzoato, butilparabeno, isobutilparabeno, isopropilparabeno, sorbato de potasio, ácido sórbico, ácido benzoico, metil benzoato, fenoxietanol, bronopol, bronidox, MDM hydantoin, iodopropinilbutilcarbamato, EDTA, propilenglicol (aumenta la solubilidad de los conservantes), cloruro de benzalconio, benzilalcohol, o mezclas de conservantes como el Germaben II & IIE (mezcla de imidazolidinil urea, metil y propil parabeno y propilen glicol; disponible de ISP-Sutton Labs).

Ejemplos de humectantes son la glicerina, propilen glicol, sorbitol, ácido láctico y urea.

Ejemplos de agentes quelantes son EDTA de sodio, ácido cítrico, y ácido fosfórico.

Ejemplos de otros excipientes son los aceites comestibles como el aceite de almendra, aceite de castor, manteca de cacao, aceite de coco, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de maní, aceite de semilla de amapola, aceite de colza, aceite de sésamo, aceite de soja, aceite de girasol, y aceite de teaseed; y de polímeros tales como: la carmelosa, la carmelosa de sodio, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, pectina, goma de xantán, goma carragenina, goma de algarrobo, goma de acacia, gelatina, carbomer, emulsionantes tales como: la vitamina E, TPGS, estearato de glicerilo, cetearyl glucosido y alginatos.

Ejemplos a bases de ungüento son en general: cera de abejas, parafina, cetanol, cetil palmitato, aceites vegetales, ácidos grasos ésteres de sorbitan (Span), polietilenglicol, y productos de condensación desde ésteres sorbitan de ácidos grasos hasta óxido etileno, por ejemplo polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween).

Ejemplos de bases de ungüentos hidrofóbicos o emulsionantes en agua son las parafinas, aceites vegetales, grasas animales, glicéridos sintéticos, ceras, lanolina, y polyalkylsiloxanes líquidos.

Ejemplos de bases de ungüento hidrofílicos son macrogoles sólidos (polietilenglicoles).

Otros ejemplos de bases de ungüento son: los jabones trietanolaminas, alcohol graso sulfatado y polisorbatos.

Ejemplos a base de gel o componentes que, cuando apropiados, son capaces de absorber exudación son: parafina líquida, polietilen, aceites grasos, sílica coloidal o aluminio, jabones de zinc, glicerol, propilenglicol, tragacanto, almidón, derivados de celulosa, polímeros de carboxyvinyl, silicato de magnesio-aluminio, Carbopol, polímeros hidrofilicos tales como: el almidón o derivados de celulosa, vendajes absorbentes, hidrocoloides que se hinchan con agua, y alginatos.

Ejemplos de los componentes en polvo son: alginato, colágeno, lactosa, polvo capaz de formar un gel cuando se aplica a una superficie húmeda. Normalmente, los polvos que se utilizan para la aplicación en heridas grandes abiertas (por ejemplo tumores incarcerados) deben ser estériles y las partículas presentes deben ser micronizadas.

El ácido algínico o alginatos son importantes excipientes relacionados con las composiciones de acuerdo con la presente invención. Como se explica arriba, los alginatos pueden formar un gel y, además, pueden absorber exudaciones y, de ese modo, contribuir a controlar el contenido de la humedad de por ej. un área incarcerada. El ácido algínico y los alginatos están disponibles en diversas calidades que tienen un promedio de peso molecular en el rango de alrededor de 32,000- 200,000. La proporción relativa de los restos de ácido manurónico y gulurónico varía de una calidad a otra.

Otros excipientes para uso tópico incluyen: resina tackifier, unidores elastoméricos viscosos, films elásticos, material adhesivo elástico, elastómeros y plasticizers.

Vendajes y/o vendas también son importantes sistemas de administración para una combinación de acuerdo con la invención. Los vendajes pueden ser vendajes absorbentes para la aplicación en áreas exudadas. Dichos vendajes están frecuentemente hechos de algodón o fibras viscosas que se encuentran incluida en el interior de una gasa o tela apropiada non-wowen. Otros materiales relevantes son las fibras de celulosa, celulosa de pulpa de madera (polvo fino). Los vendajes pueden estar en forma de vendajes con hidrogel como por ejemplo, i) vendajes que tienen una macro- estructura tridimensional fija, y ii) vendajes que contienen hidrogeles amorfos. Ejemplos de otros tipos de vendajes son i) vendajes hidrocoloides (agentes formadores de gel combinados con otro material como ser elastómeros y adhesivos) que incluyen gránulos hidrocoloides o pasta y lámina hidrocoloide ii) lámina de alginato (soga o mono, alginato con un apósito absorbente integral), iii) espumas (vendas de espuma, espuma silastic, espuma de poliuretano), iv) varios materiales polisacáridos, v) vendajes oclusivos, vi) vendajes semipermeables, vii) vendajes de gasa de parafina, viii) vendas de Tulle ix) pastas polisacáridas, gránulos y beads (pueden estar fabricados de derivados de dextrano), y x) vendajes que absorben olor. Los vendajes apropiados pueden ser i) vendajes no-extensibles, ii) vendas elásticas, iii) vendajes adhesivos/cohesivos, iv) vendas tubulares, v) vendajes con pasta medicamentosa, y vi) aparatos ortopédicos para montaje.

Las composiciones mencionadas arriba para la administración tópica pueden ser apropiadas para la aplicación en el cuerpo o para la introducción en un orificio relevante del cuerpo, por ej. el orificio anal, uretral, vaginal, nasal u oral. La composición puede ser simplemente aplicada directamente en la parte a ser tratada como ser, en la mucosa, o por cualquier vía de administración conveniente.

Los agentes dispersantes o humedificantes apropiados son, por ejemplo, los fosfátidos naturales, como ser: la lecitina, o la lecitina de soja; productos de condensación del óxido de etileno como por ejemplo, un ácido graso, un alcohol de cadena alifática larga, o un éster parcial derivados de ácidos grasos y un hexitol o un hexitol anhídrido, como por ejemplo, estearato de polioxietileno, polyoxyethylene sorbitol monooleate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, etc.

Por último, es una posibilidad interesante dirigir cualquiera de las sustancias (tales como los inhibidores de proteasas) utilizadas de acuerdo con la invención, a una molécula o tejido. De esta manera, relativamente altas concentraciones del inhibidor en cuestión estarán presentes en dicho tejido o en áreas donde la molécula diana es especialmente abundante. Existen diferentes maneras para obtener este efecto, pero en general todas dependen del uso de una molécula transportadora con gran afinidad por el tejido elegido (como un anticuerpo transportador o un fragmento de un anticuerpo) al cual se le une covalentemente o no covalentemente la sustancia en cuestión. Para los objetos de la presente invención, un anticuerpo (o un fragmento de un anticuerpo) dirigido a un antígeno específico sobre-expresado en tumores (como por ejemplo el antígeno carcino-embriónico, el antígeno de Lewis, transferrina, la bomba de resistencia a multi-drogas, transportadores de glucosa, y uPAR) podrían ser útiles como moléculas transportadoras para cualquiera de las sustancias usadas de acuerdo a la invención.

En lugar de depender de la implantación y/o curación de heridas en ratones Plg-/- con el objeto de estudiar la posible conveniencia de un segundo y/o una tercera sustancia tal cual definida, es posible estudiar la conveniencia en base a los efectos obtenidos en modelos de ratones donde las acciones de plasmina son sustancialmente eliminadas (por ej. por el uso de uno de los inhibidores mencionados más arriba). Como surge de los ejemplos, es posible eliminar el crecimiento de tumores en ratones tratados simultáneamente con inhibidores de plasmina y metalo-proteasas, y así, el modelo donde las acciones de plasmina están siendo bloqueadas también podría ser conveniente para determinar la conveniencia de otros inhibidores de proteasas, especialmente para el tratamiento de cáncer. Entonces, otra parte de la invención está relacionada a un método para prevenir o detener el remodelamiento invasivo en un mamífero, el método comprendiendo 1) inhibir o eliminar, en el mamífero, las actividades proteolíticas de la plasmina como así también los derivados activos de la misma in vivo y 2) simultáneamente inhibir o eliminar las actividades proteolíticas de al menos una enzima proteolítica que es diferente a la plasmina como así también de los derivados activos de la misma y que ejerce su acción en al menos una proteína extracelular, dicha al menos una enzima proteolítica siendo análoga no-murina (incluyendo humana) de enzima(s) que, aisladas o en combinación, es/son esenciales para la destrucción de tejido invasivo asociado con crecimiento maligno en ratones donde la actividad proteolítica de la plasmina está sustancialmente eliminada.

Todos los embodimentos mencionados más arriba sobre las composiciones de la invención se aplican mutatis mutandis a ésta composición, y de hecho las composiciones descriptas más arriba podrían también ser provistas sobre la base de la evaluación en tal modelo de ratón en lugar del modelo Plg-/-. Así, todos los embodimentos descriptos aquí que dependen de los efectos de una segunda sustancia en el modelo de ratones Plg-/- también pueden aplicarse cuando la segunda sustancia elimina la destrucción de tejido asociada con crecimiento maligno en ratones cuando la actividad proteolítica de plasmina es sustancialmente eliminada.

Finalmente, es una posibilidad de que algunos tipos de remodelamiento invasivo utilicen otras enzimas que el sistema de plasminógeno/plasmina. A pesar de ello, se cree que el concepto de la invención, específicamente la explotación de la redundancia de acciones de proteasas que son activas contra proteínas extracelulares, es una manera general de atacar la remodelación invasiva. Así, un aspecto general la invención se refiere también a un método para prevenir o eliminar el remodelamiento invasivo en el mamífero, el método comprendiendo 1) inhibir o eliminar, en el mamífero, la actividad proteolítica de al menos una primera proteasa, A, y 2) simultáneamente inhibir o eliminar las actividades proteolíticas de al menos una otra proteasa, B, que es de una clase diferente de proteasas a A, donde A y B tienen al menos un sustrato extracelular común, dicha al menos una proteasa, B, siendo esencial para la implantación del embrión y/o curación de heridas y/o necesaria para la destrucción de tejido invasivo asociada con crecimiento maligno en el mamífero cuando la actividad proteolítica de A está sustancialmente eliminada en el mamífero pero no cuando la actividad proteolítica de la A está sustancialmente intacta en el mamífero.

Las arriba mencionadas proteasas A y B son elegidas preferentemente del grupo consistiendo en metalo-proteasas, cisteína-proteasas, serina-proteasas y aspartico-proteasas.

El principio arriba mencionado de usar sustancias A y B también se combina con todos los embodimentos pertinentes de otras composiciones de la invención con respecto a la elección de sustancias usadas para obtener inhibición o eliminación de sus actividades proteolíticas como así también de la elección de los regímenes, elección de condiciones para tratamiento, etc. De hecho, todos los embodimentos de las composiciones usadas de acuerdo a la invención que se divulga supra se aplican mutatis mutandis a éste aspecto de la invención, y todas las limitaciones en las composiciones usadas de acuerdo a la presente invención descripta arriba, se tiene la intención que también sean limitaciones en éste aspecto de la invención.

En otro aspecto de la invención, se reconoce que el uso de animales donde las actividades proteolíticas de proteasas han sido sustancialmente eliminadas proveen una herramienta completamente nueva en la búsqueda de sustancias que son activas en la remodelación de tejido invasivo. Dado que una actividad de dicha sustancia podría ser "oscurecida" por el hecho de que las acciones de una proteasa con la que interfiere son suplementadas por otras proteasas, el uso de dicho animal puede dar lugar a una visión sustancial en la relación entre sustancias conocidas y nuevas por un lado y la remodelación de tejido invasivo por el otro.

Así, un aspecto de la invención se refiere a un método de búsqueda de sustancias que es capaz de interferir con el remodelamiento de tejido invasivo en el mamífero, incluyendo a un ser humano, mientras el método comprenda proveer a un animal donde se ha sustancialmente eliminado la actividad proteolítica in vivo de al menos una proteasa que contribuye a la remodelación invasiva, y luego medir el efecto de la administración de sustancias al animal en relación a al menos un proceso que se conoce que está relacionado con remodelación invasiva, y finalmente estableciendo como resultado que la sustancia es capaz de interferir con la remodelación invasiva si al menos un proceso es inhibido en un nivel significativamente más elevado que en ambos, en el animal cuando no recibe la sustancia y en un animal de referencia que no ha tenido la eliminación in vivo de al menos una actividad proteolítica de una proteasa. La eliminación sustancial de la actividad proteolítica in vivo de al menos una proteasa puede, por ejemplo, ser acompañada por modificaciones genéticas del animal (por ej. por el knock-out del gen para la proteasa como en el ratón Plg-/- usado aquí) o por la inhibición farmacéutica de las acciones de una proteasa. La proteasa puede ser como fue definida más arriba. Por supuesto, los procesos conocidos que requieren remodelación invasiva son los descriptos más arriba, por ejemplo, curación de heridas, implantación de embrión, etc.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1: El RNAm de gelatinasa B se expresa en queratinocitos en el borde del frente de crecimiento durante la re-epitalización de las heridas por corte de piel en ratones. La expresión del RNAm para gelatinasa B es detectado por hibridización in situ en los queratinocitos del borde del frente 48 horas después de producida la herida experimental a través de todo el grosor de la piel (las flechas en A y B). A ese tiempo, los queratinocitos del frente se han aplastado y se mueven por debajo del coágulo de la herida, las células que expresan gelatinasa B están localizadas exactamente en el frente de la capa epitelial en movimiento. A los tiempos entre 24 y 120 horas después de producida la herida el RNAm para gelatinasa B se expresa exclusivamente en los queratinocitos localizados en la punta y en la zona basal de la capa epitelial que se mueve. Cuando la herida se cubre con epidermis nuevamente formada después de aproximadamente 7 días, la expresión de RNAm para gelatinasa B no es detectable. La expresión de RNAm para gelatinasa B no pudo ser detectada en ningún otro tipo celular en la herida o en la piel normal (no se muestra). La Fig. 1ª es de un campo luminoso y la Fig. 1b es una micrografía de campo oscuro. Magnificación: x 85.

Fig. 2: Curación de heridas en ratones deficientes en plasminógeno (plg-/-) y en ratones de tipo salvaje plg+/+ tratados sistémicamente con Galardin^{TM}. Cuatro grupos de 12 ratones fueron heridos con una incisión estandarizada de 20 mm de longitud y corte de todo el grosor de la piel. El primer grupo (indicado como plg-/-) consistió de ratones plg-/- y fueron tratados i.p. sólo con vehículo tampón (4% carboximetil celulosa, CMC) después de la herida, mientras que otro grupo (indicado como plg-/- + LBH106) de 12 ratones plg-/- fueron tratados i.p. con 2.5 mg Galardin^{TM} por día después de producida la herida. Un tercer grupo (indicado como plg+/+) consistió de ratones de tipo salvaje tratados i.p. con 2.5 mg Galardin^{TM} por día después de producida la herida. El gráfico muestra la longitud media de la herida abierta (mm) como función del tiempo de curación.

Fig. 3: Curación de heridas en ratones plg-/- y plg+/+. Estos resultados son del mismo experimento que el mostrado en Fig. 2, pero son presentados como porcentaje de heridas en cada grupo que fueron curadas totalmente (longitud de herida = 0 mm) en cada tiempo.

Fig. 4: Expresión de metalo-proteasas en la curación de heridas de ratones plg-/- tratados sistémicamente con Galardin^{TM} y en ratones de tipo salvaje no tratados. Las secciones de tejido fueron removidas el día 7 luego de cirugía de ratones plg-/- tratados sistémicamente con Galardin^{TM}. Las secciones fueron analizadas por hibridización in situ para la expresión de RNAm de metalo-proteasas y expuestas a emulsión autoradiográfica. La expresión de RNAm para gelatinasa B (a, d y g), colagenasa-3 (b, e y h) y gelatinasa A (c, f, i) en heridas de ratones plg-/- tratados con Galardin^{TM} (a-f) o ratones de tipo salvaje plg+/+ no tratados (g-i). Las flechas largas muestran la punta del borde del frente de queratinocitos. Las flechas cortas muestran el borde del tejido de granulación. Las micrografías a-c son de campo luminoso, y las de d-i de campo oscuro. Magnificación: x 100.

Fig. 5: Apariencia microscópica de heridas de piel en ratones de tipo salvaje tratados con vehículos (a) o Galardin^{TM} (b) y ratones deficientes en Plg tratados con vehículo (c) o Galardin^{TM} (d) 7 días después de la cirujía. Las secciones fueron teñidas con hematoxilina-eosina. La apariencia de forma de cuña de la capa de queratinocitos migratorios que se ven en el ratón control (a) cambia claramente a formas sin punta en los tres grupos de ratones que les falta el plasminógeno (b), tratados con inhibidor de metalo-proteasas (c) o ambos (d). En éstos casos los queratinocitos son aparentemente detenidos en el borde de la matríz provisional de la herida, que está marcada con flechas en b-d. En los ratones que son deficientes en plg y tratados con Galardin^{TM}, ésta capa de la matriz es especialmente gruesa (d). Magnificación: x 165.

Fig. 6: La curación de heridas en ratones plg+/+ tratados sistémicamente con aprotinina (AP) y ácido tranexámico (TA). Veinte ratones plg+/+ fueron heridos con cortes estandarizados de 20 mm de longitud, todo a lo largo del grosor de la piel, en la espalda, y luego divididos en cuatro grupos: el grupo 1 recibió cada día tres inyecciones i.p. de vehículo tampón; el grupo 2 recibió cada día aprotinina (13000 KIU) dividida en tres inyecciones i.p. espaciadas al menos por seis horas; el grupo 3 recibió cada día ácido tranexámico (10 mg) dividida en tres inyecciones i.p. espaciadas al menos por seis horas, y el grupo 4 recibió cada día aprotinina (13000 KIU) y ácido tranexámico (10 mg) dividido en tres inyecciones i.p. espaciadas al menos por seis horas.

Fig. 7: Curación de heridas en ratones plg+/+ tratados sistémicamente con aprotinina (AP) y ácido tranexámico (TA). Estos resultados son del mismo experimento al mostrado en la Fig. 6, pero se presentan como porcentaje de heridas en cada grupo que están completamente curadas (longitud de la herida = 0 mm) en cada tiempo.

Fig. 8: Vida media biológica de la aprotinina en ratones plg+/+. Quince ratones (pesando aproximadamente 25 g cada uno) fueron inyectados i.p. con 0.75 ml de una solución de aprotinina (20000 KIU/ml; aproximadamente 2.1 mg) y a intervalos de 0.5, 1.5, 3.0, 6.0 y 24 horas más tarde tres ratones fueron sacrificados y su sangre recogida por punción cardíaca a tubos citrato anticoagulantes. Cada muestra de plasma fue ultracentrifugada a través de membranas con cut-off de 20000 MW, y el nivel de aprotinina en el filtrado fue determinado por inhibición de la actividad de una solución de tripsina estándar, en un ensayo colorimétrico.

Fig. 9: Efecto del esquema de tratamiento sistémico con inhibidor de plasmina sobre la curación de heridas en ratones plg+/+. Quince ratones plg+/+ fueron heridos con una incisión estandarizada de 20 mm de longitud con un corte sobre todo el grosor de la piel en la espalda, y fueron luego divididos en tres grupos: el grupo 1 recibió 5 inyecciones i.p. de vehículo tampón por día; el grupo 2 recibió cada día aprotinina (650000 KIU/kg) y ácido tranexámico (1 g/kg) divididos en 4 inyecciones i.p. espaciadas por 6 horas, y el grupo 3 recibió cada día aprotinina (650000 KIU/kg) y ácido tranexámico (1 g/kg) divididos en 5 inyecciones i.p. espaciadas al menos por 4 horas; Cada día se midió cuidadosamente la longitud de la herida abierta y se tomó nota. El tiempo que fue requerido para cada herida de piel en cerrar completamente también fue anotado.

Fig. 10: Efecto del esquema de tratamiento sistémico con inhibidores de plasmina sobre la curación de heridas en ratones plg+/+. Estos resultados son del mismo experimento que la Fig. 9, pero se presentan como el porcentaje de heridas de cada grupo que están completamente cerradas (longitud de la herida = 0 mm) en cada tiempo.

Fig. 11: Efecto del tratamiento sistémico combinado con inhibidores de plasmina y con inhibidores de metalo-proteasas sobre la curación de heridas en ratones plg+/+. Cuarenta y ocho ratones plg+/+ fueron heridos con un corte estandarizado de 20 mm de longitud, todo a lo largo del grosor de la piel en la espalda y divididos en cuatro grupos: el grupo 1 recibió 5 inyecciones i.p. de vehículo tampón por día; el grupo 2 recibió cada día aprotinina (AP; 13000 KIU/día/ratón) y ácido tranexámico (TA; 20 mg/día/ratón) dividida en 4 inyecciones i.p. espaciadas por al menos cinco horas; el grupo 3 fue inyectado i.p. una vez por día con Galardin^{TM} (LBH-106; 2.5 mg en 125 \mul de CMC); el grupo 4 recibió un tratamiento Galardin^{TM} de aprotinina, ácido tranexámico y Galardin^{TM} a las mismas dosis que arriba. Cada día se midió cuidadosamente y se anotó la longitud de la herida abierta.

Fig. 12: Efecto del tratamiento sistémico combinado con inhibidores de plasmina e inhibidores de metalo-proteasas sobre la curación de heridas en ratones normales plg+/+. Estos resultados son del mismo experimento al mostrado en la Fig. 11, pero son presentados como porcentaje de heridas en cada grupo que están completamente cerradas (longitud de la herida = 0 mm) en cada tiempo.

Fig. 13: Expresión de RNAm de metalo-proteasas en carcinoma de pulmón de Lewis detectado por hibridización in situ. Las Figs. 13A y 13B muestran la misma imagen fotografiada con campo luminoso (A) y con condensador de campo obscuro(B). Las células que expresan gelatinasa-B (flechas en Figs. 13A y 13B) son fácilmente identificadas con condensador de campo oscuro, donde la señal de las células positivas aparece como granos plateados brillantes (flechas en Fig. 13B). En forma similar, usando condensador de campo oscuro, las células que expresan estromelisina-1 pudieron ser identificadas en el estroma bordeando las células del carcinoma de pulmón de Lewis (flechas en Fig. 13D). La Fig. 13C es una sección adyacente a la sección de la Fig. 13D, teñida con hematoxilina-eosina, se incluye para mostrar la estructura del tejido de la Fig. 13D. Las flechas de la Fig. 13C indican la localización virtual de las células positivas indicadas por flechas en la Fig. 13D.

Fig. 14: Efecto del tratamiento sistémico con inhibidores de plasmina y Galardin^{TM} sobre el crecimiento de carcinomas de pulmón de Lewis en ratones de tipo salvaje (plg+/+). Cuatro grupos de 17 ratones fueron inyectados subcutáneamente con tejido triturado de carcinoma de pulmón de Lewis (aproximadamente 1.0 x 10^{6} células). El primer grupo (CON) fue tratado sólo con vehículo con tampón. El segundo grupo (TA/AP) fue tratado i.p. tres veces por día con una mezcla de ácido tranexámico (TA) y aprotinina (AP), de manera que el dosage total fue de 10 mg TA y 13000 KIU AP por día por ratón. El tercer grupo (LBH 106) fue tratado con 1.8 mg Galardin^{TM} por día por ratón (en vehículo tampón CMC), y el cuarto grupo recibió ácido tranexámico, aprotinina y Galardin^{TM} en las mismas dosis. El crecimiento tumoral en los ratones fue monitoreado cada 2-3 días y graficado en función del tiempo.

Fig. 15: Efecto del tratamiento sistémico con inhibidores de plasmina y Galardin^{TM} sobre la sobrevida de ratones de tipo salvaje (plg+/+) inoculados con carcoma de pulmón de Lewis. El gráfico es de Kaplan-Meier para sobrevida de los ratones en los cuatro grupos descriptos arriba en Fig. 14.

Fig. 16: Efecto del tratamiento sistémico con inhibidores de plasmina y BB-94 sobre el crecimiento de xenografías de cáncer de mama humano MDA-MB-231 en ratones desnudos. Cuatro grupos de 11 ratones fueron inyectados subcutáneamente con 2 x 10^{6} células cultivadas de cáncer de mama humano de MDA-MB-231. El primer grupo (control) fue inyectado subcutáneamente sólo con vehículo tampón. El segundo grupo (TA/AP) fueron tratados con una mezcla de ácido tranexámico (TA) y aprotinina (AP), de manera que el dosaje total fue de 650000 KIU/kg aprotinina y 1 g/kg ácido tranexámico dividido en 5 inyecciones i.p. por día espaciadas al menos cuatro horas. El tercer grupo (BB-94) fue tratado con 125 mg/kg BB-94 como una única inyección i.p. diaria, y el cuarto grupo recibió TA, AP y BB-94 en las mismas dosis y esquema de tratamiento como arriba. El crecimiento de los tumores fue luego medido cada 2-3 días y los resultados graficados en función del tiempo.

Ejemplo 1 Curación de heridas en ratones Plg-/- tratados con inhibidor de metalo-proteasa

En este ejemplo, ratones totalmente deficientes en plasmina fueron tratados sistémicamente con un potente inhibidor de metalo-proteasas. El modelo experimentado fue el de la curación de heridas. La curación exitosa de la herida fue interpretada por el cierre completo de la incisión en la piel.

Antecedentes

La curación de heridas comparte varias características con la invasión de tumores. Así, el sistema de plasminógeno/plasmina como también metalo-proteasas son encontradas sobreexpresadas en el sitio de la migración de queratinocitos, y la total deficiencia de plasminógeno/plasmina está asociada con un retardo parcial en la migración de queratinocitos y cierre de la herida más lento (Romer, 1996).

El inhibidor de metalo-proteasas Galardin^{TM} inhibe a un número de metaloproteasas: colagenasa intersticial fibrobroblástica (MMP-1), Ki=0.4 nM; 72kd gelatinasa A (MMP-2), Ki=0.5 nM; estromelisina-1 (MMP-3), Ki= 30 nM; colagenasa intersticial de neutrófilo (MMP-8), Ki=0.1 nM; 92 kd gelatinasa B (MMP-9), Ki=0.2 nM). Por el contrario, Galardin^{TM} exhibe una débil inhibición de la serina-proteasa llamada enzima covertidora de angiotensina (ACE), y plasmina. La Ki para estas enzimas se encuentra en el rango milimolar, es decir una afinidad un millón de veces menor.

Protocolo

Los métodos usados son aquellos descriptos por Romer y colaboradores, 1996. Cuatro grupos de ratones fueron preparados, consistiendo de 12 ratones plg-/- (grupo 1), otros 12 ratones plg-/- (grupo 2), 12 ratones plg+/+ (grupo 3) y otros 12 ratones plg+/+ (grupo 4). Todos los ratones fueron heridos con una incisión estándar de 20 mm de longitud a lo largo de todo el grosor de la piel, en la espalda. Los grupos 2 y 4 fueron luego inyectados i.p una vez por día con Galardin^{TM} (2.5 mg en 125 \mul de una solución tampón 4% carboximetil celulosa; CMC) mientras que los grupos 1 y 2 recibieron sólo inyecciones i.p. con el vehículo.

Cada día siguiente, la longitud de la herida abierta fue cuidadosamente medida y anotada. El tiempo que llevó a cada herida para cerrarse completamente también fue anotado.

En experimentos en paralelo, los ratones fueron sacrificados y secciones de los tejidos fueron preparados a partir del sitio de la herida. Las secciones de tejido fueron analizadas con relación a la expresión de varias metaloproteasas por hibridización in situ y por contenido de matriz por teñido.

Hibridización in situ. La hibridización in situ fue realizada en secciones parafinadas esencialmente como descripto (Kristensen, 1991; Romer y colaboradores, 1996). Sondas de RNA sentido y antisentido fueron marcadas con ^{35}S y generadas por transcripción in vitro a partir de los subclones de cDNA de ratón siguientes: fragmento de gelatinasa A de ratón (605-1165) en pSP64 y pSP65 y (1924-2259) en pGEM-3 (Reponen y colaboradores, 1992, J. Biol. Chem. 267 (11), 7856-62); fragmentos de gelatinasa B de ratón (805-1099) y (1944-2267) en pSP64 y pSP65 (Reponen y colaboradores, 1994, J. Cell. Biol. 124, 1091-1102); fragmentos de estromelisina-1 de ratón (3115-4051) y (2205-2918) en pBluescript KS(+) (Hammani y colaboradores, 1992, Gene 120(2), 321-322); fragmentos EcoRI de colagenasa-3 de ratón (485bp) y (811 bp) en pBluescript KS(+) (Henriet y colaboradores, 1992, FEBS Letters 310 (2), 175-178); fragmento de elastasa de macrófago de ratón (900-1250) en Bluescript KS(+) (Shapiro y colaboradores, 1992, J. Biol. Chem. 267, 4664-4671); y fragmentos MT-1 MMP de ratón (1122-1258) y (1259-1705) en pBluescript KS(+) (Okada y colaboradores, 1995, PNAS USA, 92(7), 2730-2734). La expresión de sistema de elastasa de macrófago de ratón fue investigada con una única sonda, la cual en todos los casos dio resultados idénticos.

Resultados

Varias metaloproteasas son expresadas durante la curación de heridas. Para examinar la expresión de MMPs durante la curación de la piel, incisiones de todo el grosor de la piel se realizaron en ratones de tipo salvaje, y se analizaron microscópicamente secciones a lo largo del tiempo desde 12 horas hasta 7 días luego de la incisión. El RNAm codificante de las respectivas proteasas fue detectado por hibridización in situ con las sondas específicas para siete tipos diferentes de MMPs, incluyendo gelatinasa A (MMP-2), gelatinaza B (MMP-9), colagenasa-3 (MMP-13), estromelisina-1 (MMP-3), MT-1 MMP (MMP-14) y metaloproteasa de macrófago (MMP-12). En la piel normal no hubo expresión detectable del RNAm para ninguna de estas MMPs, mientras que todas se expresaron en las heridas de piel.

El RNAm codificante de gelatinasa B fue detectable a las 12 horas de haber producido la herida en los queratinocitos del borde de la herida, los cuales recién se habían achatado y movido hacia y dentro del coágulo. Estas células expresando gelatinasa B estaban localizadas en el frente de las células en movimiento y esto fue hallado también en los subsiguientes tiempos hasta 7 días después de producida la herida; La expresión de RNAm de gelatinasa B fue exclusiva de queratinocitos localizados basalmente en el frente de la hilera de epidermis en movimiento (Fig. 1a y b). El RNAm de colagenasa-3 fue expresado en un patrón similar al de gelatinasa B, con la sola diferencia que el RNAm de colagenasa-3 fue también detectado en queratinocitos basales localizados más atrás del frente. La expresión de RNAm de gelatinasa B o colagenasa-3 no fue detectable en el tejido de granulación o en ningún tipo de celulas fuera de queratinocitos. Cuando las heridas se cubrieron completamente con una capa de epidermis nueva, que en algunos casos ya se observó a los siete días de la producción de la herida, la expresión de RNAm para las dos MMPs no fue detectable en ninguna célula de la piel (no se muestra).

Los RNAm para gelatinasa A y MT-1 MMP fueron detectados en fibroblastos localizados en la dermis inferior del borde de la herida desde 12 horas después de producida la herida. A tiempos más tardíos, se observaron fuertes señales para los dos mensajeros en el tejido de granulación, localizado en fibroblastos que migraban por debajo de la herida. Comparando secciones adyacentes se observó que los RNAm de gelatinasa A y MT-1 MMP se expresaban en exactamente los mismos fibroblastos. En la etapa más tardía del cierre de la herida por epidermis, la expresión de los dos RNAm se observó localizado muy cerca de la recientemente formada membrana basal del epitelio. Luego del cierre de la herida con una capa epitelial nueva, se observó una señal débil para RNAm de gelatinasa A y MT-1 MMP en algunos fibroblastos. La expresión de éstos dos mensajeros no fue detectado en queratinocitos o en ningún otro tipo celular en la herida (no se muestra).

El patrón de expresión de estromelisina-1 y metaloelastasa de macrófago fue diferente de todos los otros MMPs estudiados. El RNAm de estromelisina-1 fue hallado en ambos queratinocitos y fibroblastos. La expresión fue mayor en los queratinocitos basales detrás del frente de migración en el área que se corresponde con el borde de la herida original, y en fibroblastos localizados por debajo y adyacentes a estos queratinocitos, pero el RNAm para estromelisina-1 fue también detectado en queratinocitos del borde del frente. El RNAm de metaloelastasa de macrófagos fue expresado en un subgrupo de macrófagos localizados por debajo y adyacentes al coágulo. La expresión de RNAm para estromelisina-1 y metaloproteasa de macrófago no fue detectada en ningún otro tipo de células de la herida.

La expresión de gelatinasa B, colagenasa-3, y estromelisina-1 en los queratinocitos en el frente es particularmente notable porque se había hallado previamente que los mismos queratinocitos expresan dos de los reguladores clave de la generación de plasmina, uPA y uPAR (Romer y colaboradores, 1996).

Detención completa de la curación de la herida en ratones deficientes en plasminógeno tratados con inhibidor de metalo-proteasas. Los resultados de las mediciones de curación de herida se muestran en las Figs. 2 y 3. Se puede observar que la observación previa (Romer 1996) de retardo parcial del cierre de la herida en ratones plg-/- fue reproducida (45% de las heridas cerraron luego de 38 días), y que el tratamiento de plg+/+ con Galardin^{TM} produjo un mayor retardo pero aun un retardo parcial de la curación de la herida (22% de las heridas curadas luego de 38 días). Sin embargo, cuando el tratamiento con inhibidor de metaloproteasa fue combinado con deficiencia de plasmina en los ratones plg-/- tratados con Galardin^{TM} la curación de la herida fue sorpresivamente completamente eliminada: 38 días después de producida la herida, ninguno de los ratones había curado la herida, mientras que todas las heridas habían curado luego de 20 días en los ratones plg+/+. Aun luego de 80 días, ninguna de las heridas en ratones plg-/- tratados con inhibidor de metalo-proteasas había sido curada.

Migración de queratinocitos. En experimentos diferentes analizamos el impacto del tratamiento con Galardin^{TM} sobre la migración de queratinocitos en ratones de tipo salvaje y en animales de la misma camada deficientes en Plg. Para cada uno de los grupos de genotipos, 5 ratones fueron ya sea tratados cpm 100 mg/Kg diarios de Galardin^{TM} durante 7 días luego de producida la herida, o tratados controles, mock. De cada grupo se analizaron microscópicamente entre 18 y 20 secciones de tejido de la herida, y se midió en forma ciega, por morfometría asistida por computadora, la distancia de migración de queratinocitos a lo largo de la base de la epidermis desde el borde de la herida hasta la punta de la cuña (ver Romer y colaboradores, Fig. 2). En los ratones de tipo salvaje controles tratados mock, la distancia de migración de queratinocitos fue 354 +- 70 (media +- desviación estándar en unidades arbitrarias) comparado con 268 +- 80 en los tratados con Galardin^{TM}, 290 +- 59 en los controles tratados mock en ratones Plg deficientes y 208 +- 60 en los ratones Plg-deficientes tratados con Galardin^{TM}. En la evaluación por test de Students t-test, la disminución en la migración de queratinocitos causada por tratamiento con Galardin^{TM} en ratones de tipo salvaje fue significativa estadísticamente (p=0.007) y éste fue también el caso para la disminución causada por la deficiencia de Plg sola (p=0.01). En el grupo de ratones Plg-deficientes tratado con Galardin^{TM}, la disminución fue significativa comparando, los ratones de tipo salvaje controles tratados mock (p<0.00001), los ratones de tipo salvaje tratados con Galardin^{TM} (p=0.02) y los ratones Plg-deficientes controles tratados mock (p=0.0008). Así, la inhibición de MMP y la deprivación de Plg, cada uno redujo la distancia de migración de queratinocitos, y en combinación, tuvieron un efecto aditivo sobre este parámetro.

La apariencia microscópica de las heridas de piel en ratones de tipo salvaje y en deficientes en plasminógeno tratadas con vehículo o Galardin^{TM} se muestra en la Fig. 5. La apariencia en forma de cuña de la hilera en migración que se observa en los ratones de tipo salvaje controles tratados con vehículo cambia a una forma sin punta en los otros tres grupos de ratones, los queratinocitos aparentemente siendo detenidos por el borde de la matriz provisional de la herida que es claramente más abundante en el grupo de ratones deficientes en plasmina que en aquellos tratados con Galardin^{TM}.

Aumento de la expresión de MMP luego del tratamiento con inhibidor de metalo-proteasa. La expresión de gelatinasa B, colagenasa-3, estromelisina, y gelatinasa A fue examinada por hibridización in situ del tejido de la herida de ratones deficientes en Plg controles tratados mock y en ratones de tipo salvaje, y en ratones de ambos genotipos que habían sido tratados con dosis diarias de 100 mg/kg de Galardin^{TM}. En los ratones controles tratados mock, la expresión de estas MMPs fue tal cual descripto arriba para animales no tratados. Sin embargo, en ambos, ratones de tipo salvaje y deficientes en Plg, la expresión del RNAm para gelatinasa B, colagenasa-3 y estromelisina-1 fueron dramáticamente aumentados en los queratinocitos del frente en los ratones tratados con Galardin^{TM} en comparación con los ratones tratados mock del mismo genotipo (ver Fig. 4). Más aun, la expresión de gelatinasa B también fue hallada en ambos grupos de ratones tratados con Galardin^{TM} en células del tejido de granulación localizado justo por debajo del frente de queratinocitos, en contraste con la ausencia de expresión de gelatinasa B en el tejido de granulación en los dos grupos de ratones tratados mock. Además, la expresión de RNAm para ambos, gelatinasa A y estromelisina-3, fue aumentada en el tejido de granulación de fibroblastos en los ratones de tipo salvaje tratados con Galardin^{TM} y en ratones deficientes en Plg, y la expresión de RNAm para gelatinasa A en estos animales fue también detectable en los queratinocitos del frente, en contraste con la falta detectable de expresión de gelatinasa A en queratinocitos de ratones tratados mock.

Conclusión

La curación de heridas en ratones se retrasa pero pese a ello procede en ausencia de plasmina (Romer, 1996), y nuevamente se retrasa pero procede cuando se inhiben metalo-proteasas en presencia de plasmina/plasminogeno, pero la curación de la herida se detiene totalmente cuando en ausencia de plasmina/plasminógeno se combina con la inhibición de metalo-proteasas. Estos hallazgos se interpretan como que la ausencia de plasmina y la inhibición de metalo-proteasas actúan sinergísticamente, reflejando una contribución dual o una sobreposición funcional entre estos dos tipos de enzimas en el proceso de remodelamiento de la curación de heridas.

Más aun, el tratamiento sistémico con inhibidor de metaloproteasa produce una aumento en el nivel de expresión del RNAm de las metalo-proteasas diana en el mismo tejido blanco donde interviene en la reparación del tejido, demostrando una respuesta compensatoria a la inhibición de la metalo-proteasa. Esto y el aumento en el contenido de la matríz proporciona evidencia que el tratamiento con inhibidor actúa efectivamente en su sistema enzimático diana, y que el tejido remodelado es capaz de intentar sobrellevar la inhibición regulando positivamente las enzimas afectadas.

Ejemplo 2 Implantación en ratones Plg-/- tratados con inhibidor de metalo-proteasas

En este ejemplo, los ratones deficientes en plasminógeno fueron tratados sistémicamente con un inhibidor potente de metalo-proteasas. El modelo usado en la experimentación fue la implantación de embrión. La presencia de embriones viables en ratones preñados fue interpretado como que la implantación fue exitosa.

Antecedentes del modelo

El momento medio para el inicio del estro en un ratón hembra normal es 4 a 6 horas luego de iniciada la oscuridad. La ovulación ocurre entre 2 y 3 horas luego del inicio del estro. La ratona hembra sólo copula durante estro cuando tiene huevos que están listos o están próximos a estar listos para fertilización. Dado que el estro usualmente comienza alrededor de medianoche, la copulación se desarrolla más comúnmente durante las horas de la noche, generalmente alrededor de las 02:00. La evidencia de una copulación exitosa es el tapón vaginal, un coágulo de fluido de las glándulas vesiculares y coagulantes del macho, que ocluye el orificio vaginal. Al mediodía del día siguiente a la copulación se estima como día 0.5 de gestación. Las primeras divisiones de la cigota comienzan en la ampula del oviducto después de 24 horas de la fertilización y las divisiones continúan durante 2 ó 3 días durante el tránsito a través del oviducto hacia el útero. En el día 3 de gestación el embrión entra en el útero y consiste en 16 células. El estado de mórula está aún en la parte superior del útero, hasta que el 4to día de gestación la zona pelucida se pierde y se hallan blastocitos libres en el útero. En el día 4.5 de gestación comienza la implantación del embrión en la pared uterina.

Protocolo

Por la tarde, ratones hembra plg-/- (8-10 semanas de edad) fueron ubicadas en jaulas junto a machos plg-/- de probado potencial. Cada mañana las hembras fueron examinadas detenidamente por el característico tapón vaginal que se forma luego de copular, luego de hallar hembras con tapón éstas fueron trasladadas y agrupadas en dos grupos de tratamiento. Comenzando en el día 3.5 (es decir justo antes de la implantación) y hasta el día 18.5 se les inyectaron i.p. diariamente (125 \mul) de vehículo CMC (grupo 1, 3 ratones), o el mismo vehículo pero con la adición de Galardin^{TM} (G; 2.5 mg) (grupo 2, 4 ratones). En forma similar, ratones de tipo salvaje plg+/+ hembras fueron cruzados con plg+/+ machos y 10 hembras con tapón fueron obtenidas para dos grupos de tratamiento. Tres días luego de la formación del tapón, los ratones fueron inyectados diariamente con vehículo (grupo 3, cinco ratones), o con vehículo con la adición de Galardin^{TM} (2.5 mg) (grupo 4, cinco ratones).

Resultados

Al día 18.5 los ratones fueron evaluados para determinar embarazo, y los resultados obtenidos se muestran en la tabla 1. Se obtuvo una tasa de embarazo del 80% en ratones plg+/+ luego de tratamiento con Galardin^{TM}, y 100% de estos embarazos fueron viables; el efecto del inhibidor de metalo-proteasa sobre el embarazo fue, así, no existente o leve cuando el sistema plasminógeno/plasmina estuvo intacto. Sin embargo en ratones plg-/-, Galardin^{TM} redujo la tasa de preñez al 25% y éste embarazo no fue viable. No se obtuvieron embriones viables cuando la inhibición de la metaloproteasa fue combinada con la total deficiencia de plasmina.

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TABLA 1 Efecto del tratamiento con Galardin^{TM} sobre la fertilidad de ratones Plg -/-

1

Conclusión

Estos resultados son interpretados de la siguiente manera: La implantación del embrión de ratón procede virtualmente en forma normal ya sea cuando existe actividad de plasmina o de metalo-proteasa, pero, el éxito de la implantación se elimina en ratones cuando plasmina está absolutamente ausente y se inhiben las metalo-proteasas, es decir la deficiencia en plasmina y la inhibición de metalo-proteasas actúan aditivamente en la eliminación del proceso de implantación invasiva.

Ejemplo 3 Inhibición de la involución de la glándula mamaria en ratones

En este ejemplo, ratones deficientes en plasminógeno y ratones de tipo salvaje post-lactantes fueron tratados sistémicamente con un potente inhibidor de metalo-proteasas y el efecto sobre la involución de la glándula mamaria fue analizado pesando las glándulas extraídas luego del intervalo normal de involución.

Antecedentes

Luego de que los ratones han dado a luz, las glándulas mamarias de la madre lactante crecen considerablemente con el objeto de proveer suficiente leche para alimentar a sus crías. Cuando las crías son destetadas luego de aproximadamente 7.8 días, la lactación se detiene y las glándulas tienen un proceso de involución para retornar a su tamaño normal. Este es un típico proceso de remodelación de tejido, en el que el activador plasminógeno uroquinasa y metalo-proteasas intervienen para la degradación de la matriz. Los niveles de uroquinasa, gelatinasa A, estromelisinas 1 y 3, y MT-MMP- todos incrementan rápidamente 3-4 días luego de que la lactancia se detiene.

Protocolo

Luego de parir, las crías de la ratona fueron alejadas de la madre y se fijó el número de crías para cada madre en 8 crías, agregando crías de otras madres, si necesario, para proveer una cantidad constante de lactancia para cada madre. Se permitió la lactancia y alimentación con ocho crías durante 7-8 días, a cuyo momento, las crías fueron removidas (día 1). En la mañana del día 2 del destete se comenzó el tratamiento sistémico con Galardin^{TM} (2.5 mg/ratón por inyección i.p., en vehículo CMC), y al día 5 del destete, los ratones fueron sacrificados y la glándula con definición mas clara (la cuarta de cuatro en cada lado) fue extraída y pesada.

Resultados

Los resultados se muestran en la Tabla 2, abajo.

TABLA 2 Efecto de Galardin^{TM} en la involución de glándula mamaria en ratones plg-/-

2

La involución de la glándula mamaria se retrasa en ratones plg-/- en comparación con ratones normales plg+/+. El tratamiento de ratones plg +/+ con Galardin^{TM} conlleva a un retraso de la misma magnitud, mientras que el tratamiento con Galardin^{TM} en ratones plg-/- conlleva a un retraso mucho más pronunciado de la remodelación de tejido asociado con la involución de la glándula mamaria.

Conclusión

La involución de la glándula mamaria está parcialmente retrasada en ausencia de plasmina y nuevamente cuando las metalo-proteasas son inhibidas, pero encuentra dramáticamente inhibida cuando la ausencia de plasmina se combina con la inhibición de metalo-proteasas. Estos hallazgos se interpretan como que los inhibidores de plasmina e inhibidores de metalo-proteasas actúan conjuntamente y de manera estrecha en este proceso de remodelación de tejido.

Ejemplo 4 Inhibición de la involución uterina en ratones plg-/-

En este ejemplo, ratones deficientes en plasminógeno (plg-/-) fueron tratados peri-parto sistémicamente con un potente inhibidor de metalo-proteasas, y el efecto sobre la involución uterina post-parto fue evaluada pesando los úteros extraídos.

Antecedentes

Luego de parir, el útero agrandado que previamente fue necesario para la gestación sufre un proceso rápido de reabsorción, que produce una reducción marcada en el tamaño del útero a lo largo de sólo unos pocos días. La involución uterina post-parto es un típico proceso de remodelación de tejidos y es conocido que involucra una gran cantidad de actividad proteolítica.

Protocolo

Nueve ratonas plg+/+ y nueve ratonas plg-/- fueron cruzadas con ratones macho, y empezando en el día 18.5 post-coito (es decir 12-24 h antes de parir) cinco ratones de cada genotipo fueron tratados cada día con una inyección i.p. de Galardin^{TM} (90 mg/kg) en vehículo CMC. El tratamiento fue continuado durante 4 días post-parto y en el quinto día post-parto los ratones fueron sacrificados y el útero fue removido, disectado de tejido graso adherido, y secada por adsorción antes de ser pesadas.

Resultados

Los resultados se muestran en la Tabla 3 abajo. El tratamiento sistémico de ratones plg-/- con el inhibidor de metalo-proteasas Galardin^{TM} produjo un aumento significativo en el peso del útero (p=0.0129) a los 5 días post-parto. El tratamiento de ratones plg+/+ con la misma dosis de Galardin^{TM} no produjo aumentos significativos en el peso de los úteros a los cinco días post-parto (p=0.158).

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TABLA 3 Efecto de un inhibidor de metalo-proteasas en la involución uterina

3

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Conclusión

En ausencia de plasmina, la actividad remodeladora de tejido asociada a la involución del útero post-parto en el ratón es acompañada por la actividad proteolítica de metalo-proteasas.

Ejemplo 5 (A) Curación de heridas en ratones normales Plg+/+ tratados con inhibidores de plasmina

En este ejemplo, los ratones que exhiben una expresión normal de plasminógeno fueron tratados sistémicamente con dos inhibidores de plasmina, aprotinina y ácido tranexámico. El modelo de tratamiento fue la curación de heridas. La curación exitosa de la herida fue interpretada por el cierre completo de la incisión en la piel. Con respecto a los antecedentes del modelo, ver Ejemplo 1.

Protocolo

Veinte ratones plg+/+ fueron heridos con un corte estándar de 20 mm de longitud, con un corte a través del grosor total de la piel en la espalda, y luego divididos en cuatro grupos: el grupo 1 recibió cada día tres inyecciones i.p. con vehículo tampón; el grupo 2 recibió cada día aprotinina (AP; 13000 KIU) dividida en tres inyecciones i.p. al menos espaciadas por 6 horas; el grupo 3 recibió cada día ácido tranexámico (TA; 10 mg) dividida en tres inyecciones i.p espaciadas al menos por 6 horas, y el grupo 4 recibió cada día un tratamiento combinado de aprotinina (13000 KIU) y ácido tranexámico (10 mg) dividida en tres inyecciones espaciadas al menos por 6 horas.

Cada día el largo de la herida abierta fue cuidadosamente medida y anotada. El tiempo que fue necesario para cada herida de piel para cerrar completamente también fue anotado.

Resultados

Los resultados se muestran en las Figs. 6 y 7. Mientras todas las heridas en ratones no tratados se curaron luego de 17 días, y las heridas en ratones tratadas con ácido tranexámico también curaron luego de 17 días, las heridas en ratones tratados con el inhibidor aprotinina sólo se curaron luego de 24 días, y las heridas en los ratones tratados con ambos aprotinina y ácido tranexámico se cerraron sólo luego de 39 días.

Conclusión

Estos resultados demuestran que la inhibición de la curación de heridas se puede obtener in vivo mediante un tratamiento sistémico con inhibidores de plasmina en ratones de tipo salvaje, produciendo una inhibición de la curación de heridas que es significativa y similar, pero no tan pronunciada, como la observada en ratones plg-/- no tratados (Romer, 1996, y ejemplo 2 arriba). Nosotros interpretamos este resultado como que muestra que con las drogas, dosis, y esquemas de administración usados en el presente experimento, se obtuvo una parcial pero incompleta inhibición sistémica de plasmina in vivo.

(B) Vida media biológica de la Aprotinina en plasma de sangre de ratones normales plg+/+

El inhibidor de plasmina aprotinina fue inyectado intraperitonealmente en ratones normales, y luego el nivel en sangre de aprotinina fue medido en diferentes intervalos de tiempo para determinar la vida media de la actividad funcional en la circulación.

Protocolo

Quince ratones (que pesaron aproximadamente 25 g cada uno) fueron inyectados i.p. con 0.75 ml de una solución de aprotinina (20000 KIU/ml; aproximadamente 2.1 mg) y a intervalos de tiempo de 0.5, 1.5, 3.0, 6.0 y 24 h, tres ratones fueron sacrificados y su sangre recuperada por punción cardíaca y transpasada en tubos anticoagulante citrato. Cada muestra de plasma fue ultracentrifugada a través de una membrana con cut-off de 20000 MW, y el nivel de aprotinina en el ultrafiltrado fue determinado mediante la inhibición de la actividad de una solución estándar de tripsina en un ensayo colorimétrico.

Resultados

Los niveles de aprotinia encontrados en la sangre de los ratones se muestran en la Fig. 8. Se puede ver que una única inyección i.p. de aprotinina de 2.1 mg puede alcanzar un nivel en plasma de ratón de aproximadamente 25 \mug/ml, pero este nivel decae rápidamente, con una vida media de aproximadamente 3 h.

Conclusión

Interpretamos estos resultados para mostrar que el tratamiento efectivo con aprotinina requiere que se administre el agente varias veces i.p. por día (por ejemplo 6 veces), o preferiblemente continuamente, de manera de mantener un alto nivel de actividad inhibitoria contra plasmina en los tejidos del cuerpo.

(C) efecto del esquema de administración del inhibidor de plasmina en la curación de heridas en ratones normales plg+/+

Ratones normales fueron tratados sistémicamente con dos esquemas diferentes de administración de una mezcla de dos inhibidores de plasmina, aprotinina y ácido tranexámico. El modelo experimentado fue la curación de heridas. La curación exitosa de la herida fue interpretada por el cierre completo de la incisión de la piel. Con respecto a los antecedentes del modelo, ver Ejemplo 1.

Protocolo

Quince ratones plg+/+ fueron heridos con una incisión estándar de 20 mm de longitud a lo largo de todo el grosor de la piel, en la espalda y luego divididos en tres grupos: el grupo 1 recibió 5 inyecciones i.p. de vehículo tampón por día; el grupo 2 recibió cada día aprotinina (650000 KIU/kg) y ácido tranexámico (1 g/kg) divididos en 4 inyecciones i.p. espaciadas por 6 horas, y el grupo 3 recibió cada día aprotinina (650000 KIU/kg) y ácido tranexámico (1 g/kg) dividido en 5 inyecciones i.p. espaciadas al menos 4 horas; cada día, se midió cuidadosamente la longitud de la herida abierta y se tomó nota. El tiempo requerido para cada herida de piel en cerrarse completamente también fue anotado.

Resultados

Los resultados se muestran en las Figs. 9 y 10. La curación de heridas fue claramente inhibida más fuertemente por una dada dosis de inhibidor de proteasas cuando el tratamiento sistémico se administró con más frecuencia, en este ejemplo, 5 inyecciones diarias en comparación a 4.

Conclusión

Estos resultados confirman que el tratamiento sistémico efectivo de ratones con inhibidores de plasmina requiere que el agente sea administrado varias veces por día (por ejemplo 5 veces), para mantener un nivel elevado de actividad inhibitoria de plasmina en los tejidos del cuerpo. Pero aún con este esquema de administración, el efecto de los inhibidores de plasmina sobre la curación de heridas de piel no es tan poderoso como el efecto de la deficiencia de plasminógeno, el cual indica que la actividad de plasmina fue completamente eliminada.

Ejemplo 6 Efecto del tratamiento combinado de inhibidores de plasmina e inhibidores de metalo-proteasas en la curación de heridas en ratones normales plg+/+

En este ejemplo, ratones normales fueron tratados sistémicamente con (a) una mezcla de los dos inhibidores de plasmina, aprotinina y ácido tranexámico, (b) un inhibidor de metalo-proteasas, y (c) una combinación de los dos tratamientos con inhibidores de proteasas. El modelo experimentado fue en la curación de heridas. Una curación exitosa de la herida fue interpretada como el cierre completo de la herida de piel. Con respecto a los antecedentes del modelo, ver Ejemplo 1.

Protocolo

Cuarenta y ocho ratones plg+/+ fueron heridos con una incisión estándar de 20 mm de longitud a lo largo de todo el grosor de la piel, en la espalda y luego divididos en cuatro grupos: el grupo 1 recibió 5 inyecciones i.p. de vehículo tampón (suspensión de 4% carboxymethyl celulosa, CMC) por día; el grupo 2 recibió cada día aprotinina (13000 KIU/día/ratón) y ácido tranexámico (20 mg/día/ratón) divididos en 4 inyecciones i.p. espaciadas por al menos 5 horas; el grupo 3 fue inyectado i.p. una vez por día con Galardin^{TM} (2.5 mg 125 \mul of CMC); el grupo 4 recibió un tratamiento combinado de aprotinina, ácido tranexámico y Galardin^{TM} en las mismas dosis que las indicadas más arriba. Cada día, se midió cuidadosamente la longitud de la herida abierta y se tomó nota. El tiempo requerido para cada herida de piel en cerrarse completamente también fue anotado.

Resultados

Los resultados se muestran en Figs. 11 y 12. La curación de heridas en ratones normales plg+/+ fue claramente inhibida más fuertemente cuando se usaron tratamientos sistémicos combinando inhibidores de metalo-proteasas e inhibidores de plasmina.

Conclusión

El remodelamiento de tejido asociado con la curación de heridas en ratones puede ser inhibido fuertemente in vivo cuando se aplican tratamientos sistémicos con inhibidores de proteasas dirigidos a ambos sistemas, de plasmina y de metalo-proteasas. Sin embargo, no hay una completa inhibición de la curación de heridas. Esto se contrasta con la completa inhibición obtenida con el tratamiento con inhibidores de metalo-proteasas en ratones plg-/- del ejemplo 1 más arriba. De acuerdo con los resultados del ejemplo 5, concluimos que el tratamiento sistémico con inhibidor de plasmina inhibe la acción de plasmina, pero no completamente.

Ejemplo 7 Implantación en ratones normales Plg+/+ tratados con inhibidores de plasmina e un inhibidor de metalo-proteasa

En éste ejemplo, ratones que expresan normalmente plasminógeno fueron tratados sistémicamente con un potente inhibidor de metalo-proteasas en combinación con inhibidores de plasmina, aprotinina y ácido tranexámico. El modelo experimentado fue el de la implantación del embrión. La implantación exitosa fue interpretada por la presencia viable de embriones en la ratona preñada. Los antecedentes para este modelo se discuten en el Ejemplo 2.

Protocolo

Por la tarde, ratones hembra de tipo salvaje (plg+/+) fueron ubicados junto con ratones macho de tipo salvaje plg+/+ de potencial probado. Cada mañana, las hembras fueron examinadas cuidadosamente para determinar la presencia de tapones vaginales formados luego de la copulación, y las hembras que copularon fueron transladadas y adjudicadas a uno de cuatro grupos. Empezando dos días después de la copulación, fueron inyectadas i.p. diariamente con una solución (125 \mul) de vehículo CMC (grupo 1), o del mismo vehículo con la adición de Galardin^{TM} (2.5 mg) (grupo 2), o aprotinina (13000 KIU) y ácido tranexámico (10 mg) dividido en tres inyecciones i.p. espaciadas al menos seis horas (grupo 3), mientras que el grupo 4 recibió cada día aprotinina, ácido tranexámico y Galardin^{TM} en las mismas dosis. Los grupos de ratones fueron tratados de esta manera en cada día subsiguiente y también se observó de cerca por la presencia de signos de preñez, hasta el final del período normal de gestación (tres semanas).

Tener en cuenta que las dosis de aprotinina y ácido tranexámico fueron aquellas usadas en el experimento de curación de heridas (Ejemplo 5) y por ello se sabía que producían una inhibición parcial de plasmina in vivo.

Resultados

La producción de crías por los ratones no fue afectada por tratamiento con inhibidores de plasmina o por inhibidores de metalo-proteasas o por una combinación de ambos.

Conclusión

Encontramos que la combinación de GalardinTM con inhibidores de plasmina no conlleva a la eliminación de la implantación de embriones, en contraste con GalardinTM en la misma dosis en un esquema de administración sobre ratones deficientes en plasminógeno (ver Ejemplo 2). Interpretamos este resultado como una indicación de que no hemos obtenido una suficiente inhibición sistémica de la plasmina, de acuerdo con los hallazgos de los Ejemplos 5 y 6 (ver arriba), y concluimos que la actividad plasmina residual es suficiente para permitir la exitosa implantación, aún en la presencia de inhibidor de metalo-proteasas.

Ejemplo 8 Tratamiento de tumores de pulmón de Lewis en ratones normales C57B16 Plg+/+ con inhibidores de plasmina y un inhibidor de metalo-proteasa

En este ejemplo, ratones C57B16 que normalmente expresan plasminógeno, fueron tratados sistémicamente con inhibidores de plasmina, aprotinina y ácido tranexámico, en combinación con un potente inhibidor de metalo-proteasas. El modelo experimentado fue el del crecimiento de un tumor invasivo transplantable de ratón, el carcinoma de pulmón de Lewis.

Antecedentes

El carcinoma de pulmón de Lewis es un modelo de tumor transplantable de uso difundido y bien caracterizado, de una línea C57B1. La inyección subcutánea de una suspensión de fragmentos de tumor produce un tumor primario de crecimiento rápido agresivamente invasivo, que es notable por su habilidad de destruir el músculo adyacente y el tejido conectivo, como así también por su metástasis temprana a los pulmones. El tiempo de sobrevida es usualmente aproximadamente 25-30 días, mientras que la metástasis ocurre usualmente dentro de 7 días. Se ha demostrado previamente que el tejido tumoral expresa niveles elevados de uPA y uPAR.

Protocolo

Cuatro grupos de 17 ratones fueron inyectados subcutáneamente con tejido triturado de carcinoma de pulmón de Lewis (aproximadamente 1.0 x 10^{6} células). El primer grupo (CON) fue tratado sólo con vehículo con tampón. El segundo grupo (TA/AP) fue tratado i.p. tres veces por día con una mezcla de ácido tranexámico (TA) y aprotinina (AP), de manera que el dosage total fue de 10 mg TA y 13000 KIU AP por día por ratón. El tercer grupo (LBH 106) fue tratado con 1.8 mg Galardin^{TM} por día por ratón (en vehículo tampón CMC), y el cuarto grupo recibió ácido tranexámico, aprotinina y Galardin^{TM} en las mismas dosis. El crecimiento tumoral en los ratones fue monitoreado cada 2-3 días midiendo cuidadosamente con callipers los ejes más largos y más cortos de los tumores palpables, y el volumen calculado se presenta en función del tiempo. La tasa de crecimiento de los tumores fue seguida hasta la muerte y la sobrevida de los ratones en los cuatro grupos fue analizada en un gráfico de Kaplan-Meier. Secciones histológicas de los carcinomas primarios murinos de pulmón de Lewis fueron analizados por hibridización in situ para verificar la expresión de estromelisina-1 y gelatinasa-B.

Para los estudios de hibridización in situ, 15 días después de la transplantación, los ratones fueron perfundidos en 4% paraformaldehido. Los tumores primarios fueron removidos y embebidos en parafina. Secciones de 5 \mum fueron hibridizados con sondas marcadas con 35S de gelatinasa-B y estromelisina-1 (Lund y colaboradores, 1996). Las secciones fueron expuestas a una emulsión de autoradiografía y reveladas 7 días mas tarde.

Resultados

Los estudios de expresión usando hibridización in situ mostraron que las dos metalo-proteasas estromelisina-1 y gelatinasa B se expresan a niveles elevados en tumores de pulmón de Lewis (Fig. 13). Las figuras 13A y 13B muestran a la misma imagen fotografiada con (A) campo luminoso y un condensor de campo oscuro. Las células que expresan gelatinasa-B (flechas en figuras 13A y B) se identifican fácilmente con el condensador de campo oscuro, donde la señal para las células positivas se observa como un teñido leve (flechas en figuras 13B). La Fig 13C está teñida con hematoxilina-eosina y corresponde a una sección adyacente a la sección de la Fig 13D. Las flechas en la Fig. 13C indican la localización virtual de las células positivas indicadas con flechas en la Fig. 13D.

Los resultados de los tratamientos sistémicos con inhibidores de proteasa en ratones con carcinoma de pulmón de Lewis se muestran en Figs. 14 y 15.

El tratamiento con inhibidores de plasmina sólo y también el tratamiento con inhibidor de metalo-proteasa sólo produjo una disminución clara en la tasa de crecimiento de estos tumores. El tratamiento combinado con los dos tipos de inhibidores produjo un efecto sustancialmente más fuerte sobre el crecimiento que cualquier tratamiento por si sólo. Cada uno de los tipos de inhibidores también produjeron un alargamiento considerable de la sobrevida de los ratones que llevaban el tumor. También la combinación de inhibidores de plasmina y de metalo-proteasas incrementaron la sobrevida de los ratones sustancialmente y en este grupo de ratones hubo tres sobre 17 con una sobrevida larga sorprendente. Esto está en contraste claro con los ratones de los otros tres grupos que no tuvieron ningún ratón con sobrevida larga. En este contexto, debe notarse que los ratones del experimento fueron mezclados en cuatro grupos al azar luego de haber sido inoculados con las células tumorales. Todos los sobrevivientes de vida larga estaban libres de tumores palpables en el momento en que el tratamiento fue detenido (día 50). Desde entonces ellos han sido mantenidos sin tratamiento y todavía se encuentran vivos y libres de tumores al día de la entrega de este documento (>300 días después de la inoculación). De los 68 ratones que murieron espontáneamente en este experimento, a 55 se les practicó una autopsia. Todos estos 55 ratones tenían extensas metástasis en los pulmones y en otros
órganos.

Conclusión

Concluimos que el tratamiento sistémico de ratones tanto con inhibidores de plasmina o inhibidores de metalo-proteasas pueden producir una inhibición parcial del crecimiento de carcinoma primarios de pulmón de Lewis, y la combinación de los dos regímenes conlleva a un fuerte efecto aditivo sobre el crecimiento. Los tres regímenes también conllevan a un aumento sustancial en la sobrevida de los ratones inoculados con tumor. En los ratones tratados con inhibidores individuales, todos los ratones murieron. Por contraste, hubo tres sobrevivientes de larga vida entre los ratones tratados con una combinación de los dos regímenes y por ello concluimos que con respecto a la sobrevida, hubo un efecto sinergístico y claro con la combinación. Estos hallazgos están de acuerdo con los resultados del tratamiento combinado obtenido en otros procesos de remodelación de tejido invasivo, y en particular en los estudios de curación de heridas (Ejemplo 6) en los cuales hubo un retraso substancial pero no una detención completa como resultado del mismo tratamiento combinado.

Contemplamos que una combinación de inhibición de metalo-proteasa con la inhibición completa de plasmina podría llevar a la inhibición completa del crecimiento tumoral y/o a la sobrevida de todos los ratones inoculados. Este tipo de experimento podría realizarse inmediatamente cuando la línea de ratones C57B1 se haga deficiente en plasminógeno por cruzamiento y posteriormente por cruzamiento se haya hecho histo-compatible con el carcinoma de pulmón de Lewis.

Ejemplo 9 Tratamiento de xenografías de cáncer de mama humano en ratones "athymic" (sin timo) con inhibidores de plasmina e inhibidores de metalo-proteasas

En este ejemplo los ratones "athymic" son usados, que permiten la hetero-transplantación y crecimiento invasivo de tumores humanos en ratones. Los ratones usados expresan plasminógeno, y fueron tratados sistémicamente con inhibidores de plasmina, aprotinina y ácido tranexámico, con un potente inhibidor de metalo-proteasas (BB-94), y con una combinación de inhibidores de plasmina con BB-94. Los resultados fueron interpretados a partir del crecimiento primario de tumores.

Protocolo

Cuatro grupos de 11 ratones fueron inyectados subcutáneamente con 2 x 10^{6} células cultivadas de cáncer de mama humano de MDA-MB-231. El grupo 1 fue posteriormente inyectado i.p. sólo con vehículo tampón; el grupo 2 (TA/AP) fueron tratados con una mezcla de ácido tranexámico (TA) y aprotinina (AP), de manera que el dosaje total fue de 650000 KIU/kg aprotinina y 1 g/kg ácido tranexámico dividido en 5 i.p. por día espaciadas al menos cuatro horas; el grupo 3 (BB-94) fue tratado con 125 mg/kg BB-94 como una única inyección diaria, y el cuarto grupo recibió TA, AP y BB-94 en las mismas dosis. EL crecimiento de los tumores fue luego cuidadosamente medido cada 2-3 días midiendo el eje más largo y el eje más corto de los tumores palpables, y los resultados graficados en función del tiempo.

Los tumores de los ratones no tratados controles y de los ratones recibiendo BB-94 fueron homogeneizados y ensayados para determinar el contenido de uPA murino usando un ELISA uPA murino específico.

Resultados

En éste modelo, el tratamiento sistémico con inhibidores de plasmina usado sólo a la dosis y esquema de administración mostrado no produjo una inhibición detectable en el crecimiento del tumor, mientras que el tratamiento sistémico con inhibidor de metalo-proteasa usado sólo tuvo un efecto inhibitorio claro sobre el crecimiento del tumor, efecto que pudo ser reforzado con el tratamiento sistémico combinado con inhibidores de plasmina e inhibidor de metalo-proteasa usados conjuntamente (Fig. 16).

Conclusión

El inhibidor de metalo-proteasas BB-94 inhibe claramente el crecimiento de esta xenografía tumoral, mientras que no hay efecto sobre este parámetro con la inhibición de plasmina sola. Sin embargo, sorpresivamente, la inhibición de plasmina tuvo un efecto significativo sobre el crecimiento de tumores que eran conjuntamente tratados con inhibidor de metalo-proteasa. Observamos, pues, un moderado, pero claro efecto sinérgico de los dos regímenes sobre el crecimiento de tumores en este sistema.

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Claims (41)

1. El uso de al menos una primera sustancia que, en un mamífero, tiene el efecto de inhibición o abolición de la actividad proteolítica de plasmina in vivo, como así de sus derivados activos,

para la preparación de una composición farmacéutica para la administración a un mamífero en el que, al menos,

la actividad proteolítica in vivo de al menos una enzima proteolítica que es diferente de plasmina al igual que derivados activos de la misma y que ejerce su acción sobre al menos una proteína extracelular sobre la cual plasmina y derivados activos de plasmina también actúan enzimáticamente,

son inhibidas o eliminadas, dicha al menos una enzima proteolítica siendo análoga(s) no-murina (incluyendo humana(s)) de metalo-proteasa(s) murinas que, aisladas o en combinación, es/son esenciales para la implantación del embrión y/o curación de heridas en ratones Plg-/- pero no en ratones de tipo salvaje, o que, aisladas o en combinación, es/son necesaria(s) para la

destrucción de tejido invasivo asociada con crecimiento maligno en ratones donde la actividad proteolítica de plasmina es sustancialmente eliminada,

Para prevención o detención de modelación de tejido invasivo en mamíferos, mientras la modelación de tejido invasivo no incluya la contracción de tejido o la ulceración de córnea.

2. El uso de acuerdo a la reivindicación 1, donde el mamífero al que se administra la composición farmacéutica es un mamífero recibiendo una cantidad efectiva de al menos una segunda sustancia que, en el mamífero, tiene el efecto de la inhibición o eliminación de

la actividad proteolítica in vivo de al menos una enzima proteolítica que es diferente de plasmina, al igual que derivados activos de la misma y que ejerce su acción sobre al menos una proteína extracelular sobre la cual plasmina y derivados activos de plasmina también actúan enzimáticamente,

dicha al menos segunda sustancia siendo al menos un inhibidor de metalo-proteasa que, luego de su administración en una cantidad efectiva, resulta en una inhibición significativamente mayor de implantación de embrión y/o curación de herida en ratones Plg-/- que en ratones salvajes, o resulta en abolición de la

destrucción de tejido invasivo asociada con crecimiento maligno en ratones donde la actividad proteolítica de plasmina es substancialmente eliminada,

la preparación farmacéutica conteniendo al menos una primera sustancia siendo para administración ya sea simultánea con al menos una dicha segunda sustancia o con un intervalo de administración de la segunda dicha sustancia que las dos, al menos una segunda sustancia y la dicha al menos una primera sustancia están presentes simultáneamente en concentraciones que afectan sustancialmente la inhibición in vivo, preferentemente bloqueando, sus respectivas proteasas diana.

3. El uso de al menos una segunda sustancia que en un mamífero tiene el efecto de la inhibición o eliminación de

la actividad proteolítica in vivo de al menos una enzima proteolítica que es diferente de plasmina, así como de derivados activos de la misma y que ejerce su acción sobre al menos una proteína extracelular sobre la cual plasmina y derivados activos de plasmina también actúan enzimáticamente,

dicha al menos segunda sustancia siendo al menos un inhibidor de metalo-proteasa que, luego de su administración en una cantidad efectiva, resulta en inhibición significativamente mayor de implantación de embrión y/o curación de herida en ratones Plg-/- que en ratones salvajes, o resulta en abolición de la

destrucción de tejido invasivo asociada con crecimiento maligno en ratones donde la actividad proteolítica de plasmina es sustancialmente eliminada,

para la preparación de una composición farmacéutica para administración a un mamífero en el cual la actividad proteolítica de plasmina in vivo como así de derivados activos de la misma son inhibidas o eliminadas,

para prevención o detención de modelación de tejido invasivo en mamíferos, mientras la modelación de tejido invasivo no incluya la contracción de tejido o la ulceración de córnea.

4. El uso de acuerdo a la reivindicación 3, donde el mamífero al que se administra la composición farmacéutica es un mamífero que recibe una cantidad efectiva de al menos una primera sustancia que, en el mamífero, tiene el efecto de la inhibición o eliminación de

la actividad proteolítica in vivo de plasmina al igual que derivados activos de la misma,

la preparación farmacéutica conteniendo al menos una segunda sustancia siendo para administración ya sea simultánea con al menos una dicha primera sustancia o con un intervalo tal de administración de la primera dicha sustancia que las dos, al menos una segunda sustancia y la dicha al menos una primera sustancia estén presentes simultáneamente en concentraciones que afectan sustancialmente la inhibición in vivo, preferentemente bloqueando, sus respectivas proteasas diana.

5. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la al menos una primera sustancia es al menos una primera sustancia que tiene un efecto sustancial en la eliminación in vivo de la actividad proteolítica de plasmina.

6. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la al menos una segunda sustancia es al menos una segunda sustancia que tiene un efecto sustancial en la eliminación in vivo de la actividad proteolítica de al menos una metalo-proteasa.

7. El uso de al menos una tercera sustancia que, en un mamífero, tiene el efecto de inhibir ambas, la actividad proteolítica in vivo de plasmina como así también derivados activos de la misma y de la actividad proteolítica de al menos una enzima proteolítica que es diferente de plasmina como también sus derivados activos y que ejerce su acción sobre al menos una proteína extracelular sobre la cual plasmina y derivados activos de la misma también actúan enzimáticamente, dicha al menos una enzima proteolítica siendo al menos una metalo-proteasa, la al menos una tercera sustancia siendo al menos una sustancia que, luego de administración en una dosis efectiva, resulta en una inhibición significativamente mayor de implantación de embrión y/o curación de heridas en ratones Plg-/- que en ratones salvajes, o que, aislada o en combinación, es/son necesarias para la destrucción de tejido invasivo asociada con crecimiento maligno en ratones donde la actividad proteolítica de plasmina es sustancialmente eliminada,

para la preparación de una composición farmacéutica para administración a un mamífero,

para prevención o detención de modelación de tejido invasivo en mamíferos, mientras la modelación de tejido invasivo no incluya la contracción de tejido o la ulceración de córnea.

8. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 1-6, donde al menos una de las al menos una primera y/o al menos una segunda sustancia es una tercera sustancia de acuerdo con la definición en la reivindicación 7.

9. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 4, 5, 6, u 8, donde la al menos una primera sustancia es administrada en una cantidad que produce una concentración que es o está por debajo de la máxima concentración farmacológicamente aceptable de dicha primera sustancia sola, y, cuando la concentración está debajo del máximo farmacológicamente aceptable de la primera sustancia sola, dicha concentración es una que produce sustancialmente la misma inhibición que la máxima concentración farmacológicamente aceptable de la primera sustancia sola,

y la composición farmacéutica que contiene la al menos una segunda sustancia es para ser administrada en una cantidad que produce una concentración que, cuando la composición farmacéutica contiene la al menos una segunda sustancia es administrada simultáneamente o luego de la administración de la al menos una primera sustancia, es o está por debajo de la concentración máxima farmacológicamente aceptable y que, si está por debajo de la concentración máxima farmacológicamente aceptable, es una concentración que produce sustancialmente la misma inhibición que la concentración máxima farmacológicamente aceptable.

10. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 4, 5, 6, u 8, donde la al menos una primera sustancia es administrada en una cantidad que produce una concentración que es o está por debajo de la máxima concentración farmacológicamente aceptable de dicha segunda sustancia sola, y, cuando la concentración está debajo del máximo farmacológicamente aceptable de la segunda sustancia sola, dicha concentración es una que produce sustancialmente la misma inhibición que la máxima concentración farmacológicamente aceptable de la segunda sustancia sola,

y la composición farmacéutica que contiene la al menos una primera sustancia es para ser administrada en una cantidad que produce una concentración que, cuando la composición farmacéutica contiene la al menos una primera sustancia es administrada simultáneamente o luego de la administración de la al menos una segunda sustancia, es o está por debajo de la concentración máxima farmacológicamente aceptable y que, si está por debajo de la concentración máxima farmacológicamente aceptable, es una concentración que produce sustancialmente la misma inhibición que la concentración máxima farmacológicamente aceptable.

11. El uso de acuerdo a la reivindicación 7, donde la composición farmacéutica conteniendo la al menos una tercera sustancia es para ser administrada en una cantidad que produce una concentración que es o está por debajo de la máxima concentración farmacológicamente aceptable de dicha tercera sustancia, y, cuando la concentración está debajo del máximo farmacológicamente aceptable de dicha al menos una tercera sustancia, dicha concentración es una que produce substancialmente la misma inhibición que la máxima concentración farmacológicamente aceptable de la al menos una tercera sustancia.

12. El uso de acuerdo a las reivindicaciones 4, 5 u 8, donde la al menos una segunda sustancia es administrada en una cantidad que está de acuerdo con aquella usada en la reivindicación 9, y donde la composición farmacéutica conteniendo la al menos una primera sustancia es para ser administrada en una cantidad que, cuando es administrada simultáneamente con o luego de la administración de la segunda sustancia, produce una concentración que resulta en sustancialmente la misma inhibición que la concentración máxima farmacológicamente aceptable.

13. El uso de acuerdo a las reivindicaciones 2, 5, 6 u 8, donde la al menos una primera sustancia es administrada en una cantidad que está de acuerdo con aquella usada en la reivindicación 10, y donde la composición farmacéutica que contiene la al menos una segunda sustancia es para ser administrada en una cantidad que, cuando es administrada simultáneamente con o luego de la administración de la primera sustancia, produce una concentración que resulta en sustancialmente la misma inhibición que la concentración máxima farmacológicamente aceptable.

14. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 1-13, donde la al menos una primera sustancia es administrada en una cantidad de entre 1 y 1000 mg por día, o la composición farmacéutica que contiene la al menos una primera sustancia es para administración en una cantidad entre 1 y 1000 mg por día de la al menos una primera sustancia.

15. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 1-14, donde la cantidad relativa de la al menos una primera y al menos una segunda sustancia están en una relación tal que la administración simultánea o secuencial de una cantidad efectiva de ellas a un mamífero llevará a una prevención efectiva o detención de modelación invasiva de tejido en dicho mamífero.

16. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 1-15, donde la metalo-proteasa es seleccionada de un grupo comprendiendo colagenasa, estromelisina, gelatinasa, una elastasa, y una metalo-proteasa de tipo de membrana.

17. El uso de acuerdo a la reivindicación 16, donde la colagenasa es seleccionada del grupo que comprende MMP-1, MMP-8 y MMP-13.

18. El uso de acuerdo a la reivindicación 16, donde estromelisina es seleccionada del grupo que comprende MMP-3, MMP-7, MMP-10 y MMP-11.

19. El uso de acuerdo a la reivindicación 16, donde gelatinasa es seleccionada del grupo comprendiendo MMP-2, y MMP-9.

20. El uso de acuerdo a la reivindicación 16, donde elastasa es MMP-12.

21. El uso de acuerdo a la reivindicación 16, donde metalo-proteasa de tipo de membrana es seleccionada del grupo que comprende MMP-14, MMP-15 y MMP-16.

22. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 1-21, donde la modelación de tejido invasivo corresponde a un neoplasma maligno.

23. El uso de acuerdo a la reivindicación 21, donde el neoplasma maligno es seleccionado entre el grupo que comprende carcinoma como adenocarcinoma, sarcoma como liposarcoma, fibrosarcoma, chondrosarcoma, osteosarcoma, leiomyosarcoma, rhabomyosarcoma, glioma, neurosarcoma, medulablastoma, melanoma maligno, neurofibrosarcoma, hemangiosarcoma, y limphangiosarcoma, y otros neoplasmas malignos como teratoma maligno, dysgerminoma, seminoma, chriocarcinoma, leucemia y linfoma.

24. El uso de acuerdo a la reivindicación 23, donde el carcinoma es carcinoma de pulmón, de mama, de próstata o de colon.

25. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 1-22 para uso en contracepción.

26. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 1-25, donde la al menos una primera sustancia es seleccionada entre el grupo que comprende aprotinina, ácido traxémico, N\alpha-trans-4-aminomethyl-cyclohexane carbonyllysine 4 benzoylanilide, N\alpha-trans-4-aminomethyl-cyclohexane carbonyl-O-bromobenzyltoxycarnyltyrosine 4 acetylanilide, 1-(ethoxy-carbonyloxy)ethyl trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxylate hydrochloride (KABI 2161), alpha-2-antisplasmin, alpha-2-makroglobulin, inhibidor de tripsina asociado a tumor (tumor associated trypsin inhibitor), inhibidor de tripsina urinario (urinary trypsin inhibitor), leupeptina, pyroglutamyl-Leu-Arg-CHO, 6-aminocaproic acid, p-aminobenzamidine, bis(5-amidino-2-benzimidazolyl)methane, alpha-N-acetyl-L-lysine methyl ester, tosyl-lysine chloromethyl ketone, and Boc-D-Phe-ProBoro-Arg-OH.

27. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones entre 1-26, donde la al menos una segunda sustancia es seleccionada del grupo que comprende a tejido inhibidor de metalo-proteasas, alpha-2-macro-globulin, Galardin^{TM},
N[2R-2-(hydroxyamidocarbonylmethyl)-4-methylpentanolyl]-L-tryptophan methylamide, batimastat, marimastat, GI 129471, GI 168, GI 173,GI 179, GI 184, CI A, CI-B, RP59794, SC-44463, Ro31-4724, CT1746, SCH 47890, un peptido hydroxamate, LMHKPRCGVPDVGG, inhibidor de la proteasa de liberación de TNF-\alpha, Zincov®, Pro-Ileu, phosphoramidon, thiorphan, tiopronin, a tetracycline, N-acetylcysteina, EDTA y 1,10 phenanthrolene.

28. El uso de acuerdo a la reivindicación 26, donde el tejido inhibidor de proteasas es seleccionado entre el grupo comprendiendo TIMP-1, TIMP-2 y TIMP-3.

29. El uso de acuerdo a la reivindicación 26, donde el peptido hydroxamate es Pro-Leu-Gly-NHOH.

30. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 7-29, donde la al menos una tercera sustancia es seleccionada entre un grupo que comprende un conjugado de Galardin^{TM} con leupeptina.

31. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 1-30, donde la al menos una proteína extracelular es seleccionada entre un grupo comprendiendo colágeno, elastina, fibrina, y proteoglicanos.

32. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 1-30, donde la al menos una proteína extracelular es fibronectina o laminina.

33. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 1-30, donde la al menos una proteína extracelular es un factor de crecimiento o una citoquina, como TGF\alpha (factor de crecimiento transformador), TNF\alpha, factor de crecimiento de fibroblastos básico, y precursores de TGF\alpha o de otros factores de crecimiento o citoquinas.

34. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 1-33, donde la composición farmacéutica es para administración vía parental (como intravenosa e intra-arterial), intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intradermal, oral, bucal, sublingual, nasal, rectal, o una ruta transdermal.

35. El uso de acuerdo a cualquier reinvindicación entre 1-34, donde las sustancias independientemente son dirigidas para una acción sitio-específica.

36. uso de acuerdo a cualquier reivindicación entre 1-35, donde la composición farmacéutica es para uso sistémico.

37. El uso de al menos una primera sustancia

que en un mamífero, produce el efecto de inhibición o eliminación in vivo de la actividad proteolítica de al menos una proteasa, A,

para la preparación de una composición farmacéutica para la administración a un mamífero en el que las acciones in vivo de al menos una proteasa, B, son inhibidas o eliminadas,

para prevención o detención del remodelado de tejido invasivo en el mamífero, mientras la modelación de tejido invasivo no incluya la contracción de tejido o la ulceración de córnea,

la primera proteasa, A, y la otra proteasa, B, teniendo al menos una proteína extracelular como sustrato común, dicha al menos una proteasa, B, siendo esencial para la implantación del embrión y/o curación de heridas y/o necesaria para la destrucción de tejido invasivo asociada con crecimiento maligno en un mamífero cuando la actividad proteolítica de A es sustancialmente eliminada en el mamífero pero no cuando la actividad proteolítica de A esta sustancialmente intacta en el mamífero, donde una de las proteasas, A y B, siendo al menos una metalo-proteasa y la otra proteasa siendo plasmina o derivados activos de la misma.

38. El uso de acuerdo a la reivindicación 37, donde las actividades proteolíticas in vivo de la al menos una proteasa, B, son inhibidas o eliminadas por al menos una segunda sustancia diferente de la dicha al menos una primera sustancia.

39. Un método de búsqueda para una substancia que es capaz de interferir con el remodelamiento invasivo de tejidos en un mamífero, incluyendo el ser humano, el método comprendiendo la provisión de un animal -exepto humanos- donde se ha substancialmente eliminado in vivo las actividades proteolíticas de plasmina, y de ahí en mas se verifica el efecto de la administración de la substancia al animal sobre al menos un proceso que se conoce que involucra modelación de tejido invasivo, y finalmente se establece como resultado que la substancia es capaz de interferir con el modelamiento invasivo de tejidos si el al menos un proceso es inhibido a un nivel significativamente mayor que en ambos, el animal cuando no recibe la substancia y en un animal de referencia que no ha tenido substancialmente eliminadas in vivo las actividades proteolíticas de la al menos una proteasa.

40. Un método de acuerdo a la reinvindicación 39, donde la eliminación substancial de la actividad proteolítica de la al menos una proteasa in vivo fue obtenida mediante una modificación genética del animal o por inhibición farmacéutica.

41. Un método de acuerdo a la reinvindicación 39 ó 40 donde la al menos una proteasa es seleccionada entre el grupo definido en cualquiera de las reivindicaciones 16-21.