DE69131692T3

DE69131692T3 - Verfahren und zusammensetzung zur verbesserung der ungünstigen auswirkungen des alterns

Info

Publication number: DE69131692T3
Application number: DE69131692T
Authority: DE
Inventors: Suresh I. S. Rattan
Original assignee: Senetek PLC
Current assignee: Senetek PLC
Priority date: 1991-05-16
Filing date: 1991-05-16
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2011-05-17
Also published as: FI935039A; ATE185272T1; FI111219B; NO934115L; CN1037235C; CA2108369C; JPH10510240A; AU666836B2; ES2140392T5; WO1992020341A1; EP0584068B1; DK0584068T3; NO304814B1; JP3103375B2; CA2108369A1; BR9107307A; EP0584068A1; CN1068033A; IN172210B; EP0584068B2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Verringerung von nachteiligen Alterungseffekten auf Säugerzellen, ohne die Wachstumsrate oder Gesamtproliferationskapazität der Zellen zu erhöhen.
Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zur Anwendung von bekannten Verbindungen, Kinetin und andere 6-(aminosubstituierte) Purincytokinine, um den nachteiligen Alterungseffekten auf Säugerzellen, einschließlich Zellen der menschlichen Haut, in Kultur und in vivo entgegenzuwirken, und Zusammensetzungen zur Durchführung solcher Verfahren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Verhinderung des zellulären Alterungsprozesses war ein ständiges, jedoch schwer zu erreichendes Ziel der Biologie. Die Verhinderung des Alterungsprozesses hätte eine Reihe von wichtigen praktischen Konsequenzen. Beispielsweise könnte die Produktion von wertvollen Produkten durch Zellen in Kultur verbessert werden, wenn die Zellen die Eigenschaften junger Zellen beibehalten. Auch die Verhinderung der Alterung in Zellen der menschlichen Haut oder anderer Organe wäre wegen der damit verbundenen Konservierung der strukturellen und funktionellen Intaktheit von beträchtlichem Wert. Im Fall der Haut würde eine Verhinderung der nachteiligen Auswirkungen der Zellalterung vorteilhafterweise auch die Konservierung der kosmetischen Unversehrtheit beinhalten.
Man hat eine Reihe von Merkmalen identifiziert, um zwischen jungen und gealterten Zellen zu unterscheiden. Zum Beispiel fand man heraus, dass junge Säugerzellen, einschließlich humane Fibroblasten, in einer Standardkultur gesund und sauber aussehen; eine ebenmäßige, längliche, dünne spindelförmige Morphologie aufweisen; bei der Annäherung an die Konfluenz auf Kultursubstraten dicht in Arrays gepackt vorliegen; nicht übereinanderwachsen; selten mehr als einen Nukleus aufweisen; und wenig (Zell-)Trümmer im Kulturmedium erzeugen. Auf der anderen Seite zeigen alte Fibroblastenzellen viele altersbedingte Symptome, wie etwa eine abgeplattete und unregelmäßige Morphologie, eine anormal große Größe, spärliches Wachstum, eine geringe Zellausbeute pro Flächeneinheit des Kultursubstrats, eine signifikante Häufigkeit von Zellen mit mehreren Zellkernen, Schwierigkeiten bei der Trypsinisierung und eine hohe Produktionsrate von Trümmern im Kulturmedium. Die morphologischen Eigenschaften, welche junge Zellen von alten Zellen unterscheiden, sowie der hohe Grad an Autofluoreszenz, den man in alten Zellen beobachtet, spiegeln verschiedene physiologische und biochemische Charakteristika wider, welche junge Zellen von gealterten Zellen unterscheiden, einschließlich einer hohen Ansprechempfindlichkeit auf Wachstumsfaktoren und höhere Syntheseraten von DNA und Protein in jungen Zellen.
Die morphologischen, physiologischen und biochemischen Charakteristika zur Unterscheidung zwischen jungen und alten Zellen wurden größtenteils durch Studien von Säugerzellen, einschließlich humanen Zellen (im allgemeinen Fibroblasten) in Kultur identifiziert. In diesen Studien wird das "Alter" von Zellen in einer Kultur nach der Anzahl von Verdoppelungen der Zellanzahl gemessen, die eine Primärkultur (aus Gewebe hergestellt) bis hin zur fraglichen Kultur, die von der Primärkultur abgeleitet wurde oder von ihr abstammt, durchlaufen hat.
Diese durch Untersuchungen von Zellen in Kultur gefundenen Charakteristika zur Unterscheidung von jungen und alten Zellen sind jedoch auch für in vivo-Zellen in lebenden Säugern relevant, welche mit den kultivierten Fibroblasten viele Eigenschaften gemeinsam haben, wie etwa ähnliche biochemische Eigenschaften und eine strenge Wachstumskontrolle (d. h. eine strenge proliferative Kontrolle). Fibroblasten der Dermalschicht (d. h. der Dermis) der Haut und der Bindegewebsschicht, welche unter den Epithelien der inneren Wand des Gastrointestinaltraktes liegt, sind Beispiele von Zellen, welche ähnliche Eigenschaften aufweisen wie diejenigen für Fibroblasten in Kultur.
Ein Maß für das "Alter" solcher Fibroblasten in Geweben eines lebenden Säugetiers, welche sich normalerweise unter strenger Wachstumskontrolle in Abständen teilen, ist die Anzahl von Zellteilungen, welche zwischen den Zellen und ihren Vorgängern ausgehend von ungefähr dem Zeitpunkt der Geburt des Säugetiers erfolgt sind. Da die Zellteilung periodisch auftritt, besteht normalerweise eine Korrelation zwischen dem chronologischen Alter des Säugetiers und dem Alter von bestimmten Zellen, gemessen nach Zellteilungen zwischen den Zellen und ihren Vorgängern am Geburtszeitpunkt.
Ein weiteres Merkmal von Fibroblasten in Kultur ist die "Gesamtproliferationskapazität" der Zellen. Diese wird nach der Gesamtanzahl von Verdoppelungen der Zellanzahl gemessen, die eine Kultur durchlaufen kann, bevor das Wachstum der Kultur aufgrund von Tod (Stop von Wachstum und Zellteilung) der "gealterten" Zellen darin aufhört. Bei humanen Fibroblastenkulturen beträgt diese Gesamtproliferationskapazität typischerweise ungefähr 45 bis 60 Verdoppelungen für eine Primärkultur. Im Stand der Technik geht man davon aus, dass der Stop des Kulturwachstums sehr schnell auftritt, wobei die Wachstumsrate (gemessen als reziproker Wert der Verdoppelungszeit) von annähernd normalen Werten, die für junge Zellen charakteristisch sind, in nur wenigen Verdoppelungen auf null absinkt. In Kulturen normaler Fibroblasten, d. h. in denen die Zellen nicht zu einem immortalisierten oder "krebsartigen" Zustand transformiert wurden, nimmt die "Gesamtproliferationskapazität" als Funktion der Anzahl der Verdoppelungen ab, welche eine Kultur von der Primärkultur, von welcher sie abstammt, trennt. Andere mit der "Gesamtproliferationskapazität" von normalen Zellen in Kultur verwandte Ausdrücke sind die "Lebenserwartung" und "normale Lebenszeit" der Zellen. Die "Lebenserwartung" oder "normale Lebenszeit" von normalen Zellen ist die "Gesamtproliferationskapazität" der Primärkultur, von welcher die Kultur, in der die Zellen auftreten, abstammt.
Die Tatsache, dass normale Fibroblasten, insbesondere solche humanen Ursprungs, eine eng definierte (mit wenigen Verdoppelungen) Gesamtproliferationskapazität in Kultur aufweisen, ist ein Ausdruck der strengen Proliferationskontrolle, der solche Zellen unterliegen. Manchmal können Zellen, welche normalerweise eine beschränkte Gesamtproliferationskapazität haben, transformiert werden, so dass sie diese Beschränkung verlieren. Kulturen solcher Zellen können manchmal wiederholt ohne eine offensichtliche Beschränkung der Anzahl von Passagen kultiviert werden. Solche Zellen werden als immortalisiert bezeichnet.
Die Immortalisierung ist ein Merkmal von Krebszellen. Krebszellen stehen unter wenig oder keiner proliferativen Kontrolle.
Eine Messung der Gesamtproliferationskapazität ist für Zellen in vivo in lebenden Säugern, wie etwa Fibroblasten der Dermis der Haut oder der Bindegewebsschicht, welche sich unter dem intestinalen Epithel befindet, nicht einfach zu ermitteln, da Fibroblasten in Kultur bezogen auf eine feste Anzahl von Verdoppelungen auf einen engen Bereich beschränkt sind, welcher für die Spezies des Säugetiers charakteristisch ist (z. B. wie oben angegeben 45 bis 60 für menschliche Zellen; ungefähr 10 für Mäusezellen). Es ist jedoch klar, dass solche Zellen in lebenden Säugetieren, wenn diese Zellen normal sind, eine beschränkte Kapazität zur Zellteilung haben und sich unter strenger proliferativer Kontrolle befinden.
Zum Beispiel sind Fibroblasten in Primärkulturen, die aus normalen Zellen der humanen Erwachsenendermis erstellt wurden, dafür bekannt, eine geringere Gesamtproliferationskapazität zu haben als Fibroblasten in Primärkulturen, die aus normalen Zellen aus einer menschlichen fötalen oder Neugeborenendermis erstellt wurden. In der Tat ist es aus Studien mit großen Zahlen von menschlichen Spendern offensichtlich, dass Fibroblasten in Primärkulturen, die aus normalen Dermalschichtzellen hergestellt wurden, Gesamtproliferationskapazitäten in Kultur aufweisen, welche zu dem Alter des Spenders in umgekehrtem Verhältnis stehen.
Der Verlust der begrenzten Gesamtproliferationskapazität, der für Zellen in Kultur charakteristisch ist, die zu einem immortalisierten oder "Krebszustand" transformiert wurden, wird oft von einer anormal erhöhten Profilerationsrate begleitet, die hier als "Wachstumsrate" bezeichnet wird. Die Proliferationsrate oder Wachstumsrate ist ein Maß für die Geschwindigkeit, mit welcher sich die Zellen teilen.
In ähnlicher Weise wird der Verlust der strengen proliferativen Kontrolle, der ein Charakteristikum von Krebszellen in vivo ist, oft von einer anormal erhöhten Wachstumsrate der Zellen begleitet.
In früheren Versuchen, den "jungen" Phänotyp von alternden Zellen in vivo zu erhalten, wurden unweigerlich die Wachstumsraten der Zellen erhöht. Man fand jedoch, dass eine Erhöhung der Wachstumsrate der Zellen, die notwendigerweise die Geschwindigkeit der Zellteilung erhöht, das Risiko erhöht, dass die Zellen zu einem immortalisierten oder Krebszustand transformiert werden.
In ähnlicher Weise stellte sich heraus, dass Behandlungen, welche die Gesamtproliferationskapazität von Zellen in Kultur über das normale Limit künstlich erhöhen, das Risiko einer Transformation zu einem immortalisierten oder Krebszustand erhöhen.
Das Risiko, eine Transformation hervorzurufen, wenn die strenge proliferative Kontrolle von Zellen beeinflußt wird, oder wenn die Wachstumsraten oder Beschränkungen der Gesamtproliferationskapazität oder beide beeinflußt werden, ist vermutlich auf die Auswirkungen zurückzuführen, die solche Beeinflussungen auf die Zellgenome oder die biochemischen Mechanismen für eine Kontrolle der Genexpression haben.
Des weiteren sind Behandlungen, welche zumindest bei Zellen in Kultur die Wachstumsrate oder die Gesamtproliferationskapazität erhöhen, wie z. B. epidermale und aus Plättchen stammende Wachstumsfaktoren (platelet-derived growth factors), Insulin, Glucocorticoide, Extrakte aus Panax Ginseng und Gibberellin-Pflanzenhormone im allgemeinen nur wirksam zur Konservierung des "jungen" Phänotyps von "jungen" Zellen, für welche solche Behandlungen am wenigsten benötigt werden. "Alte" Zellen, deren normale Lebenszeit zu mindestens ungefähr 80% bis 90% vorbei ist, sprechen auf eine Behandlung selbst mit hohen Konzentrationen dieser Substanzen (viel höher als die, welche bei "jungen" Zellen, deren Lebenszeit weniger oder ungefähr zur Hälfte vorbei ist, wirksam sind) wenig oder überhaupt nicht an.
Jedwede Zusammensetzung, welche zur Verringerung der nachteiligen Alterungseffekte auf Zellen eingesetzt werden soll, und welche die Wachstumsrate oder die Gesamtproliferationskapazität von Zellen in vivo oder in Kultur erhöht, muß mit Vorsicht behandelt werden, zumindest in dem Maße, in dem die Zusammensetzung auf Gewebe (d. h. Haut, Darmwand) angewendet werden soll, welche Zellen enthalten, die normalerweise unter einer strengen proliferativen Kontrolle stehen.
Vor der vorliegenden Erfindung waren Zusammensetzungen zur Verringerung der negativen Alterungseffekte auf morphologische, physiologische und biochemische Eigenschaften von Zellen ohne eine potentiell schädliche Erhöhung der Zellwachstumsrate oder Gesamtproliferationskapazität nicht verfügbar.
Es ist wichtig für die vorliegende Erfindung, zu verstehen, welche Rolle Fibroblasten insbesondere in der Dermis der menschlichen Haut, aber auch in den entsprechenden Bindegewebsschichten, welche unter den Haut- oder Hüllschichten anderer Säugetiere und unter den Epithelien der inneren Wand des Gastrointestinaltraktes von Menschen und anderen Tieren liegen, spielen. Die Fibroblasten synthetisieren eine Anzahl von Komponenten, die für die Erhaltung der strukturellen, funktionellen und kosmetischen Unversehrtheit der Haut und für die strukturelle und funktionelle Intaktheit dieser anderen von Epithel bedeckten Oberflächengewebe, erforderlich sind. Diese Komponenten umfassen Collagen und Elastin: faserartige Proteine, die für die dreidimensionale Architektur der Haut und anderer Oberflächengewebe verantwortlich sind; Fibronectin: ein Protein, welches für die Zellverankerung und Erhaltung der Zellmorphologie verantwortlich ist; und eine Anzahl von proteinhaltigen Wachstumsfaktoren, welche für die Erhaltung der Epithelien und Basalzellschichten und darunterliegenden Bindegewebsschichten essentiell sind. Wegen der wichtigen Rolle der Proteinsynthese durch Fibroblasten bei der Erhaltung der Gesundheit der Haut und anderer Oberflächengewebe und weil die erhältlichen Ergebnisse darauf hindeuten, dass die proteinbiosynthetische Aktivität von Fibroblasten signifikant mit dem Alter abnimmt (z. B. beträgt die Rate der Collagensynthese nach Ablauf einer Zeit, die ungefähr 70% der Lebenserwartung von humanen Fibroblasten in Kultur, die von fötalem Gewebe abstammen, entspricht, nur ungefähr 50% derjenigen von Fibroblasten nach Ablauf einer Zeit, die weniger als 20% ihrer Lebenserwartung entspricht); wären Verfahren und Zusammensetzungen zur Verringerung der nachteiligen Alterungseffekte auf die proteinbiosynthetische Aktivität von Fibroblasten in vivo, die die Gesamtproliferationskapazität oder Wachstumsrate solcher Fibroblasten nicht beeinflussen, besonders vorteilhaft.
Die vorliegende Erfindung umfaßt 6-(aminosubstituierte) Purincytokinine, welche Kinetin und 6-Aminopurin-Analoga davon umfassen, gemäß der Formel I:
worin R₁ Furfuryl, Phenyl, Benzyl, n-Alkyl mit 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, (Cyclohexyl)methyl, 3,3-Dimethylallyl oder 3-Hydroxymethyl-3-methylallyl ist.
Die Cytokinine sind eine Klasse von Pflanzenhormonen, die durch ihre Fähigkeit zur Förderung der Zellteilung in Pflanzengewebeexplantaten in Standardmedien, die Auxine (eine weitere Klasse von Pflanzenhormonen) sowie Vitamine, Mineralsalze und Zucker enthalten, definiert werden.
Ribonukleotide, in denen ein Cytokinin, insbesondere Kinetin (6-Furfuryl-aminopurin), Zeatin (6-(3-Hydroxymethyl-3-methylallyl)-aminopurin) oder 6-(3,3-Dimethylallyl)-aminopurin die Basengruppe ist, wurden als Komponenten einiger Transfer-RNAs in bestimmten Pflanzen- und Tierzellen identifiziert.
Kinetin ist dafür bekannt, mit bestimmten RNA-Bindeproteinen aus Weizenembryonenextrakten Komplexe zu bilden, und es wurde vermutet, dass es die Proteinsynthese in Pflanzen fördert. Spirin und Ajtkhozhin, Trends in Biochem. Sci., April 1985, Seite 162.
Des weiteren wurde Kinetin zur Herstellung von proteinreicher Hefe eingesetzt, unter Verwendung von herkömmlichen Kulturverfahren, worin Kinetin zum Kulturmedium hinzugegeben wird. DDR-Patent Nr. 148,889 (1981) (Derwent Welt-Patentindex-Zusammenfassung). Es wurde auch berichtet, dass Kinetin das Wachstum von mikrobiellen Kulturen erhöht. Merck Index, 10. Auflage, Eintrag 5148 (Merck und Co., Rahway, New Jersey, U.S.A., 1983).
Schließlich offenbart das japanische Patent Nr. 60019709 (1985) eine Zusammensetzung, welche nicht mehr als 1% Kinetin und nicht mehr als 20% eines nicht charakterisierten Lithospermumwurzelextrakts enthält, welche angeblich die Zellteilung in menschlicher Haut beschleunigt und dadurch Hautalterung verhindert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde nun überraschenderweise entdeckt, dass die Behandlung von Säugerzellen mit verschiedenen 6-(aminosubstituierten) Purincytokininen die negativen Wirkungen der Alterung auf solche Zellen verringert, indem sie den Beginn der altersbedingten morphologischen Veränderungen, die normalerweise bei der Zellalterung auftreten, verzögern oder sogar umkehren, und dass eine solche Behandlung diese vorteilhafte Wirkung hat, ohne die Wachstumsrate oder Gesamtproliferationskapazität der Zellen zu erhöhen.
Auf der Grundlage dieser Entdeckung werden neue Zusammensetzungen und Verfahren zur Verringerung, einschließlich der Umkehrung, der negativen Alterungseffekte auf Säugerzellen, einschließlich Zellen in Kultur und in vivo, wie etwa in der menschlichen Haut, bereitgestellt.
Somit sind die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung neben anderen Anwendungen nützlich zur Verlangsamung und Umkehrung der Degeneration der strukturellen, funktionellen und kosmetischen Unversehrtheit der menschlichen Haut, welche normalerweise die Alterung begleitet.
Wie oben bereits erwähnt, erhöhen alle bis jetzt erhältlichen Zusammensetzungen zur Verringerung der nachteiligen Alterungseffekte auf die biochemischen, physiologischen und morphologischen Charakteristika von Säugerzellen ebenfalls unerwünschterweise die Wachstumsrate oder Gesamtproliferationskapazität der Zellen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verringerung der nachteiligen Alterungseffekte auf Säugerzellen, wobei das Verfahren die Verabreichung an solche Zellen einer Zusammensetzung, umfassend ein Cytokinin, welches ein 6-(aminosubstituiertes) Purin ist, in einer Konzentration, welche zur Verringerung der negativen Effekte auf solche Zellen wirksam ist, umfaßt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Verringerung der nachteiligen Alterungseffekte auf Säugerzellen, wobei die Zusammensetzung ein Cytokinin, welches ein 6-(aminosubstituiertes) Purin ist, in einer zur Verringerung der nachteiligen Effekte auf solche Zellen wirksamen Konzentration umfaßt.
Unter den 6-(aminosubstituierten) Purincytokininen, welche als zur Verringerung der nachteiligen Alterungseffekte wirksame Verbindung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung eingesetzt werden können, sind Kinetin, Zeatin, 6-13,3-Dimethylallyl)aminopurin, 6-(Benzyl)aminopurin, 6-(Phenyl)aminopurin, 6-(n-Alkyl)aminopurin, worin die n-Alkylgruppe 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatome aufweist, und 6-(Cyclohexyl)methylaminopurin. Am meisten bevorzugt ist Kinetin (6-(furfuryl)aminopurin).
Säugerzellen, welche mit den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung behandelt werden können, umfassen humane Zellen, und Zellen in Kultur sowie Zellen in vivo in lebenden Säugetieren.
Die Zellen in Kultur können aus jedwedem Gewebe gewonnen werden und, falls sie in vivo vorliegen, Teil jedweden Gewebes sein. Die Verfahren und Zusammensetzungen werden bevorzugt an Fibroblasten in Geweben in vivo in Menschen, wie etwa Fibroblasten der Dermis der menschlichen Haut oder der unter dem Epithel der inneren Wand des menschlichen Dünndarms oder Magens liegenden Bindegewebsschicht angewandt. Die bevorzugte Anwendung betrifft Zellen der menschlichen Haut.
Somit umfaßt die vorliegende Erfindung weiterhin Verfahren und Zusammensetzungen zur Durchführung der Verfahren zur Verlangsamung (oder Umkehrung) der Degeneration der strukturellen und funktionellen Intaktheit der Haut und Epithelien der inneren Wand des Gastrointestinaltraktes und der kosmetischen Unversehrtheit der Haut, welche normalerweise die Alterung begleitet.
Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung sind bei überraschend und vorteilhaft geringen Konzentrationen des 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins wirksam. Die Konzentrationen betragen typischerweise zwischen 10^–6 M und 5 × 10^–4 M in einem Gewebekulturmedium. Bei diesen Konzentrationen hat das Cytokinin keine merklichen toxischen Effekte auf Säugerzellen.
Überraschenderweise beeinflussen die Verfahren der Erfindung weder die Wachstumsrate noch die Gesamtproliferationskapazität der gemäß den Verfahren der Erfindung behandelten Zellen in ausschlaggebender Weise. Dies ist besonders vorteilhaft. Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung beeinflussen weder die Geschwindigkeit noch die Höhe der DNA-Synthese in behandelten Zellen. Im Gegensatz zu anderen Zusammensetzungen zur Erhaltung oder Wiederherstellung des "jungen" Phänotyps von alternden Zellen beeinflussen die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht die strenge proliferative Kontrolle, der viele Zellen in vivo, wie etwa Fibroblasten und bestimmte Zellen der Epidermis und anderer Epithelien unterliegen, um normal zu funktionieren.
Eine "Verringerung der nachteiligen Alterungseffekte" auf Säugerzellen bedeutet, dass die Entwicklung der oben beschriebenen morphologischen Veränderungen, die normalerweise mit der "Alterung" in normalen Säugerzellen in Kultur oder in vivo auftreten, verlangsamt oder umgekehrt wird.
Der Fachmann kann feststellen, ob eine Zusammensetzung, der Säugerzellen ausgesetzt werden, um das Verfahren der Erfindung durchzuführen, eine Menge eines 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins umfaßt, welche zur Verringerung der nachteiligen Alterungseffekte auf Zellen wirksam ist. Mit der Alterung assoziierte morphologische Veränderungen können durch mikroskopische Untersuchung der Zellen, die einer Kultur entnommen oder durch Biopsie aus Gewebe entnommen wurden o. dgl. vom Fachmann leicht erkannt werden.
Im Fall von Säugerzellen in Kultur, welche direkt aus dem Gewebe und ohne genetische Manipulationen kultiviert werden können oder welche gemäß verschiedenen bekannten genetischen Manipulationstechniken genetisch modifiziert werden können, um ein erwünschtes Produkt zu ergeben, und welche wie im Stand der Technik bekannt verwendet werden können, um wertvolle Proteine herzustellen, wie etwa Lymphokine oder Hormone, die für diagnostische, therapeutische oder weitere Anwendungen geeignet sind, erhält die Verringerung der nachteiligen Alterungseffekte mit Hilfe der Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auf vorteilhafte Weise die Zellen "jünger" als die Zellen tatsächlich sind. In der Tat kehrt eine Zugabe einer wirksamen Menge eines 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins zu einem Kulturmedium mit Säugerzellen, die viele Passagen durchlaufen haben und deren morphologische Eigenschaften charakteristisch für alternde Zellen sind, die morphologischen Eigenschaften in solche von jüngeren Zellen um.
Die durch die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Vorteile zur Erhaltung und, im Fall der Umkehrung der nachteiligen Alterungseffekte, Verbesserung der funktionellen Unversehrtheit von Säugerzellen in vivo, wie etwa Fibroblasten der Dermis der Haut oder der unter den Epithelien der inneren Wand des Gastrointestinaltraktes von Menschen liegenden Bindegewebsschicht, und insbesondere zur Erhaltung der kosmetischen Unversehrtheit der menschlichen Haut sind offensichtlich und wurden oben bereits erwähnt.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in einer Reihe von Formen vorliegen, je nach der Natur und der Umgebung der Zellen, an denen die negativen Alterungseffekte verringernde Mengen eines 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins gemäß der Erfindung angewandt werden sollen.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung für Zellen in Kultur, entweder im Bad oder suspendiert in einem Kulturmedium, ist jedes für Säugerzellen verwendete Kulturmedium, welches mit zwischen ungefähr 10^–6 M (d. h. 1 μM) und ungefähr 5 × 10⁴ M eines 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins ergänzt wurde. Für die bevorzugten Cytokinine der Formel I
worin R₁ Furfuryl, Phenyl, Benzyl, n-Alkyl mit 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, (Cyclohexyl)methyl(-CH₂(C₆H₁₁)),
3,3-Dimethylallyl(-CH₂CH=C(CH₃)₂) ist, beträgt der Konzentrationsbereich im Kulturmedium zwischen 0,2 und 100 ppm (parts per million). Für das am meisten bevorzugte Cytokinin, Kinetin, beträgt der Konzentrationsbereich ungefähr 25 μM bis ungefähr 250 μM (d. h. ungefähr 5 ppm bis ungefähr 50 ppm) im Medium.
Im Fall von Zellen in Kultur wird das erfindungsgemäße Verfahren der Verabreichung an die Zellen einer die nachteiligen Alterungseffekte verringernden Menge eines 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins durchgeführt, in dem die Zellen in einem Kulturmedium, welches eine erfindungsgemäße Zusammensetzung ist, einfach gebadet oder kultiviert werden.
Das Verfahren der Erfindung wird mit Zellen in vivo in Säugetieren, bevorzugt mit Fibroblasten (oder anderen aktiven Zellen, z. B. Keratinocyten) auf der Dermis der menschlichen Haut oder der unter dem Epithelium der inneren Wand des menschlichen Gastrointestinaltraktes liegenden Bindegewebsschicht durchgeführt, in dem solche Zellen mit einer den nachteiligen Alterungseffekt verringernden Menge eines 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins behandelt werden.
Im allgemeinen wird eine solche Behandlung über eine Zeit, während der es erwünscht ist, die nachteiligen Alterungseffekte auf die Zellen gemäß der Erfindung zu verringern, periodisch wiederholt. Die Häufigkeit der Behandlung hängt von den betroffenen Zellen ab, davon, wo im Säuger sich die Zellen befinden (z. B. erfordern Zellen im Gastrointestinaltrakt, wo das wiederholte Durchspülen mit Zusammensetzungen, die frei von 6-(aminosubstituierten) Purincytokininen sind, erfolgt, eine häufigere Behandlung als Zellen der Haut), und von der Konzentration des 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins in einem Konzentrationsbereich, typischerweise zwischen ungefähr 10 ppm und ungefähr 1000 ppm), die wirksam ist, um durch die Bindegewebsschicht (die unter dem Epithelium der inneren Wand des Gastrointestinaltraktes liegt), mit einer Konzentration, die zur Verringerung der nachteiligen Alterungseffekte auf aktive Zellen, wie etwa Fibroblasten in der Bindegewebsschicht, wirksam ist, zu dringen.
Für die unter dem Epithel der inneren Wand des Gastrointestinaltraktes liegende Bindegewebsschicht wird das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt, indem die erfindungsgemäße Zusammensetzung, welche eine Lösung, Suspension oder Tonikum ist, das für eine orale Aufnahme physiologisch annehmbar ist und welche ein 6-(aminosubstituiertes) Purincytokinin in einem Konzentrationsbereich von typischerweise zwischen ungefähr 10 ppm und ungefähr 1000 ppm umfaßt, und wobei die Zusammensetzung wirksam ist, um die unter dem Epithel der inneren Wand des Gastrointestinaltraktes liegende Bindegewebsschicht zu durchdringen, um die nachteiligen Alterungseffekte auf aktive Zellen, wie etwa Fibroblasten, in der Bindegewebsschicht zu verringern, eingenommen wird.
Für Fibroblasten (oder andere aktive Zellen, wie etwa Keratinocyten) der menschlichen Haut wird das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt, indem auf die äußere Oberfläche der Haut eine erfindungsgemäße Zusammensetzung aufgebracht wird, welche eine Creme, Salbe, Lotion, Gel, Lösung, Parfüm, Feststoff o. dgl., in zum Auftragen auf die äußere Oberfläche der Haut physiologisch annehmbarer Form ist, und welche ein 6-(aminosubstituiertes) Purincytokinin in einem geeigneten Träger in einer wirksamen Konzentration umfaßt, d. h. einer Konzentration, die zur Permeation der Dermis der Haut bei einer Konzentration zur wirksamen Verringerung der nachteiligen Alterungseffekte auf aktive Zellen (z. B. Fibroblasten) in der Dermis wirksam ist.
Zusammensetzungen der Erfindung zur Anwendung auf der menschlichen Haut werden mit einem 6-(aminosubstituierten) Purincytokinin formuliert, bevorzugt mit einem der genannten der oben definierten Formel I, in einem wirksamen Konzentrationsbereich, im allgemeinen zwischen ungefähr 0,5 ppm und ungefähr 500 ppm in einer Creme, Salbe, Lotion, Gel, Lösung oder festem Grundstoff oder Träger, die im Stand der Technik bekannt sind und nicht toxisch und dermatologisch annehmbar sind. Die Konzentration (oder der Gewichtsanteil) des 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins in gelöster, suspendierter, dispergierter oder ähnlich verarbeiteter Form in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Anwendung auf der menschlichen Haut ist derart, dass das 6-(aminosubstituierte) Purincytokinin zwischen ungefähr 0,2 ppm und ungefähr 100 ppm auf aktive Zellen der Haut, wie etwa Fibroblasten, abgegeben wird. Im allgemeinen sind geschmeidigmachende oder ölende Träger, die dazu beitragen, die Haut feucht zu halten, stärker bevorzugt als flüchtige Träger, wie etwa Ethanol, welche die Haut austrocknen.
Beispiele von geeigneten Grundstoffen oder Trägern zur Herstellung von Zusammensetzungen der Erfindung zur Anwendung auf der menschlichen Haut sind Petrolat, Petrolat plus flüchtige Silikone, Lanolin, Cold Cream (USP) und Hydrophile Salbe (USP). Eine bevorzugte Zusammensetzung der Erfindung weist zwischen ungefähr 10 ppm und 100 ppm Kinetin in Kombination mit einer geeigneten Salbe oder Cremebasis auf.
Die Auswahl eines geeigneten Trägers wird größtenteils durch die Art der Verabreichung des 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins bestimmt. Derartige Verfahren umfassen eine topische Verabreichung. Geeignete pharmazeutisch und dermatologisch annehmbare Träger zur topischen Anwendung umfassen solche, die zur Verwendung in Lotionen, Cremes, Lösungen, Gels, (Klebe band u. dgl. geeignet sind. Im allgemeinen ist der Träger entweder organisch oder eine wäßrige Emulsion und in der Lage, das 6-(aminosubstituierte) Purincytokinin darin dispergiert, suspendiert oder gelöst zu enthalten. Der Träger kann pharmazeutisch annehmbare Weichmacher, Hautdurchdringungsverstärker, Farbstoffe, Duftstoffe, Emulgiermittel, Verdickungsmittel und Lösungsmittel enthalten. Eine detailliertere Beschreibung solcher Formen ist wie folgt:
1. Lotionen
Die Lotionen können eine wirksame Menge eines 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins (beispielsweise eine zur Abgabe des 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins zwischen ungefähr 0,2 ppm und ungefähr 100 ppm auf aktive Zellen der Haut, wie etwa Fibroblasten wirksame Menge); von 1 % bis 50%, bevorzugt von 3% bis 15% eines Weichmachers; enthalten, wobei das Gleichgewicht durch Wasser, einen C₂- oder C₃-Alkohol oder ein Gemisch von Wasser und dem Alkohol hergestellt wird. Verschiedene Weichmacher sind bekannt. Beispiele solcher Weichmacher sind wie folgt:

a. Kohlenwasserstofföle und -wachse. Beispiele sind Mineralöl, Petrolat, Paraffin, Ceresin, Ozokerit, mikrokristallines Wachs, Polyethylen und Perhydrosqualen.
b. Silikonöle, wie etwa Dimethylpolysiloxane, Methylphenylpolysiloxane, wasserlösliche und alkohollösliche Silikonglycolcopolymere.
c. Triglyceridfette und -öle, wie etwa solche die aus pflanzlichen, tierischen und marinen Quellen stammen. Beispiele umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Ricinusöl, Safloröl, Baumwollsamenöl, Maisöl, Olivenöl, Lebertran, Mandelöl, Avocadoöl, Palmöl, Sesamöl und Sojabohnenöl.
d. Acetoglyceridester, wie etwa acetylierte Monoglyceride.
e. Ethoxylierte Glyceride, wie etwa ethoxyliertes Glycerylmonostearat.
f. Alkylester von Fettsäuren mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen. Methyl-, Isopropyl- und Butylester von Fettsäuren sind geeignet. Beispiele umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Hexyllaurat, Isohexyllaurat, Isohexylpalmitat, Isopropylpalmitat, Isopropylmyristat, Decyloleat, Isodecyloleat, Hexadecylstearat, Decylstearat, Isopropylisostearat, Diisopropyladipat, Diisohexyladipat, Dihexyldecyladipat, Diisopropylsebacat, Lauryllactat, Myristyllactat und Cetyllactat.
g. Alkenylester von Fettsäuren mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen. Beispiele davon umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Oleylmyristat, Oleylstearat und Oleyloleat.
h. Fettsäuren mit 9 bis 22 Kohlenstoffatomen. Geeignete Beispiele umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Pelargon-, Laurin-, Myristin-, Palmitin-, Stearin-, Isosteari-, Hydroxystearin-, Öl-, Linol-, Ricinol-, Arachidon-, Behen- und Erucasäuren.
i. Fettalkohole mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen. Lauryl-, Myristyl-, Cetyl-, Hexadecyl-, Stearyl-, Isostearyl-, Hydroxystearyl-, Oleyl-, Ricinoleyl-, Behenyl-, Erucyl- und 2-Octyldodecylalkohole sind Beispiele von geeigneten Fettalkoholen.
j. Fettalkoholether. Ethoxylierte Fettalkohole mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) die Lauryl-, Cetyl-, Stearyl-, Isostearyl-, Oleyl- und Cholesterinalkohole, die daran gebunden von 1 bis 50 Ethylenoxidgruppen oder 1 bis 50 Propylenoxidgruppen oder ein Gemisch davon aufweisen.
k. Ether-Ester, wie etwa Fettsäureester von ethoxylierten Fettalkoholen.
l. Lanolin und Derivate. Lanolin, Lanolinöl, Lanolinwachs, Lanolinalkohole, Lanolinfettsäuren, Isopropyllanolat, ethoxyliertes Lanolin, ethoxylierte Lanolinalkohole, ethoxyliertes Cholesterin, propoxylierte Lanolinalkohole, acetyliertes Lanolin, acetylierte Lanolinalkohole, Linoleatlanolinalkohole, Ricinoleatlanolinalkohole, Acetat von Ricinoleatlanolinalkoholen, Acetat von ethoxylierten Alkoholestern, Hydrogenolyse von Lanolin, ethoxyliertes hydriertes Lanolin, ethoxyliertes Sorbitollanolin und flüssige und halbfeste Lanolinabsorptionsbasen sind beispielhaft für von Lanolin abstammende Weichmacher.
m. Mehrwertige Alkohole und Polyetherderivate. Propylenglycol, Dipropylenglycol, Polypropylenglycol (Molekulargewicht 2000 bis 4000), Polyoxyethylenpolyoxypropylenglycole, Polyoxypropylenpolyoxyethylenglycole, Glycerin, ethoxyliertes Glycerin, propoxyliertes Glycerin, Sorbitol, ethoxyliertes Sorbitol, Hydroxypropylsorbitol, Polyethylenglycol (Molekulargewicht 200 bis 6000), Methoxypropylenglycole 350, 550, 750, 2000, 5000, Poly[ethylenoxid]homopolymere (Molekulargewicht 100.000 bis 5.000.0001, Polyalkylenglycole und Derivate, Hexylenglycol (2-Methyl-2,4-pentandiol), 1,3-Butylenglycol, 1,2,6-Hexantriol, Ethohexadiol USP (2-Ethyl-1,3-hexandiol), C₁₅-C₁₈-Vicinalglycol und Polyoxypropylenderivate von Trimethylolpropan sind Beispiele davon.
n. Mehrwertige Alkoholester. Ethylenglycolmono- und -difettsäureester, Diethylenglycolmono- und -difettsäureester, Polyethylenglycol (Molekulargewicht 200 bis 6000), Mono- und Difettsäureester, Propylenglycolmono- und -difettsäureester, Propylenglycol 2000 Monooleat, Polypropylenglycol 2000 Monostearat, ethoxyliertes Propylenglycolmonostearat, Glycerylmono- und difettsäureester, Polyglycerolpolyfettsäureester, ethoxyliertes Glycerylmonostearat, 1,3-Butylenglycolmonostearat, 1,3-Butylenglycoldistearat, Polyoxyethylenpolyol-ettsäureester, Sorbitanfettsäureester und Polyoxyethylensorbitanfettsäureester sind geeignete mehrwertige Alkoholester.
o. Wachsester, wie etwa Bienenwachs, Spermazet, Myristylmyristat und Stearylstearat.
p. Bienenwachsderivate, z. B. Polyoxyethylensorbitolbienenwachs. Diese sind Reaktionsprodukte von Bienenwachs mit ethoxyliertem Sorbitol mit unterschiedlichem Ethylenoxidgehalt, wobei ein Gemisch von Ether-Estern gebildet wird.
q. Pflanzliche Wachse, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) Carnauba- und Candelillawachse.
r. Phospholipide, wie etwa Lecithin und Derivate.
s. Styrole. Cholesterin und Cholesterinfettsäureester sind Beispiele davon.
t. Amide, wie etwa Fettsäureamide, ethoxylierte Fettsäureamide und feste Fettsäurealkanolamide.

Die Lotionen umfassen weiterhin von 1% bis 10%, stärker bevorzugt von 2% bis 5% eines Emulgiermittels. Das Emulgiermittel kann nicht-ionisch, anionisch oder kationisch sein. Beispiele von geeigneten nicht-ionischen Emulgatoren umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Fettalkohole mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen, mit 2 bis 20 Mol Ethylenoxid oder Propylenoxid kondensierte Fettalkohole mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen, mit 2 bis 20 Mol Ethylenoxid kondensierte Alkylphenole mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, Mono- und Difettsäureester von Ethylenoxid, Mono- und Difettsäureester von Ethylenglycol, worin die Fettsäuregruppe 10 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, Diethylenglycol, Polyethylenglycole mit einem Molekulargewicht von 200 bis 6000, Propylenglycole mit einem Molekulargewicht von 200 bis 3000, Glycerin, Sorbitol, Sorbitan, Polyoxyethylensorbitol, Polyoxyethylensorbitan und hydrophile Wachsester. Geeignete anionische Emulgatoren umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) die Fettsäureseifen, z. B. Natrium-, Kalium- und Triethanolaminseifen, worin die Fettsäuregruppe von 10 bis 20 Kohlenstoffatome enthält. Weitere geeignete anionische Emulgatoren umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) die Alkalimetall-Ammonium- oder substituierten Ammoniumalkylsulfate, Alkylarylsulfonate, und Alkylethoxyethersulfonate mit 10 bis 30 Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe. Die Alkylethoxyethersulfonate enthalten von 1 bis 50 Ethylenoxideinheiten. Unter den geeigneten kationischen Emulgatoren sind quarternäre Ammonium-, Morpholinium- und Pyridiniumverbindungen. Einige der in den obigen Abschnitten beschriebenen Weichmacher haben auch emulgierende Eigenschaften. Wenn eine Lotion mit einem solchen Weichmacher formuliert wird, ist ein zusätzlicher Emulgator nicht notwendig, obwohl er in die Zusammensetzung mitaufgenommen werden kann.
Das Gleichgewicht der Lotion wird durch Wasser oder einen C₂- oder C₃-Alkohol oder ein Gemisch von Wasser und dem Alkohol hergestellt. Die Lotionen werden formuliert, indem einfach alle Komponenten zusammengemischt werden. Bevorzugt wird das 6-(aminosubstituierte) Purincytokinin im Gemisch gelöst.
Herkömmliche optionale Komponenten können mitverwendet werden. Ein solcher Zusatzstoff ist ein Verdickungsmittel in einer Menge von 1 % bis 10% der Zusammensetzung. Beispiele von geeigneten Verdickungsmitteln umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf): quervernetzte Carboxypolymethylenpolymere, Ethylcellulose, Polyethylenglycole, Tragant, Kharaya, Xanthanlösungen und Bentonit, Hydroxyethylcellulose und Hydroxypropylcellulose.
2. Cremes
Die Cremes umfassen eine wirksame Menge eines 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins (beispielsweise eine zur Abgabe des 6-laminosubstituierten) Purincytokinins von zwischen ungefähr 0,2 ppm und ungefähr 100 ppm an aktive Zellen der Haut, wie etwa Fibroblasten wirksame Menge); von 5% bis 50%, bevorzugt von 10% bis 25% eines Weichmachers, wobei das Gleichgewicht durch Wasser hergestellt wird. Die oben beschriebenen Weichmacher können auch für die Cremezusammensetzungen verwendet werden. Gegebenenfalls enthält die Cremeform geeignete Emulgatoren, wie zuvor beschrieben. Wenn ein Emulgator verwendet wird, ist er in der Zusammensetzung in einer Menge von 3% bis 50%, bevorzugt von 5% bis 20% vorhanden.
3. Lösungen
Die Lösungsform umfaßt eine wirksame Menge eines 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins (z. B. eine zur Abgabe des 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins bei zwischen ungefähr 0,2 ppm und ungefähr 100 ppm an aktive Zellen der Haut, wie etwa Fibroblasten, wirksame Menge); wobei das Gleichgewicht durch Wasser hergestellt wird, ein geeignetes organisches Lösungsmittel oder eine Kombination von Wasser und einem solchen organischen Lösungsmittel. Geeignete organische Materialien, die als Lösungsmittel oder Teil eines Lösungsmittelsystems geeignet sind, sind wie folgt: Proyplenglycol, Polyethylenglycol (Molekulargewicht 200 bis 600), Polypropylenglycol (Molekulargewicht 425 bis 2025), Glycerin, Sorbitolester, 1,2,6-Hexantriol, Ethanol, Isopropanol, Diethyltartrat, Butandiol und Gemische davon. Ein solches Lösungsmittelsystem kann auch Wasser enthalten.
Diese Zusammensetzungen in Lösungsform können so wie sie sind auf die Haut aufgebracht werden, oder sie können zu einem Aerosol formuliert werden und als Spray auf die Haut aufgetragen werden. Die Aerosolzusammensetzungen umfassen weiterhin von 25% bis 80%, bevorzugt von 30% bis 50% eines geeigneten Treibmittels. Beispiele solcher Treibmittel sind die chlorierten, fluorierten und chlorfluorierten niederen Kohlenwasserstoffe. Distickstoffoxid, Kohlendioxid, Butan und Propan werden ebenfalls als Treibgase verwendet. Diese Treibmittel werden im Stand der Technik in einer geeigneten Menge und unter einem geeigneten Druck verwendet, so dass der Inhalt des Behälters ausgestoßen werden kann.
4. Gele
Gelzusammensetzungen können formuliert werden, indem einfach ein geeignetes Verdickungsmittel zu den zuvor beschriebenen Lösungszusammensetzungen zugegeben wird. Beispiele geeigneter Verdickungsmittel wurden bereits im Zusammenhang mit den Lotionen beschrieben.
Die Gelzusammensetzungen umfassen eine wirksame Menge eines 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins (beispielsweise eine zur Abgabe des 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins bei zwischen ungefähr 0,2 ppm und ungefähr 100 ppm auf aktive Zellen der Haut, wie etwa Fibroblasten, wirksame Menge), von 5% bis 75%, bevorzugt von 10% bis 50% eines organischen Lösungsmittels wie zuvor beschrieben; von 0,5% bis 20%, bevorzugt von 1 % bis 10% des Verdickungsmittels; wobei das Gleichgewicht durch Wasser hergestellt wird.
5. Feststoffe
Zusammensetzungen in fester Form finden Anwendung als stiftartige Zusammensetzungen, die für das Auftragen auf die Lippen oder andere Körperteile vorgesehen sind. Solche Zusammensetzungen umfassen eine wirksame Menge eines 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins (z. B. eine zur Abgabe des 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins bei zwischen ungefähr 0,2 ppm und ungefähr 100 ppm auf aktive Zellen der Haut, wie etwa Fibroblasten wirksame Menge), und von 50% bis 98%, bevorzugt von 60% bis 90% der zuvor beschriebenen Weichmacher. Diese Zusammensetzung kann weiterhin von 1 % bis 20%, bevorzugt von 5% bis 15% eines geeigneten Verdickungsmittel umfassen, und es können optional Emulgatoren und Wasser vorhanden sein. In den Zusammensetzungen in fester Form werden bevorzugt die zuvor im Zusammenhang mit den Lotionen beschriebenen Verdickungsmittel verwendet.
Ein Beispiel einer für die Anwendung auf menschliche Gesichtshaut geeignete Zusammensetzung der Erfindung wurde aus 10 ppm bis 100 ppm Kinetin in einem Grundstoff bestehen, der durch Mischen (nach Gewicht) von 10 Teilen Glycerinmonostearat, 10 Teilen Cetylalkohol, 30 Teilen Spermazet, 10 Teilen Tween 20 (Polyoxyalkylenderivat von Sorbitanmonostearat), 10 Teilen Span 20 (Sorbitanmonolaurat), 12,5 Teilen Glycerin und 100 Teilen Wasser hergestellt wird. Beispiele von die nachteiligen Alterungseffekte verringernden aktiven Bestandteilen, welche anstelle von Kinetin verwendet werden können, sind Zeatin, 6-(3,3-Dimethylallyl)aminopurin, 6-Benzylaminopurin oder eine Kombination von Kinetin und 6-(n-Hexyl)aminopurin oder 6-Benzylaminopurin.
Weitere Inhaltsstoffe, wie etwa Konservierungsstoffe (z. B. Methylparaben oder Ethylparaben), Duftstoffe, Farbstoffe o. dgl., welche im Stand der Technik vor Erzielung einer gewünschten Stabilität, Duftnote oder Farbe oder weiterer erwünschter Eigenschaften bekannt sind, wie etwa die Abschirmung vor aktinischen Strahlen der Sonne, können ebenfalls für die Zusammensetzung der Erfindung für eine topische Anwendung auf die Haut eingesetzt werden.
Eine Zusammensetzung der Erfindung kann ebenfalls die negativen Alterungseffekte verringernde Wirkstoffe außer 6-(aminosubstituiertes) Purincytokinin umfassen. Ein Vorteil der Verwendung von Cytokininen allein, nämlich dass die Wachstumsrate und Gesamtproliferationskapazität von behandelten Zellen nicht signifikant beeinflußt wird, wird jedoch in der Regel verdünnt, wenn andere solcher Inhaltsstoffe verwendet werden, welche die Wachstumsrate oder Gesamtproliferationskapazität oder beides der behandelten Zellen erhöhen. Demnach umfassen bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen als einzigen die negativen Alterungseffekte verringernden Wirkstoff ein 6-(aminosubstituiertes) Purincytokinin.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen zur Anwendung auf die menschliche Haut werden bevorzugt einmal pro Tag auf die Hautstellen aufgetragen, die mit dem Verfahren der Erfindung behandelt werden sollen.
Das Verfahren der Erfindung wird für die Haut einer Person angewandt, indem bevorzugt täglich eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, die für eine menschliche Hautbehandlung geeignet ist, wie zuvor erwähnt über einen unbestimmten Zeitraum, d. h. solange wie die Person die Verringerung der nachteiligen Alterungswirkungen auf die Haut, die durch die Zusammensetzung der Erfindung bereitgestellt werden, genießen möchte, aufgetragen wird. Eine tägliche Anwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung auf die Haut, ist für mindestens einen Monat und bis zu mindestens ungefähr 1 Jahr erforderlich, je nach Alter der Person, dem Zustand der Haut, auf welche die Zusammensetzung aufgebracht wird und der Konzentration (oder Gewichtsanteil) des 6-(aminosubstituierten) Purincytokinins in der Zusammensetzung, bevor die vorteilhaften Wirkungen der Verzögerung der Abnahme der Proteinsyntheserate und der Verzögerung von altersbedingten morphologischen Veränderungen in Fibroblasten der Basalzellschicht der Haut auf der Hautoberfläche offensichtlich werden. Wenn die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens beendet wird, werden die durch das Verfahren verringerten Alterungseffekte nach einiger Zeit wieder einsetzen.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
BEISPIEL I
WIRKUNG VON KINETIN AUF KURZZEITIGES ZELLWACHSTUM
Die Wirkungen von Kinetin auf kurzzeitiges Wachstum von normalen diploiden menschlichen Embryo-Hautfibroblasten, ein als KIS bezeichneter Stamm, wurden durch im Stand der Technik als "Einschritt-Wachstumskurve"-Experimente untersucht (one-step growth curve experiments). Zu diesem Zweck wurden gleiche Anzahlen von KIS-Zellen (10⁵) zu mehreren Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, Antibiotika und Glutamin, enthaltenden Kulturgefäßen hinzugegeben. Verschiedene Volumina von Stammlösungen von Kinetin, die in ausgewogener Salzlösung (Hank's Puffer) hergestellt wurden, wurden zu den Flaschen hinzuzugeben, um endgültige Konzentration von 40 μM, 80 μM und 200 μM Kinetin im Kulturmedium zu erreichen. Die Kulturen wurden dann bei 37°C in einer 5%-igen CO₂-Atmosphäre inkubiert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.
Um die Anheftungshäufigkeit von Zellen zu bestimmen, die mit verschiedenen Dosen Kinetin behandelt worden waren, wurde je ein Satz Kulturgefäße jeder Dosis verwendet, um die Anzahl von Zellen zu zählen, die sich an die Bodenoberfläche des Kulturgefäßes 6 Stunden nach dem Aussäen angeheftet hatten. Dies wurde durchgeführt, indem die Zellen zunächst durch Trypsinisierung entfernt wurden, in frischem Medium resuspendiert wurden und unter Verwendung eines Coulter-Zählers gezählt wurden.
Für die Schätzung der Wachstumsraten oder Proliferationsraten von Kinetinbehandelten und unbehandelten Zellen wurden alle 24 Stunden die Zellzahlen in jedem Satz wie oben bestimmt. Dies wurde fortgesetzt, bis alle Kulturen konfluent wurden und keine weitere Zunahme der Zellzahl erfolgte (im allgemeinen 8 bis 10 Tage). Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten.

1. Normale menschliche Zellen zeigen keine nachteiligen morphologischen Wirkungen der Behandlung mit verschiedenen Dosen von Kinetin, wie sich durch mikroskopische Untersuchung der Zellen unter einem Lichtmikroskop feststellen ließ.
2. Kinetin hatte keine sichtbaren toxischen Wirkungen auf menschliche Zellen, denn es gab keinen Unterschied in der Zellanheftung, Zelltrümmern im Medium und der Zellzahl pro Flächeneinheit des Kultursubstrats zwischen behandelten und unbehandelten Zellen.
3. Sowohl Kinetin-behandelte und unbehandelte humane Zellen zeigten dieselbe Wachstumsrate und wurden zur selben Zeit konfluent. Dies ist klares Beweismaterial dafür, dass Kinetin nicht die Wachstumsraten der Zellen in Kultur erhöht. Weitere Beweise zur Stützung des genannten wird in Beispiel II dargestellt.

BEISPIEL II
WIRKUNG VON KINETIN AUF DIE LANGZEITWACHSTUMSRATE UND GESAMTPROLIFERATIONSKAPAZITÄT
Mit Hilfe von im Stand der Technik als "Lebensdauerkurven"-Experimente ("longevity curve" experiments) wurden die Wirkungen von Kinetin auf die Langzeitwachstumsrate und Gesamtproliferationskapazität von KIS-Zellen untersucht. Zu diesem Zweck wurden mindestens 16 parallele Kulturen von KIS-Zellen in Gegenwart von 40 μM Kinetin im Medium neben einer gleichen Anzahl unbehandelter Kontrollkulturen kultiviert. Alle Experimente wurden bei dem Populationsverdoppelungsgrad (population doubling level, PDL) sechs begonnen, welcher, wie zuvor bestimmt ungefähr 12% der normalen Lebenserwartung (d. h. die Gesamtproliferationskapazität der Zellen beträgt ungefähr PDL = 50) in vitro darstellt.
Die Verfahren zur Zellkultur, Trypsinisierung und Zählung der Zellzahlen waren wie in Beispiel I beschrieben. Für Langzeitstudien wurden die Kultur jedoch jedesmal, wenn sie konfluent wurden, seriellen Passagen unterzogen. Diese seriellen Passagen der Kulturen wurden fortgeführt, bis alle Kulturen trotz einer wöchentlichen Wechslung des Kulturmediums für 5 bis 6 Wochen aufhörten, konfluent zu werden. Um die exakten Anzahlen von PDL, die von den kinetinbehandelten und unbehandelten Kulturen erzielt wurden, zu schätzen, wurden Zellen in mindestens vier konfluenten Kulturgefäßen aus 16 parallel laufenden Kulturen mit einem Splittingverhältnis bei jungen Zellen von 1 : 4 und von 1 : 2, wenn ihre Wachstumsrate sich aufgrund von Alterung verlangsamte, aufgeteilt. Die Anzahl von PDs, die eine Kultur zwischen dem Aussehen der Zellen und dem Konfluentwerden durchlaufen hatte, wurde bestimmt durch: log N/log 2, wobei N = die Anzahl von Zellen in einer konfluenten Kultur, geteilt durch die Anzahl von Zellen, die ursprünglich in das Gefäß ausgesät wurden. Schließlich wurde für jede Kultur der kumulative PDL am Ende ihrer in vitro-Lebensdauer errechnet.
Bezüglich des kumulativen PDLs gab es keinen Unterschied in der Lebensdauer zwischen mit und ohne ein kontinuierliches Vorhandensein von Kinetin im Kulturmedium wachsenden humanen Zellen. In dieser Serie von Experimenten erreichten beide Typen von Kulturen einen maximalen PDL im Bereich von 47 bis 49. Dies bedeutet, dass die Gesamtproliferationskapazität der Zellen durch das Vorhandensein von Kinetin im Kulturmedium nicht signifikant verändert wurde.
Bezüglich der chronologischen Zeit schienen die Kinetin-behandelten Zellen jedoch länger (217 Tage) als die Kontrollzellen (196 Tage) zu leben. Dies kommt daher, dass am Ende ihrer Lebenszeit (d. h. wenn keine Konfluenz mehr erreicht werden kann), die Kinetin-behandelten Zellen für mindestens zwei Wochen viel gesünder aussahen und keine signifikanten Anzahlen von toten Zellen ins Medium abgaben.
Bezüglich der Wachstumsraten waren die Kurven der Anzahlen von Populationsverdopplungen als Funktion der Zeit sowohl für Kinetin-behandelte und unbehandelte Zellen experimentell nicht voneinander zu unterscheiden. Somit waren die Wachstumsraten von Kinetin-behandelten und unbehandelten (Kontrollen) Kulturen nicht signifikant unterschiedlich. Kinetin veränderte die genetisch bestimmte inhärente Grenze der normalen Lebensdauer (d. h. die Gesamtproliferationskapazität) von humanen Zellen in Kultur nicht signifikant.
DNA-Synthese und Wachstumsrate
Cytokinine, einschließlich Kinetin, sind bekannt dafür, die Beendigung der letzten Stadien der Zellteilung in Pflanzen zu fördern, d. h. die Cytokinese. Dies legte nahe, dass Cytokinine möglicherweise in Säugerzellen die DNA-Synthese so beeinflussen, dass das Risiko solcher Zellen in Gegenwart von Cytokininen zu einem kanzerogenen Zustand transformiert werden, erhöht wird.
Es wurden daher unter Verwendung von Verfahren von Kernspurautoradiographie (nuclear track autoradiography) und ³N-Thymidinaufnahme in säurelöslichem Material Untersuchungen durchgeführt, um die Wirkungen von Kinetin auf die DNA-Synthese von humanen Zellen in Kultur zu beobachten.
Für die Autoradiographie wurden KIS-Zellen auf sterilisierten Glasobjektträgern entweder in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen an Kinetin (40 μM bis 200 μM) oder in seiner Abwesenheit kultiviert. Nach unterschiedlichen Behandlungszeiträumen wurde (³H)Thymidin (1 Mikrocurie/ml) entweder für eine kurze Zeit (2 Stunden), um die Anzahl von sich im Zellteilungszyklus befindenden Zellen zu dieser Zeit zu bestimmen, oder für eine längere Zeit (24 bis 48 Stunden), um die Anzahl von Zellen in der Kultur zu schätzen, welche in der Lage sind, in die S-Phase des Zellzyklus einzutreten, zu den Kulturen hinzugegeben. Nach Beendigung des Markierungszeitraums wurden die Zellen gemäß Standardverfahren für die Autoradiographie verarbeitet. Nach der Beendigung der Belichtungs-, Entwicklungs- und Färbeverfahren wurden in jedem Objektträger unter Verwendung eines Mikroskops mindestens 500 Zellen gezählt. So wurde der prozentuale Anteil von sich im Zellteilungszyklus befindlichen Zellen (welche radioaktives Thymidin aufgenommen und in ihre neusynthetisierte DNA eingebaut hatten, und welche autoradiographisch dunkle Kerne zeigten) und sich nicht im Zellteilungszyklus befindlichen Zellen bestimmt. Kinetin-behandelte und unbehandelte Zellen hatten nach 2 Stunden und längeren (24 bis 48 Stunden) Markierungszeiten experimentell nicht unterscheidbare Prozentanteile von im Zyklus und nicht im Zyklus befindlichen Zellen.
Ähnlich zeigten auch die Schätzungen der ³H-Thymidin-Aufnahme von Kinetinbehandelten und unbehandelten KIS-Zellen nach einer entweder 90-minütigen oder 72-stündigen Markierungszeit bezüglich der mit einem Scintillierungszähler gemessenen dpm von säureunlöslichem Material pro 10⁶ Zellen keine Stimulierung der DNA-Synthese durch Behandlung mit Kinetin.
Wie in Beispiel I angedeutet, hat eine große Zahl von vielen unabhängigen Experimenten gezeigt, dass Kinetin keine zusätzliche Proliferation von Zellen in humanen Zellkulturen induziert. Die Experimente dieses Beispiels zeigen, dass Kinetin nicht die DNA-Synthese stimuliert oder Zellen schneller in neue Zellzyklen drängt als Kontrollzellen in diese Zyklen eintreten. Somit verändert Kinetin nicht die zellulären Wachstumsraten von humanen Zellen.
BEISPIEL III
WIRKUNG VON KINETIN AUF DIE ZELLMORPHOLOGIE
Altersbedingte Veränderungen in der Morphologie von Zellen während serieller Passagen ist für Zellbiologen, die sich mit Alterungsuntersuchungen beschäftigen, ein wohlbekanntes Phänomen. Junge humane Fibroblasten in Kultur sind dünn, lang, spindelförmig und bei Annäherung an die Konfluenz eng in Arrays gepackt. Alte Zellen, die mehr als 90% ihrer Lebensdauer hinter sich haben, sind sehr groß, stark abgeplattet, unregelmäßig in ihrer Form, weisen viele Vacuolen auf und enthalten mehrere sogenannte "residual bodies" ("Restkörper"), welche eine intensive Autofluoreszenz nach Erregung mit ultravioletten Strahlen zeigen, wie man unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachten kann.
In Gegenwart von 40 μM Kinetin wachsende und ohne Kinetin wachsende KIS-Zellen wurden bei PDL = 44 morphologisch verglichen. Die Kinetin-behandelten Zellen hatten keine typische Morphologie von alten Zellen. Die Kinetin-behandelten Zellen waren nicht signifikant größer als junge (z. B. PDL = 14) Zellen, im Gegensatz zu unbehandelten Zellen. Die Kinetin-behandelten Zellen behielten ihr spindelförmiges Aussehen größtenteils bei; sie waren nicht unregelmäßig angeordnet; und sie enthielten nicht so viele Vacuolen und residual bodies im Vergleich mit Zellen ohne Kinetinbehandlung. Diese dramatische Erhaltung eines gewissermaßen jungen Aussehens, selbst während der letzten Lebensphasen, bedeutet einen signifikanten Nachweis der Fähigkeit von Kinetin, bei Konzentrationen im Bereich von 10^–6 M bis 10^–4 M den Beginn von altersbedingten Symptomen zu verzögern.
In einem weiteren Satz von Experimenten wurde gefunden, dass Zellen, die bereits alt geworden waren (z. B. PDL größer als 40) morphologisch zu einem sozusagen jüngeren Aussehen zurückkehren konnten, wenn Kinetin in verschiedenen Konzentrationen dem Kulturmedium zugegeben wurde. Das Ausmaß der Reversion hängt von dem Grad des vor der Behandlung mit Kinetin erreichten Alters ab, wobei junge Zellen stärker revertieren, und von der Konzentration von Kinetin, die dem Medium hinzugegeben wird und von der Länge der Zeit, über die Kinetin vorhanden ist. Beispielsweise begannen KIS-Zellen, deren Lebenszeit über 80% vorüber war (mehr als 40 PDL), nach 2 bis 3 Wochen mit 200 μM Kinetin im Kulturmedium wie Zellen mit PDL = 30 bis 35 auszusehen.
Die Geschwindigkeit des Wiedererlangens der "alten" Morphologie, nachdem Kinetin aus dem Medium wieder entfernt wird, bleibt ungewiß, aber es gibt Experimente, die darauf hindeuten, dass sie viel geringer ist als die Geschwindigkeit der Reversion zu einer jüngeren Morphologie, nachdem Kinetin ins Medium eingebracht wird.
Zellausbeute und -größe
Ein Parameter der Zellalterung in Kultur ist der Rückgang der Zellausbeute (d. h. der Anzahl von Zellen in einer konfluenten Schicht), wenn die Kulturen ein gewisses Alter erreichen. Dies beruht primär auf der Tatsache, dass die Zellen nach und nach beim Altern größer werden. Wenn also die Fläche des Kulturgefäßes dieselbe bleibt, nimmt die Anzahl von Zellen pro Gefäß ab, wenn die Zellen nach periodischen Passagen sich dem Ende ihrer Lebenszeit annähern. Ein Satz von KIS-Zellkulturen wurde ohne Kinetin im Medium in Abständen Passagen unterzogen. Ein weiterer Satz von KIS-Zellkulturen wurde auf die gleiche Art und Weise behandelt, außer dass im Medium 40 μM Kinetin vorhanden waren. Die Zellausbeute der unbehandelten Zellen blieb, bis PDL = 43 erreicht wurde bei ungefähr 1,5 × 10⁶ pro 25 cm² annähernd konstant, und nahm dann bei PDL = 48, wenn ein Wachstumsstopp eintrat, auf ungefähr 3,5 × 10⁵ pro 25 cm² ab. Die Zellausbeute der behandelten Zellen blieb bis PDL = 48 bei ungefähr 1,5 × 106 pro 25 cm² im wesentlichen konstant, und nahm dann bei PDL = 49, wenn das Wachstum stoppte auf ungefähr 7 × 10⁵ pro 25 cm² ab. Diese Erhaltung der für "junge" Zellen charakteristischen Zellausbeute selbst während der letzten Lebensphasen von mit Kinetin behandelten Zellen ist in Bezug auf die Verzögerung des Beginns einiger der Alterungssymptome in humanen Zellen durch eine Kinetinbehandlung hoch signifikant.

Claims

Verfahren zur Verringerung von nachteiligen Alterungseffekten auf Säugerzellen in Kultur, umfassend Inkontaktbringen von Säugerzellen mit einer Zusammensetzung, welche eine wirksame Konzentration eines 6-(aminosubstituierten)-Purin-Cytokinins enthält, worin: das 6-(aminosubstituierte)-Purin-Cytokinin die Formel I aufweist:
worin R₁ ausgewählt ist aus Furfuryl, Phenyl, Benzyl, n-Alkyl mit 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, (Cyclohexyl)methyl(-CH₂(C₆H₁₁), oder
wobei das Cytokinin die einzige wirksame Substanz ist, welche in einer ausreichenden Konzentration vorhanden ist, um die nachteiligen Alterungseffekte auf die Zellen zu verringern, wobei die Entwicklungsrate von Zellmerkmalen, welche mit Zellalterung assoziiert sind, umgekehrt oder verlangsamt wird; und die Wachstumsrate und Gesamtproliferationskapazität der Zellen nach dem Inkontaktbringen im wesentlichen dieselbe ist wie vor dem Inkontaktbringen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zellen Fibroblastenzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Zusammensetzung Kulturmedium ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Konzentration des 6-(aminosubstituierten)-Purin-Cytokinins zwischen 0,5 ppm und 500 ppm beträgt.
Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verbesserung der nachteiligen Wirkungen der Alterung auf normale diploide Säuger-Hautzellen, welche Zusammensetzung ein 6-(aminosubstituiertes)-Purin-Cytokinin in einem Konzentrationsbereich von zwischen 0,5 ppm und 500 ppm enthält, worin das 6-(aminosubstituiertes)-Purin-Cytokinin die Formel I aufweist:
worin R₁ ausgewählt ist aus Furfuryl, Phenyl, Benzyl, n-Alkyl mit 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, (Cyclohexyl)methyl(-CH₂(C₆H₁₁), oder
wobei der Konzentrationsbereich ausreichend ist, um die nachteiligen Alterungseffekte auf die Zellen zu verringern, wobei die Entwicklungsrate von Zellmerkmalen, die mit Zellalterung assoziiert sind, umgekehrt oder verlangsamt wird; und die Wachstumsrate und Gesamtproliferationskapazität der Zellen nach dem Inkontaktbringen im wesentlichen dieselbe ist wie vor dem Inkontaktbringen.
Verwendung nach Anspruch 5, worin die Zellen Hautfibroblasten sind.
Verwendung nach Anspruch 6, worin die Zusammensetzung als Lotion, Salbe, Creme, fester Stift oder Spray für die Anwendung auf die Oberfläche der Haut formuliert wird.
Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin R₁ der Formel I Furfuryl oder 3-Hydroxymethyl-3-methylallyl ist.
Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Konzentration des 6-(aminosubstituiertes)-Purin-Cytokinin zwischen 10 ppm und 100 ppm beträgt.
Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das 6-(aminosubstituierte)-Purin-Cytokinin Kinetin ist.
Zusammensetzung zur Verringerung von nachteiligen Alterungseffekten auf Säugerzellen, umfassend zwischen 0,5 ppm und 500 ppm eines 6- (aminosubstituierten)-Purin-Cytokinins mit der Formel I:
und worin R₁ ausgewählt ist aus Furfuryl, Phenyl, Benzyl, n-Alkyl mit 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, (Cyclohexyl)methyl(-CH₂(C₆H₁₁), oder
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung ein Kosmetikum ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Zusammensetzung für die topische Anwendung auf die Oberfläche von Säugerhaut formuliert ist.
Kosmetische Zusammensetzung nach Anspruch 12 oder 13, worin die Zusammensetzung als Lotion, Salbe, Creme, fester Stift oder Spray formuliert ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, worin R₁ der Formel I Furfuryl oder 3-Hydroxymethyl-3-methylallyl ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, worin das 6-(aminosubstituierte)-Purin-Cytokinin der Formel I Kinetin ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 16, worin die Konzentration der Verbindung der Formel I zwischen 10 ppm und 100 ppm beträgt.
Orale Zusammensetzung zur Verringerung von nachteiligen Alterungseffekten auf Säugerzellen, umfassend eine wirksame Konzentration eines 6-(aminosubstituierfen)-Purin-Cytokinins in einem physiologisch annehmbaren Träger, worin das 6=(aminosubstituierte)-Purin-Cytokinin die Formel I aufweist:
worin R₁ ausgewählt ist aus Furfuryl, Phenyl, Benzyl, n-Alkyl mit 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, (Cyclohexyl)methyl(-CH₂(C₆H₁₁), oder
und wobei die Konzentration zwischen ungefähr 10 ppm und ungefähr 1000 ppm beträgt und ausreichend ist, um die Bindegewebsschicht des Gastrointestinaltrakts zu durchdringen und dadurch die nachteiligen Alterungseffekte auf die Zellen zu verringern.