DE69826547T2

DE69826547T2 - Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumphase

Info

Publication number: DE69826547T2
Application number: DE69826547T
Authority: DE
Inventors: Eriko Yokohama-shi Takeoka; Chika Yokohama-shi Hamada; Jun Yokohama-shi Suzuki; Yosuke Yokohama-shi Nakazawa; Tsutomu Yokohama-shi Souma; Masashi Yokohama-shi Ogou; Masahiro Yokohama-shi Tajima
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 1997-03-26
Filing date: 1998-03-25
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2018-03-26
Also published as: US6139852A; KR19980080680A; TW592719B; EP0867169A1; KR100503695B1; DE69826547D1; EP0867169B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG 1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase. Insbesondere betrifft sie eine Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase, die die Wachstumsphase im Haarzyklus unter Förderung des Haarwachstums beibehält oder verlängert.
2. Beschreibung des Standes der Technik
In der modernen heutigen Gesellschaft, die als Gesellschaft hohen Alters, Gesellschaft hoher Belastung bezeichnet wird, werden die Möglichkeiten, dass Kopfhaar der Gefahr eines Verlusts unterliegt, aufgrund verschiedener Faktoren zunehmend weit verbreitet.
Um dem zu begegnen, wurden verschiedene Versuche unternommen, bessere "Haarwässer" bereitzustellen.
Die Hauptwirkungen, die Haarwässer bzw. Haartonika auf das Haar ausüben, sind (1) die Wirkung eines Induzierens der Haarbildung (Wirkung einer Förderung der Haarbildung und Wirkung eines Induzierens der Wachstumsphase), (2) die Wirkung eines Verdickens von Haar, (3) die Wirkung einer Verlängerung der Wachstumsphase von Haar, (4) die Wirkung einer Hemmung von 5α-Reduktase, (5) die Wirkung einer Förderung der Blutzirkulation, (6) eine Sterilisierungswirkung, (7) eine Antischuppenwirkung, (8) eine Befeuchtungswirkung, (9) eine Antioxidationswirkung und andere Wirkungen.
Trotz der verschiedenen Versuche, die auf diesem Wege gemacht wurden, bewirkten die herkömmlichen Haarwässer nicht unbedingt in ausreichender Weise das Verhindern von Haarverlust, das Fördern von Haarbildung und dgl. Der Grund hierfür liegt vermutlich darin, dass wahrscheinlich verschiedene Gründe für Haarverlust existieren und der Mechanismus der Haarbildung äußerst kompliziert ist. Die bis heute bereitgestellten "Haarwässer" wurden unter Konzentration auf das relativ allgemeine Konzept von Haarverlust, mit anderen Worten für das Phänomen von "Haarverlust" entwickelt, wobei nicht viele unter Vertiefung in den Mechanismus desselben entwickelt wurden.
Der Hauptgrund beruht unleugbar teilweise auf der Tatsache, dass kein ausreichendes Verfahren zur Bewertung von Haarwachstumswirkstoffen vorgeschlagen wurde, das eine einfache Bewertung der Bewirkung der Haarbildung unter Konzentration auf diesen Mechanismus ermöglicht. Insbesondere ist es schwierig, ein Verfahren der Bewertung von Haarwachstumswirkstoffen einzuführen, das (3) die Wirkung einer Verlängerung der Haarwachstumsphase bewertet. Infolgedessen konzentrierten sich die bis heute bereitgestellten Haarwässer hauptsächlich auf die obige (1) Wirkung eines Induzierens der Haarbildung, die Haar durch das Induzieren von Haar in der Wachstumsphase des Haarzyklus fördert, und (4) die Wirkung einer Blockierung von 5α-Reduktase.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Daher erstrebten die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Ermittlung eines einfachen In-vitro-Verfahrens zur Bewertung eines Haarwachstumsmittels zur Bewertung der Wirkung (3) einer Verlängerung der Haarwachstumsphase und die Verwendung des Verfahrens zur Bewertung des Haarwachstumsmittels, um eine Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase zu finden, die einen Bestandteil mit der obigen Wirkung (3) einer Verlängerung der Haarwachstumsphase als wirksamen Bestandteil enthält.
Daher ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Lösung der im vorhergehenden genannten Probleme des Standes der Technik und die Bereitstellung eines Wirkstoffs mit der obigen Wirkung (3) einer Verlängerung der Haarwachstumsphase und die Bereitstellung einer Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase, die denselben als Wirkstoff enthält.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bereitstellung einer Zusammensetzung zur starken Verlängerung der Wachstumsphase, die einen Extrakt einer zu Coriandrum gehörenden Pflanze als Wirkstoff und einen Träger hierfür umfasst.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten intensive Untersuchungen im Hinblick auf einen Bestandteil mit der obigen Wirkung (3) einer Verlängerung der Haarwachstumsphase bei verschiedenen Substanzen unter Verwendung des Verfahrens der Bewertung eines Haarwachstumsmittels, das durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung ermittelt wurde, durch und sie fanden heraus, dass die gewünschte Wirkung einer Verlängerung der Haarwachstumsphase bei ungesättigten Fettsäuren und/oder Derivaten derselben und auch bei einem Extrakt von zu Coriandrum gehörenden Pflanzen, wie Koriander, beobachtet wurde.
Wie im vorhergehenden erklärt, ist in der vorliegenden Erfindung das "Mittel zur Verlängerung der Haarwachstumsphase" ein auf Haare wirkendes Mittel, das derart formuliert ist, dass es als Wirkstoff einen Bestandteil auf weist, der die Wirkung einer Verlängerung der Wachstumsphase des Haars durch Beibehalten oder Fördern der Schizogenesefunktion der Follikelepithelzellen oder der Wuchsfunktion der Haarwurzeln gemäß dem Verfahren zur Bewertung eines Haarwuchsmittels, das später erklärt ist, aufweist, und insbesondere die Wirkung (3) einer Verlängerung der Haarwachstumsphase zeigt, d.h. die Eigenschaften eines sog. "Einzelwirkungshaarwassers" hat.
Dieses "Mittel zur Verlängerung der Haarwachstumsphase" ist beispielsweise ein gegenüber Alopezie besonders wirksames Mittel, was von der Tatsache abgeleitet wurde, dass die Proliferation von Follikelepithelzellen in der Nähe der Haarwurzeln niedrig ist, wodurch die Wachstumsphase kürzer wird und der Anteil von Haar in der Ruhephase gegenüber Haar der Wachstumsphase relativ größer wird. Ferner kann durch die Kombination und Verwendung von Haarwässern mit anderen Einzelwirkungen die gesamte synergistische Wirkung in einem breiteren Bereich von Alopezie hervorgerufen werden. D.h., dieses "Mittel zur Verlängerung der Haarwachstumsphase" weist ein Konzept auf, das die im vorhergehenden erklärten Wirkungen von (1) bis (9) umfasst, und es besitzt von den Anwendungsmöglichkeiten eines allgemeinen Haarwassers verschiedene Anwendungsmöglichkeiten.
Es ist anzumerken, dass vorzugsweise Koriander als Wirkstoff des Mittels zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung gewählt wird.
Das Mittel zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung enthält einen Extrakt von zu Coriandrum der Umbelliferae gehörenden Pflanzen als Wirkstoff.
Spezielle Beispiele für die zu Coriandrum gehörenden Pflanzen sind Coriandrum sativum L., das allgemein als Koriander bekannt ist, jedoch kann der Extrakt, sofern er die Wirkung einer Verlängerung der Wachstumsphase im Haarzyklus hat, ebenso zu Varietäten, Unterarten und dgl. gehören.
Ferner können die Extrakte von zu Coriandrum gehörenden Pflanzen in vorteilhafter Weise aus der ausgewachsenen Form oder unreifen Früchten dieser Pflanzen erhalten werden, jedoch auch aus der reifen Frucht extrahiert werden (Anmerkung: die als Materialien für diese Extrakte dienenden Teile werden auch insgesamt als "zu Coriandrum gehörende Pflanzen" bezeichnet).
Bei der Extraktion der Extrakte von zu Coriandrum gehörenden Pflanzen können allgemein bei der Extraktion von von Pflanzen stammenden Extrakten verwendete Verfahren verwendet werden.
D.h., eine zu Coriandrum gehörende Pflanze kann zur Lösemittelextraktion in frischem Zustand oder, falls gewünscht, getrocknet, wobei sie, so wie sie ist, oder pulverisiert verwendet wird, verwendet werden. Das zur Extraktion verwendete Lösemittel kann ein beliebiges herkömmliches Lösemittel, das allgemein bei der Extraktion der Bestandteile einer Pflanze aus der Pflanze verwendbar ist, sein und es ist nicht speziell beschränkt. Als Beispiele können heißes Wasser; niedrigere Alkohole, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Heptanol; Polyole, wie Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, wässrige Alkohole derselben; Kohlenwasserstofflösemittel und dgl., wie n-Hexan, Toluol, genannt werden, jedoch werden niedrigere Alkohole, wie Methanol, Ethanol, vorzugsweise als Extraktionslösemittel verwendet. Wenn diese niedrigeren Alkohole als Extraktionslösemittel verwendet werden, können die gebildeten Extrakte direkt als Wirkstoffe, so wie sie sind, in die Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsperiode gemäß der vorliegenden Erfindung eingearbeitet werden, jedoch ist es auch möglich, zunächst die Extraktionslösemittel abzudestillieren und dann diese nach dem Trocknen, falls gewünscht, in die Zusammensetzung zu formulieren.
Es wurde nachgewiesen, dass die auf diese Weise erhaltenen Extrakte von zu Coriandrum gehörenden Pflanzen ätherische Öle, beispielsweise mindestens d-Linalool, Pinen, fette Öle, wie Petroselinsäure, Ölsäure (oder Oleinsäure), und Proteine, Zucker, langkettige aliphatische Aldehyde und dgl. enthalten.
Es ist nicht klar, ob die Wirkung der Proliferation der Follikelepithelzellen des Extrakts, der als Wirkstoff in der Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung eingearbeitet ist, von einem dieser Bestandteile stammt, doch hat er, wie im vorhergehenden erklärt, eine starke Wirkung der Proliferation der Follikelepithelzellen insgesamt.
Es ist anzumerken, dass in der Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung natürlich ein im Handel erhältlicher Extrakt einer zu Coriandrum gehörenden Pflanze verwendbar ist.
Die Menge des obigen Extrakts einer zu Coriandrum gehörenden Pflanze, die in der Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung formuliert ist, kann in geeigneter Weise, bezogen auf die spezifische Form der Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung gewählt werden. Sie ist nicht speziell beschränkt, beträgt jedoch zweckmäßigerweise als getrockneter Extrakt 0,00005 bis 20,0 Gew.-%, vorzugsweise 0,01 bis 10,0 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der Zusammensetzung. Wenn die Menge als Trockenextrakt weniger als 0,00005 Gew.-% beträgt, zeigt sich die gewünschte Wirkung der vorliegenden Erfindung, d.h. die Wirkung einer Verlängerung der Haarwachstumsphase auf der Basis der Wirkung der Proliferation der Follikelepithelzellen, nicht in ausreichender Weise, und sie ist daher nicht bevorzugt. Auch ist, wenn die Menge mehr als 20,0 Gew.-% beträgt, nicht nur keine Erhöhung der Wirkung entsprechend der Zunahme der Menge zu erwarten, sondern es besteht auch eine beträchtliche Neigung zum Auftreten von Problemen bei der Herstellung der Zusammensetzung.
Auf diese Weise hat die Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung, die den im vorhergehenden genannten Extrakt einer zu Coriandrum gehörenden Pflanze als Wirkstoff enthält, die Wirkung einer Verlängerung der Haarwachstumsphase auf der Basis der hervorragenden Wirkung der Proliferation der Follikelepithelzellen. Wie im vorhergehenden erklärt, ist die Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung beispielsweise ein besonders wirksames Mittel gegen Alopezie aufgrund der Tatsachen, dass die Proliferation der Follikelepithelzellen in der Nähe der Haarwurzeln langsam ist, wodurch die kürzere Wachstumsphase kürzer wird und der Anteil von Haar in der Ruhephase, der diese beendet, relativ größer als das Haar in der Wachstumsphase wird. Ferner kann durch die Kombination und Verwendung von Haarwässern mit anderen Einzelwirkungen die synergistische Wirkung hinsichtlich einer speziellen Alopezie erreicht werden.
Die Mittel zur Spezifizierung der Wirkung der Beibehaltung oder Verlängerung der Wachstumsphase im Haarzyklus, der inhärenten Wirkung hinsichtlich der gewünschten Wirkung der Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung, d.h. die Wirkung einer Verlängerung der Haarwachstumsphase ist nicht speziell beschränkt, sofern das spezielle Verfahren selbst zur Spezifizierung der Wirkung geeignet ist. Beispielsweise kann ein spezifiziertes In-vitro-Verfahren oder ein spezifiziertes In-vivo-Verfahren verwendet werden, doch wird bei Betrachtung der Handhabung und der Effektivität vorzugsweise ein spezifiziertes In-vitro-Verfahren verwendet.
Im folgenden wird ein spezifiziertes In-vitro-Verfahren, d.h. das spezifizierte Verfahren, das durch die Untersuchung der Wirkung der Proliferation von kultivierten Follikelepithelzellen gekennzeichnet ist, kurz erklärt (genauere Beschreibung in den Beispielen).
D.h., das spezifizierte Verfahren ist das "Verfahren zur Bewertung eines Haarwachstumswirkstoffs, das das Inkontaktbringen einer Substanz mit kultivierten Follikelepithelzellen in einem Keratinocytenwachstumsmedium und das Spezifizieren des Vorhandenseins und/oder der Stärke der Zellproliferationsaktivität zum Bewerten der Wirkung der Substanz hinsichtlich der Verlängerung der Wachstumsphase im Haarzyklus und das Durchführen eines zweiten Screenings, das das Kultivieren von humanen Follikeln in einem Keratinocytenwachstumsmedium, das die gemäß dem ersten Screening Wirkungen aufweisende Substanzen enthält, zur weiteren Selektion der ein Wachstum der Haarwurzeln zeigenden Substanzen umfasst", d.h. ein In-vitro-Verfahren zur Bewertung von Haarwachstumswirkstoffen unter Berücksichtigung der Follikelepithelzellen, die direkt mit dem Haarwachstum in Verbindung stehen, und unter Verwendung der kultivierten Zellen, um die gewünschte Wirkung einer Verlängerung der Wachstumsphase im Haarzyklus zu spezifizieren.
Beim ersten Screening dieses Verfahrens der Bewertung von Haarwachstumswirkstoffen wird die Substanz mit gezüchteten Zellen, die durch Isolieren der Follikelepithelzellen von Lebewesen (einschließlich Menschen, wie unten) erhalten wurden, d.h. "gezüchteten Follikelepithelzellen", in Kontakt gebracht, um das Vorhandensein und/oder die Stärke der Proliferation zu spezifizieren.
"Follikelepithelzellen" bezeichnen insbesondere von Follikeln stammende Epithelzellen, wie äußere Wurzelscheidezellen oder Matrixzellen. Innere Dermiszellen sind ausgeschlossen.
Die Wachstumsphase im Haarzyklus ist wörtlich die Phase, in der die Haarwurzeln wachsen, d.h. in der die Follikelepithelzellen die Schizogenese durchlaufen. Die Intermediär-Phase und die Ruhephase sind Phasen, in denen diese das Wachsen absenken und stoppen.
D.h., die Substanzen, die die Wachstumsphase im Haarzyklus verlängern oder aufrechterhalten, sind folglich Substanzen, die die Schizogeneseaktivität der Follikelepithelzellen durch eine Verabreichung derart, dass der Übergang des Haars in die Intermediär-Phase und die Ruhephase des Haarzyklus verhindert wird, beibehalten, d.h. Substanzen, die fortgesetzt die Proliferation von Follikelepithelzellen fördern oder aufrechterhalten.
Des weiteren werden beim zweiten Screening humane Follikel kultiviert, um Substanzen, die ein Wachstum von Haarwurzeln zeigen, weiter zu selektieren.
Im Falle dieses zweiten Screenings ist es zunächst notwendig, Follikelbälge zu präparieren. Üblicherweise ist es möglich, Follikelbälge durch Auswählen von Haar in der Wachstumsphase von gesundem menschlichem Haar und Abschneiden von etwa den oberen 2 mm der Haarzwiebeln des Haars zu präparieren.
Wenn die Follikelbälge durch ein Insulin enthaltendes Basalmedium kultiviert werden, wird der Zustand der Wachstumsphase über einen relativ langen Zeitraum beibehalten, jedoch verändern sie sich, wenn sie durch ein nicht Insulin enthaltendes Basalmedium kultiviert werden, zu einem Zustand, der Follikeln in der Intermediär-Phase ähnelt, innerhalb eines kurzen Zeitraums von etwa einer Woche.
Daher ist es günstig, bei einem Kultivieren in einem nicht Insulin enthaltenden Basalmedium den Test innerhalb etwa einer Woche durchzuführen. Wenn ein Insulin enthaltendes Medium verwendet wird, wird es möglich, die Kulturperiode auf etwa zwei Wochen zu verlängern. Ungeachtet des Mediums ist es möglich, das Ausmaß des Wachstums der Haarwurzeln durch Kultivieren der Follikel in Gegenwart der Testsubstanz zu beobachten.
Es ist anzumerken, dass das beim zweiten Screening verwendbare Basalmedium ein allgemein verwendetes Lebewesenzellkulturmedium sein kann. Die Zugabe eines Antibiotikums oder eines antibakteriellen Mittels zur Verhinderung einer Kontamination ist möglich.
Die Kulturbedingungen der Follikel können die normalen Bedingungen einer Lebewesenkultur, wie 5 % CO₂ und 37 °C, sein. Die Kultur wird üblicherweise während 5 bis 14 Tagen durchgeführt.
Das Wachstum der Haarwurzeln in den humanen Follikeln kann beispielsweise visuell in einem Probenmikroskop, das mit einem Mikrometer ausgestattet ist, festgestellt werden.
Durch Durchführen des ersten Screening und zweiten Screening in der im vorhergehenden genannten Weise ist es möglich, die Wirkung hinsichtlich einer Beibehaltung oder Verlängerung der Wachstumsphase im Haarzyklus oder die Wirkung hinsichtlich des Wachstums der Haarwurzeln zu spezifizieren.
Es ist anzumerken, dass als In-vitro-Verfahren der Bewertung eines Haarwachstumswirkstoffs das Verfahren des Einwirkens der Substanz auf die Haarpapillezellen eines Lebewesens und Beurteilens der Wirkung einer Förderung der Proliferation verwendet werden kann.
Ferner wird als spezifisches In-vivo-Verfahren das folgende Verfahren als Beispiel angegeben. Dies ist das "Verfahren der Bewertung eines Haarwachstumswirkstoffs, das das Verabreichen der Substanz an eine nackte Maus, das Spezifizieren des Zustandes der Haarbildungsbereiche auf der Oberfläche des Körpers der nackten Maus und das Bewerten der Wirkung der Substanz auf die Verlängerung der Wachstumsphase im Haarzyklus umfasst", d.h. das Verfahren des Spezifizierens der Größe des Haarbildungsbereichs und der Geschwindigkeit der Bewegung des Haarbildungsbereichs in einer nackten Maus, die im Prinzip haarlos ist, jedoch in charakteristischer Weise Haar in einer Weise bildet, wobei der Haarbildungsbereich sich mit der Zeit entlang der Körperoberfläche derart bewegt, dass die Länge der Wachstumsphase im Haarzyklus bewertet wird.
Die Zubereitungsform der Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung ist nicht speziell beschränkt, sofern dies eine Form ist, die auf die Haut appliziert werden kann. Beispiele für derartige Formen sind eine Flüssigkeit, Emulsion, Salbe und dgl.
Ferner ist jede Art der Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung akzeptabel. Beispielsweise können ein Tonikum, eine Haarcreme, ein Schaum, Shampoo, eine Spülung, eine Creme, eine Emulsion, ein Pflegewasser, eine Packung oder dgl. verwendet werden.
Zusätzlich zu den obigen essentiellen Bestandteilen der Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung können optional in einem die gewünschten Wirkungen der vorliegenden Erfindung nicht beeinträchtigenden Maße verschiedene öllösliche oder wasserlösliche Bestandteile, Feuchthaltemittel, Dickungsmittel, Konservierungsmittel, Antioxidationsmittel, Aromastoffe, Farben, verschiedene Chemikalien und dgl., die üblicherweise in Kosmetika, Quasi-Arzneimitteln, Arzneimitteln und dgl. verwendet werden, einformuliert werden.
Beispielsweise können Öle, wie höhere gesättigte Fettsäuren, festes Paraffin, Paraffinöl, Siliconöl, Squalan, Glycerylmonooleat, Olivenöl, Isopropylmyristat, höhere Alkohole; Feuchthaltemittel, wie Glycerin, Hyaluronsäure, Propylenglykol, Maltit, Atelocollagen, Natriumlactat; Dickungsmittel, wie Malmero(phonetisch)-Klebrigsubstanzen, Carboxyvinylpolymere, Xanthangummi; Gefäßdilatatoren, wie Nicotinsäureamide, Benzylnicotinat, Vitamin-E-Acetat, Swertia-Kräuterextrakt, Carproniumchlorid, Acetylcholinderivate, Aminosäuren, wie Serin, Methionin, Alginin; Vitamine, wie Vitamin B₆, Vitamin E (oder dessen Derivate), Biotin, Pantothensäure (oder dessen Derivate); Nicotinsäureester, wie Nicotinsäure, Methylnicotinsäure, Tocopherolnicotinsäure, und die Hautfunktion fördernde Mittel, wie Cepharanthin; weibliche Hormone, wie Östradiol; entzündungshemmende Mittel, wie Glycyrrhetinsäure (oder deren Derivate); antibakterielle Mittel, wie Hinokitiol, Hexa chlorophen, Benzalkoniumchlorid, Bithionol; Kühlmittel, wie Menthol; organische Säuren, wie Salicylsäure, Zink (oder dessen Derivate), Milchsäure (oder deren Alkylester) und dgl.; Citronensäure und dgl. eingemischt werden.
Spezielle Formulierungen der Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung werden später erklärt.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, ohne jedoch in irgendeiner Weise hierauf beschränkt zu sein.
Es ist anzumerken, dass in den folgenden Beispielen die Angabe von "%" und der innere Gehalt Gewichtsprozent bedeuten, falls nicht speziell anders angegeben.
Zunächst erfolgt eine Erklärung des In-vitro-Zellproliferationstests zur Bewertung der Wirkung von Extrakten von Pflanzen, die in den Beispielen und dgl. zur Verlängerung der Haarwachstumsphase verwendet werden.
Testbeispiel 1: Zellproliferationstest unter Verwendung kultivierter Follikelepithelzellen
A. Humane Follikelepithelzellen
1. Probengewinnung von humanen Follikelepithelzellen
Follikel in der Wachstumsphase im Haarzyklus wurden mechanisch unter einem Probenmikroskop von als Nebenprodukte einer Operation erhaltenen Kopfhäuten von Männern als Proben gewonnen. Die Follikel in der Wachstumsphase wurden durch ein nach Dulbecco modifiziertes MEM (DMEM), das 1000 U/ml Dispase und 0,2 % Collagenase enthielt, 30 min bei 37 °C behandelt. Unter Verwendung der Spitze einer Spritzennadel wurden die Dermisscheiden, die Dermispapille und Haarzwiebelepithelgewebe entfernt und der Rest durch einen Phosphatpuffer, der 0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA enthielt, [PBS(-)] ((-) bedeutet, dass Calciumionen oder Magnesiumionen nicht enthalten sind) 5 min bei 37 °C behandelt.
Als nächstes wurden die Follikel in einer mit Collagen (Typ I) beschichteten Kulturplatte stehen gelassen und eine externe Primärkultur durchgeführt. Es ist anzumerken, dass das zu diesem Zeitpunkt verwendete Medium Keratinocytenwuchsmedium (KGM) war (serumfreies Keratinocytenmedium kann ebenfalls verwendet werden).
Nach einer Kultur von 4 bis 5 Tagen wurde das Medium zu einem Zeitpunkt, an dem die Haftung der Follikel an der Kulturplatte und die Proliferation der Zellen festgestellt werden konnte, ersetzt. Das Medium wurde danach alle 3 Tage ersetzt.
Die auf diese Weise proliferierten Zellen wurden mit PBS(-), das 0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA enthielt, 5 min bei 37 °C behandelt. Die Reaktion wurde durch eine gleiche Menge eines 0,1%-Trypsin-Inhibitors gestoppt und danach wurde die Lösung zentrifugiert (800 x g, 5 min), um die Zellen zu gewinnen.
Als nächstes wurden die Zellen in dem obigen Keratinocytenwachstumsmedium aufgeschwemmt und auf eine mit Collagen (Typ 1) beschichtete Kulturplatte mit einer Dichte von 5000 Zellen/cm² überimpft. Das Medium wurde alle 3 Tage ersetzt, bis die Zellen subkonfluent wurden, und sie wurden danach erneut durch PBS(-), das 0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA enthielt, 5 min bei 37 °C behandelt. Die Reaktion wurde dann durch eine gleiche Menge des 0,1%-Trypsin-Inhibitors gestoppt und die Lösung wurde zentrifugiert (800 × g, 5 min). Eine Zelleinfrierlösung (Cell Banker, hergestellt von Diatron) wurde zu den dadurch erhaltenen humanen Follikelepithelzellen unter Einstellen der Konzentration auf 1,0 × 10⁶ Zellen/ml gegeben. 1,0 × 10⁶ Zellen wurden jeweils in Gefrierröhrchen gegeben und diese wurden eingefroren und aufbewahrt. Es ist anzumerken, dass die Zellzahl durch ein Hämozytometer berechnet wurde.
2. Probenansatz der zu testenden Substanz
Die Rate der Einmischung von Fibroblasten in die durch das obige Verfahren erhaltenen Follikelepithelzellen (d.h. die FB-Einmischrate) wurde ermittelt (3000 x, 5 Felder). Proben mit FB-Einmischungsraten von über 3 % als Ergebnis wurden aus dem Probenansatz herausgenommen.
Die Follikelepithelzellen wurden in einen Kulturkolben überimpft und anschließend durch PBS(-), das 0,25 % Trypsin und 0,02 % EDTA enthielt, behandelt. Die Reaktion wurde dann durch einen 0,1%-Trypsin-Inhibitor gestoppt, und das System wurde 5 min mit 1500 Umin^–1 zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und danach wurden 20 ml KGM-Medium zu dem Rückstand gegeben, um eine Zellsuspension herzustellen.
Die Zellen wurden in eine 96-Vertiefungen-Platte (mit I-Typ-Collagen beschichtete Platte, hergestellt von Falcon Co.) mit einer Rate von 0,2 ml/Vertiefung (3,0 × 10³ Zellen/Vertiefung) überimpft. Sie wurden etwa 20 min bei Raumtemperatur stehen gelassen, bis die Zellen zum Boden der Vertiefungen sanken.
Als nächstes wurden die Zellen bei 37 °C in 5 % CO₂ einen Tag kultiviert, um die gewünschten humanen kultivierten Follikelepithelzellen zu erhalten.
B. Probengewinnung von Rattenfollikelepithelzellen
1. Probengewinnung von Rattenfollikelepithelzellen
(1) Probengewinnung von Follikeln
Rückenhaut von neugeborenen (3–4 Tage alten) Ratten wurde in PBS(-), das 5 % PSF enthielt, getaucht und danach wurden das darunterliegende Unterhautfett und die darunterliegende Membran von der Hautfettschicht durch Sektionsscheren entfernt. Als nächstes wurde die Rückenhaut erneut in PBS(-), das 1 % PSF enthielt, getaucht und danach über Nacht in PBS(-), das 0,25 % Trypsin und 0,02 % EDTA (im folgenden das gleiche) bei 4 °C eingeweicht.
Nach dem Eintauchen in die Trypsinlösung wurden die Dermisschicht und die Epidermisschicht der Rückenhaut durch eine Pinzette abgelöst und danach wurde die Dermisschicht durch eine Schere in Ham-F12-Medium, das 0,35 % Collagenase enthielt [Zusammensetzung (mg/l): L-Alanin (8,9), L-Arginin (HCl: 211), L-Asparagin (13,2), L-Asparaginsäure (13,3), L-Cystein (HCl: 31,5), L-Glutaminsäure (14,7), L-Glutamin (146), Glycin (7,5), L-Histidin (HCl: 19), L-Isoleucin (3,9), L-Leucin (13,1), L-Lysin (HCl: 36,5), L-Methionin (4,5), L-Phenylalanin (5,0), Prolin (34,5), L-Serin (10,5), L-Threonin (11,9), L-Tryptophan (2,0), L-Tyrosin (5,4), L-Valin (11,7), Biotin (0,0073), Cholin (Cl: 14,0), Vitamin B₁₂ (1,36), Folsäure (1,32), Inosit (18,0), Nicotinamid (0,037), Pantothensäure (Ca: 0,477), Vitamin B₆ (HCl: 0,062), Vitamin B₂ (0,038), Vitamin B₁ (HCl: 0,337), CaCl₂ (2H₂O: 44,0), CuSO₄·5H₂O (0,0025), FeSO₄·7H₂O (0,834), KCl (224,0), MgCl₂ (6H₂O: 122), "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288 (1965)", im folgenden das gleiche], zerschnitten. Das Medium, das diese geschnittenen Teile enthielt, wurde dann 35 min bei 37 °C einweichen gelassen (60 Umin^–1). Nach dem Einweichen wurde ein Pipettieren durchgeführt, bis in dem Collagenasereaktionsprodukt keine Klümpchen mehr sichtbar waren, DNase (10000 Einheiten) enthaltendes Ham-F12-Medium wurde zugegeben und das Gemisch wurde 5 min stehen gelassen.
Nach dem Stehenlassen wurde die erhaltene Suspension weiter pipettiert und dann durch ein Nylonsieb (Nytex 157 mesh) filtriert.
Die Suspension wurde durch PBS(-) verdünnt und danach wurde die verdünnte Lösung zentrifugiert (4 °C, 400 Umin^–1, 5 min). Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand entfernt und der fette Teil aus dem System entfernt.
Als nächstes wurde PBS(-) zu dem Rückstand zur Bildung einer Suspension gegeben und danach wurde diese weiter zentrifugiert [(4 °C, 400 Umin^–1, 5 min) × 3x].
Der durch diesen Zentrifugationsvorgang erhaltene Rückstand waren die Follikel in der Rückenhaut der Ratten.
(2) Probengewinnung von Follikelepithelzellen
5 ml PBS(-), das 0,25 % Trypsin und 0,02 % EDTA enthielt, wurde zu den durch das obige Arbeitsverfahren erhaltenen Follikeln gegeben. Die Zellsuspension wurde 5 min bei 37 °C inkubiert.
Nach der Inkubation wurden gleiche Mengen von 0,1 % Trypsin-Inhibitor und Ham-F12-Medium zugegeben, die Zellsuspension wurde durch eine Zellbeschränkungsvorrichtung bzw. ein Zellfilter (100 μm, hergestellt von Nalgene Co.) gegeben, und danach wurde die Zellsuspension zentrifugiert (4 °C, 1500 Umin^–1, 5 min). Der Überstand wurde von dem System entfernt, wobei als Rückstand die gewünschten Follikelepithelzellen erhalten wurden. Eine Zelleinfrierlösung (Cell Banker, hergestellt von Diatron) wurde zu den Follikelepithelzellen unter Einstellen der Konzentration auf 1,5 × 10⁷ Zellen/ml gegeben, jeweils 1,5 × 10⁷ Zellen wurden in Einfrierröhrchen gegeben, und diese wurden eingefroren und aufbewahrt. Die Zahl der Zellen wurde mit einer Blutzählplatte berechnet.
2. Vorkultur von Follikelepithelzellen
Die in dem System eingemischten Fibroblasten wurden soweit wie möglich aus dem System entfernt, und danach wurden die von dem obigen Verfahren erhaltenen Follikelepithelzellen vorkultiviert. Dieses Verfahren wird im folgenden erklärt.
Die durch das obige Verfahren erhaltenen eingefrorenen Zellen wurden in einem Inkubator von 37 °C aufgetaut. Als nächstes wurden ein FAD-Medium [Ham-F12-Medium (das später erklärt ist) und MEN-Medium in einer Mischung in einem Volumenverhältnis von 3/1, die mit einem Medium, das Insulin (5,0 μg/ml), Hydrocortison (0,45 μg/ml), Epidermiswachstumsfaktor (EGF) (10,0 ng/ml), Choleratoxin (10^–9 M) und fetales Rinderserum (10 %) enthielt, versetzt wurde, ebenso im folgenden] zum Verdünnen der Zelllösung zugegeben. Das System wurde dann zentrifugiert (nicht mehr als 10 °C, 1500 Umin^–1, 5 min). Nach der Zentrifugation wurde der Überstand entfernt, FRD-Medium zu dem System gegeben und ein Pipettieren wiederholt, bis keine Zellklumpen mehr beobachtet wurden.
Als nächstes wurden Proben unter Verwendung des FAD-Mediums unter Bilden einer Zellkonzentration von 2,5 × 10⁵ Zellen/ml hergestellt.
Die Zellen wurden in einem mit I-Typ-Collagen beschichteten Kulturkolben von 75 cm³ überimpft und bei 37 °C in 5 % CO₂ über Nacht kultiviert.
Nach der Kultur wurde das System mit PBS(-) gewaschen, mit PBS(-), das 0,25 % Trypsin und 0,02 % EDTA enthielt, versetzt, und dieses System bei 37 °C in 5 % CO₂ 4 min inkubiert. Eine zu der Trypsinlösung gleiche Menge von 0,1%-Trypsin-Inhibitor wurde zu dem System gegeben, es wurde einmal ein sanftes Spülen durchgeführt, der Überstand wurde entfernt und die in das System eingemischten Fibroblasten waren entfernt.
Ferner wurde ein KGM-Medium [Keratinocytenwachstumsmedium: umfasst Keratinocytenbasalmedium (KBM-Medium (modifiziertes MCDB153-Medium (hergestellt von Chronetics Co.)) plus zugesetztem Rinderhypophysenextrakt (BPE) (0,4 Vol.-%), Insulin 0,5 μm/ml), Hydrocortison (0,5 μm/ml), h-EGF (0,1 ng/ml), im folgenden das gleiche] zugesetzt und das Ergebnis bei 37 °C in 5 % CO₂ 3 Tage kultiviert.
3. Substanzprobenansatz
Die Rate der Einmischung von Fibroblasten in dem Kulturkolben, der mit den durch das obige Verfahren erhaltenen Follikelepithelzellen beimpft wurde, (FB-Einmischungsrate) wurde ermittelt (3000 x, 5 Sichtfelder). Proben mit einem Ergebnis einer FB-Einmischungsrate von über 2 % wurden aus dem Test entfernt.
Das System wurde mit PBS(-) gewaschen, mit PBS(-), das 0,25 Trypsin und 0,02 % EDTA enthielt, versetzt, und das Ergebnis wurde bei 37 °C 3 min inkubiert. Als nächstes wurde der Unterschied der Reaktivität der Epithelzellen und der Fibroblasten mit Trypsin verwendet, um durch Entfernen des Trypsins die Fibroblasten aus dem System zu entfernen, und danach wurde erneut PBS(-), das 0,25 % Trypsin und 0,02 EDTA enthielt, zugegeben und das Ergebnis bei 37 °C mit 20 Umin^–1 5 min geschüttelt.
Als nächstes wurde ein Ablösen von Zellen unter einem Mikroskop festgestellt und danach wurde DMEM-Medium, das 10 FBS enthielt, zugegeben und es wurde pipettiert. Das System wurde mit 1500 Umin^–1 5 min zentrifugiert.
Der Überstand wurde entfernt, das KGM-Medium wurde zugegeben, und danach wurde ein Pipettieren durchgeführt, bis keine Zellklümpchen mehr vorhanden waren.
Die Suspension wurde durch eine Zellbeschränkungsvorrichtung (100 μm, hergestellt von Nalgene Co.) filtriert, und danach wurde die Zahl der lebenden Zellen in der Suspension durch ein Hämozytometer berechnet. KGM-Medium wurde zu dem System zum Einstellen der Zellkonzentration in dem System auf 2,0 × 10⁹ Zellen/ml gegeben.
Als nächstes wurde eine 96-Vertiefungen-Platte (mit I-Typ-Collagen beschichtete Platte: hergestellt von Falcon Co.) mit einer Rate von 0,2 ml/Vertiefung beimpft (4,0 × 10³ Zellen/Vertiefung). Sie wurde dann etwa 20 min bei Raumtemperatur stehengelassen, bis die Zellen auf den Boden der Vertiefungen sanken.
Als nächstes wurde bei 37 °C in 5 % CO₂ 1 Tag lang inkubiert, um die gewünschten humanen kultivierten Follikelepithelzellen zu erhalten.
C. Herstellung von Testmedien gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung
(1) Herstellung von Substanzmedien
Die Substanzen wurden zu dem KBM-Medium mit einer Konzentration von 1,0 μmol/ml in Bezug auf das Medium mit 0,1 % DMSO gegeben.
(2) Herstellung eines Kontrollmediums
Negative Kontrolle Herstellung durch die Zugabe von DMSO (Lösemittel) zu dem KBM-Medium unter Bildung einer Endkonzentration von 0,1 %.
Positive Kontrolle: Herstellung durch Zugabe von Endkonzentrationen von 5 μg/ml Insulin und 0,5 μg/ml Hydrocortison zu dem negativen Kontrollmedium.
C'. Herstellung von Testmedien gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung
(1) Herstellung eines Extrakts
500 g von handelsüblichem (getrocknetem) Koriander wurden zweimal 24 h in 10 1 70%-iges Methanol bei Raumtemperatur (23 °C) getaucht. Das Lösemittel wurde von dem Extrakt abdestilliert, wobei 57,5 g eines getrockneten 70%-Methanol-Extrakts von Koriander erhalten wurden.
(2) Herstellung von Substanzmedien
Etwa 1,5 mg des obigen Korianderextrakts wurden in einem Schraubröhrchen abgewogen und durch ein organisches Lösemittel (DMSO) zu einer 0,2%-igen Lösung verdünnt.
In ähnlicher Weise wurden als Kontrollen 0,2%-ige DMSO-Lösungen von Teeextrakt (Extraktionsverfahren: Wasserextraktion) und eines Extrakts von Tuber Ophiopogonis (Extraktionsverfahren: 10%-Ethanol-Extraktion) hergestellt.
Als nächstes wurden die DMSO-Lösungen der obigen Kräuterextrakte zu einem 1000-fachen Volumen des obigen KBM-Mediums gegeben (Extraktkonzentration: 2,0 × 10^–4 % (DMSO 0,1 %)).
Mengen von 0,2 ml dieser Substanzmedien wurden zu Mengen von 1,8 ml KBM-Medium, das 0,1 % DMSO enthielt, gegeben, um die Konzentrationen der Substanzen auf 2,0 × 10^–5 % (10-fache Verdünnung) einzustellen.
(3) Herstellung eines Kontrollmediums

Negative Kontrolle: Herstellung durch Zugabe von 2 μl DMSO (Lösemittel) zu 2 ml KBM-Medium (DMSO 0,1 %).
Positive Kontrolle: Herstellung durch Zugabe von 2 μl Insulin (5 mg/ml) und 2 μl Hydrocortison (0,5 mg/ml) zu dem negativen Kontrollmedium.

D. Austausch von Substanzmedien
Im obigen A und B wurden die KGM-Medien in den 96-Vertiefungen-Platten, die mit den humanen kultivierten Follikelepithelzellen und kultivierten Rattenfollikelepithelzellen hergestellt wurden, durch die Substanzmedien und Kontrollmedium (200 μl/Vertiefung) ausgetauscht. Nach dem Austausch wurde bei 37 °C in 5 % CO₂ 2 Tage lang kultiviert.
Es ist anzumerken, dass die Medien durch Abziehen der KGM-Medien in den Vertiefungen durch eine Mehrfachpipette unter Beachtung von Sorgfalt, die am Boden haftenden Zellen nicht zu beschädigen, und anschließend rascher Zugabe der Sub stanzmedien und dgl. von den beiden Enden der Vertiefungen ausgetauscht wurden.
E. Ermittlung der Zellproliferation
Alamar Blue (hergestellt von Alamar Bioscience Co.) wurde in einer Menge von 1/10 der Mediummenge (bezogen auf das Volumen) zugegeben und es wurde bei 37 °C (5 % CO₂) 6 h inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Extinktionswerte bei 595 nm und 570 nm des Systems unter Verwendung einer Mikroplattenlesevorrichtung (hergestellt von Bio RAD Co.) ermittelt. Der Zellproliferationsgrad wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet: Berechnungsverfahren des Zellproliferationsgrads (Zellproliferationsgrad einer Probe) = (Alamar Blue-Reduktionsrate der Probe)/(Alamar Blue-Reduktionsrate der negativen Kontrolle) × 100 (%)
Ferner wurde der Zellproliferationsförderungsindikator durch die folgende Gleichung berechnet: (Zellproliferationsförderungsindikator einer Probe) [(Zellproliferationsgrad einer Probe)-(Zellproliferationsgrad der negativen Kontrolle)]/[(Zellproliferationsgrad der positiven Kontrolle)-(Zellproliferationsgrad der negativen Kontrolle)]
Hierbei wird der Zellproliferationsförderungsindikator der negativen Kontrolle 0 und der Zellproliferationsförderungsindikator der positiven Kontrolle 1.
F. Ergebnisse der vorliegenden Erfindung
Der im vorhergehenden bestimmte Zellproliferationsgrad des Korianderextrakts betrug 0,5 bei von Menschen stammenden kultivierten Follikelepithelzellen und ebenso 0,5 bei von Ratten stammenden kultivierten Follikelepithelzellen.
Durch diese Ergebnisse wurde festgestellt, dass eine proliferative Aktivität gegenüber kultivierten Follikelepithelzellen bei Korianderextrakt, d.h, einem Extrakt einer zu Coriandrum gehörenden Pflanze, klar beobachtet wurde.
Das heißt, dass klar wurde, dass eine Aktivität der Verlängerung der Wachstumsphase von Haar bei einem Extrakt einer zu Coriandrum gehörenden Pflanze beobachtet wurde.
Die Formulierungen der Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden nun als Beispiele angegeben. Die Ergebnisse des Haarwachstums wurden untersucht.
Beispiel I-1: Herstellung einer flüssigen Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase
0,1 % Petroselinsäure und 0,1 % Ölsäure wurden gerührt, gemischt und in 90 % 70 % Ethanol, 0,49 % Dodecylbenzolsulfonat, 0,5 % hydriertem Rizinusöl-Ethylenoxid(40 mol)-Addukt und Ionenaustauschwasser (Rest) gelöst. Ionenaustauschwasser (10 %) wurde zugegeben und darin eingemischt, wobei eine flüssige Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase erhalten wurde.
In der Formulierung der flüssigen Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase wurden die Petroselinsäure und Ölsäure weggelassen, um ein flüssiges Mittel herzustel len, das als Kontrolle verwendet wurde (Vergleichsbeispiel I-1).
Beispiel I-2: Herstellung einer Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase des Emulsionstyps

Eine Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase eines Emulsionstyps wurde nach der folgenden Rezeptur hergestellt:

Formulierungsbestandteil Menge	(Gew.-%)
(Phase A)
Petroselinsäure	1,0
Polyoxyethylen(60 mol)-hydriertes Rizinusöl-Addukt	2,0
Glycerin	10,0
Dipropylenglykol	10,0
1,3-Butylenglykol	5,0
Polyethylenglykol 1500	5,0
(Phase B)
Cetylisooctanat	10,0
Squalan	5,0
Vaseline	2,0
Propylparaben	2,0
(Phase C)
1%-ige wässrige Carboxyvinylpolymerlösung	30,0
Natriumhexametaphosphat	0,03
Ionenaustauschwasser	8,35
(Phase D)
Ionenaustauschwasser	4,5
(Phase E)
KOH	0, 12
Ionenaustauschwasser	5,0

<Herstellungsverfahren>
Die Phase A und die Phase B wurden erhitzt, aufgeschmolzen und bei 60 °C gemischt und durch einen Homomischer weiter verarbeitet, wobei ein Gel hergestellt wurde. Die Phase D wurde allmählich dazugegeben und durch einen Homomischer verteilt.
Als nächstes wurde die aufgeschmolzene Phase C dazugegeben, die schließlich aufgeschmolzene Phase E zugegeben und das Gemisch durch einen Homomischer emulgiert, wobei eine Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase des O/W-Emulsionstyps erhalten wurde.
Beispiel I-3: Herstellung einer cremeähnlichen Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase

Eine cremeähnliche Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase wurde nach der folgenden Rezeptur hergestellt:

Formulierungsbestandteil	Menge (Gew.-%)
(Phase A)
Paraffinöl	5,0
Cetostearylalkohol	5,5
Glycerinmonostearat	3,0
EO(20 mol)-2-Octyldodecylether	8,0
Propylparaben	0,3
Duftstoff	0,1
(Phase B)
Petroselinsäure	5,0
Glycerin	8,0
Dipropylenglykol	20,0
Polyethylenglykol 4000	5,0
Natriumdodecylsulfat	0,1
Natriumhexametaphosphat	0,005
Ionenaustauschwasser	39,995

<Herstellungsverfahren>
Die Phase A und die Phase B wurden erhitzt, aufgeschmolzen und vermischt und dann durch einen Homomischer emulgiert, wobei eine cremeähnliche Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase erhalten wurde.
Beispiel I-4: Untersuchung der Haarwachstumswirkung einer Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung
Zur Untersuchung der Verhinderung von Haarverlust, der Haarbildungswirkung und anderer Haarwachstumswirkungen der Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein Tricogrammtest an Menschen nach dem folgenden Verfahren durchgeführt. Die Testproben und die Kontrollprobe waren die Zusammensetzungen zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung der Beispiele I-1 bis I-3, die Zusammensetzung von Vergleichsbeispiel I-1 und 70%-iges Ethanol.
Testverfahren
Haarwurzeln von entnommenem Haar vor der Verwendung der obigen Probe und nach der Verwendung entnommenem Haar wurden unter einem Mikroskop geprüft. Die Zahl der Haarwurzeln von Haar, das zu wachsen aufgehört hatte, d.h. "Haarwurzeln in der Ruhephase" (es wird angenommen, dass Leute, die einen Haarverlust behaupten, einen im Vergleich zu normalen Leuten größeren Anteil von Haarwurzeln in der Ruhephase aufweisen), wurden gezählt. Die Änderung des Anteils wurde verwendet, um die Haarwachstumswirkung der Proben zu vergleichen.
Das heißt, die Testproben und die Kontrollprobe wurde zweimal täglich in einer Menge von jedesmal 2 ml kontinuierlich während sechs Monaten auf die Kopfhaut von 10 männlichen Testpersonen aufgetragen. Unmittelbar vor der Auftragung und direkt nach dem Ende der Auftragungen während des Zeitraums von sechs Monaten wurden pro Testperson 100 Haare entnommen. Die Haarwurzeln wurden unter einem Mikroskop geprüft. Ferner wurden praktische Tests hinsichtlich des Zutreffens oder Nichtzutreffens der Haarwachstumswirkung auf die Proben durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser Tests sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3
Nach den Ergebnissen von Tabelle 3 wurde eine Haarwachstumswirkung auf der Grundlage der Wirkung einer Verlängerung der Haarwachstumsphase von Petroselinsäure in der Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung, die mit einer ungesättigten Fettsäure, d.h. Petrosilinsäure, als Wirkstoff formuliert wurde, beobachtet.
Ferner wurde eine ähnliche Wirkung der Verlängerung der Haarwachstumsphase wie bei Petroselinsäure bei von der obi gen Petroselinsäure verschiedenen ungesättigten Fettsäuren beobachtet, weshalb klar ist, dass eine Haarwachstumswirkung in ähnlicher Weise wie in der obigen Ausführungsform bei einer Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase, die mit diesen Pflanzenölextrakten und dgl. als Wirkstoffen formuliert wurde, beobachtet wird.
Gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann eine Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase, die die Wachstumsphase im Haarzyklus durch Fördern des Haarwachstums beibehält oder verlängert, wie im vorhergehenden angegeben bereitgestellt werden.
Die Formulierungen einer Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden als Beispiele angegeben. Die Ergebnisse des Haarwachstums wurden untersucht.
Beispiel II-1: Herstellung einer flüssigen Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase
0,1 % eines getrockneten 70%-Methanol-Extrakts von Koriander wurden gemischt, gerührt und in 90 % 70 % Ethanol, 0,1 Natriumoleat 0,49 % Dodecylbenzolsulfonat, 0,5 % hydriertem Rizinusöl-Ethylenoxid(40 mol)-Addukt und Ionenaustauschwasser (Rest) gelöst. Ionenaustauschwasser (10 %) wurde zugegeben und darin eingemischt, wobei eine flüssige Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase erhalten wurde.
In der Formulierung der flüssigen Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase wurden 0,1 % eines getrockneten 10%-Ethanol-Extrakts von Tuber Ophiopogonis anstelle des 70%-Methanol-Extrakts von Koriander zugegeben, um ein flüssiges Mittel als Kontrolle herzustellen (Vergleichsbeispiel II-1).
Beispiel II-2: Herstellung einer Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase des Emulsionstyps

Bei dem obigen Verfahren zur Herstellung eines Korianderextrakts wurde Ethanol anstelle des 70%-igen Methanols zur Gewinnung eines Extrakts verwendet. Dieser wurde als Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase eines Emulsionstyps mit der folgenden Formulierung verwendet:

Formulierungsbestandteil Menge	(Gew.-%)
(Phase A)
getrockneter Korianderextrakt	1,0
Polyoxyethylen(60 mol)-hydriertes Rizinusöl-Addukt	2,0
Glycerin	10,0
Dipropylenglykol	10,0
1,3-Butylenglykol	5,0
Polyethylenglykol 1500	5,0
(Phase B)
Cetylisooctanat	10,0
Squalan	5,0
Vaseline	2,0
Propylparaben	2,0
(Phase C)
1%-ige wässrige Carboxyvinylpolymerlösung	30,0
Natriumhexametaphosphat	0,03
Ionenaustauschwasser	8,35
(Phase D)
Ionenaustauschwasser	4,5
(Phase E)
KOH	0,12
Ionenaustauschwasser	5,0

<Herstellungsverfahren>
Die Phase A und die Phase B wurden erhitzt, aufgeschmolzen und bei 60 °C gemischt und durch einen Homomischer weiter verarbeitet, wobei ein Gel hergestellt wurde. Die Phase D wurde allmählich dazugegeben und durch einen Homomischer verteilt.
Als nächstes wurde die aufgeschmolzene Phase C dazugegeben, die schließlich aufgeschmolzene Phase E zugegeben und das Gemisch durch einen Homomischer emulgiert, wobei eine Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase des O/W-Emulsionstyps erhalten wurde.
Beispiel II-3: Herstellung einer cremeähnlichen Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase

Gemäß Beispiel II-2 wurde ein getrockneter Ethanolextrakt von Koriander in einer cremeähnlichen Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase der folgenden Rezeptur verwendet:

Formulierungsbestandteil	Menge (Gew.-%)
(Phase A)
Paraffinöl	5,0
Cetostearylalkohol	5,5
Glycerinmonostearat	3,0
EO(20 mol)-2-Octyldodecylether	8,0
Propylparaben	0,3
Duftstoff	0,1
(Phase B)
getrockneter Korianderextrakt	5,0
Glycerin	8,0
Dipropylenglykol	20,0
Polyethylenglykol 4000	5,0

Natriumdodecylsulfat	0,1
Natriumhexametaphosphat	0,005
Ionenaustauschwasser	39,995

<Herstellungsverfahren>
Die Phase A und die Phase B wurden erhitzt, aufgeschmolzen und vermischt und dann durch einen Homomischer emulgiert, wobei eine cremeähnliche Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase erhalten wurde.
Beispiel II-4: Untersuchung der Haarwachstumswirkung einer Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung
Zur Untersuchung der Verhinderung von Haarverlust, der Haarbildungswirkung und anderer Haarwachstumswirkungen der Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein Tricogrammtest an Menschen nach dem folgenden Verfahren durchgeführt. Die Testproben und die Kontrollprobe waren die Zusammensetzungen zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung der Beispiele II-1 bis II-3, die Zusammensetzung von Vergleichsbeispiel II-1 und 70%-iges Ethanol.
Testverfahren
Haarwurzeln von vor der Verwendung der obigen Probe und nach der Verwendung entnommenem Haar wurden unter einem Mikroskop geprüft. Die Zahl der Haarwurzeln von Haar, das zu wachsen aufgehört hatte, d.h. "Haarwurzeln in der Ruhephase", wurden gezählt. Die Änderung des Anteils wurde verwendet, um die Haarwachstumswirkung der Proben zu vergleichen.
Das heißt, die Testproben und die Kontrollprobe wurden zweimal täglich in einer Menge von jedesmal 2 ml kontinuierlich während sechs Monaten auf die Kopfhaut von 10 männlichen Testpersonen aufgetragen. Unmittelbar vor der Auftragung und direkt nach dem Ende der Auftragungen während des Zeitraums von sechs Monaten wurden pro Testperson 100 Haare entnommen. Die Haarwurzeln wurden unter einem Mikroskop geprüft. Ferner wurden praktische Tests hinsichtlich des Zutreffens oder Nichtzutreffens der Haarwachstumswirkung auf die Proben durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser Tests sind in der folgenden Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4
Nach den Ergebnissen von Tabelle 4 wurde eine Haarwachstumswirkung auf der Grundlage der Wirkung einer Verlängerung der Haarwachstumsphase des Wirkstoffs in der Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß der vorliegenden Erfindung beobachtet.
Wie im vorhergehenden erklärt, kann gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase, die die Wachstumsphase im Haarzyklus durch Aktivieren der Proliferation von Follikelepithelzellen verlängert, bereitgestellt werden.

Claims

Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase, die einen Extrakt aus einer Frucht von zu Coriandrum gehörendem Koriander als wirksamen Bestandteil und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger hierfür umfasst.
Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß Anspruch 1, wobei die Menge des wirksamen Bestandteils 500 ppb bis 20 % (bezogen auf das Gewicht), bezogen auf die Gesamtmenge der Zusammensetzung, beträgt.
Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Extrakt mit einem Lösemittel, das aus der aus heißem Wasser, niedrigen Alkoholen, Polyolen und Kohlenwasserstofflösemitteln bestehenden Gruppe ausgewählt ist, extrahiert ist.
Zusammensetzung zur Verlängerung der Haarwachstumsphase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die niedrigen Alkohole aus der aus Methanol, Ethanol, Isopropanol und n-Heptanol bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Verwendung eines Extrakts aus einer Frucht von zu Coriandrum gehörendem Koriander zur Herstellung einer Zusammensetzung, die als Haarwachstumsphasenverlängerungsmittel verwendbar ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Menge des Extrakts 500 ppb bis 20 % (bezogen auf das Gewicht), bezogen auf die Gesamtmenge der Zusammensetzung, beträgt.
Verwendung nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei der Extrakt mit einem Lösemittel, das aus der aus heißem Wasser, niedrigen Alkoholen, Polyolen und Kohlenwasserstofflösemittel bestehenden Gruppe ausgewählt ist, extrahiert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die niedrigen Alkohole Methanol, Ethanol, Isopropanol und n-Heptanol sind.