CZ302225B6 - Substituované 6-anilinopurinové deriváty jako inhibitory cytokinin oxidasy a prípravky obsahující tyto slouceniny - Google Patents

Abstract

Rešení se týká substituovaných 6-anilinopurinových derivátu obecného vzorce I pro použití jako inhibitoru cytokinin oxidasy v zemedelství pri produkci užitkových rostlin a/nebo kosmetice, ve kterých R znamená 1 až 5 substituentu nezávisle vybraných ze skupiny zahrnující vodík, halogen, hydroxyl, amino, C1-C6 alkyloxy a C1-C6 alkylovou skupinu a R2 znamená amino, halogen, nitro, thio nebo C1-C6 alkylthio skupinu.

Description

Substituované 6-anilinopurinové deriváty jako inhibitory cytokinin oxidasy a přípravky obsahující tyto sloučeniny

Oblast techniky

Vynález se týká substituovaných 6-anilinopurinových derivátů, jejich použití jako inhibitoru cytokinin oxidasy a přípravků obsahujících tyto sloučeniny.

Dosavadní stav techniky

V posledních letech jsou 6-substituované aminopuriny považovány za látky se značným biochemickým významem. Některé látky tohoto typu stimulují růst rostlin a jsou řazeny do skupiny růstových regulátorů označovaných cytokininy (Letham, Ann. Rev. Plant. Physiol. 18, 349, 1967). První objevenou molekulou s cytokininovou aktivitou je kinetin (N^-furťuryladenin), který byl původně izolován z autoklávované DNA spermatu sledě (Miller et al. 1955, J. Am. Chem. Soc. 77:1392). Cytokininy blízce příbuzné kinetinu také tvoří modifikované báze RNA (Skoog et al., Science 154:1354, 1966). V tRNA pro šeřin a tyrosin kvasinek, rostlin a živočichů sousedí cytokininy přímo s antikodonem. Některé Nesubstituované adenosiny s cytokinovou aktivitou inhibují růst savčích buněčných kultur (Grace et al., Proč. Am. Assoc. Cancer Res. 8:23,1967).

Cytokininy jsou významné rostlinné hormony regulující mnoho aspektů vývoje rostlin. Současné studie na transgenních rostlinách s pozměněným cytokininovým metabolismem nebo signalingem odhalily zajímavé důsledky cytokininové deficience, či narušení percepce cytokininů (Werner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 98:10487, 2001, Werner et al., Plant Cell 15:2532, 2003; Riefler et al., Plant Cell 18:40, 2006). Modulace hladiny cytokininů jejich exogenní aplikací nebo genetickou regulací endogenních hladin pomocí cytokinin oxidasy/dehydrogenasy (CKX, EC 1.5.99.12), klíčového enzymu degradace cytokininů, již ukázaly své potenciální využití v zemědělství. Exogenní aplikace cytokininů vedla například ke zkrácení období předcházejícímu době kvetení u rajčete (Sawhney and Shukla, Am J Bot 81:1640, 1994), nebo k reverzi samčí sterility u ječmene (Ahokas, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:7605, 1992). Specifická exprese CKX v prašníku a pylu kukuřice byla prezentována jako účinný nástroj k navození samčí sterility pro produkci hybridů u tradičně nesnadno hybridizovatelných plodin (Huang et al., 2003). Současná práce také přinesla poznatky o účasti CKX na regulaci produkce zm u rýže (Ashikari et al., Science 309:741,2005).

V současné době jsme objevili nové generace CKX inhibitorů založené na 2-substituovaných 640 anilinopurinech. Mezi nej slibnější substituenty, ve smyslu přípravy specifických CKX inhibitorů, patří 2-chlor, 2-fluor a 2-amino skupiny.

Předmětem tohoto vynálezu jsou cytokininová analoga mající vylepšenou selektivitu a index účinnosti inhibice cytokinin oxidasy, tzn. jsou méně toxické, avšak účinnější, než dříve známá analoga.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I

-1 CZ 302225 B6

(I), nebo jejich farmaceuticky využitelných solí s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, jakož i jejích adičních solí s kyselinami, ve kterých

R znamená 1 až 5 substituentů nezávisle vybraných ze skupiny zahrnující vodík, halogen, hydroxyl, amino, C1-C6 alkyloxy a C1-C6 alkylovou skupinu,

R2 znamená amino, halogen, nitro, thio nebo C1-C6 aikylthio skupinu, jako inhibitorů cytokinin oxidasy v zemědělství při produkci užitkových rostlin, ve tkáňových kulturách ke stimulaci proliferace a morfogeneze a/nebo v kosmetice.

Výše uvedené dosud nevymezené generické skupiny mají významy uvedené v následující legen15 dě, přičemž amino znamená skupinu -NH₂, halogen znamená atom halogenu vybraný ze skupiny zahrnující atom fluoru, atom bromu, atom chloru a atom jodu, nitro znamená skupinu -NO₂, thio znamená skupinu -SH, alkyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující l až 6 uhlíkových atomů, hydroxy znamená skupinu -OH,

3o alkyloxy znamená skupinu -OR, ve které R je alkyl, přičemž uvedené generické substituentové skupiny mají významy, které jsou identické s definicemi odpovídajících skupin uvedenými v této legendě, aikylthio znamená skupinu -SR, ve které R je alkyl, přičemž uvedené generické substituentové skupiny mají významy, které jsou identické s definicemi odpovídajících skupin uvedenými v této legendě.

Výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce I ze skupiny zahrnující: 2-{chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-anili40 nopurin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-chloranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-chloranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(4-chloranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-fluoranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3fluoranilino)purin, 2-(chIor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(4-fluoranilino)purin,

2-{chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-bromanÍlino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-bromanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino,

-2CZ 30222S B6 nitro, thio, methylthio)-6-(4-bromanilíno)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)6-(3-methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(4methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-ethoxy5 anilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-ethoxyanilino)purin, 2(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(4—ethoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio>-6-(2-aminoanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-aminoanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methy lthio)-6--(4-aminoanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6“ (2-methylanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-methylanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(4~methylanilino)purin, 2(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-hydroxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio) 6-(3-hydroxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-{4—hydroxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio>-6-(2,3-dÍfluoranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)6-(2,4-difluoranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,3,4-trifluoranilino)purin, 2^(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,4,5-trífIuoranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,3-dichloranilino)purin, 2-tchlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,4-dichloranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,4-dimethoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio>-6-(2,3-dimethoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3,4-dimethoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6Ý2,5-dimethoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3,4,5-trimethoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methyl25 thto)-6-(2,4,6-trimethoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6(2,3-dimethylanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,4dimethylanilino)purin, 2-(chtor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthío)-6-(3,4-dÍmethylanilinojpurin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3,5-dimethylanilino)purín, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,3-dihydroxyanilino)purin, 230 (chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,4-dihydroxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,5-dihydroxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3,5-dihydroxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio>-6-(3-hydroxy-2-methylanilÍno)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methyithio)-6—(3—hydroxy-4—methylanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methy lthio)-6-(2-hydroxy-5-methylanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-ó-(3-hydroxy-2-methoxyanilmo)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-hydroxy-4-methoxyanilÍno)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-hydroxy-3-methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-hydroxy-5-methoxyanilmo)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyanilmo)purin, 2-(amino, chlor, fluor, thio, methylthio)-6-(2-chlor—4-methoxyanilino)purin, 2-{amino, chlor, fluor, brom, nitro, thio, methylthio)-6-(2-chlor-5-methoxyanilÍno)purin, 2-{chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-chlor-3-methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-brom-3-methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-methoxy-3-chloranilino)purin, 2~(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio )-6“(2-methoxy-4-chloranilino)purin, ajejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, a jejich použití jako inhibitorů cytokinin oxidasy v zemědělství při produkci užitkových rostlin, ve tkáňových kulturách ke stimulaci proliferace a morfogeneze a/nebo v kosmetice.

-3CZ 302225 B6

Mimořádně výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou substituované 6-anilinopurinové deriváty zahrnující: 2-(chior, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-methoxyaniHno)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-hydroxy-3-methoxyanílino)purin, 2-{chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-chlor-3-methoxyanilino)purin, 2-( chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-brom-3-methoxyanilino)purín, 2(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(4-hydroxyanilino)purin, ajejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, ajejich použití jako inhibitorů cytokinin oxidasy v zemědělství při produkci užitkových rostlin, ve tkáňových kulturách ke stimulaci proliferace a morfogeneze a/nebo v kosmetice.

Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy v zemědělství, zejména pro zvýšení výnosu a kvality zemědělských produktů.

Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I pro přípravu prostředku pro použití jako inhibitoru cytokinin oxidasy v tkáňových kulturách ke stimulaci proliferace a morfogeneze.

Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy v kosmetice pro zpomalení senescence lidských pokožkových buněk, například fibroblastů a keratinocytů.

Předmětem vynálezu je použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy při produkci užitkových rostlin, s výhodou u obilovin (pšenice, ječmen, rýže, kukuřice, žito, oves, ěirok a další druhy), řep (cukrová a krmná řepa); malvic, peckovic a bobulovin (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, jahody, maliny a ostružiny); vikvovitých rostlin (bob, čočka, hrách, sója); olejnin (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokos, Ricinus, kakaový bob, podzemnice olejná); lilkovitých rostlin (dýně, okurky, melouny); přidaných rostlin (bavlna, len, konopí, juta); citrusů (pomeranče, citrony, grapefruity, mandarinky); zeleniny (špenát, skořice, kafr) nebo rostlin jakými jsou tabák, ořešák, baklažán, cukrová třtina, Čajovník, réva vinná, chmel, banány a přírodní kaučukovnikové a léčivé rostliny stejně tak jako okrasné rostliny. Plodiny zahrnují ty, které poskytuji toleranci vůči třídám růstových faktorů konvenčním křížením nebo metodami genetického inženýrství. Plevely, jejichž růst může být kontrolován zahrnují jak jednoděložné tak dvouděložné druhy, například Stellaria, Nasturtium, Agrostis, Digitaria, Avena, Setaria, Sinapis, Lolium, Solárium, Echinochloa, Scirpus, Monochoria, Sagittaria, Bromus, Alopecurus, Sorghum halepense, Rottboellia, Cyperus, Abutilon, Sida, Xanbthium, Amaranthus, Chenopodium, Ipomoena, Chrysanthemum, Galium, Viola a Veronica.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou používány v nemodifikované formě, nebo s výhodou společně s pomocnými látkami běžně využívanými v přípravcích. Jsou přednostně používány koncentráty aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze a disperze, ředěné emulze, rozpustné prášky, prach, granuláty, krémy, gely, olejové suspenze a rovněž enkapsulované produkty, např. polymemí substance. Ve vztahu k typu přípravku je určena i metoda aplikace, například sprejování, atomizace, poprach, rozptyl, nátěr a polévání, která je zvolena ve vztahu k předurčenému použití a převažujících okolnostech. Přípravky mohou být sterilizovány anebo obsahují další přídavné látky neutrální povahy, například konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, hnojivá, či donory mikrohnojiv nebo další přípravky za účelem získání speciálních účinků.

-4CZ 302225 B6

Sloučenina obecného vzorce I může být smíchána s dalšími růstovými regulátory za účelem dosažení synergického účinku.

Přípravky

Přípravky obsahující sloučeniny obecného vzorce I (aktivní látky), a pokud je třeba, jednu nebo více pevných nebo kapalných pomocných látek, jsou připraveny známými způsoby, například smísením nebo mletím účinné látky s pomocnými látkami, jako jsou např. rozpouštědla nebo pevné nosiče. Do přípravků mohou být přidávány povrchově aktivní látky (surfaktanty).

V závislosti na povaze sloučeniny obecného vzorce I, která má být formulována, vhodné povrchově aktivní látky jsou neiontové, kationtové a/nebo aniontové povrchově aktivní látky ajejich směsi mající dobré emulzifikační, dispergační a zvlhčovači vlastnosti.

Příklady vhodných aniontových, neiontových a kationtových smáčedel jsou shrnuty například ve WO 97/34485.

Pro přípravu formulací obsahujících inhibitory cytokinin oxidasy na bázi substituovaných 6anilinopurmových derivátů jsou podle toho vynálezu používána smáčedla konvenčně používaná při přípravě technologii přípravků, která jsou popsána, např. v „McCutcheons Detergents and Emulsifiers Annual“ MC Publishing Corp., Ridgewood New Jersey, 1981, Stache, H., „TensidTaschenbuch“, Caři Hanser Vertag, MunichNienna, 1981 and M. and J. Ash, „Encyclopedia of Surfactants“, Voll-111, Chemical Publishing Co., New York, 1980-81.

Formulace přípravku s inhibitorem cytokinin oxidasy obsahuje váhově od 0,1 do 95 % aktivní látky, přičemž obsahují od 5 do 99,9 % směsi přísad či farmaceutických nosičů a to v závislosti na způsobech aplikace a obsahují váhově i od 0,1 do 25 % smáčedla.

Ačkoliv jsou komerční produkty obvykle připravovány ve formě koncentrátů, konečný uživatel upotřebí neředěný přípravek. Kompozice může proto obsahovat i další přísady, jakými jsou stabilizátory, např. rostlinné oleje nebo epoxidizované rostlinné oleje (epoxidizovaný palmový olej 0;l, řepkový nebo olivový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo emulgátory, vískozitní činidla, pojivá, lepidla, a také hnojivá a další aktivní přísady. S výhodou jsou využívány přípravky následujícího složení: (% = hmot35 nostní procento).

Emulgované koncentráty:

směs aktivní přísady: 1 až 90 %, s výhodou 5 až 20 % smáčedlo: 1 až 30 %, s výhodou 10 až 20 % kapalný nosič: 5 až 94 %, s výhodou 70 až 85 %

Prášky:

směs aktivní přísady: 0,1 až 10 %, s výhodou 0,1 až 5 % pevný nosič: 99,9 až 90 %, s výhodou 99,9 až 95 %

Suspenzní koncentráty:

směs aktivní přísady: 5 až 75 %, s výhodou 10 až 50 % voda: 94 až 24 %, s výhodou 88 až 30 % smáčedlo: 1 až 40 %, s výhodou 2 až 30 %

-5CZ 302225 B6

Smáčí vé prášky:

směs aktivní přísady: 0,5 až 90 %, s výhodou 1 až 80 % smáčedlo: 0,5 až 20 %, s výhodou 1 až 15 % pevný nosič: 5 až 95 %, s výhodou 15 až 90 %

Granule:

směs aktivní přísady: 0,1 až 30 %, s výhodou 0,1 až 15 % io pevný nosič: 99,9 až 70 %, s výhodou 99,9 až 85 %

Kompozice mohou rovněž obsahovat další příměsi, jakými jsou stabilizátory, například vegetativní oleje nebo epoxidízované vegetativní oleje (epoxidisovaný kokosový olej, řepkový opek nebo sojový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační látky, regulátory viskozity, is pojivá, zahušťovadla, a také hnojivá a další aktivní látky. Pro použití sloučenin obecného vzorce

I, nebo kompozic je obsahujících, při ochraně rostlin před škodlivým vlivem růstových regulátorů se používají rozdílné metody a technologie, kterými jsou například následující:

i) Obalování osiva

a) Obalování osiva smáčivou práškovou formulací sloučeniny obecného vzorce I, a to mícháním v nádobě až do stejnorodé distribuce na povrchu semen (suché obalování). Při takové proceduře je přibližně 1 až 500 g sloučeniny obecného vzorce I (4 g až 2 kg smáčivého prášku) používáno na 100 kg osiva.

b) Obalování osiva emulzifikovaným koncentrátem sloučeniny obecného vzorce I v souladu s metodou a) (mokré obalování).

c) Obalování osiva cestou máčení semen po dobu 1 až 72 h v tekutině obsahující od 100 do

1000 ppm sloučeniny obecného vzorce I, a s výhodou následného usušení semen (imerzní obalování).

Obalování semen nebo ošetření klíčících semen jsou upřednostňovanou metodou aplikace, protože ošetření aktivní látkou je určeno cílovou plodinou. Obecně jsou antidota používána od 1 do 1000 g, s výhodou od 5 do 250 g, na 100 kg semen, avšak v závislosti na metodice, která rovněž umožňuje přidání dalších aktivních látek nebo mikroživin; určené koncentrační limity se mohou pohybovat nahoru nebo dolů (opakované obalování).

ii) Aplikace cisternové směsi

Kapalná formulace směsi růstového regulátoru a antidota je používána ve váhovém poměru jednoho k druhému od 10:1 do 1:100, rychlost aplikace růstového regulátoru od 0,005 do 5,0 kg na hektar. Taková cisternová aplikace směsi se provádí před anebo po setí.

iii) Aplikace do semenné brázdy

Sloučenina obecného vzorce I je zavedena do otevřené brázdy oseté semenem ve formě emulzifikovaného koncentrátu, smáčivého prášku nebo granulí. Jakmile je semenná brázda zaklopena, je růstový regulátor aplikován cestou obvykle používanou při preemergentním procesu.

iv) Kontrolované uvolňování aktivních látek

Sloučeniny obecného vzorce I jsou aplikovány v roztoku k minerálním granulovaným nosičům nebo polymerizovaným granulím (močovina, formaldehyd) a jsou vysušeny. V případě, že je to

-6CZ 302225 B6 žádoucí, tak se provádí obalování, které umožňuje postupné uvolňování látky v měřitelných množstvích po určitou specifickou periodu (obalované granule).

Kosmetické kompozice obsahují od přibližně 0,05 % (w/w) do 10 % (w/w) aktivní látky, s výho5 dou od 0,1 % (w/w) do 2 % (w/w). Kosmetické kompozice jsou ve formě krému, aerosolu, pleťové vody, roztoků, náplastí, obkladu, šampónu, rtěnky, pasty, krému, tinktury, spreje, atd.

Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70 %, ale přednostně 20 až 50 % vody nebo vodné fáze. Tukovou fází tvoří uhlovodíky, například vazelína, parafinový olej nebo io tvrdé parafiny, které přednostně obsahují vhodné hydroxysloučeníny jako mastné alkoholy a jejich estery, například cetyl alkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin pro zlepšení kapacity pro vázání vody. Emulgátory jsou odpovídající lipofilní sloučeniny jako sorbitanové estery mastných kyselin (Spaný), s výhodou sorbitan oleát nebo sorbitan isostearát. Aditiva k vodné fázi jsou například smáčedlajako polyalkoholy, například glycerol, propylen glykol, sor15 bitol a polyethylenglykol, nebo konzervační prostředky či příjemně vonicí látky.

Mastné masti jsou nevodné a obsahují jako bázi hlavně uhlovodíky, například parafin, vazelínu nebo parafinový olej, a dále přírodní nebo semisyntetické tuky, například hydrogenované kokosové triglyceridy mastných kyselin nebo hydrogenované oleje, například hydrogenovaný ricínový olej nebo olej z podzemnice olejné, a dále částečné glycerolové estery mastných kyselin, například glycerol mono- a distearát. Dále obsahují například mastné alkoholy, emulgátory a aditiva zmíněná v souvislosti s mastmi, která zvyšují příjem vody.

Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50 % vody. Používané olejové báze jsou mastné alkoholy, například isopropyl myristát, lanolin, včelí vosk, nebo uhlovodíky, s výhodou vazelína (petrolátum) a parafínový olej. Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, například estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethylenoxy adukty, například polyglycerických mastných kyselin nebo polyethylen sorbitanové estery či kyselé estery polyglycerických mast30 ných kyselin (Tween), dále polyoxyethylenové estery mastných alkoholů nebo polyoxyethylenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátory, jako alkalické soli sulfátů mastných alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, cetylsulfát sodný nebo steaiylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetyl stearyl alkoholu nebo stearyl alkoholu. Aditiva k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrání krémy před vyschnu35 tím, například polyalkoholy jako glycerol, sorbitol, propylenglykol a polyethylenglykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonicí látky.

Pasty jsou krémy nebo masti obsahující práškové složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, například oxidy titanu nebo oxid zinečnatý, a dále talek či silikáty hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci.

Olejové suspense obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8 až 22, s výhodou pak 12 až 22 uhlíkových atomů, například kyselin laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, například kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linolenovou, případně s přídavkem antioxidantů, například vitaminu Ε, βkarotenu nebo 3,5-di-terí-butyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá více než 6 uhlíkových atomů a je mono- nebo polyhydrická, například mono, dinebo trihydrické alkoholy jako methanol, ethanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich izomery, ale hlavně glykol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou například ethyl oleát, isopropyl myristát, isopropylpalmitát, „Labrafil M 2375“ (polyoxyethylen glycerol trioleát, Gattefoseé, Paříž), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené potyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složený z glyceridů a esterů polyethylenglykolu; Gatte-7CZ 302225 B6 foseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylenglykolu; Gattefoseé, Paříž), „Miglyol 812“ (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce C$ až C₁₂ od Hiils AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sezamový olej, sójový olej a olej z podzemnice olejné.

Pěny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako chlor-fluor nižší alkany, např. dichlorfluormethan a dichlortetrafluorethan, nebo přednostně nehalogenované io plynné uhlovodíky, vzduch, N₂O či oxid uhličitý. Používané olejové fáze jsou stejné jako pro masti a také jsou používána aditiva tam zmíněná.

Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-ethanolickou bázi, ke které jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování jako jsou polyalkoholy, například glycerol, glykoly a póly ethy leníš glykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethylenglykolů, tj. lipofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže ethanolem, a pokud je to nutné, i ostatní neutrální látky a aditiva.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje obnovení přirozeného fenotypu po systematické aplikaci látky 12 na CKX nadprodukující rostliny. + znamená ošetřeno, - neošetřeno.

Obr. 2 ukazuje srovnání účinku cytokininu a CKX inhibitoru na obnovení přirozeného fenotypu AtCKXl semenáčků Arabidopsis. (A) AtCKXl, (B) AtCKXl kultivované na 0,1 μΜ látce 12, (C) AtCKXl kultivované na 0,1 μΜ BAP, (D) kontrolní rostlina s přirozeným fenotypem.

Obr. 3 znázorňuje účinek látky 12 na kvetení rostlin Arabidopsis.

Obr. 4 znázorňuje vliv 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino) purinu na adherenci buněk. Hodnoty uvedeny relativně vzhledem ke kontrole.

Obr. 5 znázorňuje vliv 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purinu na viabilitu buněk po 3 dnech.

Hodnoty uvedeny relativně vzhledem ke kontrole.

Obr. 6 znázorňuje růstovou křivku lidských diploidních fibroblastů BJ ovlivněných 2-chlor-6(4-hydroxyani 1 ino)purinem,

Obr. 7 ukazuje počet buněk po 7 a 14 denním působení 2-chlor-6-(4—hydroxyani lino)purinu. Hodnoty uvedeny relativně vzhledem ke kontrole.

Příklady provedení vynálezu

Výchozím materiálem pro přípravu sloučenin obecného vzorce I je 2,6-chlorpurin. Dalším výchozím materiálem je 2-amino-ó-chlorpurin nebo 2-fluor-6-chlorpurin, který je možné buď připravit z 2-amino-6-chlorpurinu reakcí s kyselinou tetrafluorboritou v přítomnosti vodného roztoku dusičnanu sodného (Beach et al., 1992). Další výchozí materiál, 2-brom-6-chlorpurin, je možné připravit z 2-amino-6-chlorpurinu diazotací s t-butylnitritem a následnou bromací za přítomnosti vhodného donoru bromu (Kim Hak Sung et al.; J. Med. Chem. 46; 23; 2003; 49744987). Další výchozí materiál může být ještě 2-methyl-6-chlorpurin, který je možné připravit z 6-chlor-2-jodpurinu Střílovým cross couplingem (Kim et al., 2003). Dalším výchozím materiálem může ještě být 2-nitro-6-chlor-9-Boc-purin, který je možné připravit z 6-chlorpurinu (Rodenko et al.; J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 5957-5963).

-8CZ 302225 B6

Výchozí substituované fenylaminy, které nebyly komerčně dostupné (ostatní získány od Sigma Aldrich nebo Fluorochem), byly připraveny zodpovídajících aldehydů v přítomnosti katalyzátoru. Ty, které mají více hydroxy skupin, mohou být s výhodou připraveny demethylací odpovída5 jících methoxyderivátů 48% HBr v Ň₂ atmosféře.

Elementární analýzy (C, H a N) byly měřeny na EA1108 CHN analyzátoru (Fissons Instruments). Na zjišťováni teploty tání byl použit přístroj BÚCHI Melting Point B-540. Analytická tenkovrstvá chromatografie (TLC) byla prováděna na destičkách silikagelu 60 WF254 (Merck), v mobilní fázi CHCl₃:MEOH:konc. NH4OH (8:2:0,2, v/v/v). ES+ hmotová spektra byla naměřena za použití přímého nástřiku na Waters ZMD 2000 hmotovém spektrometru. Hmotnostní interval při měření byl 10 až 1500 u. Spektra byla měřena za použití cyklických skenů o délce 3,0 sekundy, při napětí na vstupní štěrbině 25 V a teplotě vypařovacího bloku 150 °C, desolvataČní teplotě 80 °C a průtoku desolvatačního plynu 200 1/hodinu. Získaná data byla zpracována pomocí pro15 gramu MassLynx data systém. NMR spektra byla měřena na přístroji Bruker Avance AV 300 při teplotě 27 °C a frekvenci 300,3 MHz (*H) respektive 75,48 MHz (*³C). Vzorky byly připraveny rozpuštěním daných látek v DMSO-d*. Tetramethylsilan (TMS) byl použit jako interní standard.

Příklad 1

2-Chlor-6—anilinopuritt

Anilin (4,66 g; 0,05 mol) byl přidán do suspenze 2,6-dichlorpurinu (5,67 g; 0,03 mol) v n-propa25 nolu (60 ml) a N,N-ethyldiisopropylaminu (6,44 g; 0,05 mol). Reakční směs byla míchána při 100 °C po 4 hodiny. Po ochlazení na pokojovou teplotu byl vzniklý precipitát zfiltrován, promyt n-propanolem (2x 10 ml) a vodou (3x 10 ml) a vysušen při 60 °C do konstantní váhy. Výtěžek: 6,26 g nažloutlé pevné látky (84,9 %). TLC (chloroform-methanol; 85:15): žádné nečistoty; bez výchozích látek, HPLC čistota: 98+ %.

Příklad 2

2-Chlor~6-(3-cMoranilino)purin

2,6-Díchlorpurin (3,78 g; 0,02 mol) byl smíchán s 3-chloranilinem (3,83 g; 0,03 mol) v nbutanolu (40 ml) v přítomnosti triethylaminu (7 ml; 0,05 mol) při 110 °C 3 hodiny. Po ochlazení na pokojovou teplotu byla reakční směs míchána při 0 °C 2 hodiny. Žlutý precipitát byl zfiltrován, promyt chladným n-butanolem (2x 10 ml), vodou (3x 10 ml) a vysušen pri 60 °C do konstantní váhy. Výtěžek: 3,69 g žlutý krystalický prášek (65,8 %). Surový produkt byl rekrystalizován v isopropanolu a poskytl 2,85 g čisté látky. TLC (chloroform-methanol; 85:15): žádné nečistoty; bez výchozích látek. HPLC čistota: 98+ %.

Příklad 3

2-Chlor-6-(3-fluoranil ino)purin

Látka byla připravena, jak je popsáno v příkladu 2, reakcí 2,6-dichlorpurinu s 3-fluoranilinem. 50 Reakční směs byla následně odpařena na rotační vakuové odparce, zbytek byl rozdělen mezi ethylacetát a 0,5M HCL Organická vrstva byla promyta vodou, vysušena MgSO₄, a odpařena s výtěžkem žluté pevné látky (3,72 g). Surový produkt byl přečištěn flash chromatografií. Výtěžek: 2,20 g žlutého krystalického prášku. TLC (chloroform-methanol; 85:15): homogenní. HPLC čistota: 98+ %.

-9CZ 302225 B6

Příklad 4

2~Chlor-6-(3-hydroxyanilino)purin

Tato látka byla připravena reakcí 2,6-dichlorpurinu (3,78 g; 0,02 mol), 3-amínofenolu (3,27 g; 0,03 mol), a N,N-ethyldiisopropylaminu (6,44 g; 0,05 mol) v n-butanolu (40 ml) při 90 °C 4 hodiny. Reakční směs pak byla míchána při pokojové teplotě a vzniklá krystalická sraženina, promyta chladným n-butanolem (3x 10 ml), vodou (3x 10 ml), byla následně vysušena do konstantní váhy.

TLC (chloroform-methanol; 85:15): homogenní. HPLC čistota: 98+ %

Příklad 5

2~Chlor-6-(3-methoxyanilino)purin

Do suspenze 2,6-dÍchlorpurinu (3,78 g; 0,02 mol) a m-anisidinu (3,69 g; 0,03 mol) v n-pentanolu (40 ml), byl přidán triethylamin (7 ml; 0,05 mol). Reakční směs byla míchána při 100 °C 4 hodiny a následně ochlazena na pokojovou teplotu. Bílá sraženina byla po odsátí promyta isopropanolem (2x 10 ml) a vodou (3x 10 ml). Surový produkt byl rekrystalován z methanolu s aktivním uhlím za vzniku bílých kiystalů. Výtěžek: 4,36 g (77,8 %). TLC (chloroform-methanol; 85:15): žádné nečistoty, neobsahuje výchozí látky, HPLC čistota: 98+ %.

Tabulka 1

Látky připravené způsobem podle příkladu 1-5

SUBSTITUENT PURINU	CHN ANALÝZY	MS ANALÝZA-ZMD
	R6	R2	[%]	[M-H]' a)	[M+H]+b)
1	anilino	chlor	053,5, Η-3ΛΝ-28.6	244	246
2	2-chloranilino	chlor	046,8; H«2.9;N24,7	278	280
3	3-chloranilino	chlor	C-46,8; H-2,9; N-24,6	278	280
4	4-chioranitino	chlor	C-46,9; H-3,0; N-24.7	278	280
s	2-fluoranilino	chlor	049,9; H-3,0; N-26,5	262	264
ti	3-fluoranilitK)	chlor	049,7; H-3,0; N-26,7	262	264
7	4-fluoranilino	chlor	049.8; H-3,1; N-26,4	262	264
8	2-hydroxy anilino	chlor	049,7; H-3, l; N-26,7	260	262
9	3-hydroxy anilino	chlor	049,9; H-3,2; N-26,7	260	262
10	4-bydroxyanilino	chlor	050,5; H-3,1; N-26,8	260	262
11	2-methoxyanilino	chlor	051,4; H-3,8;N-2S,5	274	276
12	3-methoxyanilino	chlor	051,8, H=3,8, N-25,2	274	276
13	4-methoxyani! ino	chlor	052,0; H-3,7; N-25,2	274	276
14	2-aminomilino	chlor	050,5; H-3,2; N=32,8	259	261

- 10CZ 302225 B6

15	3-aminoanilino	chlor	050,6, H-3,2; N-32,5	259	261
1«	4-aminomílino	chlor	050,4; H-33; N-32.3	259	261
17	3,4-dimetboxyanilino	chlor	OSl,3;H-3,9;N-23,3	304	306
18	2,5-dÍntethaxyanilino	chlor	OSU; H-4,0;N-23^	304	306
19	3,4,5-trí methoxyanilino	chlor	C-49,9;H-4^;N-21,0	334	336
2«	3,4-di hydroxy anilino	chlor	047,2; H2,8; N-25,5	276	278
21	2,5-dihydroxyanilino	chlor	047,3; H—2,8, N-25,6	276	278
22	2-chlor-5-methoxyanilino	chlor	Ο46Λ H-2,9;N“22,7	308	310
23	2<hlor-3-mctlnxyaailifio	chlor	C=46,4;H-2,9;N-22,7	308	310
24	2-brom - 3-methoxyanilino	chlor	040,8; H-2,5;N-19,4	353	355
25	2-methoxy-3-chloranilino	chlor	046,4; H-3,0;N-22,6	308	310
26	3-ethoxyanilino	chlor	053,8; H-4,l;N-243	288	290
27	2-tiydroxy-S-tnethylamlino	chlor	051,9; H=3,6; N*=25,7	274	276
28	34iyd(oxy-4-methyIuiilino	chlor	C«52,l,H»3,7;N-25,5	274	276
29	3-hydiDxy-2-methyIaniiino	chlor	052,1; H-3,8; N-25,4	274	276
30	3,4-dimethylanilino	chlor	056,8; H«4,l;N-25,7	272	274
31	2-hydroxy-3-methoxyanilino	chlor	C-49,3 H—3,6; N—24,3	290	292
32	2-hydroxy-4-methoxyaniliiio	chlor	C=49,2; H-3,7; N’24,7	290	292
33	4-hydroxy-3,S-dimethaxyanilino	chlor	048,2; H-3.6;N“2l,9	320	322
34	23-difluoranilino	chlor	046,6; H=2,0;N=25,l	280	282
35	2,4-difluoranilino	chlor	046,7; H-2,0; N=25,l	280	282
36	2^,4-trifluoranilino	chlor	O43,6;H-1,6;N*23,7	280	282
37	2.4,5-trifluoranilíno	chlor	043,8; H-1,6; N-23,6	280	282
38	23-dichJoianilino	chlor	0423; H*=2,0; N-22,0	312	314
39	2,4-dichloranilino	chlor	042,0; H-2,0;N-223	312	314

Příklad 6

2-Amino-6-(3-methoxyanil inojpurin

Do suspenze 2-amino“6-chlorpurinu (1,69 g; 0,01 mol) a m-anisidínu (1,23 g; 0,01 mol) vnio butanolu (20 ml) byl přidán triethylamin (3,5 ml; 0,025 mol). Vzniklá hustá suspenze byla míchána 3 hodiny při 110°C. Když TLC potvrdilo absenci výchozích látek a přítomnost produktu, reakce byla následně ochlazena na pokojovou teplotu. Bílá sraženina byla odfiltrována, promyta n-butanolem (3x 10 ml), vodou (3x 10 ml) a vysušena do konstantní váhy. Výtěžek: 2,19 g (85 %). Surový produkt byl přečištěn jako hydrochlorid krystalizaci z 2,5M roztoku HCI 15 v methanolu za vzniku 2,17 g téměř bílých krystalů hydrochloridu. TLC (chloroform-methanolNH4OH: 4:1:0,05): žádné nečistoty, neobsahuje výchozí látky. HPLC čistota: 99+ %.

-11 CZ 302225 B6

Tabulka 2

Látky připravené způsobem podle příkladu 6

SUBSTITUENT PURINU	CHN ANALÝZY	MS ANALÝZA-ZMD
	R6	R2	[%]	[M-H] a)	[M+H]+b)
64	anilíno	amino	058,2; H-4,4; N-37,5	225	227
65	2-chloranilino	amino	0507; H-3 7; N-32,9	259	261
66	3-chloranilino	amino	OSO,5; H-3,4; N-32,6	259	261
67	4-chloranilino	amino	050,S; H-3,4; N-32,5	259	261
68	2-fluoraniIino	amino	053,8; H-3,7;N-34,7	243	245
6»	3-fluoranilino	amino	053,9; H-3,6; N-34,8	243	245
70	4-fluoranilino	amino	054,0; Η-3ΛΝ-34.5	243	245
71	2-hydroxyanilino	amino	O54,0;H-4,l;N»34,9	241	243
73	3-hydn>xy aniline	amino	C-54,1; H-4,2; N-34,8	241	243
73	4-hydroxy anilíno	amino	054,4; H-47.N-34.7	241	243
74	2-methoxyanilino	amino	055,9; H-4.7; N-33,0	255	257
75	3-methoxyanilino	amino	056,0; H-4,8; N-32,9	255	257
76	4-methoxyanilino	amino	056,3; H-4,7; N-32,9	255	257
77	3,4-dimethyIanilino	amino	O51,0;H-57;N-33,4	253	255

io Příklad 7

2-Fluor-6-(3-methoxyaniiino)purin

Látka byla připravena reakcí 2-fluor-6-chlorpurinu (1,7 g; 0,01 mol), m-anisidinu (1,23 g; 15 0,01 mol) a triethylaminu (3,5 ml; 0,025 mol) v n-butanolu (20 ml) při 90 °C po dobu 4 hodin.

Reakční směs byla následně ochlazena na pokojovou teplotu a vzniklá bílá sraženina byla odsáta, promyta n-butanolem (3x 10 ml), vodou (3* 10 ml) a vysušena do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 5,55 g (61 %) nažloutlého krystalického prášku. TLC (chloroform-methanol; 85:15): žádné nečistoty. HPLC čistota: 99+ %.

- 12CZ 302225 B6

Tabulka 3

Látky připravené způsobem podle příkladu 7

SUBSTITUENT PURINU	CHN ANALÝZY	MS ANALÝZY-ZMD
	R6	R2	[%]	[M-H]' a)	[M+H]+b)
40	anilino	fluor	057,6; H-3,5; N-30,7	228	230
41	2-chloranilino	fluor	049,7, H-2,7; N-26,8	262	264
42	3-chloranilino	fluor	Č-49.9;H-2.7;N*26,7	262	264
43	4-chloranilino	fluor	050,0, H-2,7; N-26,7	262	264
44	2-fluoranilino	fluor	053,4; H-2,7; N-28,5	246	248
45	3-fluorantlino	fluor	053,3; H-2,7; N-28,5	246	248
46	4-fluoranilino	fluor	053,4; H—2,8;N-28,4	246	248
47	2-hydroxy anilino	fluor	053,0; H-3,4; N-28J	244	246
48	3-hydroxyanilino	fluor	053,4; H-3,4; N-28,2	244	246
49	4-hydroxy anilino	fluor	053,9; H-3J; N-28,5	244	246
50	2-fnethoxyanilino	fluor	C=54,7; H-4,l;N-27,0	258	260
51	3-mcthoxyanilino	fluor	055,1; H-4,0; N-26,9	258	260
52	4-methoxyanilino	fluor	055,0, H—4,0; N—27,4	258	260
53	3,4-dimethoxyanilino	fluor	053,7; H-3,9; N-24,8	288	290
54	2,5-dimethoxyanilino	fluor	C-53,6; H-4,0; N-24,5	288	290
55	3,4-dihydroxy anilino	fluor	050,2; H-3,0; N-27,3	260	262
5«	2,5-dihydroxy anilino	fluor	C-502; H-3,0; N-272	260	262
57	2-chlor- 5-methoxyanilino	fluor	049,0; H—3,1; N-24,0	292	294
50	2-methoxy-3-chloranilino	fluor	048,0; H-3,0; N-24,0	292	294
59	3-ethoxyanilino	fluor	056,8; H-4AN-26.0	272	274
60	2-hydroxy-5-methy1anilino	fluor	055,2; H-3.8; N-27Z	258	260
61	3-hydroxy-4-methylanilino	fluor	0553; H-3,8; N-27,2	258	260
62	3-hydroxy-2-methylanilioo	fluor	055,3, H-3,9. N-27,0	258	260
63	3,4-dimethylanilno	fluor	060,4; H-4,6; N=27,4	256	258

Příklad 8 io

2-Thioxanthin

4,5-Diamino-ó-hydroxy-2-thiopyrimidin (lOOg) byl refluxován s 90% kyselinou mravenčí (500 ml) dvě hodiny za mechanického míchání. Po ztuhnutí směsi bylo přidáno dalších 100 ml kyseliny mravenčí. Směs ochlazena na l°C a surový 4-amino-5-formamido-6-hydroxy-2thiopyrimidin byl následně odfiltrován a vysušen pod vakuem. Filtrační koláč byl resuspendován ve formamidu (225 ml) a zahříván na teplotu 175 až 185 °C v parafinové lázni po dvě hodiny za občasného míchání. Směs byla následně ochlazena na pokojovou teplotu, znovu zfiltrována, promyta dvěma litry IM NaOH a vysušena dvě hodiny při teplotě 95 °C. Výtěžek 103 g (97 %),

- 13CZ 302225 B6

Příklad 9

2-Benzylthio-6-purinol

5,28 gramů 8-thioxanthinu bylo resuspendováno v 78,5 ml ÍM NaOH, naředěno vodou na celkový objem 400 ml. (Výchozí látka se zcela nerozpustí ani po přidání 2,5-násobku báze). Následně bylo přidáno 3,7 ml benzy leh loridu a směs byla silně míchána po dobu 3 hodin při pokojové teplotě, pak upraveno pH na 5 pomocí ledové kys. octové. Vznikla červená sraženina, jo která byia odsáta, promyta důkladně vodou a vysušena přes noc ve vakuu 80 °C. Takto bylo získáno 7,33 g růžové pevné látky, která byla použita do následující reakce bez dalšího přečištění.

Příklad 10

2-Benzylthio-6~chiorpurin

K 2-benzylthioxanthinu (27,6 g, 0,107 mmol) byl přidán POCU (506 ml) a N,N-diethylanilin (40 ml). Směs byla refluxována 1,5 hodiny a přebytek POCI3 byl odstraněn odpařením ve vakuu.

Výsledný sirup byl smíchán s ledem (2 kg) a za přidání hydroxidu sodného a chlazení vznikla pevná látka. Směs byla následně okyselena pomocí koncentrované HCI na pH 1 a vzniklá pevná látka byla odsáta, promyta vodou a vysušena několik hodin při teplotě 70 °C. Surový produkt, na prášek rozmělněný, byl smíchán s malým množstvím methanolu a žlutá pevná látka byla vysušena ve vakuu při 70 °C. Výtěžek 17,5 g (59 %). Surový 2-benzylthio-6-chlorpurin, stejně jako 2-benzylthioxanthin, je dobře rozpustný v DMSO. TLC (chloroform-methanol; 95:5): bez výchozích látek. Surový produkt byl čištěn kolonovou chromatografii (125 g šilika) a eluován 2,5 % MeOH/chloroform. Z frakcí (100 ml) 7 až 36 byla odpařením získána žlutá pevná látka, která byla následně rekry statována z 50% methanolu. Byla získána bílá krystalická látka a vysušena do konstantní váhy při 45 °C (chloridem vápenatým a následně oxidem fosforečným přes noc). Výtěžek: 3 g. Teplota tání 176 až 178 °C, bez rozkladu. TLC (SILICA-5% MeOH/chloroform). HPLC čistota*. 95+ %.

Příklad 11

2-Benzylthio-6-anilinopurin

2-Benzylthio-6-chlorpurin (3,9 g) a anilin (3,42 g) byl refluxován v n-BuOH (100 ml) za 40 přítomnosti triethylaminu (7,5 ml) 2 h. Reakční směs byla následně ochlazena na pokojovou teplotu, odpařena do sucha na rotační vakuové odparce, znovu ochlazena ledem a přidáno 400 ml vody za silného třepání. Při stání přes noc pri -16 °C vznikl tmavohnědý surový produkt, který byl následně vysušen do konstantní váhy a přečištěn preparativní kolonovou chromatografií (100 g silika). Kolona byla promyta chloroformem a 500 ml x 1,25% MeOH/chloroform, nás45 ledně eluována 1,51 x 2,5% MeOH/chloroform. Frakce (100 ml) 12 až 15 byly odpařeny do sucha za vzniku světle hnědého produktu, který byl rekry stal izován z methanolu za přítomnosti aktivního uhlí. Výtěžek: 1,18 g bílé amorfní látky. TLC (2,5% MeOH/chloroform) žádné nečistoty. HPLC čistota: 98+ %.

- 14CZ 302225 B6

Příklad 12

2~Thio-6~anilinopurin

2-Benzylthio-6-anÍlinopurin (1,18 g) byl rozpuštěn v tekutém amoniaku (125 ml). Do vzniklého roztoku byl následně přidáván sodík po malých částech do vzniku stabilního modrého zabarvení. V dalším kroku bylo pak přidáno malé množství chloridu amonného a tak odstraněn přebytek sodíku. Po zredukování objemu byl přidán ether (125 ml) (k odstranění vedlejších produktů), io Po odstranění zbytku amoniaku byla reakční směs extrahována vodou (2x 65 ml). pH vodné frakce bylo následně upraveno pomocí kys. octové na 5 a roztok ochlazen suchým ledem pod

-10 °C, za vzniku pevné látky krémové barvy. Produkt byl zfíltrován, promyt důkladně vodou a vysušen přes noc nad chloridem vápenatým. Výtěžek: 760 mg téměř bílého prášku. TLC: žádné nečistoty. HPLC čistota: 95 %.

Tabulka 4

Látky připravené způsobem podle příkladu 12

SUBSTITUENT PURINU	CHN ANALÝZY	MS ANALÝZA-ZMD
	R6	R2	[%]	[M-H]' a)	[M+Hfb)
78	anilino	thio	C=54,0; H-3,5; N-29.0	242	244
79	2-chloranilino	thio	047,2; H-2,7, N-25,4	276	278
80	3-chloranítino	thio	047,4; H-2,8; N—25,1	276	278
81	4-chtoranilino	thio	C-47,4, H-2,8; N”25,2	276	278
83	2-fluoranilino	thio	OSO.S; H-3,0; N-27,0-	260	262
83	3-fiuoranilino	thio	050,5; H-2,8, N-27,0	260	262
84	4-fluoranilino	thio	050,4; H-3,0, N-27,2	260	262
85	2-hydroxyanilino	thio	050,6; H-3,4; N-272	258	260
84	3-hydroxy anilino	thio	O50A H-3A N-27,7	258	260
87	2-nwthoxyanilino	thio	052,5; H-4,0; N-26,0	272	274
88	3-methoxy anilino	thio	052,6, H-4,1; N-25,7	272	274
89	4-methoxyanilino	th»	052,5; H-4,0; N“25,9	272	274
90	3,4-dinwtboxyanilino	thio	051,7; H-4,1; N-23,5	302	304
91	2,5-dimethoxy anilino	thio	O51,1;H-43;N=23,3	302	304
93	2-chk>r- 5-methoxyanilino	thio	C-46,3; H-3,1; N-22,9	306	308
93	2-methoxy-3-chloranilÍno	thio	046,4; H-3,2; N-22,9	306	308

Příklad 13

2-Methylthioxanthin

Do čerstvě připraveného roztoku 2-thioxanthinu (103g, 0,613 mol) ve 2M NaOH (613 ml) a vodě (245 ml) byl po kapkách přidán dimethylsulfát (77 g, 58 ml), teplota byla udržována mezi

- 15CZ 302225 B6 a 40 °C. Reakční směs byla další hodinu míchána a pak ponechána přes noc při pokojové teplotě. Poté byla tmavě červená kapalina zfiltrována a produkt vysrážen ledovou kyselinou octovou, zfíltrován a rekrystalizován z horké vody (1500 ml) s přídavkem aktivního uhlí. Produkt vykrystaloval při -10 °C, byl následně zfíltrován a sušen při 95 °C 3 h, a poté nad oxidem fosforečným do konstantní váhy. Výtěžek: 48 %. HPLC čistota: 80 %.

Příklad 14

2-Methylthio-6—chlorpurin

2-Methylthioxanthin (65 g) byl smíchán s POCI3 (975 ml) a N,N-diethylanilinem (97,5 ml). Reakční směs byla následně refluxována s mechanickým mícháním po dobu 90 minut. Přebytek POCI3 byl odstraněn na vakuové rotační odparce při 55 až 60 °C a zbytek byl míchán s ledem (0 °C, 1,75 kg) po dobu 10 minut (do dokončení hydrolýzy POCI3. Produkt byl následně extrahován ethylacetátem (4x 2,5 1). Extrakty byly promyty vodou a odpařeny do sucha, za vzniku tmavě hnědé pevné látky. Surový produkt byl rekrystalován z ethanolu za přítomnosti aktivního uhlí a vysušen do konstantní hmotnosti nad oxidem fosforečným. Výtěžek: 23,6 g (33 %). HPLC čistota: 99 %. TLC (chloroform/methanol, 9/1) bez nečistot.

Příklad 15

2~Methylthio-6-anilinopurin

Směs 2-metbylthio-6-chlorpurinu (10 g, 50 mmol), anilinu (7,7 g, 63 mmol) a triethylaminu (35 ml, 250 mmol) byla refluxována v butanolu (400 ml) 2 hodiny. Butanol byl odpařen pod vakuem a po ochlazení přidána voda (290 ml). pH bylo upraveno na 8,0 a směs byla ponechána přes noc při -16 °C. Vzniklý žluto-zelený produkt (10 g) byl zfíltrován, vysušen pod vakuem nad oxidem fosforečným a chromatograficky přečištěn (250 g silika, Fisons, v chloroformu), eluován směsí chloroform/methanol (97/3, v/v). Odpovídající frakce byly odpařeny do sucha, produkt rekrystalován z ethanolu s přídavkem aktivního uhlí a následně vysušen nad oxidem fosforečným do konstantní hmotnosti. Výtěžek 5,76 g, (46 %), HPLC čistota >98 %.

TLC: Chloroform/methanol (9:1, v/v), bez nečistot.

Tabulka 5

Látky připravené způsobem podle příkladu 15

SUBSTITUENT PURINU	CHN ANALÝZY	MS ANALÝZA-ZMD
	R6	R2	[%]	»)	[M+H]+b)
94	anilino	methylthio	055,9; H-4.2; N=27,3	256	258
95	2-chloranilino	methylthio	O49,1;H-33;N=24,3	290	292
9«	3-chloranilino	methylthio	049,1; H-3,1;N=24,1	290	292
97	2-fluoranilino	methylthio	C=52,2; H-3,7; N-25.3	274	276
98	3-fluoranilino	methylthio	052,4; H-3,6; N-25,4	274	276
99	4-fluoranilino	methylthio	051,9; H-3,4, N=25,6	274	276
100	2-hydroxyantlino	methylthio	052,5, H-4,0; N-25,8	272	274

-16CZ 302225 B6

101	3-hydroxyanilino	methylthio	052,5; H-4,0;N-25,7	272	274
101	2-methoxyanilíno	methylthio	C-54,3;H-4,4;N-24,6	286	288
103	3-methoxyanilino	methylthio	054,0; H-4.4; N-24.9	286	288
104	4-methoxy anilino	methylthio	C=53,8;H-4J;N=24,7	286	288
10S	3,4-difnethoxyaniltno	methylthio	052,6; H-4,7; N-22,2	316	318
106	2^-dimethoxyinílíno	methylthio	052,9; H-4,8; N-22,2	316	318
107	2-chlor- 5-methoxyanilino	methylthio	048,8; H-4,7; N-22,0	320	322
108	2-methoxy-3-chloranlíino	methylthio	048,1; H-5 3; N-21,3	320	322

Příklad 16 5

2-Methyl~6-(3-methoxyanilino)purin

Do suspenze 2-methyl-6-chlorpurinu (1,69 g; 0,01 mol) a m-anisidinu (1,23 g; 0,01 mol) v nbutanolu (20 ml) byl přidán triethylamin (3,5 ml; 0,025 mol). Vzniklá hustá směs byla míchána io při 110 °C po 3 hodiny, kdy TLC ukázalo nepřítomnost výchozích látek v reakční směsi. Ta byla následně ochlazena na pokojovou teplotu. Bílá sraženina byla zfíltrována, promyta n-butanolem (2x 10 ml), vodou (3x 10 ml) a vysušena do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 1,92 g (75%). Surový produkt byl přečištěn jako hydrochlorid krystalizací z 2,5M roztoku kyseliny chlorovodíkové v methanolu. TLC (chioroform-methanol-NH₄OH; 4:1:0,05): bez nečistot a výchozích látek. HPLC čistota: 99+ %.

Tabulka 6

Látky připravené způsobem podle příkladu 16

PURIN SUBSTITUENT	CHN ANALYSES	MS ANALYSES-ZMD
	R.6	R2	[%]	[M-H]- a)	[M+H]+b)
10»	anitmo	methyl	063,8; H”4,9;N—31,2	224	226
110	2-ctiloranilino	methyl	C=553;H-3,7, N-27,3	258	260
lil	3-chloranilino	methyl	0553; H-3,8; N-27,3	258	260
112	2-fluoranilíno	methyl	059,0; H—4,l;N-29,0	242	244
113	3. fluoranilino	methyl	C-59,2; H-43;N-29,1	242	244
114	4-fluoranilino	methyl	059,1; H-4,I;N-29,0	242	244
115	2-hydroxyanilino	methyl	060,0; H-4,6; N-293	240	242
116	3-hydroxyanilino	methyl	059,9; H-4,6; N-2 9,1	240	242
117	2-methoxy anilino	methyl	C-61,l,H-53;N-27,9	254	256
118	3-methoxyanilino	methyl	060.8; H-5,1;N-27,J	254	256
119	4-mcthoxyanilino	methyl	061,0, H«5,l;N-27,5	254	256
120	3,4-dimethoxyanilino	methyl	O58,5;H-5,l;N-24,9	284	286

- 17CZ 302225 B6

Ul	2,5-dimethaxyanilino	methyl	058,8; H-5,1; N-24,6	284	286
122	2-chlor- 5-methoxyanilino	methyl	C-53,7; H-4,l;N-243	288	290
123	2-methoxy-3-chloranilino	methyl	053,8; H-4,2; N-24,6	288	290

Příklad 17

2-Brom-6-(methoxyanilino)purm

2-Brom-6~(methoxyanilino)purin byl připraven podobně jako látka v příkladu 5, zde reakcí 2brom-6-chlorpurinu a m-anisidinu (v molámím poměru 1:1) v přítomnosti triethylaminu ío (2,5 ekv.) v n-propanolu při 100 °C 4 hodiny. Po ochlazení na pokojovou teplotu byla vzniklá bílá sraženina zfiltrována, promyta chladným n-propanolem, vodou a vysušena v exikátoru do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 69 % (jako hydrochlorid). Surový produkt byl rekrystalován z methanolu a volná báze byla získána reakcí hydrobromídu s 10% vodným roztokem amoniaku.

HPLC čistota: 98+ %.

Tabulka 7

Látky připravené způsobem podle příkladu 17

SUBSTITUENT PURINU	CHN ANALÝZY	MS ANALÝZA-ZMD
	R6	R2	[%1	[M-H]· a)	[M+H]+b)
124	anilino	hrom	045,4; H-2,7, N-24,3	289	291
I2S	2- chloranilino	brom	C-40,5; H—2,1; N-21,7	323	325
126	3-chloranilino	brom	040,5; H-2,1;N-21(6	323	325
127	2-fiuoranil ino	brom	044,5; H*2,1;N-2V>	307	309
12*	3-fluoranilino	brom	044,7; H-2,l;N-22,9	307	309
1»	3-methoxyanilino	brom	C=44,6; H-3,2; N-21,6	319	321
130	2-hydroxy anilino	brom	042,-9; H-2,6; N-23f 1	305	307
131	3-hy droxy anil ino	brom	043,2; H=4,6;N«22,9	305	307

Příklad 18

2-Nitro-6—(3-methoxyfenyl)amino-9-Boc-purin

Do roztoku 2-nitro-6-chlor-9-THP-purinu (3,00 g; 0,01 mol) v methanolu (40 ml) při 0 °C byl po kapkách přidán roztok m-anisidinu (1,48 g; 0,012 mol) a triethylaminu (3,0 g = 4,2 ml;

0,03 mol), v methanolu (10 ml). Teplota při reakci byla udržována +5 °C. Po přidání veškerého m-anisidinu byla reakční směs (monitorována TLC do vymizení výchozího 2-nitro-6-chlor-9THP-purinu v reakční směsi) za míchání pomalu ohřátá na pokojovou teplotu. Methanol byl následně odpařen a produkt rozdělen mezi vodu (50 ml) a ethylacetát (50 ml). Vodná fáze byla znovu reextrahována ethylacetátem (50 ml). Spojené organické fáze byly promyty vodou (20 ml), sušeny bezvodým MgSO₄, a odpařeny do sucha. Surový produkt byl rekrystalován ze směsi ether

-18CZ 302225 B6

- cyklohexan (1:1). Výtěžek: 3,1 g (80 %) téměř bílého krystalického produktu. Čistota (HPLC): 98+ %.

Příklad 19

2-Nitro-6-(3-methoxyfenyl)aminopurin

2-Nitro-6-(3-methoxyfenyl)amino-9-Boc-purin (3,86 g; 0,01 mol) byl rozpuštěn v 50% kyselině trifluoroctové (50 ml) při 0 °C. Roztok byl inkubován přes noc v lednici a následně odpařen na rotační vakuové odparce. Krystalický produkt byl smíchán s vychlazeným 5% vodným roztokem amoniaku (100 ml). Surový produkt byl zfiltrován a rekrystalován z 50% methanolu. Výtěžek: 1,97 g (69 %) nažloutlé krystalické látky; čistota (HPLC): 98+ %.

Tabulka 8

Látky připravené způsobem podle příkladu 18-19

SUBSTITUENT PURINU	CHN ANALÝZY	MS ANALÝZA-ZMD
	R6	R2	[%]	[M-H]‘ «)	[M+H]+b)
134	aniliito	nitro	055,1; H»3,4;N=3S,1	239	241
125	2-chloranilino	nitro	047,9; H-2,ó; N-30,9	273	275
124	3-chloranilino	nitro	048,0; H-2,6; N-30,7	273	275
127	2-fluoranilino	nitro	C-51,0; H-2,6,N-32,8	257	259
128	3-fluoranilino	nitro	051,1; H-2,7;N-32,8	257	259
139	3-methoxyanilino	nitro	053,1; H-3,6;N-31,5	269	271
138	2-hydroxyaniliiw	nitro	051,5; H-3,l;N-33,0	255	257
131	3-hydroxyanilino	nitro	051,3^-2,9-,032,9	255	257

Příklad 20 inhibice aktivity cytokinin oxidasy

Hodnoty 1C_5O byly stanoveny užitím testu v mikrotitrační destičce. Každá jamka obsahovala ΙΟΟμΙ PMS/MTT [fenazin methosulfát/3-(4,5-dÍmethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid] reakční směsi (výsledné koncentrace složek: 0,1 Μ KH2PO4, pH 7,4, 1 mM MTT, 0,2 mM PMS) obsahující testovanou látku (3 x 10⁷ M až 3 x I0^-4 M) a 30 μΜ N⁶-isopentenyladeninu (iP) jako substrátu. Ke směsi bylo přidáno ΙΟΟμΙ buněk prostého růstového média kmene S. cerevisiae 23344c ura nesoucího plasmid pYES2-AtCKX2, jako zdroje AtCKX2. Destičky byly inkubovány 30 min ve tmě a enzymatická reakce byla zastavena přídavkem 25 μί 35% kys. octové. Následně byla změřena absorbance při 578 nm na spektrofotometru Tecan. Absorbance vzorku bez iP byla odečtena.

Hodnota IC50, tedy koncentrace látky inhibující aktivitu enzymu z 50 %, byla spočtena ze získaných křivek odezvy. V tabulce 9 jsou uvedené průměry ze tří opakování, celý test byl proveden nejméně dvakrát. Látky účinnější než thidiazuron (referenční látka) mají ICjo nižší než thidiazuron.

- 19CZ 302225 B6

Tabulka 9

Účinek nových látek na inhibici rekombinantní AtCKX2

No.	Testovaná látka	IC50 (pmol.L'1)
R6	R2
	thidiazuron		30
1	anilino	chlor	22,6
3	3-chloranilino	chlor	6,3
4	4-chlorantlino	chlor	24,,
6	3-fluoranilino	chlor	12,2
7	4-fluoranilino	chlor	28,3
9	3 -hydroxyanilino	chlor	3(5
12	3-methoxy anilino	chlor	0,8
13	4-methoxy anilino	chlor	18
40	anilino	fluor	14,9
42	3-chloranilino	fluor	15,3
43	4-chloranílino	fluor	27
45	3-fluoranilino	fluor	22,1
48	3-hydroxy anilino	fluor	11,8
51	3-methoxyanilino	fluor
66	3-chloranilino	amino	25,6
69	3-fluoranilino	amino	29,4
75	3-methoxy anilino	amino	24,7
80	3-chloranilino	thio	28,4
83	3-fluoranilino	thio	22,6
88	3-methoxyanilino	thio	28,3
lil	3-chloranilino	methyl	15,7
113	3-fluoranilino	methyl	21,8
118	3-methoxyanilino	methyl

Příklad 21 io ln vivo účinek 2-chlor-6-(3-methoxyanilino)aminopurinu (látka 12)

Transgenní rostliny Arabidopsis 35S:AtCKXl a tabáku 35S:AtCKX2 pěstované v půdě ve skleníku byly systematicky ošetřovány 10 μΜ látky 12. Nadzemní části kontrolních transgenních rostlin byly sprejovány každý druhý den po dobu jednoho měsíce vodným roztokem látky 12 obsahujícím 0,01 % smáčedla Silwet L-77. Z obrázku 1 je jasně patrné, že aplikace CKX inhibitoru 2-chlor-6-(3-methoxyanilino)amÍnopurinu (látka 12) uvolnila rostliny z růstové inhibice způsobené poklesem cytokininů a vedla k obnovení přirozeného fenotypu. Abychom potvrdili, že

-20CZ 302225 B6 tento účinek není obecným účinkem exogenně aplikovaného cytokininu, ale specifickým účinkem CKX inhibitoru, byly CKX1 nadprod ukuj ící semenáčky Arabidopsis pěstovány in vitro na MS mediu obsahujícím 0,1 μΜ cytokinin BAP (obrázek 2C) nebo stejnou koncentraci látky 12 (obrázek 2B).K obnovení přirozeného fenotypu došlo pouze pokud byla v médiu přítomná látka

12.

Dlouhodobá aplikace látky 12 na přirozené rostliny Arabidopsis vedla k pozměněnému vývoji květů a inhibici oplodnění (obrázek 3). Květy měly špatně vyvinuté prašníky a byly sterilní.

io

Příklad 22

Aktivace cytokininových receptorů

Escherichia coli kmeny KMI001 nesoucí plasmid pIN-III-AHK4 nebo pSTV28-AHK3 byly pěstovány přes noc při 25 °C v M9 médiu obohaceném 0,1% kasaminovými kyselinami do OD6oo~l (optická densita při 600 nm odpovídající 1). Prekultura byla naředěna 1:600 v 1 ml M9 média obsahujícího 0,1% kasaminovými kyselinami a kní byl přidán 1 μΐ zásobního roztoku testované látky (10^-7 M až 5 x 10⁵ M) nebo rozpouštědla (DMSO, ethanol, methanol). Kultury byly dále kultivovány při 25 °C v mikrotitrační destičce, 200 μΐ na jamku, po dobu 17 h v případě CRE1/AHK4 kultury a 28 h v případě AHK3 kultury. Poté byly kultury zcentriťugovány a 50μ1 alikvoty supematantu byly přeneseny do mikrotitrační destičky obsahující 2 μΐ 50 mM 4-methy] umbelliferyl galaktosidu v každé jamce a následně inkubovány 1 h při 37 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 100 μΐ 0,2M Na₂CO3. Fluorescence vzorků byla změřena spektrofotometrem

Fluoroscan Ascent (Labsystems, Finsko) při vlnových délkách 365 nm (excitační) a 460 nm (emisní). Bylo stanoveno OD®» zbylé kultury a aktivita β-galaktosidasy byla vyjádřena jako nmol 4—methylumbelliferonu x ODůoo^-1 x h¹.

Hodnoty EC50, tedy koncentrace látky aktivující receptor z 50 %, byla spočtena ze získaných křivek odezvy. V tabulce 10 jsou uvedené průměry ze tří opakování, celý test byl proveden nejméně dvakrát. Látky aktivující receptory méně než /rans-zeatin (referenční látka) jsou zajímavé jako CKX inhibitory. Nové substituované 6-anilinopuriny vykazovaly mnohem menší afinitu k cytokininovým receptorům než /rans-zeatin.

Tabulka 10

Účinek nových látek na aktivaci cytokininových receptorů Arabidopsis thaliana CRE1/AHK4 aAHK3.

No.	Testované látky	EC50 (pmol.L1)
R6	R2	CRE1/AHK4	AHK3
	Zraro-zeatin		0,9	2,1
	benzylamino		19,7	18,2
1	aniline	chlor		10
3	3-chloranilino	chlor	7,5	20
4	4-chloraniiíno	chlor	27,8	2,5
6	3-fluoranilino	chlor	>50	33,3

-21 CZ 302225 B6

7	4-fluoranilino	chlor	n.i.	8,3
8	2-hydroxy anilino	chlor	50	31,7
9	3-hydroxyanilino	chlor	37,1	2,8
10	4-hydroxyanilino	chlor	26,7	44,4
11	2-methoxyanilino	chlor	>50	6,1
12	3-methoxyanilino	chlor	31^	¥
13	4-methoxyanilino	chlor	n.i.	6
30	3,4-dimethylanilino	chlor	33,3	>50
40	anilino	fluor	46/2	19
42	3-chloraiúlino	fluor	21	31,6
43	4-chloranilino	fluor	39,8	27
45	3-fluoranilino	fluor	>50	42,1
46	4-fluoranilino	fluor	n.i.	22,5
47	2-hydroxyamlino	fluor	>50	45,8
48	3-hydroxyanilino	fluot	49,6	15
49	4-hydroxyanilino	fluor	37,1	>50
50	2-methoxy anilino	fluor	>50	17,4
51	3-methoxyantlino	fluor	43	22,7
52	4-methoxyanilino	fluor	n.i.	18,9
64	anilino	amino	n.i.	25,3
66	3- chloranilino	amino	n.i.	43
67	4-chloranilino	amino	n.i.	8,1
69	3-fluoranÍlíno	amino	n.i.	>50
70	4-fluoranilino	amino	n.i.	19,5
71	2-hydroxy anilino	amino	>50	>50
72	3-hydroxyanilino	amino	>50	7,7
73	4-hydroxyanilino	amino	>50	>50
74	2-methoxyanilino	amino	n.i.	29
75	3-methoxyanilino	amino	n.i.	20,4
76	4-methoxyanilino	amino	n.i.	26,3
80	3-chloranilino	thio	n.i.	42
81	4-chloranilino	thio	n.i.	10,2
83	3-fluoranilino	thio	n.i.	>50
88	3-methoxyanilino	thio	n.i.	31,7
96	3- chloranilino	methylthio	41	29
98	3-fluoranilino	methylthio	49	32
103	3-methoxyanil'ino	methylthio	>50	27,5
111	3* chloranilino	methyl	n.i.	>50
113	3-fluoranilino	methyl	n.i.	n.i.
118	3-methoxyanilino	methyl	n.i.	>50

n.i, znamená bez interakce

-22CZ 302225 B6

Příklad 23

Stimulační vliv nových látek na buněčné dělení rostlinných buněk

Stimulační vliv nově připravených derivátů byl testován v kalusovém biotestu za použití cytokinin—dependentního kalusu tabáku. Tento cytokinin-dependentní tabákový kalus Nicotiana tabacum L. cv. Wísconsins 38 byl udržován pri 25 °C na modifikovaném mediu MurashigeSkoog obsahujícím na 1 litr: 4 pmol kys. nikotinové, 2,4 pmol pyridoxin hydrochloridu, io 1,2 pmol thiaminu, 26,6 pmol glycinu, 1,37 pmol glutaminu, 1,8 pmol myoinositolu, 30 g sacharózy, 8 g agaru, 5,37 pmol α-naftyloctové kyseliny a 0,5 pmol 6-benzylaminopurinu. Subkultivace probíhala každé 3 týdny. Čtrnáct dní před započetím biotestu byl kalus přenesen na médium bez 6-benzylaminopurinu. Stimulační růstová aktivita byla stanovena na základě nárůstu čerstvé hmoty kalusu po 4 týdnech kultivace. Pět replikátů bylo připraveno pro každou testovanou kon15 centraci a daný test byl opakován minimálně 2-krát. V každém experimentu byla použita jako kontrolní látka kinetin, který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok byl doplněn vodou na 10“⁵ M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10^-8 až 10“⁴ M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2% a v této koncentraci neovliv20 ňovala biologickou aktivitu testu.

Ze získaných dat byla opět vypočítána maximální účinná koncentrace testované látky a její relativní účinnost v této koncentraci (Tab. 11). 10⁵ M koncentrace kontrolní látky kinetinu byla postulována jako 100 % biologické aktivity.

Výsledky v tabulce 11 naznačují, že substituce v poloze 2 a 6 purinového kruhu vedla k nárůstu cytokininové aktivity v kalusovém biotestu ve srovnání s klasickým cytokininem kinetinem (K).

Tabulka 11

Vliv nových cytokininů na růst cytokinin-dependentního tabákového kalusu Nicotiana tabacum L. cv. Wísconsins 38

č.	Testovaná sloučenina	maximální účinná koncentrace (mol.r1)	aktivita (%) [10-5mol.rl K = 100%]
R6	R2
C	furfurylamino	H	io3	100
3	3-chloranilino	chlor	10'5	110 (±6)
4	4-chloranilino	chlor	10*	102 (±8)
6	3-fluoranilino	chlor	10J	119,7 (±8)
7	4-fluoranilino	chlor	10s	112 (±12)
9	3-hydroxy anilino	chlor	10J	116/2 (±13)
11	2-methoxyanilino	chlor	10’	109 (± 5)
12	3-meíhoxyanilino	chlor	10’	102 (± 3)
40	anilino	fluor	IO-5	108,l(±4)
42	3-chloranitino	fluor	10J	121(±8)

-23CZ 302225 B6

43	4-chloraniIino	fluor	10’’	130(±6)
45	3-fluoranilino	fluor	10’	127,9 (±8)
46	4-fluoranilino	fluor	IO’5	110,7 (±5)
48	3-hydroxy anilino	fluor	io-’	104,2 (± 3)
49	4-hydroxyanilino	fluor	10’’	106 (± 3)
50	2-methoxy anilino	fluor	10'’	117,6 (±9)
51	3-methoxyanilino	fluor	IO5	120,5 (± 13)
52	4-methoxyanilino	fluor	IO'5	105 (±7)
80	3-chloranilino	thio	10’	126 (±5)
81	4-chloranilino	thio	10·’	115,7 (±4)
83	3-fluoranilino	thio	10-’	102,5 (±10)
88	3-methoxyanilino	thio	10'5	103,4(± 12)
96	3- chloranilino	methylthio	10’	121,2 (± 18)
98	3-fluoranilino	methylthio	10’’	130,3 (± 17)
103	3-methoxyanilino	methylthio	IO5	142,8 (±21)
111	3-chloranilino	methyl	10·’	128,3 (±6)
113	3-fluoranilino	methyl	10’’	125,3 (±7)
118	3-methoxyan i lino	methyl	IO·5	105,7 (±5)

Příklad 24

Testování nových cytokininů v amarantovém biotestu

Pro studium cytokininové aktivity byl rovněž použit „amarantový“ biotest v následující modifikaci. Semena Amaranthus caudatus var. Atropurpurea byla povrchově sterilizována 10% io N-chlorbenzensulfonamídem (w/v) po dobu 10 min a poté promyta 5-krát deionizovanou vodou.

Semena byla rozmístěna v 15 cm Petriho miskách s filtračním papírem saturovaným destilovanou vodou. Po 72 hodinách kultivace při 25 °C ve tmě byly ze semenáčků odstraněny kořeny. Tyto explantáty obsahující 2 kotyledony a hypkotyl byly umístěny do 5cm Petriho misek na 2 vrstvy filtračního papíru nasyceného 1 ml inkubačního média obsahujícího 10 pmol Na2HPO4-KH₂PO₄, pH 6,8, 5 pmol tyrosinu a testovaný cytokinin. Na misku bylo umístěno 20 explantátů. Veškeré manipulace byly prováděny pod zeleným světlem v temné komoře. Po 48 hodinách inkubace při 25 °C ve tmě byl betacyanin extrahován cestou zmražení expantátů v 3,33 pM kyselině octové. Koncentrace betacyaninu byla stanovena porovnáním absorbancí při 537 a 620 nm a vypočtena pomocí vzorce ΔΑ = A₅₃7nm - Α₆20ηπ,· Hodnoty byly vyneseny do grafů závislosti ΔΑ na koncent20 raci. Pět replíkátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a daný test byl opakován minimálně 2-krát. V každém experimentu byl použit jako kontrolní látka kinetin, který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na ΙΟ³ M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu IO⁸ až 10 ' M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2 % a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu.

Ze získaných dat byla vypočítána maximální účinná koncentrace testované látky a její relativní účinnost v této koncentraci (Tab. 8). 10^-4 M koncentrace K byla postulována jako 100 % biologické aktivity.

-24CZ 302225 B6

Výsledky naznačují, že substituce v poloze 2 a 6 purinového kruhu vedla k nárůstu obsahu betacyaninu (purpurová barva) v explantátech kotyledonů/hypokotylů Amaranthus caudatus ve srovnání s klasickým cytokininem kinetinem (K).

Tabulka 12

Vliv nových cytokininů na obsah betacyaninu v explantátech kotyledonů/hypokotylů Amaranthus caudatus.

č.	Testovaná sloučenina	maximální účinná koncentrace (mol.l*1)	Účinnost (%) [ΐσ’ιηοΙ.Γ1 κ = 100%]
R6	R2
C	furfury lamino	H	10®	100
9	3-chloranilino	chlor	10*	166 (±4)
4	4-chloranilino	chlor	10·*	107 (±8)
6	3-fluoranilino	chlor	10*	120 (±15)
7	4-fluoranilino	chloi	10*	104 (±4)
9	3-hydroxyanilino	chlor	10*	115,4 (±18)
11	2-methoxyanilino	chlor	10*	110,3(± 15)
12	3-methoxyanilino	chlor	10*	132,3 (± 14)
40	anilíno	fluor	10*	107 (±5)
42	3-chloranilino	fluor	10*	121(±6)
43	4-chloranilino	fluor	10*	102,6 (±1)
45	3-fluoranilino	fluor	10®	105,1 (±13)
46	4-fluoranilino	fluor	10®	109 (±8)
48	3-hydroxyanilino	fluor	10*	100p (± 10)
50	2-methoxyanilino	fluor	10®	105,2 (± 9)
51	3-methoxyanilino	fluor	10*	117,2 (±11)
64	anilíno	amino	10*	125,2 (±14)
66	3-chloranilino	amino	10*	122 (±5)
67	4-chloranilino	amino	10*	141,7 (±6)
69	3-fluoranilino	amino	10*	113,2 (±10)
70	4-fluoranilino	amino	Ϊ05	136(±7)
72	3-hydroxyanilino	amino	10*	119,8 (±15)
74	2-methoxyanilino	amino	10*	108 (± 13)
75	3-methoxyanilino	amino	10*	123,6 (±19)
80	3-chloranilino	thio	10*	106(±4)
81	4-chloranilino	thio	10*	122,9 (±5)
83	3-fluoranilino	thio	10*	133,5 (±11)
88	3-methoxyanilino	thio	10*	113,4 (± 15)
96	3-chloranilino	methylthío	10*	145,8 (±23)

-25CZ 302225 B6

98	3-fluoramlino	methylthio	10'J	142,5 (± 15)
103	3-methoxyanilino	methylthio	IO'5	156,4 (± IS)
11	3-chloranilino	methyl	10s	121,7 (±5)
113	3-fluoranilino	methyl	10s	120,2 (±6)
118	3-methoxyanilino	methyl	10-’	144,2 (± 8)

Příklad 25

In vitro cytotoxická aktivita nových derivátů

Nízká cytotoxicita je nezbytná pro použití těchto látek v kosmetice. Jedním z parametrů používaných jako základ pro cytotoxickou analýzu je metabolická aktivita životaschopných buněk. ío Například mikrotitrační analýza, kde se používá Calceín AM, je dnes rozšířena jako metoda kvantifikace buněčné proliferace a cytotoxicity. Tento test je využíván v programech pro screening léků a pro testy chemosensitivity. Testem se rozpoznají pouze životaschopné buňky.

Množství zredukovaného Calceinu AM odpovídá počtu životaschopných buněk v kultuře.

is Lidská T-lymfoblastická leukemická buněčná linie CEM, promyelocytární HL-60 a monocytámí U937 leukemie, buněčné linie prsního karcinomu MCF-7, buňky cervikálního karcinomu HELA, myší fibroblasty N1H3T3, lidská erythroleukemie K.562, buňky G361 lidského maligního melanomu byly použity pro rutinní screening sloučenin. Buňky byly udržovány v Nunc/Coming 80 cm² plastikových lahvích a pěstovány v mediu pro buněčné kultury (DMEM obsahující 5 g/l glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 10 % fetálního telecího séra a hydrogenuhličitan sodný), sloučeniny byly připraveny podle postupu podle předloženého vynálezu.

Buněčné suspenze byly připraveny a naředěny podle typu buněk a podle očekávané konečné hustoty buněk (10⁴ buněk na jamku na základě charakteristik buněčného růstu), pipetovalo se 80 μί buněčné suspenze na 96jamkové mikrotitrační destičky. lnokuláty byly stabilizovány 24 hodinovou preinkubací při 37 °C v atmosféře 5% CO₂. Jednotlivé koncentrace testovaných látek byly přidány v čase nula jako 20μ1 alikvotní podíl do jamek mikrotitračních destiček. Obvykle se sloučeniny ředily do šesti koncentrací v čtyřnásobné ředící řadě. Při rutinním testová30 ní byla nejvyšší koncentrace v jamce 166,7 μΜ, změny této koncentrace závisí na dané látce. Všechny koncentrace byly testovány v triplikátech. Inkubace buněk s testovanými deriváty trvala 72 hodin při 37 °C, 100% vlhkosti a v atmosféře 5% CO₂. Na konci inkubační periody byly buňky analyzovány po přidání roztoku Calceinu AM (Molecular Probes) a inkubace probíhala další 1 hodinu. Fluorescence (FD) byla měřena pomocí Labsystem FIA readeru Fluorskan Ascent (Microsystems). Přežití nádorových buněk (tumor cell survival-TCS) bylo spočítáno podle následujícího vztahu. GLq (FD^n,^ sderívůtem /FD^ontroinj jamka) x 100 34). Hodnota GI50, která odpovídá koncentraci látky, kdy je usmrceno 50 % nádorových buněk, byla vypočtena ze získaných dávkových křivek.

Nulová cytotoxicita je základním předpokladem pro použití těchto látek v zemědělských aplikacích. Pro vyhodnocení protinádorové aktivity byla testována toxicita nových derivátů na panelech obsahujících buněčné linie rozdílného histogenetíckého a druhového původu (Tab. 14). Ukázalo se, že pro všechny testované nádorové linie bylo působení nových sloučenin srovnatelné, kdežto nemaligní buněčné linie, tzn. NIH3T3 fibroblasty a normální lidské lymfocyty, byly vůči tomuto působení rezistentní. Sloučeniny uvedené v tab. 14 je možné rozdělit do 2 skupin. První skupina obsahuje „klasické cytokininy“ reprezentované 6-substituovanými puriny (jejich působení je již známé). Druhá skupina zahrnuje nové substituované 6-anilinopurinové deriváty. Tyto výsledky naznačují, že substituce v pozici 2 purinového skeletu vede obecně k poklesu cytotoxické aktivity

-26CZ 302225 B6 ve srovnání s „klasickými cytokininovými“ analogy. Jak je ukázáno v tabulce 14, GI50 pro NIH3T3 fibroblasty a normální lidské lymfocyty byla vždy vyšší než 166,7 μΜ. Nové deriváty vykazují nulovou toxicitu pro normální i nádorové buňky v koncentracích okolo 166,7 μΜ a jsou proto mnohem vhodnější pro zemědělské a kosmetické aplikace než „klasické cytokininy“ (6— substituované deriváty purinu).

Tabulka 14 io Cytotoxicita nových sloučenin pro různé nádorové buňky

	Použitá buněčná linie / GIjq (gmol/L)
Sloučenina	HOS	K-562	MCF7	B16-F0	NIH-3T3	G-361	CEM	HL60
kinetin	>166,7	164,1	>166,7		>166,7		155,1
isopentenyladenin	>166,7	146,9	>166,,7		>166,7		92,2	>166,7
benzy ladenin	>166,7	138,9	166,1		>166,7		>166,7	>166,7
frazu-zeatin			>166,7		>166,7		>166,7	>166,7
meía-topolin	>166,7	128,4	>166,7	90,6	>166,7	>166,7	90,1	79,2
orfAo-topolin	>166,7	>166,7	>166,7	150	>166,7	103,4	69,2	78
adenin		>166,7	>166,7		>166,7		>166,7	>166,7
1	>166,7		>166,7		>166,7		>166,7
3	>166,7		>166,7		>166,7		>166/7
4	>166,7	>166,7	>166,7		>166,7		>166,7
6	>166,7	>166,7	>166,7		>166f7
9	>166,7		>166,7		>166,7
12	>166,7		>166,7		>166,7
40	>166,7		>166,7		>166,7		>166,7
42	>166,7		>166,7		>166,7		>166,7
48	>166,7	>166,7	>166,7		>166,7
51	>166,7		>166,7		>166/7
64	>166,7		>166,7		>166,7
66	>166,7		>166,7		>166,7
72	>166,7		>166,7		>166,7
73	>166,7		>166.7 1		>166,7
78	>166,7		>166,7		>166,7
83	>166,7		>166,7		>166,7
87	>166,7		>166,7		>166,7
94	>166,7		>166,7		>166/7
101	>166,7		>166,7		>166,7
103	>166,7		>166,7		>166,7
116	>166,7		>166(7		>166,7
131	>166,7		>166,7		>166,7

Příklad 26

Zpomaleni vzniku, případně reverze senescentního fenotypu normálních lidských fibroblastů

V tomto příkladu byly pro studium β-galaktosidázové aktivity použity lidské diploidní fibroblas20 ty (HCA buňky s rozdílnou úrovní pasážování: pasáž 25 - označení HCA25; pasáž 45 - označení

-27CZ 302225 B6

HCA45; pasáž 80- označení HCA80). Medium použité pro kultivaci buněk bylo odstraněno, buňky byly promyty 2-krát PBS a fixovány ve 2 až 3 ml fixačního činidla skládajícího se ze 2% formaldehydu a 0,2% glutaraldehydu v PBS. Buňky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 5 min a poté 2krát promyty PBS. Buňky byly pak inkubovány při 37 °C (bez CO?) po dobu

1 až 16 hodin ve 2 až 3 ml roztoku obsahujícího ferrikyanid draselný (5 mM), ferrokyanid draselný (5 mM), MgCl₂ (2 mM), X-gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-J3-D-galaktopyranosid) (1 mg/ml), v citrát/fosfátovém pufru, pH 6,0). Po této inkubační periodě byly buňky pozorovány mikroskopicky za účelem zjištění senescentních buněk anebo pro měření intenzity zabarvení při 415 nm spektrofotometricky pomocí readeru Multiscam MCC (Labsystems) (pozitivně senesio centní buňky). V těchto experimentech byly označeny pouze senescentní buňky a to díky účinku β-galaktosidasy na substrát.

Tabulka 15

Vliv nových sloučenin na počet senescentních buněk v kultuře lidských fibroblastů

Sloučenina	Senescentní buňky (%)
HCA25	HCA50	HCA80
Kinetin	3	5	38
2-chlor- 6-(4-hydroxyanilino)purin	4	6	22
2-chlor - 6-(3-methoxyanilmo)purin	5	5	24
2-chlor- 6-(4-methoxyanilino)purin	4	3	26
2-chlor - 6-{3-methoxy-4hydroxyanilino)purin	4	6	25
2-amino-(4-hydroxyanilmo)purin	3	4	21
2-methy lthio-6-(4hydroxyanilino)purin	4	6	34
2-fluor- 6-(4-hydroxyanilino)purin	3	4	18
2-fluor- 6-(3-methoxyanilino)purin	3	5	29
2-amino-6-(3-methoxyanilino)purin	4	4	22
2-chlor- 6-(3-methoxy-4hydroxyanilino)purin	4	6	31
2-amino-(4-hydroxyanilino)purin	4	4	18

Se zvyšujícím se počtem pasáží docházelo k zintenzivnění zabarvení. U nejstarších buněk byly pozorovány pouze buňky od jasně modré až po tmavě matnou barvu. Substituované 6—anilinopurinové deriváty byly obecně mnohem efektivnější než kinetin při udržování nižší hladiny senescentních buněk po 80. pasáži.

-28CZ 302225 B6

Příklad 27

Protizánětlivá aktivita nových substituovaných 6-anilinopurinů

Pro ti zánětlívá aktivita několika substituovaných 6-anilinopurinů byla stanovena na buněčné linii krysího gliomu C6 (ATCC No. CCL107). Jako kontrola byl použit kinetin. Buňky byly pěstovány v jedné vrstvě v chemicky definovaném médiu bez přídavku séra. Kultivační médium mělo následující složení: Hamovo médium F10 / minimální esenciální médium (1:1 v/v), 2 mM Lglutamin, 1 % (v/v) minimální esenciální vitamíny (ΙΟΟχ), 1 % (v/v) minimální neesenciální aminokyseliny (lOOx), 100 U/ml penicilín, 100 mg/ml streptomycin a 30 nM seleničitan sodný. Inkubace probíhala při 37 °C a 100% vzdušné vlhkosti. Experimenty byly prováděny v logaritmické růstové fázi při hustotě buněk 2,5x10⁵ buněk/cm².

Syntéza cAMP byla indukována přídavkem 5 mM (-)-isoproterenolu, který byl k buněčným kulturám přidáván zároveň s testovanou látkou. Inkubace probíhala 30 minut. cAMP bylo stanoveno pomocí ELISA (cAMP-enzyme immunoassay kit firmy Amersham). Hodnoty I_;o byly odečteny z kalibrační křivky. Stanovení bylo provedeno v duplikátu. Výsledky byly následující:

Sloučenina	ProtizftnitHvi aktivita
ImOiM)	Účinek
Kinetin ( 6-furťurylaminopurin)	0	neaktivní
2-chlor- 5-{2-hydroxyaniIino)purin	25	Inhibice
2-chlor- 6-(4-hydroxyani]ino)purin	13	Inhibice
2-chlor- 6-(3methoxybenzy laminojp urin	7	Inhibice
2-chlor- 6-(3,5dim ethoxy benzylaminojpunn	11	Inhibice

Substituované 6-anilinopuriny vykázaly protizánětlivou aktivitu. Kinetin byl neúčinný.

Příklad 28

Vliv látek na adherenci fibroblastú

Test adherenční schopnosti buněk je jednou z metod hodnocení akutní toxicity látek vůči adherentním buňkám. Testovaná látka se přidá do média s definovaným počtem ztrypsinizovaných buněk a po stanovené době se spočítá počet buněk přisedlých ke dnu kultivační nádoby. V experimentu jsme použily lidské diploidní fibroblasty BJ (19. pasáž) ve standardním kultivačním médiu (DMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 10% fetálního telecího séra). Počty přisedlých buněk byly stanoveny po 6 hodinách. Experiment byl proveden v triplikátu. Výsledky ukazuje Obr. 4.

Procento buněk adherovaných k povrchu nebylo významně ovlivněno 2-chlor-6-(4—hydroxyanilinojpurinem v koncentračním rozmezí od 40 do 200 μΜ, látka tedy nevykazuje vůči fibroblastům akutní toxicitu.

-29CZ 302225 B6

Příklad 29

Sledováni in vitro viability lidských diploidních fibroblastů pomocí MTT

MTT test je standardní kolorimetrickou metodou pro měření proliferace a přežívání buněk. Žluté MTT je v metabolicky aktivních buňkách redukováno na fialový formazan a ten je stanoven spektrofotometricky. Diploidní lidské fibroblasty BJ (19. pasáž) byly vysety do 96 jamkové mikrotitrační desky v počtu 5000 na jamku, po 6 hodinách bylo médium (DMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 10 % fetálního teleio čího séra) odsáto a nahrazeno médiem obsahujícím testovanou látku v koncentračním rozmezí 0 až 200 μΜ. Každá koncentrace byla testována v pentaplikátu. MTT bylo k buňkám přidáno po 72 hodinách (finální koncentrace 0,5 mg/ml) a inkubace probíhala 3 hodiny. Obr. 5 ukazuje výsledky pro 2-chlor-6-(4—hydroxyanilinojpurin. Z výsledků vyplývá, že látka není pro lidské diploidní fibroblasty toxická.

Příklad 30

Sledování in vitro toxicity na lidských diploidních flbroblastech vyhodnocením růstové křivky

Diploidní lidské fibroblasty BJ (19. pasáž) byly vysety do 24 jamkového panelu po 10 000 buňkách na jamku. Po 6 hodinách bylo médium (DMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 10 % fetálního telecího séra) odsáto a nahrazeno médiem obsahujícím testovanou látku v koncentračním rozmezí 12,5 až 400 μΜ. Každá koncent25 race byla testována vtríplikátu. Počty buněk byly sledovány 12 dní. Z obrázku 6 je patrné, že sledovaná látka nevykazuje ve sledovaném časovém období toxicitu vůči lidským diploidním fibroblastům.

Příklad 31

Účinek na senescentni lidské diploidnífibroblasty

Přežiti buněk. Senescentni diploidní lidské fibroblasty SNF20 (38. pasáž) byly vysety do 24 jam35 kového panelu po 10 000 buňkách na jamku. Po 6 hodinách bylo médium (DMEM obsahující g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 10 % fetálního telecího séra) odsáto a nahrazeno médiem obsahujícím testovanou látku v koncentračním rozmezí 12,5 až 400 μΜ. Každá koncentrace byla testována v triplikátu. Počty buněk byly odečteny 7. a 14. den.

Z obr, 7 je patrné, že 2-chlor-ó-(4-hydroxyanilino)purin v koncentracích do 200 μΜ nemá výrazný negativní vliv na přežití senescentních buněk ve sledovaném časovém intervalu.

Morfologie senescentních buněk:

Fibroblasty SNF20 (38. pasáž) byly kultivovány po dobu 14 a 30 dní v přítomnosti 2-chlor-6(4-hydroxyanilÍno)purinu v koncentracích od 12,5 do 200 μΜ po dobu 14 a 30 dní. Poté byl aktinový cytoskelet obarven phalloidinem konjugovaným s TRITC a pozorován ve fluorescenčním mikroskopu. V případě buněk ovlivněných 25, 50 a 100 μΜ byl zjištěn vyšší podíl morfotypů odpovídajících nižší pasáži, aktinový cytoskelet byl více difiizní a přítomno bylo méně stresových vláken.

-30CZ 302225 B6

Příklad 32

Amesúv test

K vyloučení mutagenního působení 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purinu byl použit Amesův test. Jako indikátorové kmeny byly použity histidinové auxotrofy Salmonella typhimurium TA98 a TA 100 a test byl proveden podle standardních protokolů (Ames et al., Mutation Research, 31, 347-364 (1975); Maron et al., Mutation Research, 113, 173-215 (1983)). Látka byla nemutagenní i v koncentracích překračujících mez rozpustnosti látky v daném médiu (2,5, 5,0, 15, 50, 500, io 1500, a 5000 gg/misku).

Příklad 33 ts Přípravky

Přípravky ovlivňující růst obvykle obsahují od 0,1 do 99 % (w/w), zejména pak od 0,1 do 95 % (w/w), aktivní složky nebo složek odpovídajících látce nebo látkám vzorce 1, od 1 do 99,9 % (w/w), pevných nebo tekutých pomocných látek, a od 0,1 do 25 % (w/w), zejména od 0,1 do

25 % (w/w) surfaktantu. Zatímco komerční přípravky jsou obvykle formulovány jako koncentráty, koncový uživatel používá přípravek ředěný. Přípravek může zahrnovat i další komponenty jako stabilizátory, např. rostlinné oleje nebo epoxidované rostlinné oleje (epoxidovaný kokosový olej 0;l, řepkový olej, podzemnicový olej), protipěnivé látky, např. silikonový olej, konservační látky, látky regulující viskozitu, pojivá, látky zvyšující přilnavost, hnojivá, případně další aktivní složky. Preferované přípravky mají zejména toto složení (uvedena hmotnostní procenta):

A1. Emul Kovatelné koncentráty	a)	b)	c)	d)
Směs aktivních složek	5%	10%	25%	50%
dodecylbenzensulfonát vápenatý	6%	8%	6%	8%
polyoxyethylovaný ricinový olej
(polyglykol ether ricinového oleje)	4%	-	4%	4%
(36 mol ethylen oxid)
oktylfenol polyglykol ether -	4%	-	-	2%
(7-8 mol ethylenoxid)
cyklohexanon	-	-	10%	20%
směs aromatických uhlovodíků	85 %	78%	55%	16%

C^-C]2

Emulze o vyžadované finální koncentraci mohou být získány z takového koncentrátu zředěním 40 vodou.

A2. Roztoky	a)	b)	c)	d)
Směs aktivních složek	5%	10%	50%	90%
1 -methoxy-3-(3-methoxy-
propoxy jpropan	-	20%	20%	-
polyethylenglykol MW 400	20%	10%	-	-
N-methy 1-2-pyrrol idon	-	-	30%	10%
směs aromatických uhlovodíků	75%	60%	-	-

Cr-Ct2

-31 CZ 302225 B6

Roztoky jsou vhodné k aplikaci ve formě mikrokapének.

A3. Smáčivé práškv	a)	b)	c)	d)
Směs aktivních složek	5 %	25 %	50%	80%
lignosulfonát sodný	4%	-	3%	-
laurylsulfát sodný	2%	3%	-	4%
diisobutylnaftalensulfonát sodný	-	6%	5%	6%
oktylfenol póly gly kol ether-	1 %	2%	-
(7-8 mol ethylen oxid)
vysoce disperzní kyselina křemičitá	1 %	3 %	5 %	10%
kaolin	88%	62%	35%

Aktivní složka je důkladně promísena s pomocnými látkami a směs je důkladně rozemleta ve vhodném mlýnu. Suspenzi libovolné koncentrace je možné získat smísením vzniklého prachu s vodou.

A4. Potahované granule	a)	b)	c)
Směs aktivních složek	0,1 %	5%	15%
vysoce disperzní kyselina křemičitá	0,9 %	2%	2%
anorganický nosič	99,0 %	93%	83 %

(0,1-1 mm) např. CaCO₃ nebo SiO₂

Aktivní složka je rozpuštěna v methylenchloridu a nasprejována na nosič. Rozpouštědlo je odpařeno ve vakuu.

A5. Potahované granule	a)	b4)	c)
Směs aktivních složek	0,1 %	5%	15%
polyethylenglykol MW 200	1,0 %	2%	3%
vysoce disperzní kyselina křemičitá	0,9 %	l %	2%
anorganický nosič	98,0 %	92%	80%

(AE 0,1-1 mm) např. CaCOí nebo SiO₂

Jemně rozemletá aktivní složka je v mixéru stejnoměrně nanesena na nosič zvlhčený polyethylengtykolem. Takto jsou získány neprašné granule.

A6. Extrudované granule	a)	b)	c)	d)
Směs aktivních složek	0,1 %	3%	5%	15 %
lignosulfonát sodný	1,5%	2%	3 %	4%
karboxy methy lce 1 ulóza	1,4%	2%	2%	2%
kaolin	97,0 %	93%	90%	79%

Aktivní složka je smísena a rozemleta s pomocnými látkami a složka je zvlhčena vodou. Směs je extrudována a usušena v proudu vzduchu.

-32CZ 302225 B6

A7. Prachy

Směs aktivních složek talek kaolin

a) b) c)

0,1 % 1 % 5 %

39,9% 49% 35%

60,0 % 50 % 60 %

Prachy k přímému použití jsou získány rozemletím aktivní složky s nosičem ve vhodném mlýnu.

A8, Suspenzní koncentrát io Směs aktivních složek ethylenglykol nonylfenol polyglykol ether(15 mol ethylenoxid) lignosulfonát sodný karboxymethylcelulóza % vodný roztok formaldehydu emulze silikonového oleje voda

a)	b)	c)	d)
3%	10%	25%	50%
5%	5%	5%	5%
1 %	2%	-
3%	3%	4%	5%
1 %	1 %	1 %	1 %
0,2 %	0,2 %	0,2 %	0,2 %
0,8 %	0,8 %	0,8 %	0,8 %
87%	79%	62%	38%

Jemně rozemletá aktivní složka je smíchána s pomocnými látkami. Vzniklý suspenzní koncentrát umožňuje přípravu suspenze o požadované koncentraci zředěním vodou.

Příklad 34

Gel

Názvy složek jsou uváděna v souladu s terminologií registračních úřadů. Složky jsou uváděny v gramech na 100 g.

Gel	/100 g
Aktivní látka 2-chlor-6-<4-hydroxyanilino)purin	(2C14OHAP)	1,0 g
butylhydroxytoluen	(Nipanox BHT)	0,2 g
butylparaben	(Nipabutyl)	0,2 g
diethylenglykol monoethy lether	(Transcutol P)	10,0 g
bezvodá koloidní silika	(Zeopharm 177)	5,0 g
propylenglykol laurát	(Lauroglycol FCC)	83,6 g

Konzistence gelu může být dále modifikována přidáním bezvodé koloidní siliky.

Účinek aktivní látky může být zvýšen pomocí transdermálního systému Transcutol P/Lauroglycol FCC. Bezvodá koloidní silika pravděpodobně zpomalí penetraci účinné látky, což povede k protahovanému účinku.

-33 CZ 302225 B6

Příklad 35

Příprava přípravku určeného k aplikaci na kůži (mast)

Názvy složek jsou uváděna v souladu s terminologií registračních úřadů. Složky jsou uváděny v gramech na 200 g

aktivní látka 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purin	(2C14OHAP)	/200 g 2,0 g
butylhydroxytoluen	(Nipanox BHT)	0,4 g
200018035611NP
butylparaben	(Nipabutyl)	0,4 g
diethylenglykolmonoethylether	(Transcutol P)	20,0 g
3260/02
glycerol dibehenát	(Compritol 888 ATO)	44,0 g
3123/04
propylenglykol laurát	(Lauroglycol FCC)	133,2 g

3219/00

Doporučený postup

Fáze A gramy účinné látky byly rozpuštěny ve 20 g Transcutolu P stálým mícháním v oddělené skleněné nebo nerezové ocelové nádobě při teplotě místnosti. Rozpouštění může být urychleno zahříváním na maximálně 40 °C,

Fáze B

0,4 gramu Nipanox BHT a 0,4 g Nipabutylu byly rozpuštěny za stálého míchání při teplotě přibližně 70 °C v 133,2 g Lauroglycol FCC. Operace byla provedena v oddělené skleněné nebo nerezové ocelové nádobě. Čirý olejovitý roztok byl zahřát na přibližně 80 °C a v něm bylo za míchání roztaveno 44 g Compritolu 888 ATO. Vzniklý roztok byl ochlazen na přibližně 60 °C a během stálého míchání chladnoucího roztoku smíchán s fází A. Vzniklá bělavá masťovitá hmota byla rozdělena po 15 gramech do plastových nádobek.

Příklad 36

Příprava přípravku pro topickou aplikaci na kůži

Složení topického přípravku určeného k aplikaci na kůži (hmotnostní procenta): Aktivnílátka 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purÍn (2C14OHAP) 0,1%

Olejová fáze

Čety lalkohol 5,0 %

Glyceryl monostearát 15,0 %

Sorbitan monooleát 0,3 %

Polysorbát 80 USP 0,3 %

-34CZ 302225 B6

Vodná fáze

Methylcelulóza lOOcps Methyl paraben

Propyl paraben Destilovaná voda

1,0%

0,25 %

0,15% kvantitativně do 100 %

Methylcelulóza byla rozpuštěna ve vodě obsahující methyl a propyl paraben. Směs pak byla zahřáta na 72 °C a přimíchána k olejové fázi o teplotě 70 °C. Účinná látka 2C14OHAP byla ío přidána po ochlazení směsi na 35 °C a míchána do vychlazení.

Tento přípravek je určen k aplikaci na kůži na přinejmenším denní bázi dokud se nedostaví požadovaný příznivý efekt (omlazovací účinek).

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   l. Použití substituovaných 6-aniIinopurínových derivátů obecného vzorce I

   25 nebo jejich farmaceuticky využitelných solí s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, ve kterých

   R znamená 1 až 5 substituentů nezávisle vybraných ze skupiny zahrnující vodík, halogen, hydroxyl, amino, C1-C6 alkyloxy a C1-C6 alkylovou skupinu,

   R2 znamená amino, halogen, nitro, thio nebo C1-C6 alkylthio skupinu, jako inhibitorů cytokinin oxidasy v zemědělství při produkci užitkových rostlin, ve tkáňových kulturách ke stimulaci proliferace a morfogeneze a/nebo v kosmetice.
2. 2. Použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů podle nároku 1 obecného vzorce I ze skupiny zahrnující 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-anilinopurin, 2(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2--chloranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-chloranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino,

   40 nitro, thio, methylthío)-6-(4-chloranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-fluoranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3fluoranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-ó-(4-fluoranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-bromaniIino)purin, 2-(chIor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-bromanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino,

   45 nitro, thio, methylthio)-6-(4~bromanilÍno)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio,

   -35CZ 302225 B6 methylthio)-6-(2-methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)6—(3-methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(4methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-ethoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-ethoxyanilino)purin, 2(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(4-ethoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthío)-6-(2-aminoanilÍno)purin, 2-(chIor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-aminoanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(4-aminoanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6(2-methylanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)—6—(3-methylanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthío)-6-(4“methylanilino)purin, 2(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-hydroxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-hydroxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(4-hydroxyaniIino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methyIthio)-6-(2,3-dÍfluoranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)6-(2,4-dÍfluoranilino)purin, 2-(chIor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,3,4-trifluoranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,4,5-trifluoranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,3-dichloranilÍno)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,4—dichloranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,4—dimethoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,3-dimethoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3,4-dimethoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,5-dimethoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthÍo)-6-{3,4,5-trimethoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,4,6-trimethoxyanilÍno)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6(2,3-dimethylanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthío)-6-(2,4-dimethylanÍ1ino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6—(3,4—dímethylanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthÍo)-6-(3,5-dimethylanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,3-dihydroxyanilino)purin, 2(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,4-dihydroxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2,5-dÍhydroxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3,5-dihydroxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-hydroxy-2-methylanil ino) purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-hydroxy-4-methylanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-hydroxy-5-methylanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-hydroxy-2-methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3-hydroxy-4—methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-{2-hydroxy-3-methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-hydroxy-5-methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyanilino)purin, 2-(amino, chlor, fluor, thio, methylthio)-6-(2-chlor-4-methoxyanilino)purin, 2-(amino, chlor, fluor, brom, nitro, thio, methylthio)-6-(2-chlor-5-methoxyanilino)purin, 2-(amino, chlor, fluor, brom, nitro, thio, methylthio)-6-(2-chlor-3-methoxyanilÍno)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methyIthio)-6-(2-brom-3-methoxyanilino)purÍn, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-methoxy-3-chloranilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methy Ith io)-6-(2-methoxy-4-ch loranil i no)puri n, nebo jejich farmaceuticky využitelných solí s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátu nebo opticky aktivních izomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, jako inhibitorů cytokinin oxidasy v zemědělství při produkci užitkových rostlin, ve tkáňových kulturách ke stimulaci proliferace a morfogeneze a/nebo v kosmetice.
3. 3. Použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů podle nároku 2 obecného vzorce I ze skupiny zahrnující s výhodou 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(3methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-hydroxy-3methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthÍo)-6-(2-chlor-3-36CZ 302225 B6 methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthio)-6-{2-brom-3methoxyanilino)purin, 2-(chlor, fluor, brom, amino, nitro, thio, methylthío)-ó-{
4. 4-hydroxyanilino)purin, s a jejich farmaceuticky využitelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, jakož i jejich adičnich solí s kyselinami, jako inhibitorů cytokinin oxidasy v zemědělství při produkci užitkových rostlin, ve tkáňových kulturách ke stimulaci proliferace a morfogeneze a/nebo v kosmetice.

   io 4. Použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2 obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy v kosmetice pro zpomalení senescence lidských pokožkových buněk, zejména keratinocytů a fibroblastů.
5. 5. Použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I podle nároku 1

   15 nebo 2 jako inhibitorů cytokinin oxidasy v zemědělství pro zvýšení výnosu a kvality zemědělských produktů.