CZ300774B6

CZ300774B6 - Substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty pro použití jako antagonisté cytokininových receptoru a prípravky obsahující tyto slouceniny

Info

Publication number: CZ300774B6
Application number: CZ20070691A
Authority: CZ
Inventors: Spíchal@Lukáš; Popa@Igor; Voller@Jirí; Doležal@Karel; Strnad@Miroslav; Werner@Tomas; Schmülling@Thomas
Original assignee: Univerzita Palackého; Freie Universität Berlin
Priority date: 2007-10-05
Filing date: 2007-10-05
Publication date: 2009-08-05
Also published as: EP2203451A2; US20100240537A1; WO2009043320A3; WO2009043320A2; CZ2007691A3; PL2203451T3; US20130130906A1; EP2203451B1

Abstract

Substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I pro použití jako antagonistu cytokininových receptoru, jako regulátoru rustu rostlin, ve kterých R1 znamená substituent vybraný ze skupiny zahrnující hydroxyl, amino, nitro, thio a alkyl skupinu, R2 znamená 1 až 4 alkyl skupiny.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká substituovaných 6-(alkylbenzylamino)purinových derivátů, jejich použití jako antagonistů cytokininových receptoru a přípravků obsahujících tyto sloučeniny.

io

Dosavadní stav techniky

Cytokininy jsou rostlinné hormony, které hrají klíčovou úlohu v rozdílných aspektech regulace růstu a vývoje. Celá skupina zahrnuje chemikálie s rozdílnými stupni strukturální podobnosti, i5 z nichž některé se vyskytují přirozeně v rostlinách, kdežto jiné byly připraveny chemicky (Mok& Mok Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52: 89—118, 2001). Přirozené cytokininy jsou adeninové deriváty, které je možné klasifikovat podle postranního řetězce na isoprenoidní nebo aromatické. Důležitými představiteli těchto dvou tříd jsou zeatin a 6-benzylaminopurin.

Cytokininy jsou centrálními regulátory buněčného cyklu a indukce buněčného dělení je považována za diagnostickou pro tuto skupinu rostlinných hormonů. Molekulární podstata této aktivity je pochopena pouze částečné a může se lišit u různých buněčných typů. Bylo prokázáno, že cytokininy kontrolují defosforylaci tyrosinu a aktivují p34^cdc2-podobnou H1 histonovou kinasu (Zhang et al., Planta 200: 2-12,1996), stejně jako transkripčně aktivují cytiin D3 (Riou-Khamli25 chi etal. Science 283: 1541-1544, 1999). Některé z důležitých fyziologických a vývojových procesů jakými jsou tvorba a aktivita apikálního meristému, vývoj květů, přerušení dormance pupenů a klíčení semen, které jsou kontrolovány cytokininy, mají přinejmenším funkční vazby s mechanismy kontroly buněčného cyklu.

Jak rostliny rozpoznávají cytokininy bylo po dlouhou dobu záhadou. Zcela nedávno se však podařilo identifikovat několik cytokininových receptorů v Arabidopsis (Inoue et al. Nátuře 409: 1060-1063, 2001) a Zea mays (Yonekura-Sakakibara etal. Plant Physiol. 134: 1 654-1 661, 2004). Arabidopsis má tři cytokininové receptory, AHK2, AHK3 a CRE1/AHK4. Všechny jsou membránově-lokalizované sensorové histidin kinasy s extracelulámí ligandvazebnou doménou a cytoplasmatickou His-kinasovou doménou. Bylo rovněž ukázáno, že cytokininový signál je transmitován několikakrokovým fosfát-přenosovým systémem, který byl známý u prokaryot a nižších eukaryot. U vyšších eukaryot jsou dvoučlenné signální dráhy známé pouze u rostlin (Ferreira & Kieber, Curr. Opin. Plant Biol. 8: 518-525,2005). Vývoj agonístů a antagonistů určitého fyziologického účinku je důležitý pro studium mechanismu účinku biologicky aktivních přirozených látek. Potenciální cytokininové antagonisty byly navrženy na základě domněnky, že se (1) aktivní cytokininy mohou vázat na jeden nebo více buněčných receptorů a (2) že bude možné připravit sloučeniny, které mají minimální cytokininovou aktivitu, avšak vysoký stupeň strukturální podobnosti umožňující jim kompetovat o dostupná receptorová vazebná místa, čímž omezí biologickou aktivitu cytokininů. Účinný přirozeně se vyskytující cytokinín N⁶-isopente45 nyladenin posloužil jako základ úvodních studií vztahů mezi strukturou a aktivitou. Modifikace heterocyklického purinového systému přinesla první analoga s antagonistickou aktivitou, která významně redukovala cytokininovou aktivitu v biotestech (Skoog & Armstrong, Annu, Rev. Plant Physiol. 21: 359-384, 1970; Skoog etal., Phytochemistry 6: 1 169-1 192, 1967). Identifikace třídy cytokininových antagonistů racionálními postupy naznačila, že další strukturálně příbuzné heterocyklické sloučeniny mohou mít cytokininovou antagonistickou aktivitu. Proto byla připravena řada substituovaných pyrrolo[2,3-J]pyrimidinů, pyrazolo[4,3-ťflpyrimídinů, striazinů, N-benzyl-N -fenylmočovin a N-arylkarbamátů, které byly testovány na schopnost ínhibovat cytokininy stimulované procesy v různých biotestech, jež prokázaly řadu látek jako potenciální anticytokininy (Hecht, Proč. Nati. Acad. Sci USA 68: 2608-2610, 1971; Skoog et al.

Phytochemistry 12: 25-37, 1973; Shimizu etal. J. Agríc. Food Chem.37: 236-240, 1989,

CZ 300774 Bó

Iwamura etal. Biochim. Biophys. Res. Commun. 57: 412-416, 1974; Hecht etal. 1976: US4, 282, 361; Skoog et al. 1981: US3,988, 338). Vzhledem ke strukturální podobnosti s přirozenými cytokininy a vzhledem k jejich antagonistickým účinkům, které byly reverzibilní v závislosti na zvyšujících se koncentracích cytokininů bylo předpokládáno, že tyto sloučeniny fungují skrze interakci se společným molekulárním cílem, tedy cytokininovými receptory (in Mok & Mok, CRC Press, Boča Raton, USA, pp.43-55, 1994). Nicméně, přímý důkaz, že cytokininové receptoiy jsou místem cytokinin-anticytokininové interakce chyběl, protože cytokininové receptory byly v té době neznámé. Nedávný objev a pochopení cytokininového signalingu nás motivoval k přezkoumání anticytokininového mechanismu účinku. Nejprve jsme prokázali, že reprezentaio tivní anticytokininy nejsou kompetitivními inhibitory dvou cytokininových receptorů zArabidopsis. S použitím velmi účinného anticytokininu 3-methyl-7-pentylaminopyrazolo[4,3-íř]pyrimidinu jsme prokázali, že tato sloučenina inhibuje progres v buněčném cyklu a vyvolává změny připomínající účinek inhibitorů cyklin-dependentních kinas (CDK). Potvrdili jsme rovněž inhibicí CDK anticytokininy u rostlin a lidí vazbou anticytokininu do ATP-vazebného místa lid15 ské CDK2 (Spíchal et al, J. Biol. Chem. 282: 14 356-63,2007).

Ze současných prací je patrné, že percepce cytokininů je nezbytným krokem v regulaci mnoha aspektů růstu a vývoje rostlin. Studium rostlin pozbývajících funkční cytokininové receptoryjednoduchých, dvojitých a kompletních mutantů - ukazuje, že snížená schopnost vnímat cyto20 kininy vede k ovlivnění růstu prýtu, oddálení senescence listů, zvětšení velikosti semen, zkrácení doby klíčení a zvětšení kořenového systému (Higuchi etal. Proč. Nati. Acad. Sci USA 101: 8821-8826, 2004; Nishimura et al. Plant Cell 16: 1365-1377, 2004; Riefler et al. Plant Cell 18: 40-54, 2006). Mutace způsobující vyřazení z funkce, nebo naopak zvýšenou aktivitu cytokininových receptorů luštěnin napomohly objasnění klíčového postavení percepce cytokininů při modu25 láci (Gonzalez-Rizzo et al. Plant Cell 18: 2680-2693, 2006; Murray et al. Science 315: 101-104, 2007; Tirichine etal. Science 315: 104-107, 2007). Inhibitor percepce cytokininů - antagonista cytokininových receptorů-aplikovaný v určité době růstu rostlin, nebo orgánově specificky by tak mohl najít široké využití v zemědělství.

V nedávné době jsme objevili první generaci antagonistů cytokininových receptorů založenou na substituovaných 6-(alkylbenzylamino)purinech. Mezi nejslibnější substituenty, ve smyslu přípravy specifických antagonistů, patří 2-hydroxy, 2-amino a 2-nitro skupiny. Nově připravené látky vykazují zajímavé in vivo účinky na růst modelových rostlin.

Předmětem tohoto vynálezu jsou cytokininová analoga vykazující unikátní růstověregulační účinky a selektivitu vůči cytokininovým receptorům, která jsou netoxická pro živočišné buňky.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I

- 2 .

ve kterém

R1 znamená substituent vybraný ze skupiny zahrnující hydroxyl, amino, nitro, thio a alkyl skupinu,

R2 znamená 1 až 4 alkyl skupiny, stejné nebo různé, a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, nebo jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako antagonisty cytokininových receptorů.

Výše uvedené generické skupiny máji významy uvedené v následující legendě, přičemž amino znamená skupinu -NH₂, nitro znamená skupinu -NO₂, thio znamená skupinu -SH, hydroxyl znamená skupinu -OH, alkyl znamená přímou nebo rozvětvenou aíkylovou skupinu obsahující 1 až 5 uhlíkových atomů.

Výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I ze skupiny zahrnující: 6-(2-amino-3-methylbenzylamino)purin, 6—(2— amino-4-methylbenzylamino)purin, 6-(2-amino-5-methylbenzyIamino)purin, 6-(2-amino-325 ethylbenzvlamino)purin, 6-(2-amino-5-ethylbenzylamino)purin, 6-(2-amino-3-isopropylbenzylamino)purin, 6-{2-amino-5-isopropylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy~3-methylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy-4-methylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy-5-methylbenzylaminojpurin, 6-(2-hydroxy-6-methylbenzylamino)purin, 6-~(2-hydroxy-3-ethylbenzylamino)purin, 6-{2-hydroxy-4-ethylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy-5-ethylbenzylamino)purin, 630 (2-hydroxy-6-ethylbenzytamino)purin, 6-(2-hydroxy-3-isopropylbenzylamino)purin, 6—(2— hydroxy-5-isopropylbenzylamino)purin, 6-(2-nÍtro-3-methylbenzylainino)purin, 6-(2-nitro-4— methylbenzylaminojpurin, 6-(2-thio-3-methylbenzylamino)purin, 6—(2-thio-5-methyIbenzylamino)purín, 6-(2-thio-3-ethylbenzylamino)purin 6-(2-hydroxy—3,5—dimethylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy-3,4-dimethylbenzyiamino)purin, 6-(2-hydroxy-3,6-dimethylbenzyl35 aminojpurin, 6-(2-hydroxy-3₎4,5-trimethylbenzylamino)purin, 6-(2-amÍno-3,5-dimethylbenzylamino)purin, 6-(2-amÍno-3,6-dimethylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy-3,5-diethylbenzylaminojpurin, 6-(2-hydroxy-3,6-diethyIbenzylamino)purin, a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy,

-3CZ 300774 B6 ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, nebo jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů.

Mimořádně výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou substituované 6-(methylbenzyl5 amino)purinové deriváty zahrnující zejména 6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino)purin a 6-(2hydroxy-5-methylbenzylamino)purin a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, nebo jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů.

ío Předmětem vynálezu jsou substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, nebo jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů pro morfogenní účinky vedoucí ke zvětšení kořenového systému rostlin.

Předmětem vynálezu jsou substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, nebo jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů pro urychlení nalévání semen a zvětšení velikosti semene a plodů rostlin a hub a pro zkrácení doby klíčení semen rostlin.

Předmětem vynálezu jsou substituované 6-(aIkylbenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, nebo jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů v tkáňových kulturách k regulaci proliferace a tnorfogeneze,

Předmětem vynálezu jsou substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, nebo jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů, zejména pro zvýšení výnosu a kvality zemědělských produktů.

Předmětem vynálezu jsou substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce l a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, nebo jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů při produkci užitkových rostlin, s výhodou obilovin (pšenice, ječmen, rýže, kukuřice, žito, oves, čirok a další druhy), řep (cukrová a krmná řepa); malvic, peckovic a bobulovin (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, jahody, maliny a ostružiny); vikvovitých rostlin (bob, čočka, hrách, sója); olejnin (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokos, Ricinus, kakaový bob, podzemnice olejna); Iilkovitých rostlin (dýně, okurky, melouny); přadných rostlin (bavlna, len, konopí, juta); citrusů (pomeranče, citrony, grapefruity, mandarinky); zeleniny (špenát, skořice, kafr) nebo rostlin jakými jsou tabák, ořešák, baklažán, cukrová třtina, čajovník, réva vinná, chmel, banány a přírodní kaučukovníkové a léčivé rostliny stejně tak jako okrasné rostliny. Plodiny zahrnují ty, které poskytují toleranci vůči třídám růstových faktorů konvenčním křížením nebo metodami genetického inženýrství. Plevely, jejichž růst může být kontrolován, zahrnují jak jednoděložné tak dvouděložné druhy, například Stellaria, Nasturtium, Agrostis, Digitaria, Avena,

Setaria, Sinapis, Lolium, Solárium, Echinochloa, Scirpus, Monochoria, Sagittaria, Bromus, Alopecurus, Sorghum halepense, Rottboellia, Cyperus, Abutilon, Sida, Xanbthium, Amaranthus, Chenopodium, Ipomoena, Chrysanthemum, Galium, Viola and Veronice.

Předmětem vynálezu jsou substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty obecného vzor50 ce I a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, nebo jejich adičních solí s kyselinami, pro použití při přípravě přípravků pro klonování rostlinných i savčích zárodečných buněk a embryí.

Vynález dále zahrnuje přípravky pro klonování rostlinných i savčích zárodečných buněk a embryí obsahující alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I či sůl takovéto sloučeniny

CZ 300774 Bó s alkalickým kovem, amoniakem Či aminem, ve formě racemátu nebo opticky aktivního izotneru, nebo jeho adiční soli s kyselinou, a pomocné látky.

Předmětem vynálezu jsou substituované 6~(alkylbenzylamino)purinové deriváty obecného vzor5 ce I ajejich soli s alkalickými kovy, amoniakem Či aminy, ve formč racemátů nebo opticky aktivních izomerů, nebo jejich adičních solí s kyselinami, pro použití při přípravě růstově-regulačních přípravků.

Vynález rovněž zahrnuje růstově-regulační přípravky obsahující alespoň jednu sloučeninu obec10 ného vzorce I či sůl takovéto sloučeniny s alkalickým kovem, amoniakem či aminem, ve formě racemátu nebo opticky aktivního izomeru, nebo jeho adiční soli s kyselinou, a pomocné látky.

Použití substituovaného 6-(alkylbenzylamino)purinového derivátu obecného vzorce I nebo jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem Či aminy, ve formě racemátů nebo opticky aktivních izome15 rů, nebo jejich adičních solí s kyselinami pro přípravu přípravku pro inhibici cytokininových receptorů.

Vynález dále zahrnuje přípravky pro inhibici cytokininových receptorů obsahující alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I či sůl takovéto sloučeniny s alkalickým kovem, amoniakem či aminem, ve formě racemátu nebo opticky aktivního izomeru, nebo jeho adiční soli s kyselinou, a pomocné látky.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou používány v nemodifikované formě, nebo s výhodou společně s pomocnými látkami běžně využívanými v přípravcích. Jsou přednostně používány koncentráty aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze a disperze, ředěné emulze, rozpustné prášky, prach, granuláty, krémy, gely, olejové suspenze a rovněž enkapsulované produkty, např. polymemí substance. Ve vztahu k typu přípravku je určena i metoda aplikace, například sprejování, atomizace, poprach, rozptyl, nátěr a polévání, která je zvolena ve vztahu k předurčenému použití a převažujícím okolnostem. Přípravky mohou být sterilizovány anebo obsahují další přídavné látky neutrální povahy, například konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, hnojivá, či donory mikrohnojiv nebo další přípravky za účelem získání speciálních účinků.

Sloučenina obecného vzorce I může být smíchána s dalšími růstovými regulátory za účelem dosažení synergického účinku.

Přípravky

Přípravky obsahující sloučeniny obecného vzorce I (aktivní složka) nebo jejich soli a pokud je třeba, jednu nebo více pevných nebo kapalných pomocných látek, jsou připraveny známými způsoby, například smísením nebo mletím účinné látky s pomocnými látkami, jako jsou např. rozpouštědla nebo pevné nosiče. Do přípravků mohou být přidávány povrchově aktivní látky (surfaktanty).

V závislosti na povaze sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli, která má být formulována, vhodné povrchově aktivní látky jsou neiontové, kationtové a/nebo aniontové povrchově aktivní látky ajejich směsi mající dobré emulzifikační, díspergační a zvlhčovači vlastnosti.

Příklady vhodných aniontových, neíontových a kationtových smáčedel jsou shrnuty například ve

WO 97/34485.

Pro přípravu formulací obsahujících antagonisty cytokininových receptorů na bázi substituovaných 6-(alkyIbenzylamÍno)purinových derivátů jsou podle tohoto vynálezu používána smáčedla konvěčně používaná při přípravách přípravků, které jsou popsány, např. v „McCutcheon's Deter55 gents and Emulsifiers Annual“ MC Publishing Corp., Ridgewood New Jersey, 1981, Stache, H,, „Tensid-Taschenbuch“, Carl Hanser Verlag, MunichNienna, 1981 and M. and J. Ash, „Encyclopedia of Surfactants“, Vol—lil, Chemical Publishing Co., New York, 1980—81.

Formulace přípravku s cytokininovým antagonistou obsahuje hmotnostně 0,1 do 99% (w/w), s zejména pak od 0,1 do 95 % (w/w) aktivní složky odpovídající látce nebo směsi látek obecného vzorce I, přičemž obsahuje i od 5 do 99,9% směsi přísad či farmaceutických nosičů, a to v závislosti na způsobech aplikace, a popřípadě obsahuje i váhově od 0,1 do 25 % smáčedla.

Ačkoliv jsou komerční produkty obvykle připravovány ve formě koncentrátů, konečný uživatel ío upotřebí nareděný přípravek. Kompozice může proto obsahovat i další přísady, jakými jsou stabilizátory, např. rostlinné oleje nebo epoxidizované rostlinné oleje (epoxidizovaný palmový olej

0; 1, řepkový nebo olivový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo emulgátory, viskozitní činidla, pojivá, lepidla, a také hnojivá a další aktivní přísady. S výhodou jsou využívány přípravky následujícího složení: (% = hmotnostní pro15 cento)

Emulgované koncentráty:

aktivní složka:

smáčedlo: kapalný nosič:

Prášky:

aktivní složka: pevný nosič:

Suspenzní koncentráty:

aktivní složka: voda: smáčedlo:

Smáčivé prášky:

aktivní složka: smáčedlo: pevný nosič:

Granule:

aktivní složka: pevný nosič:

až 90 %, s výhodou 5 až 20 % až 30 %, s výhodou 10 až 20 % 5 až 94%, s výhodou 60 až 85 %

0,1 až 10 %, s výhodou 0,1 až 5 % 99,9 až 90 %, s výhodou 99,9 až 95 % až 75 %, s výhodou 10 až 50 % 94 až 24 %, s výhodou 88 až 30 % 1 až 40 %, s výhodou 2 až 30 %

0,5 až 90 %, s výhodou 1 až 80 % 0,5 až 20 %, s výhodou 1 až 15 % 5 až 95 %, s výhodou 15 až 90 %

0,1 až 30 %, s výhodou 0,1 až 15 % 99,9 až 70 %, s výhodou 99,9 až 85 %

Kompozice mohou rovněž obsahovat další příměsi, jakými jsou stabilizátory, například rostlinné oleje nebo epoxidizované rostlinné oleje (epoxidizovaný kokosový olej, řepkový olej nebo sojový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační látky, regulátory viskozity, pojivá, zahušťovadla, a také hnojivá a další aktivní látky. Pro použití sloučenin obecného vzorce 1 nebo jejich solí, nebo kompozic je obsahujících, při ochraně rostlin před škodlivým vlivem růstových regulá50 torů se používají rozdílné metody a technologie, kterými jsou například následující:

£.

i) Obalování osiva

a) Obalování osiva smáčivou práškovou formulací sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli, a to mícháním vnádobč až do stejnorodé distribuce na povrchu semen (suché obalování).

Při takové proceduře je přibližně 1 až 500 g sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli, (4 g až 2 kg smáčívého prášku) používáno na 100 kg osiva.

b) Obalování osiva emulzífikovaným koncentrátem sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli, io v souladu s metodou a) (mokré obalování).

c) Obalování osiva cestou máčení semen po dobu 1 až 72 h v tekutině obsahující od 1000 1.10^-6(ppm) sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli, a s výhodou následného usušení semen (imerzní obalování).

Obalování semen nebo ošetření klíčících semen jsou upřednostňovanou metodou aplikace, protože ošetření aktivní látkou je určeno cílovou plodinou. Obecně jsou látky vzorce 1 nebo jejich soli používány v množství od l do 1000 g, s výhodou od 5 do 250 g, na 100 kg semen, avšak v závislosti na metodice, která rovněž umožňuje přidání dalších aktivních látek nebo mikroživin; určené koncentrační limity se mohou pohybovat nahoru nebo dolů (opakované obalování).

ii) Aplikace cisternové směsi

Kapalná formulace směsi růstového regulátoru a antidota je používána v hmotnostním poměru jednoho k druhému od 10:1 do 1:100, rychlost aplikace růstového regulátoru od 0,005 do 5,0 kg na hektar. Taková cisternová aplikace směsi se provádí před anebo po setí.

iii) Aplikace do semenné brázdy

Sloučenina obecného vzorce I nebo její sůl, je zavedena do otevřené brázdy oseté semenem ve formě emulzifikovaného koncentrátu, smáčivého prášku nebo granulí. Jakmile je semenná brázda zaklopena, je růstový regulátor aplikován cestou obvykle používanou při preemergentním procesu.

iv) Kontrolované uvolňování aktivních látek

Sloučeniny obecného vzorce I nebo jejich soli, jsou aplikovány v roztoku k minerálním granulovaným nosičům nebo polymerizovaným granulím (močovina, formaldehyd) a jsou vysušeny. V případě, že je to žádoucí, tak se provádí obalování, které umožňuje postupné uvolňování látky v měřitelných množstvích po určitou specifickou periodu (obalované granule).

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje vazebný test s CRE1/AHK4- a AHK3-obsahujícími membránami E. coli. (A) Vazba 2 nM 3HtZ byla testována v kombinaci se stoupající koncentrací kompetitoru 8, nebo v přítomnosti neznačeného /raws-zeatinu (tZ; positivní kontrola). (B) Dvojitě reciproké vynesení ukazující kompetitivní charakter inhibice vazby 3HtZ do receptoru CRE1/AHK4 látkou 8.

Obr. 2 ukazuje efekt látky 8 na cytokininem indukovanou expresi genu P_arrs::GUS. (A) Parrs-GUS transgennní semenáčky Arabidopsis inkubované s 2,5 μΜ 6-benzylaminopurinem (BA) za přítomnosti, či absence 5 μΜ látky 8; DMSO (0.1%) bylo testováno jako kontrola rozpouštědla použitého pro rozpouštění aplikovaných látek. (B) Kvantitativní vyjádření koncentračně závislého inhibičního účinku látky 8 na indukci exprese genu P_ARRp:GUS spuštěné 1 μΜ BA.

-7CZ 300774 B6

Obr. 3 znázorňuje antagonistický efekt látky 8 ve standardních cytokininových biotestech. (A) Efekt na proliferaci buněk cytokinin-depenentního kalusu Arabidopsis. (B) Efekt na cytokininem stimulovanou tvorbu betacyaninu v hypokotylech Amaranthu ve tmě. (C) Efekt na cytokininem stimulovanou retenci chlorofylu v listech pšenice.

Obr, 4 ukazuje in vivo účinek látky 8 na formování laterálních kořenů. (A) Počet laterálních kořenů formovaných semenáčky Arabidopsis (divoký typ) 10 dnů po vyklíčení - zleva: DMSO kontrola, tvorba postranních kořenů v přítomnosti cytokininu BA, látky 8, a kompetiční efekt při aplikaci obou látek. (B) Nárůst počtu postranních kořenů u rostlin Arabidopsis divokého typu io a receptorových mutantů rostoucích na médiu obsahujícím látku 8.

Obr. 5 ukazuje in vivo účinek látky 8 na klíčení. Zkrácení doby klíčení semen Arabidopsis divokého typu kultivovaných na médiu obsahujícím různé koncentrace látky 8 po přemístění ze tmy na bílé světlo (režim 16 hod den/8 hod noc).

Příklady provedení vynálezu

Výchozím materiálem pro přípravu sloučenin obecného vzorce I je 6-chlorpurín nebo 620 brompurin. Výchozí substituované benzylaminy, které nebyly komerčně dostupné (ostatní získány od Sigma Aldrich nebo Fluorochem), byly připraveny z odpovídajících aldehydů v přítomnosti katalyzátoru. Ty, které mají více methyl skupin, mohou být s výhodou připraveny z příslušných methyíbenzaldehydů. Hydroxyderiváty se připravují demetylací odpovídajících methoxyderivátů 48% HBr v N₂ atmosféře.

Elementární analýzy (C, H a N) byly měřeny na EA1108CHN analyzátoru (Fissons Instruments). Na zjišťování teploty tání byl použit přístroj BŮCHI Melting Point B-540. Analytická tenkovrstvá chromatografie (TLC) byla prováděna na destičkách silikagelu 60 WF;y (Merck), v mobilní fázi CHCI₃:MeOH:konc. NH₄OH (8:2:0,2, v/v/v). ES+ hmotová spektra byla naměřena za použití přímého nástřiku na Waters ZMD 2000 hmotovém spektrometru. Hmotnostní interval při měření byl 10- 1500amu. Spektra byla měřena za použití cyklických skenů o délce 3,0 sekundy, při napětí na vstupní štěrbině 25 V a teplotě vypařovacího bloku 150 °C, desolvatační teplotě 80 °C a průtoku desolvatačního plynu 200 1/hodinu, Získaná data byla zpracována pomocí programu MassLynx data systém. NMR spektra byla měřena na přístroji Bruker Avance

AV 300 pří teplotě 300 K a frekvenci 300,3 MHz (’H) respektive 75,48 MHz (ⁿC). Vzorky byly připraveny rozpuštěním daných látek v DMSO-d₆. Tetramethylsilan (TMS) byl použit jako interní standard.

Příklad 1

Příprava 6-(2-hydroxy-3-methyIbenzylamino)purinu mmol 6-chIorpurinu byly rozpuštěny v 15 ml butanolu a byly přidány 4 mmol 2-hydroxy-3~ 45 methylbenzylaminu a 5 mmol triethylaminu. Roztok byl zahříván na 90 °C po dobu 4 hodin.

Po ochlazení byl surový produkt odfiltrován a rekrystalován v etanolu. T.t. 276 až 277 °C. TLC: chloroform-metanol-amoniak (90:9:1): žádné nečistoty; bez výchozích látek, HPLC čistota: 98+ %. Výtěžek 92 %.

Tabulka 1

Látky připravené postupem podle příkladu 1

PŘIPRAVENÉ	CHN ANALÝZY	MS ANALÝZA-ZMD
	LÁTKY	[%]	[M-H]' .)	[M+H]⁺b>
1	6-(2*amitM>3-mMhylben2ylamino)puriii	060,8; H=5,7; N=32,7	253	255
2	6-{2-emini>4-methylbcnzylamino)purin	061,2; H=5,6; N“32,9	253	255
3	6-(2-emino-í-fnethylbenzy)ainiiK>)purin	061,2; H=*S,6;N“32,9	253	255
4	6-(2-amino-3-ethylben^lamino)purin	062,4; H-6,0;N-31,l	267	269
S	6-(2-«miiK>5-ethylbenzylainino)purin	062,5; H-6,0;N-31,2	267	269
6	6-{2-amino-3-Í3opropylben2ylamtno)ptirin	063,8; H=6,1;N“29,4	281	283
7	6-(2-amino-5-ísopropylben^laniiiio)purín	063,6; H-6,3; N-29,8	281	283
8	6-(2-hydroxy-3-methytbcnzylemino)piinn	C=60,9;H=5,4;N-273	254	256
9	6-<2-hydroxy4-methylbenzyl«mino)purin	060,5; H“53;N»27,2	254	256
to	6-{2-hydroxy-5-inethylbeiuylainino)purin	060,8; H-53.N-27.4	254	256
11	M2-hydroxy-6-methylbenzylsmino)punn	060,8; H“5,3; N“27,2	254	256
12	6-(2-hydroxy-3-ethylbenzyIainino)purin	062,4; H=5,5; N-25,9	268	270
13	6-(2-hydroxy-í-íthylbenzylamino)purin	C“62,3; H-5,5; N-25,8	268	270
14	6-(2-hydroxy-3-isopn>pylbeiuylimiin)purín	063,6; H=6,2;N=24.5	282	284
ÍS	6-{2-nitro-3-methytbenzylamino)piirin	C=54,7;H-43;N-29,3	283	285
16	6^2-mtro-5-methylbenzylanino)purin	C=54,8; H“4,3; N-29,3	283	285
17	6-{2-njtro-3-etfaylbenzytunino)purín	056,3; H-4,7; N-28,2	297	299
18	6-<2-thicH3-niethylbenzylaniino)purin	057,4; H=4,7;N=25,6	270	272
19	M2-1hio-5-methylbenzylamino)purin	057,3; H-4,7; N-25,7	270	272
20	6T2-thio-3<thyibcnzy!aniino)purin	058,3; H=53; N-24,6	284	286
21	6-(2-amino-3,5-dimethylben2ylamino)purin	062,5; H=5,9; N=30,9	267	269
22	6-(2-amino-3,6-dimethylbenzylamino)purin	O62,3;H=5,8;N-30,7	267	269
23	6<2-liydroxy-3,5-<liniethylbenaylamino)purin	C=62,2; H=5,5;N=25,8	268	270
24	6-(2-hydroxy-3,4-dimeihylbenzylBniino)purin	062,3; H=5,S;N=25,9	268	270
25	6-{2-hydroxy-3.6-dÍniethylbenzylaniino)purin	062,2; H-5,6; N=25,8	268	270
26	6-(2-hydiOxy-3₁4,5-trimethylbenzylamíno)purin	063,2; H=S,9; N=24,5	282	284
27	6-{2-hydroxy-3,5-díethylbcnzylainino)purin	C=64,0; H-6,6; N=23,2	296	298

-9CZ 300774 B6

Příklad 2

Testování agonistické aktivity na cytokininových receptorech

Escherichia coli kmene ΚΜΙ00Ι nesoucí plasmid pIN-III-AHK4 nebo pSTV28-AHK3 byly pěstovány přes noc při 25 °C vM9 médiu obohaceném 0,1% kasami novým i kyselinami do ODfioo-l. Prekultura byla naředěna 1:600 v 1 ml M9 média obsahujícího 0,1%kasaminových kyselin a k ní byl přidán 1 μΐ zásobního roztoku testované látky (10~⁷ M - 5 x 10 ⁵ M) nebo rozio pouštědla (DMSO, ethanol, methanol). Kultury byly dále kultivovány pří 25 °C v mikrotitraění destičce, 200 μΐ na jamku, po dobu 17 h v případě CRE1/AHK4 kultury a 28 h v případě AHK3 kultury. Poté byly kultury zcentrifugovány a 50 μΙ alikvoty supematantu byly přeneseny do mikrotitraění destičky obsahující 2 μΐ 50mM 4-methylumbelliferyl gaiaktosidu v každé jamce a následně inkubovány 1 h při 37 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 100 μΐ 0,2 M Na₂CO₃.

Fluorescence vzorků byla změřena spektrofotometrem Fluoroscan Ascent (Labsystems, Finsko) při vlnových délkách 365 nm (excitační) and 460 nm (emisní). Bylo stanoveno OD₆₀q zbylé kultury a aktivita β-galaktosidasy byla vyjádřena jako nmol 4-methyIumbelliferonu x ODmo ¹ x h ¹.

Hodnoty EC50, tedy koncentrace látky aktivující receptor z 50 %, byla spočtena ze získaných křivek odezvy. Látka účinkující jako cytokíninový antagonista by neměla aktivovat cytokininovou signální dráhu. V tabulce 2 jsou uvedené průměry ze tří opakování, celý test byl proveden nejméně dvakrát Nově připravené 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I vykazovaly výrazně sníženou afinitu k cytokininovým receptorům v porovnání s kontrolním cytokininem Zra/rv-zeatinem.

Tabulka 2

Účinek nových látek na aktivaci cytokininových receptorů Arabidopsis thaliana CRE1/AHK4 and AHK3.

č.	Testované látky	EC50 (gmol.L·¹)
CRE1/AHK4	AHK3
	Z/ww-zeatin	0,9	V
	ó-(benzylamino)piirin	19_f7	18,2
1	6-(2'amino-3-methylbenzylamino)purin	n.i.	n.i
2	6-(2-amino-4-methylbenzylainino)purin	n.i.	n.i
3	6-(2-aniino-5-methylbenzylannno)purin	n.i.	n.i
4	6-(2-amino-3-ethylbenzylamino)purin	n.i.	n.i
5	6-(2-amino-5-ethylbenzylamino)purin	n.i.	n.i
8	6-(2'hydroxy-3-methy!benzylamino)puTÍn	n.i.	>100
9	6-(2-hydroxy-4-methylbenzylamino)purin	n.i.	n.i
10	6-(2-hydroxy-5-methylbenzylamino)purin	n.i.	>100
11	6-(2-hydroxy-6-methylbenzylamino)purin	n.i.	n.i
12	6-(2-hydroxy-3-ethylbenzyIamino)purin	n.i.	n.i
13	6-(2-hyclroxy-5-ethylbenzylamino)purin	n.i.	n.i

t Λ

15	6-(2-nítro-3 -methy lbenzy lamino)purin	n.i.	>100
16	6-(2-nítro-5-methyIbenzylaniino)purin	n.i.	n.i
17	6-(2-nitro-3-ethylbenzylamino)purin	n.i.	n.i
19	6-(2-thio-5-methylbenzylamino)purin	n.i.	n.i
21	6-(2-amino-3,5-dimethylbenzylamino)purin	n.i.	n.i
23	6-(2-hydroxy-3,5-dimethy lbenzy lamino)purin	n.i.	n.í
24	6-(2-hydroxy-3,4-dimethylbenzylamino)purin	n.i.	n.i

n.i. znamená bez interakce

Příklad 3

Inhibice vazby přirozeného ligandu cytokininového receptoru 6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino)purinem (látka 8)

K vazebnému testu byly použity izolované membrány E. coli obsahující CRE1/AHK4 a AHK3 io receptory (viz příklad 2). Membrány byly izolovány a vazebný test byl proveden postupem publikovaným Románovém etal. (Romanov etal. Analytícal Biochemistry 347:129-134, 2005).

V testu byl posuzován vliv stoupající koncentrace kompetitoru (látka 8) na vazbu radioaktivně značeného přirozeného ligandu frans-zeatinu (³HtZ). Neznačený trans-zeatin (tZ) byl použít jako pozitivní a adenín jako negativní kontrola. Látka 8 snížila vazbu 3HtZ na 50% v koncentraci

3 μΜ (obr. 1), zatímco ani lOOOx vyšší koncentrace adeninu nebyla efektivní.

Příklad 4

Snížení indukce exprese cytokininového reportéru ARR5 vlivem aplikace cytokininového antagonisty 6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino)purinem (látka 8)

Cytokíniny specificky indukují expresi genu ARR5, který patří do rodiny typu A regulátorů odpovědi. P_arrs:GUS (D'Agostino et al. Plant Phystol, 124:1706-1717,2000) transgennní seme25 náčky Arabidopsis byly kultivované v MS médiu obsahujícím 2,5 μΜ 6-benzylaminopurin (BA) za přítomnosti, či absence 5 μΜ látky 8; DMSO (0,1 %) bylo testováno jako kontrola rozpouštědla použitého pro rozpouštění aplikovaných látek. Semena byla sterilizována 70% ethanolem a potom přidána do jamek 6-jamkové desky (TPP, Švýcarsko) obsahujících 3 ml MS média. Desky byly uloženy ve 4 °C ve tmě za účelem synchronizace klíčení. Poté byly desky přeneseny do fytotronu (22 °C, 16h světlo/8h tma), kde pak byla po 23 dnech po vyklíčení provedena aplikace testovaných látek přímo do media rostlin. V případě kvalitativního stanovení byly rostliny inkubovány s testovanými látkami 4 h, v případě kvantitativního testu 17 h. Kvalitativní stanovení - barvení GUS bylo provedeno podle Jeffersona et al. (Jefferson et al. EMBO J. 6: 3901-3907, 1987). Rostliny byly nejprve zbaveny zelených barviv 1 h inkubací v 90% acetonu při 4 °C, poté bylo provedeno barvení substrátem X-Glc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-(3-D-glucuronid, sodná sůl) po dobu 40 min při 37 °C. Reakce byla zastavena přenesením rostlin do 70% ethanolu. Jak je patrné z obrázku 2A, látka 8 vyvolala snížení úrovně exprese cytokininového reportéru ARR5:GUS indukovanou cytokíninem BA v kořeni i nadzemní části testovaných rostlin. Kvantitativní stanovení míry indukce genu ARR5:GUS bylo provedeno podle práce Romanova etal.

(Romanov etal. FEBS Letters 515: 39-A3, 2002). Po extrakci proteinů byla aktivita GUS (βglukuronidasa) stanovena po inkubaci s fluorogenním substrátem MUG (4-methylumbelliferyl glukuronid; 1 h, 37 °C) měřením fluorescence při 365 nm a 460 nm (excitační a emisní vlnové délky), jak je detailně popsáno v práci Spíchal et al. (Spíchal et al. Plant and Cell Physiology 45: 1299-1305, 2004). Kvantitativní stanovení potvrdilo, že pokles indukce exprese ARR5OUS

1 μΜ BA je závislý na aplikaci vzrůstající koncentrace látky 8 (obr. 2B). Tento pokles dokazuje,

- 11 CZ 300774 B6 že došlo k zablokování percepce cytokininu receptorem, byla tedy inhibována událost, která je lokalizována „up-stream“ vzhledem k odpovědi na účinek cytokininu.

Příklad 5

Testování vlivu nových látek na buněčné dělení rostlinných buněk

Stimulační vliv nově připravených derivátů byl testován v kalusovém biotestu za použití cytoío kinin-dependentního kal usu tabáku. Tento cytokinin-dependentní tabákový kalus Nicotiana tabacum L, cv. Wisconsin 38 byl udržován při 25 °C na modifikovaném mediu MurashigeSkoog (MS) obsahujícím na 1 litr: 4 μιηοΐ kys. nikotinové, 2,4 μπιοΙ pyridoxin hydrochloridu, 1,2 μπιοί thiaminu, 26,6 μπιοί glycinu, 1,37 μπιοί glutaminu, 1,8 pmol myoinositolu, 30 g sacharosy, 8 g agaru, 5,37 μηιοί a-naftyloctové kyseliny a 0,5 μπιοί 6-benzylaminopurinu. Subkulti15 vace probíhala každé 3 týdny. Čtrnáct dní před započetím biotestu byl kalus přenesen na médium bez 6-benzylaminopurinu. Stimulační růstová aktivita byla stanovena na základě nárůstu čerstvé hmoty kalusu po 4 týdnech kultivace. Pět replikátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a daný test byl opakován minimálně 2-krát. V každém experimentu byla použita jako kontrolní látka kinetin, který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokí20 niny byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na ΙΟ^-3 M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu IO^-8 až ΚΓ¹ M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2 % a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu.

Ze získaných dat byla opět vypočítána maximální účinná koncentrace testované látky a její relativní účinnost v této koncentraci (Tab. 3). 10 ⁶ M koncentrace kontrolní látky 6-benzylaminopurinu byla postulována jako 100% biologické aktivity.

Látka účinkující jako cytokininový antagonista by neměla mít stimulační vliv na buněčné dělení rostlinných buněk. Výsledky v tabulce 11 naznačují, že nově připravené 6—(alkylbenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I vykazovaly výrazný pokles až ztrátu cytokininové aktivity v kalusovém biotestu ve srovnání s klasickým cytokininem - ΙΟ“⁶ M koncentrace kontrolní látky 6-benzylaminopurinu byla postulována jako 100% biologické aktivity (BA).

Tabulka 3

Vliv nových antagonistů cytokininu na růst cytokinin-dependentního tabákového kalusu Nicotiana tabacum L. cv. Wisconsin 38

č.	Testovaná sloučenina	maximální účinná koncentrace (molT¹)	aktivita (%) [lOÝnol.l'¹ BA = 100%]
	ó-(benzylamino)purin	10*	100
1	6-{2-amino-3-methylbenzylamino)purin		n.a.
2	6-(2-amino-4-methylbenzylamino)purin		n.a.
5	6-(2-amino-5-methylbenzylamino)purin		n.a.
4	6-(2-amino-3 -ethy lbenzy iamino)purín		n.a.
5	ó-(2-amino-5 -ethy lbenzy lamino)purin		n.a.
8	6-(2-hydroxy-3-methyIbenzylamino)purin	io*	2 (±2)

9	6-(2-hydroxy-4-methylbenzyIamino)purin		n.a.
10	6-(2-hydroxy-5-methylbenzylamino)purin	KT*	35 (±8)
11	6-(2-hydroxy-6-methylbenzylamino)purin	10*	23 (±5)
12	6-(2-hydroxy-3-ethylbenzylamino)purin		n.a.
13	6-(2-hydroxy-5-ethylbenzylamino)purin		n.a.
15	6-<2-nitro-3-methylbenzylammo)purin		n.a.
16	6-(2-nitro-5-methylbenzylamino)purin		n.a.
17	6-(2-nitro-3-eíhylbenzylamino)purin		n.a.
19	6-{2-thio-5-methylbenzylamino)purin	KT*	1.3 (±1)
21	6-(2-amino-3,5-dimethy lbenzylamíno)purin		n.a.
23	6-(2-hydroxy-3,5-dimethylbenzylannno)purin		n.a.
24	6-(2-hydroxy-3,4-dimethy lbenzy lammo)purin		n.a.

n.i. znamená neaktivní

Příklad 6

Testování nových látek v amarantovém biotestu

Pro studium cytokíninové aktivity byl rovněž použit „amarantový“ biotest v následující modifikaci. Semena Amaranthus caudatus var. Atropurpurea byla povrchově sterilizována 10% Nio chlorbenzensulfonamidem (w/v) po dobu 10 min a poté promyta 5-krát deionizovanou vodou.

Semena byla rozmístěna v 15 cm Petriho miskách s filtračním papírem saturovaným destilovanou vodou. Po 72 hodinách kultivace při 25 °C ve tmě byly ze semenáčků odstraněny kořeny. Tyto explantáty obsahující 2 kotyledony a hypokotyl byly umístěny do 5 cm Petriho misek na 2 vrstvy filtračního papíru nasyceného 1 ml inkubačního média obsahujícího 10 pmol Na₂HPO4-KH₂PO₄, pH 6,8, 5 pmol tyrosinu a testovaný cytokinin. Na misku bylo umístěno 20 explantátů. Veškeré manipulace byly prováděny pod zeleným světlem v temné komoře. Po 48 hodinách inkubace při 25 °C ve tmě byl betacyanin extrahován cestou zmražení explantátů v 3,33 μΜ kyselině octové. Koncentrace betacyaninu byla stanovena porovnáním absorbancí při 537 a 620 nm a vypočtena pomocí vzorce ΔΑ = Α5_37ηπ, - A^o™· Hodnoty byly vyneseny do grafů závislosti ΔΑ na koncent20 raci. Pět replikátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a daný test byl opakován minimálně 2-krát. V každém experimentu byl použit jako kontrolní látka 6-benzylaminopurin, který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na 10³ M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10^-* až ΚΓ⁴ M. Finální koncentrace

DMSO v médiu nepřevýšila 0,2% a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. 10⁴ M koncentrace kontrolní látky 6-benzylaminopurinu byla postulována jako 100 % biologické aktivity.

Látka účinkující jako cytokinínový antagonista by neměla mít stimulační vliv na indukci betacy30 aninu v amarantovém biotestu. Stejně jako v případě kalusového testu vykazovaly nově připravené 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I výrazný pokles až ztrátu cytokininové aktivity ve srovnání s klasickým cytokininem 6-benzylaminopurinem (BA).

Příklad 7

Antisenescenční aktivity nových látek při testování v senescenčním biotestu na segmentech listů pšenice

Semena ozimé pšenice Triticum aestivum cv. Hereward byla promyta pod tekoucí vodou po 24 hod, a poté vyseta do vermikulitu nasyceného Knopovým živným roztokem. Nádoby se semeny byl umístěny do klimatizované růstové komory s 16/8 hodinovou světelnou periodou (světelná ío intenzita 50 mmol.m'².s^_1) a teplotou 15 °C. Po 7 dnech měly semenáčky vyvinutý první praporcový list a druhý list začínal prorůstat. Z prvních listů vždy od 5 rostlin byly odebrány vrcholové sekce dlouhé přibližně 35 mm, které byly zkráceny tak, aby jejich váha byla přesně 100 mg,

Bazální konce těchto 5 listových segmentů byly umístěny do jamek mikrotitračních polystyrénových destiček obsahujících 150 ml roztoku testovaného derivátu. Destičky byly umístěny do plašíš tového boxu vystlaného filtračním papírem, který byl nasycen vodou za účelem maximální vzdušné vlhkosti. Po 96 hodinách inkubace ve tmě při 25 °C byly listové sekce vyjmuty a chlorofyl extrahován v 5 ml 80% ethanolu zahřátím při 80 °C po dobu 10 min. Objem vzorku byl poté doplněn na 5 ní 1 přidáním 80% ethanolu. Absorbance extraktů byla měřena při 665 nm. Jako kontroly byly měřeny rovněž chlorofylové extrakty z listů a listových vrcholů inkubované v de20 ionizované vodě. Vypočtené hodnoty jsou průměrem z 5 opakování a celý experiment byl zopakován minimálně 2-krát. V každém experimentu byla použita jako kontrolní látka 6-benzylaminopurin, který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na 10‘³M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu ΚΓ* až 10¹ M. Finál25 ní koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2% a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. ΙΟ^-4 M koncentrace kontrolní látky 6-benzylaminopurinu byla postulována jako 100% biologické aktivity.

Látka účinkující jako cytokininový antagonista by neměla mít pozitivní vliv na oddálení senes30 cence v segmentech listů pšenice. Stejně jako v případě kalusového testu vykazovaly nově připravené 6-(alkylbenzylamÍno)purinové deriváty obecného vzorce I výrazný pokles až ztrátu cytokíninové aktivity ve srovnání s klasickým cytokininem 6-benzylaminopurinem (BA).

Příklad 8

Antagonistický efekt 6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino)purinu (látka 8) v cytokininem mediovaných procesech

Výše uvedené klasické biotesty (kalusový, amarantový, senescenční) byly dále použity pro ověření in vitro antagonistického účinku látky 8 na cytokininem mediované procesy. V testech byl použit cytokinin 0,5-1 μΜ BA k vyvolání cytokinin-dependentního efektu. Látka 8 byla aplikována buď samostatně v koncentraci 1 μΜ pro zjištění vlastní cytokininové aktivity, nebo v širší koncentrační škále od 10 nM- 10 μΜ v kombinaci s BA pro ověření antagonistického efektu.

Jak je zřejmé z obr. 3, ve všech použitých biotestech látka 8 významně snižovala biologický účinek aktivního cytokininu 6-benzylaminopurinu (BA) aplikovaného v jeho optimální koncentraci. Síla antagonistického účinku byla závislá na zvyšující se koncentraci látky 8.

.4

Příklad 9

In vivo účinek 6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino)purinu (látka 8) na zvětšení kořenového systému modelové rostliny Arabidopsis

Cytokininy jsou negativními regulátory růstu a vývoje kořenů. Rostliny Arabidopsis divokého typu, nebo transgenní rostliny se sníženou percepcí cytokininů byly pěstovány na MS médiu obsahujícím buď cytokinin 1 a 5 nM BA pro ověření inhibičního efektu cytokininů na zakládání ío postranních kořenů, nebo látku 8 v koncentraci 1 a 10 nM, nebo kombinaci těchto látek v koncentracích uvedených v obr. 4A. Jak je patrné z obr. 4A, cytokinin způsobil inhibici formování postranních kořenů. Aplikace látky 8 působila na tento efekt antagonisticky a vedla k obnovení přirozeného feno typu u rostlin stáří 14 dnů od vyklíčení, V případě, že byla do média aplikována pouze látka 8 v submikromolámích koncentracích, docházelo ke zvětšení kořenového· systému navýšením počtu postranních kořenů oproti kontrole. Z toho vyplývá, že látka 8 působí antagonisticky na endogenní hladiny cytokininů v kořenech modelových rostlin. U receptorových mutantů, které mají zachovaný vždy pouze jeden ze tří cytokininových receptorů byl efekt nejvýraznější u mutanta ahk2ahk3, což na in vivo úrovni potvrzuje, že látka 8 blokuje vazbu cytokininů do receptorů AHK4 (obr. 4B).

Příklad 10

In vivo účinek 6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino)purinu (látka 8) na klíčení semen modelové rostliny Arabidopsis

V průběhu klíčení semen bylo zjištěno, že semena inkubovaná na MS médiu obsahujícím látku 8 vyklíčila rychleji po přemístění ze tmy na světlo, než semena kontrolních rostlin (obr. 5). Po 30 hodinách vyklíčilo více než 60 % semen kultivovaných na médiu obsahujícím 1 nM lát30 ku 8, což představovalo dvojnásobné množství oproti kontrole, při vyšší koncentraci (10 nM) dosahoval počet vyklíčených semen až 80 %.

Stejně jako u předešlého příkladu se jedná o stejný efekt, který byl pozorovaný u receptorových mutantů se sníženou percepcí cytokininů (Riefler et al, Plant Cell 18: 40-45, 2006).

Příklad 11

In vitro cytotoxická aktivita nových derivátů

Jedním z předpokladů využití 6-(alkylbenzylamino)purinových derivátů v zemědělských aplikacích je absence toxického působení na člověka a zvířata. Standardním postupem je hodnocení toxicity látek na savčích, především lidských, buněčných liniích. Toxicita se mimo jiné projevuje snížením metabolické aktivity buňky, což je možné s výhodou hodnotit pomocí standardních testů založených na metabolizaci umělého substrátu na produkt detekovatelný např. spektrometricky. Naměřené hodnoty jsou pak dány jak počtem živých buněk v daném vzorku, tak jejich metabolickým stavem. Testy je možné s výhodou provádět v mikrotitrační destičce. Rozšířenou metodou používanou v programech pro screening léků a testech chemosensitivity je test založený na kvantifikaci metabolizace Calceinu AM. Calcein AM je v živých buňkách enzymaticky hydro50 lyžován na calcein, jehož kumulace se projeví zelenou fluorescencí.

Pro rutinní screening sloučenin byly používány následující lidské buněčné linie: normální diploidní lidské fibroblasty BJ, erythroleukemická linie K562, linie prsního karcinomu MCF-7, linie lidského osteosarkomu HOS a linie odvozená z lidského maligního melanomu G361.

- 15CZ 300774 Bó

Buněčné suspenze byly připraveny a naředěny na základě růstových charakteristik jednotlivých buněčných linií a podle očekávané konečné hustoty buněk (obvykle IO⁴ buněk na jamku). Do jednotlivých jamek 96-jamkové mikrotitrační destičky bylo pipetováno 80 μΐ buněčné suspenze, lnokuláty byly stabilizovány 24 hodinovou preinkubací při 37 °C, 100 % vlhkosti a v atmosféře obsahující 5,5 % COr Testované látky se obvykle ředily do šesti koncentrací v trojnásobné ředící řadě a k buňkám byly přidány v objemu 20 μΙ. Při rutinním testování byla nejvyšší sledovaná finální koncentrace obvykle 100 μΜ, případné změny závisely na fyzikálně chemických charakteristikách dané látky. Každá koncentrace testované látky byla testována v triplikátu. Inkubace buněk s testovanými deriváty trvala 72 hodin při 37 °C, 100 % vlhkosti a v atmosféře obsahující io 5,5% CO₂. Na konci inkubační doby byl k buňkám přidán roztok CalceinuAM (Molecular Probes) v PBS (finální koncentrace 1 pg/ml) a inkubace probíhala další 1 hodinu. Fluorescence (FD) byla změřena pomocí Labsystem FIA readeru Fluorscan Ascent (Microsystems). Efekt látky byl vyjádřen jako IC = (FD_{jamka s} derivátem /FDtarobii jamka) x 100 %. Hodnota IC₅₀, která odpovídá koncentraci látky způsobující 50% redukci esterázové aktivity byla vypočtena ze získaných dávkových křivek. Výsledky ukazuje tabulka 4.

Tabulka 4

Cytotoxicita nových sloučenin pro savčí buňky

Sloučenina	Použitá buněčná linie / IC₅₀ (pmoI/L)	Maximální testovaná koncentrace (pmol/L)
	BJ	K-562	MCF7	HOS	G-361
Kinetin	>100	>100	>100	>100	>100	100
isopentenyladenin	>100	>100	>100	>100	>100	100
benzyladenin	>100	>100	>100	>100	>100	100
/rans-zeatin	>100	>100	>100	>100	>100	100
meřa-topolin	>100	>100	>100	>100	>100	100
ortAo-topoIin	>100	>100	>100	>100	>100	100
Adenin	>100	>100	>100	>100	>100	100
8	>50	>50	>50	>50	>50	50
10	>100	>100	>100	>100	>100	100

Ze získaných výsledků vyplývá, že testované (alkylbenzylamino)purinové deriváty jsou v koncentračních rozmezích předpokládaných v zemědělských aplikacích netoxické.

Příklad 12

Sledování in vitro viability lidských diploidních fibroblastů pomocí MTT

MTT test je standardní kolorimetrickou metodou pro měření proliferace a přežívání buněk. Žluté MTT je v metabolicky aktivních buňkách redukováno na fialový formazan a ten je stanoven spektrofotometricky. Diploidní lidské fibroblasty SNF25 (19. pasáž) byly vysety do 96 jamkové mikrotitrační desky v počtu 5000 na jamku, po 6 hodinách bylo médium (DMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 10% fetálního telecího séra) odsáto a nahrazeno médiem obsahujícím testovanou látku v koncentračním rozmezí ΟΙ 00 μΜ. V případě nerozpustných látek byla maximální testovaná koncentrace upravena. Každá f

koncentrace byla testována v pentaplikátu. MTT bylo k buňkám přidáno po 72 hodinách (finální koncentrace 0,5 mg/ml) a inkubace probíhala 3 hodiny.

Absorbance vzniklého MTT byla po rozpuštění v DMSO změřena při vlnové délce 570 nm (refe5 renční vlnová délka 650). Cytotoxický účinek byl vyjádřen jako IC - (Aj^ ,^νήΐίη/Α^^ jamka)^x 100%. Hodnota IC_So, která odpovídá koncentraci látky způsobující 50% redukci mitochondriální aktivity byla vypočtena ze získaných dávkových křivek. Výsledky ukazuje tabulka 5.

io

Tabulka 5

Cytotoxicita nových sloučenin pro lidské diploidní fibroblasty

Sloučenina	ic₅₀ (μπιοΙ/L)	Maximální testovaná koncentrace (pmol/L)
kinetin	>100	100
isopentenyladenin	>100	100
benzyladenin	>100	100
trans-zeatin	>100	100
meto-topolin	>100	100
or/Ao-topolin	>100	100
adenin	>100	100
8	>50	50
10	>100	100

Z výsledků testování vyplývá, že testované látky nejsou pro lidské diploidní fibroblasty v koncentracích předpokládáných pro zemědělské aplikace toxické.

Příklad 13

Přípravky

Přípravky obvykle obsahují od 0,1 do 99 % (w/w), zejména pak od 0,1 do 95 % (w/w) aktivní složky odpovídající látce nebo směsi látek obecného vzorce I, od 1 do 99,9% (w/w) pevných nebo tekutých pomocných látek, a od 0,1 do 25 % (w/w), zejména od 0,1 do 25 % (w/w) surfaktantu. Zatímco komerční přípravky jsou obvykle formulovány jako koncentráty, koncový uživatel používá přípravek ředěný. Přípravek může zahrnovat i další komponenty jako stabilizátory, např. rostlinné oleje nebo epoxidované rostlinné oleje (epoxidovaný kokosový olej 0;l, řepkový olej, podzemnicový olej), protipěnivé látky, např. silikonový olej, konservační látky, látky regulující viskozitu, pojivá, látky zvyšující přilnavost, hnojivá, případně další aktivní složky. Preferované přípravky mají zejména toto složení (uvedena hmotnostní procenta):

Al. Emulaovatelné koncentráty	a)	b)	c)	d)
Aktivní složka	5%	10%	25%	50%
dodecylbenzensulfonát vápenatý	6%	8%	6%	8%
polyoxyethylovaný ricinový olej (polyglykol ether ricinového oleje)	4%	_	4%	4%

17CZ 300774 B6 (36 mol ethylen oxid)

oktylfenol polyglykol ether -	2%	2
(7-8 mol ethylen oxid cyklohexanon			10%	20%
směs aromatických uhlovodíků	83%	82%	53%	18%

C9-C12

Emulze o vyžadované finální koncentraci mohou být získány z takového koncentrátu zředěním

vodou.
A2. Roztoky	a)	b)	c)	d)
Aktivní složka	5%	10%	50%	90%
l-methoxy-3-(3-methoxypropoxy-propan	-	20%	20%	-
polyethylenglykol MW 400	20%	10%	-	-
N-methy 1-2-pyrro 1 idon	-	-	30%	10%
směs aromatických uhlovodíků	75%	60%	-	-

C9-C[₂

Roztoky jsou vhodné k aplikaci ve formě mikrokapének.

A3. Skučivé nráškv	a)	b)	c)	d)
Aktivní složka	5%	25%	50%	80%
lignosulfonát sodný	4%	-	3%	-
laurylsulfonát sodný	2%	3%	-	4%
diisobutylnaftalensulfonát sodný	-	6%	5%	6%
oktylfenol polyglykol ether -	1 %	2%	-
(7-8 mol ethylen oxid) vysoce disperzní kyselina křemičitá	1 %	3%	5%	10%
kaolin	87%	61%	37%

Aktivní složka je důkladně promísena s pomocnými látkami a směs je důkladně rozemleta ve 10 vhodném mlýnu. Suspenzi libovolné koncentrace je možné získat smísením vzniklého prachu s vodou.

A4. Potahované granule	a)	c)	c)
Aktivní složka	0,1 %	5%	15%
vysoce disperzní kyselina křemičitá	0,9 %	2%	2%
anorganický nosič	99,0 %	93%	83%

(0,1-1 mm) např. CaCO₃ nebo SiO₂

Aktivní složka je rozpuštěna v methylenchloridu a nasprejována na nosič. Rozpouštědlo je odpa15 reno ve vakuu.

o

A5. Potahované granule	a)	b)	c)
Aktivní složka	0,1 %	5%	15%
polyethylenglykol MW 200	1,0%	2%	3%
vysoce disperzní kyselina křemičitá	0,9 %	1 %	2%
anorganický nosič	98,0 %	92%	80%

(AE 0,1-1 mm) např. CaCO₃ nebo S1O2

Jemně rozemletá aktivní složka je v mixéru stejnoměrně nanesena na nosič zvlhčený polyethylen-

glykolem. Takto jsou získány neprašné granule.
A6. Extrudované granule	a)	b)	c)	d)
Aktivní složka	0,1 %	3%	5%	15%
lignosulfonát sodný	1,5%	2%	3%	4%
karboxymethylcelulosa	1,4%	2%	2%	2%
kaolin	97,0 %	93%	90%	79%

Aktivní složka je smísena a rozemleta s pomocnými látkami a složka je zvlhčena vodou. Směs je

extrudována a usušena v proudu vzduchu.
A7, Prachy	a)	b)	c)
Aktivní složka	0,1 %	1 %	5%
talek	39,9 %	49%	35%
kaolin	60,0 %	50%	60%

Prachy k přímému použití jsou získány rozemletím aktivní složky s nosičem ve vhodném mlýnu.

A8. SusDenzní koncentrát	a)	b)	c)	d)
Aktivní složka	3%	10%	25%	50%
ethylen glykol	5%	5%	5%	5%
nonylfenol polyglykol ether	1 %	2%	-
(15 mol ethylen oxid) lignosulfonát sodný	3%	3%	4%	5%
karboxymethylcelulosa	1 %	1 %	1 %	1%
37 % vodný roztok formaldehydu	0,2 %	0,2 %	0,2 %	0,2 %
emulse silikonového oleje	0,8 %	0,8 %	0,8 %	0,8 %
voda	86%	78%	64%	38%

Jemně rozemletá aktivní složka je smíchána s pomocnými látkami. Vzniklý suspenzní koncentrát 15 umožňuje přípravu suspenze o požadované koncentraci zředěním vodou.

19CZ 300774 B6

Příklad 14

Gel

Názvy složek jsou uváděny v souladu s terminologií registračních úřadů. Obsah složek je uváděn v gramech na 100 g.

Gel	/100 g
to Aktivní látka 6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino)purin(20H3MeBAP)	1,0 g
butylhydroxytoluen	(Nipanox BHT)	0,2 g
butylparaben	(Nípabutyl)	0,2 g
diethylenglykol monoethyl ether	(Transcutol P)	10,0 g
bezvodá koloidní silika	(Zeopharm 177)	5,0 g
15 propylenglykollaurát	(Lauroglycol FCC)	83,6 g

Konzistence gelu může být dále modifikována přidáním bezvodé koloidní siliky.

Účinek aktivní látky může být zvýšen pomocí transdermálního systému Transcutol P/Lauroglycol 20 FCC. Bezvodá koloidní silika pravděpodobně zpomalí penetraci účinné látky, což povede k protrahovanému účinku.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Substituované 6-(alkylbenzylamÍno)purinové deriváty obecného vzorce I ve kterém

35 R1 znamená substituent vybraný ze skupiny zahrnující hydroxyl, amino, nitro, thio a alkyl skupinu,

R2 znamená 1 až 4 alkyl skupiny, stejné nebo různé,

40 a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, nebo jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů.
2. Substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty podle nároku 1 vybrané ze skupiny

5 zahrnující 6-(2-amino-3-methylbenzylamino)purin, 6-(2-amino-4-methylbenzylamino)purin,

6-(2-amino~5-methyIbenzyIamino)purin, 6-(2“amino-3-ethylbenzylamino)purin, 6-(2-amino_ 5-ethylbenzylamino)purin, 6-(2-amino-3-ÍsopropylbenzyIamino)purin, 6-{2-amÍno-5-isopropylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy-4-methylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy-5-methylbenzylamíno)purín, 6-(2-hydroxy-6-methylbenzylio aminojpurin, 6-(2-hydroxy-3-ethylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy-4-ethylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy-5-ethylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy_6-ethylbenzylamino)purin, 6(2-hydroxy-3-isopropylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy-5-isopropyIbenzylamino)purin, 6(2-nitro-3-methylbenzylamino)purin, 6-{2-nitro-4-methylbenzy!amino)purin, 6-(2-thio-3methy lbenzy lamino)purin, 6-(2-thio-5-methylbenzylamtno)purin, 6-(2-thio-3-ethylbenzyl15 aminojpurin, 6-(2-hydroxy-3,5-dimethylbenzylamino)purin, 6-{2-hydroxy-3,4-dimethyIbenzylammo)purin, 6-(2-hydroxy-3,6-dimethylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy-3,4,5-trimethy lbenzy laminojpurin, 6~(2-amino-3,5-dimethylbenzylamino)purin, 6-(2-amino-3,6dimethylbenzylaminoípurin, 6-(2-hydroxy-3,5-diethylbenzylamino)purin, 6-(2-hydroxy-3,6diethy lbenzylamino)purin, a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě race20 mátů nebo opticky aktivních izomerů, nebo jejích adičních solí s kyselinami, pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů.
3. Substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty podle nároku 2 vybrané ze skupiny

25 zahrnující 6-(2-hydroxy~3-methylbenzylamino)purín a 6-(2-hydroxy-5-methy lbenzy lam ino)purin a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních izomerů, nebo jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů.

30
4. Substituované 6-ýalkylbenzylamino)purinové deriváty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů pro morfogenní účinky vedoucí ke zvětšení kořenového systému rostlin.
5. Substituované 6-(alkylbenzyIarnino)purinové deriváty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3

35 pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů pro urychlení nalévání semen a zvětšení velikosti semene a plodů rostlin a hub a pro zkrácení doby klíčení semen rostlin.
6. Substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů ve tkáňových kulturách k regulaci prolife40 race a morfogeneze.
7. Substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů pro zvýšení výnosu a kvality zemědělských produktů.
8. Substituované 6-{alkylbenzylamino)purinové deriváty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů při produkci užitkových rostlin, zejména obilovin, řep, malvic, peckovic a bobulovin, vikvovitých rostlin, olejnin, lilkovitých rostlin, přadných rostlin, citrusů, zeleniny, nebo rostlin vybraných ze skupiny zahrnující tabák, ořešák, bakla50 žán, cukrová třtina, čajovník, réva vinná, chmel, banány, přírodní kaučukovníkové a léčivé rostliny a okrasné rostliny.
9. Substituované 6-(alky lbenzy lam ino)purinové deriváty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů při kontrole růstu plevelů.

-21 SVVIIH BÓ
10. Substituované 6 (alkylbenzylaniino)punnové deriváty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití při přípravě přípravků pro klonování rostlinných i savčích zárodečných buněk a embryí.

5
11. Přípravky pro klonování rostlinných i savčích zárodečných buněk a embryí, vyznačující se tím, že obsahují alespoň jeden substituovaný 6-(alkylbenzylamino)purinový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 a pomocné látky.
12. Substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 ío pro použití při přípravě růstově regulačních přípravků.
13. Růstově-regulační přípravky, vyznačující se tím, že obsahují alespoň jeden substituovaný 6-(alkylbenzylamino)purinový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 a pomocné látky.
14. Substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití při přípravě přípravků pro inhibici cytokininových receptorů.
15. Přípravky pro inhibici cytokininových receptorů, v y z n a č u j í c í se t í m, že obsahují
20 alespoň jeden substituovaný 6 (alkylbenzylamino)purinový derivát podle kteréhokoliv z nároků

1 až 3 a pomocné látky.