CZ307722B6 - Adeninové deriváty a jejich použití - Google Patents

Adeninové deriváty a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ307722B6
CZ307722B6 CZ2015-582A CZ2015582A CZ307722B6 CZ 307722 B6 CZ307722 B6 CZ 307722B6 CZ 2015582 A CZ2015582 A CZ 2015582A CZ 307722 B6 CZ307722 B6 CZ 307722B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
alkyl
tetrahydrofuran
purine
ylmethylamino
amino
Prior art date
Application number
CZ2015-582A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2015582A3 (cs
Inventor
Martin Hönig
Lucie Plíhalová
Karel DoleĹľal
Jiří Voller
Miroslav Strnad
Lukáš Spíchal
Jitka Vostálová
Alena Rajnochová Svobodová
Jitka ULRICHOVÁ
Alena Kadlecová
Ondřej Plíhal
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Palackého v Olomouci filed Critical Univerzita Palackého v Olomouci
Priority to CZ2015-582A priority Critical patent/CZ307722B6/cs
Priority to EP16762957.5A priority patent/EP3341371B1/en
Priority to US15/753,828 priority patent/US10774084B2/en
Priority to PCT/CZ2016/050029 priority patent/WO2017036434A1/en
Publication of CZ2015582A3 publication Critical patent/CZ2015582A3/cs
Publication of CZ307722B6 publication Critical patent/CZ307722B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/26—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with an oxygen, sulphur, or nitrogen atom directly attached in position 2 or 6, but not in both
    • C07D473/32—Nitrogen atom
    • C07D473/34—Nitrogen atom attached in position 6, e.g. adenine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N3/00—Preservation of plants or parts thereof, e.g. inhibiting evaporation, improvement of the appearance of leaves or protection against physical influences such as UV radiation using chemical compositions; Grafting wax
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/40—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with halogen atoms or perhalogeno-alkyl radicals directly attached in position 2 or 6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/52—Stabilizers
    • A61K2800/522—Antioxidants; Radical scavengers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Předkládané řešení poskytuje adeninové deriváty obecného vzorce I substituované v polohách C2, N9 a na aminoskupině, které mají antisenescenční a kombinované fotoprotektivní UVA/UVB účinky. Tyto látky jsou vhodné zejména jako antisenescenční a UV-fotoprotektivní složky v kosmetických přípravcích, v přípravcích pro ochranu rostlin a v přípravcích pro ošetření tkáňových kultur.

Description

Adeninové deriváty a jejich použití
Oblast techniky
Vynález se týká adeninových derivátů majících kombinované antisenescenční a UVfotoprotektivní účinky proti záření UVA i UVB. Dále se týká jejich použití a přípravků je obsahujících.
Dosavadní stav techniky
6-Furfúrylaminopurin (kinetin) je látka ze skupiny rostlinných hormonů cytokininů, jež jsou N6substituovanými deriváty adeninu. Kinetin byl objeven v padesátých letech minulého století a byl považován za tzv. růstový faktor, protože pozitivně ovlivňoval dělení buněk tabákového kalusu. Exogenní aplikace kinetinu indukuje buněčné dělení a morfogenezi buněk rostlinného kalusu, anebo například oddaluje senescenci listů. Kromě vlivu na rostlinné buňky vykazuje kinetin také účinky na buňky živočišné. Má antioxidaění vlastnosti a brání oxidačnímu poškození DNA, inhibuje oxidační a glykaění poškození proteinů, dokáže ovlivňovat růst keratinocytů a oddaluje stárnutí lidských kožních fibroblastů in vitro, aniž by látka měla efekt na proliferaci těchto fibroblastů. Derivát kinetinu 6-furfurylamino-9-(2-tetrahydropyran-2-yl)purin (obchodní název Pyratine), který je v současné době komerčně využíván v kosmetických přípravcích, byl připraven spojením protektivní tetrahydropyranylové skupiny s molekulou kinetinu. Tato strukturní modifikace vedla ke zlepšení antisenesceněních a antioxidaěních účinků na rostlinné i živočišné buňky, a to i při testech prováděných na lidské kůži nebo jejích modelech.
V posledních letech narůstá množství UV záření, zejména jeho středních (UVB) a dlouhých (UVA) vlnových délek, které dopadá na povrch Země, a tento nový fenomén přispívá u lidí k rozvoji řady kožních onemocnění a poruch. UVB záření představuje asi 4 až 5 % celkového objemu záření a proniká do kožní epidermis, kde způsobuje přímé i nepřímé nežádoucí biologické účinky. UVA záření tvoří 90 % celkového podílu záření a proniká hlouběji do papilámí dermis a částečně i do hypodermis (10 %), kde způsobuje vznik tzv. reaktivních sloučenin kyslíku (ROS) a dusíku (RNS). Chronické vystavení kůže UVA záření může vést k tzv. předčasnému stárnutí kůže, které je spojeno s poškozením struktury dermis a jehož důsledkem je vznik vrásek, pigmentových skvrn, aj. Přirozenou endogenním fotoprotektivní látkou je melanin, ale v lidské kůži se ho netvoří dostatek, zejména v souvislosti se zvyšující se intenzitou UV záření dopadajícího na Zemi, vlivem úbytku ozonu v atmosféře, a změnou životního stylu (více outdoorových aktivit, oděv zakrývající menší část povrchu těla). Pokud je kůže ošetřena látkou, která zamezuje pronikání zejména UV paprsků, může ji chránit před předčasným stárnutím ale i krátkodobým nežádoucím účinkům UV záření.
Většina přípravků, které dnes využívají kosmetické přípravky k ochraně před slunečním zářením, tzv. sunscreens (UV filtry), byly vyvinuty, aby chránily především před škodlivějším” UVB zářením, které může vyvolat vznik zhoubného melanokarcinomu. Sunscreens se dělí na fyzikální (anorganické minerální látky, které vytvářejí fyzikální překážku záření na kůži, jako například T1O2 nebo ZnO) a chemické (organické látky schopné absorbovat radiaci změnou distribuce elektronů - například benzofenony, cinamáty, salicyláty). U některých stávajících sunscreens byly popsány nežádoucí účinky, spojené zejména s fotoalergickou nebo fotoiritující reakcí při používání těchto přípravků. Častým problémem těchto látek je také fotonestabilita.
Původci předkládaného vynálezu nalezli látky, které neočekávaně jeví kombinované antisenescenční účinky a UV-fotoprotektivní účinky (UVB i UVA). Tyto látky jsou velmi stabilní, a zároveň nejsou foto toxické a ani neiritují ošetřenou tkáň.
- 1 CZ 307722 B6
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je použití adeninových derivátů obecného vzorce I
(I) a jejich farmaceuticky přijatelných solí s alkalickými kovy, amoniakem, aminy, nebo adičních solí s kyselinami, kde
R2 je vodík nebo halogen;
R6 je vybrán ze skupiny zahrnující
- heteroaryl s 5- až 6-ělenným aromatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, přičemž heteroaryl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
- heteroarylalkyl s 5- až 6-ělenným aromatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž heteroarylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1-C4) alkyl;
- heterocyklyl s 5- až 6-ělenným alifatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, přičemž heterocyklyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
- heterocyklylalkyl s 5- až 6-ělenným alifatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž heterocyklylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1-C4) alkyl;
- cykloalkyl s kruhem obsahujícím 5 až 6 atomů uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl -C4)alkyl;
- cykloalkylalkyl s kruhem obsahujícím 5 až 6 atomů uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž cykloalkylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1-C4) alkyl;
-2CZ 307722 B6
- isoalkyl obsahující 3 až 7 atomů uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1-C4) alkyl, jako UV-fotoprotektivních složek v kosmetických přípravcích, v přípravcích pro ochranu rostlin a/nebo v přípravcích pro ošetření tkáňových kultur.
Heteroaryl s výhodou obsahuje 5-členný kruh, výhodněji obsahuje v 5-členném kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S. Nejvýhodněji je heteroaryl vybrán z furan-2-ylu a thiofen-2ylu.
Heteroarylalkyl s výhodou obsahuje 5-členný kruh a C1-C2 alkyl, výhodněji obsahuje v 5členném kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S. Nej výhodněji je heteroarylalkyl vybrán z furan-2-ylmethylu (furfurylu) a thiofen-2-ylmethylu.
Heterocyklyl s výhodou obsahuje 5-členný kruh, výhodněji obsahuje v 5-členném kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S. Nejvýhodněji je heterocyklyl vybrán ze skupiny zahrnující tetrahydrofuran-2-yl a tetrahydrothiofen-2-yl.
Heterocyklylalkyl s výhodou obsahuje 5-členný kruh a C1-C2 alkyl, výhodněji obsahuje v 5— členném kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S. Nejvýhodněji je heterocyklylalkyl vybrán ze skupiny zahrnující tetrahydrofuran-2-ylmethyl (tetrahydrofurfuryl) a tetrahydrothiofen-2ylmethyl.
Cykloalkylem je s výhodou cyklopentyl. Cykloalkylalkylem je s výhodou cyklopentylmethyl.
Isoalkylem je s výhodou isopropyl, isobutyl, isopentyl, isohexyl, isoheptyl.
Halogen je vybrán ze skupiny zahrnující fluor, chlor, brom, jod. S výhodou je halogenem chlor.
V jednom výhodném provedení jsou látky obecného vzorce I vybrány ze skupiny zahrnující: 6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(5-methylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(5-hydroxymethylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(5-formylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-( 1 -furan-2-y lethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(5-methyltetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(l-tetrahydrofuran-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(cyklopentylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(3-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(5-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(5-chlorthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(5-bromthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-( 1 -thiofen-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-furfurylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-(5-methylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-(5-hydroxymethylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-formylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-(l-furan-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-(5-methyltetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(l-tetrahydrofuran-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-(thiofen-2-ylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
-3CZ 307722 B6
2-chlor-6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-(3-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5~chlorthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-bromthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(l-thiofen-2-ylethylamino)-9-(tetrahydro-2-chlor-6-(cyklopentylmethylamino)-9(tetrahydrofuran-2-yl)purin.
Výhodněji jsou látky obecného vzorce I vybrány ze skupiny zahrnující: 6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-furfurylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin.
Ve výhodném provedení se uvedené látky použijí jako složky s kombinovaným antisenesceněním a UV-fotoprotektivním účinkem.
Látky podle předkládaného vynálezu jeví kombinované antisenescenční a UV-fotoprotektivní účinek. UV-fotoprotektivní účinek byl pozorován pro záření UVA i UVB. Jsou tedy vhodné jako složky kosmetických přípravků, přípravků na ochranu rostlin a přípravků pro ošetření tkáňových kultur. Kosmetické přípravky s těmito složkami jsou zejména vhodné pro aplikaci na pokožku, srst či vlasy savců. Přípravky pro ošetření tkáňových kultur jsou vhodné zejména pro ošetření kultur buněk rostlin i savců, například keratinocytů a fibroblastů.
Předmětem vynálezu jsou dále adeninové deriváty obecného vzorce I per se (I) a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem, aminy, nebo adiční soli s kyselinami, kde
R2 je vodík nebo halogen;
R6 je vybrán ze skupiny zahrnující
- heteroaryl s 5- až 6-členným aromatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, přičemž heteroaryl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
- heteroarylalkyl s 6-členným aromatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž heteroarylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním
-4CZ 307722 B6 substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
- heteroarylalkyl s 5-členným aromatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž heteroarylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
- heterocyklyl s 5- až 6-členným alifatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, přičemž heterocyklyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
- heterocyklylalkyl s 5- až 6-členným alifatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž heterocyklylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
- cykloalkyl s kruhem obsahujícím 5 až 6 atomů uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1-C4) alkyl;
- cykloalkylalkyl s kruhem obsahujícím 5 až 6 atomů uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž cykloalkylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl.
Předmětem vynálezu jsou ve výhodném provedení adeninové deriváty obecného vzorce I per se, vybrané z:
6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(5-methyltetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(l-tetrahydrofuran-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(cyklopentylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-(3-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-chlorthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-bromthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-( 1 -thiofen-2-y lethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-(5-methyltetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(l-tetrahydrofuran-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-(thiofen-2-ylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-(3-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-chlorthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-bromthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(l-thiofen-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(cyklopentylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin.
Přípravky
Vhodné podání pro kosmetickou aplikaci je lokální, topické. Přípravky zpravidla obsahují od 0,1 do 95 hmotn. % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahují přednostně od 10 do 90 hmotn. % aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují přednostně
-5CZ 307722 B6 od 1 do 10 hmotn. % aktivní látky. Formy aplikace jsou např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Přípravky pro ochranu rostlin a pro ošetření tkáňových kultur jsou nejčastěji ve formě roztoku, spreje, disperze nebo suspenze. Přípravky jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, rozpouštěcími nebo lyofilizačními procesy.
Roztoky aktivních látek, suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze a disperze, mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizovaných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem jako je například mannitol.
Olejové suspenze obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8 až 22, s výhodou pak 12 až 22 uhlíkových atomů, např. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antioxidantů, např. vitaminu E, β-karotenu nebo 3,5-di-tertbutyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá více než 6 uhlíkových atomů a je mono- nebo polyhydrická, např. mono-, di- nebo trihydrické alkoholy jako methanol, ethanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich isomery, ale hlavně glykol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyl oleát, isopropyl myristát, isopropyl palmitát, Labrafil M 2375” (polyoxyethylen glycerol trioleát, Gattefoseé, Paříž), Labrafil M 1944 CS” (nenasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složený z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž), Labrasol (nasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž), Miglyol 812” (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce Cs až C12 od Huls AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sezamový olej, sójový olej a olej z podzemnice olejně.
Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70 %, ale přednostně 20 až 50 % vody nebo vodné fáze. Tukovou fázi tvoří uhlovodíky, např. vazelína, parafínový olej nebo tvrdé parafíny, které přednostně obsahují vhodné hydroxysloučeniny jako mastné alkoholy a jejich estery, např. cetyl alkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin pro zlepšení kapacity pro vázání vody. Emulgátory jsou odpovídající lipofilní sloučeniny jako sorbitanové estery mastných kyselin (Spaný), s výhodou sorbitan oleát nebo sorbitan isostearát. Aditiva k vodné fázi jsou např. smáčedla jako polyalkoholy, např. glycerol, propylen glykol, sorbitol a polyethylen glykol, nebo konzervační prostředky či příjemně vonící látky.
Mastné masti jsou nevodné a obsahují jako bázi hlavně uhlovodíky, např. parafin, vazelínu nebo parafínový olej, a dále přírodní nebo semisyntetické tuky, např. hydrogenované kokosové triglyceridy mastných kyselin nebo hydrogenované oleje, např. hydrogenovaný ricínový olej nebo z podzemnice olejně, a dále částečné glycerolové estery mastných kyselin, např. glycerol mono- a distearát. Dále obsahují např. mastné alkoholy, emulgátory a aditiva zmíněná v souvislosti s mastmi, která zvyšují příjem vody.
Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50 % vody. Používané olejové báze jsou mastné alkoholy, např. isopropyl myristát, lanolin, včelí vosk, nebo uhlovodíky, s výhodou vazelína (petrolátum) a parafínový olej. Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, např. estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethylenoxy adukty, např. polyglycerických mastných kyselin nebo polyethylen sorbitanové estery či kyselé estery polyglycerických mastných kyselin (Tween), dále polyoxyethylenové étery mastných alkoholů nebo polyoxyethylenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátory, jako alkalické soli sulfátů mastných alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, cetylsulfát sodný nebo stearylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetyl stearyl alkoholu nebo stearyl alkoholu. Aditiva k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrání krémy před vyschnutím, např.
-6CZ 307722 B6 polyalkoholy jako glycerol, sorbitol, propylen glykol a polyethylen glykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonící látky.
Pasty jsou krémy nebo masti obsahující práškové složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, např. oxidy titanu nebo oxid zineěnatý, a dále talek či silikáty hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci.
Pěny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako chlor-fluor deriváty nižších alkanů, např. dichlorfluormethan a dichlortetrafluorethan, nebo přednostně nehalogenované plynné uhlovodíky, vzduch, N2O či oxid uhličitý. Používané olejové fáze jsou stejné jako pro masti a také jsou používána aditiva tam zmíněná.
Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-ethanolickou bázi, ke které jsou přimíchány zvlhěovadla pro snížení odpařování, jako jsou polyalkoholy, např. glycerol, glykoly a polyethylen glykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethylen glykolu, tj. lipofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže ethanolem, a pokud je to nutné i ostatní neutrální látky a aditiva.
Vynález je dále objasněn s pomocí příkladů, které ale jeho rozsah dále neomezují.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Příprava 6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purinu (1)
6-Chlor-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin (1 g; 4,46 mmol) byl umístěn do varné baňky spolu s npropanolem (50 ml). Ke vzniklé suspenzi byl přidán tetrahydrofurfurylamin (554 μΐ; 5,36 mmol) spolu s triethylaminem (Et3N) (3,2 ml; 22,3 mmol). Reakční směs byla pod zpětným chladičem zahřívána na teplotu 100 °C. Doba reakce byla 4 h. Po zahuštění byla reakční směs extrahována pomocí kontinuálního extraktoru (EtOAc:H2O; 24 h). Ethylacetátová (EtOAc) frakce byla následně vysušena pomocí Na2SO4. Takto předěištěná reakční směs byla rozdělena pomocí sloupcové chromatografie s mobilní fází (EtOAc:MeOH:NH3; 34:1:1; v:v).Výtěžek: 74,6 %. Ή NMR (500 MHz, DMSO-J6), ppm: 1,53 - 1,64 (m, 1 H); 1,69 - 1,89 (m, 3 H); 1,95 - 2,02 (m, 1 H); 2,11 - 2,23 (m, 1 H); 2,30 - 2,44 (m, 2 H); 3,37 - 3,48 (m, 1 H); 3,48 - 3,53 (m, 1 H); 3,53 3,60 (m, 1 H); 3,70-3,76 (m, 1 H); 3,81 -3,90 (m, 1 H); 3,98 (q, 7 = 7,03 Hz, 1 H); 4,09 (q, J = 7,44 Hz, 1 H); 6,21 (dd, J = 6,88, 3,82 Hz, 1 H); 7,63 (br. s„ 1 H); 8,17 (br. s„ 1 H); 8,21 (s, 1 H).
Tabulka 1: Látky připravené způsobem podle příkladu 1
C.
Elementární analýza vypočteno/nalezeno
i : L.............................................................. %C ......1__________________________________ %H %N ES MS [M-tHf 1
6,6/6,6 ! 24,2/24,3 ____1____________________ 2903
H tetrahydrofúr^ Η 1 58,1/58,0
2 5-hydroxyinethyifuran-2.... ylmethyl H L------------ H 60,2/60,1 $,7/5,7 23,4/23,5 3003
3 57,1/57,2 $,4/5,4 1 22,2/22,5 3163
4 · 5-fortnyhuran-2-ylniethyl H 57,5/57,6 1 4,8./4,8 | 22,4/22,2 314,3
|j Ufuran-2-ylethyl H 60,2/60,1 1 5,7/5,8 i 23,4/23,5 1 300,3
6 5-methyÍtetrahy<lrofuran’2ylmethyl H 59,4/59,3 1 7,0/7,0 I 23,1/23.2 304,4 ____________________________________________:____________________________\
-7 CZ 307722 B6
c Elementární analýza vy pík teno/nakze no
%c ········.; i %H ES Jai MS
y. Utetrahyfe Ϊ I| : 59,4/59,2 23,1/23,2 : 3( 14,4
8 i cykfopentylmethyl |h 62,7'62,9 7,.4/7,5 24,4/24,5 18,4 |
Příklad 2: Příprava 6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purinu (9)
6-Chlor-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin (0,5 g; 2,23 mmol) byl umístěn do varné baňky spolu s n-propanolem (25 ml). Ke vzniklé směsi byl přidán 2-thiofenmethylamin (275 μΐ; 2,68 mmol) spolu s EtsN (1,6 ml; 11,15 mmol). Vzniklá směs byla pod zpětným chladičem za stálého míchání zahřívána na 100 °C. Po 3 hodinách bylo přidáno (23 μΐ; 0,23 mmol) 2thiofenmethylaminu. Reakce byla následně za 1,5 h ukončena. Reakční směs byla poté odpařena a přečištěna extrakcí kapalina-kapalina (EtOAc:H2O). EtOAc frakce byla vysušena pomocí Na2SO4 a odpařena. Odparek byl přes noc krystalizován z diehyletheru při 4 °C.
Výtěžek: 61 %. Ή NMR (500 MHz, DMSO-J6) δ ppm 1,92 - 2,00 (m, 1 H); 2,12 - 2,22 (m, 1 H); 2,31 - 2,38 (m, 1 H); 2,38 - 2,43 (m, 1 H); 3,85 (td, J = 7,68, 6,34 Hz, 1 H); 4,08 (td, J = 7,68. 6,50 Hz, 1 H); 4,79 (br. s., 2 H); 6,21 (dd, J= 6,88, 3,82 Hz, 1 H); 6,88 (dd, J= 5,04, 3,44 Hz, 1 H); 6,97 (dd, J= 3,40, 1,03 Hz, 1 H); 7,27 (dd, J = 5,12, 1,22 Hz, 1 H); 8,23 (s, 2 H); 8,36 (br. s., 1 H).
Tabulka 2: Látky připravené způsobem podle příkladu 2
A / Rž Elem< ___________vypN %C i mtánii as iteno/nak alýza i izeno__i ES MS [M+Hf
9 10 thielhi*2-ylmetliyl H 55,8/55,6 ' 5,0/54 23,2/23,3 302,4
i . 3 -meíhyItíUofe^ íí 57,1/57,2 5,4/5,5 22,222,3' 316,4
11 : 5 -methy 1 th i of en-2-y Imethy l li 57,1 /57,0 5,4/5,3 22,2/224. 316,4 i
12 i 5-chtoi^thiofen-2*ýimethyl H 50,0'504 4,2/4,3 20,9/20,8 336,8
13 5*brómothíd^^ H 44,2/44,1 3,7/3,8 i 8.448,5 381,3
14 14hiofen*2~y fetíiy 1 H 57,1/57,0 5,4/5,5 22,222,0. 316,4
Příklad 3: Příprava 2-chloro-6-furfurylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purinu (15)
2,6-Dichlor-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin (0,5 g; 1,93 mmol) byl umístěn do varné baňky spolu s n-propanolem (25 ml). Ke vzniklé suspenzi byl přidán furfurylamin (204 μΐ; 2,31 mmol) spolu s EtsN (1,35 ml; 9,65 mmol). Reakční směs byla pod zpětným chladičem za stálého míchání zahřívána na teplotu 100 °C. Po 5 h byla reakce ukončena. Jestliže látka nevykrystalizovala z reakční směsi, byla reakční směs po zahuštění za horka rozpuštěna ve směsi (CHC13:EtOH; 1:8; v:v), nebo za pokojové teploty v směsi (CHC13:Ether; 1:7; v:v). Po ochlazení byla vzniklá suspenze přefiltrována přes fritu a filtrační koláč byl promyt destilovanou vodou. Po vysušení byl
-8CZ 307722 B6 filtrát za horka rozpuštěn v ethanolu (EtOH), petroletheru, karbofiltrován a krystalizován při 4 °C.
Tabulka 3: Látky připravené způsobem podle Příkladu 3
Λ ———. ....... . . .. . ..... ,
Ά I ::: I § Elementární Sít i _ vypcctem^ale alýzíí i zeno
..... {..................... 1 %C j %N 1 ESMS I
: .5:............................... : [MTHJ $
15 | £urfíityl | Cl I 52,6/52,5 |44/4,3 21,9/21,7 320,7 i
16 1 | Cl | 54,0/54,1 1 4,8/44 21,»4 3344 j
Ý j_____________ylWthyl ____________: I ci 5 j 51,5/51,6 j 4,6/4,7 20,0/20,1 3504 1
18 j 5-fonn}dfuran-2-^ 1 ci 1 514/514 14.174,2 20,1/204 3484 :
19 | 1 -furan-2-yleíhyl 1 ci 1 544/54,1 14,8/4,9 21MU 3M4:
20 | tetrahydrofuraii-2-ylmethyl | ci 1 51,9/514 1 5,6/5,7 21,6/21,5 2334
Λ _______yltnethyl.................: 1 ci s______ 1 534/534 16,0/6,0 20,7.40,5 1384 i
22 1-tetraltydraftiram^ i Cl | 53,3/534 | 6,0/6,1 20,7/20,6: 338,8 1
23 thioíen-2Almethyi Cl 1 50,1.50,1 1 X24J 20,9/20,8 336^8:
3-ínethýfehió^ ' vlnwhvl Cl 5.1,5/51,6' 1 4,6/44 20,0/20,2 350,8
1 yuhguíy 1
j 5-methylthio fen-2- ....________ytoeihyl __________ Cl 51.,5/514 4,6/4,7 204/20,1 3504
| 26 5-chlorthi^^ Cl 454/454 3,5/377 : 18,9/184 371,3 :
27 $ 5^óhithiáf^ i ..................................,............ 1 α 40,6/40,5 1 3,273.1 164/164 415,7 1
28 í 'U&iofetó-yle^yi 1 Cl Cl 51,5 A 1,6 14,6/44 20,6/20,1 3504 :
1 .. ... i 29 i eyklopentyl^ i t .....1........ ' ; ' __________j 56,0/564 J 6,3/64 214/214 3224
Příklad 4: Cytotoxicita nových derivátů pro kožní buňky stanovená MTT in vitro testem
MTT test je standardní test toxicity založený na fotometrickém měření schopnosti metabolicky aktivních buněk redukovat MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid) na formazan. V testu byl sledován vliv 72 hodinového působení několika koncentrací látek (šestinásobná ředicí řada, maximální koncentrace = 50 μΜ) na viabilitu kožních fibroblastů BJ a 15 keratinocytů HaCaT. 5000 buněk bylo vyseto do jednotlivých jamek 96 jamkové mikrotitraění destičky 24 hodin před přidáním testovaných látek. Jako negativní kontrola bylo použito DMSO vehikulum. Po 72 hodinovém působení bylo přidáno nové médium s MTT (Sigma, M2128) do konečné koncentrace 0,5 mg/ml. Po třech hodinách bylo médium odstraněno a formazan
-9CZ 307722 B6 obsažený v buňkách rozpuštěn v DMSO. Absorbance byla změřena při 570 nm (640 nm referenční vlnová délka). Hodnoty IC50 byly vypočteny z dávkových křivek. 6Furfurylaminopurin ribosid byl použit jako pozitivní kontrola. Byly obdrženy následující výsledky:
Tabulka 4: Cytotoxicita stanovená MTT in vitro testem
: Látka IC50 ( μΜ)
1 dimethylsulfoxid >100
ΐ 6-(tetrahydiOfuran-2-yhnethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yr)purin >100
i 6-(thiofen~2-ylmethylammo)-941etrahydiOfuram2~yl)at^^^ j ' ............. >100
2 -chlor - 6-furfurylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin >100
1 6-furfurylamino-9-ribosylpurin (srovnávací látka) 1___. <3
Příklad 5: Zpomalení stárnutí listů pšenice a zpomalení degradace chlorofylu při testování nových derivátů v senesceněním biotestu
Nádoby se semeny ozimé pšenice Triticum aestivum cv Hereward vyseté do vermikulitu nasyceného Knopovým živným roztokem byly umístěny do klimatizované růstové komory s 16/8 hodinovou světelnou periodou (světelná intenzita 50 mmoLnrV1’) a teplotou 15 °C. Po 7 dnech měly semenáčky vyvinutý první praporcový list a druhý list začínal prorůstat. Z prvních listů vždy od 10 rostlin byly odebrány vrcholové sekce dlouhé přibližně 35 mm, které byly zkráceny tak, aby jejich váha byla přesně 100 mg. Bazální konce těchto 10 listových segmentů byly umístěny do jamek mikrotitraěních polystyrénových destiček obsahujících 150 ml roztoku testovaného derivátu. Destičky byly umístěny do plastického boxu vystlaného filtračním papírem, který byl nasycen vodou za účelem maximální vzdušné vlhkosti. Po 96 hodinách inkubace ve tmě při 25 °C byly listové sekce vyjmuty a chlorfyl extrahován v 5 ml 80% ethanolu zahřátím při 80 °C po dobu 10 min. Objem vzorku byl poté doplněn na 5 ml přidáním 80% ethanolu. Absorbance extraktů byla měřena při 665 nm. Jako kontroly byly měřeny rovněž chlorofylové extrakty z listů a listových vrcholů inkubované v deionizované vodě. Vypočtené hodnoty jsou průměrem z 10 opakování a celý experiment byl zopakován minimálně 3krát. Výsledky těchto experimentů byly vyneseny ve formě grafů závislosti obsahu chlorfylu v senesceněních listech na koncentraci aplikované látky. V každém experimentu byla použita jako pozitivní kontrolní látka 6-benzylaminopurin, který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na výslednou koncentraci 10“3 M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10“8 až 10^ M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2 % a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. Ze získaných dat byla vypočítána maximální účinná koncentrace testované látky a její relativní účinnost v této koncentraci (Tab. 5). 10^ M koncentrace BAP byla postulována jako 100 % biologické aktivity. Jako další srovnávací látka byl použit kinetin. Nově připravené látky převyšují zpravidla účinnost BAP standardu v rozmezí o 10 %. Nově vyvinuté látky mají tedy výraznější antisenescenění účinky než známé látky.
Tabulka 5: Účinek nových cytokinů na retenci chlorofylu v extirpovaných listových segmentech pšenice. Hodnoty v tabulce jsou vyjádřeny v % výchozího obsahu chlorofylu v čerstvých listech před inkubací.
- 10CZ 307722 B6
Látka maximální účinná koncentrace (mol.l·1) účinnost (%) [ΙΟΛηοΙ.Γ1 BAP = 100%]
BAP (srovnávací látka) 10’4 100±l
kinetin (srovnávací látka) W4 98±4
6-furfiirylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)piirin 10’1 ' 114±3
6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9- (tetrahydrofuran-2-yl)purin 10'4 122±2
6-(t.etrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9- (tetrahydrofuran-2-yl)purin 10'4 125±9
6-(thiofen-2-ylmethylannno)-9-(tetrahydrofuran-2yl)purin 10’4 112±5
2-chlor - 6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9(tetrahydrofuran-2-yl)purin 10’4 127±5
Příklad 6: In vitro cytotoxická aktivita nových derivátů na nádorových buněčných liniích
Jedním z parametrů používaných jako základ pro cytotoxickou analyzuje metabolická aktivita životaschopných buněk. Například mikrotitrační analýza, kde se používá Calcein AM, je dnes rozšířena jako metoda kvantifikace buněčné proliferace a cytotoxicity. Množství zredukovaného Calceinu AM odpovídá počtu životaschopných buněk v kultuře.
Buněčné linie prsního karcinomu MCF-7, lidské erythroleukemie K562, lidské diploidní fibroblasty BJ a lidské keratinocyty HaCaT byly použity pro screening cytotoxicity sloučenin. Buňky byly udržovány v Nunc/Coming 80 cm2 plastových lahvích a pěstovány v médiu pro buněčné kultury (DMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 10% fetálního telecího séra a hydrogenuhličitan sodný). Buněčné suspenze byly připraveny a naředěny podle typu buněk a podle očekávané konečné hustoty buněk (104 buněk na jamku na základě charakteristik buněčného růstu), bylo pipetováno 80 μΐ buněčné suspenze na 96-jamkové mikrotitrační destičky. Inokuláty byly stabilizovány 24 hodinovou preinkubací při 37 °C v atmosféře CO2. Jednotlivé koncentrace testovaných látek byly přidány v čase nula jako 20 μΐ alikvotní podíl do jamek mikrotitračních destiček. Obvykle byly sloučeniny testovány v šesti koncentracích v čtyřnásobné ředicí řadě. Při rutinním testování byla nejvyšší koncentrace v jamce 166,7 μΜ, změny této koncentrace závisí na dané látce. Všechny koncentrace byly testovány v dubletu. Inkubace buněk s testovanými deriváty trvala 72 hodin při 37 °C, 100% vlhkosti a v atmosféře obohacené CO2. Na konci inkubační periody byly buňky analyzovány po přidání roztoku Calceinu AM (Molecular Probes) a inkubace probíhala další 1 hodinu. Fluorescence (FD) byla měřena pomocí Labsystem FIA readeru Fluorskan Ascent (Microsystems). Přežití buněk (The cell survival-TCS) bylo spočítáno podle následujícího vztahu: GI5o=(FDjamka s derivátem /FDkontroiní jamka) x 100 %. Hodnota GI50, která odpovídá koncentraci látky, kdy je usmrceno 50 % buněk, byla vypočtena ze získaných dávkových křivek.
Pro vyhodnocení protinádorové aktivity byla testována toxicita nových derivátů na panelech obsahujících buněčné linie rozdílného histogenetického a druhového původu (Tab. 6, GI50 koncentrace uváděny v μΜ). Ukázalo se, že pro všechny testované nádorové linie i pro nemaligní buněčné linie BJ a HaCaT bylo působení nových sloučenin netoxické. Účinné deriváty zabíjí nádorové buňky při koncentracích blízkých 0,1 až 50 μΜ.
-11CZ 307722 B6
Tabulka 6: Cytotoxicita látek podle vynálezu pro různé buněčné linie
Látka j MCF-7 K.562 BJ HaCaT
[ó-fiirfuryiam íno-9-(letrahydrofurari-2-y !)purin >100 >100 >100 >100
j 6-(t e trahyd refuran-2-ylm etby 1 am ino)-9-(te trahy drofu rau2-yi)purin >100 >100 >100 >100
|6-(tliíofen-2~ylmtfhylamiuo)-9~(telrahydrolw lyl)purin >100 >100 >100 >100
|2-chlor - 6-(tetrahydtOfuran-2-yimethylamino)-9- |(tetrahydrofuran-2-yi)purin >100 >100 >100 >100
Příklad 7: In vitro test fotoxických účinků na lidské kožní fibroblasty
Možné fototoxické účinky látek byly stanoveny podle modifikovaného in vitro testu validovaného pro stanovení fototoxicity látek (Spielmann a kol., 1998). Jako in vitro model byly použity normální lidské kožní fibroblasty (NHDF). Buňky byly izolovány z fragmentů kůže od zdravých dárců, kteří podstoupili chirurgický zákrok na Oddělení plastické a estetické chirurgie FN Olomouc. Odběr tkáně a izolace buněk proběhla podle postupu a podmínek schválených Etickou komisí FN Olomouc a Lékařské fakulty UP Olomouc a po podepsání informovaného souhlasu s odběrem tkáně jednotlivými dárci. Pro experimenty byly NHDF použity mezi 2. a 4. pasáží. NHDF byly vysety na 96-jamkové desky v koncentraci 0,8.105 buněk/ml kultivačního média (DMEM doplněné o fetální telecí sérum (10%), penicilín (100 mg/ml) a streptomycin (100 U/ml)) v množství 0,2 ml na jamku.
Testovanou látkou byl 6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 1. Látka byla rozpuštěna v DMSO a poté ředěna do média bez séra (DMEM s penicilinem (100 mg/ml) a streptomycinem (100 U/ml)). Výsledné aplikované koncentrace byly 3,9 až 500 Dmol/l. Jako kontrola bylo použito médium bez séra s DMSO (0,5 % (v/v)), což odpovídá jeho výsledné koncentraci při experimentu s testovanými látkami. Pro srovnání s tetovanými látkami byl použit chlorpromazin (CPZ; 0,8 až 50 pmol/l) jako pozitivní fototoxická látka. Po 24 hodinách od vysetí NHDF bylo růstové médium vyměněno za médium bez séra obsahující testované látky nebo DMSO (rozpouštědlová kontrola). Roztoky testovaných látek byly paralelně aplikovány na dvě 96-jamkové desky s NHDF. Po 1 hodinové preinkubaci s látkami bylo médium odstraněno, buňky byly dvakrát opláchnuty roztokem PBS a poté bylo aplikováno PBS s glukózou (1 mg/ml). Následně byla jedna deska ozářena netoxickou dávkou (5 J/cm2) UVA záření. Druhá deska byla po dobu ozařování inkubována v temnu. K ozáření byl použit solární simulátor SOL 500 vybavený H1 filtrem (Dr. Hóenle Technology, Německo), který propouští záření v rozsahu vlnových délek 320 až 400 nm. Intenzita UVA záření byla při každém ozařování stanovena pomocí UVA-metru (Dr. Hóenle Technology, Německo). Po UVA expozici bylo PBS s glukózou odstraněno a k buňkám bylo aplikováno médium bez séra. Po 24 hodinové inkubaci (37 °C, 5 % CO2) byla sledována životnost buněk (respektive buněčné poškození) stanovením inkorporace neutrální červeně (NČ) do buněk. Po odstranění média bez séra byl k buňkám aplikován roztok NČ (0,03 %; PBS). Po 1 hodinové inkubaci (37 °C, 5 % CO2) byl roztok s NČ odstraněn, buňky byly fixovány směsí formaldehydu (0,5 %, v/v) a CaCE (1 %, m/v) v poměru 1:1a barvivo bylo rozpuštěno extrakčním roztokem (methanol (50 %, v/v), CH3COOH (1 %, v/v). Po 5 minutovém intenzivním třepání byla změřena absorbance při 540 nm. Experimenty byly provedeny ve 4 nezávislých opakováních s použitím buněk od 4 dárců kvůli minimalizaci individuálních rozdílů v citlivosti buněk. Fototoxický účinek látek byl hodnocen určením procent životnosti kontrolních buněk (% životnosti kontroly) z hodnot příslušných absorbancí podle následujícího vztahu:
... ..... _ ΜΛ-Χ)Κ_
Životnost % kontroly) - : ........ ........ 400 -4)1
- 12 CZ 307722 B6
Av... absorbance vzorku (buňky pre-inkubované s testovanými látkami v médiu bez séra a následně ozářené)
Ak ... absorbance kontroly (buňky inkubované s DMSO v médiu bez séra a ozářené)
Ap ... absorbance pozadí (extrakční roztok)
Výsledek: Testovaná látka nejevila v použitém koncentračním rozmezí, tj. 3,9 až 500 pmol/l, fototoxické účinky (nedošlo ke snížení životnosti buněk ~ schopnosti inkorporovat NČ ve srovnání s kontrolními buňkami). Výsledky jsou znázorněny v tabulce (Tab. 7). Současně byl jako pozitivní kontrola použit CPZ, který je doporučován validovaným postupem (Spielmann H, Balls M, Dupuis J, Pape WJ, Pechovitch G, de Silva O, Holzhutter HG, Clothier R, Desolle P, Gerberick F, Liebsch M, Lovell WW, Maurer T, Pfannenbecker U, Potthast JM, Csato M, Sladowski D, Steiling W, Brantom P., Toxicol In Vitro. 1998 Jun 1; 12(3):305-27) jako známá fototoxická sloučenina, viz Tab. 8. Z výše uvedených výsledků vyplývá, že testovaná látka je bezpečná při použití do kosmetických a dermatologických přípravků, i ve spojení s následnou expozicí jí ošetřené pokožky slunečnímu záření.
Tabulka 7: Účinky látky 1 na životnost NHDFstimulovaných UVA zářením (+UVA) ve srovnánís kontrolou inkubovanou v temnu (-UVA).
Koncentrace % kot ttroly
(μηιοΙ/Ι) -UVA +UVA ~~
3,9 96,6 4 (7,4) 105,1 4 (10,3)
7,8 106,5 4 (9,2) 110,6 4(10,7)
153 99.6 ± (3,7) 106,8 ± (13,4)
313 102,4 4(2,1) 1.09,5 ±(10)
623 102,3 4(5,8) 103,3 4(8,9)
125 109,5 ± (10,5) 107,5 4 (8,9)
250 109,1 4(6,7) 106,74(7,8)
500 105,3 4(11,1) 98,9 4 (4,2)
Tabulka 8: Pro srovnání: účinky fototoxického chlorpromazinu na životnost NHDF stimulovaných UVA zářením (+UVA) ve srovnánís kontrolou inkubovanou v temnu (-UVA).
Koncentrace (pmol/l)
0,8
1,6
3,1
123
CPZ___ % kontroly
- UVA+UVA
102,6 4(5,8) 101,54(1) 105,6 4 (6)
107,4 ±(4,6) 104 4(3,8) 77 4(7,8) 4,7 ± (4,2)
99,2 ± (7,1)
104,6 ± (7,7)
87,3 4 (8,6)
82,8 4(15,4)
49,6 4 (17,6) 19,84(14,2)
9,8 4 (7,8)
-13 CZ 307722 B6
Příklad 8. In vitro test fotoprotektivních účinků na normální lidské kožní fíbroblasty
Jako in vitro model byly použity normální lidské kožní fíbroblasty (NHDF). Buňky byly izolovány z fragmentů kůže od zdravých dárců, kteří podstoupili chirurgický zákrok na Oddělení plastické a estetické chirurgie FN Olomouc. Odběr tkáně a izolace buněk proběhla podle postupu a podmínek schválených Etickou komisí FN Olomouc a Lékařské fakulty UP Olomouc a po podepsání informovaného souhlasu s odběrem tkáně jednotlivými dárci. Pro experimenty byly NHDF použity mezi 2. a 4. pasáží. NHDF byly vysety na 96-jamkové desky v koncentraci 0,8.105 buněk/ml kultivačního média (DMEM doplněné o fetální telecí sérum (10%), penicilín (100 mg/ml) a streptomycin (100 U/ml)) v množství 0,2 ml na jamku.
Testovanou látkou byl 6-tetrahydrofurfurylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 1. Látka byla rozpuštěna v DMSO a poté ředěna do média bez séra (DMEM s penicilinem (100 mg/ml) a streptomycinem (100 U/ml)). Jako kontrola bylo použito médium bez séra s DMSO (0,5 % (v/v)), což odpovídá jeho výsledné koncentraci při experimentu s testovanými látkami. Po 24 hodinách od vysetí NHDF bylo růstové médium vyměněno za médium bez séra obsahující testované látky nebo DMSO (rozpouštědlová kontrola). Testovaná látka byla paralelně aplikována na dvě 96-jamkové desky s NHDF. Po 60 min inkubaci bylo médium s látkami odstraněno, buňky byly dvakrát opláchnuty roztokem PBS a bylo aplikováno PBS s glukózou (1 mg/ml). V případě sledování ochrany vůči UVA záření byla následně jedna deska ozářena cytotoxickou dávkou UVA záření (7,5 J/cm2) s využitím solárního simulátoru SOL 500 (Dr. Hóenle Technology, Německo) vybaveným H1 filtrem, který propouští záření v rozsahu vlnových délek 320 až 400 nm. Při sledování ochrany vůči UVB záření byly buňky ozářeny cytotoxickou dávkou UVB záření (400 mJ/cm2). K ozáření byl použit solární simulátor SOL 500 vybavený H2 filtrem, který propouští záření v rozsahu vlnových délek 295 až 320 nm. Intenzita UVA nebo UVB záření byla při každém ozařování stanovena pomocí UVA- nebo UVB-metru (Dr. Hóenle Technology, Německo). Kontrolní buňky byly v obou případech po dobu ozařování inkubovány v temnu. Po UVA/UVB expozici bylo PBS s glukózou odstraněno a k buňkám bylo aplikováno médium bez séra. Po 24 hodinové inkubaci (37 °C, 5 % CO2) bylo sledováno buněčné poškození stanovením inkorporace neutrální červeně (NČ) do buněk. Po odstranění média bez séra byl k buňkám aplikován roztok NČ (0,03 %; PBS). Po 1 hodinové inkubaci (37 °C, 5 % CO2) byl roztok s NČ odsán, buňky byly fixovány směsí formaldehydu (0,5 %, v/v) a CaCE; (1 %, m/v) v poměru 1:1a barvivo bylo rozpuštěno extrakčním roztokem (methanol (50 %, v/v), CH3COOH (1 %, v/v). Po 5 min intenzivního třepání byla změřena absorbance při 540 nm. Experimenty byly provedeny ve 4 nezávislých opakováních s použitím buněk od 4 dárců kvůli minimalizaci individuálních rozdílů v citlivosti buněk.
Ochranný účinek látky na poškození vyvolané UVA nebo UVB zářením byl vypočítán z experimentálních dat (absorbancí) testovaných látek s pozitivní a negativní kontrolou podle následujícího vztahu:
% ochrany- 100
Apk - Ank
100
Avz ... absorbance vzorku (buňky pre-inkubované s testovanými látkami v médiu bez séra a následně ozářené)
Ank ... absorbance negativní kontroly (buňky inkubované s DMSO v médiu bez séra a neozářené = inkubované v temnu)
Apk ... absorbance pozitivní kontroly (buňky inkubované s DMSO v médiu bez séra a ozářené)
Výsledek: U buněk inkubovaných s testovanou látkou před UVA nebo UVB ozářením byla nalezena vyšší životnost buněk (schopnost inkorporace NČ) ve srovnání s buňkami inkubovanými s DMSO (kontrola) a ozářenými UVA nebo UVB ozářením (Tab. 9 a 10). Látka tedy vykazuje současně UVA i UVB fotoprotektivní efekt.
- 14CZ 307722 B6
Tabulka 9: Stanovení ochranných účinků látky 1 vůči poškození UVA zářením. Výsledky reprezentují průměr ± SD ze 4 experimentů provedených na NHDF izolovaných od různých pacientů.
UVA fotoprotekce
Koncentrace (umaLJ) .........................................t----% ochrany
3,9 7,8 15,6 31,3 62,5 27,7 i· (6,9) 57,4 ±( 14,4) 43,2 i (10,8) 47,5 i (11,9) 41,3 ±(10,3)
125 250 500 49 ±( 12,3) 45,3 ± (11,3) 18,5 ±(4,6)
Tabulka 10: Stanovení ochranných účinků látky 1 vůči poškození UVB zářením. Výsledky reprezentují průměr ± SD ze 4 experimentů provedených na NHDF izolovaných od různých pacientů.
UVB fotoprotekce
Koncentrace (μηκΨΙ) ........................ -.............
% ochrany
3,9
7,8 44,1 ±(11)
15,6 35 ± (8,7)
31,3 38,3 ± (9,6)
62,5 44,4 ± (11,1)
125 42,7 ±(10,7)
250 46,6 ±(11.6)
7 4. ÍG
Příklad 9. In vitro test fototoxicity na normální lidské kožní keratinocyty
Jako in vitro model byly použity normální lidské kožní keratinocyty (NHEK). Buňky byly izolovány z fragmentů kůže od zdravých dárců, kteří podstoupili chirurgický zákrok na Oddělení plastické a estetické chirurgie FN Olomouc. Odběr tkáně a izolace buněk proběhla podle postupu a podmínek schválených Etickou komisí FN Olomouc a Lékařské fakulty UP Olomouc. Všichni dárci podepsali informovaný souhlas s odběrem tkáně. Pro experiment byly buňky použity ve 3. až 4. pasáži. NHEK byly vysety na 96-jamkové desky v koncentraci 1.104 buněk/jamku v růstové médium pro keratinocyty (EpiLife®) doplněné o komerční sadu růstových faktorů (Human Keratinocyte Growth Supplement Kit) a antibiotika (penicilín (100 mg/ml), streptomycin (100 mg/1) a ampicilin (250 pg/ml).
Testovanou látkou byl 6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 1. Látka 1 byla rozpuštěna v DMSO a poté naředěna do média bez séra (EpiLife® s penicilinem (100 mg/ml) a streptomycinem (100 U/ml) a ampicilinem (250 pg/ml)) na koncentrační rozmezí (3,9 až 500 pmol/l) tak, aby výsledná koncentrace DMSO v médiu byla 0,5 % (v/v). Kontrolní médium obsahovalo příslušný objem DMSO v médiu bez séra. Po 24 hodinové inkubaci NHEK
- 15 CZ 307722 B6 bylo růstové médium vyměněno za médium bez séra obsahující testované látky a DMSO (negativní kontrola). Jako pozitivní kontrola byla použita známá fototoxická sloučenina chlorpromazin (CPZ; 0,8 až 50 pmol/l). Roztoky testovaných látek byly paralelně aplikovány na dvě 96-jamkové desky s buňkami. Po 1 hodinové preinkubaci bylo médium odstraněno, buňky byly dvakrát opláchnuty roztokem PBS a poté bylo aplikováno PBS s glukózou (1 mg/ml). Následně byla jedna deska ozářena netoxickou dávkou (5 J/cm2) UVA záření. Druhá deska byla po dobu ozařování inkubována v temnu. K ozáření byl použit solární simulátor SOL 500 vybavený H1 filtrem (Dr. Hoenle Technology, Německo), který propouští záření v rozsahu vlnových délek 320 až 400 nm. Intenzita UVA záření byla při každém ozařování stanovena pomocí UVA-metru (Dr. Hoenle Technology, Německo). Po UVA expozici bylo PBS s glukózou odstraněno a k buňkám bylo aplikováno bezsérové médium. Po 24 hodinové inkubaci (37 °C, 5 % CO2) bylo sledováno buněčné poškození stanovením inkorporace NČ do buněk. Po odstranění média bez séra byl k buňkám aplikován roztok NČ (0,03 %; PBS). Po 1 h inkubaci (37 °C, 5 % CO2) byl roztok s NČ odstraněn, buňky byly fixovány směsí formaldehydu (0,5 %, v/v) a CaCk (1 %, m/v) v poměru 1:1a barvivo bylo rozpuštěno extrakčním roztokem (methanol (50 %, v/v), CH3COOH (1 %, v/v). Po 5 minutách intenzivního třepání byla změřena absorbance při 540 nm. Experimenty byly provedeny ve 4 nezávislých opakováních s použitím buněk od 4 dárců kvůli minimalizaci individuálních rozdílů v citlivosti buněk. Fototoxický účinek látek byl hodnocen určením procent životnosti kontrolních buněk (% životnosti kontroly) z hodnot příslušných absorbancí podle následujícího vztahu:
Životnost (% kontroly) Úl......íLlpioo
Av... absorbance vzorku (buňky pre-inkubované s testovanými látkami v médiu bez séra a následně ozářené)
AK... absorbance kontroly (buňky inkubované s DMSO v médiu bez séra a ozářené)
Ap ... absorbance pozadí (extrakční roztok) naměřených hodnot absorbance byla pro každou koncentraci látky vypočtena viabilita buněk jako % kontroly.
Výsledek: Látka 1 nejevila v použitém koncentračním rozmezí 3,9 až 500 pmol/l fototoxické účinky, (nedošlo ke snížení životnosti buněk - schopnosti inkorporovat NČ ve srovnání s kontrolními buňkami), viz Tab. 11. Současně s látkou 1 byl jako pozitivní kontrola použit CPZ, který je doporučován validovaným postupem (Spielmann H, Balls M, Dupuis J, Pape WJ, Pechovitch G, de Silva O, Holzhutter HG, Clothier R, Desolle P, Gerberick F, Liebsch M, Lovell WW, Maurer T, Pfannenbecker U, Potthast JM, Csato M, Sladowski D, Steiling W, Brantom P., Toxicol In Vitro. 1998 Jun 1; 12(3):305-27) jako známá fototoxická sloučenina, viz Tab. 12. Z výše uvedených výsledků vyplývá, že testovaná látka je bezpečná při použití do kosmetických a dermatologických přípravků, i ve spojení s následnou expozicí jí ošetřené pokožky slunečnímu záření.
Tabulka 11: Účinky látky 1 na životnost NHEKstimulovaných UVA zářením (+UVA) ve srovnání s kontrolou inkubovanou po dobu ozařování v temnu (-UVA).
- 16CZ 307722 B6
Koncentrace (μηιοΙ/Ι) .............................1...................................
% kontroly
- UVA +UVA
3,9 112,2 4(11) 109,1 4(2,3)
7,8 135,5 4(8,2) 1 1 A λ -μ (O R A 120,6 4(1,6) 1 1 O 4- f 7 Ο A
313 1 .1 O, J X ) 119,1 4(8,7) i 1 v 4 ( Z j J JI 115,1 4(2,8)
623 121 4(8,7) 105,9 4(8,7)
125 119 4(2,8) 111,7 x (6,8)
250 110,8 4(12,4) 112,14(3,7)
500 105,7 4(7,1) 101,2 4(3,3)
Tabulka 12: Pro srovnám: účinky fototoxického chlorpromazinu na životnost NHEK stimulovaných UVA zářením (+UVA) ve srovnání s kontrolou inkubovanou po dobu ozařování v temnu (-UVA).
Koncentraci (μπΚ1/1)
3,1
123
CFZ % koůtrolý
-UVA. 4ÚVA
1033 ± (M) 102 (4,6)
99,9 4(7)
45,4-4 (24,6) 29,1 4 (M5) 17,34(2.2)
121,7 4 (13). 77,6 4(0,9)
70,4 4(5,5)
47,14(5,2) 34,74(15.4)
26,3 4(19)
21,7 4(19)
Příklad 10. In vitro test fotoprotektivních účinků na normální lidské kožní keratinocyty (NHEK)
Jako in vitro model byly použity normální lidské kožní keratinocyty (NHEK). Buňky byly izolovány z fragmentů kůže od zdravých dárců, kteří podstoupili chirurgický zákrok na Oddělení plastické a estetické chirurgie FN Olomouc. Odběr tkáně a izolace buněk proběhla podle postupu a podmínek schválených Etickou komisí FN Olomouc a Lékařské fakulty UP Olomouc. Všichni dárci podepsali informovaný souhlas s odběrem tkáně. Pro experiment byly buňky použity ve 3. až 4. pasáži. NHEK byly vysety na 96-jamkové desky v koncentraci 1.104buněk/jamku v růstové médium pro keratinocyty (EpiLife®) doplněné o komerční sadu růstových faktorů (Human Keratinocyte Growth Supplement Kit) a antibiotika (penicilín (100 mg/ml), streptomycin (100 mg/1) a ampicilin (250 pg/ml).
Testovanou látkou byl 6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 1. Látka 1 byla rozpuštěna v DMSO a poté naředěna do média bez séra (EpiLife® s penicilinem (100 mg/ml) a streptomycinem (100 U/ml) a ampicilinem (250 pg/ml)) na koncentrační rozmezí (3,9 až 500 pmol/l) tak, aby výsledná koncentrace DMSO v médiu byla 0,5 % (v/v). Po 24 hodinové inkubaci NHEK bylo růstové médium vyměněno za médium bez séra obsahující testované látky a DMSO (negativní kontrola). Kontrolní médium obsahovalo příslušný objem
- 17 CZ 307722 B6
DMSO v médiu bez séra. Jako kontrola bylo použito médium bez séra s DMSO (0,5 % (v/v)), což odpovídá jeho výsledné koncentraci při experimentu s testovanými látkami. Testovaná látka byla paralelně aplikována na dvě 96-jamkové desky s NHEK. Po 60 minutové inkubaci bylo médium s látkami odstraněno, buňky byly dvakrát opláchnuty roztokem PBS a bylo aplikováno PBS s glukózou (1 mg/ml). V případě sledování ochrany vůči UVA záření byla následně jedna deska ozářena cytotoxickou dávkou UVA záření (7,5 J/cm) s využitím solárního simulátoru SOL 500 (Dr. Hoenle Technology, Německo) vybaveným H1 filtrem, který propouští záření v rozsahu vlnových délek 320 až 400 nm. Při sledování ochrany vůči UVB záření byly buňky ozářeny cytotoxickou dávkou UVB záření (400 mJ/cm2). K ozáření byl použit solární simulátor SOL 500 vybavený H2 filtrem, který propouští záření v rozsahu vlnových délek 295 až 320 nm. Intenzita UVA nebo UVB záření byla při každém ozařování stanovena pomocí UVA- nebo UVB-metru (Dr. Hoenle Technology, Německo). Kontrolní buňky byly v obou případech po dobu ozařování inkubovány v temnu. Po UVA/UVB expozici bylo PBS s glukózou odstraněno a k buňkám bylo aplikováno médium bez séra. Po 24 hodinové inkubaci (37 °C, 5 % CO2) bylo sledováno buněčné poškození stanovením inkorporace neutrální červeně (NČ) do buněk. Po odstranění média bez séra byl k buňkám aplikován roztok NČ (0,03 %; PBS). Po 1 hodinové inkubaci (37 °C, 5 % CO2) byl roztok s NČ odsán, buňky byly fixovány směsí formaldehydu (0,5 %, v/v) a CaCE (1 %, m/v) v poměru 1:1a barvivo bylo rozpuštěno extrakčním roztokem methanol (50 %, v/v), CH3COOH (1 %, v/v). Po 5 minutách intenzivního třepání byla změřena absorbance při 540 nm. Experimenty byly provedeny ve 4 nezávislých opakováních s použitím buněk od 4 dárců kvůli minimalizaci individuálních rozdílů v citlivosti buněk.
Ochranný účinek látek na poškození vyvolané UVA nebo UVB zářením byl vypočítán z experimentálních dat (absorbancí) testovaných látek s pozitivní a negativní kontrolou podle následujícího vztahu:
% ochrany- 100Apk - Ank |
100
Avz ... absorbance vzorku (buňky pre-inkubované s testovanými látkami v médiu bez séra a následně ozářené)
Ank ... absorbance negativní kontroly (buňky inkubované s DMSO v médiu bez séra a neozářené = inkubované v temnu)
Apk ... absorbance pozitivní kontroly (buňky inkubované s DMSO v médiu bez séra a ozářené)
Výsledek: U buněk inkubovaných s látkou 1 před UVA nebo UVB ozářením byla nalezena vyšší životnost buněk (schopnost inkorporace NČ) ve srovnání s buňkami inkubovanými s DMSO (kontrola) a ozářenými UVA nebo UVB ozářením (Tab 13 a 14). Látka 1 tedy vykazuje současně UVA i UVB fotoprotektivní efekt.
Tabulka 13: Stanovení ochranných účinků látky 1 vůči poškození UVA zářením. Výsledky reprezentují průměr ± SD ze 4 experimentů provedených na NHEK izolovaných od různých pacientů
- 18 CZ 307722 B6
UVA fotopřotěkee
Koncentrace (pmoVI)'-----------........;...........— %ocnrany
3,9 39,7 *(12,9)
7,8 60,2-2(16,1) i 5,6 53,5*02,4)
31,3 46,8* (1(,8)
62,5 47,9 * (8,9)
125 5 1,7 *(4,8)
250 48 *(3,2)
500 _ 30i(13,S)
Tabulka 14: Stanovení ochranných účinků látky 1 vůči poškození UVB zářením. Výsledky reprezentují průměr ± SD ze 4 experimentů provedených na NHEK izolovaných od různých pacientů
UVB fotoprotelíce í.
Koncentrace (μτηοΡ1) ---------------——:----% ochrany
3.9 :53,5 * (7,6)
7,8 73* (6)
15,6 69,8*(8,6)
31,3 65.9* (9)
62,5 65,9* (5) !25 72,9 *(6,9)
250 65,7 *(3,6)
500 28 *(3,2)
Příklad 11: Vliv testovaných látek na délku života Caenorhabditis elegans
Caenorhabditis elegans se používá jako modelový organismus pro identifikaci látek schopných příznivě modulovat některé aspekty stárnutí savců včetně člověka. Rada látek prodlužujících život C. elegans má příznivý efekt na patologické projevy některých nemocí spojených se stářím. Příkladem takových látek může být resveratrol, kurkumin a řada dalších. Délku života C. elegans prodlužuje i řada látek používaných v kosmetice pro regeneraci pleti a zpomalení jejího stárnutí, jako je například výše zmíněný resveratrol, vitamin E, koenzym Q10, extrakty ze zeleného čaje nebo granátového jablka nebo cytokinin kinetin. V tomto experimentu byla použita standardní linie Caenorhabditis elegans fem-l/HCll nesoucí teplotou indukovatelnou mutaci, která způsobí, že se všichni jedinci při kultivaci ve 25 °C vyvinou v samice, což zabrání další reprodukci a potenciálnímu smíchání původní experimentální populace s potomstvem. Testované látky rozpuštěné v DMSO (100 mM zásobní roztoky) byly přidány do čerstvého NGM (nematode growth medium) do finální koncentrace 10 a 100 μΜ. Médium bylo následně rozpipetováno do Petriho misek. Jako negativní kontrola bylo použito čisté NGM a NGM s DMSO vehikulem. Po ztuhnutí média bylo na misky rozetřeno 100 μΐ suspenze bakterií Escherichia coli OP50 v LB médiu (suspenze kultivována přes noc ve 37 °C a 20krát zkoncentrována), které slouží jako zdroj potravy pro háďátka. Misky byl ponechány přes noc v 37 °C, aby se bakterie mohly rozrůst. Na takto připravené misky byla následně nasazena populace věkově synchronizovaných mladých dospělců C. elegans. Misky byly uchovávány v inkubátoru ve 25 °C a ve vybraných časových intervalech (každé 1 až 3 dny) skenovány na skeneru (Epson perfection V700 photo). Počet
- 19CZ 307722 B6 přežívajících jedinců byl určen pomocí analýzy obrazu v programu Fiji. Skript vycházející z identifikuje pohybující se objekty srovnáním série fotografií misky pořízených s malým časovým odstupem (přibližně 30 s). Byly srovnávány tři po sobě pořízené fotografie každé misky a napočtené hodnoty byly zprůměrovány, aby se snížila možnost chyby. Výsledky byly následně analyzovány pomocí programů OASIS a ED50vl0. Statistická signifikance byla vyhodnocena pomocí Log-Rank testu a získané p-hodnoty byly korigovány podle Bonferroniho. Výsledky shrnuje tabulka 15. Látky 1, 15 a 20 statisticky významně prodlužovaly život C. elegans.
Tabulka 15: Vliv testovaných látek na délku života C. elegans (ve dnech)
1 DMSO 15 10 μΜ 15 100 μΜ ..... 20 10 μΜ 20 | 100 μΜ 1 10 μΜ í i 1 100 μ Μ
medián 8.7 9,4 10,3 11,2 1 10,2 10,3 ϊ 0,2
| průměr 10,9 11,3 : Γ 13,8 i___ 12 ί 11,2 11,9 J 12,6
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (10)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použití alespoň jednoho adeninového derivátu obecného vzorce I
    (I) a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem, aminy, nebo adiční soli s kyselinami, kde
    R2 je vodík nebo halogen;
    R6 je vybrán ze skupiny zahrnující
    - heteroaryl s 5- až 6-členným aromatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, přičemž heteroaryl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
    - heteroarylalkyl s 5- až 6-členným aromatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž heteroarylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl,
    -20CZ 307722 B6 merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1-C4) alkyl;
    - heterocyklyl s 5- až 6-členným alifatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, přičemž heterocyklyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
    - heterocyklylalkyl s 5- až 6-členným alifatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž heterocyklylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1-C4) alkyl;
    - cykloalkyl s kruhem obsahujícím 5 až 6 atomů uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl -C4)alkyl;
    - cykloalkylalkyl s kruhem obsahujícím 5 až 6 atomů uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž cykloalkylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1-C4) alkyl;
    - isoalkyl obsahující 3 až 7 atomů uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1-C4) alkyl, jako UV-fotoprotektivních složek v kosmetických přípravcích, v přípravcích pro ochranu rostlin a/nebo v přípravcích pro ošetření tkáňových kultur.
  2. 2. Použití podle nároku 1, kde v substituentu R6 heteroaryl obsahuje 5-členný kruh, a v tomto 5-atomovém kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S, přičemž heteroaryl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(ClC4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl.
  3. 3. Použití podle nároku 1, kde v substituentu R6 heteroarylalkyl obsahuje 5-členný kruh a ClC2 alkyl, a v 5-atomovém kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S, přičemž heteroarylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl.
  4. 4. Použití podle nároku 1, kde v substituentu R6 heterocyklyl obsahuje 5-členný kruh, av5atomovém kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S, přičemž heterocyklyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(ClC4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl.
  5. 5. Použití podle nároku 1, kde v substituentu R6 heterocyklylalkyl obsahuje 5-členný kruh a C1-C2 alkyl, a v 5-atomovém kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S, přičemž heterocyklylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl.
  6. 6. Použití podle nároku 1, kde substituent R6 je vybrán ze skupiny zahrnující cyklopentyl, cyklopentylmethyl, isopropyl, isobutyl, isopentyl, isohexyl, isoheptyl, přičemž každá z
    -21 CZ 307722 B6 uvedených skupin je nesubstituovaná nebo substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl.
  7. 7. Použití podle nároku 1, kde adeninové deriváty jsou vybrané ze skupiny zahrnující:
    6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(5-methylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(5-hydroxymethylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(5-formylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-( 1 -furan-2-y lethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(5-methyltetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(l-tetrahydrofuran-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(cyklopentylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(3-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(5-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(5-chlorthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(5-bromthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-( 1 -thiofen-2-y lethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-furfurylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(5-methylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(5-hydroxymethylmran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(5-formylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(l-furan-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(5-methyltetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(l-tetrahydrofuran-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(thiofen-2-ylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(3-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(5-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5~chlorthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-bromthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(l-thiofen-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(cyklopentylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin.
  8. 8. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde se alespoň jeden adeninový derivát obecného vzorce I použije jako složka s kombinovaným antisenescenčním a UVfotoprotektivním účinkem.
  9. 9. Adeninové deriváty obecného vzorce I (I)
    -22CZ 307722 B6 a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem, aminy, nebo adiční soli s kyselinami, kde
    R2 je vodík nebo halogen;
    R6 je vybrán ze skupiny zahrnující
    - heteroaryl s 5- až 6-členným aromatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, přičemž heteroaryl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
    - heteroarylalkyl s 6-členným aromatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž heteroarylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
    - heteroarylalkyl s 5- členným aromatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž heteroarylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
    - heterocyklyl s 5- až 6-členným alifatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, přičemž heterocyklyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
    - heterocyklylalkyl s 5- až 6-členným alifatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž heterocyklylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
    - cykloalkyl s kruhem obsahujícím 5 až 6 atomů uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1-C4) alkyl;
    - cykloalkylalkyl s kruhem obsahujícím 5 až 6 atomů uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž cykloalkylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
  10. 10. Adeninové deriváty podle nároku 9, vybrané ze skupiny zahrnující:
    6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(5-methyltetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(l-tetrahydrofuran-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(cyklopentylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(3-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(5-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(5-chlorthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(5-bromthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-( 1 -thiofen-2-y lethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(5-methyltetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(l-tetrahydrofuran-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    2-chlor-6-(thiofen-2-ylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    -23CZ 307722 B6
    2-chlor-6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(3-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5~chlorthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    5 2-chlor-6-(5-bromthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(l-thiofen-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(cyklopentylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin.
CZ2015-582A 2015-08-28 2015-08-28 Adeninové deriváty a jejich použití CZ307722B6 (cs)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2015-582A CZ307722B6 (cs) 2015-08-28 2015-08-28 Adeninové deriváty a jejich použití
EP16762957.5A EP3341371B1 (en) 2015-08-28 2016-08-24 Adenine derivatives and their use as uv-photoprotective agents
US15/753,828 US10774084B2 (en) 2015-08-28 2016-08-24 Adenine derivatives and their use as UV-photoprotective agents
PCT/CZ2016/050029 WO2017036434A1 (en) 2015-08-28 2016-08-24 Adenine derivatives and their use as uv-photoprotective agents

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2015-582A CZ307722B6 (cs) 2015-08-28 2015-08-28 Adeninové deriváty a jejich použití

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2015582A3 CZ2015582A3 (cs) 2017-03-08
CZ307722B6 true CZ307722B6 (cs) 2019-03-27

Family

ID=56888877

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2015-582A CZ307722B6 (cs) 2015-08-28 2015-08-28 Adeninové deriváty a jejich použití

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10774084B2 (cs)
EP (1) EP3341371B1 (cs)
CZ (1) CZ307722B6 (cs)
WO (1) WO2017036434A1 (cs)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ307868B6 (cs) * 2017-04-28 2019-07-10 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci Deriváty 9-(2-oxacykloalkyl)-9H-purin-2,6-diaminu, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použití
WO2022012702A1 (en) * 2020-07-13 2022-01-20 Univerzita Palackeho V Olomouci Nitrogen heterocyclic cytokinin derivatives, compositions containing these derivatives and use thereof
CZ2022227A3 (cs) * 2022-05-30 2023-12-13 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci Heterocyklické sloučeniny pro prevenci a terapii poruch cirkadiánního rytmu
CN116444522B (zh) * 2023-06-14 2023-08-25 齐泽(云南)生物科技有限公司 一种姜黄素腺嘌呤衍生化合物
CN116496277B (zh) * 2023-06-14 2023-08-25 齐泽(云南)生物科技有限公司 一种姜黄素2,6-二氨基嘌呤衍生化合物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009086457A2 (en) * 2007-12-28 2009-07-09 Institute Of Experimental Botany, Academy Of Sciences Of The Czech Republic 6,9-disubstituted purine derivatives and their use as cosmetics and cosmetic compositions
CZ300774B6 (cs) * 2007-10-05 2009-08-05 Univerzita Palackého Substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty pro použití jako antagonisté cytokininových receptoru a prípravky obsahující tyto slouceniny

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080009508A1 (en) * 2006-07-10 2008-01-10 Lucie Szucova 6,9-Disubstituted Purine Derivatives And Their Use For Treating Skin

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ300774B6 (cs) * 2007-10-05 2009-08-05 Univerzita Palackého Substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty pro použití jako antagonisté cytokininových receptoru a prípravky obsahující tyto slouceniny
WO2009086457A2 (en) * 2007-12-28 2009-07-09 Institute Of Experimental Botany, Academy Of Sciences Of The Czech Republic 6,9-disubstituted purine derivatives and their use as cosmetics and cosmetic compositions

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HASAN A., Studies in nucleosides: Part XIV - synthesis of 2-chloro/methoxy-6-N-substituted-9-(2-tetrahydrofuranyl)-9H-purines and their biological aktivity. Indian Journal of Chemistry, Section B: Organic Chemistry Including Medicinal Chemistry (19861031), 25B(10), pp. 1070-1 *
MIK, V. a kol. N9-substituted derivatives of kinetin: Effective anti-senescence agents. Phytochemistry 72, 2011, 821-831 *
SZÜČOVÁ, L., a kol. Synthesis, characterization and biological activity of ring-substituted 6-benzylamino-9-tetrahydropyran-2-yl and 9-tetrahydrofuran-2-ylpurine derivatives. Bioorganic & medicinal chemistry, 2009, 17, 1938-1947. *

Also Published As

Publication number Publication date
US10774084B2 (en) 2020-09-15
US20180298004A1 (en) 2018-10-18
EP3341371A1 (en) 2018-07-04
CZ2015582A3 (cs) 2017-03-08
EP3341371B1 (en) 2022-06-29
WO2017036434A1 (en) 2017-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ307722B6 (cs) Adeninové deriváty a jejich použití
KR100939147B1 (ko) Ｎ6-치환된 아데닌을 기본으로 한 헤테로시클릭 화합물,이들의 제조방법, 약물, 화장품 제제 및 성장조절제제조를 위한 이들의 용도, 이들 화합물을 함유하는약제학적 제제, 화장품 제제 및 성장조절제
AU2002363362A1 (en) Heterocyclic compound based on N6-substituted adenine, methods of their preparation, their use for preparation of drugs, cosmetic preparations and growth regulators, pharmaceutical preparations, cosmetic preparations and growth regulators containing these compounds
EP2648689B1 (de) 2-pyrone
Hönig et al. New cytokinin derivatives possess UVA and UVB photoprotective effect on human skin cells and prevent oxidative stress
US11643413B2 (en) 9-(2-oxacycloalkyl)-9H-purine-2,6-diamine derivatives and their use for the treatment of skin disorders
CZ2014908A3 (cs) 6,8-Disubstituované-9-(heterocyklyl)puriny, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použití v kosmetických a medicínských aplikacích
US20130072506A1 (en) 6,8-disubstituted purine compositions
CZ308881B6 (cs) 6-aryl-9-glykosylpuriny a jejich použití
KR20110054377A (ko) 니아신 또는 니아신아마이드를 도입시킨 아스코르빈산 유도체 및 이의 제조방법
JP5620657B2 (ja) 日焼け細胞形成抑制剤
Romanucci et al. 7-O-tyrosyl Silybin Derivatives as a Novel Set of Anti-Prostate Cancer Compounds
KR20180068694A (ko) 신규 티오황산 유도체, 그 제조방법 및 그를 포함하는 화장료 조성물
ITBO20070403A1 (it) Cosmetico, uso topico del medesimo e metodi di applicazione e di preparazione di tale cosmetico

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20230828