CZ2015582A3 - Adeninové deriváty a jejich použití - Google Patents

Adeninové deriváty a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ2015582A3
CZ2015582A3 CZ2015-582A CZ2015582A CZ2015582A3 CZ 2015582 A3 CZ2015582 A3 CZ 2015582A3 CZ 2015582 A CZ2015582 A CZ 2015582A CZ 2015582 A3 CZ2015582 A3 CZ 2015582A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
alkyl
tetrahydrofuran
purine
ylmethylamino
amino
Prior art date
Application number
CZ2015-582A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ307722B6 (cs
Inventor
Martin Hönig
Lucie Plíhalová
Karel DoleĹľal
Jiří Voller
Miroslav Strnad
Lukáš Spíchal
Jitka Vostálová
Svobodová Alena Rajnochová
Jitka Ulrichová
Alena Kadlecová
Ondřej Plíhal
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Palackého v Olomouci filed Critical Univerzita Palackého v Olomouci
Priority to CZ2015-582A priority Critical patent/CZ307722B6/cs
Priority to PCT/CZ2016/050029 priority patent/WO2017036434A1/en
Priority to EP16762957.5A priority patent/EP3341371B1/en
Priority to US15/753,828 priority patent/US10774084B2/en
Publication of CZ2015582A3 publication Critical patent/CZ2015582A3/cs
Publication of CZ307722B6 publication Critical patent/CZ307722B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/26—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with an oxygen, sulphur, or nitrogen atom directly attached in position 2 or 6, but not in both
    • C07D473/32—Nitrogen atom
    • C07D473/34—Nitrogen atom attached in position 6, e.g. adenine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/12—Chemical aspects of preservation
    • A01N1/122—Preservation or perfusion media
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N3/00—Preservation of plants or parts thereof, e.g. inhibiting evaporation, improvement of the appearance of leaves or protection against physical influences such as UV radiation using chemical compositions; Grafting wax
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/40—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with halogen atoms or perhalogeno-alkyl radicals directly attached in position 2 or 6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/52—Stabilizers
    • A61K2800/522—Antioxidants; Radical scavengers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Adeninové deriváty substituované v polohách CS, N6 a N9 obecného vzorce I mají antisenescenční a kombinované fotoprotektivní UVA/UVB účinky. Tyto látky jsou vhodné zejména jako antisenescenční a UV-fotoprotektivní složky v kosmetických přípravcích, v přípravcích pro ochranu rostlin a v přípravcích pro ošetření tkáňových kultur.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká adeninových derivátů majících kombinované antisenescenční a UVfotoprotektivní účinky proti záření UVA i UVB. Dále se týká jejich použití a přípravků je obsahujících.
Dosavadní stav techniky
6-Furfurylaminopurin (kinetin) je látka ze skupiny rostlinných hormonů cytokininů, jež jsou N6-substituovanými deriváty adeninu. Kinetin byl objeven v padesátých letech minulého století a byl považován za tzv. růstový faktor, protože pozitivně ovlivňoval dělení buněk tabákového kalusu. Exogenní aplikace kinetinu indukuje buněčné dělení a morfogenezi buněk rostlinného kalusu, anebo například oddaluje senescenci listů. Kromě vlivu na rostlinné buňky vykazuje kinetin také účinky na buňky živočišné. Má antioxidační vlastnosti a brání oxidačnímu poškození DNA, inhibuje oxidační a glykační poškození proteinů, dokáže ovlivňovat růst keratinocytů a oddaluje stárnutí lidských kožních fíbroblastů in vitro, aniž by látka měla efekt na proliferaci těchto fíbroblastů. Derivát kinetinu 6-furfurylamino-9-(2tetrahydropyran-2-yl)purin (obchodní název Pyratine), který je v současné době komerčně využíván v kosmetických přípravcích, byl připraven spojením protektivní tetrahydropyranylové skupiny s molekulou kinetinu. Tato strukturní modifikace vedla ke zlepšení antisenescenčních a antioxidačních účinků na rostlinné i živočišné buňky a to i při testech prováděných na lidské kůži nebo jejích modelech.
V posledních letech narůstá množství UV záření, zejména jeho středních (UVB) a dlouhých (UVA) vlnových délek, které dopadá na povrch Země, a tento nový fenomén přispívá u lidí k rozvoji řady kožních onemocnění a poruch. UVB záření představuje asi 4 až 5 % celkového objemu záření a proniká do kožní epidermis, kde způsobuje přímé i nepřímé nežádoucí biologické účinky. UVA záření tvoří 90 % celkového podílu záření a proniká hlouběji do papilámí dermis a částečně i do hypodermis (10 %), kde způsobuje vznik tzv. reaktivních sloučenin kyslíku (ROS) a dusíku (RNS). Chronické vystavení kůže UVA záření může vést k tzv. předčasnému stárnutí kůže, které je spojeno s poškozením struktury dermis a jehož důsledkem je vznik vrásek, pigmentových skvrn, aj.. Přirozenou endogenním fotoprotektivní látkou je melanin, ale v lidské kůži se ho netvoří dostatek, zejména v souvislosti se zvyšujícíse intenzitou UV záření dopadajícího na Zemi, vlivem úbytku ozonu v atmosféře, a změnou životního stylu (více outdoorových aktivit, oděv zakrývající menší část povrchu těla). Pokud je kůže ošetřena látkou, která zamezuje pronikání zejména UV paprsků, může ji chránit před předčasným stárnutím ale i krátkodobím nežádoucím účinkům UV záření.
Většina přípravků, které dnes využívají kosmetické přípravky k ochraně před slunečním zářením, tzv. sunscreens (UV filtry), byly vyvinuty, aby chránily především před „škodlivějším“ UVB zářením, které může vyvolat vznik zhoubného melanokarcinomu. Sunscreens se dělí na fyzikální (anorganické minerální látky, které vytvářejí fyzikální překážku záření na kůži, jako například TÍO2 nebo ZnO) a chemické (organické látky schopné absorbovat radiaci změnou distribuce elektronů - například benzofenony, cinamáty, salicyláty). U některých stávajících sunscreens byly popsány nežádoucí účinky, spojené zejména s fotoalergickou nebo fotoiritující reakcí při používání těchto přípravků. Častým problémem těchto látek je také fotonestabilita.
Původci předkládaného vynálezu nalezli látky, které neočekávaně jeví kombinované antisenescenční účinky a UV-fotoprotektivní účinky (UVB i UVA). Tyto látky jsou velmi stabilní, a zároveň nejsou fototoxické a ani neiritují ošetřenou tkáň.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou adeninové deriváty obecného vzorce I
I a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem, aminy, nebo adiční soli s kyselinami, kde
R2 je vodík nebo halogen;
R6 je vybrán ze skupiny zahrnující
- heteroaryl s 5- až 6-členným aromatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, přičemž heteroaryl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
- heteroarylalkyl s 5- až 6-členným aromatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž heteroarylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1 -C4)alkyl;
- heterocyklyl s 5- až 6-členným alifatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, přičemž heterocyklyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
- heterocyklylalkyl s 5- až 6-členným alifatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž heterocyklylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(ClC4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(ClC4)alkylamino, amino(C 1 -C4)alkyl;
- cykloalkyl s kruhem obsahujícím 5 až 6 atomů uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(C 1 -C4)alkylamino, amino(C 1 -C4)alkyl;
- cykloalkylalkyl s kruhem obsahujícím 5 až 6 atomů uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž cykloalkylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1 -C4)alkyl;
- isoalkyl obsahující 3 až 7 atomů uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(C 1 -C4)alkylamino, amino(C 1 -C4)alkyl.
Heteroaryl s výhodou obsahuje 5-členný kruh, výhodněji obsahuje v 5-členném kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S. Nej výhodněji je heteroaryl vybrán z furan-2-ylu a thiofen-2ylu.
Heteroarylalkyl s výhodou obsahuje 5-členný kruh a C1-C2 alkyl, výhodněji obsahuje v 5členném kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S. Nej výhodněji je heteroarylalkyl vybrán z furan-2-ylmethylu (furfurylu) a thiofen-2-ylmethylu.
Heterocyklyl s výhodou obsahuje 5-členný kruh, výhodněji obsahuje v 5-členném kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S. Nejvýhodněji je heterocyklyl vybrán ze skupiny zahrnující tetrahydrofuran-2-yl a tetrahydrothiofen-2-yl.
Heterocyklylalkyl s výhodou obsahuje 5-členný kruh a C1-C2 alkyl, výhodněji obsahuje v 5členném kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S. Nejvýhodněji je heterocyklylalkyl vybrán ze skupiny zahrnující tetrahydrofuran-2-ylmethyl (tetrahydrofurfuryl) a tetrahydrothofen-2-ylmethyl.
Cykloalkylem je s výhodou cyklopentyl. Cykloalkylalkylem je s výhodou cyklopentylmethyl.
Isoalkylem je s výhodou isopropyl, isobutyl, isopentyl, isohexyl, isoheptyl.
Halogen je vybrán ze skupiny zahrnující fluor, chlor, brom, jod. S výhodou je halogenem chlor.
V jednom výhodném provedení jsou látky obecného vzorce I vybrány ze skupiny zahrnující: 6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-methylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-hydroxymethylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-formylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-( 1 -furan-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-methyltetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(l-tetrahydrofuran-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(cyklopentylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(3-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-chlorthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-bromthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
6-( 1 -thiofen-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-furfurylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-methylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-hydroxymethylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-formylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(l-furan-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-methyltetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(l-tetrahydrofuran-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(thiofen-2-ylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(3-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-chlorthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-bromthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(l-thiofen-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(cyklopentylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin.
Výhodněji jsou látky obecného vzorce I vybrány ze skupiny zahrnující: 6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-furfurylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
2-chlor-6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin.
Předmětem vynálezu je také použití adeninových derivátů obecného vzorce I jako UVfotoprotektivních složek v kosmetických přípravcích, v přípravcích pro ochranu rostlin a/nebo v přípravcích pro ošetření tkáňových kultur. Ve výhodném provedení se uvedené látky použijí jako složky s kombinovaným antisenescenčním a UV-fotoprotektivním účinkem.
Látky podle předkládaného vynálezu jeví kombinované antisenescenční a UV-fotoprotektivní účinek. UV-fotoprotektivní účinek byl pozorován pro záření UVA i UVB. Jsou tedy vhodné jako složky kosmetických přípravků, přípravků na ochranu rostlin a přípravků pro ošetření tkáňových kultur. Kosmetické přípravky s těmito složkami jsou zejména vhodné pro aplikaci na pokožku, srst či vlasy savců. Přípravky pro ošetření tkáňových kultur jsou vhodné zejména pro ošetření kultur buněk rostlin i savců, například keratinocytů a fibroblastů.
Dále jsou předmětem předkládaného vynálezu kosmetické přípravky, přípravky pro ochranu rostlin a/nebo v přípravky pro ošetření tkáňových kultur, obsahující látky obecného vzorce I. Přípravky pro ošetření tkáňových kultur jsou použitelné v biotechnologiích, zejména v tkáňových kulturách pro mikropropagaci rostlin.
PŘÍPRAVKY
Vhodné podání pro kosmetickou aplikaci je lokální, topické. Přípravky zpravidla obsahují od 0,1 do 95 hmotn. % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahují přednostně od 10 do 90 hmotn. % aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují přednostně od 1 do 10 hmotn. % aktivní látky. Formy aplikace jsou např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Přípravky pro ochranu rostlin a pro ošetření tkáňových kultur jsou nejčastěji ve formě roztoku, spreje, disperze nebo suspenze. Přípravky jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, rozpouštěcími nebo lyofilizačními procesy.
Roztoky aktivních látek, suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze a disperze, mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizovaných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem jako je například mannitol. Olejové suspenze obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8-22, s výhodou pak 12-22 uhlíkových atomů, např. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antioxidantů, např. vitaminu E, β-karotenu nebo 3,5-di-terř-butyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá více než 6 uhlíkových atomů a je mono- nebo polyhydrická, např. mono-, di- nebo trihydrické alkoholy jako methanol, ethanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich isomery, ale hlavně glykol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyl oleát, isopropyl myristát, isopropyl palmitát, „Labrafil M 2375“ (polyoxyethylen glycerol trioleát, Gattefoseé, Paříž), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složený z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž), „Miglyol 812“ (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce Cg až C12 od Hůls AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sesamový olej, sójový olej a olej z podzemnice olejně.
Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70%, ale přednostně 20 až 50% vody nebo vodné fáze. Tukovou fázi tvoří uhlovodíky, např. vazelína, parafínový olej nebo tvrdé parafiny, které přednostně obsahují vhodné hydroxysloučeniny jako mastné alkoholy a jejich estery, např. cetyl alkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin pro zlepšení kapacity pro vázání vody. Emulgátory jsou odpovídající lipofílní sloučeniny jako sorbitanové estery mastných kyselin (Spaný), s výhodou sorbitan oleát nebo sorbitan isostearát. Aditiva k vodné fázi jsou např. smáčedlajako polyalkoholy, např. glycerol, propylen glykol, sorbitol a polyethylen glykol, nebo konzervační prostředky či příjemně vonící látky.
Mastné masti jsou nevodné a obsahují jako bázi hlavně uhlovodíky, např. parafin, vazelínu nebo parafínový olej, a dále přírodní nebo semisyntetické tuky, např. hydrogenované kokosové triglyceridy mastných kyselin nebo hydrogenované oleje, např. hydrogenovaný ricínový olej nebo z podzemnice olejně, a dále částečné glycerolové estery mastných kyselin, např. glycerol mono- a distearát. Dále obsahují např. mastné alkoholy, emulgátory a aditiva zmíněná v souvislosti s mastmi, která zvyšují příjem vody.
Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50% vody. Používané olejové báze jsou mastné alkoholy, např. isopropyl myristát, lanolin, včelí vosk, nebo uhlovodíky, s výhodou vazelína (petrolátum) a parafínový olej. Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, např. estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethylenoxy adukty, např. polyglycerických mastných kyselin nebo polyethylen sorbitanové estery či kyselé estery polyglycerických mastných kyselin (Tween), dále polyoxyethylenové etery mastných alkoholů nebo polyoxyethylenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátory, jako alkalické soli sulfátů mastných alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, cetylsulfát sodný nebo stearylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetyl stearyl alkoholu nebo stearyl alkoholu. Aditiva k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrání krémy před vyschnutím, např. polyalkoholy jako glycerol, sorbitol, propylen glykol a polyethylen glykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonící látky.
Pasty jsou krémy nebo masti obsahující práškové složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, např. oxidy titanu nebo oxid zinečnatý, a dále talek či silikáty hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci.
Pěny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako chlor-fluor deriváty nižších alkanů, např. dichlorfluormethan a dichlortetrafluorethan, nebo přednostně nehalogenované plynné uhlovodíky, vzduch, N2O či oxid uhličitý. Používané olejové fáze jsou stejné jako pro masti a také jsou používána aditiva tam zmíněná.
Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-ethanolickou bázi, ke které jsou přimíchány zvlhčovadla pro snížení odpařování, jako jsou polyalkoholy, např. glycerol, glykoly a polyethylen glykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethylen glykolů, tj. lipofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže ethanolem, a pokud je to nutné i ostatní neutrální látky a aditiva.
Vynález je dále objasněn s pomocí příkladů, které ale jeho rozsah dále neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Příprava 6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purinu (1)
6-Chlor-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin (Ig; 4,46 mmol) byl umístěn do varné baňky spolu s npropanolem (50 ml). Ke vzniklé suspenzi byl přidán tetrahydrofurfurylamin (554 μΐ; 5,36 mmol) spolu s triethylaminem (Et3N) (3,2 ml; 22,3 mmol). Reakční směs byla pod zpětným chladičem zahřívána na teplotu 100 °C. Doba reakce byla 4 h. Po zahuštění byla reakční směs extrahována pomocí kontinuálního extraktoru (EtOAc:H2O; 24 h). Ethylacetátová (EtOAc) frakce byla následně vysušena pomocí Na2SO4. Takto předčištěná reakční směs byla rozdělena pomocí sloupcové chromatografie s mobilní fází (EtOAc:MeOH:NH3; 34:1:1; v:v).Výtěžek:
74,6 %. *H NMR (500 MHz, DMSO-íZ6), ppm: 1.53 - 1.64 (m, 1 H); 1.69 - 1.89 (m, 3 H); 1.95 - 2.02 (m, 1 H); 2.11 - 2.23 (m, 1 H); 2.30 - 2.44 (m, 2 H); 3.37 - 3.48 (m, 1 H); 3.48 3.53 (m, 1 H); 3.53 - 3.60 (m, 1 H); 3.70 - 3.76 (m, 1 H); 3.81 - 3.90 (m, 1 H); 3.98 (q, J=7.03 Hz, 1 H); 4.09 (q, J=7.44 Hz, 1 H); 6.21 (dd, J=6.88, 3.82 Hz, 1 H); 7.63 (br. s„ 1 H); 8.17 (br. s., 1 H); 8.21 (s, 1 H).
Tabulka 1: Látky připravené způsobem podle příkladu 1
č. Ré r2 Elementární analýza vypočteno/nalezeno
%C %H %N ES MS [M+H]+
1 tetrahydrofuran-2-ylmethyl H 58,1/58,0 6,6/6,6 24,2/24,3 290,3
2 5-methylfuran-2-ylmethyl H 60,2/60,1 5,7/5,7 23,4/23,5 300,3
3 5-hydroxymethylfuran-2ylmethyl H 57,1/57,2 5,4/5,4 22,2/22,5 316,3
4 5-formylfuran-2-ylmethyl H 57,5/57,6 4,8/4,8 22,4/22,2 314,3
5 l-furan-2-ylethyl H 60,2/60,1 5,7/5,8 23,4/23,5 300,3
6 5-methyltetrahydrofuran-2ylmethyl H 59,4/59,3 7,0/7,0 23,1/23,2 304,4
č. Rů r2 Elementární analýza vypočteno/nalezeno
%C %H %N ES MS [M+H]+
7 1 -tetrahydrofuran-2-ylethyl H 59,4/59,2 7,0/7,1 23,1/23,2 304,4
8 cyklopentylmethyl H 62,7/62,9 7,4/7,5 24,4/24,5 288,4
Příklad 2: Příprava 6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purinu (9)
6-Chlor-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin (0,5g; 2,23 mmol) byl umístěn do varné baňky spolu s n-propanolem (25 ml). Ke vzniklé směsi byl přidán 2-thiofenmethylamin (275 μΐ; 2,68 mmol) spolu sEt3N (1,6 ml; 11,15 mmol). Vzniklá směs byla pod zpětným chladičem za stálého míchání zahřívána na 100 °C. Po 3 hodinách bylo přidáno (23 μΐ; 0,23 mmol) 2thiofenmethylaminu. Reakce byla následně za 1,5 h ukončena. Reakční směs byla poté odpařena a přečištěna extrakcí kapalina-kapalina (EtOAc:H2O). EtOAc frakce byla vysušena pomocí Na2SC>4 a odpařena. Odparek byl přes noc krystalizován z diehyletheru při 4 °C. Výtěžek: 61 %.*H NMR (500 MHz, DMSO-76) δ ppm 1.92 - 2.00 (m, 1 H); 2.12 - 2.22 (m, 1
H); 2.31 - 2.38 (m, 1 H); 2.38 - 2.43 (m, 1 H); 3.85 (td, 7=7.68, 6.34 Hz, 1 H); 4.08 (td, 7=7.68, 6.50 Hz, 1 H); 4.79 (br. s., 2 H); 6.21 (dd, 7=6.88, 3.82 Hz, 1 H); 6.88 (dd, 7=5.04,3.44 Hz, 1 H); 6.97 (dd, 7=3.40, 1.03 Hz, 1 H); 7.27 (dd, 7=5.12, 1.22 Hz, 1 H); 8.23 (s, 2 H); 8.36 (br. s., 1 H).
Tabulka 2: Látky připravené způsobem podle příkladu 2
Č. R« r2 Elementární analýza vypočteno/nalezeno
%C %H %N ES MS [M+H]+
9 thiofen-2-ylmethyl H 55,8/55,6 5,0/5,4 23,2/23,3 302,4
10 3 -methylthiofen-2-y Imethyl H 57,1/57,2 5,4/5,5 22,2/22,3 316,4
11 5-methylthiofen-2-ylmethyl H 57,1/57,0 5,4/5,3 22,2/22,1 316,4
12 5-chlorothiofen-2-ylmethyl H 50,0/50,1 4,2/4,3 20,9/20,8 336,8
13 5-bromothiofen-2-ylmethyl H 44,2/44,1 3,7/3,8 18,4/18,5 381,3
14 l-thiofen-2-ylethyl H 57,1/57,0 5,4/5,5 22,2/22,0 316,4
Příklad 3: Příprava 2-chloro-6-furfurylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purinu (15)
2,6-Dichlor-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin (0,5 g; 1,93 mmol) byl umístěn do varné baňky spolu s n-propanolem (25 ml). Ke vzniklé suspenzi byl přidán furfurylamin (204 μΐ; 2,31 mmol) spolu sEtsN (1,35 ml; 9,65 mmol). Reakční směs byla pod zpětným chladičem za stálého míchání zahřívána na teplotu 100 °C. Po 5 h byla reakce ukončena. Jestliže látka nevykrystalizovala z reakční směsi, byla reakční směs po zahuštění za horka rozpuštěna ve směsi (CHC^EtOH; 1:8; v:v), nebo za pokojové teploty v směsi (CHC^Ether; 1:7; v:v). Po ochlazení byla vzniklá suspenze přefiltrována přes fritu a filtrační koláč byl promyt destilovanou vodou. Po vysušení byl filtrát za horka rozpuštěn v ethanolu (EtOH), petroletheru, karbofiltrován a krystalizován při 4 °C.
Tabulka 3: Látky připravené způsobem podle Příkladu 3
č. Ré r2 Elementární analýza vypočteno/nalezeno
%C %H %N ES MS [M+H]+
15 furfuryl Cl 52,6/52,5 4,4/4,3 21,9/21,7 320,7
16 5-methylfuran-2-ylmethyI Cl 54,0/54,1 4,8/4,7 21,0/20,9 334,8
17 5-hydroxymethylfuran-2ylmethyl Cl 51,5/51,6 4,6/4,7 20,0/20,1 350,8
18 5-formylfuran-2-ylmethyl Cl 51,8/51,9 4,1/4,2 20,1/20,3 348,8
19 1 -furan-2-ylethyI Cl 54,0/54,1 4,8/4,9 21,0/21,3 334,8
20 tetrahydrofuran-2-ylmethyl Cl 51,9/51,8 5,6/5,7 21,6/21,5 233,8
21 5-methyltetrahydrofuran-2ylmethyl Cl 53,3/53,4 6,0/6,0 20,7/20,5 338,8
22 1 -tetrahydrofuran-2-ylethy 1 Cl 53,3/53,4 6,0/6,1 20,7/20,6 338,8
23 thiofen-2-ylmethyl Cl 50,1/50,1 4,2/4,3 20,9/20,8 336,8
24 3-methylthiofen-2ylmethyl Cl 51,5/51,6 4,6/4,7 20,0/20,2 350,8
25 5-methylthiofen-2ylmethyl Cl 51,5/51,6 4,6/4,7 20,0/20,1 350,8
26 5-chlorthiofen-2-ylmethyl Cl 45,4/45,6 3,5/3,7 18,9/18,8 371,3
č. Ré r2 Elementární analýza vypočteno/nalezeno
%C %H %N ES MS [M+H]+
27 5-bromthiofen-2-ylmethyl Cl 40,6/40,5 3,2/3,1 16,9/16,8 415,7
28 1 -thiofen-2-ylethyl Cl 51,5/51,6 4,6/4,7 20,0/20,1 350,8
29 cyklopentylmethyl Cl 56,0/56,1 6,3/6,4 21,8/21,9 322,8
Příklad 4: Cytotoxicita nových derivátů pro kožní buňky stanovená MTT in vitro testem
MTT test je standardní test toxicity založený na fotometrickém měření schopnosti metabolicky aktivních buněk redukovat MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromid) na formazan. V testu byl sledován vliv 72 hodinového působení několika koncentrací látek (šestinásobná ředící řada, maximální koncentrace = 50 μΜ) na viabilitu kožních fibroblastů BJ a keratinocytů HaCaT. 5000 buněk bylo vyseto do jednotlivých jamek 96 jamkové mikrotitrační destičky 24 hodin před přidáním testovaných látek. Jako negativní kontrola bylo použito DMSO vehikulum. Po 72 hodinovém působení bylo přidáno nové médium s MTT (Sigma, M2128) do konečné koncentrace 0,5 mg/ml. Po třech hodinách bylo médium odstraněno a formazan obsažený v buňkách rozpuštěn v DMSO. Absorbance byla změřena při 570 nm (640 nm referenční vlnová délka). Hodnoty IC50 byly vypočteny z dávkových křivek. 6-Furfurylaminopurin ribosid byl použit jako pozitivní kontrola. Byly obdrženy následující výsledky:
Tabulka 4: Cytotoxicita stanovená MTT in vitro testem
Látka IC50 ( μΜ)
dimethylsulfoxid >100
6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin >100
6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)aminopurin >100
2-chloro-6-furfurylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin >100
6-furfurylamino-9-ribosylpurin (srovnávací látka) <3
Příklad 5: Zpomalení stárnutí listů pšenice a zpomalení degradace chlorofylu při testování nových derivátů v senescenčním biotestu
Nádoby se semeny ozimé pšenice Triticum aestivum cv Hereward vyseté do vermikulitu nasyceného Knopovým živným roztokem byly umístěny do klimatizované růstové komory s 16/8 hodinovou světelnou periodou (světelná intenzita 50 mmol.m^.s’1) a teplotou 15 °C. Po 7 dnech měly semenáčky vyvinutý první praporcový list a druhý list začínal prorůstat. Z prvních listů vždy od 10 rostlin byly odebrány vrcholové sekce dlouhé přibližně 35 mm, které byly zkráceny tak, aby jejich váha byla přesně 100 mg. Bazální konce těchto 10 listových segmentů byly umístěny do jamek mikrotitračních polystyrénových destiček obsahujících 150 ml roztoku testovaného derivátu. Destičky byly umístěny do plastického boxu vystlaného filtračním papírem, který byl nasycen vodou za účelem maximální vzdušné vlhkosti. Po 96 hodinách inkubace ve tmě při 25°C byly listové sekce vyjmuty a chlorfyl extrahován v 5 ml 80% ethanolu zahřátím při 80°C po dobu 10 min. Objem vzorku byl poté doplněn na 5 ml přidáním 80% ethanolu. Absorbance extraktů byla měřena při 665 nm. Jako kontroly byly měřeny rovněž chlorofylové extrakty z listů a listových vrcholů inkubované v deionizované vodě. Vypočtené hodnoty jsou průměrem z 10 opakování a celý experiment byl zopakován minimálně 3-krát. Výsledky těchto experimentů byly vyneseny ve formě grafů závislosti obsahu chlorfylu v senescenčních listech na koncentraci aplikované látky. V každém experimentu byla použita jako pozitivní kontrolní látka 6-benzylaminopurin, který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na výslednou koncentraci 10' M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10' až ΙΟ'4 M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2% a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. Ze získaných dat byla vypočítána maximální účinná koncentrace testované látky a její relativní účinnost v této koncentraci (Tab. 5). ΙΟ'4 M koncentrace BAP byla postulována jako 100% biologické aktivity. Jako další srovnávací látka byl použit kinetin. Nově připravené látky převyšují zpravidla účinnost BAP standardu v rozmezí o 10 %. Nově vyvinuté látky mají tedy výraznější antisenescenční účinky než známé látky.
Tabulka 5: Účinek nových cytokinů na retenci chlorofylu v extirpovaných listových segmentech pšenice. Hodnoty v tabulce jsou vyjádřeny v % výchozího obsahu chlorofylu v čerstvých listech před inkubací.
Látka maximální účinná koncentrace (mol.!'1) účinnost (%) [ΙΟΛηοΙ.Γ1 BAP = 100%]
BAP (srovnávací látka) ΚΓ4 100±l
kinetin (srovnávací látka) 10’4 98±4
6-furfurylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 10-4 114±3
6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9- (tetrahydrofuran-2-yl)purin 10'4 122±2
6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9- (tetrahydrofuran-2-yl)purin 10-4 125±9
6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2yl)purin 10’4 112±5
2-chloro-6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9- (tetrahydrofuran-2-yl)purin 10’4 127±5
Příklad 6: In vitro cytotoxická aktivita nových derivátů na nádorových buněčných liniích
Jedním z parametrů používaných jako základ pro cytotoxickou analýzu je metabolická aktivita životaschopných buněk. Například mikrotitrační analýza, kde se používá Calcein AM, je dnes rozšířena jako metoda kvantifikace buněčné proliferace a cytotoxicity. Množství zredukovaného Calceinu AM odpovídá počtu životaschopných buněk v kultuře.
Buněčné linie prsního karcinomu MCF-7, lidské erythroleukemic K562, lidské diploidní fibroblasty BJ a lidské keratinocyty HaCaT byly použity pro screening cytotoxicity sloučenin. Buňky byly udržovány v Nunc/Coming 80 cm2 plastových lahvích a pěstovány v mediu pro buněčné kultury (DMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 10% fetálního telecího séra a hydrogenuhličitan sodný). Buněčné suspenze byly připraveny a naředěný podle typu buněk a podle očekávané konečné hustoty buněk (104 buněk na jamku na základě charakteristik buněčného růstu), bylo pipetováno 80 pl buněčné suspenze na 96-jamkové mikrotitrační destičky. Inokuláty byly stabilizovány 24 hodinovou preinkubací při 37°C v atmosféře CO2. Jednotlivé koncetrace testovaných látek byly přidány v čase nula jako 20 pl alikvotní podíl do jamek mikrotitračních destiček. Obvykle byly sloučeniny testovány v šesti koncentracích v čtyřnásobné ředící řadě. Při rutinním testování byla nej vyšší koncentrace v jamce 166,7 pM, změny této koncentrace závisí na dané látce. Všechny koncentrace byly testovány v dubletu. Inkubace buněk s testovanými deriváty trvala 72 hodin při 37°C, 100% vlhkosti a v atmosféře obohacené CO2. Na konci inkubační periody byly buňky analyzovány po přidání roztoku Calceinu AM (Molecular Probes) a inkubace probíhala další 1 hodinu. Fluorescence (FD) byla měřena pomocí Labsystem FIA readeru Fluorskan Ascent (Microsystems). Přežití buněk (The cell survival-TCS) bylo spočítáno podle následujícího vztahu: Gl5o=(FDjamka s derivátem /FDkontroini jamka) x 100 %. Hodnota GI50, která odpovídá koncentraci látky, kdy je usmrceno 50 % buněk, byla vypočtena ze získaných dávkových křivek.
Pro vyhodnocení protinádorové aktivity byla testována toxicita nových derivátů na panelech obsahujících buněčné linie rozdílného histogenetického a druhového původu (Tab. 6, GI50 koncentrace uváděny v μΜ). Ukázalo se, že pro všechny testované nádorové linie i pro nemaligní buněčné linie BJ a HaCaT bylo působení nových sloučenin netoxické. Účinné deriváty zabíjí nádorové buňky při koncentracích blízkých 0,1 až 50 μΜ.
Tabulka. 6: Cytotoxicita látek podle vynálezu pro různé buněčné linie
Látka MCF-7 K562 BJ HaCaT
6-furfurylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin >100 >100 >100 >100
6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran- 2-yl)purin >100 >100 >100 >100
6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2- yl)purin >100 >100 >100 >100
2-chloro-6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9- (tetrahydrofuran-2-yl)purin >100 >100 >100 >100
Příklad 7: In vitro test fotoxických účinků na lidské kožní fibroblasty
Možné fototoxické účinky látek byly stanoveny podle modifikovaného in vitro testu validovaného pro stanovení fototoxicity látek (Spielmann a kol., 1998). Jako in vitro model byly použity normální lidské kožní fibroblasty (NHDF). Buňky byly izolovány z fragmentů kůže od zdravých dárců, kteří podstoupili chirurgický zákrok na Oddělení plastické a estetické chirurgie FN Olomouc. Odběr tkáně a izolace buněk proběhla podle postupu a podmínek schválených Etickou komisí FN Olomouc a Lékařské fakulty UP Olomouc a po podepsání informovaného souhlasu s odběrem tkáně jednotlivými dárci. Pro experimenty byly NHDF použity mezi 2. a 4. pasáží. NHDF byly vysety na 96-jamkové desky v koncentraci 0,8.105 buněk/ml kultivačního média (DMEM doplněné o fetální telecí sérum (10%), penicilín (100 mg/ml) a streptomycin (100 U/ml)) v množství 0,2 ml na jamku.
Testovanou látkou byl 6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin (1). Látka byla rozpuštěna v DMSO a poté ředěna do média bez séra (DMEM s penicilinem (100 mg/ml) a streptomycinem (100 U/ml)). Výsledné aplikované koncentrace byly 3,9 až 500 pmol/l. Jako kontrola bylo použito médium bez séra s DMSO (0,5 % (v/v)), což odpovídá jeho výsledné koncentraci při experimentu s testovanými látkami. Pro srovnání s tetovanými látkami byl použit chlorpromazin (CPZ; 0,8 až 50 pmol/l) jako pozitivní fototoxická látka. Po 24 hodinách od vysetí NHDF bylo růstové médium vyměněno za médium bez séra obsahující testované látky nebo DMSO (rozpouštědlová kontrola). Roztoky testovaných látek byly paralelně aplikovány na dvě 96-jamkové desky s NHDF. Po 1 hodinové preinkubaci s látkami bylo médium odstraněno, buňky byly dvakrát opláchnuty roztokem PBS a poté bylo aplikováno PBS s glukózou (1 mg/ml). Následně byla jedna deska ozářena netoxickou dávkou (5 J/cm2) UVA záření. Druhá deska byla po dobu ozařování inkubována v temnu. K ozáření byl použit solární simulátor SOL 500 vybavený H1 filtrem (Dr. Hoenle Technology, Německo), který propouští záření v rozsahu vlnových délek 320 až 400 nm. Intenzita UVA záření byla při každém ozařování stanovena pomocí UVA-metru (Dr. Hoenle Technology, Německo). Po UVA expozici bylo PBS s glukózou odstraněno a k buňkám bylo aplikováno médium bez séra. Po 24 hodinové inkubaci (37 °C, 5 % CO2) byla sledována životnost buněk (respektive buněčné poškození) stanovením inkorporace neutrální červeně (NČ) do buněk. Po odstranění média bez séra byl k buňkám aplikován roztok NČ (0,03 %; PBS). Po 1 hodinové inkubaci (37 °C, 5 % CO2) byl roztok s NČ odstraněn, buňky byly fixovány směsí formaldehydu (0,5 %, v/v) a CaCl2 (1 %, m/v) v poměru 1:1a barvivo bylo rozpuštěno extrakčním roztokem (methanol (50 %, v/v), CH3COOH (1 %, v/v). Po 5 minutovém intenzivním třepání byla změřena absorbance při 540 nm. Experimenty byly provedeny ve 4 nezávislých opakováních s použitím buněk od 4 dárců kvůli minimalizaci individuálních rozdílů v citlivosti buněk. Fototoxický účinek látek byl hodnocen určením procent životnosti kontrolních buněk (% životnosti kontroly) z hodnot příslušných absorbancí podle následujícího vztahu:
Životnost (% kontroly) = (4~Λ) •100
Av... absorbance vzorku (buňky pre-inkubované stestovanými látkami v médiu bez séra a následně ozářené)
AK ... absorbance kontroly (buňky inkubované s DMSO v médiu bez séra a ozářené)
Ap ... absorbance pozadí (extrakění roztok)
Výsledek: Testovaná látka nejevila v použitém koncentračním rozmezí, tj. 3,9 až 500 gmol/l, fototoxické účinky (nedošlo ke snížení životnosti buněk ~ schopnosti inkorporovat NČ ve srovnání s kontrolními buňkami). Výsledky jsou znázorněny v tabulce (Tab. 7). Současně byl jako pozitivní kontrola použit CPZ, který je doporučován validovaným postupem (Spielmann H, Balls M, Dupuis J, Pape WJ, Pechovitch G, de Silva O, Holzhutter HG, Clothier R, Desolle P, Gerberick F, Liebsch M, Lovell WW, Maurer T, Pfannenbecker U, Potthast JM, Csato M, Sladowski D, Steiling W, Brantom P., Toxicol In Vitro. 1998 Jun 1 ;12(3):305-27) jako známá fototoxická sloučenina, viz Tab. 8. Z výše uvedených výsledků vyplývá, že testovaná látka je bezpečná při použití do kosmetických a dermatologických přípravků, i ve spojení s následnou expozicí jí ošetřené pokožky slunečnímu záření.
Tabulka 7: Účinky látky 1 na životnost NHDF stimulovaných UVA zářením (+UVA) ve srovnání s kontrolou inkubovanou v temnu (-UVA).
1
Koncentrace (gmol/l) % kontroly
-UVA ±UVA
3,9 96,6 ± (7,4) 105,1 ±(10,3)
7,8 106,5 ±(9,2) 110,6 ±(10,7)
15,6 99,6 ± (3,7) 106,8 ±(13,4)
31,3 102,4 ±(2,1) 109,5 ±(10)
62,5 102,3 ±(5,8) 103,3 ± (8,9)
125 109,5 ±(10,5) 107,5 ±(8,9)
250 109,1 ±(6,7) 106,7 ±(7,8)
500 105,3 ± (11,1) 98,9 ± (4,2)
Tabulka 8: Pro srovnání: účinky fototoxického chlorpromazinu na životnost NHDF stimulovaných UVA zářením (+UVA) ve srovnánís kontrolou inkubovanou v temnu (-UVA).
CPZ
Koncentrace % kontroly
(gmol/l) -UVA ±UVA
0,8 102,6 ±(5,8) 99,2 ±(7,1)
1,6 101,5 ±(1) 104,6 ±(7,7)
3,1 105,6 ± (6) 87,3 ± (8,6)
6,3 107,4 ±(4,6) 82,8 ±(15,4)
12,5 104 ±(3,8) 49,6 ±(17,6)
25 77 ± (7,8) 19,8 ±(14,2)
50 4,7 ± (4,2) 9,8 ± (7,8)
Příklad 8. In vitro test fotoprotektivních účinků na normální lidské kožní fibroblasty
Jako in vitro model byly použity normální lidské kožní fibroblasty (NHDF). Buňky byly izolovány z fragmentů kůže od zdravých dárců, kteří podstoupili chirurgický zákrok na Oddělení plastické a estetické chirurgie FN Olomouc. Odběr tkáně a izolace buněk proběhla podle postupu a podmínek schválených Etickou komisí FN Olomouc a Lékařské fakulty UP Olomouc a po podepsání informovaného souhlasu s odběrem tkáně jednotlivými dárci. Pro experimenty byly NHDF použity mezi 2. a 4. pasáží. NHDF byly vysety na 96-jamkové desky v koncentraci 0,8.105 buněk/ml kultivačního média (DMEM doplněné o fetální telecí sérum (10%), penicilín (100 mg/ml) a streptomycin (100 U/ml)) v množství 0,2 ml najamku. Testovanou látkou byl 6-tetrahydrofurfurylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin (1). Látka byla rozpuštěna v DMSO a poté ředěna do média bez séra (DMEM s penicilinem (100 mg/ml) a streptomycinem (100 U/ml)). Jako kontrola bylo použito médium bez séra s DMSO (0,5 /ó (v/v)), což odpovídá jeho výsledné koncentraci při experimentu s testovanými látkami. Po 24 hodinách od vysetí NHDF bylo růstové médium vyměněno za médium bez séra obsahující testované látky nebo DMSO (rozpouštědlová kontrola). Testovaná látka byla paralelně aplikována na dvě 96-jamkové desky s NHDF. Po 60 min inkubaci bylo médium s látkami odstraněno, buňky byly dvakrát opláchnuty roztokem PBS a bylo aplikováno PBS s glukózou (1 mg/ml). V případě sledování ochrany vůči UVA záření byla následně jedna deska ozářena cytotoxickou dávkou UVA záření (7,5 J/cm2) s využitím solárního simulátoru SOL 500 (Dr.
Hoenle Technology, Německo) vybaveným Hl filtrem, který propouští záření v rozsahu vlnových délek 320-400 nm. Při sledování ochrany vůči UVB záření byly buňky ozářeny cytotoxickou dávkou UVB záření (400 mJ/cm2). K ozáření byl použit solární simulátor SOL 500 vybavený H2 filtrem, který propouští záření v rozsahu vlnových délek 295-320 nm. Intenzita UVA nebo UVB záření byla při každém ozařování stanovena pomocí UVA- nebo UVB-metru (Dr. Hoenle Technology, Německo). Kontrolní buňky byly v obou případech po dobu ozařování inkubovány v temnu. Po UVA/UVB expozici bylo PBS s glukózou odstraněno a k buňkám bylo aplikováno médium bez séra. Po 24 hodinové inkubaci (37 °C, 5 % CO2) bylo sledováno buněčné poškození stanovením inkorporace neutrální červeně (NC) do buněk. Po odstranění média bez séra byl k buňkám aplikován roztok NČ (0,03 %; PBS). Po 1 hodinové inkubaci (37 °C, 5 % CO2) byl roztok s NČ odsán, buňky byly fixovány směsí formaldehydu (0,5 %, v/v) a CaCl2 (1 %, m/v) v poměru 1:1a barvivo bylo rozpuštěno extrakčním roztokem (methanol (50 %, v/v), CH3COOH (1 %, v/v). Po 5 min intenzivního třepání byla změřena absorbance při 540 nm. Experimenty byly provedeny ve 4 nezávislých opakováních s použitím buněk od 4 dárců kvůli minimalizaci individuálních rozdílů v citlivosti buněk.
Ochranný účinek látky na poškození vyvolané UVA nebo UVB zářením byl vypočítán z experimentálních dat (absorbancí) testovaných látek s pozitivní a negativní kontrolou podle následujícího vztahu:
% ochrany = 100 —
Avz - Ank Apk - Ank •100
Avz ... absorbance vzorku (buňky pre-inkubované s testovanými látkami v médiu bez séra a následně ozářené)
Ank ... absorbance negativní kontroly (buňky inkubované s DMSO v médiu bez séra a neozářené = inkubované v temnu)
Apk ... absorbance pozitivní kontroly (buňky inkubované sDMSO v médiu bez séra a ozářené)
Výsledek: U buněk inkubovaných s testovanou látkou před UVA nebo UVB ozářením byla nalezena vyšší životnost buněk (schopnost inkorporace NČ) ve srovnání s buňkami inkubovanými s DMSO (kontrola) a ozářenými UVA nebo UVB ozářením (Tab 9 a 10). Látka tedy vykazuje současně UVA i UVB fotoprotektivní efekt.
Tabulka 9: Stanovení ochranných účinků látky 1 vůči poškození UVA zářením. Výsledky reprezentují průměr ± SD ze 4 experimentů provedených na NHDF izolovaných od různých pacientů.
Koncentrace (pmol/l)
UVA fotoprotekce % ochrany
3,9 27,7 ± (6,9)
7,8 57,4 ±(14,4)
15,6 43,2 ±(10,8)
31,3 47,5 ±(11,9)
62,5 41,3 ±(10,3)
125 49 ±(12,3)
250 45,3 ±(11,3)
500 18,5 ±(4,6)
Tabulka 10: Stanovení ochranných účinků látky 1 vůči poškození UVB zářením. Výsledky reprezentují průměr ± SD ze 4 experimentů provedených na NHDF izolovaných od různých pacientů.
Koncentrace (pmol/l)
UVB fotoprotekce _______________________1 % ochrany
3,9 4,9 ±(1,2)
7,8 44,1 ±(11)
15,6 35 ±(8,7)
31,3 38,3 ±(9,6)
62,5 44,4 ± (11,1)
125 42,7 ±(10,7)
250 46,6 ±(11,6)
500 _____________26,3 ± (6,6)
Příklad 9. In vitro test fetotoxicity na normální lidské kožní keratinocyty
Jako in vitro model byly použity normální lidské kožní keratinocyty (NHEK). Buňky byly izolovány z fragmentů kůže od zdravých dárců, kteří podstoupili chirurgický zákrok na
Oddělení plastické a estetické chirurgie FN Olomouc. Odběr tkáně a izolace buněk proběhla podle postupu a podmínek schválených Etickou komisí FN Olomouc a Lékařské fakulty UP Olomouc. Všichni dárci podepsali informovaný souhlas s odběrem tkáně. Pro experiment byly buňky použity ve 3. až 4. pasáži. NHEK byly vysety na 96-jamkové desky v koncentraci 1.10 buněk/jamku v růstové médium pro keratinocyty (EpiLife®) doplněné o komerční sadu růstových faktorů (Human Keratinocyte Growth Supplement Kit) a antibiotika (penicilín (100 mg/ml), streptomycin (100 mg/1) a ampicilin (250 pg/ml).
Testovanou látkou byl 6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin (1). Látka 1 byla rozpuštěna v DMSO a poté naředěna do média bez séra (EpiLife® s penicilinem (100 mg/ml) a streptomycinem (100 U/ml) a ampicilinem (250 pg/ml)) na koncentrační rozmezí (3,9 až 500 pmol/1) tak, aby výsledná koncentrace DMSO v médiu byla 0,5 % (v/v). Kontrolní médium obsahovalo příslušný objem DMSO v médiu bez séra. Po 24 hodinové inkubaci NHEK bylo růstové médium vyměněno za médium bez séra obsahující testované látky a DMSO (negativní kontrola). Jako pozitivní kontrola byla použita známá fototoxická sloučenina chlorpromazin (CPZ; 0,8-50 pmol/1). Roztoky testovaných látek byly paralelně aplikovány na dvě 96-jamkové desky s buňkami. Po 1 hodinové preinkubaci bylo médium odstraněno, buňky byly dvakrát opláchnuty roztokem PBS a poté bylo aplikováno PBS s glukózou (1 mg/ml). Následně byla jedna deska ozářena netoxickou dávkou (5 J/cm2) UVA záření. Druhá deska byla po dobu ozařování inkubována v temnu. K ozáření byl použit solární simulátor SOL 500 vybavený H1 filtrem (Dr. Hoenle Technology, Německo), který propouští záření v rozsahu vlnových délek 320-400 nm. Intenzita UVA záření byla při každém ozařování stanovena pomocí UVA-metru (Dr. Hoenle Technology, Německo). Po UVA expozici bylo PBS s glukózou odstraněno a k buňkám bylo aplikováno bezsérové medium. Po 24 hodinové inkubaci (37 °C, 5 % CO2) bylo sledováno buněčné poškození stanovením inkorporace NČ do buněk. Po odstranění média bez séra byl k buňkám aplikován roztok NC (0,03 %; PBS). Po 1 h inkubaci (37 °C, 5 % CO2) byl roztok s NČ odstraněn, buňky byly fixovány směsí formaldehydu (0,5 %, v/v) a CaCl2 (1 %, m/v) v poměru 1:1a barvivo bylo rozpuštěno extrakčním roztokem (methanol (50 %, v/v), CH3COOH (1 %, v/v). Po 5 minutách intenzivního třepání byla změřena absorbance při 540 nm. Experimenty byly provedeny ve 4 nezávislých opakováních s použitím buněk od 4 dárců kvůli minimalizaci individuálních rozdílů v citlivosti buněk. Fototoxický účinek látek byl hodnocen určením procent životnosti kontrolních buněk (% životnosti kontroly) z hodnot příslušných absorbancí podle následujícího vztahu:
Životnost (% kontroly) = — Ap) •100
Av... absorbance vzorku (buňky pre-inkubované s testovanými látkami v médiu bez séra a následně ozářené)
Ak ... absorbance kontroly (buňky inkubované s DMSO v médiu bez séra a ozářené)
Ap ... absorbance pozadí (extrakční roztok) naměřených hodnot absorbance byla pro každou koncentraci látky vypočtena viabilita buněk jako % kontroly.
Výsledek: Látka 1 nejevila v použitém koncentračním rozmezí 3,9 až 500 pmol/l fototoxické účinky, (nedošlo ke snížení životnosti buněk ~ schopnosti inkorporovat NČ ve srovnání s kontrolními buňkami), viz Tab. 11. Současně s látkou 1 byl jako pozitivní kontrola použit CPZ, který je doporučován validovaným postupem (Spielmann H, Balls M, Dupuis J, Pape WJ, Pechovitch G, de Silva O, Holzhutter HG, Clothier R, Desolle P, Gerberick F, Liebsch M, Lovell WW, Maurer T, Pfannenbecker U, Potthast JM, Csato M, Sladowski D, Steiling W, Brantom P., Toxicol In Vitro. 1998 Jun 1 ;12(3):305-27) jako známá fototoxická sloučenina, viz Tab. 12. Z výše uvedených výsledků vyplývá, že testovaná látka je bezpečná při použití do kosmetických a dermatologických přípravků, i ve spojení s následnou expozicí jí ošetřené pokožky slunečnímu záření.
Tabulka 11: Účinky látky 1 na životnost NHEK stimulovaných UVA zářením (+UVA) ve srovnání s kontrolou inkubovanou po dobu ozařování v temnu (-UVA).
1
Koncentrace (pmol/l) % kontroly
-UVA ±UVA
3,9 112,2 ± (11) 109,1 ±(2,3)
7,8 135,5 ±(8,2) 120,6 ±(1,6)
15,6 116,5 ±(2,8) 110 ±(2,9)
31,3 119,1 ±(8,7) 115,1 ±(2,8)
62,5 121 ±(8,7) 105,9 ±(8,7)
125 119 ±(2,8) 111,7 ±(6,8)
250 110,8 ±(12,4) 112,1 ±(3,7)
500 105,7 ±(7,1) 101,2 ±(3,3)
Tabulka 12: Pro srovnání: účinky fototoxického chlorpromazinu na životnost NHEK stimulovaných UVA zářením (+UVA) ve srovnánís kontrolou inkubovanoupo dobu ozařování v temnu (-UVA).
CPZ
Koncentrace (pmol/1) % kontroly
-UVA +UVA
0,8 103,8 ±(4,4) 121,7 ± (13)
1,6 102 ±(4,6) 77,6 ± (0,9)
3,1 97,6 ±(13,1) 70,4 ± (5,5)
6,3 99,9 ± (7) 47,1 ±(5,2)
12,5 45,4 ± (24,6) 34,7 ±(15,4)
25 29,1 ±(14,5) 26,3 ±(19)
50 17,3 ±(2,2) 21,7 ± (19)
Příklad 10. In vitro test fotoprotektivních účinků na normální lidské kožní keratinocyty (NHEK)
Jako in vitro model byly použity normální lidské kožní keratinocyty (NHEK). Buňky byly izolovány z fragmentů kůže od zdravých dárců, kteří podstoupili chirurgický zákrok na Oddělení plastické a estetické chirurgie FN Olomouc. Odběr tkáně a izolace buněk proběhla podle postupu a podmínek schválených Etickou komisí FN Olomouc a Lékařské fakulty UP Olomouc. Všichni dárci podepsali informovaný souhlas s odběrem tkáně. Pro experiment byly buňky použity ve 3. až 4. pasáži. NHEK byly vysety na 96-jamkové desky v koncentraci 1.104 buněk/jamku v růstové médium pro keratinocyty (EpiLife®) doplněné o komerční sadu růstových faktorů (Human Keratinocyte Growth Supplement Kit) a antibiotika (penicilín (100 mg/ml), streptomycin (100 mg/1) a ampicilin (250 pg/ml).
Testovanou látkou byl 6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin (1). Látka 1 byla rozpuštěna v DMSO a poté naředěna do média bez séra (EpiLife® s penicilinem (100 mg/ml) a streptomycinem (100 U/ml) a ampicilinem (250 pg/ml)) na koncentrační rozmezí (3,9-500 pmol/1) tak, aby výsledná koncentrace DMSO v médiu byla 0,5 % (v/v). Po 24 hodinové inkubaci NHEK bylo růstové médium vyměněno za médium bez séra obsahující testované látky a DMSO (negativní kontrola). Kontrolní médium obsahovalo příslušný objem
DMSO v médiu bez séra. Jako kontrola bylo použito médium bez séra s DMSO (0,5 % (v/v)), což odpovídá jeho výsledné koncentraci při experimentu s testovanými látkami. Testovaná látka byla paralelně aplikována na dvě 96-jamkové desky s NHEK. Po 60 minutové inkubaci bylo médium s látkami odstraněno, buňky byly dvakrát opláchnuty roztokem PBS a bylo aplikováno PBS s glukózou (1 mg/ml). V případě sledování ochrany vůči UVA záření byla následně jedna deska ozářena cytotoxickou dávkou UVA záření (7,5 J/cm2) s využitím solárního simulátoru SOL 500 (Dr. Hoenle Technology, Německo) vybaveným H1 filtrem, který propouští záření v rozsahu vlnových délek 320-400 nm. Při sledování ochrany vůči UVB záření byly buňky ozářeny cytotoxickou dávkou UVB záření (400 mJ/cm2). K ozáření byl použit solární simulátor SOL 500 vybavený H2 filtrem, který propouští záření v rozsahu vlnových délek 295-320 nm. Intenzita UVA nebo UVB záření byla při každém ozařování stanovena pomocí UVA- nebo UVB-metru (Dr. Hoenle Technology, Německo). Kontrolní buňky byly v obou případech po dobu ozařování inkubovány v temnu. Po UVA/UVB expozici bylo PBS s glukózou odstraněno a k buňkám bylo aplikováno médium bez séra. Po 24 hodinové inkubaci (37 °C, 5 % CO2) bylo sledováno buněčné poškození stanovením inkorporace neutrální červeně (NČ) do buněk. Po odstranění média bez séra byl k buňkám aplikován roztok NČ (0,03 %; PBS). Po 1 hodinové inkubaci (37 °C, 5 % CO2) byl roztok s NČ odsán, buňky byly fixovány směsí formaldehydu (0,5 %, v/v) a CaCl2 (1 %, m/v) v poměru 1:1 a barvivo bylo rozpuštěno extrakčním roztokem (methanol (50 %, v/v), CH3COOH (1 %, v/v). Po 5 minutách intenzivního třepání byla změřena absorbance při 540 nm. Experimenty byly provedeny ve 4 nezávislých opakováních s použitím buněk od 4 dárců kvůli minimalizaci individuálních rozdílů v citlivosti buněk.
Ochranný účinek látek na poškození vyvolané UVA nebo UVB zářením byl vypočítán z experimentálních dat (absorbancí) testovaných látek s pozitivní a negativní kontrolou podle následujícího vztahu:
% ochrany = 100Avz - Ank
Apk - Ank •100
Avz ... absorbance vzorku (buňky pre-inkubované s testovanými látkami v médiu bez séra a následně ozářené)
Ank ... absorbance negativní kontroly (buňky inkubované s DMSO v médiu bez séra a neozářené = inkubované v temnu)
Apk ... absorbance pozitivní kontroly (buňky inkubované s DMSO v médiu bez séra a ozářené)
Výsledek: U buněk inkubovaných s látkou 1 před UVA nebo UVB ozářením byla nalezena vyšší životnost buněk (schopnost inkorporace NC) ve srovnání s buňkami inkubovanými s DMSO (kontrola) a ozářenými UVA nebo UVB ozářením (Tab 13 a 14). Látka 1 tedy vykazuje současně UVA i UVB fotoprotektivní efekt.
Tabulka 13: Stanovení ochranných účinků látky 1 vůči poškození UVA zářením. Výsledky reprezentují průměr ±SD ze 4 experimentů provedených na NHEK izolovaných od různých pacientů
UVA fotoprotekce
Koncentrace (pmol/l) -----------------------% ochrany
3,9 39,7 ±(12,9)
7,8 60,2 ±(16,1)
15,6 53,5 ±(12,4)
31,3 46,8 ±(11,8)
62,5 47,9 ± (8,9)
125 51,7 ±(4,8)
250 48 ± (3,2)
500 30 ±(13,5)
Tabulka 14: Stanovení ochranných účinků látky 1 vůči poškození UVB zářením. Výsledky reprezentují průměr ± SD ze 4 experimentů provedených na NHEK izolovaných od různých
pacientů
UVB fotoprotekce
Koncentrace (pmol/l) 1
% ochrany
3,9 53,5 ± (7,6)
7,8 72 ± (6)
15,6 69,8 ± (8,6)
31,3 65,9 ± (9)
62,5 65,9 ± (5)
125 72,9 ± (6,9)
250 65,7 ± (3,6)
500 28 ±(3,2)
Příklad 11: Vliv testovaných látek na délku života Caenorhabditis elegans
Caenorhabditis elegans se používá jako modelový organismus pro identifikaci látek schopných příznivě modulovat některé aspekty stárnutí savců včetně člověka. Rada látek prodlužujících život C. elegans má příznivý efekt na patologické projevy některých nemocí spojených se stářím. Příkladem takových látek může být resveratrol, kurkumin a řada dalších. Délku života C. elegans prodlužuje i řada látek použiváných v kosmetice pro regeneraci pleti a zpomalení jejího stárnutí, jako je například výše zmíněný resveratrol, vitamin E, koenzym Q10, extrakty ze zeleného čaje nebo granátového jablka nebo cytokinin kinetin. V tomto experimentu byla použita standardní linie Caenorhabditis elegans fem-l/HCAl nesoucí teplotou indukovatelnou mutaci, která způsobí, že se všichni jedinci při kultivaci ve 25 °C vyvinou v samice, což zabrání další reprodukci a potenciálnímu smíchání původní experimentální populace s potomstvem. Testované látky rozpuštěné v DMSO (100 mM zásobní roztoky) byly přidány do čerstvého NGM (nematode growth medium) do finální koncentrace 10 a 100 μΜ. Médium bylo následně rozpipetováno do Petriho misek. Jako negativní kontrola bylo použito čisté NGM a NGM s DMSO vehikulem. Po ztuhnutí média bylo na misky rozetřeno 100 μΐ suspenze bakterií Escherichia coli OP50 v LB médiu (suspenze kultivována přes noc ve 37°C a 20krát zkoncetrována), které slouží jako zdroj potravy pro háďátka. Misky byl ponechány přes noc v 37°C, aby se bakterie mohly rozrůst. Na takto připravené misky byla následně nasazena populace věkově synchronizovaných mladých dospělců C. elegans. Misky byly uchovávány v inkubátoru ve 25°C a ve vybraných časových intervalech (každé 1-3 dny) skenovány na skeneru (Epson perfection V700 photo). Počet přežívajících jedinců byl určen pomocí analýzy obrazu v programu Fiji. Skript vycházející z identifikuje pohybující se objekty srovnáním série fotografií misky pořízených s malým časovým odstupem (přibližně 30 s). Byly srovnávány tři po sobě pořízené fotografie každé misky a napočtené hodnoty byly zprůměrovány, aby se snížila možnost chyby. Výsledky byly následně analyzovány pomocí programů OASIS a ED50vl0. Statistická signifikance byla vyhodnocena pomocí Log-Rank testu a získané p-hodnoty byly korigovány podle Bonferroniho. Výsledky shrnuje tabulka 15. Látky 1, 15 a 20 statisticky významně prodlužovaly život C. elegans.
Tabulka 15: Vliv testovaných látek na délku života C. elegans (ve dnech)
DMSO 15 10 μΜ 15 100 μΜ 20 10 μΜ 20 100 μΜ 1 10 μΜ 1 100 μΜ
medián 8,7 9,4 10,3 11,2 10,2 10,3 10,2
průměr 10,9 11,3 13,8 12,4 11,2 11,9 12,6

Claims (10)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Adeninové deriváty obecného vzorce I
    a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem, aminy, nebo adiční soli s kyselinami, kde
    R2 je vodík nebo halogen;
    R6 je vybrán ze skupiny zahrnující
    - heteroaryl s 5- až 6-členným aromatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, přičemž heteroaryl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
    - heteroarylalkyl s 5- až 6-členným aromatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž heteroarylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(C 1 -C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1 -C4)alkyl;
    - heterocyklyl s 5- až 6-členným alifatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, přičemž heterocyklyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(C 1-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl;
    - heterocyklylalkyl s 5- až 6-členným alifatickým kruhem obsahujícím alespoň jeden heteroatom vybraný z O, S a ostatní atomy kruhu jsou atomy uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž heterocyklylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(ClC4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(ClC4)alkylamino, amino(C 1 -C4)alkyl;
    - cykloalkyl s kruhem obsahujícím 5 až 6 atomů uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(C 1 -C4)alkylamino, amino(C 1 -C4)alkyl;
    - cykloalkylalkyl s kruhem obsahujícím 5 až 6 atomů uhlíku, kde alkyl obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž cykloalkylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1 -C4)alkyl;
    - isoalkyl obsahující 3 až 7 atomů uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1 -C4)alkyl.
  2. 2. Adeninové deriváty podle nároku 1, kde v substituentu R6 heteroaryl obsahuje 5-členný kruh, a v tomto 5-atomovém kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S, přičemž heteroaryl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl.
  3. 3. Adeninové deriváty podle nároku 1, kde v substituentu R6 heteroarylalkyl obsahuje 5členný kruh a C1-C2 alkyl, a v 5-atomovém kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S, přičemž heteroarylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl.
  4. 4. Adeninové deriváty podle nároku 1, kde v substituentu R6 heterocyklyl obsahuje 5-členný kruh, a v 5-atomovém kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S, přičemž heterocyklyl je ne substituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(Cl-C4)alkyl.
  5. 5. Adeninové deriváty podle nároku 1, kde v substituentu R6 heterocyklylalkyl obsahuje 5členný kruh a Cl-C2 alkyl, a v 5-atomovém kruhu jeden heteroatom, kterým je O nebo S, přičemž heterocyklylalkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1 -C4)alkyl.
  6. 6. Adeninové deriváty podle nároku 1, kde substituent R6 je vybrán ze skupiny zahrnující cyklopentyl, cyklopentylmethyl, isopropyl, isobutyl, isopentyl, isohexyl, isoheptyl, přičemž každá z uvedených skupin je nesubstituovaná nebo substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující C1-C4 alkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, merkapto(Cl-C4)alkyl, formyl, acetyl, halogen, karboxyl, amino, di(Cl-C4)alkylamino, amino(C 1 -C4)alkyl.
  7. 7. Adeninové deriváty podle nároku 1, vybrané ze skupiny zahrnující: 6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-methylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-hydroxymethylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-formylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-( 1 -furan-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(5-methyltetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(l-tetrahydrofuran-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(cyklopentylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(3-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin
    6-(5-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-chlorthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-(5-bromthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 6-( 1 -thiofen-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-furfurylamino-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-methylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-hydroxymethylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-formylfuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(l-furan-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(tetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-methyltetrahydrofuran-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(l-tetrahydrofuran-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(thiofen-2-ylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(thiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(3-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-methylthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-chlorthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(5-bromthiofen-2-ylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(l-thiofen-2-ylethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin 2-chlor-6-(cyklopentylmethylamino)-9-(tetrahydrofuran-2-yl)purin.
  8. 8. Použití alespoň jednoho adeninového derivátu obecného vzorce I podle kteréhokoliv z předcházejících nároků jako UV-fotoprotektivních složek v kosmetických přípravcích, v přípravcích pro ochranu rostlin a/nebo v přípravcích pro ošetření tkáňových kultur.
  9. 9. Použití podle nároku 8, kde se alespoň jeden adeninový derivát obecného vzorce I použije jako složka s kombinovaným antisenescenčním a UV-fotoprotektivním účinkem.
  10. 10. Kosmetické přípravky, přípravky pro ochranu rostlin a/nebo v přípravky pro ošetření tkáňových kultur, vyznačené tím, že obsahují alespoň jednu látku obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7.
CZ2015-582A 2015-08-28 2015-08-28 Adeninové deriváty a jejich použití CZ307722B6 (cs)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2015-582A CZ307722B6 (cs) 2015-08-28 2015-08-28 Adeninové deriváty a jejich použití
PCT/CZ2016/050029 WO2017036434A1 (en) 2015-08-28 2016-08-24 Adenine derivatives and their use as uv-photoprotective agents
EP16762957.5A EP3341371B1 (en) 2015-08-28 2016-08-24 Adenine derivatives and their use as uv-photoprotective agents
US15/753,828 US10774084B2 (en) 2015-08-28 2016-08-24 Adenine derivatives and their use as UV-photoprotective agents

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2015-582A CZ307722B6 (cs) 2015-08-28 2015-08-28 Adeninové deriváty a jejich použití

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2015582A3 true CZ2015582A3 (cs) 2017-03-08
CZ307722B6 CZ307722B6 (cs) 2019-03-27

Family

ID=56888877

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2015-582A CZ307722B6 (cs) 2015-08-28 2015-08-28 Adeninové deriváty a jejich použití

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10774084B2 (cs)
EP (1) EP3341371B1 (cs)
CZ (1) CZ307722B6 (cs)
WO (1) WO2017036434A1 (cs)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ307868B6 (cs) * 2017-04-28 2019-07-10 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci Deriváty 9-(2-oxacykloalkyl)-9H-purin-2,6-diaminu, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použití
WO2022012702A1 (en) * 2020-07-13 2022-01-20 Univerzita Palackeho V Olomouci Nitrogen heterocyclic cytokinin derivatives, compositions containing these derivatives and use thereof
CZ2022227A3 (cs) * 2022-05-30 2023-12-13 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci Heterocyklické sloučeniny pro prevenci a terapii poruch cirkadiánního rytmu
CN116496277B (zh) * 2023-06-14 2023-08-25 齐泽(云南)生物科技有限公司 一种姜黄素2,6-二氨基嘌呤衍生化合物
CN116444522B (zh) * 2023-06-14 2023-08-25 齐泽(云南)生物科技有限公司 一种姜黄素腺嘌呤衍生化合物

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080009508A1 (en) 2006-07-10 2008-01-10 Lucie Szucova 6,9-Disubstituted Purine Derivatives And Their Use For Treating Skin
CZ300774B6 (cs) * 2007-10-05 2009-08-05 Univerzita Palackého Substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty pro použití jako antagonisté cytokininových receptoru a prípravky obsahující tyto slouceniny
US7960397B2 (en) 2007-12-28 2011-06-14 Institute Of Experimental Botany, Academy Of Sciences Of The Czech Republic 6,9-disubstituted purine derivatives and their use as cosmetics and cosmetic compositions

Also Published As

Publication number Publication date
EP3341371A1 (en) 2018-07-04
US20180298004A1 (en) 2018-10-18
US10774084B2 (en) 2020-09-15
WO2017036434A1 (en) 2017-03-09
CZ307722B6 (cs) 2019-03-27
EP3341371B1 (en) 2022-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100939147B1 (ko) Ｎ6-치환된 아데닌을 기본으로 한 헤테로시클릭 화합물,이들의 제조방법, 약물, 화장품 제제 및 성장조절제제조를 위한 이들의 용도, 이들 화합물을 함유하는약제학적 제제, 화장품 제제 및 성장조절제
CZ2015582A3 (cs) Adeninové deriváty a jejich použití
JP2005508386A6 (ja) Ｎ６−置換アデニンに基づく複素環状化合物およびその調製方法、ならびに、薬、化粧品、成長調節剤や、上記化合物を含む医薬品、化粧品、成長調節剤の調製のための使用
AU2002363362A1 (en) Heterocyclic compound based on N6-substituted adenine, methods of their preparation, their use for preparation of drugs, cosmetic preparations and growth regulators, pharmaceutical preparations, cosmetic preparations and growth regulators containing these compounds
AU2016233247A1 (en) Nicotinic acid riboside or nicotinamide riboside compositions, reduced derivatives thereof, and the use thereof
US10093675B2 (en) 6,8-disubstituted-9-(heterocyclyl)purines, compositions containing these derivatives and their use in cosmetic and medicinal applications
WO2012076109A2 (de) 2-pyrone
KR20130058926A (ko) 옥시레스베라트롤과 디오스신을 포함하는 피부미백용 조성물
CZ2017237A3 (cs) Deriváty 9-(2-oxacykloalkyl)-9H-purin-2,6-diaminu, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použití
KR102226673B1 (ko) 탄닌산 탄소양자점을 포함하는 피부광노화 개선 또는 치료용 조성물
KR20110054377A (ko) 니아신 또는 니아신아마이드를 도입시킨 아스코르빈산 유도체 및 이의 제조방법
KR20100052092A (ko) 피부미백용조성물
EP3229771B1 (en) 6-aryl-9-glycosylpurines and use thereof
JP5620657B2 (ja) 日焼け細胞形成抑制剤
KR102120619B1 (ko) 겐티스산을 유효성분으로 하는 피부 세포 재생용 조성물
JP3584397B2 (ja) リナカンツスナスツス抽出物を含有する育毛剤組成物
KR101882923B1 (ko) S-메틸메티오닌 설포늄의 유도체를 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부 손상 억제 및 피부 보호용 화장료 조성물
EP2794572A1 (fr) Derives d&#39;acridinedione pour le traitement des troubles de la pigmentation et du vieillissement cutane
KR20180068694A (ko) 신규 티오황산 유도체, 그 제조방법 및 그를 포함하는 화장료 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20230828