CZ302618B6 - Cyklobutan-1,1-dikarboxylátokomplexy platiny s deriváty N6-benzyladeninu, zpusoby jejich prípravy a použití techto komplexu jako léciv v protinádorové terapii - Google Patents

Abstract

Rešení se týká cyklobutan-1,1-dikarboxylátokomplexu platiny v oxidacním stupni +II a jejich krystalosolvátu zahrnujících strukturní motiv I nebo obecného vzorce II vyjádreného strukturním vzorcem [Pt(L).sub.2.n.(cbdc)] nebo obecného vzorce III vyjádreného strukturním vzorcem [Pt(L)(L')(cbdc)], kde (cbdc) je cyklobutan-1,1-dikarboxylátový dianion, kde symboly L a L' predstavují deriváty N6-benzyladeninu obecného vzorce IV vázaného na atom platiny základního motivu V pres libovolný atom dusíku adeninu nezávisle vybraný z atomu N1, N3, N6, N7 nebo N9, v závislosti na míre substituce molekul, a kde substituenty R1, R2, R3 a R4 mají specifický význam. Rešení se dále týká zpusobu prípravy uvedených komplexu, farmaceutických kompozic obsahujících tyto komplexy a jejich použití v lécbe nádorových onemocnení.

Description

Cyklobutan-l,l-dikarboxylátokomplexy platiny s deriváty Nó-benzyladeninu, způsoby jejich přípravy a použití těchto komplexů jako léčiv v protinádorové terapii

Oblast techniky

Předložený vynález, spadající do oblasti léčiv nádorových onemocnění na bázi platiny, se týká 5 platnatých cyklobutan-1,1-dikarboxylátokomplexů s deriváty Nó-benzyladeninu, jejich způsobu přípravy a jejich použití v lékařské praxi jako léčiv a farmaceutických kompozic, které tyto komplexy obsahují jako účinnou látku.

Dosavadní stav techniky io

Cisplatina (a), c/s-[Pt(NH₃)2Cl₂], cís-diamm-dichloroplatnatý komplex, je jedním z nejznámějších komplexů platiny používaných v boji proti rakovině (Rosenberg, B,; Camp, V. L.; Krigas, T. Nátuře 1965, 205, 698-699). Od roku 1978 se využívá při chemoterapii proti zhoubným nádorům varlat, vaječníků, plic, krku, hlavy, popřípadě jiným druhům nádorového onemocnění (Weiss, R.. B.; Christian, M. C. Drugs 1993, 46, 360-365). Vlastní chemoterapie se však neobejde bez vedlejších negativních účinků na organismus, jako jsou nefrotoxicita či ototoxicita. Tato omezení vedla k přípravě nových platnatých komplexů s cílem zvýšit účinnost a selektivitu léčivých přípravků a zároveň potlačit negativní účinky na organismus (Abrams M. J.; Murrer B. A. Science 1993, 261, 725-730). Mezi nej významnější takto objevené sloučeniny řadící se mezi tzv. léčiva druhé generace je možno zařadit například karboplatinu (b), [Pt(NH₃)₂(cbdc)], diammincyklobutan-l,l-dikarboxylátoplatnatý komplex, kde cbdc je cyklobutan-1,1-dikarboxylátový dianion. Jeho syntéza vychází z tetrachloroplatnatanu draselného, K^tPtCU], který se nechá reagovat s tetramolánum nadbytkem jodidu draselného, Kl, kde v první fázi vznikne tetrajodoplatnatan draselný, K₂[Ptl₄]. Působením NH4OH vznikne cu- diammin- dijodoplatnatý komplex, c/5-[Pt(NH₃)₂l2L který poskytne s dusičnanem stříbrným, AgNO₃, v poměru 1:2 ve vodě dobře rozpustný komplex dusičnan c/j-diammin-diaquaplatnatý, c/j-[Pt(NH₃)₂(H₂O)₂](NO₃)₂. Ten se pak ve vodném prostředí kyseliny cyklobutan-1,1-dikarboxylové transformuje na karboplatinu (b) (US 4 273 755 - Preparation of cis-diammin-diidoplatinum(II)). Je známa i modifikovaná možnost přípravy, která opět vychází z tetrachloroplatnatanu draselného s tetramolámím nadbytkem jodidu draselného, kde v první fázi vznikne tetrajodoplatnatan draselný. Působením NH4OH vznikne civ-diammin-dijodoplatnatý komplex, který poskytne s dusičnanem stříbrným v poměru 1:2 ve vodě dobře rozpustný komplex dusičnan civ-diammin-diaquaplatnatý, cis-[Pt(NH₃)₂(H₂O)₂] (NO₃)₂. Přidáním síranu stříbrného do tohoto vodného roztoku převedeme v temnu za 24 hodin kladně nabitou civ-diammin-diaquaplatnatou komplexní částici, c/5-[Pt(NH₃)₂(H2O)2]²’, na žlutý c/5-diammin- aqua-sulfátoplatnatý komplex, cís-[Pt(NH₃)2(H₂O)(SO₄)]. Ve vodném roztoku po přidání sodné soli kyseliny cyklobutan-1, 1-dikarboxylové vzniká karboplatina (b) (Ali, M. S.; Thurston, J. H.‘, Whitmire, K. H.; Khokhar, A R.. Polyhedron 2002, 21, 2659-2665).

Další možnost přípravy tohoto komplexu je reakce cisplatiny, efA-lPt(NI-h)₂Cl₂], která se po týdnu působení dusičnanem stříbrným ve vodném roztoku transformuje na dusičnan cZv-diammindiaquaplatnatý, Pt(NH3)₂(H₂O)₂](NO₃)₂. Substituce dusičnanového aniontu za hydroxylový je uskutečněna pomocí chromatografie na iontoměničích a vzniklý hydroxid cís-diammin5 diaquaplatnatý, cZs’-[Pt(NH3)₂(H₂O)₂j(OH)₂, vstupuje do reakce s kyselinou cyklobutan-1,Ιό ikarboxy lovou za vzniku karboplatiny (b) (Brunner, H; Meiterth, F.; Treittžnger, B. Chem. Ber. 1994. 127, 2141-2148). Molekulová a krystalová struktura je známa od roku 1980 (Neidle, S.; Ismail, /. M.; Sadler, P. J. J. Inorg. Bioch. 1980, 13, 205-212), detailnější popis molekulové a krystalové struktury je z roku 1985 (Beagley, B.; Cruickshank, D. W.J.: McAuliffe, C. A.; ío Pritchard, R. G.: Zaki, A. M.; Beddoes, R. L.; Cernik, R. J.; Mills, O. S. ,1. Mol. Str. 1985, 130. 97-102). Karboplatina (b) je účinná proti téměř stejným lidským nádorovým liniím jako cisplatina fa), a taktéž je podávána intravenózně (Hambley, T. W.; Dalton Trans. 2001, 120, 2711-2718). Na rozdíl od cisplatiny, se karboplatina vyznačuje výrazným snížením nežádoucích vedlejších efektů, především nižší toxicitou na organismus (Wilkinson, A. R.; Cox, P. J; Jones. i? M.; Harrap, K. R. Biochimie 1978, 60, 851-857). U karboplatiny bylo poprvé publikováno úspěšné stanovení in vivo cytotoxické aktivity proti rakovině varlat, plic (V79) a prsnímu tumoru (MTG-B) (vystupuje pod označením JM8)již v roce 1985 (Peckham, M. J.; Horwich, A.; Brada, M.; Drury, A.; Hendry, IT F. Canc. Treat. Rew. 1985, 12, 10l-l 10, Douple, Ε. B.; Richmond, R.. C.; ()'Hara, J. A.; Coughlin,C. T. Canc. Treat. Rew. 1985, 12, 111-124) a v současnosti jsou publikovány výsledky druhé fáze in vivo testování tohoto léčiva například v kombinaci s aplidinem (WO 2008/135793 - Combination of aplidine and carboplatin in anticancer treatments), paclitaxelem proti nádorům plic (WO 2008/081927 - Method for treating cancer using anticancer agent in combination, EP 1 942 884 — Methods of treating cancers with Saha, carboplatin and paclitaxel and other combination therapies) nebo nádoru vaječníků (Iura, A. ;

Katsumata, N.: Kouno, T; Shimizu, C.; Ando, M.; Fujiwara, Y. Int. J. Gynec. Obst. 2009, 105, 261-270, EP 2 076 259 - Methods of treating ovarian cancer).

Mezi další významná proti nádorová léčiva na bázi platnatých komplexů patří oxaliplatina (c), [IR^/č-TZ-diamin-eyklohexan-jV/Vj-fyxaláto-čZOy-platnatý komplex, poprvé syntetizovaný v roce 1978 (Kidani, Y; Inagaki, K.; ligo, M.; Hoshi, A.; Kure táni, K. J. Med. Chem. 1978, ío 21. 1315-1318, EP 2 029 615 - A process for the preparation of an oxaliplatin, EP 1 979 369

- Preparation of platinum(Il) complexes), jehož molekulová struktura byla vyřešena v roce 1984 (Bruck, M. A.; Bau, R.; Noji, M.; Inagaki, K.; Kidani, Y. Inorg. Chim. Acta 1984, 92, 279-284).

Používá se při léčbě rakoviny konečníku a u nádorových liniích rezistentních na cisplatinu (Tashiro, T; Kawada, Y.; Sakurai, Y.; Kidani, Y. Biomed. Pharmacother. 1989, 43, 251-260, 35 Kraker, A. J.; Moore, C. W, C ancer Res. 1988, 48, 9-13). Ve výčtu léčiv je třeba taktéž zmínit nedaplatinu, cZs-diammin-glykolátoplatnatý komplex (d), poprvé syntetizovanou v roce 1986 (Totani, Τ; Aono, K; Komura, M.; Adachi, Y; Chem. Lett. 1986, 3, 429-432), která se využívá např. při léčbě nádorů konečníku, plicního a srdečního karcinomu, nádorů hlavy a krku (Furuse, K.; Fukuota, M.; Ohshima, S, Proč. Am. Soc, Clin. Oncol. 1989, 8, 238-243,

4o Inuyama, Y.; Miyake, H; Horiuchi, M.; Hayasaki, K.; Komiyama, S.; Ohia, K. Jpn. J. Cancer

Chemother. 1992, /9, 863-869). Na rozdíl od cisplatiny byly v preklinických testech zjištěny nižší nežádoucí účinky na organismus (Kameyama, Y.; Okazaki, N; Nakagawa, M. ; Koshida, H; Nakamura, M.; Gamba, M. Toxicol. Lett. 1990, 52, 15-24).

Předložené a připravené komplexy je možno řadit mezi deriváty odvozené od karboplatiny (b), 45 [Pt(NH₃)₂(cbdc)], kde dva amino ligandy (NH₃) byly nahrazeny derivátem N6-benzyladeninu (L). Tato sloučenina (L) patří do skupiny přírodních rostlinných růstových regulátorů nazývaných cytokin i ny (Skoog, F; Hamzi, H Q.; Szweykowska, A. M.; Leopard, N. .1; Carraway, K. L.; Fujii, T; Helgeson, J. P.; Loeppky, R. N. Phytoehem. 1967, 6, 1169-1192), V obecné rovině je však možno konstatovat, že mnohé rozmanitě substituované deriváty purinu nebo adeninu mohou být připraveny i laboratorně (Mok, D. W. S.; Mok, M. C, Ann. Rev. Planí. Physiol. Plant. Mol.

Biol. 2001, 52, 89-118, Roelen, H.; Veldman, N; Spek, A. L.; Von Frijtag Drabhe Kunzel.J.;

Mathot, R. A. A.: Ijzerman, A.P.J. Med. Chem. 1996, 39, 1463-1471, Holmes, R. E.;

Robins, R. K. J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 3773-3779, Moravec, J.; Kryštof, V; Hanuš, J;

Havlíček, L.; Moravcová, D.; Fuksová, K.; Kuzma, M.; Lenobel, R.; Otyepka, M.; Strnad, M.

. 9

Bioorg. Med Chem. Letí. 2003, 13, 2993-2996). Vhodnou substitucí základního skeletu N6~benzyladeninu je možno získat velmi účinné inhibitory cyklin-dependentních kináz, tedy látek ovlivňujících buněčný cyklus (Brun, V.; Legraverend, M.; Grierson, D. S. Tetrahedr. Lett. 2001, 42, 8161-8164, Brun, V.; Legraverend, M.; Grierson, D. S. Tetrahedr. Lett. 2001, 42, s 8165-8167). Syntéza, charakterizace a především biologické, farmaceutické, popřípadě jiné využití těchto látek je možno najít v následujících českých spisech pod Čísly CZ 1999-273 Al (Substituované dusíkaté heterocyklické deriváty, způsob jejich přípravy, tyto deriváty pro použití jako léčiva, farmaceutická kompozice a kombinovaný farmaceutický přípravek tyto deriváty obsahující a použití těchto derivátů pro výrobu léčiv), CZ 294 535 (Heterocyklické sloučeniny na io bázi N6-substituovaného adeninu, způsoby jejich přípravy, jejich použití pro přípravu léčiv, kosmetických přípravků a růstových regulátorů, farmaceutické přípravky, kosmetické přípravky a růstové regulátory tyto sloučeniny obsahující), CZ 2002-2353 Al (Deriváty purinu, způsob jejich přípravy ajejich použití), CZ 294 538 (Substituční deriváty Nó-benzyladenosinu, způsob jejich přípravy, jejich použití pro přípravu léčiv, kosmetických přípravků a růstových regulátorů, farmaceutické přípravky, kosmetické přípravky a růstové regulátory tyto sloučeniny obsahující aCZ 2007-691 Al (Substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů a přípravky obsahující tyto sloučeniny). Dosud je vCambridgské strukturní databázi (CSD) uloženo 21 platnatých komplexů odvozených od karboplatiny obsahující základní motiv [Pt(La)₂(cbdc)] (a = 1 až 4), kde (cbdc) je cy klobutan-1,1 -d i karboxy 20 látový dianion a (La) representuje libovolný monodentátní ligand koordinovaný na centrální atom přes atom dusíku: Ll = hexamethylenimin (Ali, M. S.; Thurston, J. H; Whitmire, K. H.; Khokhar, A. R.; Polyhedron 2002, 21, 2659-2665), L2 = amínoethanol (Meelich, K.; Galanski,

M. ; Arion, V. B.; Keppler, Β. K. Eur. J. Inorg. Chem. 2006, 2476-2483), L3 - 2-methylpyridin (Ming-Jin, X.; Yao, Y.; Wei-Ping, L.; Shu-Qian, H ; Xizhu, C. Acta Crystallogr., Séct. E: Struct.

Rep. Online 2007, 63, 2728), L4 = ethy lamin (Rochon, F. D.; Grupa, L. M. Inorg Chim. Acta 2000, 306, 193-204) a základní motiv [Pt(LbXcbdc)], kde b - 5-22, cbdc je cyklobutan-1,1dikarboxylátový dianion a (L) representuje libovolný bídentální ligand koordinovaný na centrální atom přes dva atomy dusíku: L5 = ethy len- 1,2-diamin (Rochon, F. D.; Massarweh, G. Inorg. Chim. Acta 2006, 359, 4095-4104), L6 = butan-l,4-diamin (Alvarez-Valdes, A.; Perez, J, M.;

Lopez-Solera, 1.; Lannegrand, R.; Continente, J. M.; Amo-Ochoa, P.; Camazon, M. J.; Solans, X.; Font-Bardia, M.; Navarro-Ranninger, C, J. Med. Chem. 2002, 45, 1835-1844), L7 N, N,N^r,N',N,N' -hexakis(2-pyridyl)-l,3,5-tris(aminomethyl)benzen (Tu, C.; Lin,J; Shao, Y. Guo, Z. Inorg. Chem. 2003, 42, 5795-5797), L8 = 4,4~(bis(aminomethyl)tetrahydrofuran (Bitha,

P. ; Child, R. G.; Hlavka, J. J.; Lang, S. A.; Lin, Y.-I.; Haltiwanger, R. C; Pierpont. C. G. Inorg.

Chim. Acta 1988, 151, 89-93), L9 = 1,3-dihydroxy-2,2-bis(aminomethyl)propan (Bitha, P.;

Child, R. G.; Hlavka, J. A; Lang, S. A.: Lin, Y.-I.; Haltiwanger, R. C; Pierpont, C. G. Inorg, Chim. Acta 1988, 151, 89-93), L10 = bis(2-pyridyl)amín (Tu, C.; Wu, X.; Liu, Q.; Wang, X; Xu,

Q. ; Guo, Z. Inorg. Chim. Acta 2004, 357, 95-102), Ll i — zrans-(-)-<yklohexan- 1,2-diamin (Bitha, P.; Morton, G. O.; Dunne, T. S.; Santos, E. F. D.; Lin, Y.; Boone, S. R.; Haltiwanger, R.

C; Pierpont, C. G. Inorg Chem. 1990, 29, 645-652), L12 = bis(2-pyridyl)keton (Ferreira, A. D. Q.; Bino, A.; Gibbon, D. Inorg. Chim. Acta 1997, 265, 155-161), L13 = (3,6,9,12-tetraoxatetradekan-l,l4-diyl-2,2'-bipyridyl-3,3'-dikarboxylát (Yoo, J.; Sohn, Y. S.; Do, Y J. Inorg. Biochem. 1999, 73, 187-193), L14 = 2,3-bis(2-pyridyl)pyrazin (Ferreira, A. D. Q.; Bino, A.; Gibbon, D. Inorg Chim. Acta 1997, 265, 155-161), L15 = (5)-A-<2-aminopropyl)cyklohexyl45 amin (Lee, E. J; Jun, M. J.; Sohn, M. S. Bull. Korean Chem. Soc. 1999, 20, 1469—1474), L16 ~ l-methyl-2,3-diamino-2,3-dideoxy-L-xylopyranosid (Hanessian, S.; Wang, J. Canc. J. Chem.

1993, 71, 886-895), L17 = 2-morfolinoethy lamin (Chen, X; Xie, M.; Liu, M.; Ye, Q.; Yu, Y; Hou, S.; Gao, W; Liu, Y. Inorg. Chim. Acta 2007, 360, 2851-2856), L18 - (-H^-2-(aminomethyljpyrrolidin (Yonei, M.; Murata, H; Itoh, M.; Watanabe, Y; Ochi, K.; Honda, M.; Nawata,

Y. Acta Crystallogr., Séct. C: Cryst. Struct. Commun. 1990, 46, 137-138), L19 — propan-1.2diamin (Rochon, F. D.; Massarweh, G. Inorg. Chim. Acta 2006, 359, 4095-4104), L20 = 3aminohexahydroazepin (Lee, S. S.; Jun, M. J.; Jung, O.-S.; Sohn. Y. 5. Bull. Korean Chem. Soc.

1994, 15, 84-86), L21 = propan- 1,3-diamin-2-oI (Xie, M. J.; Chen, X. Z.; Liu, W. P.; Yu, K; Ye, Q. S.; Acta Crystallogr., Séct. E: Struct. Rep. Online 2007, 63, 1495-1497. Liu, W.: Chen, X.;

-3CZ 302618 B6

Xie, M.; Lou.L.; Ye, Q.; Yu, Y.; Hou, S.J. Inorg. Bioch. 2007, 102, 1942-1946), L22 = cyklohexan-1,4-diamin {Shamsudin, S.; Khokhar, A. R, J. Coord. Chem. /994, 33, 83-91).

Předložené platnaté komplexy odvozené od karboplatiny s deriváty Nó-benzyladeninu (L) navazují na již dříve publikované komplexy platiny obecného složení [Pt(L23)Cl(H₂O)₂], lPt(Lc)Cl₃] H₂O, (l.d)[PtCI₆], [Pt(Le)Cl₅l, c/A-[Pt(Ld)₂Cl₂]CI₂, t7A-[Pt(Lf)₂Cl₂>xH₂O a trans[Pt(Lg)₂Ch]-xH₂O, kde c = 23-24, d - 23-26, e = 23, 26-38, f = 23-26, 39-43, g -41-43, x = 13, L23 = 2-[(3-hydroxypropyl)amino]-6-(benzylamino)-9-isopropylpurin. L24 = 2-[(2hydroxyethyl)amino]-6-(benzylamino)-9-methylpurin, L25 - 2-(2-hydroxyethylamino)-6benzy lamino—9-isopropylpurin, L26 = 2-[(l -hydroxymethylpropyl)amino]-6-(benzylamino)-9io isopropylpurin, L27 - 6-(2-methoxybenzylamino)purin, L28 = 6-(3-methoxybenzylamino)purin, L29 - 6-(4-methoxybenzylamÍno)purin, L30 = 6-(2-hydroxybenzylamino)purin, L31 = 6-(3-hydroxybenzylamíno)purin, L32 = 6-(4-hydroxybenzylamino)purin, L33 = 6-(2-fluor benzylamino)purin, L34 = 6-(3-ťluorbenzylamino)purin, L35 - 6-(4-fluorbenzylamino)purin, L36 = 6-(2-chlorbenzylamino)purin, L37 = 6-(3-chlorbenzylamino)purin, L38 = 6-(4-chlor15 benzylamino)-9-isopropylpurin, L40 = 2-[(l-hydroxymethylisobutyl)amino]-6-(3-hydroxybenzylamino)-9-isopropylpurin, L41 = 2-chloro-6-(benzylamÍno)-9-isopropylpurin, L42 = 2chloro-6-(2-methoxybenzylamino)-9-isopropylpurin, L43 = 2-chloro-6-(4-methoxy benzy Iamino)-9—isopropylpurin (Szučová, L.; Trávníček, Z; Zatloukal, M.; Popa, 1. Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 479-491, Szučová, L.; Trávniček, Z.; Popa, I.; Marek, J. Polyhedron 2008, 27,

2710-2720, Trávníček Z.; Popa, I.; Cajan, M.; Herchel, R.; Marek, J. Polyhedron 2007, 26,

5271-5282, Trávniček, Z.; Maloň, M.; Zatloukal, M.; Doležal, K.; Strnad, M.; Maek, J. J. Inorg. Bioch. 2003, 94, 307-316, Maloň M.; Trávníček, Z.: Marek, R.; Strnad, M. J. Inorg, Bioch. 2005, 99, 2127-2138), u kterých kromě fyzikálně-chemické charakterizace byla studována i in vitro cytotoxická aktivita na některých lidských nádorových liniích (K-562 = lidská erytroleukemie,

MCF7 = lidský prsní adenokarcinom, HOS = lidský osteosarkom, G-361 = lidská chronická myelogenní leukemie). Některé z výše zmíněných komplexů byly v in vitro testech aktivnější, než zmíněná kancerostatika cisplatina, oxaliplatina nebo karhoplatina.

Podstata vynálezu

Cyklobutan-l,1-d i karboxy látokomplexy platiny v oxidačním stupni +11 ajejich krystalosolváty zahrnující strukturní motiv I nebo obecného vzorce II vyjádřeného strukturním vzorcem |Pt(L)₂(cbdc)] nebo obecného vzorce III vyjádřeného strukturním vzorcem [Pt(L)(L')(cbdc)], kde symboly L a L' představují deriváty N6-benzy laděn inu obecného vzorce IV vázaného na atom platiny základního motivu V

Pt

O· (V)

-4CZ 302618 B6 přes libovolný atom dusíku adeninu nezávisle vybraný z atomů Nl, N3, N6, N7 nebo N9, v závislosti na míře substituce molekul, kde jsou substituenty Rl, R2 a R3 nezávisle vybrány ze skupiny:

atom vodíku, halogen, alkyl, substituovaný alkyl, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkynyl, 5 substituovaný alkynyl, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, cykloheteroalkyl, substituovaný cykloheteroalkyl, cykloalkenyl, substituovaný cykloalkenyl, cykloheteroalkyl, substituovaný cykloheteroalkenyl, funkční skupina a N-R'R skupina, v níž R' a R” nezávisle na sobě symbolizují atom vodíku, alkyl, substituovaný alkyl, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkynyl, substituovaný alkynyl, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, cykloheteroalkyl, io substituovaný cykloheteroalkyl, cykloalkenyl, substituovaný cykloalkenyl, cykloheteroalkenyl, substituovaný cykloheteroalkenyl, kde termín:

halogen představuje atom fluoru, bromu, chloru, nebo jodu,

- alkyl jako takový nebo jako součást jiné skupiny představuje rozvětvený nebo nerozvětvený uhlovodíkový řetězec z 1 až 18 atomů uhlíku,

- alkenyl jako takový nebo jako součást jiné skupiny představuje rozvětvený nebo nerozvětvený uhlovodíkový řetězec z 2 až 18 atomů uhlíku, obsahující alespoň jednu dvojnou vazbu mezi atomy uhlíku,

- alkynyl jako takový nebo jako součást jiné skupiny představuje rozvětvený nebo nerozvětvený uhlovodíkový řetězec z 2 až 18 atomů uhlíku obsahující alespoň jednu trojnou vazbu mezi atomy uhlíku,

- cykloalkyl jako takový nebo jako součást jiné skupiny představuje cyklický uhlovodík ze 3 až 12 atomů uhlíku, a to včetně kondenzovaných cyklů nezávisle vybraných ze skupiny cykloalkyl, cykloheteroalkyl, cykloalkenyl, cykloheteroalkenyl,

- cykloheteroalkyl jako takový nebo jako součást jiné skupiny představuje cykloalkyl s alespoň jedním atomem uhlíku zaměněným za heteroatom ze skupiny dusík, kyslík, nebo síra,

- cykloalkenyl jako takový nebo jako součást jiné skupiny představuje cykloalkyl obsahující alespoň jednu dvojnou vazbu mezi atomy uhlíku,

- cykloheteroalkenyl jako takový nebo jako součást jiné skupiny představuje cykloheteroalkyl obsahující alespoň 45 jednu dvojnou vazbu mezi dvěma atomy uhlíku, atomem uhlíku a heteroatomem, nebo dvěma heteroatomy,

- funkční skupina jako taková nebo jako součást jiné skupiny představuje amino, alkylamino, dialkylamino, 50 alkenylamíno, cykloalkylamino, cykloheteroalkylamino, cykloalkenylamino, cykloheteroalkenylamino, hydroxy, alkyl hydroxy, alkoxy, kyano, karboxy, alkylkarboxy, karboxyalkyl, hydroxyamino, nitro, amido, nitroso, sulfonyl, sulftnyl, sutfamido, thio, alkylthio, merkapto, karbamoyl,

- 5 C7. 302618 B6

- substituovaný alkyl, substituovaný alkenyl, substituovaný alkynyl, substituovaný cykloalkyl, substituovaný cykloheteroalkyl, substituovaný cykloalkenyl, substituovaný cykloheteroalkenyl, jako takové nebo jako součásti jiných skupin představují alkyl, alkenyl, alkynyl, cykloalkyl, cykloheteroalkyl, cykloalkenyl, cykloheteroalkenyl substituované substítuenty z množiny halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cykloalkyl, cykloheteroalkyl, cykloalkenyl, cykloheteroalkenyl a funkční skupina.

io Další podstatou vynálezu jsou krystalosolváty platnatých cyklobutan-l,]-dikarboxylátokomplexů, kde u sloučenin obecného složení [Pt(L)₂(cbdc)j · xSolv nebo [Pt(L)(L')(cbdc)] · xSolv udává (x) počet krystalových molekul 1 až 6, a (Solv), je konkrétní molekula použitého rozpouštědla a/nebo některá z reakčních komponent vybraná ze skupiny voda, primární alkohol, sekundární alkohol, aceton, N,N'-dimethylformamid (DMF), dimethyl sulfoxid (DMSO), chloroform, i? dichlormethan, acetonitril nebo diethylether, a to buď samostatně, nebo v kombinaci uvedených solvátových molekul.

Ve výhodném provedení se pak sloučenina obecného vzorce II nebo III připraví tak, že nejdříve spolu reagují dva molární ekvivalenty derivátu N6—benzyladeninu rozpuštěného při teplotě 40 až

80 °C v minimálním množství rozpouštědla ze skupiny primárních nebo sekundárních alkoholů nebo acetonu, sjedním molárním ekvivalentem sloučeniny M₂[DMSO)₂(cbcd)], rozpuštěné v minimálním množství studené vody. Poté se reakční směs míchá po dobu dvou až Čtyř dnů při teplotě 50 až 95 °C, a následně je vzniklý produkt odfiltrován, promyt použitými rozpouštědly a vysušen (Schéma 1).

Rovněž je podstatou vynálezu použití platnatých cyklobutan-1,1 dikarboxylátokompicxú jako výchozích sloučenin pro přípravu analogicky substituovaných komplexů platiny v oxidačním stupni +IV.

so Nedílnou podstatou vynálezu je farmakologický prostředek obsahující terapeuticky účinné množství platnatých cyklobutan-1, l-dikarboxylátokomplexů a nebo farmaceutickou kompozici platnatých cyklobutan-1,1-dikarboxylátokomplexů sjedním či více přijatelných nosičů a pomocných látek pro použití v lékařství pro výrobu léčiv pro léčbu nádorových onemocnění.

V dalším jsou nové sloučeniny obecného vzorce 11 nebo III a způsob jejich přípravy a použití osvětleny na konkrétních příkladech, které mají pouze ilustrační charakter a nijak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně určen definici patentových nároků.

io Přehled obrázků na připojených výkresech

Konkrétní příklady provedení vynálezu jsou doloženy připojenými výkresy, kde

- obr. 1 je ^l3C NMR spektrum bis(2-chloro-6-(3,4—dichlor)benzylamino-9-ísopropylpurÍno)45 cyklobutan-1,1-dikarboxylátoplatnatého komplexu, [Pt(L₂)₂(cbcd)], s interpretací jednotlivých atomu uhlíku, které byly identifikovány pomocí ⁿC, ATP, 'H-^bC gs-HMQC a gs-HMBC experimentů.

-obr. 2 je FT IR spektrum bis(2-chloro—6—(2-fluor—6—bromjbenzylamino—9—isopropylpurino)— cyklobutan-1,1-dikarboxylátoplatnatého komplexu [Pt(L|)₂(cbdc)], v oblasti 400-W00 cm' s přirazením maxim charakteristických pro jednotlivé atomové skupiny.

- obr. 3 je FT IR spektrum bis(2-chloro-6-(2-ťIuor-6-brom)benzylamÍno-9-isopropylpurino)~ cyklobutan-l,]-dikarboxylátoplatnatého komplexu fPt(Li)₂(cbdc)], v oblasti 150-400 cm^-1 s při55 razením maxim charakteristických pro vibrace Pt-N a Pt-O.

-6CZ 302618 B6

- obr, 4 je Ramanovo spektrum bis(2~{3-hydroxypropylamino)-6-benzylamino-9-Ísopropylpurino)-cyklobutan-l, 1-dikarboxylátoplatnatého komplexu, [Pt(L₈)₃(cbdc)] v oblasti 1504000 cm’¹ a přiřazení maxim charakteristických pro vybrané atomové skupiny,

- obr. 5 představuje molekulovou strukturu hydrátu 2-chloro-6-{2~methoxy)benzylamino-9isopropy lpurino)-(dimethylsulfoxid-X)-<yklobutan-1, 1-dikarboxylátoplatnatého komplexu, [Pt(DMSO)(L₇)(cbdc)] · H₂O, vyřešenou pomocí monokrystalové rentgenové strukturní analýzy. Všechny nevodíkové atomy byly znázorněny formou teplotních elipsoidů s 50% pravděpodobni ností. Vodíkové atomy nebyly pro přehlednost zobrazeny.

Příklady provedení vynálezu i? V následující části je vynález doložen, nikoli však limitován, konkrétními příklady jeho uskutečnění. Rozsah vynálezu je pak jednoznačně limitován patentovými nároky.

V příkladech 1, 2 a 3 pak může být derivát L' z chemického a strukturního hlediska vzhledem k derivátu L:

a) chemicky a strukturně totožný jako je L, vázaný na atom platiny základního motivu V přes totožný atom dusíku N(6)-benzyladeninu, jako je tomu u L;

b) chemicky a strukturně totožný jakoje L, vázaný na atom platiny základního motivu V přes odlišný atom dusíku N(6)-benzyladeninu, jako je tomu u L;

c) chemicky a strukturně odlišný derivát N(6)-benzyladeninu, než je L, vázaný na atom platiny základního motivu V přes jakýkoliv z atomů dusíku derivátu N(6)-benzyladeninu.

3o Vynález dále využívá sloučenin t*w-[Pt(DMSO)2CI₂] a [Pt(DMSO)₂(cbdc)], kde cbdc je dianion kyseliny cyklobutan-1,1-dikarboxylové, jako meziproduktů pro přípravu cyklobutan-1,1-dikarboxylátokomplexů platiny obecného vzorce II nebo III, které se připraví reakcí chloridu platnatého, PtCI₂, v prostředí dimethylsulfoxidu (DMSO), kdy vzniká při zvýšené teplotě komplex o složení cí$-[Pt(DMSO)2Cl·] (Rochon, F. D.; Massanveh, G. inorg. Chim. Acta 2006,

359, 4095-4104, Price, J. H: Williamson, A. N.; Schramm, R. F; Wayland, Β. B. Inorg. Chem.

1972, 11, 1280-1284). Po nutné purifikaci je meziprodukt rozpuštěn a je k němu přidáno ekvimolámí množství kyseliny cyklobutan-l,l-dikarboxylové, respektive její sodné, draselné nebo stříbrné soli. Reakční směs je poté míchána v temnu a za sníženého teploty po několik dnů. Poté se vyloučí komplex o složení [Pt(DMSO)₂(cbdc)] (viz Schéma 1). Podrobný popis přípravy uve40 děného meziproduktu je uveden v následující literatuře (Bitha, P.; Morton, G. O.; Dunne, T. S.: Santos, E. F. D.; Lin, Y; Boone, S. R.: Haltiwanger, R. C.; Pierpoint, C. G. Inorg. Chem. 1990, 29, 645-652).

-7 CZ 302618 B6

Schéma 1.

V níže uvedených příkladech byly připravené látky charakterizovány následujícími fyzikálně-chemickými metodami:

- elementární analýza s procentovým zastoupením prvků C, H aN,

- měření molární vodivosti roztoků komplexů v DMF,

- infračervená spektroskopie (FT IR), kde oblast 400 až 4000 cm'¹ provedena technikou KBr tablet a oblast 150 až 600 cm ¹ provedena Nujolovou technikou, nukleární magnetická rezonance (NMR) - 'H, ^t3C, ^l9íPt, 'H-'H gs-COSY, 'H-¹^ gs-HMQC, ^lH-'³C gs-HMBC a ‘H-^I5N gs-HMBC experimenty, io - monokrystalová rentgenová strukturní analýza.

Vynález využívá bisídimethylsulfoxid-ACVy-cyklobutan-lJ-dikarboxyláto-Q O-platnatý komplex, [Pt(DMSO)₂(cbdc)], jako výchozí platnatou sloučeninu. Uvedená sůl není komerčně dostupná, lze ji však připravit postupem uvedeným v dostupné literatuře (Bitka, P.; Morton, G. O.;

Dunne, T. S.; Santos, E. F. D.; Lin, Y; Boone, S, R.; Haltrwanger, R. C.; Pierpoint, C. G. ínorg. Chem. 1990, 29, 645-652, Schéma 2). Procentové zastoupení prvků C, Η, N ve formě: vypočtená hodnota (v závorce nalezená hodnota) pro PtS₂O₆C_J0H|₈: C, 24,3 (23,9); H, 3,7 (3,9)%. IR (vNujol/cm'): 326, 378, 471. IR (vKBr/cm j; 2924, 1663, 1613, 1353, 1160, 1130.

-8CZ 302618 B6

PtCL

DMSO

DMSO

DMSO'

DMSO^ _o pí ' --- ^P1 \ ^C1 R = H, Na, K, Ag DMSO ° ,CI

R₂cbdc

O

O

Schéma 2

Příklad 1: Příprava bis(2-chlor-ó~{3,4-dichlorbenzylamino-9-isopropylpurino)-cyklobutan1,1-dikarboxylátoplatnatého komplexu, [Pt(L₂)₂(cbdc)].

v 15 ml destilované vody bylo za laboratorní teploty rozpuštěno 0,1 g (0,2 mmol) [Pt(DMSO)₂(cbdc)], připraveného dle (Bitha, P.; Morton, G. O.; Dunne, T. S.; Santos, E. F. D.;

Lin, Y; Boone, S. R.; Haltiwanger, R. C.; Pierpoint, C. G. Inorg. Chem. 1990, 29, 645-652). Do vzniklého roztoku byl přidán roztok 0,148 (0,4 mmol) 2-chíoro-6-(3,4-dichtorbenzylamino~9io isopropylpurinu (L₂) ve 20 ml isopropanolu. Směs byla míchána po dobu dvou dnů při teplotě °C, až vznikl světle šedý produkt, který byl odfiltrován, promyt studenou destilovanou vodou a vysušen v exsikátoru nad silikagelem (Schéma 3).

DMSO^

DMSO^

Procentové zastoupení prvků C, Η, N ve formě: vypočtená hodnota (v závorce nalezená hodnota) pro PtC,6H,₄N₁₍,O4Cl6: C, 40,1 (39,8); H, 3,1 (3,1); N, 13,0 (13,2)%. IR (v_Nuj0,/cnr'): 421 (m, Pt-O), 563, (vs, Pt-N). IR (vKBr/cm¹,: 1169 (m, C-CI), 1323 (vs, COO), 1586 (m, COO), 1633 (vs, C=N), 2980 (m, C-H), 34,24 (w, N-H). Raman (vKBr/cm'): 261 (w, Pt-N), 479 (w, Pt-O), 890 (m, C-H), 1339 (vs, N-H), 1586 (s, C=N), 2942 (s, C-H₂), 3064 (s, C-H). 'HNMR (DMF-í/7, tetramethylsilan-SiMe,, ppm); δ 9,44 (ζ IH, 6,4, N6H), 9,32 (s, IH. C8H), 7,68 (d, IH, 1,8, C11H), 7,58 (dd, IH, 8,4, 1,8, CI4H), 7,53 (d, IH, 8,4, C15H), 4,96 (d, 2H, 6,2, C9H), 4,84 (sep, IH, 6,8, C16H), 2,90 (m, 2H, C22H\ C23H), 2,80 (q, IH, 7,7, C24H’), 1,67 (m, 2H, C22H^b, C23H^b), l,47(m, IH, C24H^h). ^IJC NMR (DMF-í/7, SiMe₄, ppm): δ 177,61 (C19, C20), 155,17 (C6), 153,9 (C2), 150,3 (CE4), 143,86 (C8), 140,94 (CIO), 132,08 (C12), 131,14 (C15), I3O,6O(C13), 130,04 (Cil), 128,54 (C14), 116,71 (C5), 56,79 (C21), 49,84 (C16), 44,15 (C9), 31,41 (C22, C23), 22,10 (Cl7, Cl8), 15,83 (C24). ”N NMR (DMF-í/7, ppm); δ 232,7 (NI), 225,3 (N3), 185,2 (N9), 129,3 (N7), 96,3 (N6). ^l,5Pt NMR (DMF-í/7. K,PtCl₄, ppm): δ - 1622,45.

Příklad 2: Příprava bis[2—chlor—6—(2-fluoro-6_bromo)benzylamino-9_isopropyIpurino)~ cyklobutan-Ll-dikarboxylátoplatnatého komplexu, [Pt(L_t)₂(cbdc)].

-9CZ 302618 B6

V 15 ml destilované vody bylo za laboratorní teploty rozpuštěno 0,1 g (0,2 mmol) [Pt(DMSO)₂(ebdc)] a do vzniklého roztoku byl přidán roztok 0,16 g (0,4 mmol) 2-chloro-6-(2-fluor-6— brom)benzylamino-9-isopropylpurinu (L|) ve 20 ml isopropanolu. Směs byla míchána po dobu dvou dnů při teplotě 90 °C, až vznikl světle šedý produkt, který byl odfiltrován, promyt studenou destilovanou vodou a vysušen v exsikátoru nad silikagelem (Schéma 4). Na základě CHN chemické analýzy, infračervené (střední a vzdálená oblast), Ramanovy a 'H, ^,3C a ^,95Pt NMR spektroskopie bylo potvrzeno složení komplexu.

DMSO.

DMSO'

io Procentové zastoupení prvků C, Η, N ve formě: vypočtená hodnota (v závorce nalezená hodnota) pro PtC3₆Hj4Nio04CI₂F2Br₂: C, 38,1 (37,7); H, 3,0 (2,8); N, 12,3 (12,6)%. IR (v_NllJO,/cm ‘): 432 (w, Pt-O), 554 (m, Pt-N). IR (vKBr/cm '): 1171 (m, C Clý 1322 (s, COO), 1586 (m, COO), 1621 (s, ON), 2980 (w, C-H), 3427 (s, N-H). Raman (vKBr/cm '): 262 (w, Pt-N), 478 (w, Pt-O), 887 (m, C-H), 1339 (vs, C-0), 1586 (s, C=N), 2942 (s, C-H?), 3064 (s, C-H).

'H NMR (DM0/7, tetramethylsilan-SiMe₄, ppm); δ 9,38 (t, 1H, 6,4, N6H), 9,08 (s, IH, C8H), 7,59 (s, IH, C15H), 7,49 (d, IH, 8,4, C13H), 7,32 (d, IH, 7,7, C12H), 4,96 (d, 2H, 6,0, C9H), 4,87 (sep, IH, 6,7, C16H), 2,86 (m, 2H, C22H^a, C23H^a), 1,80 (m, IH, C24H^a), 1,67 (m, 2H, C22H^b, C23H^b), 1,63 (d, 6H, 6,8, C17H, C18H), 1,57 (m, IH, C24H^b). ^I3C NMR (DMF-e/7, SiMe₄, ppm): δ 177,41 (C19, C20), 155,27 (C6), 153,75 (C2), 150,07 (C4), 143,98 (C8), 141,94 (CIO), 132,28 (Cil), 130,84 (Cl4), 130,60 (02), 129,74 (03), 128,84 (05), 116,51 (C5), 56,82 (C21), 49,86 (06), 44,35 (C9), 31,41 (C22, C23), 22,14 (07, 08), 15,86 (C24). ^l9iPt NMR(DMF-t/7, K?PtCI₄, ppm); δ - 1626,23.

Příklad 3: Příprava bis(2-(3-hydroxypropylamino)-6-benzylamino-9-isopropylpurino)-cyklobutan-l,l-dikarboxylátoplatnatého komplexu, [Pt(L₈)?(cbdc)].

V 15 ml destilované vody bylo za laboratorní teploty rozpuštěno 0,1 g (0,2 mmol) [Pt(DMSO)₂(cbdc)] a do vzniklého roztoku byl přidán roztok 0,136 g (0,4 mmol) 2-(3-hydroxypropylamino)--6-benzy lam i no-9-i sopropy Ipur inu (U) ve 20 ml ethylacetátu. Směs byla míchána po dobu dvou dnů při teplotě 90 °C, až vznikl světle šedý produkt, který byl odfiltrován, promyt studenou destilovanou vodou a vysušen v exsikátoru nad silikagelem (Schéma 5). Na základě CHN chemické analýzy, infračervené (střední a vzdálená oblast), Ramanovy a 'H, ^l3C a ^l95Pt NMR spektroskopie bylo potvrzeno složení komplexu.

DMSO.

DMSC'

- 10CZ 302618 B6

Procentové zastoupení prvků C, Η, N ve formě: vypočtená hodnota (v závorce nalezená hodnota) pro PtC₄₂H₅₄N_I2O₆: C, 49,6 (49,9); H, 5,3 (5,3); N, 16,5 (16,1)%. IR (νΝφ/cm’¹): 449 (w, Pt-O), 557 (m, Pt-N). IR (vKBr/cm’¹): 1346 (s, COO), 1551 (m, COO), 1621 (s, C=N), 2970 (w, C-H).

Raman (vKBr/cnf'): 253 (w, Pt-N), 477 (w, Pt-O), 814 (m, C-H), 1328 (vs, C-O), 1611 (s, C-N), 2938 (s, C-H₂), 3057 (s, C-H). *H NMR (DMF-J7. tetramethylsilan-SiMe₄, ppm): δ 8,74 (s, IH, C8H), 8,66 (bs, IH, N6H), 7,51 (dd, 2H, 7,3, 1,5, C11H, C15H), 7,27 (tt, 2H, 7,3, 1,5, C12H, C14H), 7,20 (dd, IH, 7,3, 1,5 C13H), 6,72 (t, IH, 6,2, N2H), 4,74 (d, 2H, 6,0, C9H), 4,72 (sep, IH, 6,8, C16H), 4,49 (bs, 1H, 021H), 3,59 (t, 2H, 6,2, C21H), 3,42 (q, 2H, 6,2, C19H), io 2,89 (t, 2H, 8,2, C24H), 1,77 (t, 2H, 8,2, C25H), 1,75 (t, 2H, 6,4, C20H), 1,54 (d, 6H, 6,8, C17H, C18H). ⁿC NMR (DMF-t/7, SiMe4, ppm): δ 177,70 (C19, C20), 160,58 (C2), 153,53 (C6), 151,01 (C4), 140,62 (ClO), 139,17 (C8), 128,82 (C12, 14), 128,30 (Cil, 15), 127,21 (C13), 111,45 (C5), 60,17 (C21), 56,73 (C23), 48,30 (Cl6), 44,62 (C9), 39,45 (Cl9), 33,45 (C20), 31,38 (C24,25), 22,06 (Cl7, C18), 15,85 (C26). ^l95PtNMR (DMF-J7, K2PtCI₄, ppm): -1611.

is Příklad 4: Příprava dimethylsulfoxido-(2-chlor-6-(2-methoxy)benzylamino-9-isopropylpurino)-cyklobutan-l,l-dikarboxylátoplatnatého komplexu, [Pt(DMSO)(L₇Xcbdc)].

V 15 ml destilované vody bylo za laboratorní teploty rozpuštěno 0,1 g (0,2 mmol) [Pt(DMSO)₂(cbdc)] a do vzniklého roztoku byl přidán roztok 0,08 g (0,2Q mmol) 2-chloro-6-(2-methoxy)benzylamino-9-isopropylpurinu ve 20 ml isopropanolu. Směs byla míchána po dobu dvou dnů při laboratorní teplotě (Schéma 6). Vzniklý šedý produkt byl odfiltrován, promyt studenou destilovanou vodou a vysušen v exsikátoru nad silikagelem. Z filtrátu byly stáním a volným odpařováním získány bezbarvé krystaly a pomocí monokrystalové rentgenostrukturní analýzy byla vyřešena molekulová a krystalová struktura komplexu [Pt(DMSOXL₇)(cbdc)] H₂O. Molekulová struktura byla určena na přístroji Oxford Xcalibur diffractometer s detektorem CrysAlis CCD (Oxford Diffiaction, 2002), redukce dat a určení mřížkových parametrů bylo provedeno pomocí CrysAlis RED (Oxford Diffraction, 2002), molekulová struktura byla řešena přímou metodou programem SHELXS97 (Sheldrick, G. M. SHELXS 97, Acta Cryst. A 1990, 46, 467), a další výpočty byly provedeny programem SHELXL97 (Sheldrick, G. M. SHELXL 97, Program for Crystal Structure Refinement, University of Góttingen, Góttingen, Germany, 1997). Jako software pro zobrazení molekulové struktury byl použit program Diamond (Brandenburg, K. DIAMOND, Release 3.1f Crystal Impact GbR, Bonn, Germany, 2006).

Příklad 5: In vitro cytotoxická aktivita nových derivátů karboplatiny [Pt(L, ₆)₂(cbdc)] (1-6) 35 s ligandy odvozenými od 2-chIoro-6~/?-benzylamino-9-isopropylpurinu (R = 2fluor-6-brom L|, 3,4-dichlor L₂, 3-brom L₃, 2-trifluormethyl L₄, 3-trifluormethyl L₅,

4-trifluormethyl L₆).

Jedním z parametrů používaných jako základ pro stanovení in vitro cytotoxicity je metabolická 40 aktivita životaschopných buněk. Například mikrotitrační analýza, kde se používá Calcein AM, je dnes rozšířena jako metoda kvantifikace buněčné proliferace a cytotoxicity. Tento test je využíván v programech pro screening léků a pro testy chemosensitivity. Testem se rozpoznají pouze

C7. 302618 B6 životaschopné buňky. Množství zredukovaného Calceinu AM odpovídá počtu životaschopných buněk v kultuře.

Pro rutinní screening sloučenin a stanovení in vitro cytotoxické aktivity byly vybrány buněčné linie prsního karcinomu MCF-7) a buňky lidské erythroleukemie K562. Buňky byly udržovány v Nunc/Coming 80 cm² plastikových lahvích a pěstovány v mediu pro buněčné kultury (DMEM obsahující 5 g/l glukózy, 2mM glutaminu, lOOU/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 10% fetálního telecího séra a hydrogenuhličitan sodný), komplexy byly připraveny podle postupu popsaného v této patentové přihlášce.

II)

Buněčné suspenze byly připraveny a naředěny podle typu buněk a podle očekávané konečné hustoty buněk (1000 buněk na jamku na základě charakteristik buněčného růstu), pipetovalo se 80 μΙ na buněčné suspenze na 96-jamkové mikrotitrační destičky. Inokuláty byly stabilizovány 24hod inovou preinkubací při 37 °C v atmosféře CO₂.

Jednotlivé koncentrace testovaných látek byly přidány v čase nula jako 20μ1 alikvotní podíl do jamek mikrotitračních destiček. Obvykle se sloučeniny ředily do šesti koncentrací v čtyřnásobné ředící řadě. Pri rutinním testování byla nejvyšší koncentrace v jamce 25 μΜ, změny této koncentrace závisí na dané látce. Všechny koncentrace byly testovány v dubletu. Inkubace buněk

2o s testovanými deriváty trvala 72 hodin pri 37 °C, 100% vlhkosti a v atmosféře CO₂. Na konci inkubační periody byly buňky analyzovány po přidání roztoku Calceinu AM (Molecular Probes) a inkubace probíhala další 1 hodinu. Fluorescence (FD) byla měřena pomocí Labsystem FIA readeru Fluoroskan Ascent (Microsystems). Přežití nádorových buněk (The tumor cell survivalTCS) bylo spočítáno podle následujícího vztahu: IC₅₀=(FD_jamka /FD_{kontrolnl jamka}) x 100 %.

Získaná hodnota IC₅o odpovídá koncentraci látky, kdy je usmrceno 50 % nádorových buněk.

Ke stanovení in vitro cytotoxicity připravených sloučenin vůči lidské nádorové linii HOS (osteosarkom) byl také použit MTT test. Metoda je založena na schopnosti metabolicky aktivních buněk redukovat žlutou sůl 3-(4,5^dimethylthiazol 2-yl)-2,5-difěnyltetrazolium bromid (MTT) za vzniku modrého formazanového barviva. Jelikož k této přeměně dochází pouze v živých buňkách, lze tímto způsobem stanovit cytotoxicitu různých chemických látek. V rámci buňky jsou za redukci zodpovědné mitochondriální dehydrogenázy. Vznikající formazanové barvivo je nerozpustné a je následně kvantifikováno po rozpuštění v DMSO s amoniakem za použití klasického spektrofotometru (ELISA reader).

Výsledky stanovení in vitro cytotoxicity za využití AM a MTT testů vyjádřené pomocí hodnoty IC₅o pro komplexy o složení [Pt(Li_₆)₂(cbdc)] (1-6) s ligandy odvozenými od 2-chloro-ó-Kbenzy lam i no-9-i sopropy Ipuri nu (R- 2-fluoro-6-bromo L|, 3,4-dichloro L₂, 3-bromo L₃, 2-trifluormethyl, L₄, 3-trifluoromethyl L₅, 4~trifluoromethyl L₆) jsou uvedeny v tabulce I, když látky byly testovány in vitro na 3 lidských nádorových liniích, a to MCE-7 prsní karcinom, K562 erythroleukemie, HOS osteosarkom. Hodnoty IC₅o byly pro karboplatinu nalezeny v (Carland, Μ.; Tan, K. J.; White, Λ/.; Stephenson, J.; Murray, V; Denny, FE A.: McFadyen, FE. D. J. Inorg. Ploch. 2005, 99, 1738-! 743)^{V' a (Ghezzi, A. R; Aceto, M.; Cassino, C.; Gabano, E.; Osedla, D. J. Inorg. Bioch. 2004, 98, 73-78)^{~\

- 12CZ 302618 B6

komplex	MCF-7 j AM-test ί	MCF-7 MTT test	K562 AM test	HOS MTT test
1	|9,5 Π	15,1±6,8	9,0 !	17ř4±2,0
2	!	13,6±5,2	4,3	14,8±2,1
3	: 5,o :	22,1+14,0	6,8	>50
: 4	9,2	25,1±9,3	9,0	>50
js	14.1	38,9±3,Q	21,0	>50
: 6	7.5	, 19,0±6,6	19,2	>50
! cisplatina	11 Í	19,6±4,3 _	5	34,2±6,4
karboplatina	| 60ιυ	>1	250(2)	>1

Tab.1

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY io

   1. Cyklobutan-lJ-dikarboxylátokomplexy platiny v oxidačním stupni +11 ajejich krystalosolváty zahrnující strukturní motiv I nebo obecného vzorce II vyjádřeného strukturním vzorcem [Pt(L)₂(cbdc)] nebo obecného vzorce III vyjádřeného strukturním vzorcem [Pt(L)(L')(cbdc)], kde (cbdc) je cy klobutan-l,l-d i karboxy látový dianion, kde symboly Lať představují i? deriváty Nó-benzy laděn inu obecného vzorce IV vázaného na atom platiny základního motivu

   V

   - 13 CZ 302618 B6

   R1 %-^R4

   R3

   Pt (V) (IV) přes libovolný atom dusíku adeninu nezávisle vybraný z atomů Nl, N3, N6, N7 nebo N9, v závislosti na míře substituce molekul, kde jsou

   - substituenty Rl, R2 R3 a R4 nezávisle vybrány ze skupiny:

   atom vodíku, halogen, alkyl, substituovaný alkyl, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkynyl, substituovaný alkynyl, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, cykloheteroalkyl, substituovaný cykloheteroalkyl, cykloalkenyl, substituovaný cykloalkenyl, cykloheteroalkyl, substituovaný cykloheteroalkenyl, funkční skupina N-RR”, v níž R' a R nezávisle na sobě symbolizují atom vodíku, alkyl, substituovaný alkyl, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkynyl, substituovaný alkynyl, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, cykloheteroalkyl, substituovaný cykloheteroalkyl, cykloalkenyl, substituovaný cykloalkenyl, cykloheteroalkenyl, substituovaný cykloheteroalkenyl a funkční skupinu, kde termín:

   - halogen představuje atom fluoru, bromu, chloru, nebo jodu,

   - alkyl jako takový nebo jako součást jiné skupiny představuje rozvětvený nebo nerozvětvený uhlovodíkový řetězec z I až 18 atomů uhlíku,

   - alkenyl jako takový nebo jako součást jiné skupiny představuje rozvětvený nebo nerozvětvený uhlovodíkový řetězec z 2 až 18 atomy uhlíku obsahující alespoň jednu dvojnou vazbu mezi atomy uhlíku,

   - alkynyl jako takový nebo jako součást jiné skupiny představuje rozvětvený nebo nerozvětvený uhlovodíkový řetězec z 2 až 18 atomů uhlíku obsahující alespoň jednu trojnou vazbu mezi atomy uhlíku,

   - cykloalkyl jako takový nebo jako součást jiné skupiny představuje cyklický uhlovodík ze 3 až 12 atomů uhlíku, a to včetně kondenzovaných cyklů nezávisle vybraných ze skupiny cykloalkyl, cykloheteroalkyl, cykloalkenyl, cykloheteroalkenyl,

   -14CZ 302618 B6 cykloheteroalkyl jako takový nebo jako součást jiné skupiny představuje cykloalkyl s alespoň jedním atomem uhlíku zaměněným za heteroatom ze skupiny dusík, kyslík, nebo síra,

   - cykloalkenyl jako takový nebo jako součást jiné skupiny představuje cykloalkyl obsahující alespoň jednu dvojnou vazbu mezi atomy uhlíku,

   10 - cykloheteroalkenyl jako takový nebo jako součást jiné skupiny představuje cykloheteroalkyl obsahující alespoň jednu dvojnou vazbu mezi dvěma atomy uhlíku, atomem uhlíku a heteroatomem, nebo dvěma heteroatomy,

   15 - funkční skupina jako taková nebo jako součást jiné skupiny představuje amino, alky lamino, dialky lamino, alkeny lamino, cykloalkyl amino, cykloheteroalky lamino, cykloalkeny lamino, cykloheteroalkenylamino, hydroxy, alkylhydroxy, alkoxy, kyano, karboxy, alkylkarboxy, karboxyalkyl, hydroxyamino, nitro, amido, nitroso, sulfonyl, sulfinyl, sulfamido, thio, alkylthio, merkapto,

   20 karbamoyl, substituovaný alkyl, substituovaný alkenyl, substituovaný alkynyl, substituovaný cykloalkyl, substituovaný cykloheteroalkyl, substituovaný cykloalkenyl, substituovaný cykloheteroalkenyl, jako takové nebo jako součásti jiných skupin představují alkyl, alkenyl, alkynyl, cykloalkyl, cykloheteroalkyl, cykloalkenyl, cykloheteroalkenyl substituované substituenty z množiny halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cykloalkyl, cykloheteroalkyl, cykloalkenyl, cykloheteroalkenyl a funkční skupina.
2. 2. Kry stal osol váty platnatých cyklobutan-1,1-dikarboxy látokomplexů podle nároku 1, kde u sloučenin obecného složení [Pt(L)₂(cbdc)] · xSolv nebo [Pt(L)(L'Xcbdc)] · xSolv udává (x) počet krystalových molekul 1 až 6, a (Solv) je konkrétní molekula použitého rozpouštědla a/nebo některá z reakčních komponent vybraná ze skupiny voda, primární alkohol, sekundární alkohol,

   35 aceton, N,N'-dimethylformamid, dimethylsulfoxid, chloroform, dichlormethan, acetonitril nebo diethylether, a to buď samostatně nebo v kombinaci uvedených solvátových molekul.
3. 3. Způsob přípravy platnatých cyklobutan-1,1-dikarboxy látokomplexů podle nároku 1, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce II nebo III se připraví reakcí

   40 bis(dimethylsulfoxid)-cyklobutan-l,l-dikarboxylátoplatnatého komplexu o vzorci [Pt(DMSO)₂(cbdc)] s derivátem N6-benzy laděn inu.
4. 4 Způsob přípravy platnatých cyklobutan-l, 1 -dikarboxylátokomplexů podle nároku 3, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce Π nebo III se připraví tak, že

   45 nejdříve spolu reagují dva molámí ekvivalenty derivátu N6-benzyladeninu rozpuštěného pří teplotě 40 až 80 °C v minimálním množství rozpouštědla ze skupiny primárních nebo sekundárních alkoholů nebo acetonu, s jedním molámím ekvivalentem sloučeniny [Pt(DMSO)2(cbdc)], rozpuštěné v minimálním množství studené vody, poté se reakční směs míchá po dobu dvou až čtyř dnů při teplotě 50 až 95 °C, a následně je vzniklý produkt odfiltrován, promyt horkými použitými

   50 rozpouštědly a vysušen.
5. 5. Použití platnatých cyklobutan-l, 1-dikarboxylátokomplexů podle nároku 1 jako výchozích sloučenin pro přípravu analogicky substituovaných komplexů platiny v oxidačním stupni +IV.

   - 15 CZ 302618 B6
6. 6. harmakologický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství platnatých cyklobutan-l, 1-díkarboxylátokomplexů podle nároku 1 nebo farmaceutickou kompozici platnatých cyklobutan-l, 1-dikarboxylátokomplexů podle nároku 1 sjedním či

   5 více přijatelných nosičů a pomocných látek,
7. 7. Farmako logický prostředek podle nároku 6 pro použití v lékařství.
8. 8. Použití farmaceutického nebo farmakologického prostředku podle nároku 6 pro výrobu léčiv to pro léčbu nádorových onemocnění.