CZ2007453A3 - Substituované 6-anilinopurinové deriváty jako inhibitory cytokinin oxidasy a prípravky obsahující tyto slouceniny - Google Patents

Substituované 6-anilinopurinové deriváty jako inhibitory cytokinin oxidasy a prípravky obsahující tyto slouceniny Download PDF

Info

Publication number
CZ2007453A3
CZ2007453A3 CZ20070453A CZ2007453A CZ2007453A3 CZ 2007453 A3 CZ2007453 A3 CZ 2007453A3 CZ 20070453 A CZ20070453 A CZ 20070453A CZ 2007453 A CZ2007453 A CZ 2007453A CZ 2007453 A3 CZ2007453 A3 CZ 2007453A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
amino
chloro
thio
fluoro
bromo
Prior art date
Application number
CZ20070453A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ302225B6 (cs
Inventor
Spíchal@Lukáš
Gemrotová@Markéta
Zatloukal@Marek
Frébortová@Jitka
Galuzska@Petr
Werner@Tomas
Schmülling@Thomas
Doležal@Karel
Strnad@Miroslav
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Freie Universität Berlin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Palackého v Olomouci, Freie Universität Berlin filed Critical Univerzita Palackého v Olomouci
Priority to CZ20070453A priority Critical patent/CZ302225B6/cs
Priority to ES08773244T priority patent/ES2431926T3/es
Priority to JP2010513636A priority patent/JP5539866B2/ja
Priority to AU2008271800A priority patent/AU2008271800B2/en
Priority to EP08773244.2A priority patent/EP2173173B1/en
Priority to PL08773244T priority patent/PL2173173T3/pl
Priority to BRPI0812865A priority patent/BRPI0812865B8/pt
Priority to US12/666,189 priority patent/US8222260B2/en
Priority to NZ582642A priority patent/NZ582642A/en
Priority to CA2691625A priority patent/CA2691625C/en
Priority to DK08773244.2T priority patent/DK2173173T3/da
Priority to PT87732442T priority patent/PT2173173E/pt
Priority to PCT/CZ2008/000074 priority patent/WO2009003428A2/en
Publication of CZ2007453A3 publication Critical patent/CZ2007453A3/cs
Publication of CZ302225B6 publication Critical patent/CZ302225B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/16—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two nitrogen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/26—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with an oxygen, sulphur, or nitrogen atom directly attached in position 2 or 6, but not in both
    • C07D473/32—Nitrogen atom
    • C07D473/34—Nitrogen atom attached in position 6, e.g. adenine

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Vynález se týká substituovaných 6-anilinopurinových derivátu obecného vzorce I pro použití jako inhibitoru cytokinin oxidasy, ve kterých R znamená 1 až 5 substituentu nezávisle vybraných ze skupiny zahrnující vodík, halogen, hydroxyl, amino, alkylosy a alkylovou skupinu a R2 znamená amino, halogen,nitro, thio, alkylthio nebo alkylovou skupinu. Vynález se týká rovnež prípravku obsahujících tyto slouceniny.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká substituovaných 6-anilinopurinových derivátů, jejich použití jako inhibitorů cytokinin oxidasy a přípravků obsahujících tyto sloučeniny.
Dosavadní stav techniky
V posledních letech jsou 6-substituované aminopuriny považovány za látky se značným biochemickým významem. Některé látky tohoto typu stimulují růst rostlin a jsou řazeny do skupiny růstových regulátorů označovaných cytokininy (Letham, Ann. Rev. Plant. Physiol. 18, 349, 1967). První objevenou molekulou s cytokininovou aktivitou je kinetin (N6furfuryladenin), který byl původně izolován z autoklávované DNA spermatu sledě (Miller et al. 1955, J. Am. Chem. Soc. 77:1392). Cytokininy blízce příbuzné kinetinu také tvoří modifikované báze RNA (Skoog et al., Science 154:1354, 1966). V tRNA pro serin a tyrosin kvasinek, rostlin a živočichů sousedí cytokininy přímo s antikodonem. Některé N6substituované adenosiny scytokinovou aktivitou inhibují růst savčích buněčných kultur (Grace et al., Proc.Am.Assoc.Cancer Res. 8:23,1967),
Cytokininy jsou významné rostlinné hormony regulující mnoho aspektů vývoje rostlin. Současné studie na transgenních rostlinách s pozměněným cytokininovým metabolismem nebo signalingem odhalily zajímavé důsledky cytokininové defcience, či narušení percepce cytokininů (Werner et al, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 98:10487, 2001, Werner et al, Plant Cell 15:2532, 2003; Riefler et al., Plant Celí 18:40, 2006). Modulace hladiny cytokininů jejich exogenní aplikací nebo genetickou regulací endogenních hladin pomocí cytokinin oxidasy/dehydrogenasy (CK.X, EC 1.5.99.12), klíčového enzymu degradace cytokininů, již ukázaly své potenciální využití v zemědělství. Exogenní aplikace cytokininů vedla například ke zkrácení období předcházejícímu době kvetení u rajčete (Sawhney and Shukla, Am J Bot 81:1640, 1994), nebo k reverzi samčí sterility u ječmene (Ahokas, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:7605, 1992). Specifická exprese CKX v prašníku a pylu kukuřice byla prezentována jako účinný nástroj k navození samčí sterility pro produkci hybridů u tradičně nesnadno hybridizovatelných plodin (Huang et al., 2003). Současná práce •
také přinesla poznatky o účasti CKX na regulaci produkce zrn u rýže (Ashikari et al., Science 309:741,2005).
V současné době jsme objevili nové generace CKX inhibitorů založené na 2substituovaných 6-anilinopurinech. Mezi nejslibnější substituenty, ve smyslu přípravy specifických CKX inhibitorů, patří 2-chlor, 2-fluor and 2-amino skupiny.
Předmětem tohoto vynálezu jsou cytokininová analoga mající vylepšenou selektivitu a index účinnosti inhibice cytokinin oxidasy, tzn. jsou méně toxické, avšak účinnější, než dříve známá analoga.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce
a jejich farmaceuticky využitelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, ve kterých
R znamená 1 až 5 substituentů nezávisle vybraných ze skupiny zahrnující vodík, halogen, hydroxyl, amino, alkyloxy a alkylovou skupinu,
R2 je vybráno ze skupiny zahrnující amino, halogen, nitro, thio, alkylthio a alkylovou skupinu, pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy.
Výše uvedené dosud nevymezené generické skupiny máji významy uvedené v následující legendě, přičemž amino znamená skupinu -NH2, • · · • ·♦· halogen znamená atom halogenu vybraný ze skupiny zahrnující atom fluoru, atom bromu, atom chloru a atom jodu, nitro znamená skupinu -NO2, thio znamená skupinu -SH, alkyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, hydroxy znamená skupinu -OH, alkyloxy znamená skupinu -OR, ve které R je alkyl, přičemž uvedené generické substituentové skupiny mají významy, které jsou identické s definicemi odpovídajících skupin uvedenými v této legendě, alkylthio znamená skupinu -SR, ve které R je alkyl, přičemž uvedené generické substituentové skupiny mají významy, které jsou identické s definicemi odpovídajících skupin uvedenými v této legendě.
Výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce I ze skupiny zahrnující: 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-ó-anilinopurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-chloroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-chloroanilmo)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-chloroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-fluoroamlino)purin, 2-(chIoro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-fluoroaniIino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-fluoroanilino)purin, 2-( chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio)-6-{2-bromoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-bromoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-bromoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-ó-(2-ethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, inethyl)-ó-(3-ethoxyaniIino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-ethoxyanilino)purín, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-aminoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, • · mcthylthio, mcíhyl)-6-(3-aminoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyI)-6-(4-aminoanilino)purin, 2-(chIoro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-methylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-methy]anilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-methylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-hydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-hydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-hydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,3-difluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6'(2,4-dífiuoroanilíno)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,3,4-trifluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,4,5-trifluoroanilino)purín, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,3-dichloroanilino)purin, 2-(ehloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)'6-(2,4-díchloroanilino)purin,2-(chIoro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(2.4-dimethoxyanilino)purin, 2-(cbIoro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(2,3-dimethoxyanilino)purin, 2(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethy 1)-6-(3,4dimethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6(2,5-dimethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(3,4,5-trímcthoxyanilino)purin, 2-(amino, chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(2,4,6-trimethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,3-dimethylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(2,4-dimethylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3,4-dimcthylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(3,5-dimethylanilino)purin, 2(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(2,3dihydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6(2,4-dihydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,5-dihydroxyanilino)purm, 2-(amino, chloro, íluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3,5-dihydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyI)-6-(3-hydroxy-2-melhylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-hydroxy-4-methylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-hydroxy-5-methyIanilino)purin, • · « · · t · « · · · • «
2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-hydroxy-2methoxyaniiinojpurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, melhyI)-6-(3hydroxy’4-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-hydroxy-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-hydroxy-5-methoxyanilino)purin, 2-(cbloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-hydroxy’3,5-dimethoxyanilino)purin, 2-(amino, chloro, fluoro, hydroxy, thio, methylthio, methyl)-6-(2-chloro-4-methoxyanilino)purin, 2(amino, chloro, fluoro, bromo, nitro, thio, methylthio, methyl)-ó-(2-chloro-5methoxyanílinojpurin, 2-(amino, chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-chloro-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-bromo-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-{2-methoxy-3-chloroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(2-nielhoxy-4-chloroanilino)purin, a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy.
Mimořádně výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou substituované 6anilinopurinové deriváty zahrnující:
2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-methoxyanilino)purin, 2-(chioro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyI)-6-(2-hydroxy-3methoxyanilinojpurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2chloro-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-bromo-3-methoxyanilino)purin, 2-(chIoro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(4-hydroxyanilinojpurin, a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy.
• · »
I · ♦ , · *··· ·
Vynález, rovněž zahrnuje farmaceutické, kosmetické a růstovč-regulační přípravky obsahující alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I či sůl takovéto sloučeniny s alkalickým kovem, amoniakem či aminem ve formě racemátu nebo opticky aktivního ísomeru, nebo jeho adiční soli s kyselinou, včetně pomocných látek.
Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaného ó-anilinopurinovcho derivátu obecného vzorce I nebo jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami pro přípravu přípravku pro použití pro inhibici cytokinin oxidasy.
Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-anilinopurínových derivátů obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy, zejména pro zvýšení výnosu a kvality zemědělských produktů.
Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-anílinopurinových derivátů obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy v tkáňových kulturách ke stimulaci proliferace a morfogeneze.
Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce 1 jako inhibitorů cytokinin oxidasy pro zpomalení seneseenee buněk rostlin, živočichů, mikroorganismů, kvasinek a hub.
Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy pro zpomalení seneseenee savčích pokožkových buněk, například fibroblastů a keratinocytů.
Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I pro výrobu přípravků používaných ke klonování rostlinných í savčích zárodečných buněk a embryí, s výhodou oocytů.
• · • · · • · · ·· · « · » · * · * *
Předmětem vynálezu je konečně použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy na potlačení imunostímulace například arthritis nebo při supresi rcjekce transplantovaných orgánů u savců.
Předmětem vynálezu je konečně použití substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy při produkci užitkových rostlin, s výhodou u obilovin (pšenice, ječmen, rýže, kukuřice, žito, oves, čirok a další druhy), řep (cukrová a krmná řepa); malvic, peckovic a bobulovin (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, jahody, maliny a ostružiny); vikvovitých rostlin (bob, Čočka, hrách, sója); olejnin (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokos, Ricinus, kakaový bob, podzemnice olejna); lilkovitých rostlin (dýně, okurky, melouny); přadných rostlin (bavlna, len, konopí, juta); citrusů (pomeranče, citrony, grapefruity, mandarinky); zeleniny (špenát, skořice, kafr) nebo rostlin jakými jsou tabák, ořešák, baklažán, cukrová třtina, čajovník, réva vinná, chmel, banány a přírodní kaučukovníkové a léčivé rostliny stejně tak jako okrasné rostliny. Plodiny zahrnují ty, které poskytují toleranci vůči třídám růstových faktorů konvenčním křížením nebo metodami genetického inženýrství. Plevely, jejichž růst může být kontrolován zahrnují jak jednoděložné tak dvoudčložné druhy, například SteJlaria, Nasturtium, Agrosťts, Digitaria, A véna, Setaria, Sinapis, Lolium, Solárium, Echinochloa, Scirpus, Monochoria, Sagittaria, Bromus, Alopecurus, Sorghum halepense, Rottboellia, Cyperus, Abutilon, Sida, Xanbthium, Amaranthus, Chenopodium, Ipomoena, Chrysanthemum, Galium, Viola and Veronica.
Sloučeniny obecného vzorce 1 jsou používány v nemodifikované formě, nebo s výhodou společně s pomocnými látkami běžně využívanými v přípravcích. Jsou přednostně používány koncentráty aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze a disperze, ředěné emulze, rozpustné prášky, prach, granuláty, krémy, gely, olejové suspenze a rovněž enkapsulované produkty, např polymemí substance. Ve vztahu ktypu přípravku je určena i metoda aplikace, například spejování, atomizace, poprach, rozptyl, nátěr a polévání, která je zvolena ve vztahu k předurčenému použití a převažujících okolnostech. Přípravky mohou být sterilizovány anebo obsahují další přídavné látky neutrální povahy, například konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, hnojivá, či donory mikrohnojiv nebo další přípravky za účelem získání speciálních účinků.
Sloučenina obecného vzorce I může být smíchána s dalšími růstovými regulátory za účelem dosažení synergického účinku.
Přípravky
Přípravky obsahující sloučeniny obecného vzorce I (aktivní látky), a pokud je třeba, jednu nebo více pevných nebo kapalných pomocných látek, jsou připraveny známými způsoby, například smísením nebo mletím účinné látky s pomocnými látkami, jako jsou např. rozpouštědla nebo pevné nosiče. Do přípravků mohou být přidávány povrchově aktivní látky (surfaktanty).
V závislosti na povaze sloučeniny obecného vzorce I, která má být formulována, vhodné povrchově aktivní látky jsou neiontové, kationtové a/nebo aniontové povrchově aktivní látky a jejich směsi mající dobré emulzifikační, dispergační a zvlhčovači vlastnosti.
Příklady vhodných anionlových, neiontových a kationtových smáčedel jsou shrnuty například ve WO 97/34485.
Pro přípravu formulací obsahujících inhibitory cytokinin oxidasy na bázi substituovaných 6-anilinopurinových derivátů jsou podle toho vynálezu používána smácedla konvecně používaná při přípravě technologií přípravků, která jsou popsána, např. v McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual MC Publishing Corp., Ridgewood New Jersey, 1981, Stache, H., Tensid- Taschenbuch, Carl Hanser Verlag, MunichNienna, 1981 and M. and J. Ash, Encyclopedia of Surfactants, Voll-lll, Chemical Publishing Co., New York, 1980-81.
Formulace přípravku s inhibitorem cytokinin oxidasy obsahuje váhově od 0,1 do 95% aktivní látky, přičemž obsahují od 5 do 99,9% směsi přísad či farmaceutických nosičů a to v závislosti na způsobech aplikace a obsahují váhově i od 0,1 do 25% smácedla.
Ačkoliv jsou komerční produkty obvyklé připravovány ve formě koncentrátů, konečný uživatel upotřebí naředěný přípravek. Kompozice může proto obsahovat i další přísady, jakými jsou stabilizátory, např. rostlinné oleje nebo epoxidizované rostlinné oleje (epoxidizovaný palmový olej 0;l, řepkový nebo olivový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo emulgátory, viskozitní činidla, pojivá, lepidla, a také hnojivá a další aktivní přísady. S výhodou jsou využívány přípravky následujícího složení: (% = hmotnostní procento)
Emulgované koncentráty:
směs aktivní přísady: smáčedlo: kapalný nosič:
Prášky:
směs aktivní přísady: pevný nosič:
Suspenzní koncentráty:
směs aktivní přísady: voda:
smáčedlo:
Smáčivé prášky: směs aktivní přísady: smáčedlo: pevný nosič:
Granule:
směs aktivní přísady: pevný nosič:
až 90 %, s výhodou 5 až 20 % až 30 %, s výhodou 10 až 20 % až 94 %, s výhodou 70 až 85 %
0,1 až 10 %, s výhodou 0,1 až 5 %
99,9 až 90 %, s výhodou 99,9 až 95 až 75 %, s výhodou 10 až 50 % 94 až 24 %, s výhodou 88 až 30 % až 40 %, s výhodou 2 až 30 %
0,5 až 90 %, s výhodou 1 až 80 % 0,5 až 20 %, s výhodou 1 až 15 % až. 95 %, s výhodou 15 až 90 %
0,1 až 30 %, s výhodou 0,1 až 15 %
99,9 až 70 %, s výhodou 99,9 až 85
Kompozice mohou rovněž obsahovat další příměsi, jakými jsou stabilizátory, například vegetativní oleje nebo epoxidizované vegetativní oleje (epoxidisovaný kokosový olej, řepkový olej nebo sojový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační látky, regulátory viskozity, pojivá, zahušťovadla, a také hnojivá a další aktivní látky. Pro použití sloučenin obecného vzorce 1, nebo kompozic je obsahujících, při ochraně rostlin před škodlivým vlivem růstových regulátorů se používají rozdílné metody a technologie, kterými jsou například následující:
i) Obalování osiva « ··«· * • ·
a) Obalování osiva smáčivou práškovou formulací sloučeniny obecného vzorce I, a to mícháním v nádobě až do stejnorodé distribuce na povrchu semen (suché obalování). Při takové proceduře je přibližně 1 až 500 g sloučeniny obecného vzorce I (4 g až 2 kg smáčivého prášku) používáno na 100 kg osiva.
b) Obalování osiva emulzifikovaným koncentrátem sloučeniny obecného vzorce I v souladu s metodou a) (mokré obalování).
c) Obalování osiva cestou máčení semen po dobu 1 až 72 h v tekutině obsahující od 100 do 1000 ppm sloučeniny obecného vzorce I, a s výhodou následného usušení semen (imerzní obalování).
Obalování semen nebo ošetření klíčících semen jsou upřednostňovanou metodou aplikace, protože ošetření aktivní látkou je určeno cílovou plodinou. Obecně jsou antidota používána od 1 do 1000 g, s výhodou od 5 do 250 g, na 100 kg semen, avšak v závislosti na metodice, která rovněž umožňuje přidání dalších aktivních látek nebo mikroživin; určené koncentrační limity se mohou pohybovat nahoru nebo dolů (opakované obalování).
ii) Aplikace cisternové směsi
Kapalná formulace směsi růstového regulátoru a antidota je používána ve váhovém poměru jednoho k druhému od 10:1 do 1 :100, rychlost aplikace růstového regulátoru od 0,005 do 5,0 kg na hektar. Taková cisternová aplikace směsi se provádí před anebo po setí.
iii) Aplikace do semenné brázdy
Sloučenina obecného vzorce I je zavedena do otevřené brázdy oseté semenem ve formě emulzifikovaného koncentrátu, smáčivého prášku nebo granulí. Jakmile je semenná brázda zaklopena, je růstový regulátor aplikován cestou obvykle používanou při preemergentním procesu.
iv) Kontrolované uvolňování aktivních látek
Sloučeniny obecného vzorce l jsou aplikovány v roztoku k minerálním granulovaným nosičům nebo polymerizováným granulím (močovina, formaldehyd) a jsou vysušeny. V případě, že je to žádoucí, tak se provádí obalování, které umožňuje postupné uvolňování látky v měřitelných množstvích po určitou specifickou periodu (obalované granule).
Kosmetické kompozice obsahují od přibližně 0,05% (w/w) do 10% (w/w) aktivní látky, s výhodou od 0,1 % (w/w) do 2 % (w/w). Kosmetické kompozice jsou ve formě krému, • · aerosolu, pleťové vody, roztoků, náplasti, obkladu, šampónu, rtěnky, pasty, krému, tinktury, spreje, atd.
Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70%, ale přednostně 20 až 50% vody nebo vodné fáze. Tukovou fázi tvoří uhlovodíky, například vazelína, parafínový olej nebo tvrdé parafíny, které přednostně obsahují vhodné hydroxysloučeniny jako mastné alkoholy a jejich estery, například cetyl alkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin pro zlepšení kapacity pro vázání vody. Emulgátory jsou odpovídající lipofilní sloučeniny jako sorbitanové estery mastných kyselin (Spaný), s výhodou sorbitan oleát nebo sorbitan isostearát. Aditiva k vodné fázi jsou například smáčedla jako polyalkoholy, například glycerol, propylen glykol, sorbitol a polyethylenglykol, nebo konzervační prostředky či příjemně vonící látky.
Mastné masti jsou nevodné a obsahují jako bázi hlavně uhlovodíky, například parafín, vazelínu nebo parafínový olej, a dále přírodní nebo semisyntetické tuky, například hydrogenovanc kokosové triglyceridy mastných kyselin nebo hydrogenované oleje, například hydrogenovaný ricínový olej nebo olej zpodzemnice olejně, a dále částečné glycerolové estery mastných kyselin, například glycerol mono- a distearát. Dále obsahují například mastné alkoholy, emulgátory a aditiva zmíněná v souvislosti s mastmi, která zvyšují příjem vody.
Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50% vody. Používané olejové báze jsou mastné alkoholy, například isopropyl myristát, lanolin, včelí vosk, nebo uhlovodíky, s výhodou vazelína (petrolátum) a parafínový olej. Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, například estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethylenoxy adukty, například polyglycerických mastných kyselin nebo polyethylen sorbitanové estery či kyselé estery polyglycerických mastných kyselin (Tween), dále polyoxyethylenové etery mastných alkoholů nebo polyoxyethylenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátory, jako alkalické soli sulfátů mastných alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, cetylsulfát sodný nebo stearylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetyl stearyl alkoholu nebo slearyl alkoholu. Aditiva k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrání krémy před vyschnutím, například polyalkoholy jako glycerol, sorbitol, propylenglykol a polyethylenglykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonící látky.
« · « · « · • · · • ·*·
Pasty jsou krémy nebo masti obsahující práškové složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, například oxidy titanu nebo oxid zinečnatý, a dále talek či silikáty hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci.
Olejové suspense obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8-22, s výhodou pak 12-22 uhlíkových atomů, například kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, například kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antioxidantů, například vitaminu E, β-karotenu nebo 3,5-di-íerf-butyl-4hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá více než 6 uhlíkových atomů a je mono- nebo polyhydrická, například mono-, dí- nebo trihydrícké alkoholy jako metanol, etanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich isomery, ale hlavně glykol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou například ethyl oleát, isopropyl myristát, isopropyl palmitát, „Labrafil M 2375“ (polyoxyethylen glycerol trioleát, Gattefoseé, Paříž), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složený z glyceridů a esterů polyethylenglykolu; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylenglykolu; Gattefoseé, Paříž), „Miglyol 812“ (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce Cs až C12 od Húls AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sezamový olej, sójový olej a olej z podzemnicc olejně.
Pěny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako chlor-fluor nižší alkany, např. dichlorfluormethan a dichlortctraíluorethan, nebo přednostně nehalogenované plynné uhlovodíky, vzduch, N2O či oxid uhličitý. Používané olejové fáze jsou stejné jako pro masti a také jsou používána aditiva tam zmíněná.
Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-etanolíckou bázi, ke které jsou přimíchána zvlhěovadla pro snížení odpařování jako jsou polyalkoholy, například glycerol, glykoly a polyethylenglykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethylenglykolů, tj. lípofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže etanolem, a pokud je to nutné, i ostatní neutrální látky a aditiva.
Seznam vyobrazení
Obr, 1 ukazuje obnovení přirozeného fenotypu po systematické aplikaci látky 12 na CKX nadprodukující rostliny. + znamená ošetřeno, - neošetřeno.
Obr. 2 ukazuje srovnání účinku cytokininu a CKX inhibitoru na obnovení přirozeného fenotypu AtCKXl semenáčků Arabidopsis. (A) AtCKXl, (B) AtCKXl kultivované na 0,1 μΜ látce 12, (C) AtCKXl kultivované na 0,1 μΜ BAP, (D) kontrolní rostlina s přirozeným fenotypem.
Obr. 3 znázorňuje účinek látky 12 na kvetení rostlin Arabidopsis.
Obr. 4 znázorňuje vliv 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino) purinu na adherenci buněk Hodnoty uvedeny relativně vzhledem ke kontrole.
Obr. 5 znázorňuje vliv 2-chlor-ó-(4-hydroxyanilino)purinu na viabilitu buněk po 3 dnech. Hodnoty uvedeny relativně vzhledem ke kontrole.
Obr. 6 znázorňuje růstovou křivku lidských diploidních fibroblastů BJ ovlivněných 2-chIor-6-(4hydroxyanilinojpurinem
Obr. 7 ukazuje počet buněk po 7 a 14 denním působení 2-chlor-6-(4-hydroxyanÍlino)purinu. Hodnoty uvedeny relativně vzhledem ke kontrole.
Příklady provedení vynálezu
Výchozím materiálem pro přípravu sloučenin obecného vzorce 1 je 2,6-chlorpurin. Dalším výchozím materiálem je 2-amino-6-chlorpurin nebo 2-fluor-6-chlorpurin, který je možné buď připravit z 2-amino-6-chIorpurinu reakcí s kyselinou tetrafluoroboritou v přítomnosti vodného roztoku dusičnanu sodného (Beach et al., 1992). Další výchozí materiál, 2-brom-6-chlorpurin, je možné připravit z 2-amino-6-chlorpurinu diazotací s tbutyl nitritem a následnou bromací za přítomnosti vhodného donoru bromu (Kím Hak Sung et al.; J.Med.Chem.46; 23; 2003; 4974-4987). Další výchozí materiál může být ještě 2methyl-6-chlorpurin, který je možné připravit z 6-chlor-2-jodpurinu Střílovým cross couplingem (Kim et al., 2003). Dalším výchozím materiálem může ještě být 2-nitro-6-chlor9-Boc-purin, který je možné připravit z 6-chlorpurinu (Rodenko et al.; J .Am. Chem .Soc. 2005,127,5957-5963).
Výchozí substituované fenylaminy, které nebyly komerčně dostupné (ostatní získány od Sigma Aldrich nebo Fluorochem), byly připraveny zodpovídajících aldehydů v přítomnosti katalyzátoru. Ty, které mají více hydroxy skupin, mohou být s výhodou připraveny demctylací odpovídajících methoxyderivátů 48% HBr v N2 atmosféře.
Elementární analýzy (C, H a N) byly měřeny na EA1108 CHN analyzátoru (Fissons Instruments). Na zjišťování bodu tání byl použit přístroj BŮCHI Melting Point B-540. Analytická tcnkovrstvá chromatografie (TLC) byla prováděna na destičkách silikagelu 60 WF254 (Merck), v mobilní fázi CHClgMEOITkone. NII4OH (8:2:0,2, v/v/v). ES+ hmotová spektra byla naměřena za použití přímého nástřiku na Waters ZMD 2000 hmotovém spektrometru. Hmotnostní interval při měření byl 10 - 1500 amu. Spektra byla měřena za použití cyklických skenů o délce 3,0 sekundy, při napětí na vstupní štěrbině 25 V a teplotě vypařovacího bloku 150 °C, desolvatační teplotě 80 °C a průtoku desolvatačního plynu 200 I/hodinu. Získaná data byla zpracována pomocí programu MassLynx data systém. NMR spektra byla měřena na přístrojí Bruker Avance AV 300 při teplotě 300 K a frekvenci 300,3 MHz ('Η) respektive 75,48 MHz (13C), Vzorky byly připraveny rozpuštěním daných látek v DMSO-d6. Tetramethylsilan (TMS) byl použit jako interní standard.
Příklad 1
2-Chlor-6-anilinopurin
Anilin (4,66 g; 0,05 mol) byl přidán do suspenze 2,6-dichlorpurinu (5,67 g; 0,03 mol) v npropanolu (60 ml) a Ν,Ν-ethyldiisopropylaminu (6,44 g; 0,05 mol). Reakční směs byla míchána při 100 °C po 4 hodiny. Po ochlazení na pokojovou teplotu byl vzniklý precipitát /filtrován, promyt 11-propanolem (2x10 ml) a vodou (3x10 ml) a vysušen při 60 °C do konstantní váhy, Výtěžek: 6,26 g nažloutlé pevné látky (84,9 %). TLC (chloroform-metanol; 85:15): žádné nečistoty; bez výchozích látek, HPLC čistota: 98+ %
Příklad 2
2-Chlor-6- f7chloranilino)pitrin
2,6-Dichlorpurin (3,78 g; 0,02 mol) byl smíchán s 3-chloranilinem (3,83 g; 0,03 mol) v nbutanolu (40 ml) v přítomnosti triethylaminu (7 ml; 0,05 mol) při 110 °C 3 hodiny. Po ochlazení na pokojovou teplotu byla reakční směs míchána při 0 °C 2 hodiny. Žlutý precipitát byl zfiltrován, promyl chladným n-butanolcm (2x10 ml), vodou (3x10 ml) a vysušen při °C do konstantní váhy, Výtěžek: 3,69 g žlutý krystalický prášek (65.8 %). Surový produkt byl rekry stal izo ván v isopropanolu a poskytl 2,85 g čisté látky. TLC (chloroform-metanol;
85:15): žádné nečistoty; bez výchozích látek. ÍIPLC čistota: 98+ % ··»·
Příklad 3
2-Chlor-6-(3-fluoranilino)purin
Látka byla připravena, jak je popsáno v příkladu 2, reakcí 2.6-dichlorpurinu s 3fluoroanilinem. Reakční směs byla následně odpařena na rotační vakuové odparce, zbytek byl rozdělen mezi ethylacetát a 0,5 M IICI. Organická vrstva byla promyta vodou, vysušena MgSOj, a odpařena v výtěžkem žluté pevné látky (3,72 g). Surový produkt byl přečištěn flash chromatografií. Výtěžek: 2,20 g žlutého krystalického prášku. TLC (chloroformmetanol; 85:15): homogenní. HPLC čistota: 98+ %
Příklad 4
2-Chlor-6)-(3-hydroxyanilino)purin
Tato látka byla připravena reakcí 2,6-dichlorpurínu (3,78 g; 0,02 mol), 3-aminofenolu (3,27 g; 0,03 mol), a N,N-ethyldiisopropylaminu (6,44 g; 0,05 mol) v n-butanolu (40 ml) při 90 °C 4 hodiny. Reakční směs pak byla míchána při pokojové teplotě a vzniklá krystalická sraženina, promytá chladným n-butanolem (3x10 ml), vodou (3x10 ml), byla následně vysušena do konstantní váhy.
TLC (chloroform-metanol; 85:15): homogenní. HPLC čistota: 98+ %
Příklad 5
2-Chlor-6-(3-methoxyími}ino)pw‘in
Do suspenze 2,6-dichlorpurinu (3,78 g; 0,02 mol) a m-anisidinu (3,69 g; 0,03 mol) v npentanolu (40 ml), byl přidán triethylamin (7 ml; 0,05 mol). Reakční směs byla míchána při 100 °C 4 hodiny a následně ochlazena na pokojovou teplotu. Bílá sraženina byla po odsátí promyta isopropanolem (2x10 ml) a vodou (3x10 ml). Surový produkt byl rekrystalován z metanolu s aktivním uhlím za vzniku bílých krystalů. Výtěžek: 4,36 g (77,8 %). TLC (chloroform-metanol; 85:15): žádné nečistoty, neobsahuje výchozí látky, HPLC čistota:98+ %
Tabulka 1
Látky připravené způsobem podle příkladu 1 -5
SUBSTITUENT PURINU CHN ANALÝZY MS ANALÝZA-ZMD
R6 R2 [%] [M-Η]’ a) [M+H]+b)
1 anilino chlor C=53,5: H=3,3, N=2S,6 244 246
2 2-cliloroaniliníi chlor C=46,8, H=2,9; .'<-24.7 278 280
3 3-chloroanilino chlor C=4ó,8; H=2,9; N-24,6 278 280
4 4-chloroanilino chlor C=46.9; 11=3,0; N=24.7 278 280
5 2’fl(ií)roíiniliiio chlor C=49,9; 1-1=3,0, N-26.5 262 264
6 3-l!iJí>ri>anilino chlor 049,7; 14=3,0; N-26,7 262 264
7 4-fluwpanilino chlor C=49.8; H=3,l,N-26,4 262 264
8 2-liydroxy anilino chlor C=49,7, H=3,l,N=2fi,7 260 262
9 3-bydroxy anilinu chlor C=49,9, ll=3,2,N=26,7 260 262
10 4-hydroxyanilino chlor 050,5, II=3,I;N=26,8 260 262
li 2-melhoxyatlilino chlor 051,4,11=3,8; N=25,5 274 276
12 3-methoxyanilino chlor 051,8; 11=3,8; N=25,2 274 276
13 4-methoxyanilino chlor C=52,0,11=3,7; N=25,2 274 276
14 2-aminoamlino chlor 050,5; II 3.2: N=32,8 259 261
15 3-aminoanilino chlor 050,6; 11 3.2 N=32,5 259 261
16 4-amino anilinů chlor 050,4; 11=3,3; N=32,3 259 261
17 3.4-dimethoxyanilino chlor 051,3; 11=3,9; N=23,3 304 306
18 2,5-dimelhoxyanilino chlor 051,3; [1=4,0, N=23,2 304 306
19 3,4,5-trimeihoxyaiiilÍno chlor 049,9; 11=4.2; N=21,0 334 336
20 3,4-diliydroxyanilmo chlor 047,2; 11=2,8; N=25,5 276 278
21 2,5-dihydrůxyanil ino chlor 047,3; 11=2,8; N=25,6 276 278
22 2-chloro-5-niethoxyaiiílino chlor C=4ó,3; 11=2.9; N=22,7 308 3! 0
23 2-chloro-3-methoxyanilino chlor 046,4; H=2,9; N=22,7 308 310
24 2-bromo-3-metlioxy ani 11 no chlor C=40,8,11=2.5; N=19,4 353 355
25 2-melhoxy-3-chloroamlino chlor 046,4; 11=3,0; N=22,6 308 310
26 3-ethoxyanilino chlor 053,8, H=4,l; N=24,3 288 290
27 2-liydroxy-S-methylanilino chlor 051,9. H=3.6; 19=25,7 274 276
28 3-hydroxy-4-iiiethy]anihiio chlor 052,1; II=3,7;N=25,5 274 276
29 3-hydroxy-2-melhylanilino chlor 052,1; 11=3,8; N=25,4 274 276
30 3,4-dimethylanil ino chlor 056,8; H=4,1, N=25,7 272 274
31 2-hydroxy-3-melhoxyanil i no chlor C=49,3 H-3,6; N=24,3 290 292
32 2-hydroxy-4-mclhuxyanilino chlor 049,2; 11=3,7; N=24,7 290 292
33 44iydroxy-3,5-dimeth<«yanílino chlor 048,2; 11=3.6; N=21,9 320 322
34 2,3-difl uoroani lino chlor C=46,6; 11=2,0, N=25.l 280 282
35 2,4-difluoroanitinů chlor 046,7; 11=2,0; N=25,l 280 282
36 2,3,4-trilluoroanilino chlor 043,6; 01,6; 023,7 280 282
37 2,4,5-trí(luuroanilino chlor 043,8;11=1,6.023.6 280 282
38 2,3-dichloroanil ino chlor 042,3; H=2,0; N=22,l) 312 314
39 2,4-dichloroanil inu chlor C=42,0; H=2,0, N-22,2 312 314
Příklad 6
2-Amino-6-(l-methoxyanilino)purin
Do suspenze 2-amino-6-chlorpurinu (1,69 g; 0,01 mol) a m-anisidinu (1,23 g; 0,01 mol) v nbutanolu (20 ml) byl přidán triethylamin (3,5 ml; 0,025 mol). Vzniklá hustá suspenze byla míchána 3 hodiny při 110 °C. Když TLC potvrdilo absenci výchozích látek a přítomnost produktu, reakce byla následně ochlazena na pokojovou teplotu. Bílá sraženina byla odfiltrována, promyta n-butanolcm (3x10 ml), vodou (3x10 ml) a vysušena do konstantní váhy. Výtěžek: 2,19 g (85%). Surový produkt byl přečištěn jako hydrochlorid krystalizaci z 2,5 M roztoku HCI v metanolu za vzniku 2,17 g téměř bílých krystalů hydrochloridu. TLC (chloroíbrm-mctanol-NlUOH; 4:1:0.05); žádné nečistoty, neobsahuje výchozí látky. HPLC čistota: 99+ %,
Tabulka 2
Látky připravené způsobem podle příkladu 6
SUBSTITUENT PURINU CHN ANALYZY MS ANALÝZY-ZMD
R6 K2 [%] [ΜΉ]' a) [M+H]+b>
40 anilino fluor 057,6; H=3,5;N=30,7 228 230
41 2-cbluruanilino fluor 049,7; 11=2.7,026.8 262 264
42 3-chloro anilino fluor 049.9: H=2.7;N=2Ó,7 262 264
43 4-ctiloroanilíno fluor 050,0; H=2,7; N=26,7 262 264
44 2-lluoroanilino fluor 053,4; 11=2,7; N=28.5 246 248
45 3-nuoroanilinn fluor 053,3; H=2,7;N=28,5 246 248
46 4-íluoruanilino lluor 053,4, 02.8: 028,4 246 248
47 24iydroxyanilino fluor 053,0; H=3,4 ; N=28,3 244 246
48 3-hydroxy anilino lluor 053,4; H=3,4,N=2fi,2 244 246
49 4-liydroxy anilino fluor 053,9,11=3.3, N=28,5 244 246
• · • « • · · • ·♦·
íll 2-methoxvanilino 11 nor €'=54,7; H=4,l; N 27.3 258 260
51 3-inethoxyaiilino fluor 055,1.11=4.0; N=26,9 258 260
52 4-meihoxyanilíno fluor 05 5.0; 11=4,0, N=27,4 258 260
53 3,4-dimethoxyanílino fluor €=53,7; H=3,9; 024,8 288 290
54 2.5-dimctboxyanihni) fluor C=53.6: H=4,0; N=24,5 288 290
55 3,4-dihydroxyanilino fluor €'=50,2,11=3,0,027,3 260 262
56 2,5-dihydroxyanílíno fluor 050,2; 11=3,0; N=27.2 260 262
57 2-chloro-5-methoxyanil ino fluor 049,0,11=3,1. N=24,0 292 294
58 2-mcthoxy-3-chloroanilino lluor 018,0; H=3,0;N=24,0 292 294
59 3-ethuxyanilino fluor 050,8; H-4,2; 026,0 272 274
60 2-hydroxy-5 -methyl am 1 ino lluor 055,2; 11-3,8; N=27,2 258 260
61 3-hydroxy-4-methylai]ilino (1 nor 055,3; Η=3,8;Ν=27,2 258 260
62 3-hydroxy-2-melhyl anilinů lluor C’=55,3; H=3,9; N=27,0 258 260
63 3,4-dimethyIanílino lluor 060,4; H=4,6; N=27.4 256 258
Příklad 7
2-F! nor-6- (3-methoxyanilinojpurin
Látka byla připravena reakcí 2-fluor-6-chlorpurinu (1,7 g; 0,01 mol), m-anisidinu (1,23 g; 0,01 mol) a triethylaminu (3,5 ml; 0,025 mol) v n-butanolu (20 ml) při 90 °C po dobu 4 hodin. Reakční směs byla následně ochlazena na pokojovou teplotu a vzniklá bílá sraženina byla odsáta, promyta n-butanolem (3x10 ml), vodou (3x10 ml) a vysušena do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 5,55 g (61 %) nažloutlého krystalického prášku. TLC (chlorolormmetanol; 85:15): žádné nečistoty. HPLC čistota: 99+ %.
Tabulka 3
Látky připravené způsobem podle příkladu 17
SUBSTITUENT PURINU CHN ANALÝZY MS ANALÝZA-ZMD
R6 R2 [%] [M-H]’ a) [M+H]+b)
64 aniline aminu C-58,2; 11=4,4; N=37,5 225 227
65 2-chloroanilino amino €'=50,2; 11=3,3; N=32,9 259 261
66 3-cliloroamlino amino C=50,5;11=3,4; N=32.6 259 261
67 4-chloroandino amino €-50.5; 03,4; 032.5 259 261
68 2-lluoroanilino amino 053.8; H=3,7; N=34,7 243 245
69 3-lluoroanilino amino 053,9; 11=3,6; N=34,8 243 245
70 4-fluoroaiiilino amino 054,0; H=3.7; N=34,5 243 245
• ·
71 2-hydroxyanilino amino 0=54,0; H=4,l; N=34.9 241 243
72 3-hydroxyanilino amino C=54,l; H=4,2; N=34,8 241 243
73 4-hydroxyanilíno amíno C=54,4; H-4,2, N=34,7 241 243
74 2-meihoxyanilino amino C=55,9; H=4.7, N=33.0 255 257
75 3-melhoxyanilino amino C'=56,0; Η-4Λ N=32,9 255 257
76 4-melhoxyanilino aniino 0=56,3; N=32,9 255 257
77 3,4-dimethylaňilBio amino 051,0; 11=5,5, N=33,4 253 255
Příklad 8 2-Thioxanthin
4,5-Diamino-6-hydroxy-2-thiopyrimidin (100 g) byl refluxován s 90% kyselinou mravenčí (500 ml) dvě hodiny za mechanického míchání. Po ztuhnutí směsi bylo přidáno dalších 100 ml kyseliny mravenčí. Směs ochlazena na 1 °C a surový 4-amino-5-formamido-6-hydroxy-2thiopyrimidin byl následně odfiltrován a vysušen pod vakuem. Filtrační koláč byl resuspendován ve formamidu (225 ml) a zahříván na teplotu 175-185 °C v parafinové lázni po dvě hodiny za občasného míchání. Směs byla následně ochlazena na pokojovou teplotu, znovu zfiltrována, promyta dvěma litry 1 M NaOH a vysušena dvě hodiny při teplotě 95 °C. Výtěžek 103 g (97 %).
Příklad 9
2-Benzylthio-6-purinol
5,28 gramů 8-thioxanthínu bylo resuspendováno v 78,5 ml 1 M NaOH, naředěno vodou na celkový objem 400 ml. (Výchozí látka se zcela nerozpustí ani po přidání 2,5-násobku báze). Následně bylo přidáno 3,7 ml benzyl chloridu a smě byla silně míchána po dobu 3 hodin při pokojové teplotě, pak upraveno pH na 5 pomocí ledové kys. octové.Vznikla červená sraženina, která byla odsáta, promyta důkladně vodou a vysušena přes noc ve vakuu 80 °C. Takto bylo získáno 7,33 g růžové pevné látky, která byla použita do následující reakce bez dalšího přečištění.
Přikladlo
2-Benzylthio-6-chlorpurin
K 2-benzylthioxanthínu (27,6 g, 0,107 mmol) byl přidán POCl·? (506 ml) a N,Ndiethylanilin (40 ml). Směs byla refluxována 1,5 hodiny a přebytek POCfl byl odstraněn odpařením ve vakuu. Výsledný sirup byl smíchán s ledem (2 kg) a za přidání hydroxidu sodného a chlazení vznikla pevná látka. Směs byla následně okyselena pomocí koncentrované HC1 na pH 1 a vzniklá pevná látka byla odsáta, promyta vodou a vysušena několik hodin při teplotě 70 °C. Surový produkt, na prášek rozmělněný, byl smíchán s malým množstvím metanolu a žlutá pevná látka byla vysušena ve vakuu při 70 °C. Výtěžek 17,5 g (59%). Surový 2-benzyllhio-6-chlorpurin, stejně jako 2-benzylthioxanthin, je dobře rozpustný v DMSO. TLC (chlorolorm-methanol; 95:5): bez výchozích látek. Surový produkt byl čištěn kolonovou chromatografií (125 g silika) a cluován 2,5 % MeOH/chloroform. Z frakcí (lOOml) 7-36 byla odpařením získána žlutá pevná látka, která byla následně rekrystalována z 50% metanolu. Získána bílá krystalická látka a vysušena do konstantní váhy při 45°C (chloridem vápenatým a následně oxidem fosforečným přes noc). Výtěžek: 3 g. Bod tání 176-178 °C, bez rozkladu. TLC (SILICA-5% MeOH/chloroform). HPLC čistota: 95+ %
Příklad 11
2-Benzylthio-6-anilinopurin
2-Benzylthio-6-chlorpurin (3,9 g) a anilin ( 3,42 g) byl refluxován v n-BuOH (100 ml) za přítomnosti triethylaminu (7,5 ml) 2 h. Reakční směs byla následně ochlazena na pokojovou teplotu, odpařena do sucha na rotační vakuové odparce, znovu ochlazena ledem a přidáno 400 ml vody za silného třepání. Při stání přes noc při -ló°C vznikl tmavohnědý surový produkt, který byl následně vysušen do konstantní váhy a přečištěn preparativní kolonovou chromatografií (100 g silica). Kolona byla promyta chloroformem a 500 ml x 1,25% MeOH/chloroform, následně eluována 1,51 x 2,5% MeOH/chloroform. Frakce (100 ml) 1215 byly odpařeny do sucha za vzniku světle hnědého produktu, který byl rekrystalizován z metanolu za přítomnosti aktivního uhlí. Výtěžek: 1,18 g bílé amorfní látky. TLC (2.5% MeOH/chloroform) žádné nečistoty. HPLC čistota: 98+%.
Příklad 12
2-Thio-6-amlinopurin
2-Benzylthio-6-anilinopurin (1,18 g) byl rozpuštěn v tekutém amoniaku (125 ml). Do vzniklého roztoku byl následně přidáván sodík po malých částech do vzniku stabilního modrého zabarvení. V dalším kroku bylo pak přidáno malé množství chloridu amonného a tak odstraněn přebytek sodíku. Po zredukování objemu byl přidán ether (125 ml) (k odstranění vedlejších produktů). Po odstranění zbytku amoniaku byla reakční směs extrahována vodou (2 x 65 ml). pH vodné frakce bylo následně upraveno pomocí kys, octové na 5 a roztok ochlazen suchým ledem pod -10 °C, za vzniku pevné látky krémové barvy. Produkt byl zfiltrován, promyt důkladně vodou a vysušen přes noc nad chloridem vápenatým. Výtěžek: 760 mg téměř bílého prášku. TLC: žádné nečistoty. HPLC čistota: 95%.
Tabulka 4
Látky připravené způsobem podle příkladu 12
SUBSTITUENT PURINU CHN ANALÝZY MS ANALÝZA-ZMD
R6 R2 [%] [M-II] a) [M+H]+b)
78 anilinu tliio 054,0; H-3,5; N-29.0 242 244
79 2-chloroan ilino thio 047,2; H-2.7, N-25,4 276 278
80 3-chloroanilino thio C=47,4, H=2,8; N-25,1 276 278
81 4-chloroanilino thio 047,4: H=2,8: N-25,2 276 278
82 2-tluoroanilino thio 050,5, H=3,0; N=27,0 260 262
83 3-lluoroanílino thio 050,5; H=2,8; 027,0 260 262
84 4-tIuoroani 1 ino thio C-50.-Í. H=3,0; N-27.2 260 262
85 2-hydroxyanilino thio 050,6; H=3,4; N-27.2 258 260
86 3-hydroxyanilino thio 050,2; H-3,2, N-27,7 258 260
87 2-methoxyanilino thio 052,5; HM,O;N-26,O 272 274
88 3-methoxyanilino thio 052,6; H=4,l;N-25,7 272 274
89 4-nieUioxyanilino thio 052,5; H-4,0; N=25,9 272 274
90 3,4-dimethoxyaniiino iliio 051,7; H-4.L, N-23,5 302 304
91 2,5-dímethoxyanílino thio C=5I,1,11-4,3; N=23,3 302 304
92 2-chlorO'5-methoxyanil ino thio C=46,3, H=3,l;N=22,y 306 308
93 2-mcthoxy-3-ehloro£Uiilino tliio C-40,4 H-3,2; N-22,9 306 308
Příklad 13
2-Methylthioxanthin
Do čerstvě připraveného roztoku 2-thioxanthinu (103g, 0,613 molu) ve 2 M NaOH (613 ml) a vodě (245 ml) byl po kapkách přidán dimethyl sulfát (77 g, 58 ml), teplota byla udržována mezi 25 a 40 °C. Reakční směs byla další hodinu míchána a pak ponechána přes noc při pokojové teplotě. Poté byla tmavě červená kapalina zfiltrována a produkt vysrážen ledovou kyselinou octovou, zfiltrován a rekrystalizován z horké vody (1500 ml) s přídavkem aktivního uhlí. Produkt vykrystaloval pří -10°C, byl následně /filtrován a sušen při 95 °C 3 h, a poté nad oxidem fosforečným do konstantní váhy. Výtěžek; 48 %. HPLC čistota: 80%.
Příklad 14
2-Melhylthio-6-chlorpurin
2-Methylthioxanthin (65 g) byl smíchán s POCI3 (975 ml) a N;N-diethylanilinem (97,5 ml). Reakční směs byla následně refluxována s mechanickým mícháním po dobu 90 minut, Přebytek POClj byl odstraněn na vakuové rotační odparce při 55-60 °C a zbytek byl míchán sledem (0°C, 1,75 kg) po dobu 10 minut (do dokončení hydrolýzy POCf. Produkt byl následně extrahován ethylacetátem (4 x 2,5 1), Extrakty byly promyty vodou a odpařeny do sucha, za vzniku tmavě hnčdé pevné látky, Surový produkt byl rekrystalován s etanolu za přítomnosti aktivního uhlí a vysušen do konstantní hmotnosti nad oxidem fosforečným. Výtěžek: 23,6 g (33%). HPLC čistota: 99%. TLC (chloroíorm/methanol, 9/1) bez nečistot.
Příklad 15
2-Methylthio-ó-anilinopiirin
Směs 2-methyllhio-6-chlorpurinu (10 g, 50 mmol), anilinu (7,7 g, 63 mmol) a triethylaminu (35 ml, 250 mmol) byla refluxována v butanolu (400 ml) 2 hodiny, Butanol byl odpařen pod vakuem a po ochlazení přidána voda (290 ml). pH bylo upraveno na 8,0 a směs byla ponechána přes noc při -16°C. Vzniklý žluto-zelený produkt (10 g) byl zfiltrován, vysušen pod vakuem nad oxidem fosforečným a chromatograficky přečištěn (250 g silika, Fisons, v chloroformu), eluován směsí chloroform/metanol (97/3, v/v), Odpovídající frakce byly odpařeny do sucha, produkt rekrystalován z etanolu s přídavkem aktivního uhlí a následně vysušen nad oxidem fosforečným do konstantní hmotnosti, Výtěžek 5,76 g, ( 46%), HPLC čistota >98%.
TEC: Chloroform/metanol (9 ; 1, v/v), bez nečistot.
Tabulka 5
Látky připraveně způsobem podle příkladu 15
SUBSTITUENT PURINU CHN ANALÝZY MS ANALÝZA-ZMD
R6 R2 [%] [M-H]’ .1) [M+H]+b)
94 anilino methylthio C=55,9 , H=4,2;N=27,3 256 258
95 2-chloroanilino metliyltbio 049,1 , H=3,3: N=24,3 290 292
• « · • » · * • · · · · · « « · «« · • · * • * · · • · · ♦ · ·
96 3-ehloroanilino mclhyltliio C=49,l: H-3,1; N-24.1 290 292
97 2-tluoroanílino methylthio C=52,2; 03,7; N=25.3 274 276
98 3-fluoro anilino methylthio 052,4; 03,6; N=25.4 274 276
99 4-tluoroanilino methylthio 051,9; 03,4, N=25.6 274 276
100 2-hydroxyanilino methylthio C=52,5,11=4,0: N=25,8 272 274
101 3-hydiOxyaniliiw metbyltbio C=52,5; 04,0, N=25.7 272 274
102 2-methoxyanilino melhylthio 054,3, H=4,4; N=24,6 286 288
103 3-nietlioxyanilino methylthio 054,0; 04,4,024,9 286 288
104 4-mcthoxyanilino melhylthio 053,8; O4,3,N=24,7 286 288
105 .3,4-dimethoxvanilmo methylthio 052,6; i 1=4,7; 022 2 316 318
106 2,5-dimethoxyanilino methylthio 052,9; 11=4.8. 022,2 316 318
107 2-chloro-5-methoxyanilíno methylthio 048.8; H-4,7; 022,0 320 322
108 2-metlwxy-3-chloroaniIino ntcthyhliín 048,1,05,3; 021,3 320 322
Příklad 16
2-Methyl-6-(3-methoxyaniliru))purin
Do suspenze 2-methyl-ó-chlorpurínu (1,69 g; 0,01 mol) a m-anisidinu (1,23 g; 0,01 mol) v nbutanolu (20 ml) byl přidán triethylamin (3,5 ml; 0,025 mol). Vzniklá hustá směs byla míchána při 110 “C po 3 hodiny, kdy TLC ukázalo nepřítomnost výchozích látek v reakční směsi. Ta byla následně ochlazena na pokojovou teplotu. Bílá sraženina byla zfiltrována, promyta n-butanolem (2x10 ml), vodou (3x10 ml) a vysušena do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 1,92 g (75 %). Surový produkt byl přečištěn jako hydrochlorid krystalizací z 2.5 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v metanolu. TLC (chloroform-metanol-NHyOH; 4:1:0,05): bez nečistot a výchozích látek. 1IPLC čistota: 99+ %.
Tabulka 6
Látky připravené způsobem podle příkladu 16
PURIN SUBSTITUENT CHN ANALYSES MS ANALYSES-ZMD
R6 R2 [%] [M-H]' a) [M+H]+b)
109 anilino methyl 063.8. H=4,9; 031,2 224 226
110 2-chloroanilinn methyl 055,3; H=3,7;N=27,3 258 260
111 3-chloroanilinu methyl 055,3; 11=3,8; N=27,3 258 260
112 2-fluon)anílino methyl 059,0, H=4,l;N=29,0 242 244
• * * • v · · · • ·
113 3-iluoroanilinu methyl C=39,2;»-4J;N-29,I 242 244
114 4-tlunroiinilino methyl C=59.1; H=4.1; N=29+l 242 244
115 2-hydroxyanilino methyl C=60,0; 104,6; N=29J 240 242
116 3-hydroKyamlino methyl C=59,9; H=4,6,N=29,1 240 242
117 2-mcthoxyanilino methyl C=61,1, H=5,2, N-27,9 254 256
11S 3-methoxyanilino methyl C=60,8;H--5.1;N=27,5 254 256
119 4-mclhoxyanilmo methyl C=61.0:H=5,l;N=27,5 254 256
121) 3,4-dinielhnxyanilino methyl 0=58,5; H=5,I,N=24.9 284 286
121 2,5-dimcthoxyanilino methyl 0=58,8; 11=5,1;N=24,6 284 286
122 2-chloro-5-nietlioxyanilino methyl 0=53,7, H=4,l; N-24,3 288 290
123 2-methoxy-3-ch]oroanilino methyl 0=53,8; 11=4,2; N=24,6 288 290
Příklad 17
2-Brotn-6- (methoxy unii ino)purin
2-Brom-6-(methoxyanilino)purin byl připraven podobně jako látka v příkladu 5, zde reakcí 2-brom-6-chlorpurinu a m-anisidinu (v molárním poměru 1:1) v přítomnosti triethylaminu (2,5 eq.) v n-propanolu při 100 °C 4 hodiny. Po ochlazení na pokojovou teplotu byla vzniklá bílá sraženina zíiltrována, promyta chladným n-propanolem, vodou a vysušena v exikátoru do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 69% (jako hydrobromid). Surový produkt byl rekrystalován z metanolu a volná báze byla získána reakcí hydrobromidu s 10% vodným roztokem amoniaku. HPLC čistota; 98+%.
Tabulka 7
Látky připravené způsobem podle příkladu 17
SUBSTITUENT PURINU CHN ANALÝZY MS ANALÝZA-ZMD
Ró R2 [%] [M-H] a) [M+H]+b)
124 anilinu brom C-45.4.11=2.7; N=24.3 289 291
125 2-chloroanilino brom C-40.5,11=2.1,N=2I.7 323 325
126 3-chloroanilino brom 0=40.5; 11=2.1; N=21.6 323 325
127 2-íluoroanilitto brom 0=44.5, H=2.1, N=23.0 307 309
128 3-íluoroanilino brom C=44.7; H=2.1; N=22.9 307 309
129 3-methoxyanilino brom O 44.6, H=3.2; N=2I.Ó 319 321
130 2-hydroxyanilino brom C=42 9; H=2 6; N=23.l 305 307
131 3-hydroxyanil i no brom C=43 2; 11=4,6. \ 22 9 305 307
Příklad 18
2-Nitro-6-(3-methoxyfenyl)amino-9-Boc-purin
Do roztoku 2-nitro-6-chlor-9-THP-purinu (3,00 g; 0,01 mol) v metanolu (40 ml) při 0°C’ byl po kapkách přidán roztok m-anisidinu (1,48 g; 0,012 mol) a triethylaminu (3,0 g = 4,2 ml; 0,03 mol) v metanolu (1 Oml). Teplota při rekci byla udržována +5 °C. Po přidání veškerého m-anisidinu byla reakční směs (monitorována TLC do vymizení výchozího 2-nitro-ó-chlor-9ΊΊIP-purinu v reakční směsi) za míchání pomalu ohřátá na pokojovou teplotu. Methanol byl následně odpařen a produkt rozdělen mezi vodu (50 ml) a ethylacetát (50 ml). Vodná fáze byla znovu reextrahována ethylacetátem (50 ml). Spojené organické fáze byly promyty vodou (20 ml), sušeny bezvodým MgSCC, a odpařeny do sucha. Surový produkt byl rekrystalován ze směsi ether - cyklohexan (1:1). Výtěžek: 3,1 g (80 %) téměř bílého krystalického produktu. Čistota (HPLC): 98%+.
Příklad 19
2-Nitro-6-(3-melhoxyfenyl)aminopurin
2-Nitro-6-(3-methoxyfcnyl)amino-9-Boc-purin (3,86 g; 0,01 mol) byl rozpuštěn v 50% kyselině trifluoroctové (50 ml) při 0 °C, Roztok by! inkubován přes noc v lednici a následně odpařen na rotační vakuové odparce. Krystalický produkt byl smíchán s vychlazeným 5 % vodným roztokem amoniaku (100 ml). Surový produkt byl /filtrován a rekrystalován z 50% metanolu. Výtěžek: 1,97g (69 %) nažloutlé krystalické látky; čistota (HPLC): 98%+.
Tabulka 8
Látky připravené způsobem podle příkladu 18-19
SUBSTITUENT PURINU CHN ANALÝZY MS ANALÝZA-ZMD
R6 R2 [%] [M-H]' a) [M+H]+h)
124 amlino nitro C=55.1;HM4;N-35 1 239 241
125 2-chloroíinilino nitro C=47.9; H=2.ů; 9 273 275
126 3-ciiloroanilino nitro CM 8.0: H=2ó;N=30 7 273 275
127 2-fluoroanilmo nitro C-51.0;1H2.6, N=32.8 257 259
128 3-ťl uoroanil ino nitro C=5I,I; H=2 7, N=32.R 257 259
129 3-methoxyanilinii nitro C=53 1: HM.6; N-31.5 269 271
130 2-hydiOxyanilino nitro CM 1,5; H=3,1: N-33.0 255 257
« 4 • · · · * ♦ · · · · • » · ·· · • · a · • I • a a · a · · ·« ·
131 3-hyckoxyanilino nitra 051.3: H=2.9; N<32.9 255 257
Příklad 20
Inhibice aktivity cytokinin oxidasy
Hodnoty IC50 byly stanoveny užitím testu v mikrotitrační destičce. Každá jamka obsahovala 100 μΐ PMS/MTT [fenazin methosulfát/3-(4,5-dimcthylthiazol-2-yl)-2,5difenyltetrazolium bromid] reakční směsi (výsledné koncentrace složek: 0,1 M KH7PO4, pH 7,4, 1 mM MTT, 0,2 mM PMS) obsahující testovanou látku (3 χ ΙΟ'7 Μ 3 x 10’4M) a 30 μΜ N6-isopentenyladeninu (iP) jako substrátu. Ke směsi bylo přidáno 100 μ] buněk prostého růstového media kmene S. cerevisiae 23344c ura nesoucího plasmid pYES2-AtCKX2, jako zdroje AtCKX2. Destičky byly inkubovány 30 min ve tmě a enzymatická reakce byla zastavena přídavkem 25 μΐ 35% kys. octové. Následně byla změřena absorbance při 578 nm na spektrofotometru Tecan. Absorbanee vzorku bez iP byla odečtena.
Hodnota IC50, tedy koncentrace látky inhibující aktivitu enzymu z 50%, byla spočtena ze získaných křivek odezvy. V tabulce 9 jsou uvedené průměry ze tří opakování, celý test byl proveden nejméně dvakrát. Látky účinnější než thidiaz.uron (referenční látka) mají IC50 nižší než thidiazuron.
Tabulka 9
Účinek nových látek na inhibici rekombinantní AICKX2
No. Testovaná látka ÍC50 (pmol.L'1)
R6 R2
thidiazuron 30
1 anilino chloro 22.6
3 3-chloroanilino chloro 6.3
4 4-chloroanilino chloro 24.1
6 3-fluoroanilino chloro 12.2
7 4-fluoroanilino chloro 28.3
9 3-hydroxyanilíno chloro 3.5
12 3-methoxyanilino chloro 0.8
13 4-metlio.xyanilino chloro 18
40 anilíno fluoro 14.9
42 3-chloroanil ino fluoro 15.3
43 4-chloroanilino fluoro 27
45 3-fluoroanilino fluoro 22.1
48 3-hydroxyanil ino fluoro 11,8
51 3-methoxyanilino fluoro 0.4
66 3-chloroanilino amino 25,6
69 3-fluoroanilino amino 29,4
75 3-methoxyanilino amino 24.7
80 3-chloroaniiino thio 28.4
83 3-fluoroanilino th io 22.6
88 3-methoxyanilino thio 28.3
111 3-chloroanilino methyl 15.7
113 3-fluoroanilino methyl 21.8
118 3-methoxyanilino methyl 9.4
Příklad 21
In vivo účinek 2-chlor-6-(3-meíhoxyanHino)aminopurinu (látka 12)
Transgenní rostliny Arabidopsis 35S:AtCKXl a tabáku 35S:AtCKX2 pěstované v půdě ve skleníku byly systematicky ošetřovány 10 μΜ látky 12. Nadzemní části kontrolních transgenních rostlin byly sprejovány každý druhý den po dobu jednoho měsíce vodným roztokem látky 12 obsahujícím 0,01% smáčedla Silwet L-77. Z obrázku 1 je jasně patrné, že aplikace CKX inhibitoru 2-chlor-6-(3methoxyanilinojaminopurinu (látka 12) uvolnila rostliny z růstové inhibice způsobené poklesem cytokininů a vedla k obnovení přirozeného fenotypu. Abychom potvrdili, že tento účinek není obecným účinkem exogenně aplikovaného cytokininů, ale specifickým účinkem CKX inhibitoru, byly CKX1 nadprodukující semenáčky Arabidopsis pěstovány in vitro na MS mediu obsahujícím 0,1 μΜ cytokinin BA? (obrázek 2C) nebo stejnou koncentraci látky 12 (obrázek 2B). K obnovení přirozeného fenotypu došlo pouze pokud byla v médiu přítomná látka 12.
Dlouhodobá aplikace látky 12 na přirozené rostliny Arabidopsis vedla k pozměněnému vývoji kvetu a inhibici oplodnění (obrázek 3). Květy měly špatně vyvinuté prašníky a byly sterilní.
Příklad 22
Aktivace cytokininových receptoríi
Escherichia coli kmeny KMI001 nesoucí plasmid pIN-IÍI-AHK4 nebo pSTV28AHK3 byly pěstovány přes noc při 25 °C v M9 médiu obohaceném 0,1% kasaminovými kyselinami do OD6oo~L Prekultura byla nařcděna 1:600 v 1 ml M9 média obsahujícího 0,1% kasaminovými kyselinami a k ní byl přidán 1 μΐ zásobního roztoku testované látky (10'7 M - 5 χ 10'5 M) nebo rozpouštědla (DMSO, ethanol, methanol). Kultury byly dále kultivovány při 25 °C v mikrotitrační destičce, 200 μΐ na jamku, po dobu 17 h v případě CRE1/AI1K4 kultury a 28 h v případě AHK3 kultury. Poté byly kultury zccntrifogovány a 50 μ] alikvoty supematantu byly přeneseny do mikrotitrační destičky obsahující 2 μΐ 50 mM 4-methyl umbelliferyl galaktosidu v každé jamce a následně inkubovány 1 h při 37 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 100 μΐ 0,2 M NaíCC^. Fluorescence vzorků byla změřena spektrofotometrem Fluoroscan Ascent (Labsystems, Finsko) při vlnových délkách 365 nm (excitační) and 460 nm (emisní). Bylo stanoveno ODgoo zbylé kultury a aktivita β-galaktosidasy byla vyjádřena jako nmol 4- methylumbelliferonu x ODgoo'1 x h’1.
Hodnoty EC50, tedy koncentrace látky aktivující receptor z 50 %, byla spočtena ze získaných křivek odezvy. V tabulce 10 jsou uvedené průměry ze tří opakování, celý test byl proveden nejméně dvakrát. Látky aktivující receptory méně než mmw-zeatin (referenční látka) jsou zajímavé jako CKX inhibitory. Nové substituované 6anilinopuriny vykazovaly mnohem menší afinitu k cytokininovým rcceptorům než /rarw-zeatin.
Tabulka 10
Účinek nových látek na aktivaci cytokininových receptorů Arabidopsis thaliana CRE1/AHK4 and AHK3.
No. Testované látky EC50 (pmol.L'1)
R6 R2 CRE1/AIIK4 AHK3
traw-zeatin 0.9 2.1
benzylamino 19.7 18.2
1 anilino chloro 35.4 JO
3 3-chloroaniIino chloro 7.5 20
4 4-chloroanilino chloro 27.8 2.5
6 3-fluoroaniiino chloro >50 33.3
• · · • · · • » · · • · · · · * • · · «« « · • · · • · · » · · ·* * » » · • · · • · · · ♦ · · ·· ·
7 4-fluoroaniIino chloro n.i. 8.3
8 2-hydroxyanilino cliloro 50 317
9 3-hydroxyanilino chloro 37.1 2.8
10 4-hydroxyanilino chloro 26.7 44.4
11 2-methoxyanilino chloro >50 6.1
12 3-methoxyanilino chloro 31.3 9.5
13 4-methoxyanilino chloro n.i. 6
30 3,4-dimethylanilino chloro 33.3 >50
40 anilino fluoro 46.2 19
42 3-chloroanilino fluoro 21 31.6
43 4-chloroantlino fluoro 39.8 27
45 3-fluoroanilino fluoro >50 42.1
46 4-fluoroanilino fluoro n.i. 22.5
47 2-hydroxyanilino fluoro >50 45.8
48 3-hydroxyanilino fluoro 49.6 15
49 4-hydroxyanilino fluoro 37.1 >50
50 2-methoxyanílíno fluoro >50 17.4
51 3-methoxyanilino fluoro 43 22.7
52 4-methoxyanilino fluoro n.i. 18.9
64 anilino amino n.i. 25.3
66 3-chloroanilino amino n.i. 43
67 4-chloroanilino amino n.i. 8.1
69 3-fluoroanilino amino n.i. >50
70 4-fluoroanilino amino n.i. 19.5
71 2-hydroxyanilino amino >50 >50
72 3-hydroxyanilino amino >50 7.7
73 4-hydroxyanilino amino >50 >50
74 2-methoxyanilino amino n.i. 29
75 3-melhoxyanilino amino n.i. 20.4
76 4-methoxyanilino amino n.i. 26.3
80 3-chloroanilino thio n.i. 42
81 4-chloroaniIíno thio n.i. 10.2
83 3-fluoroanilino thio n.i. >50
88 3-methoxyanilino thio n.i. 31.7
96 3-chloroanilino methylthio 41 29
98 3-fluoroanilino methylthio 49 32
103 3-methoxyanilino methylthio >50 27.5
111 3-cliloroanilino methyl n.i. >50
113 3-fluoroanilino methyl n.i. n.i.
118 3-methoxyanílíno methyl n.i. >50
* ♦ • ·
n.i. znamená bez interakce
Příklad 23
Stimulační vliv nových látek na buněčné dělení rostlinných buněk
Stimulační vliv nově připravených derivátů byl testován v kalusovém bioteslu za použití cytokinin-dependentního kalusu tabáku. Tento cytokinin-dependentní tabákový kalus Nicotiana tabacum L, cv, Wisconsins 38 byl udržován při 25 °C na modifikovaném mediu Murashige-Skoog obsahujícím na 1 litr: 4 pmol kys. nikotinové, 2,4 pmol pyridoxin hydrochloridu, 1,2 pmol thiaminu, 26,6 pmol glycinu, 1,37 pmol glutaminu, 1,8 μηιοΙ myoinositolu, 30 g sacharosy, 8 g agaru, 5,37 pimol α-naftyloctové kyseliny a 0,5 pmol 6benzylaminopurinu, Subkultivace probíhala každé 3 týdny. Čtrnáct dní před započetím biotestu byl kalus přenesen na médium bez 6-benzyIaminopurinu. Stimulační růstová aktivita byla stanovena na základě nárůstu Čerstvé hmoty kalusu po 4 týdnech kultivace. Pět replikátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a daný test byl opakován minimálně 2krát. V každém experimentu byla použita jako kontrolní látka kinetin, který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na 10'3 M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn
Ď Λ testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10' až 10' M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2% a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu.
Zc získaných dat byla opět vypočítána maximální účinná koncentrace testované látky a její relativní účinnost v této koncentraci (Tab. 11), 10‘5 M koncentrace kontrolní látky kinetinu byla postulována jako 100% biologické aktivity.
Výsledky v tabulce 11 naznačují, žc substituce v poloze 2 a 6 purinového kruhu vedla k nárůstu cytokininové aktivity v kalusovém biotestu ve srovnání s klasickým cytokininem kinctinem (K).
Tabulka 11
Vliv nových cytokininů na růst cytokinin-dependentního tabákového kalusu Nicotiana tabacum L. cv. Wisconsins 38
č. Testovaná sloučenina maximální účinná koncentrace (mokr1) aktivita (%) [ΙΟΛηοΙΤ1 K - 100%J
R6 R2
« » • « * tt·*
c furfury lamino H 100
3 3-chloroanilino chloro 10'5 110 (16)
4 4-chloroanilino chloro 10'5 102 (±8)
6 3-fluoroanilino chloro JO'5 119.7 (±8)
7 4-fIuoroanilino chloro 10'5 112(+12)
9 3-hydroxyanilino chloro IO’5 116.2(+ 13)
11 2-methoxyanilino chloro I0-5 109 (±5)
12 3-methoxyanilino chloro 10'5 102 (±3)
40 anilino fluoro I0’5 108.1 (±4)
42 3-ehloroanilino fluoro I0’5 121 (±8)
43 4-chloroanilino fluoro I0'5 130 (±6)
45 3-fluoroanilino fluoro I0’5 127.9(+8)
46 4-fluoroanilino fluoro IO’5 110.7(+5)
48 3-liydroxyanilino fluoro I0’5 104.2 (+3)
49 4-hydroxyanilino fluoro IO'5 106 (+3)
50 2-methoxyanilino fluoro 10'4 117.6(+ 9)
51 3-methoxyanilino fluoro I0’5 120.5(+ 13)
52 4-methoxyanilino fluoro IO’5 105(+7)
80 3-chloroanilino thio IO'5 126 (±5)
81 4-chloroanilino thio I0’5 115.7(+4)
83 3-fluoroanilino thio IO’5 102.5(+10)
88 3-methoxyanilino thio 105 103.4 (± 12)
96 3-chloroanilino methylthio IO’5 121,2 (+ 18)
98 3-fluoroanilino methylthio IO'5 130.3(+ 17)
103 3-mcthoxyanilino methylthio 10'5 142.8(+21)
111 3-chloroanilino methyl IO'5 128.3(+6)
113 3-fluoroanilino methyl 10'5 125.3(+7)
118 3-niethoxyanilino methyl 105 105.7(+5)
Příklad 24
Testování nových cytokininít v amarantovém biotestu
Pro studium cytokininové aktivity byl rovněž použit “amarantový” biotcst v následující modifikaci. Semena Amaranthus caudatus var. Atropurpurea byla povrchově sterilizována 10% N-chlorbenzensulfonamidem (w/v) po dobu 10 min a poté promyta 5-krát deionizovanou vodou. Semena byla rozmístěna v 15 cm Petriho miskách s filtračním papírem saturovaným destilovanou vodou. Po 72 hodinách kultivace při 25 °C ve tmě byly ze semenáčků odstraněny kořeny. Tyto explantáty obsahující 2 kotyledony a hypokotyl byly umístěny do 5 cm Petriho misek na 2 vrstvy filtračního papíru nasyceného 1 ml inkubačního * « • ♦ » • · · « · média obsahujícího 10 pmol Na2HP04'KH2P04, pH 6,8, 5 pmol tyrosinu a testovaný cytokinin. Na misku bylo umístěno 20 explantátů. Veškeré manipulace byty prováděny pod zeleným světlem v temné komoře. Po 48 hodinách inkubace při 25 °C ve tmě byl betacyanin extrahován cestou zmražení explantátů v 3,33 μΜ kyselině octové. Koncentrace betacyaninu byla stanovena porovnáním absorbancí při 537 a 620 mn a vypočtena pomocí vzorce ΔΑ = AijTnm - Afizonm. Hodnoty byly vyneseny do grafů závislosti ΔΑ na koncentraci. Pět replikátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a daný test byl opakován minimálně 2krát. V každém experimentu byl použit jako kontrolní látka kinetin, který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulloxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na 10‘3 M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10' až 10' M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2% a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu.
Ze získaných dat byla vypočítána maximální účinná koncentrace testované látky a její relativní účinnost v této koncentraci (Tab. 8). 10'4 M koncentrace K byla postulována jako 100% biologické aktivity.
Výsledky naznačují, že substituce v poloze 2 a 6 purinovcho kruhu vedla k nárůstu obsahu betacyaninu (purpurová barva) v explantátech kotyledonů/hypokotylů Amaranthus caudatus ve srovnání s klasickým cytokininem kinetinem (K).
Tabulka 12
Vliv nových cytokininů na obsah betacyaninu v explantátech kotyledonů/hypokotylů Amaranthus caudatus.
č. Testovaná sloučenina maximální' účinná koncentrace (mol.l'1) Účinnost (%) [ΙΟ'ΝηοΙ.Γ1 K =
R6 R2 100%]
c furfury lamino H I0'5 100
3 3-ch loroanilino chloro I0'5 166 (±4)
4 4-chloroanilino chloro 105 107 (±8)
6 3-fluoroanilino chloro 10’’ 120 (±15)
7 4-fluoroanilino chloro 10'5 104 (±4)
9 3-hydroxyanilino chloro 10'5 115.4 (± 18)
11 2-methoxyanilino chloro 10'5 110.3(+ 15)
12 3-methoxyanilino chloro 10’5 132.3(+ 14)
*
40 anilino fluoro ÍO’5 107 (±5)
42 3-chloroanilino fluoro 10'5 121 (±6)
43 4-chloroanilino fluoro 10’5 102.6 (±1)
45 3-fluoroanilino fluoro 10’5 105.1 (±13)
46 4-fluoroanilino fluoro 10’5 109 (±8)
48 3-hydroxyanilino fluoro 10’5 100.3 (i 10)
50 2-methoxyanilino fluoro 10’5 105.2 (± 9)
51 3-methoxyanilino fluoro 10’’ 117.2 (± 11)
64 anilino amino itr5 125.2 (±14)
66 3-chloroanilino amino 10’’ 122 (±5)
67 4-ctiloroanilino amino 10’5 141.7 (±6)
69 3-fluoroanilino amino 10’5 113.2 (±10)
70 4-fluoroanilíno amino 10’’ 136 (±7)
72 3-hydroxyanilino amino I0·5 119,8(± 15)
74 2-methoxyanilino amino I0'5 108 (± 13)
75 3-methoxyanilino amino I0’5 123.6 (± 19)
80 3-chloroanilino thio 105 106 (±4)
81 4-chloroanilino thio 10’5 122.9 (±5)
83 3-fluoroanilino thio 10'5 133.5 (±11)
88 3-metlioxyanilino thio IQ-5 113.4 (± 15)
96 3-chloroanilino methylthio IO-J 145.8 (±23)
98 3-fluoroanilino methylthío 10’5 142.5 (± 15)
103 3-methoxyanilino methylthio 10'5 156.4 <± 18)
11 3-chloroanilino methyl 10’5 12I.7(±5)
113 3-fluoroanilino methyl 10’5 120.2 (±6)
118 3-methoxyanilino methyl 10-’ 144.2 (±8)
Příklad 25 ln vitro cytotoxická aktivita nových derivátů
Nízká cytotoxicita je nezbytná pro použití těchto látek v kosmetice. Jedním z parametrů používaných jako základ pro cytotoxickou analýzu jc metabolická aktivita životaschopných buněk. Například mikrotitrační analýza, kde se používá Calcein AM, je dnes rozšířena jako metoda kvantifikace buněčné proliferace a cytotoxicity. Tento test je využíván v programech pro screening léků a pro testy chcmosensitivity. Testem se rozpoznají pouze životaschopné buňky. Množství zredukovaného Calceinu AM odpovídá počtu životaschopných buněk v kultuře.
* « ·
Lidská T-lymfoblastická leukemická buněčná linie CEM, promyelocytární HL-60 a monocytární U937 leukemie, buněčné linie prsního karcinomu MCF-7, buňky ccrvikálního karcinomu HELA, myší fibroblasty NIH3T3, lidská erythroleukemie K.562, buňky G361 lidského maligního melanomu byly použity pro rutinní screening sloučenin. Buňky byly udržovány v Nunc/Corning 80 cm2 plastikových lahvích a pěstovány v mediu pro buněčné kultury (DMEM obsahující 5 g/l glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 10 % fetálního telecího séra a hydrogenuhlÍčitan sodný), sloučeniny byly připraveny podle postupu podle předloženého vynálezu.
Buněčné suspenze byly připraveny a naředěny podle typu buněk a podle očekávané konečné hustoty buněk (104 buněk na jamku na základě charakteristik buněčného růstu), pipetovalo sc 80 μΐ buněčné suspenze na 96-jamkové mikrotitrační destičky. Inokuláty byly stabilizovány 24 hodinovou prcinkubací při 37 °C v atmosféře 5% CO2. Jednotlivé koncentrace testovaných látek byly přidány v čase nula jako 20 μΐ alikvotní podíl do jamek mikrotitračních destiček. Obvykle sc sloučeniny ředily do šesti koncentrací v čtyřnásobné ředící řadě. Při rutinním testování byla nejvyšší koncentrace v jamce 166,7 μΜ, změny této koncentrace závisí na dané látce, Všechny koncentrace byly testovány v triplikátech. Inkubace buněk s testovanými deriváty trvala 72 hodin při 37 °C, 100 % vlhkosti a v atmosféře 5% CCA . Na konci inkubační periody byly buňky analyzovány po přidání roztoku Calceinu AM (Molecular Probes) a inkubace probíhala další 1 hodinu, Fluorescence (FD) byla měřena pomocí Labsystem FIA readeru Fluorskan Asccnt (Microsystems). Přežití nádorových buněk (tumor cell survival-TCS) bylo spočítáno podle následujícího vztahu: Gl50=(FDjamka s derivátem /FD^gutroini jamka ) x 100 %, Hodnota GI50, která odpovídá koncentraci látky, kdy je usmrceno 50 % nádorových buněk, byla vypočtena ze získaných dávkových křivek.
Nulová cytotoxicita je základním předpokladem pro použití těchto látek v zemědělských aplikacích. Pro vyhodnocení protinádorové aktivity byla testována toxicita nových derivátů na panelech obsahujících buněčné linie rozdílného histogenetického a druhového původu (Tab. 14). Ukázalo se, že pro všechny testované nádorové linie bylo působení nových sloučenin srovnatelné, kdežto nemaligní buněčné linie, tzn. ΝΙΠ3Τ3 fibroblasty a normální lidské lymfocyty, byly vůči tomuto působení rezistentní. Sloučeniny uvedené v tab. 14 je možné rozdělit do 2 skupin. První skupina obsahuje “klasické cytokininy” reprezentované 6-substituovanými puriny (jejich působení jejíž známé). Druhá skupiny zahrnuje nové substituované 6-anilinopurinové deriváty. Tyto výsledky naznačují, že ·«·· ·· · * · • ···««· ·· ·· ·* ··· · » · ·♦· ·· β ·* * ·· · substituce v pozici 2 purinového skeletu vede obecně k poklesu cytotoxické aktivity ve srovnání s „klasickými cytokininovýmí“ analogy. Jak je ukázáno v tabulce 14, GI50 pro NIH3T3 fibroblasty a normální lidské lymfocyty byla vždy vyšší než 166,7 μΜ. Nové deriváty vykazují nulovou toxicitu pro normální i nádorové buňky v koncentracích okolo
166,7 μΜ a jsou proto mnohem vhodnější pro zemědělské a kosmetické aplikace než “klasické cytokininy” (6-substituované deriváty purinu).
Tabulka 14
Cytotoxicita nových sloučenin pro různé nádorové buňky
Použitá buněnčá linie i Gbo (pmol/L)
Sloučenina HOS K-562 MCF7 B16-F0 ΝΙΠ-3Τ3 G-361 CEM H1.60
kinetin >166.7 164.1 >166.7 >166.7 155.1
isopentenyladenin >166.7 146.9 >166,,7 >166.7 92,2 >166.7
benzyladenin >166.7 138.9 166,1 >166.7 >166.7 >166.7
/ranj-zeatin >166.7 >166.7 >166.7 >166.7
wefo-topolin >166.7 128.4 >166.7 90.6 >166.7 >166.7 90.1 79.2
orí/w-topolin >166,7 >166.7 >166.7 150 >166.7 103.4 69.2 78
adenin >166.7 >166.7 >166.7 >166,7 >166.7
1 >166.7 >166.7 >166.7 >166.7
3 >166,7 >166.7 >166.7 >166.7
4 >166.7 >166.7 >166.7 >166.7 >166.7
6 >166.7 >166.7 >166.7 >166.7
9 >166.7 >166.7 >166.7
12 >166.7 >166.7 >166.7
40 >166.7 >166.7 >166.7 >166.7
42 >166.7 >166.7 >166.7 >166.7
48 >166.7 >166.7 >166.7 >166.7
51 >166.7 >166.7 >166,7
64 >166.7 >166.7 >166.7
66 >166.7 >166.7 >166.7
72 >166.7 >166.7 >166.7
73 >166.7 >166.7 >166.7
78 >166.7 >166.7 >166.7
83 >166.7 >166.7 >166.7
87 >166.7 >166.7 >166.7
94 >166.7 >166.7 >166.7
101 >166.7 >166.7 >166.7
103 >166.7 >166.7 >166.7
116 >166.7 >166.7 >166.7
131 >166.7 >166.7 >166,7
Příklad 26 , · .,, * · ...
···· ·»« ·· , ,,,,,.· ,· * ♦ ·· ,,, ··· ·,.
,· , ·· · ·· ·
Zpomalení vzniku, případně reverze senescentniho fenotypu normálních lidských fihroblastů
V tomto příkladu byly pro studium β-galaktosidázovč aktivity použity lidské diploidní fibroblasty (HCA buňky s rozdílnou úrovní pasažování: pasáž 25 - označení HCA25; pasáž 45 - označení HCA45; pasáž 80 - označení HCA80). Medium použité pro kultivaci buněk bylo odstraněno, buňky byly promyty 2-krát PBS a fixovány ve 2-3 ml fixačního činidla skládajícího se zc 2% formaldehydu a 0,2% glutaraldehydu v PBS. Buňky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 5 min. a poté 2-krát promyty PBS. Buňky byly pak inkubovány při 37 °C (bez CO2) po dobu 1 až 16 hodin ve 2-3 ml roztoku obsahujícího ferrikyanid draselný (5 mM), ferrokyanid draselný (5 mM), MgCh (2 mM), Xgal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-p-D-galaktopyranosid) (1 mg/ml), v citrát/fosfátovém pufru, pH 6.0) Po této inkubační periodě byly buňky pozorovány mikroskopicky za účelem zjištění senescentních buněk anebo pro měření intenzity zabarvení při 415 nm spektrofotometricky pomocí readeru Multiscam MCC (Labsystems) (positivně senescentní buňky). V těchto experimentech byly označeny pouze senescentní buňky a to díky účinku β-galaktosidasy na substrát.
Tabulka 15
Vliv nových sloučenin na počet senescentních buněk v kultuře lidských fihroblastů • · · • · « · « · · · · * · « «· · • · · « · * « • · · • · · ♦ • · · «4 ·
Sloučenina Senescentní buňky (%)
IICA25 HCA50 IICA80
Kinetin 3 5 38
2-chloro-6-(4-hydroxyaniIino)purin 4 6 22
2-chloro- 6-(j-methoxyanilino)purin 5 5 24
2-chloro-ó-(4-methoxyanilíno)purin 4 3 26
2-chloro-6-(3-methoxy-4hydroxyanilino)purin 4 6 25
2-amino-(4-hydroanilino)purin 3 4 21
2-methyithio-6-(4hydroxy anilinojpurin 4 6 34
2-fluoro-6-(4-hydroxyanilino)purin 3 4 18
2-fluoro- 6-(3-methoxyanilino)purin •Ί .7 5 29
2-amino-ó-(3-methoxyanilino)purín 4 4 22
2-ch loro-6-(3-methoxy-4 hydroxyanilino)purin 4 6 31
2-amino-(4-hydroxyanilino)purin 4 4 18
Se zvyšujícím se počtem pasáží docházelo k /intenzívnění zabarvení. U nejstarších buněk byly pozorovány pouze buňky od jasně modré až po tmavě matnou barvu. Substituované 6anilinopurinové deriváty byly obecně mnohem efektivnější než kinctin při udržování nižší hladiny senescentních buněk po 80 pasáži.
Příklad 27
Protizánětlivá aktivita nových substituovaných 6-anílinopiirinů
Protizánětlivá aktivita několika substituovaných 6-anilinopurinů byla stanovena na buněčné linii krysího gliomu C6 (A TCC No. CCL107). Jako kontrola byl použit kinetin. Buňky byly pěstovány v jedné vrstvě v chemicky definovaném médiu bez přídavku séra. Kultivační médium mělo následující složení: Ilamovo médium F10 t minimální esenciální médium (1:1 v/v), 2 mM L-glutamin, 1 % (v/v) minimální esenciální vitamíny (lOOx), 1 % (v/v) minimální neesenciální aminokyseliny (lOOx), 100 U/ml penicilín, 100 mg/ml streptomycin a 30 nM seleničitan sodný. Inkubace probíhala při 37 °C a 100 % vzdušné vlhkosti. Experimenty byly prováděny v logaritmické růstové fázi při hustotě buněk 2,5x105 bunek/cm .
·* · . , , * ·· · ·· · • t I··· »·»· ···· ·(( 4 · » · · · ·· · ·· » ·· ·
Syntéza cAMP byla indukována přídavkem 5 mM (-)-isoproterenolu, který byl k buněčným kulturám přidáván zároveň s testovanou látkou, inkubace probíhala 30 minut, cAMP bylo stanoveno pomocí ELISA (cAMP-enzyme ímmunoassay kit firmy Amersham). Hodnoty I50 byly odečteny z kalibrační křivky. Stanovení bylo provedeno v duplikátu. Výsledky byly následující:
Sloučenina Protizánčtlivá aktivita
l5o (μΜ) Účinek
Kinetin (6-furfury laminopurin) 0 neaktivní
2-chloro-6-(2“hydroxyanílino)purin 25 Inhibice
2-chloro-6-(4-hydroxyanilino)purín 13 Inhibice
2-chloro-ó-(3mctho.xybenzylamino)purin 7 Inhibice
2-chloro-6-(3,5dimethoxybcnzylamino)purin 11 Inhibice
Substituované 6-aniIinopuriny vykázaly protizánětlivou aktivitu. Kinetin byl neúčinný.
Příklad 28
Vliv látek na adherenci ftbroblastů
Test adhcrenční schopnosti buněk je jednou z metod hodnocení akutní toxicity látek vůči adherentním buňkám. Testovaná látka se přidá do média s definovaným počtem ztrypsinizovaných buněk a po stanovené době se spočítá počet buněk přisedlých ke dnu kultivační nádoby. V experimentu jsme použili lidské diploidní íibroblasty BJ (19. pasáž) ve standardním kultivačním médiu (OMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu. 100 pg/ml streptomycinu a 10% fetálního telecího séra). Počty přisedlých buněk byly stanoveny po 6 hodinách, Experiment byl proveden v triplikátu. Výsledky ukazuje Obr.4.
Procento buněk adherovaných k povrchu nebylo významně ovlivněno 2-chlor-6-(4hydroxyanilinojpurinem v koncentračním rozmezí od 40 do 200 μΜ, látka tedy nevykazuje vůči fibroblastům akutní toxicitu.
Příklad 29
Sledováni in vitro viability lidských diploidních fibroblastůpomocí MTT • · « «
MTT test je standardní kolorimetrickou metodou pro měření proliferacc a přežívání buněk. Žluté MTT je v metabolicky aktivních buňkách redukováno na fialový formazan a ten je stanoven spektrofotometricky. Diploidní lidské fibroblasty BJ (19. pasáž) byly vysety do 96 jamkové mikrotitrační desky v počtu 5 000 na jamku, po 6 hodinách bylo médium (DMEM obsahující 5 g/l glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 10% fetálního telecího séra) odsáto a nahrazeno médiem obsahujícím testovanou látku v koncentračním rozmezí 0-200 μΜ. Každá koncentrace byla testována v pentaplikátu, MTT bylo k buňkám přidáno po 72 hodinách (finální koncentrace 0,5 mg/ml) a inkubace probíhala 3 hodiny. Obr. 5 ukazuje výsledky pro 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purin. Z výsledků vyplývá, že látka není pro lidské diploidní fibroblasty toxická.
Příklad 30
Sledování in vitro toxicity na lidských diploidníchfibroblastech vyhodnocením růstové křivky Diploidní lidské fibroblasty BJ (19. pasáž) byly vysety do 24 jamkového panelu po 10 000 buňkách na jamku. Po 6 hodinách bylo médium (DMEM obsahující 5g/l glukózy, 2mM glutaminu, 100 U/ml penicilínu, 100 pg/ml streptomycinu a 10% fetálního telecího séra) odsáto a nahrazeno médiem obsahujícím testovanou látku v koncentračním rozmezí 12,5-400 μΜ. Každá koncentrace byla testována v triplikátu. Počty buněk byly sledovány 12 dní. 7, obrázku 6 je patrné, že sledovaná látka nevykazuje ve sledovaném časovém období toxicitu vůči lidským diploidním libroblasíům.
Příklad 31
Účinek na senescentní lidské diploidní fibroblasty
Přežití buněk: Senescentní diploidní lidské fibroblasty SNF20 (38. pasáž) byly vysety do 24 jamkového panelu po 10 000 buňkách na jamku. Po 6 hodinách bylo médium (DMEM obsahující 5 g/l glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 10% fetálního telecího séra) odsáto a nahrazeno mediem obsahujícím testovanou látku v koncentračním rozmezí
12,5-400 ΠΜ. Každá koncentrace byla testována v triplikátu. Počty buněk byly odečteny 7. a 14. den.
Z obr. 7 je patrné, že 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purin v koncentracích do 200 μΜ nemá výrazný negativní vliv na přežilí senescentníeh buněk ve sledovaném časovém intervalu. Morfologie senescentníeh buněk:
Fibroblasty SNF20 (38. pasáž) byly kultivovány po dobu 14 a 30 dní v přítomnosti • β * ·
2-chIor-6-(4-hydroxyaniIino)purinu v koncentracích od 12,5 do 200 μΜ po dobu 14 a 30 dní. Poté byl aktinový cytoskelet obarven phalloidinem konjugovaným s TRITC a pozorován ve flourescenčním mikroskopu . V případě buněk ovlivněných 25, 50 a 100 μΜ byl zjištěn vyšší podíl morfotypů odpovídajících nižší pasáži, aktinový cytoskelet byl více difúzní a přítomno bylo méně stresových vláken.
Příklad 32
Amesův lest
K vyloučení mutagenního působení 2-chlor-6-(4-hydroxyanílino)purinu byl použit Amesův test. Jako indikátorové kmeny byly použity histidinové auxotrofy Salmonella typhimarium TA98 a TA100 a test byl proveden podle standardních protokolů (Ames et al., Mutation Research, 31, 347-364(1975); Maronctal., Mutation Research, 113, 173-215 (1983)). Látka byla nemutagenní i v koncentracích překračujících mez. rozpustnosti látky v daném médiu (2,5,5,0, 15, 50, 500,1500, a 5000 pg/misku).
Příklad 33
Přípravky
Přípravky ovlivňující růst obvykle obsahují od 0,1 do 99 % (w/w), zejména pak od 0,1 do 95 % (w/w), aktivní složky nebo složek odpovídajících látce nebo látkám vzorce I, od 1 do 99.9 % (w/w), pevných nebo tekutých pomocných látek, a od 0,1 do 25 % (w/w), zejména od 0,1 do 25 % (w/w) surfaktantu. Zatímco komerční přípravky jsou obvykle formulovány jako koncentráty, koncový uživatel používá přípravek ředěný. Přípravek může zahrnovat i další komponenty jako stabilizátoiy, např. rostlinné oleje nebo cpoxidované rostlinné oleje (epoxidovaný kokosový olej 0;I, řepkový olej, podzemnicový olej), protipěnivé látky, např. silikonový olej, konservační látky, látky regulující viskozitu, pojivá, látky zvyšující přilnavost, hnojivá, případně další aktivní složky. Preferované přípravky mají zejména toto složení (uvedena hmotnostní procenta):
Al. Emulgovatelné koncentráty a) b) c) d)
Směs aktivních složek 5% 10% 25% 50%
dodecylbenzensulfonát vápenatý 6% 8% 6% 8%
polyoxycthylovaný ricinový olej
(polyglykol ether ricinového oleje) 4% - 4% 4%
(36 mol ethylen oxid)
oktylfenol polyglykol ether - 4% - 2%
• · • · · • ·♦ · · (7-8 mol ethylen oxid) cyklohexanon - - 10 % 20 % směs aromatických uhlovodíků 85 % 78 % 55 % 16 %
C9-C12
Emulse o vyžadované finální koncentraci mohou být získány z takového koncentrátu zředěním vodou.
A2. Roztoky Směs aktivních složek a) 5% b) 10% c) d) 50% 90%
l-methoxy-3-( 3-methoxy-
propoxy)-propan - 20% 20% -
polyethylenglykol MW 400 20% 10% - -
N-methyl-2-pyrrolidon - - 30% 10%
směs aromatických uhlovodíků 75% 60% - -
C.9-C] 2
Roztoky jsou vhodné k aplikaci ve formě mikrokapének.
A3. Smáčívé prášky a) b) c) d)
Směs aktivních složek 5% 25% 50% 80%
lignosulfonát sodný 4% - 3% -
laurylsulfát sodný 2% 3% - 4%
díisobutylnaňalensuífonát - 6% 5% 6%
sodný
oktylfenol polyglykol ether - 1 % 2% -
(7-8 mol ethylen oxid)
vysoce disperzní kyselina křemičitá 1 % 3% 5% 10%
kaolin 88% 62% 35% -
Aktivní složka je důkladně pronášena s pomocnými látkami a směs je důkladně rozemleta ve vhodném mlýnu. Suspenzi libovolné koncentrace je možné získat smísením vzniklého prachu s vodou.
A4. Potahované granule Směs aktivních složek a) 0,1% b) 5% c) 15%
vysoce disperzní kyselina křemičitá 0.9 % 2% 2%
anorganický nosič 99.0 % 93% 83 %
(0,1-1 mm) např. CaCCý nebo S1O2 • · · · · ·
Aktivní složka je rozpuštěna v methylenchloridu a nasprejována na nosič. Rozpouštědlo je odpařeno ve vakuu.
A5. Potahované granule a) b) c)
Směs aktivních složek 0.1 % 5% 15%
polyethylenglykol MW 200 1.0% 2% 3 %
vysoce disperzní kyselina křemičitá 0.9 % 1 % 2%
anorganický nosič 98.0 % 92% 80%
(AE 0,1-1 mm) např. CaCOj nebo SiO?
Jemně rozemletá aktivní složka je v mixéru stejnoměrně nanesena na nosič zvlhčený polyethylenglykolem. Takto jsou získány neprašné granule.
A6. Exlrudované granule a) b) c) d)
Směs aktivních složek 0.1 % 3% 5% 15%
lignosulfonát sodný 1.5% 2% 3% 4%
karboxymethylcelulosa 1.4% 2% 2% 2%
kaolin 97.0 % 93% 90% 79%
Aktivní složka je smísena a rozemleta s pomocnými látkami a složka je zvlhčena vodou. Směs je extrudována a usušena v proudu vzduchu.
A7. Prachy a) b) c)
Směs aktivních složek 0.1 % 1 % 5%
talek 39.9 % 49% 35%
kaolin 60.0 % 50% 60%
Prachy k přímému použití jsou získány rozemletím aktivní složky s nosičem vc vhodném mlýnu.
A8. Suspenzní koncentrát a) b) c) d)
Směs aktivních složek 3% 10% 25% 50%
ethylen glykol 5% 5% 5% 5%
nonylfenol polyglykol ether- 1 % 2% -
(15 mol ethylen oxid)
lignosulfonát sodný 3% 3% 4% 5%
karboxymethylcelulosa 1 % 1 % 1 % 1%
37 % vodný roztok formaldehydu 0.2 % 0.2 % 0.2 % 0.2%
emulse silikonového oleje 0.8 % 0.8 % 0.8 % 0.8%
* · *
voda 87% 79% 62% 38%
Jemnč rozemletá aktivní složka je smíchána s pomocnými látkami. Vzniklý suspenzní koncentrát umožňuje přípravu suspenze o požadované koncentraci zředěním vodou.
Příklad 34
Gel
Názvy složek jsou uváděna v souladu s terminologií registračních úřadů. Složky jsou uváděny v gramech na 100 g.
Gel /100 g
Aktivní látka 2-chlor-6-(4-hydroxyaniIino)purin (2C14OHAP) úOg
butylhydroxytolucn (Nipanox BHT) 0,2 g
butylparaben (Nipabutyl) 0,2 g
diethylenglykol monoethyl ether (Transcutol P) 10,0 g
bezvodá koloidní silika (Zeopharm 177) 5.0 g
propylenglykol laurát (Lauroglycol FCC) 83,6 g
Konzistence gelu může být dále modifikována přidáním bezvodé koloidní silíky.
Účinek aktivní látky může být zvýšen pomocí transdermální ho systému Transcutol P/Lauroglycol FCC. Bezvodá koloidní silika pravděpodobně zpomalí penetraci účinné látky, což povede k protahovanému účinku.
Příklad 35
Příprava přípravku určeného k aplikaci na kůži (mast)
Názvy složek jsou uváděna v souladu s terminologií registračních úřadů. Složky jsou uváděny v gramech na 200 g
/200 g
aktivní látka 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purin (20401IAP) 2,0 g
butylhydroxytolucn (Nipanox BHT) 0.4 g
200018035611NP
butylparaben (Nipabutyl) 0,4 g
diethylenglykol monoethyl ether (Transcutol P) 20,0 g
3260/02 t ♦ • ♦ ·
glycerol dibehenát 44 (Compritol 888 ATO) 44,0 g
3123/04 propylenglykol laurát (Lauroglycol FCC) 133,2 |
3219/00
Doporučeny postup
Fáze A gramy účinné látky byly rozpuštěny ve 20 g Transcutolu P stálým mícháním v oddělené skleněné nebo nerezové ocelové nádobě při laboratorní teplotě. Rozpouštění může být urychleno zahříváním na maximálně 40 °C,
Fáze B
0,4 gramu Nipanox BIIT a 0,4 g Nipabutylu byly rozpuštěny za stálého míchání při teplotě přibližně 70°C v 133,2 g Lauroglycol FCC. Operace byla provedena v oddělené skleněné nebo nerezové ocelové nádobě. Čirý olejovitý roztok byl zahřát na přibližně 80 °C a v něm bylo za míchání roztaveno 44 g Compritolu 888 ATO. Vzniklý roztok byl ochlazen na přibližně 60 °C a během stálého míchání chladnoucího roztoku smíchán s fází A. Vzniklá bělavá masťovitá hmota byla rozdělena po 15 gramech do plastových nádobek
Příklad 36
Příprava přípravku pro topickou aplikaci na kůži
Složení topického přípravku určeného k aplikaci na kůži (hmotnostní procenta):
Aktivní látka 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purin (2C14OHAP) 0,1 %
Olejová fáze
Cetyl alkohol 5,0 %
Glyceryl monostearát 15,0%
Sorbitan monooleát 0,3 %
Polysorbát 80 USP 0,3 %
Vodná fáze
Mcthylcelulosa 100 eps 1,0 %
Methyl paraben 0,25 % * 1 · • « · · • * · · · · » · ♦ · · «
« · • » ··
45
Propyl paraben 0,15%
Destilovaná voda kvantitativně do 100 %
MethyIcelulosa byla rozpuštěna ve vodě obsahující methyl a propyl paraben. Směs pak byla zahřáta na 72 °C a přimíchána k olejové fázi o teplotě 70 °C. Účinná látka 2C14OHAP byla přidána po ochlazení směsi na 35°C a míchána do vychlazení.
Tento přípravek je určen k aplikaci na kůži na přinejmenším denní bázi dokud se nedostaví požadovaný příznivý efekt (omlazovací účinek).
• « * • · » * « · ···· • ♦ ·
4« * * «
-‘M/l
1. Substituované 6-anilinopiirinové deriváty obecného vzorce I

Claims (12)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    I a jejich farmaceuticky využitelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních ísomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, ve kterých
    R znamená 1 až 5 substituentů nezávisle vybraných ze skupiny zahrnující vodík, halogen, hydroxyl, amino, alkyloxy a alkylovou skupinu,
    R2 znamená amino, halogen, nitro, tliio, alkylthio nebo alkylovou skupinu pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy.
  2. 2. Substituované 6-anilinopurinové deriváty podle nároku l obecného vzorce I ze skupiny zahrnující 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthío, methyl)-6anilinopurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2chloroanilinojpurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methy 1)-6-(3chloroanílino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4chloroanilinojpurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2fluoroanilinojpurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio. methylthio, mcthyl)-6-(3fluoroanilinojpurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4fluoroanilinojpurín, 2-( chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2bromoanilinojpurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3bromoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-ó-(4bromoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(2methoxyanilinojpurín, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methy 1)-6-(3mcthoxyanilinojpurin, 2-(chlora, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2« * • · · • · « · · * • · * * « · ethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3ethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyI)-6-(4ethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2aminoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(3aminoanilinojpurin, 2-(chIoro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4aminoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2methylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3methylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4mcthylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, niethyl)-6-(2hydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3hydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4hydroxyanilino)purin, 2-(chIoro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6(2,3-difluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)6-(2,4’diíluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,3,4-trifluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methy])-6-(2,4,5-trifluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-ó-(2,3-dichloroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,4-dichloroanilmo)purin,2-(chloro, fluoro, bromo, amino. nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(2,4-dimethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro. bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-ó-(2,3-dimcthoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(3,4-dimethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,5dimethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethy])-6-(3,4,5-trimethoxyanilino)purin, 2-(amino, chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(2,4,6-lrimethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methy])-ó-(2,3-dimethylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-ó-(2,4-dimcthylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amíno, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3,4-dimethylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(3,5-dinielhylanilino)purin, 2(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, cthyl)-6-(2,3dihydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6(2,4-dihydroxyanilino)purin, 2-(ehloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, tnethyl)-6-(2,5-dihydroxyanilino)purin, 2-(amino, chloro, fluoro, bromo, amíno, nitro, thio, • · • · * » · · · · * • » methylthio, methyl)-6-(3,5-díhydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-hydroxy-2-mcthylanilino)purin, 2*(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyI)-ó-(3-hydroxy-4-methylanilino)purin, 2-(chIoro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-hydroxy-5-methylanilino)purin, 2-(chIoro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-hydroxy-2methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3hydroxy-4-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methy])-6-(2-hydroxy-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-ó-(2-hydroxy-5-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyanilino)purin, 2-(amino, chloro, fluoro, hydroxy, thio, methylthio, methyl)-6-(2-chloro-4-methoxyanilino)purin, 2(amino, chloro, fluoro, bromo, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-chloro-5methoxyanilinojpurin, 2-(amino, chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-chloro-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-bromo-3-methoxyanílino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, antino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-methoxy-3-chloroaniJino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-methoxy-4-chloroanilino)purin, a jejich farmaceuticky využitelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy.
  3. 3. Substituované 6-anilinopurinové deriváty podle nároku 2 obecného vzorce I ze skupiny zahrnující s výhodou 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio. mcthyl)-6-(3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(2-hydroxy-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-chloro-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyI)-ó-(2-bromo-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-hydroxyanilino)purin, a jejich farmaceuticky využitelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či antiny ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy, • *
  4. 4. Substituované 6-anilinopurínovč deriváty obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2 pro použití jako inhibitorů cytokinin oxidasy, zejména pro zpomalení senescence buněk roštím, živočichů, mikroorganismů, kvasinek a hub.
  5. 5. Substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce 1 podle nároku 1 nebo 2 obecného vzorce I pro použití jako inhibitoru cytokinin oxidasy pro zpomalení senescence savčích pokožkových buněk, zejména keratinocytů a fibroblastů.
  6. 6. Substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce 1 podle nároku 1 nebo 2 pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy ve tkáňových kulturách ke stimulaci proliferace a morfogeneze.
  7. 7. Substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2 pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy pro zvýšení výnosu a kvality zemědělských produktů.
  8. 8. Substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce 1 podle nároku 1 pro použití pro výrobu přípravků používaných ke klonování rostlinných i savčích zárodečných buněk a embryí, s výhodou oocytů.
  9. 9. Substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce 1 podle nároku 1 pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy na potlačení imunostimulace nebo při supresi rcjekcc transplantovaných orgánů u savců.
  10. 10. Substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce I podle nároku 1 pro použili jako inhibitory cytokinin oxidasy při produkci užitkových rostlin
  11. 11. Kosmetické, farmaceutické a růstově-regulační přípravky, vyznačující se tím, žc obsahují alespoň jeden substituovaný 6-anilinopurinový derivát obecného vzorce I nebo jeho sůl s alkalickým kovem, amoniakem či aminem ve formě raccmátu nebo opticky aktivního isomeru, nebo jeho adiční soli s kyselinou, včetně pomocných látek.
    • · · • · · * • · t ♦ · • » · * β • » · · · • * * · · • · · ♦ · · • · · · · •« ♦
  12. 12. Použití substituovaného 6-anilinopurinového derivátu obecného vzorce I nebo jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě raccmátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami pro přípravu přípravku pro použití pro inliibici cytokinin oxidasy.
    v ·
CZ20070453A 2007-07-04 2007-07-04 Substituované 6-anilinopurinové deriváty jako inhibitory cytokinin oxidasy a prípravky obsahující tyto slouceniny CZ302225B6 (cs)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20070453A CZ302225B6 (cs) 2007-07-04 2007-07-04 Substituované 6-anilinopurinové deriváty jako inhibitory cytokinin oxidasy a prípravky obsahující tyto slouceniny
ES08773244T ES2431926T3 (es) 2007-07-04 2008-07-02 Derivados de 6-anilinopurina sustituidos como inhibidores de citocinina oxidasa/deshidrogenasa y preparaciones que contienen estos derivados
JP2010513636A JP5539866B2 (ja) 2007-07-04 2008-07-02 サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤としての置換６−アニリノプリン誘導体および該置換６−アニリノプリン誘導体を含む製剤
AU2008271800A AU2008271800B2 (en) 2007-07-04 2008-07-02 Substituted 6-anilinopurine derivatives as inhibitors of cytokinin oxidase/dehydrogenase and preparations containing these derivatives
EP08773244.2A EP2173173B1 (en) 2007-07-04 2008-07-02 Substituted 6-anilinopurine derivatives as inhibitors of cytokinin oxidase/dehydrogenase and preparations containing these derivatives
PL08773244T PL2173173T3 (pl) 2007-07-04 2008-07-02 Podstawione pochodne 6-anilinopuryny jako inhibitory oksydazy/dehydrogenazy cytokinin i preparaty zawierające te pochodne
BRPI0812865A BRPI0812865B8 (pt) 2007-07-04 2008-07-02 derivados de 6-anilinopurina substituída
US12/666,189 US8222260B2 (en) 2007-07-04 2008-07-02 Substituted 6-anilinopurine derivatives as inhibitors of cytokinin oxidase/dehydrogenase and preparations containing these derivatives
NZ582642A NZ582642A (en) 2007-07-04 2008-07-02 Substituted 6-anilinopurine derivatives as inhibitors of cytokinin oxidase/dehydrogenase and preparations containing these derivatives
CA2691625A CA2691625C (en) 2007-07-04 2008-07-02 Substituted 6-anilinopurine derivatives as inhibitors of cytokinin oxidase/dehydrogenase and preparations containing these derivatives
DK08773244.2T DK2173173T3 (da) 2007-07-04 2008-07-02 Substituerede 6-anilinpurinderivater som inhibitorer af cytokininoxidase/-dehydrogenase og præparater indeholdende disse derivater
PT87732442T PT2173173E (pt) 2007-07-04 2008-07-02 Derivados 6-anilinopurina substituída como inibidores da citoquinina oxidase/desidrogenase e preparações contendo estes derivados
PCT/CZ2008/000074 WO2009003428A2 (en) 2007-07-04 2008-07-02 Substituted 6-anilinopurine derivatives as inhibitors of cytokinin oxidase/dehydrogenase and preparations containing these derivatives

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20070453A CZ302225B6 (cs) 2007-07-04 2007-07-04 Substituované 6-anilinopurinové deriváty jako inhibitory cytokinin oxidasy a prípravky obsahující tyto slouceniny

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2007453A3 true CZ2007453A3 (cs) 2009-02-11
CZ302225B6 CZ302225B6 (cs) 2010-12-29

Family

ID=40226563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20070453A CZ302225B6 (cs) 2007-07-04 2007-07-04 Substituované 6-anilinopurinové deriváty jako inhibitory cytokinin oxidasy a prípravky obsahující tyto slouceniny

Country Status (13)

Country Link
US (1) US8222260B2 (cs)
EP (1) EP2173173B1 (cs)
JP (1) JP5539866B2 (cs)
AU (1) AU2008271800B2 (cs)
BR (1) BRPI0812865B8 (cs)
CA (1) CA2691625C (cs)
CZ (1) CZ302225B6 (cs)
DK (1) DK2173173T3 (cs)
ES (1) ES2431926T3 (cs)
NZ (1) NZ582642A (cs)
PL (1) PL2173173T3 (cs)
PT (1) PT2173173E (cs)
WO (1) WO2009003428A2 (cs)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010047185A1 (ja) * 2008-10-20 2010-04-29 株式会社理研グリーン イネ科雑草用の生育調節剤
CZ306894B6 (cs) 2013-02-08 2017-08-30 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci 2-Substituované-6-biarylmethylamino-9-cyklopentyl-9H-purinové deriváty, jejich použití jako léčiva a farmaceutické přípravky tyto sloučeniny obsahující
US9938279B2 (en) * 2013-04-09 2018-04-10 Energenesis Biomedical Co., Ltd Method for treating disease or condition susceptible to amelioration by AMPK activators and compounds of formula which are useful to activate AMP-activated protein kinase (AMPK)
ES2975192T3 (es) * 2013-12-11 2024-07-03 Fine Agrochemicals Ltd Concentrado para la regulación del crecimiento de plantas dispersable en agua y procesos para fabricar y usar el mismo
WO2016095881A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Univerzita Palackeho V Olomouci Substituted 6-anilino-9-heterocyclylpurine derivatives for inhibition of plant stress
ITUB20153115A1 (it) * 2015-08-13 2017-02-13 Diapath S P A Nuova composizione fissativa per campioni di materiale biologico.
GB201610264D0 (en) 2016-06-13 2016-07-27 Syngenta Participations Ag Pesticidal compositions
PH12018502599B1 (en) 2016-06-14 2023-05-10 Syngenta Participations Ag Use of 6-anilino purine derivatives to improve heat stress tolerance of rice seedlings
JP7037508B2 (ja) * 2016-06-14 2022-03-16 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 非生物的ストレス耐性
CA3040286A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 Nimbus Lakshmi, Inc. Tyk2 inhibitors and uses thereof
US11452714B2 (en) 2017-05-23 2022-09-27 Regents Of The University Of Minnesota Antibacterial agents including histidine kinase inhibitors
CR20200259A (es) * 2017-12-12 2020-11-12 Syngenta Participations Ag Regulación del crecimiento de plantas
CN108371662B (zh) * 2018-02-06 2023-03-03 中国药科大学 一种五元杂环并嘧啶类化合物的应用
CN110407836B (zh) * 2019-08-15 2022-03-29 沈阳化工研究院有限公司 一种9-（2-甲氧基乙基）-9h-嘌呤-6-胺衍生物及其应用
CN110642859B (zh) * 2019-10-11 2021-11-09 青岛科技大学 一种含嘧啶硫酮嘌呤类化合物及其用途
CZ309368B6 (cs) * 2020-05-17 2022-10-12 Univerzita Palackého v Olomouci Mesylátové soli heterocyklických cytokininů, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použití
WO2022012702A1 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Univerzita Palackeho V Olomouci Nitrogen heterocyclic cytokinin derivatives, compositions containing these derivatives and use thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3118753A (en) * 1961-04-14 1964-01-21 Shive William Plant growth stimulating composition and method employing mixtures of a gibberellic acid and purine compound
EP0155911A1 (de) * 1984-03-19 1985-09-25 Ciba-Geigy Ag Purinderivate zur Regulierung des Pflanzenwachstums
JP3103375B2 (ja) * 1991-05-16 2000-10-30 セネテック・ピーエルシー 老化の不都合な影響を改善するための方法および組成物
US5663154A (en) * 1992-01-06 1997-09-02 Glaxo Wellcome Inc. 2',3'-dideoxy-3'-fluoro-purine ribonucleosides
AU7296896A (en) * 1995-11-01 1997-05-22 Novartis Ag Purine derivatives and processes for their preparation
EP0888057B1 (en) 1996-03-15 2001-09-05 Syngenta Participations AG Herbicidal synergistic composition and method of weed control
CZ294535B6 (cs) * 2001-08-02 2005-01-12 Ústav Experimentální Botaniky Avčr Heterocyklické sloučeniny na bázi N6-substituovaného adeninu, způsoby jejich přípravy, jejich použití pro přípravu léčiv, kosmetických přípravků a růstových regulátorů, farmaceutické přípravky, kosmetické přípravky a růstové regulátory tyto sloučeniny obsahující
US20070161582A1 (en) * 2003-08-08 2007-07-12 Dusan Mijikovic Pharmaceutical compositions and methods for metabolic modulation
US20050124637A1 (en) * 2003-08-15 2005-06-09 Irm Llc Compounds and compositions as inhibitors of receptor tyrosine kinase activity
GB0407723D0 (en) * 2004-04-05 2004-05-12 Novartis Ag Organic compounds

Also Published As

Publication number Publication date
US8222260B2 (en) 2012-07-17
WO2009003428A2 (en) 2009-01-08
CA2691625A1 (en) 2009-01-08
AU2008271800A1 (en) 2009-01-08
BRPI0812865B8 (pt) 2022-09-20
AU2008271800B2 (en) 2013-10-17
EP2173173B1 (en) 2013-07-24
BRPI0812865A2 (pt) 2014-10-07
JP5539866B2 (ja) 2014-07-02
CA2691625C (en) 2014-12-09
WO2009003428A3 (en) 2009-09-03
NZ582642A (en) 2011-06-30
JP2010531818A (ja) 2010-09-30
PT2173173E (pt) 2013-10-22
CZ302225B6 (cs) 2010-12-29
US20100190806A1 (en) 2010-07-29
PL2173173T3 (pl) 2014-07-31
EP2173173A2 (en) 2010-04-14
ES2431926T3 (es) 2013-11-28
DK2173173T3 (da) 2013-11-04
BRPI0812865B1 (pt) 2019-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ2007453A3 (cs) Substituované 6-anilinopurinové deriváty jako inhibitory cytokinin oxidasy a prípravky obsahující tyto slouceniny
EP2203451B1 (en) Substituted 6-(alkylbenzylamino)purine derivatives for use as cytokinin receptor antagonists and preparations containing these derivatives
US20060166925A1 (en) Substitution derivatives of n6-benzyladenosine, methods of their preparation, their use for preparation of drugs, cosmetic preparations and growth regulators, pharmaceutical preparations, cosmetic preparations and growth regulators containing these compounds
CZ294535B6 (cs) Heterocyklické sloučeniny na bázi N6-substituovaného adeninu, způsoby jejich přípravy, jejich použití pro přípravu léčiv, kosmetických přípravků a růstových regulátorů, farmaceutické přípravky, kosmetické přípravky a růstové regulátory tyto sloučeniny obsahující
US10093675B2 (en) 6,8-disubstituted-9-(heterocyclyl)purines, compositions containing these derivatives and their use in cosmetic and medicinal applications
US10662194B2 (en) Substituted 6-anilino-9-heterocyclylpurine derivatives for inhibition of plant stress
US9220269B2 (en) Use of 6-substituted 9-halogenalkyl purines for regulation of growth and development of whole plants, plant cells and plant organs; novel 6-substituted 9-halogenalkyl purines
US20130072506A1 (en) 6,8-disubstituted purine compositions
EP4178959B1 (en) Nitrogen heterocyclic cytokinin derivatives, compositions containing these derivatives and use thereof
EP4153592B1 (en) Mesylate salts of heterocyclic cytokinins, compositions containing these derivatives and use thereof
CZ310363B6 (cs) Krystalická forma 1-fenyl-3-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny, přípravky ji obsahující, a její použití
CZ2014613A3 (cs) Deriváty 1,2,3-thiadiazol-5-yl močoviny, jejich použití pro regulaci senescence rostlin a přípravky obsahující tyto deriváty