JP2010531818A

JP2010531818A - サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤としての置換６−アニリノプリン誘導体および該置換６−アニリノプリン誘導体を含む製剤

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Publication number: JP2010531818A
Application number: JP2010513636A
Authority: JP
Inventors: スピハル，ルカーシュ; ゲムロトヴァ，マルケータ; ザトロウカル，マレク; フレボートヴァ，イトカ; ガルスズカ，ペトル; ヴェルナー，トーマス; シュミリング，トーマス; ドレジャル，カレル; ストルナド，ミロスラヴ
Original assignee: ウニヴェルジタパラケーホヴオロモツ; シュミリング，トーマス; ヴェルナー，トーマス
Priority date: 2007-07-04
Filing date: 2008-07-02
Publication date: 2010-09-30
Anticipated expiration: 2028-07-02
Also published as: US8222260B2; PT2173173E; BRPI0812865A2; ES2431926T3; EP2173173A2; CZ2007453A3; EP2173173B1; PL2173173T3; WO2009003428A3; JP5539866B2; BRPI0812865B1; CA2691625C; AU2008271800B2; DK2173173T3; CA2691625A1; US20100190806A1; CZ302225B6; NZ582642A; WO2009003428A2; BRPI0812865B8

Abstract

本発明は、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤として用いる、一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリンの誘導体に関し、式中、Ｒは、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルキロキシ基、アルキル基を含む群から独立に選択された１〜５個の置換基を示す。Ｒ２は、アミノ基、ハロゲン原子、ニトロ基、チオ基、アルキルチオ基、またはアルキル基を示す。また、本発明は、これら誘導体を含む組成物に関する。

Description

本発明は、置換６−アニリノプリン誘導体、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤としての該置換６−アニリノプリン誘導体の利用、および該置換６−アニリノプリン誘導体を含む製剤に関する。

近年、６置換−アニリノプリンは、生化学の分野において、その重要性が高まってきている。この種の化合物には、植物の成長を促進し、サイトカイニンと称する成長調整剤の群に属するものがある（非特許文献１）。サイトカイニン活性を有すると分かった最初の分子として、キネチン（Ｎ⁶−フルフリルアデニン）がある。キネチンは、もともとは加熱滅菌したニシン精子ＤＮＡから単離されたものである（非特許文献２）。キネチンの近縁種であるサイトカイニンは、可溶性ＲＮＡにおける修飾塩基としても生じる（非特許文献３）。酵母や植物、動物のセリンｔＲＮＡやチロシンｔＲＮＡでは、サイトカイニンはアンチコドンに隣接している。哺乳類細胞培養物の成長は、サイトカイニン活性を有するある種のＮ⁶−置換アデノシンによって抑制される（非特許文献４）。

サイトカイニンは、植物の発達を多くの面で調整する重要な植物ホルモンである。最近のサイトカイニン代謝またはシグナル伝達が変質した遺伝子導入植物に関する研究により、サイトカイニン欠乏またはサイトカイニン感知阻害がもたらす興味深い結果が明らかになった（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。外因的応用によるサイトカイニン量の調節またはサイトカイニン分解に関わる主要な酵素であるサイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼ（ＣＫＸ，EC1.5.99.12）を介したサイトカイニンの内生量の遺伝的な調整は、すでに農業への応用の可能性が見出されている。例えば、サイトカイニンの外因的応用により、トマトが開花するまでの時間が短くなったり（非特許文献８）、オオムギの雄性不稔性が回復したり（非特許文献９）することが分かっている。トウモロコシにおけるＣＫＸの葯および花粉に特異な発現は、もともとは非雑種だった作物の雑種を生産するために雄性不稔性を生成するための潜在的なツールと見られていた（非特許文献１０）。最近の研究により、ＣＫＸが米穀生産の調整に関与していることが報告された（非特許文献１１）。

国際出願公開公報ＷＯ９７／３４４８５号

Letham, Ann. Rev. Plant. Physiol. 18, 349, 1967 Miller et al., 1955, J. Am. Chem. Soc. 77：1392 Skoog et al., Science 154：1354,1966 Grace et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 8：23, 1967 Werner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98：10487, 2001 Werner et al, Proc. Plant Cell 15：2532, 2003 Riefler et al., Plant Cell 18：40, 2006 Sawhney and Shukla, Am. J. Bot. 81：1640, 1994 Ahokas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79：7605, 1992 Huang et al., 2003 Ashikari et al., Science 309：741, 2005 "McCutcheon's Detergens and Emulsifiers Annual" MC Publishing Corp., Ridgewood New Jersey, 1981 Stache, H., "Tensid-Taschenbuch" Carl Hanser Verlag, Munich, 1981 M. and J. Ash, "Encyclopedia of Surfactants", Vol.1-3, Chemical Publishing Co., New York, 1980-81 Beach et al., 1992 Kim Hak Sung et al., ; J. Med. Chem. 46; 23; 2003; 4974-4987 Rodenko et al., ; J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 5957-5963 Ames et al., Mutation Research, 31, 347-364 (1975) Maron et al., Mutation Research, 113, 173-215 (1983)

最近、本発明者らは、新規ＣＫＸ阻害剤が２−置換６−アニリノプリンに基づいて生成されることを見出した。特定のＣＫＸ阻害剤を調製する上で最も有望な置換基としては、２−クロロ基、２−フルオロ基、および２−アミノ基がある。

本発明の目的は、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの抑制における選択性および効率指数が改善されたサイトカイニン類似体、すなわち、既知の類似体に比べて毒性が低く、かつ、より有効なサイトカイニン類似体を提供することである。

本発明の目的は、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤として用いるための、一般式Ｉ

（式中、Ｒは、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルキロキシ基、アルキル基を含む群から独立に選択された１〜５個の置換基を示す。Ｒ２は、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤として用いるアミノ基、ハロゲン原子、ニトロ基、チオ基、アルキルチオ基、またはアルキル基を示す）
で示される置換６−アニリノプリン誘導体、または、ラセミ化合物もしくは光学活性異性体の形態での上記置換６−アニリノプリンの誘導体と、アルカリ金属、アンモニアもしくはアミンとの薬学的に受容可能な塩、あるいは、これらの酸との付加塩を提供することである。

一般的な置換基は、本明細書に記載された対応する基の定義と意味が同じである。すなわち、
アミノ基は、−ＮＨ₂基を示し、
ハロゲン原子は、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、およびヨウ素原子を含む群から選択される原子を示し、
ニトロ基は、−ＮＯ₂基を示し、
チオ基は−ＳＨ基を示し、
アルキル基は、１〜６個の炭素原子を含む分岐または非分岐アルキル基を示し、
ヒドロキシ基は、−ＯＨ基を示し、
アルキロキシ基は、−ＯＲ基を示し、式中、Ｒは、アルキル基を示し、上記一般的な置換基は、本明細書に記載された対応する基の定義と意味が同じであり、
アルキルチオ基は、−ＳＲ基を示し、式中、Ｒは、アルキル基を示し、上記一般的な置換基は、本明細書に記載された対応する基の定義と意味が同じである。

本発明によると、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤として用いるための、一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリン誘導体の好適なものとしては、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−アニリノプリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−クロロアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３−クロロアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（４−クロロアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−フルオロアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３−フルオロアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（４−フルオロアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−ブロモアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３−ブロモアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（４−ブロモアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−メトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３−メトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（４−メトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−エトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３−エトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（４−エトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−アミノアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３−アミノアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（４−アミノアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−メチルアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３−メチルアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（４−メチルアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−ヒドロキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３−ヒドロキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（４−ヒドロキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，３−ジフルオロアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，４−ジフルオロアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，３，４−トリフルオロアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，４，５−トリフルオロアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，３−ジクロロアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，４−ジクロロアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，４−ジメトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，３−ジメトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３，４−ジメトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，５−ジメトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３，４，５−トリメトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，４，６−トリメトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，３−ジメチルアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，４−ジメチルアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３，４−ジメチルアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３，５−ジメチルアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，３−ジヒドロキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，４−ジヒドロキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２，５−ジヒドロキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３，５−ジヒドロキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３−ヒドロキシ−２−メチルアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３−ヒドロキシ−４−メチルアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−ヒドロキシ−５−メチルアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３−ヒドロキシ−２−メトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３−ヒドロキシ−４−メトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−ヒドロキシ−５−メトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−クロロ−４−メトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−クロロ−５−メトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−クロロ−３−メトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−ブロモ−３−メトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−メトキシ−３−クロロアニリノ）プリン、および、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−メトキシ−４−クロロアニリノ）プリンが挙げられ、これら、または、ラセミ化合物もしくは光学活性異性体の形態での上記置換６−アニリノプリンの誘導体と、アルカリ金属、アンモニアもしくはアミンとの薬学的に受容可能な塩、あるいは、これらの酸との付加塩である。

特に、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤として用いるための、以下の、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（３−メトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−クロロ−３−メトキシアニリノ）プリン、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（２−ブロモ−３−メトキシアニリノ）プリン、および、２−（クロロ，フルオロ，ブロモ，アミノ，ニトロ，チオ，メチルチオ，またはメチル）−６−（４−ヒドロキシアニリノ）プリンといった置換６−アニリノプリン誘導体、または、ラセミ化合物もしくは光学活性異性体の形態での上記置換６−アニリノプリンの誘導体と、アルカリ金属、アンモニアもしくはアミンとの薬学的に受容可能な塩、あるいは、これらの酸との付加塩が好ましい。

さらなる態様によると、本発明は、少なくとも一つの一般式Ｉで示される化合物、または、ラセミ化合物または光学活性異性体の形態での上記化合物と、アルカリ金属、アンモニア、またはアミンとの塩、上記化合物と酸との付加塩を含み、賦形剤を含有する、成長調整製剤、化粧品製剤、医薬品製剤であってもよい。

他の態様によると、本発明は、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼを阻害するための組成物の調製における、一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリン誘導体、または、ラセミ化合物もしくは光学活性異性体の形態での上記置換６−アニリノプリンの誘導体と、アルカリ金属、アンモニアもしくはアミンとの薬学的に受容可能な塩、あるいは、これらの酸との付加塩の使用であってもよい。

さらなる態様によると、本発明は、特に農産物の収穫率および品質を高めるための、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤としての、一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリン誘導体の使用であってもよい。

さらなる態様によると、本発明は、組織培養における増殖と形態形成を促進するための、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤としての、一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリン誘導体の使用であってもよい。

さらなる態様によると、本発明は、植物、哺乳類、微生物、酵母、および真菌細胞の老化を遅延するための、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤としての、一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリンの誘導体の使用であってもよい。

さらなる態様によると、本発明は、例えば、線維芽細胞および角化細胞といった哺乳類の皮膚細胞の老化を遅延するための、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤としての、一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリン誘導体の使用であってもよい。

さらなる態様によると、本発明は、植物および哺乳類の胚細胞および胚、好ましくは卵母細胞をクローニングするための組成物の調製における、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤としての、一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリン誘導体の使用であってもよい。

さらなる態様によると、本発明は、免疫賦活（例えば、関節炎）の抑制または哺乳類における移植器官の拒絶反応の抑制における、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤としての、一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリン誘導体の使用であってもよい。

さらなる態様によると、本発明は、作物生産における、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤としての、一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリン誘導体の利用であってもよい。作物の具体例としては、穀物（小麦、オオムギ、米、トウモロコシ、ライムギ、オートムギ、サトウモロコシ、およびこれらの近縁種）、ビート（甜菜および飼料用ビート）、ナシ状果、石果、および軟果物（リンゴ、西洋ナシ、プラム、モモ、アーモンド、サクランボ、イチゴ、およびブラックベリー）、豆科植物（豆、レンズ豆、エンドウ豆、大豆）、油脂植物（セイヨウアブラナ、カラシナ、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナッツ、トウゴマ、カカオ豆、ラッカセイ）、キュウリ植物（カボチャ、キュウリ、メロン）、繊維植物（綿、亜麻、麻、黄麻）、かんきつ類の果実（オレンジ、レモン、グレープフルーツ、ミカン）、野菜（ホウレンソウ、クスノキ）、またはタバコ、木の実、ナス、サトウキビ、茶、ブドウ、ホップ、バナナ、天然ゴム、薬草、観賞植物などの植物等が挙げられる。作物には、従来の育種方法または遺伝工学的手法によって、成長因子群に対する耐性を付与されたものも含まれる。

防除対象となる雑草としては、例えば、ハコベ属（Stellaria）、キンレンカ（Nasturtium）、ヌカボ属（Agrostis）、メヒシベ属（Digitaria）、カラスムギ属（Avena）、エノコログサ属（Setaria）、シロガラシ属（Sinapis）、ドクムギ属（Lolium）、ツノナス属（Solanum）、ヒエ属（Echinochola）、アブラガヤ属（Scirpus）、ミズアオイ属（Monochoria）、オモダカ属（Sagittaria）、スズメノチャヒキ属（Bromus）、スズメノテッポウ属（Alopecurus）、セイバンモロコシ属（Sorghum helepense）、ツノアイアシ属（Rottboellia）、カヤツリグサ属（Cyperus）、イチビ属（Abtilon）、キンゴジカ属（Sida）、オナモミ属（Xanbthium）、ヒユ属（Amaranthus）、アカザ属（Chenopodium）、サツマイモ属（Ipomoena）、キク属（Chrysanthemum）、ヤエムグラ属（Galium）、スミレ属（Viola）、クワガタソウ属（Veronica）等の単子葉植物と双子葉植物の両方がある。

一般式Ｉで示される化合物は、未改質の形で用いられるか、好ましくは、調剤分野にて従来から採用されてきた賦形剤と共に用いられる。このため、これらの化合物は、有効成分の濃縮物、懸濁物および分散物、選択的には、等張水溶液、懸濁物および分散物、希釈乳剤、可溶性粉剤、粉末、顆粒、クリーム、ジェル、油懸濁物、および高分子物質などのカプセルとして、好便に製剤される。製剤の種類と同様に、散布、噴霧、撒散、分散、塗布、注入等の適用の方法も、意図する目的や現場の状況に即して選択される。これらの製剤は、殺菌されていてもよいし、または、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤等の中性の賦形剤、栄養素、微量栄養素供与体、または、特別な効果を得るための製剤をさらに含んでいてもよい。

式Ｉで示される化合物は、他の成長調整剤と混合することで、相乗作用をもたらすことができる。

（製剤）
一般式Ｉで示される化合物（有効成分）を含む製剤は、必要に応じて、固形または液状の賦形剤である、例えば、有効成分を溶媒や固形基材等の賦形剤と混ぜ合わせたり挽き合わせたりすることによる既知の方法で調製される。また、表面活性化合物（界面活性剤）を上記製剤に用いてもよい。

好適な表面活性化合物としては、製剤される一般式Ｉで示される化合物の種類にもよるが、良好な乳化性、分散性、湿潤性を有する非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、および／または陰イオン性界面活性剤、並びに上記各界面活性剤の混合物が用いられる。

好適な、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、および陽イオン性界面活性剤としては、例えば、特許文献１である国際出願公開公報ＷＯ９７／３４４８５号に記載されたものが挙げられる。

また、従来から製剤技術において用いられてきた界面活性剤も、本発明に係る置換６−アニリノプリン誘導体に由来するサイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼ阻害剤を含む組成物の調製において好適に用いられる。とりわけ、非特許文献１２、非特許文献１３、および非特許文献１４に記載されたものが好適に用いられる。

サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼ阻害剤を含む製剤の調合には、適用方法にもよるが、通常、０．１重量％〜９５重量％の有効成分、５重量％〜９９．９重量％の固形または液状のアジュバント（佐剤）または薬学的な基材（キャリア）、および０．１重量％〜２５重量％の界面活性剤が用いられる。

市販用の製品は、通常、濃縮物として製剤されるが、たいていの場合、消費者は、希釈した調剤を使用する。組成物は、例えば、安定剤等のさらなる成分を含んでいてもよい。さらなる成分としては、例えば、植物油またはエポキシ化植物油（エポキシ化ココナッツ油、エポキシ化菜種油、またはエポキシ化大豆油）、シリコーン油等の消泡剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤または乳化剤、粘度調整剤、結合剤、粘着剤、および栄養素や他の有効成分等が挙げられる。好適な製剤は、特に、以下のように組成される（ここで、％は重量百分率を示す）。
乳化可能な濃縮物
有効成分混合物：１％〜９０％、好ましくは５％〜２０％
界面活性剤：１％〜３０％、好ましくは１０％〜２０％
液状基材：５％〜９４％、好ましくは７０％〜８５％
粉末
有効成分混合物：０．１％〜１０％、好ましくは０．１％〜５％
固形基材：９９．９％〜９０％、好ましくは９９．９％〜９５％
懸濁濃縮物
有効成分混合物：５％〜７５％、好ましくは１０％〜５０％
水：９４％〜２４％、好ましくは８８％〜３０％
界面活性剤：１％〜４０％、好ましくは２％〜３０％
湿潤可能な粉末
有効成分混合物：０．５％〜９０％、好ましくは１％〜８０％
界面活性剤：０．５％〜２０％、好ましくは１％〜１５％
固形基材：５％〜９５％、好ましくは１５％〜９０％
顆粒
有効成分混合物：０．１％〜３０％、好ましくは０．１％〜１５％
固形基材：９９．９％〜７０％、好ましくは９９．９％〜８５％。

組成物は、例えば、安定剤等のさらなる成分を含んでいてもよい。さらなる成分としては、例えば、植物油またはエポキシ化植物油（エポキシ化された、ココナッツ油、菜種油、または大豆油）シリコーン油等の消泡剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤または乳化剤、粘性調節剤、結合剤、粘着剤、および栄養素や他の有効成分等が挙げられる。

成長調整剤の有害作用から作物を保護するために、一般式Ｉで示される化合物、もしくはそれらを含む組成物を使用するにあたって、以下のような種々の方法や技術が考えられる。

ｉ）種子の被覆
ａ）一般式Ｉで示される化合物の湿潤可能な粉末製剤による種子の被覆を、種子の表面に均一に分散されるまで容器内にて振盪することによって行う（乾燥被覆）。上記操作では、種子１００ｋｇに対して、一般式Ｉで示される化合物（４ｇ〜２ｋｇの湿潤可能な粉末）が約１ｇ〜５００ｇ用いられる。

ｂ）式Ｉで示される化合物の乳化可能な濃縮物によって、方法ａ）に基づいて種子を被覆する（湿潤被覆）。

ｃ）一般式Ｉで示される化合物を１００ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ含む液体に１時間〜７２時間浸漬することによって種子を上記化合物により被覆し、好ましくは、その後に種子を乾燥させる（浸漬被覆）
種子の被覆や発芽した苗木の処理は、標的とする作物全体が有効成分で処理されるため、好適な適用方法とされている。種子１００ｋｇに対して、一般に１ｇ〜１０００ｇ、好ましくは５ｇ〜２５０ｇの解毒剤が用いられるが、方法によっては、他の有効成分や微量栄養素を添加してよい。ここに示した濃度の限界は上下に変動してもよい（反復被覆）。

ｉｉ）タンク混合物としての適用
解毒剤と成長調整剤の混合物（重量比で１０：１〜１：１００）の液剤が用いられる。成長調整剤の適用率は、１ヘクタール当たり０．００５ｋｇ〜５．０ｋｇである。このようなタンク混合物は、播種の前または後に適用される。
ｉｉｉ）播種用のあぜへの適用
式Ｉで示される化合物は、種を播いて埋める前の状態の播種用のあぜに、乳化可能な濃縮物、湿潤可能な粉末、または顆粒の形で導入される。播種用のあぜが覆われたら、発芽前処理として成長調整剤を常法にて適用される。
ｉｖ）有効成分の制御放出
式Ｉで示される化合物は、溶液の状態で鉱物性粒状基材または重合体粒子（ウレア／ホルムアルデヒド）に保持され乾燥される。必要に応じて、有効成分が特定の時間の経過後に一定量ずつ放出されるような被覆を施すことも可能である（被覆顆粒）。

化粧用組成物は、約０．０５％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．１％（ｗ／ｗ）〜２％（ｗ／ｗ）の有効成分を含む。化粧用組成物は、クリーム、エアロゾル、乳液、化粧水、硬膏、湿布、シャンプー、口紅、ペースト、軟膏、ペースト、チンキ剤、スプレー等の形をとる。

軟膏は、水中油型乳剤であり、７０％以下、好ましくは２０〜５０％の水または水相を含む。脂肪相は、特に、例えば、ワセリン、パラフィン油、または固形パラフィン等の炭化水素からなり、好ましくは、水結合能を向上するために、好適なヒドロキシ化合物を含む。好適なヒドロキシ化合物としては、例えば、羊毛脂のような羊毛脂アルコールやセチルアルコール等の脂肪アルコールやそのエステルが挙げられる。乳化剤は、ソルビタン脂肪酸エステル（Spans）、好ましくはオレイン酸ソルビタンまたはイソステアリン酸ソルビタンのような脂肪親和性物質である。水相への添加物としては、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、ポリエチレングリコール等の多価アルコールのような保湿剤、または防腐剤、香料が挙げられる。

脂肪性軟膏は、無水であり、基剤として、特に、パラフィン、ワセリン、パラフィン油等の炭化水素、さらに硬化ココナッツ脂肪酸トリグリセライド、または硬化ラッカセイ油や硬化ヒマシ油のような硬化油等の天然由来または半合成の脂肪、そしてさらにグリセロール・モノ−ステアレート、グリセロール・ジステアレート等のグリセロールの脂肪酸部分エステルを含む。また、脂肪性軟膏は、例えば、水の取り込み量を増加させる、軟膏に関連して言及された脂肪アルコール、乳化剤、および添加物も含む。

クリームは、水中油型乳剤であり、５０％を超える水を含む。使用される油性基剤は、特に、ミリスチン酸イソプロピル、羊毛脂、蜜ろう等の脂肪酸、またはワセリン（ペトロラタム）やパラフィン油等の炭化水素である。乳化剤は、主として親水性を有する表面活性物質であり、例えば、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレンソルビタン脂肪エステル、酸性ポリグリセリン脂肪酸エステル（Tween）のような多価アルコールの脂肪酸エステルまたはそのエチレンオキシ付加体等の対応する非イオン性乳化剤、または通常、セチルステアリルアルコールやステアリルアルコール等の脂肪アルコールの存在下で用いられる、高級アルコール硫酸エステル、好ましくはラウリル硫酸ナトリウムやセチル硫酸ナトリウム、ステアリル硫酸ナトリウムのアルカリ金属塩のようなイオン性乳化剤等が挙げられる。水相への添加物としては、とりわけ、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、ポリエチレングリコールのような多価アルコール等のクリームの乾燥を防ぐ物質、さらには防腐剤、香料が挙げられる。

ペーストは、酸化チタンや酸化亜鉛等の酸化金属のような分泌物吸収性粉末成分を含み、さらには、存在する水分や分泌物をつなぎ止めて維持するための、タルクやケイ酸アルミニウムを含むクリームまたは軟膏である。

油中懸濁物は、油性成分として、一般に注入目的で使用される、植物油、合成油、または半合成油を含む。特筆すべき油としては、８個〜２２個、特に１２個〜２２個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸を酸成分として含む液状脂肪酸エステルがある。長鎖脂肪酸としては、例えば、ラウリル酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、対応する不飽和酸等が挙げられる。対応する不飽和酸としては、例えば、オレイン酸、エライジン酸、ウレカ酸、ブラシジン酸、リノール酸等が挙げられる。適宜、ビタミンＥ、βカロチン、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン等の酸化防止剤を添加してもよい。これら脂肪酸エステルのアルコール成分は、６個以下の炭素原子を有しており、一水酸基または多水酸基、例えば、一価、二価、または多価アルコールである。例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、およびこれらの異性体、特に、グリコールとグリセロールが挙げられる。従って、脂肪酸エステルとしては、例えば、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、「ＬａｂｒａｆｉｌＭ２３７５」（ポリオキシエチレン三オレイン酸グリセリン塩；パリGattefose社製）、「ＬａｂｒａｆｉｌＭ１９４４ＣＳ」（杏仁油のアルコール分解によって調製され、グリセリドとポリエチレン・グリコール・エステルからなる不飽和ポリグリコールグリセリド；パリGattefose社製）、「Ｌａｂｒａｓｏｌ」（ＴＣＭのアルコール分解によって調製され、グリセリドとポリエチレン・グリコール・エステルからなる飽和ポリグリコールグリセリド；パリGattefose社製）、「Ｍｉｇｌｙｏｌ８１２」（鎖長がＣ₈〜Ｃ₁₂の飽和脂肪酸のトリグリセリド；独Huls社製）、特に、綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、大豆油、ラッカセイ油のような植物油等が挙げられる。

発泡体は、加圧容器から取り出される、エアロゾル発泡体状で存在する液状水中油型乳剤である。高圧ガスとしては、ジクロロフルオロメタンやジクロロテトラフルオロエタン等のポリハロゲン化アルカンのようなハロゲン化炭化水素、また、好ましくは、非ハロゲン化ガス状炭化水素、空気、二酸化窒素、二酸化炭素が用いられる。使用される油性相としては、とりわけ、軟膏に関して上述したものや上述の添加物が同様に用いられる。

チンキ剤および溶液は、通常、水性エタノール基剤を含む。この水性エタノール基剤には、グリセロール、グリコール、ポリエチレングリコール等の多価アルコールのような蒸発を抑えるための保湿剤、低級ポリエチレングリコールを有する脂肪酸エステルのようなリオイリング物質、すなわち、エタノールにより表皮から除去された脂肪質の物質を置換すべく水性混合溶媒に可溶である親油性物質、および必要に応じて他の賦形剤や添加物が混合される。

ＣＫＸを過剰に生成した植物を化合物１２によって系統的に処理した後の野生株表現型の相補性を示す図である。図中、「＋」は処理済を示し、「−」は未処理を示す。ＣＫＸを過剰に生成したタバコの根部強化に対する化合物１２の葉面散布の作用を示した図である。図中、「−」は未処理を示し、「＋」は処理済を示す。ＡｔＣＫＸ１シロイヌナズナ苗木の野生株表現型の相補性に対するサイトカイニンおよびＣＫＸ阻害剤の適用の作用を比較した図である。（Ａ）は、ＡｔＣＫＸ１を示し、（Ｂ）は、０．１μＭの化合物１２で栽培したＡｔＣＫＸ１を示し、（Ｃ）は、０．１μＭのＢＡＰで栽培したＡｔＣＫＸ１を示し、（Ｄ）は、野生株表現型の対照植物を示す。シロイヌナズナ植物の開花に対する化合物１２の作用を示した図である。ヒト線維芽細胞の付着頻度に対する２−クロロ−６−アニリノプリンの作用を示すヒストグラムである。各数値は、コントロールの数値に対する相対値にてそれぞれ示されている。３日後の細胞の生存率に対する２−クロロ−６−アニリノプリンの作用を示すヒストグラムである。各数値は、コントロールの数値に対する相対値にてそれぞれ示されている。２−クロロ−６−アニリノプリンで処理されたヒト２倍体線維芽細胞ＢＪの成長曲線を示すグラフである。２−クロロ−６−アニリノプリンで処理した７日後および１４日後の細胞数を示すヒストグラムである。各数値は、コントロールの数値に対する相対値にてそれぞれ示されている。一般式Ｉを示す図である。

式Ｉで示される化合物の出発原料としては、２，６−ジクロロプリンを用いることができる。他の出発原料としては、２−アミノ−６−クロロプリン、または、硝酸ナトリウム水溶液の存在下でテトラフルオロホウ酸との反応によって２−アミノ−６−クロロプリンから合成される２−フルオロ−６−クロロプリンを用いることもできる（非特許文献１５）。

他の出発原料としては、適切な臭素供与体の存在下で亜硝酸ｔ−ブチルとのジアゾ化とその後の臭素化によって２−アミノ−６−クロロプリンから調製される２−ブロモ−６−クロロプリンを用いることもできる（非特許文献１６）。

さらに他の出発材料としては、シュティレのクロスカップリングによって２−クロロ−６−ヨードプリンから調製される２−メチル−６−クロロプリンを用いることもできる（非特許文献１６）。

さらに他の出発材料としては、６−クロロプリンから調製される２−ニトロ−６−クロロ−９−Ｂｏｃ−プリンを用いることもできる（非特許文献１７）。

出発原料の置換フェニルアミンのうち、市販されていないものは、適切な触媒の存在下で対応するアルデヒドから調製した（その他のものはSigma Aldrich社またはFluorochem社から入手した）。より多くの水酸基を有する置換フェニルアミンは、Ｎ₂雰囲気下にて４８％ＨＢｒを用いて適切なメトキシ誘導体をジメチル化することによって調製してもよい。

元素分析（Ｃ、Ｈ、およびＮ）は、EA1108 CHN分析器（Fissons Instruments社製）を用いて行った。融点は、BUCHI社製Melting PointB-540装置を用いて測定された。分析薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲル６０ＷＦ₂₅₄プレート（Merck社製）を用いて行い、移動相としてＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ：濃ＮＨ₄ＯＨ（８：２：０．２，ｖ／ｖ／ｖ）を用いた。

ＥＳ＋質量スペクトルは、Waters社製ZMD2000質量分析計の直接プローブを用いて行った。質量は、１０ａｍｕ〜１５００ａｍｕの間隔でモニタされた。質量スペクトルは、３．０秒シリンドリカルスキャンを用いて、ソースブロック温度１５０℃、脱溶媒化温度８０℃、脱溶媒化ガス流量２００ｌ／ｈで、２５Ｖのサンプルコーン電圧を印加して測定された。質量分析計は、MassLynxデータシステムに直接接続された。

ＮＭＲスペクトルは、それぞれ、温度３００Ｋと３００．１３ＭＨｚ（¹Ｈ）、７５．４８ＭＨｚ（¹³Ｃ）の周波数にて操作された、Brucker社製Avance AV300スペクトロメータにて測定された。サンプルは、化合物をＤＭＳＯ−ｄ₆に溶解することによって調製された。内部標準としては、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を用いた。

２−クロロ−６−アニリノプリン
アニリン（４．６６ｇ；０．０５ｍｏｌ）をｎ−プロパノール（６０ｍｌ）中の２，６−ジクロロプリン（５．６７ｇ；０．０３ｍｏｌ）の懸濁物に加え、Ｎ，Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（６．４４ｇ；０．０５ｍｏｌ）が添加された。反応混合物を１００℃で４時間攪拌した。室温まで冷却した後、沈殿物をろ取し、ｎ−プロパノール（２×１０ｍｌ）と水（３×１０ｍｌ）で洗浄し、恒量になるまで６０℃の乾燥オーブンで乾燥させ、収量６．２６ｇの黄色の物質（収率８４．９％）を得た。

上記物質を、ＴＬＣ（クロロホルム−メタノール；８５：１５）にて確認したところ、単一スポットを示し、出発材料のスポットは検出されなかった。また、上記物質のＨＰＬＣ純度は、９８＋％であった。

２−クロロ−６−（３−クロロアニリノ）プリン
トリエチルアミン（７ｍｌ；０．０５ｍｏｌ）の存在下、ｎ−ブタノール（４０ｍｌ）中で３−クロロアニリン（３．８３ｇ；０．０３ｍｏｌ）に２，６−ジクロロプリン（３．７８ｇ；０．０２ｍｏｌ）を１１０℃で３時間反応させた。室温まで冷却した後、反応混合物を０℃で２時間攪拌した。黄色沈殿物をろ取し、低温ｎ−ブタノール（２×１０ｍｌ）と水（３×１０ｍｌ）で洗浄し、恒量になるまで６０℃の乾燥オーブンで乾燥させ、収量３．９６ｇの黄色結晶性粉末（収率６５．８％）の粗生成物を得た。

粗生成物をイソプロパノールから結晶化し、２．８５ｇの純物質を得た。上記純物質について、ＴＬＣ（クロロホルム−メタノール；８５：１５）にて確認したところ、単一スポットを示し、出発材料のスポットは検出されなかった。上記純物質のＨＰＬＣ純度は、９８＋％であった。

２−クロロ−６−（３−フルオロアニリノ）プリン
本実施例の化合物は、３−フルオロアニリンに２，６−ジクロロプリンを反応させることによって、実施例２と同様に調製された。その後、反応混合物の溶媒をロータリーエバポレーターにて留去し、反応混合物の残留物を酢酸エチルと０．５Ｍの塩酸水溶液とで分画した。有機層を水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、上記有機層の溶媒を留去して、黄色固体（３．７２ｇ）の粗生成物を得た。

粗生成物をフラッシュ・クロマトグラフィーによって精製し、収量２．２０ｇの黄色結晶性の粉末を得た。上記粉末について、ＴＬＣ（クロロホルム−メタノール；８５：１５）にて確認したところ、単一スポットを示した。上記粉末のＨＰＬＣ純度は、９８＋％であった。

２−クロロ−６−（３−ヒドロキシアニリノ）プリン
本実施例の化合物は、ｎ−ブタノール（４０ｍｌ）中にて、２，６−ジクロロプリン（３．７８ｇ；０．０２ｍｏｌ）、３−アミノフェノール（３．２７ｇ；０．０３ｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（６．４４ｇ；０．０５ｍｏｌ）を９０℃で４時間反応させることによって調製された。その後、反応混合物は、室温まで冷却されるまで攪拌された。形成された結晶性沈殿物は、採取され、低温ｎ−ブタノール（３×１０ｍｌ）と水（３×１０ｍｌ）で洗浄され、恒量になるまで乾燥オーブンで乾燥させた。

上記結晶性沈殿物について、ＴＬＣ（クロロホルム−メタノール；８５：１５）にて確認したところ、均一スポットを示した。上記結晶性沈殿物のＨＰＬＣ純度は、９８＋％であった。

２−クロロ−６−（３−メトキシアニリノ）プリン
ｎ−ペタノール（４０ｍｌ）中の２，６−ジクロロプリン（３．７８ｇ；０．０２ｍｏｌ）とｍ−アニシジン（３．６９ｇ；０．０３ｍｏｌ）との懸濁物にトリエチルアミン（７ｍｌ；０．０５ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１００℃で４時間攪拌し、その後、室温まで冷却した。白色沈殿物を採取し、イソプロパノール（２×１０ｍｌ）と水（３×１０ｍｌ）で洗浄した。上記白色沈殿物の粗生成物を活性炭の存在下でメタノールから結晶化することによって精製し、収量４．３６ｇの白色結晶（収率７７．８％）を得た。上記白色結晶について、ＴＬＣ（クロロホルム−メタノール；８５：１５）により確認したところ、単一スポットを示し、出発材料のスポットが検出されなかった。上記白色結晶のＨＰＬＣ純度は、９８＋％であった。

２−アミノ−６−（３−メトキシアニリノ）プリン
ｎ−ブタノール（２０ｍｌ）中の２−アミノ−６−クロロプリン（１．６９ｇ；０．０１ｍｏｌ）とｍ−アニシジン（１．２３ｇ；０．０１ｍｏｌ）との懸濁物にトリエチルアミン（３．５ｍｌ；０．０２５ｍｏｌ）を加えた。得られた高粘度の懸濁物を１１０℃で３時間攪拌した。ＴＬＣにより、出発材料がないこと、および所望の生成物があることが分かった。その後、反応混合物を室温まで冷却した。白色沈殿物をろ取し、ｎ−ブタノール（３×１０ｍｌ）と水（３×１０ｍｌ）で洗浄し、恒量になるまで乾燥オーブンで乾燥させた。収量（収率）は２．１９ｇ（８５％）であった。

上記白色沈殿物の粗生成物を２．５Ｍメタノール性塩化水素からの結晶化によって塩酸塩として精製し、２．１７ｇの略白色の結晶を（塩酸塩として）得た。上記結晶について、ＴＬＣ（クロロホルム−メタノール−ＮＨ₄ＯＨ；４：１：０．０５）にて確認したところ、単一スポットを示し、出発材料のスポットは検出されなかった。上記結晶のＨＰＬＣ純度は、９９＋％であった。

２−フルオロ−６−（３−メトキシアニリノ）プリン
本実施例の化合物は、ｎ−ブタノール（２０ｍｌ）中で２−フルオロ−６−クロロプリン（１．７ｇ；０．０１ｍｏｌ）、ｍ−アニシジン（１．２３ｇ；０．０１ｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（３．５ｇ；０．０２５ｍｏｌ）を９０℃で４時間反応させることによって調製した。その後、反応混合物を室温まで冷却した。白色沈殿物をろ取し、ｎ−ブタノール（３×１０ｍｌ）と水（３×１０ｍｌ）で洗浄し、恒量になるまで乾燥オーブンで乾燥させ、収量５．５５ｇの黄色の結晶性粉末（収率６１％）を得た。上記結晶性粉末について、ＴＬＣ（クロロホルム−メタノール；８５：１５）により確認したところ、単一スポットを示した。上記結晶性粉末のＨＰＬＣ純度は、９９＋％であった。

２−チオキサンチン
４，５−ジアミノ−６−ヒドロキシ−２−チオピリミジン（ＭＷ１５８、Aldrich社製９５％、１００ｇ）を、９０％ギ酸（５００ｍｌ）中にて還流させながら、２時間、機械的に攪拌させた。混合物が固化しはじめたところで、さらにギ酸を１００ｍｌ加えた。混合物を１℃まで氷冷し、その後、ろ取し、減圧下で３０分間乾燥させて、粗４−アミノ−５−ホルムアミド−６−ヒドロキシ−２−チオピリミジンを得た。ろ取した固形分をホルムアミド（２２５ｍｌ）に再懸濁し、流動パラフィン槽において適宜手で攪拌しながら２時間、１７５℃〜１８５℃まで加熱した。続いて、反応混合物は、室温まで冷却され、ろ取された。ろ取物を、約２Ｌの１ＭＮａＯＨに溶解し、濾過され、９５℃で２時間減圧下にて乾燥させた。収量（収率）は１０３ｇ（９７％）であった。

２−ベンジルチオ−６−プリノール
５．２８ｇの８−チオキサンチンを７８．５ｍｌの１ＭＮａＯＨに懸濁し、水で約４００ｍｌに希釈した。（出発材料は、２．５倍過剰の塩基でも完全に溶解しない。）その後、上記懸濁液に、３．７ｍｌの塩化ベンジルを一度に加え、混合物を室温で約３時間激しく攪拌した。上記混合物を、氷酢酸でｐＨ５に調整し、赤色沈殿物を得た。赤色沈殿物を、ろ取し、水でよく洗浄し、減圧下にて８０℃で一晩乾燥させて、７．３３ｇのサーモンピンク色の固体を得た。上記固体をさらに精製することなく用いた。

２−ベンジルチオ−６−クロロプリン
２−ベンジルチオキサンチン（２７．６ｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）をＰＯＣｌ₃（５０６ｍｌ）で覆い、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン（４０ｍｌ）を加えた。混合物を１．５時間還流させた。過剰な酸塩化物を減圧下で除去し、シロップ状物を得た。上記シロップ状物を氷（２ｋｇ）の上に注いだ。冷却しながら水酸化ナトリウムを加え、形成された固体分を溶解した。混合物を濃ＨＣｌでｐＨ１まで酸性にし、固体を得た。上記固体を、ろ取し、水で洗浄し、減圧下にて７０℃で数時間乾燥させた。粗生成物を、粉末状化され、少量のメタノールと混合し、黄色固体を減圧下７０℃で数時間乾燥させた。収量（収率）は１７．５ｇ（５９％）であった。

粗２−ベンジルチオ−６−クロロプリンと２−ベンジルチオキサンチンはＤＭＳＯに素早く溶ける。上記黄色固体について、ＴＬＣ（クロロホルム／ＭｅＯＨ；ｖ／ｖ）にて確認したところ、出発材料のスポットは見出せなかった。粗生成物を、１２５ｇの充填されたシリカの上に載せ、２．５％ＭｅＯＨ／クロロホルムで溶出して、クロマトグラフ的に精製された。上記粗生成物の溶出分７〜３６を乾燥させて黄色固体を得た。

上記黄色固体であるクロマトグラフ的に精製した生成物を５０％ＭｅＯＨ水溶液から再結晶させた。これにより、白色固体を得て、恒量になるまで塩化カルシウムに続いて五酸化リンの上にて４５℃で一晩乾燥させた。収量は３ｇであった。融点は１７６℃〜１７８℃とシャープであり、分解は見られなかった。上記白色固体について、ＴＬＣ（シリカ−５％ＭｅＯＨ／クロロホルム）は、単一の鋭く大きなスポット（０．５３）を示した。上記白色固体のＨＰＬＣ純度は、９５＋％であった。

２−ベンジルチオ−６−アニリノプリン
トリエチルアミン（７．５ｍｌ）の存在下、２−ベンジルチオ−６−クロロプリン（３．９ｇ）とアニリン（３．４２ｇ）をｎ−ＢｕＯＨ（１００ｍｌ）中において２時間還流させた。反応混合物は、室温まで冷却され、ロータリーエバポレーターにより乾燥させ、氷冷され、４００ｍｌの水を加えて激しく振盪した。

−１６℃で一晩静置し、濃褐色の粗固体が形成された。上記粗固体を恒量になるまで乾燥させ、カラムに充填した１００ｇのシリカの上においてクロロホルムにてクロマトグラフ的に精製した。上記カラムのシリカを５００ｍｌの１００％クロロホルムに続いて５００ｍｌの１．２５％ＭｅＯＨ／クロロホルム、その後１．５Ｌの２．５％ＭｅＯＨ／クロロホルムで溶出した。１００ｍｌ毎の画分を採取し、各画分１２〜１５を乾燥させ、淡褐色の固体を得た。淡褐色の固体を活性炭の存在下ＭｅＯＨから再結晶させ、１．１８ｇの白色のアモルファスな固体を得た。上記固体について、ＴＬＣ（２．５％ＭｅＯＨ／クロロホルム）により確認したところ、単一スポットのみを示し、不純物は見られなかった。上記固体のＨＰＬＣ純度は、９８＋％であった。

２−チオ−６−アニリノプリン
２−ベンジルチオ−６−アニリノプリン（１．１８ｇ）を液体アンモニア（１２５ｍｌ）に溶解した。上記溶解液に、ナトリウムを、青い色が持続するまで少しずつ加えた。上記青い溶解液に、少量の固体塩化アンモニウムを徐々に加え、過剰なＮａを除去した。過剰なＮａを除去した溶解液を、ホットプレート上でアンモニアを蒸発させて、少容量とした。上記小容量の溶解液にエーテル（１２５ｍｌ）を加えた。残余アンモニアの大半を水（２×６５ｍｌ）で抽出した。

水相の抽出物のｐＨをＡｃＯＨで５に調整し、その後、ドライアイス上で−１０℃以下にまで冷却し、クリーム状の固体を沈殿させた。この固体を、ろ取し、水でよく洗浄し、塩化カルシウム上で一晩乾燥させ、ほぼ白色の粉末を得た。収量は７６０ｍｇであった。上記粉末について、ＴＬＣにて確認したところ、不純物は見られなかった。上記粉末のＨＰＬＣ純度は、９５％であった。

２−メチルチオキサンチン
２−チオキサンチン（１０３ｇ、０．６１３ｍｏｌ）を２ＭＮａＯＨ（６１３ｍｌ）と水（２４５ｍｌ）に溶解して調製した直後の溶液に、硫酸ジメチル（７７ｇ、５８ｍｌ）を滴下添加した。上記添加時の温度は２５℃〜４０℃の間に維持された。反応混合物を１時間攪拌し、室温で一晩静置した。その後、暗赤色の液体を濾過し、ろ液を氷酢酸で沈殿させて生成物を得た。上記生成物をろ取した後、上記生成物の固体を沸騰水（１５００ｍｌ）から再結晶させた。−１０℃で結晶化した生成物をろ取し、減圧下、９５度で３時間乾燥させ、その後、恒量になるまで五酸化リン上で乾燥させた。収量は４８ｇで、ＨＰＬＣ純度は８０％であった。

２−メチルチオ−６−クロロプリン
２−メチルチオキサンチン（６５ｇ）をＰＯＣｌ₃（９７５ｍｌ）とＮ，Ｎ−ジエチルアニリン（９７．５ｍｌ）に混合した。混合物を還流しながら、機械的に９０分間攪拌した。過剰なＰＯＣｌ₃を、減圧下、５５℃〜６０℃にてロータリーエバポレーターにて除去し、残留物を氷（０℃、１．７５ｋｇ）の上に注いだ。上記残留物の混合物を、１０分間攪拌してＰＯＣｌ₃の加水分解を完了させ、酢酸エチル（４×２．５ｌ）で抽出した。

合わせた酢酸エチル抽出物を水で洗浄して乾燥させて、暗色固体を得た。粗固体を活性炭で脱色しながらエタノールから再結晶させ、恒量になるまで五酸化リン上で乾燥させた。収量（収率）は２３．６ｇ（３３％）で、ＨＰＬＣ純度は９９％であった。ＴＬＣ（クロロホルム／メタノール、９／１）では不純物は見られなかった。

２−メチルチオ−６−アニリノプリン
２−メチルチオ−６−クロロプリン（１０ｇ、５０ｍｍｏｌ）、アニリン（７．７ｇ、６３ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（３５ｍｌ、２５０ｍｍｏｌ）をブタノール（４００ｍｌ）中で２時間還流させた。ブタノールを減圧下で留去し、水（２９０ｍｌ）を冷却した残留物に加えた。ｐＨを８．０に調整し、混合物を−１６℃で一晩静置した。ろ取と、減圧下での五酸化リン上での乾燥により、１０ｇの黄緑色の粗生成物を得た。

この粗生成物を、（２５０ｇシリカ、Fisons社製、クロロホルム）、クロロホルム／メタノール（９７／３、ｖ／ｖ）で溶出して、クロマトグラフ的に精製した。適切な画分を減圧下で乾燥させ、活性炭で脱色しながらエタノールから再結晶させた。恒量になるまでＰ₂Ｏ₅上で乾燥させた後、収量（収率）は５．７６ｇ（４６％）であった。ＨＰＬＣ純度は＞９８％であった。ＴＬＣ（クロロホルム／メタノール（９／１、ｖ／ｖ））には、不純物は見られなかった。

２−メチル−６−（３−メトキシアニリノ）プリン
ｎ−ブタノール（２０ｍｌ）中の２−メチル−６−クロロプリン（１．６９ｇ；０．０１ｍｏｌ）とｍ−アニシジン（１．２３ｇ；０．０１ｍｏｌ）との懸濁物にトリエチルアミン（３．５ｍｌ；０．０２５ｍｏｌ）を加えた。得られた高粘度の懸濁物を１１０℃で３時間攪拌した。ＴＬＣにより、出発材料が消失していること、および所望の生成物が存在していることが分かった。

その後、反応混合物を室温まで冷却した。白色沈殿物をろ取し、ｎ−ブタノール（２×１０ｍｌ）と水（３×１０ｍｌ）で洗浄し、恒量になるまで乾燥させた。収量（収率）は１．９２ｇ（７５％）であった。粗生成物を２．５Ｍメタノール性塩化水素から結晶化によって塩酸塩として精製した。得られた塩酸塩の２−メチル−６−（３−メトキシアニリノ）プリンについて、ＴＬＣ（クロロホルム−メタノール−ＮＨ₄ＯＨ；４：１：０．０５）にて確認したところ、単一スポットを示し、出発材料のスポットは見出されなかった。得られた塩酸塩の２−メチル−６−（３−メトキシアニリノ）プリンのＨＰＬＣ純度は、９９＋％であった。

２−ブロモ−６−（メトキシアニリノ）プリン
２−ブロモ−６−（メトキシアニリノ）プリンは、２−ブロモ−６−クロロプリンとｍ−アニシジン（モル比１：１）を、トリエチルアミン（２．５等量）の存在下で、ｎ−プロパノール中において１００℃で４時間反応させることによって、実施例５と同様に調製された。室温に冷却後、得られた白色沈殿物をろ取し、ｎ−プロパノールと水で洗浄し、恒量になるまで乾燥機で乾燥させた。収率は（臭化水素酸塩として）６９％であった。粗生成物をメタノールから結晶化によって精製し、臭化水素酸塩を１０％アンモニア水で処理して遊離塩基を得た。ＨＰＬＣ純度は９８＋％であった。

２−ニトロ−６−（３−メトキシフェニル）アミノ−９−Ｂｏｃ−プリン
２−ニトロ−６−クロロ−９−テトラヒドロピラニルプリン（３．００ｇ；０．０１ｍｏｌ）をメタノール（４０ｍｌ）に溶解した０℃の溶液に対し、ｍ−アニシジン（１．４８ｇ；０．０１２ｍｏｌ）とトリエチルアミン（３．０ｇ＝４．２ｍｌ；０．０３ｍｏｌ）をメタノール（１０ｍｌ）に溶解した溶液を、反応混合物の温度が＋５℃を超えないようにゆっくりと滴下添加した。

ｍ−アニシジンの添加後、反応混合物を攪拌しながら室温まで加温させた。反応の過程はＴＬＣによってモニタされ、反応の終了は、出発材料である２−ニトロ−６−クロロ−９−テトラヒドロピラニルプリンのスポットが消失した時点によって示された。メタノールをロータリーエバポレーターにて留去させ、半固体の残留物を水（５０ｍｌ）と酢酸エチル（５０ｍｌ）とで分画した。水層をさらに酢酸エチル（５０ｍｌ）で抽出した。

合わせた有機層は、水（２０ｍｌ）にて洗浄され、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥され、溶媒が留去され、固形分が粗生成物として得られた。粗生成物をエーテル：シクロヘキサン（１：１、ｖ／ｖ）から結晶化した。ほぼ白色の結晶性生成物を収量（収率）３．１ｇ（８０％）で得た。純度（ＨＰＬＣ）は９８％＋であった。

２−ニトロ−６−（３−メトキシフェニル）アミノプリン
２−ニトロ−６−（３−メトキシフェニル）アミノ−９−Ｂｏｃ−プリン（３．８６ｇ；０．０１ｍｏｌ）を５０％トリフルオロ酢酸（５０ｍｌ）に０℃で溶解した。溶液を冷蔵庫で一晩静置した。トリフルオロ酢酸と水をロータリーエバポレーターにて留去し、結晶性残留物を冷５％アンモニア水（１００ｍｌ）で処理した。残留物をろ取し、５０％メタノールから再結晶化させて、帯黄色の結晶性生成物を収量（収率）１．９７ｇ（６９％）で得た。純度（ＨＰＬＣ）は９８％＋であった。

サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼ活性の阻害
マイクロタイタープレートにおけるアッセイを使用することによってＩＣ₅₀の測定を行った。各ウェルに、基質として３０μＭのＮ⁶−イソペンテニルアデニン（ｉＰ）と検査化合物（３×１０^-7Ｍ−３×１０^-4Ｍ）とを含む１００μＬのＰＭＳ／ＭＴＴ［フェナジンメトサルフェート／３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムの臭化物］の反応混合物（最終濃度：０．１ＭＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．４、１ｍＭＭＴＴ、０．２ｍＭＰＭＳ）を投入した。

ＡｔＣＫＸ２源として、プラスミドｐＹＥＳ２−ＡｔＣＫＸ２を含むS.cerevisiae 株２３３４４ｃｕｒａ^-の無細胞培地１００μＬをそのまま用いた。プレートを暗中３７℃で３０分間培養し、２５μＬの３５％酢酸で酵素反応を止めた。５７８ｎｍでの吸光度を分光光度計Tscan を用いて測定した。ｉＰなしのサンプルの吸光度が差し引かれた。

得られたドース応答曲線から、酵素活性を５０％に阻害する化合物濃度であるＩＣ₅₀値が算出された。表９に示す各数値は、それぞれ、３回の繰り返しの平均であり、全検査は少なくとも２回繰り返した。チジアズロンより効力のある化合物は、チジアズロンより低いＩＣ₅₀値を示す。

２−クロロ−６−（３−メトキシアニリノ）アミノプリン（化合物１２）の生体内作用
温室内の土壌で栽培した遺伝子組み換えの、３５Ｓ：ＡｔＣＫＸ１シロイナズナ種苗および３５Ｓ：ＡｔＣＫＸ１と３５Ｓ：ＡｔＣＫＸ２の各タバコ種苗を１０μＭの化合物１２で系統的に処理した。

野生型種苗と遺伝子組み換え種苗の地上部に、０．０１％のＳｉｌｗｅｔＬ−７７湿潤剤を含む化合物１２の水溶液を１ヶ月間１日おきに散布した。図１に示すように、ＣＫＸ阻害剤である２−クロロ−６−（３−メトキシアニリノ）アミノプリン（化合物１２）の散布によって、植物がサイトカイニン量の減少による成長阻害から免れ、野生株表現型の回復につながったことが明らかである。興味深いことに、化合物１２の葉面散布によって、遺伝子組み換えタバコの根系の強化につながった（図２）。

表現型相補作用が外から散布されたサイトカイニンの一般的作用ではなく、ＣＫＸ阻害剤の特定的作用であることを証明するために、０．１μＭのサイトカイニンＢＡＰ（図３Ｃ）または同濃度の化合物１２（図３Ｂ）を含むＭＳ培地上で、ＣＫＸ１を過剰に生成したシロイナズナ種苗を容器内にて栽培した。化合物１２が培地内に存在した場合にだけ、野生株表現型の復帰が観察された。

野生型シロイナズナ植物を長期に渡って処理すると、花の発達が変質し、受粉が抑制された（図４）。花は葯を落とし、不稔性であった。

サイトカイニン受容体の活性化
プラスミドｐＩＮ−III−ＡＨＫ４またはプラスミドｐＳＴＶ２８−ＡＨＫ３を含む大腸菌ＫＭＩ００１株を０．１％のカザミノ酸が付与されたＭ９培地中２５℃で一晩培養して、ＯＤ₆₀₀〜１とした。上記培養液を０．１％カザミノ酸含有Ｍ９培地１ｍｌにて１：６００に希釈し、検査化合物（１０^-7Ｍ−５×１０^-5Ｍ）の溶液またはコントロール（ＤＭＳＯ、エタノール、メタノール）の溶液を１μｌ添加して、プリカルチャーとした。

上記プリカルチャーを、マイクロタイタープレート内の各ウェルに２００μｌずつ投入し、２５℃でさらに培養した。最適な培養時間は、ＣＲＥ１／ＡＨＫ４およびＡＨＫ３に対して、それぞれ、１７時間と２８時間であることが分かった。

培養物は、遠心分離され、その上清の５０μｌアリクオートを、２μｌ５０ｍＭ４−メチルウンベリフェリルガラクトシドを含むマイクロタイタープレートに移し、その後３７℃で１時間インキュベートした。１００μｌ０．２ＭＮａ₂ＣＯ₃を添加して反応を止めた。Fluroscan Ascent（Labsystems、Finland）を用いて、励起波長３６５ｎｍと発光波長４６０ｎｍに対して、それぞれ、蛍光発光を測定した。残存の培養液のＯＤ₆₀₀を測定し、βガラクトシダーゼ活性をｎｍｏｌ４−メチルウンベリフェロン×ＯＤ₆₀₀ ^-1×ｈ^-1として計算した。

得られたドース応答曲線から、受容体を５０％活性化する化合物濃度であるＥＣ₅₀値が算出された。表１０に示す各数値は、それぞれ、３回の繰り返しの平均であり、全検査は少なくとも２回繰り返した。トランス−ゼアチンに比べてサイトカイニン受容体を活性化する程度が低い化合物は、ＣＫＸ阻害剤として有用である。新規の置換６−アニリノプリンは、トランス−ゼアチンに比べてシロイナズナサイトカイニン受容体に対する親和性が非常に低い。

植物細胞分裂に対する新規化合物の促進作用
新たに調製された誘導体の促進作用をサイトカイニン依存性タバコカルスを用いたカルスバイオテストで検査した。サイトカイニン依存性Nicotina tabacum L. cv. Wisconsin 38タバコカルスを、改変されたムラシゲ・スクーグ培地にて暗中２５℃で保持した。改変されたムラシゲ・スクーグ培地には、１リットル当たり、ニコチン酸４μｍｏｌ、塩酸ピリドキシン２．４μｍｏｌ、チアミン１．２μｍｏｌ、グリシン２６．６μｍｏｌ、グルタミン１．３７μｍｏｌ、ミオ−イノシトール１．８μｍｏｌ、砂糖３０ｇ、寒天８ｇ、ＮＡＡ５．３７μｍｏｌ、および６−ベンジルアミノプリン０．５μｍｏｌが含まれていた。

継代培養を３週ごとに行った。バイオアッセイの１４日前に、カルス組織を６−ベンジルアミノプリンのない培地に移した。培養４週間後のフレッシュカルス重量の増加から、生物活性を測定した。検査した化合物の各濃度に対して５つの各検体を用意し、全検査は２回繰り返した。

サイトカイニンを高活性するものとして知られているキネチンを各実験においてコントロール（対照）として用いた。検査対象の化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、溶液を蒸留水で１０^-3Ｍにまで希釈した。この希釈溶液をそれぞれのバイオテスト用培地で１０^-8Ｍ〜１０^-4Ｍの濃度にさらに希釈した。ＤＭＳＯの最終濃度は０．２％を超えず、使用したアッセイシステムにおける生物活性の測定への影響はなかった。

得られたデータから、検査した化合物ごとに、活性が最も高い濃度を選択した。この濃度における化合物の相対活量が算出された（表１１）。対照物質であるキネチン（Ｋ）の濃度１０^-5Ｍに対して得られた活性を１００％と仮定した。

表１１の結果に示すように、プリン環の２位、６位における置換によって、従来のサイトカイニン活性物質であるキネチン（Ｋ）に比べて、カルスバイオアッセイにおけるサイトカイニン活性が増加した。

アマランサス・バイオアッセイにおける新規サイトカイニンの検査
標準的なアマランサス・バイオアッセイに以下の変更を加えて行った。Amaranthus caudatus var. atropurpureaの種子を１０％（ｗ／ｖ）Ｎ−クロロベンゼンスルホンアミドで１０分間表面滅菌し、脱イオン水で５回洗浄した。脱イオン水に浸したティッシュペーパーを入れた１５ｃｍシャーレに種子を配置した。暗中２５度で７２時間栽培した後、種苗の根を切り取った。

ｐＨ６．８のＮａ₂ＨＰＯ₄−ＫＨ₂ＰＯ₄１０μｍｏｌと、チロシン５μｍｏｌと、検査対象の化合物とを含む培地１ｍＬに浸した二層の濾紙を入れた５ｃｍシャーレに、二つの子葉と胚軸とからなる外植片を配置した。一シャーレ当たり２０片の外植片を配置した。暗室中緑色安全光のもとで処理を行った。暗中２５℃で４８時間栽培した後、外植片を３．３３μＭ酢酸４ｍｌ中にて凍らせてベータシアニンを抽出した。ベータシアニンの濃度は、５３７ｎｍと６２０ｎｍでの吸光度からΔＡ＝Ａ_537nm−Ａ_620nmの式で決定された。値ΔＡは、検査した化合物の濃度に対してプロットし、５つの各検体の平均であり、全検査は少なくとも２回繰り返した。

サイトカイニンを高活性化するものとして知られているキネチンを各実験においてコントロール（対照）として用いた。検査対象の化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、溶液を蒸留水で１０^-3Ｍにまで希釈した。この希釈溶液をそれぞれのバイオテスト用培地で１０^-8Ｍ〜１０^-4Ｍの濃度にさらに希釈した。ＤＭＳＯの終局濃度は０．２％を超えず、使用したアッセイシステムにおける生物活性への影響はなかった。

得られたデータから、検査した化合物ごとに、活性が最も高い濃度を選択した。この濃度における化合物の相対活量を計算した（表１２）。キネチン（Ｋ）の１０^-5Ｍに対して得られた活性を１００％と仮定した。

結果に示すように、プリン環の２位、６位における置換によって、キネチン（Ｋ）に比べて、Amaranthus caudatus子葉／胚軸外植片におけるベータシアニン（紫色）含有量が増加した。

新規化合物の試験管内での細胞毒性
農業や医療における使用を目的とした化合物に関する要求事項の一つとして、広範囲の濃度に渡って哺乳類（特にヒト）細胞系に対して毒作用のないことが挙げられる。毒性化合物は細胞における代謝過程に悪影響を及ぼすため、標準的な細胞毒性アッセイ法の多くは、種々の人工物の代謝速度を測定することによって行われる。そして、得られた生成物を分光分析によって定量する。これらのアッセイ法は、９６ウェルプレート用に容易に変更することができる。本発明の化合物の毒性を評価するために、Calcein AMの代謝の定量に基づいたマイクロタイターアッセイ法を用いた。このアッセイ法は、薬剤スクリーニングプログラムや化成品の感受性検査において広く使われている。生細胞では、Calcein AMは酵素的に加水分解されており、得られたカルセインの蓄積は緑色蛍光により明らかになる。

化合物のルーチンスクリーニングには、ヒト細胞系として、Ｔリンパ芽球性白血病細胞ＣＥＭ系、骨髄球白血病細胞ＨＬ−６０系、赤白血病細胞Ｋ−５６２系、乳癌細胞ＭＣＦ−７系、骨肉腫細胞ＨＯＳ系、およびメラノーマ細胞Ｇ−３６１系を用いた。マウス細胞系として、Ｂ１６−Ｆ１０（メラノーマ）とＮＩＨ−３Ｔ３（線維芽細胞）も用いた。これらの細胞は、Nunc/Corning８０ｃｍ²プラスチック製組織培養フラスコで保持し、細胞培養液（グルコース５ｇ／ｌと、グルタミン２ｍＭと、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｌと、１０％ウシ胎仔血清と、重炭酸ナトリウムとを含むＤＭＥＭ）で培養した。

特定の細胞型と期待されるターゲット細胞密度（細胞増殖特性に基づいて各ウェルに２５００〜３００００個の細胞）とに基づいて細胞懸濁液を調製、希釈し、９６ウェルプレートにピペットで（８０μｌ）投入した。植菌には、安定化のため、３７℃で２４時間の前保温期間と５％ＣＯ₂が与えられた。

時間０の時点で、検査化合物は、容量２０μｌの水にて添加された。通常、検査化合物は、６つの３倍希釈物で評価された。ルーティンテストでは、検査した濃度で最も高かったのは、１６６．６μＭであった。全ての各薬剤濃度では、３回繰り返して検査した。検査化合物による細胞の培養は、３７℃で７２時間、５％ＣＯ₂雰囲気と湿度１００％の中で行われた。

培養期間の終わりに、ＰＢＳ中のCalcein AMを添加し、最終濃度を１μｇ／ｍｌにした。さらに、１時間培養した後、Labsystem FIA Reader Fluoroscan Ascent（ＵＫ）を用いて蛍光（ＦＤ）を測定した。成長阻害（ＧＩ）は、ＧＩ＝（ｍｅａｎＦＤ_{drug exposed wells}−ｍｅａｎＦＤ_blank）／（ｍｅａｎＦＤ_{control wells}−ｍｅａｎＦＤ_blank）×１００％の式を用いて見積もられた。ＣａｌｃｅｉｎＡＭの転換が５０％減少する薬剤濃度であるＧＩ₅₀値は、得られたドース応答曲線から算出された。

異なる組織や種に由来する哺乳類細胞系の群に対して、新規化合物の細胞毒性を検査した（表１４）。この検査結果から、本発明の化合物が、使用した哺乳類細胞系に対して、大きな毒作用を及ぼさないことが分かる。興味深いことに（従来技術で知られている）６−置換プリンキネチン、イソペンテニルアデニン、ベンジルアデニン、メタ−トポリン、およびオルト−トポリンに代表される「従来のサイトカイニンの活性化物」は、いくつかの例では、本発明の新規化合物に比べて、毒性が大きい。このように、新規な化合物は、「従来のサイトカイニンの活性化物」に比べて、農業や医療での応用に適している。

ヒト線維芽細胞における老化防止作用
本実施例では、老化バイオマーカーである老化関連βガラクトシダーゼの活性に対する本発明の化合物の作用を調べた。上記調査のために、さまざまな継代数のヒト２倍体線維芽細胞ＨＣＡを用いた。各継代ごとに、培地に検査化合物を添加した。培養期間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒドと０．２％グルタルアルデヒで固定した。

さらにＰＢＳで洗浄した後、フェリシアン化カリウム（５ｍＭ）と、フェロシアン化カリウム（５ｍＭ）と、ＭｇＣｌ₂（２ｍＭ）と、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）（１ｍｇ／ｍｌ）とを含む染色溶液を用いて、クエン酸／リン酸緩衝液中（ｐＨ６．０）３７℃（ＣＯ₂なし）で少なくとも１時間培養した。培養期間に続いて、老化関連βガラクトシダーゼ（青色細胞）を発現した細胞の数を光学顕微鏡で数えた。

置換６−アニリノプリンの誘導体は、８０継代後の老化細胞をより少数に保持することにおいて、キネチンよりも効果的であった。

新規な置換６−アニリノプリンの抗炎症活性
本発明の置換６−アニリノプリンの誘導体のうちいくつかの抗炎症活性を測定した。コントロール（対照）としてキネチンも評価した。ハムのＦ１０最小必須培地（１：１ｖ／ｖ）と、Ｌ−グルタミン酸２ｍＭと、１％（ｖ／ｖ）最小必須培地ビタミン（１００×）と、１％（ｖ／ｖ）最小必須培地非必須アミノ酸（１００×）と、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌと、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌと、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウムとを含む化学的に定義された無血清培地でラットＣ６グリオーマ細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ１０７）を単層培養した。

培養は、湿度１００％の雰囲気中３７℃で行った。検定は、密度２．５×１０⁵細胞／ｃｍ²の対数増殖期に行った。５ｍＭ（−）−イソプロテレノールを加えることにより細胞内ｃＡＭＰ合成を誘発した。（−）−イソプロテレノールとしては、さまざまな量の検査化合物を同時に加えた。３０分間培養した後、ＥＬＩＳＡ（ｃＡＭＰ−酵素免疫測定キット；Amersham社製）を用いてｃＡＭＰの細胞量を測定した。Ｉ₅₀値は、用量反応曲線から２回繰り返して測定された。得られた結果は以下の通りである。

置換６−アニリノプリンの誘導体は、抗炎症活性を示した。キネチンは、この試験プロトコルでは不活性であった。

線維芽細胞の付着に対する新規化合物の作用
付着細胞に対する化合物の急性毒性を評価する方法の一つとして、付着頻度テストが挙げられる。所定数のトリプシン処理した細胞を入れた培地に検査化合物を加え、一定時間後、付着した細胞の数を数える。ヒト２倍体線維芽細胞ＢＪ（継代数１９）と標準的な培地（グルコース５ｇ／ｌと、グルタミン２ｍＭと、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｌと、１０％ウシ胎仔血清とを含むＤＭＥＭ）を用いた。６時間後、付着した細胞を数えた。実験は３回繰り返して行った。結果を図５に示す。付着率は、濃度が０〜２５μＭの２−クロロ−６−アニリノプリンによって有意な影響を受けなかった。よって、化合物は線維芽細胞に対して急性毒性を示さなかった。

ＭＴＴアッセイ法によるヒト線維芽細胞の容器内（in vitro）での生存率の評価
ＭＴＴは、細胞の増殖と生存を測定するための標準的な比色アッセイ法である。黄色ＭＴＴは、代謝的に活性な細胞の中にて、紫色のフォルマザンに還元される。得られたフォルマザンの量を分光光度法で測定した。

ヒト２倍体線維芽細胞ＢＪ（継代数１９）を９６ウェルプレートに（１ウェル当たり５０００個）播種した。６時間後、培地（グルコース５ｇ／ｌと、グルタミン２ｍＭと、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｌと、１０％ウシ胎仔血清とを含むＤＭＥＭ）を除去し、検査化合物を０〜２５μＭの濃度で含む培地を新たに添加した。上記測定を各濃度で５回繰り返した。

７２時間後、ＭＴＴを細胞に添加し、最終濃度を０．５μｇ／ｍｌにした。培養時間は３時間であった。２−クロロ−６−アニリノプリンに関する結果を図６に示す。結果から、本願発明の化合物はヒト２倍体線維芽細胞に対して毒性がないことが分かる。

成長曲線の評価によるヒト２倍体線維芽細胞における容器内（in vitro）毒性
ヒト２倍体線維芽細胞ＳＮＦ２５（継代数２７）を２４ウェルプレートに（１ウェル当たり１００００個）播種した。培地（グルコース５ｇ／ｌと、グルタミン２ｍＭと、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｌと、１０％ウシ胎仔血清とを含むＤＭＥＭ）を除去し、検査化合物を０〜１２．５μＭの濃度範囲で含む培地に置き換えた。各濃度で３回繰り返した。続く１２日間、細胞数を数えた。図７に示すように、検査検査化合物である２−クロロ−６−アニリノプリンは、上記濃度範囲と検査した期間とにおいては、ヒト２倍体線維芽細胞に対して毒性がないことが分かる。

老化ヒト２倍体線維芽細胞に対する作用
老化ヒト２倍体線維芽細胞ＳＮＦ２５（継代数５３）を２４ウェルプレートに（１ウェル当たり１００００個）播いた。培地（グルコース５ｇ／ｌと、グルタミン２ｍＭと、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｌと、１０％ウシ胎仔血清とを含むＤＭＥＭ）を除去し、検査化合物を０〜１２．５μＭの濃度範囲で含む培地に置き換えた。各濃度で３回繰り返した。７日目と１４日目に細胞数を測定した。図８に示すように、上記濃度で検査した２−クロロ−６−アニリノプリンは、上記期間においても細胞生存に有意な悪影響を与えないことが分かる。

エイムステスト法
２−クロロ−６−（４−ヒドロキシアニリノ）プリンの変異誘発性の作用がないことを示すために、エイムステスト法を用いた。指示菌として、ネズミチフス菌のＴＡ９８株およびＴＡ１００株のヒスチジン栄養要求体を用いた。テストは、標準プロトコルに従って行った（非特許文献１８、非特許文献１９）。濃度は、２．５、５．０、１５、５０、５００、１５００、５０００μｇ／ｐｌａｔｅで検査した。本願発明の化合物は、培地における溶解限度を超える濃度でも、変異誘発性ではなかった。

製剤
成長調整製剤は、通常、式Ｉで示される化合物を含む有効成分混合物を０．１〜９９％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．１％〜９５％（ｗ／ｗ）、固形または液状のアジュバントを１％〜９９．９％（ｗ／ｗ）、および界面活性剤を０．１％〜２５％（ｗ／ｗ）含む。市販される製品は、通常、濃縮物として製剤化されるが、たいていの場合、消費者は、希釈された製剤を使用する。製剤は、例えば、安定剤等のさらなる成分を含んでいてもよい。さらなる成分としては、例えば、植物油またはエポキシ化植物油（エポキシ化ココナッツ油、エポキシ化菜種油、またはエポキシ化大豆油）シリコーン油等の消泡剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤または乳化剤、粘性調節剤、結合剤、粘着剤、および栄養素や他の有効成分等が挙げられる。好適な製剤は、特に、以下の組成物を有する（ここで、％は重量百分率を示す）。

上記濃縮物を水で希釈することによって任意の濃度で乳液を得ることができる。

上記溶液は、微小液滴の形での使用に適している。

有効成分をアジュバンドとよく混ぜ、混合物を適切な製粉機で粉砕することにより、水で希釈することによって任意の濃度で懸濁物を得ることができる湿潤可能な粉末を提供することが可能となる。

有効成分を塩化メチレンに溶解し、基材に吹き付けた後、溶媒を減圧化留去発させた。

細く粉砕された有効成分をポリエチレングリコールに濡らした基材に均一に散布した。このようにして、非粉末の被覆顆粒を得た。

有効成分をアジュバンドと混ぜて粉砕し、混合物を水にて湿潤させた。湿潤させた混合物を押し出し、その後、空気流中にて乾燥させた。

有効成分を基材と混ぜ、混合物を適切な製粉機で粉砕することで、すぐに使える状態の粉末を得た。

細く粉砕した有効成分をアジュバンドとよく混合することにより、水にて希釈することによって任意の濃度で懸濁物を得ることができる懸濁濃縮物を得た。

ゲルの調合
登録機関の用語に従って、構成成分の名称を示す。各成分の量は、１００ｇ当たりのグラムで示す。

このゲル構成は、無水ケイ酸をさらに加えて変更してもよい。この場合も、経皮Transcutol P/Lauroglycol FCC系により、有効成分の効き目が高まることが期待される。無水ケイ酸は有効成分の浸透を遅くするものと思われる。

皮膚の塗り薬（軟膏）の調製手順
登録機関の用語に従って、構成成分の名称を示す。各成分の量は、２００ｇ当たりのグラムで示す。

推奨手順
相Ａ
分離用のガラス製またはステンレス製の容器中、室温で連続攪拌しながら、有効成分（２ｇ）をTranscutol P（２０ｇ）に溶解した。この溶解工程は、溶液を最高４０℃まで加熱することによって促進されてもよい。

相Ｂ
他の分離用のガラス製またはステンレス製の容器中、約７０℃で連続攪拌しながら、Nipanox BHT（０．４ｇ）とNipabutyl（０．４ｇ）をLauroglycol FCC（１３３．２ｇ）に溶解した。透明な油剤を約８０℃に加熱し、連続攪拌しながらCompritol888ATO（４４．０ｇ）を融解する。透明な油剤を約６０℃に冷まし、連続攪拌および冷却しながら相Ａと混合した。得られたほぼ白色の軟膏状の物質を１５グラムずつに小分けし、予め用意しておいたプラスチック製の容器に充填する。

皮膚へ局所適用するための化合物の調合
皮膚へ局所適用するための化合物の構成を重量％で以下に示す。

メチルパラベンとプロピルパラベンとを含む温水にメチルセルロースを分散した。混合物を７０℃に加熱し、連続攪拌しながら７０℃に加熱しておいた油相に加えた。混合物を３５℃に冷却した後、有効成分を加え、得られた混合物を冷めるまで連続攪拌した。

この化合物は、所望の皮膚改善（抗老化）効果が出るまで少なくとも毎日皮膚に塗布される。

Claims

サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤として用いるための、一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリン誘導体、または、ラセミ化合物もしくは光学活性異性体の形態での上記置換６−アニリノプリンの誘導体と、アルカリ金属、アンモニアもしくはアミンとの薬学的に受容可能な塩、あるいは、これらの酸との付加塩。

（式中、Ｒは、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルキロキシ基、アルキル基を含む群から独立に選択された１〜５個の置換基を示す。Ｒ２は、アミノ基、ハロゲン原子、ニトロ基、チオ基、アルキルチオ基、またはアルキル基を示す。）
一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリン誘導体が、２−Ｘ−６−アニリノプリン、２−Ｘ−６−（２−クロロアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３−クロロアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（４−クロロアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−フルオロアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３−フルオロアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（４−フルオロアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−ブロモアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３−ブロモアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（４−ブロモアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−メトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３−メトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（４−メトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−エトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３−エトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（４−エトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−アミノアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３−アミノアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（４−アミノアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−メチルアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３−メチルアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（４−メチルアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−ヒドロキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３−ヒドロキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（４−ヒドロキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，３−ジフルオロアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，４−ジフルオロアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，３，４−トリフルオロアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，４，５−トリフルオロアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，３−ジクロロアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，４−ジクロロアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，４−ジメトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，３−ジメトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３，４−ジメトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，５−ジメトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３，４，５−トリメトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，４，６−トリメトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，３−ジメチルアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，４−ジメチルアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３，４−ジメチルアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３，５−ジメチルアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，３−ジヒドロキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，４−ジヒドロキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２，５−ジヒドロキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３，５−ジヒドロキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３−ヒドロキシ−２−メチルアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３−ヒドロキシ−４−メチルアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−ヒドロキシ−５−メチルアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３−ヒドロキシ−２−メトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（３−ヒドロキシ−４−メトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−ヒドロキシ−５−メトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−クロロ−４−メトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−クロロ−５−メトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−クロロ−３−メトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−ブロモ−３−メトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−メトキシ−３−クロロアニリノ）プリン、および、２−Ｘ−６−（２−メトキシ−４−クロロアニリノ）プリンからなる群（Ｘは、クロロ、フルオロ、ブロモ、アミノ、ニトロ、チオ、メチルチオ、およびメチルの何れか）から選択される、請求項１に記載の、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤として用いるための、置換６−アニリノプリン誘導体、または、ラセミ化合物もしくは光学活性異性体の形態での上記置換６−アニリノプリンの誘導体と、アルカリ金属、アンモニアもしくはアミンとの薬学的に受容可能な塩、あるいは、これらの酸との付加塩。
一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリン誘導体が、好ましくは２−Ｘ−６−（３−メトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−クロロ−３−メトキシアニリノ）プリン、２−Ｘ−６−（２−ブロモ−３−メトキシアニリノ）プリン、および、２−Ｘ−６−（４−ヒドロキシアニリノ）プリンを含む群から選択される、請求項２に記載の、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤として用いるための、置換６−アニリノプリン誘導体、または、ラセミ化合物もしくは光学活性異性体の形態での上記置換６−アニリノプリンの誘導体と、アルカリ金属、アンモニアもしくはアミンとの薬学的に受容可能な塩、あるいは、これらの酸との付加塩。
植物、哺乳類、微生物、酵母、および真菌細胞の老化を遅延するために、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤として用いるための、請求項１に記載の一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリンの誘導体。
哺乳類の皮膚細胞、好ましくは線維芽細胞および角化細胞の老化を遅延するために、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤として用いるための、請求項１の一般式Ｉの置換６−アニリノプリンの誘導体。
組織培養において増殖と形態形成を促進するために、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤として用いるための、請求項１の一般式Ｉの置換６−アニリノプリンの誘導体。
農産物の収量と品質を高めるために、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤として用いるための、請求項１の一般式Ｉの置換６−アニリノプリンの誘導体。
植物および哺乳類の胚細胞および胚、好ましくは卵母細胞をクローニングするための組成物の調製に使用するための、請求項１の一般式Ｉの置換６−アニリノプリンの誘導体。
哺乳類における免疫賦活の抑制または移植拒絶反応の抑制において、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤として用いるための、請求項１の一般式Ｉの置換６−アニリノプリンの誘導体。
作物の生産において、サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤として用いるための、請求項１の一般式Ｉの置換６−アニリノプリンの誘導体。
一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリン誘導体、または、ラセミ化合物もしくは光学活性異性体の形態での上記置換６−アニリノプリンの誘導体と、アルカリ金属、アンモニアもしくはアミンとの薬学的に受容可能な塩、あるいは、これらの酸との付加塩の、すくなくとも１つ、およびアジュバントを含む、化粧品製剤、医薬品製剤、並びに成長調整製剤。
サイトカイニンのオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの阻害剤となる製剤の調製のための、一般式Ｉで示される置換６−アニリノプリン誘導体、または、ラセミ化合物もしくは光学活性異性体の形態での上記置換６−アニリノプリンの誘導体と、アルカリ金属、アンモニアもしくはアミンとの薬学的に受容可能な塩、あるいは、これらの酸との付加塩の、使用。