CZ310363B6 - Krystalická forma 1-fenyl-3-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny, přípravky ji obsahující, a její použití - Google Patents

Abstract

Řešení se týká krystalické formy 1-fenyl-3-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny (PTU), jejího použití v zemědělství, zahradnictví, lesnictví a rostlinných biotechnologiích při pěstování rostlin, a přípravků obsahujících tuto látku. Krystalická forma 1-fenyl-3-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny jeví zlepšenou biologickou aktivitu oproti amorfní formě.

Description

Krystalická forma l-fenyl-3-(4/7-l,2,4-triazol-4-yl)močoviny, přípravky ji obsahující, a její použití

Oblast techniky

Vynález se týká krystalické formy l-fcnyl-3-(4//-l.2.4-triazol-4-yl)močoviny (PTU), jejího použití v zemědělství, zahradnictví, lesnictví a rostlinných biotechnologiích při pěstování rostlin, a přípravků obsahujících tuto látku.

Dosavadní stav techniky

Cytokininy jsou rostlinné signální látky (fýtohormony), které hrají ústřední roli v regulaci buněčného dělení rostlinných buněk a v četných vývojových procesech rostlin. Cytokininy objevili F. Skoog, C. Miller a spolupracovníci v 50. letech 20. století jako faktory, které podporují buněčné dělení (cytokinezi). Prvním objeveným cytokininem byl derivát adeninu s názvem kinetin (6-fúrfurylaminopurin), který byl izolován jako produkt degradace DNA. První běžný identifikovaný přírodní cytokinin byl izolován z nezralých kukuřičných zrn a pojmenován zeatin (chemický název: 6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)purin). V současnosti je známo několik dalších cytokininů s podobnými heterocyklickými strukturami. Cytokininy mají široké spektrum biologických účinků.

Cytokininy byly objeveny jako faktory podporující buněčné dělení a díky jejich morfbgenetickým aktivitám bylo jejich použití značně rozšířeno v in vitro kulturách vyšších rostlin (rostlinné biotechnologie), kde umožňují de novo formování orgánů a/nebo celých rostlin, ale i organogenezi a/nebo somatickou embryogenezi. V tkáňové kultuře jsou oproti přirozeně se vyskytujícím cytokininům stále více.

využívány některé deriváty močoviny, jako je A-fcnyl-A-(2-chlor-4-pyridyl)močovina (CPPU) a A-fcnyl-A-l.2.3-thiadiazol-5-ylmočovina (Thidiazuron, TDZ), vykazující zlepšení aktivity podobné cytokininů, i když jejich struktura s adeninovými deriváty nesouvisí. Bylo prokázáno, že tyto syntetické sloučeniny a některé jejich deriváty mají účinek na úrovni cytokininového receptoru bez ohledu na jejich odlišnou molekulární strukturu, nejsou degradovány cytokininoxidázou CKX a pozitivně ovlivňují endogenní koncentrace cytokininů v rostlinách (Nisler a kol. 2016, 2021). Kromě toho to bylo nedávno publikováno, že některé deriváty močoviny zpomalují stárnutí listů, což je cytokininem řízený účinek, bez ovlivnění hladiny cytokininů (Nisler et al. 2018). Jedním z močovinových derivátů je i l-fenyl-3-(477-1,2,4-triazol4-yl)močovina (Suleymanov et al. BIO Web of Conferences https://doi.org/10.1051/52, 000 bioconf/20225200012 FIES 2022, 12, 2022; US patent 3836350). Ten zatím byl připraven postupy, které vedou na nekrystalické formy, které bývají špatně čistitelné.

Předkládaný vynález si klade za cíl vyvinout krystalickou vodorozpustnou formu I-feny 1-3-(4//l,2,4-triazol-4-yl)močoviny se zvýšenou aktivitou, vhodnou zejména pro biotechnologické a zemědělské použití.

Podstata vynálezu

Podstatou předkládaného vynálezu je krystalická forma l-fcnyl-3-(4//-l.2.4-triazol-4yl)močoviny, vykazující zvýšenou biologickou aktivitu v rostlinných biotestech a na rostlinách.

Předmětem tohoto vynálezu je krystalická forma l-fcnyl-3-(4//-l.2.4-triazol-4-yl)močoviny (PTU) vzorce I (I) mající charakteristické reflexe ve spektru rentgenové práškové difrakce měřené zářením CuKa: 8,2; 12,2; 18,8; 21,0; 26,4; 30,8 ±0,2° 2-theta. Výhodněji má další charakteristické reflexe: 15,4; 16,5; 20,6; 22,0; 24,5; 28,1 ±0,2° 2-theta.

l-fenyl-3-(477-l,2,4-triazol-4-yl)močovina (PTU) v této krystalické formě krystaluje v ortorombické soustavě se specifikací prostorové grupy Pca21.

V rámci předkládaného vynálezu bylo na základě zkoumání monokrystalové struktury potvrzeno, že krystalická forma l-fcnyl-3-(4/7-l.2.4-triazol-4-yl)močoviny má sumární vzorec C9H9N5O1. Sumární vzorec vypočtený: C9H9N5O1, naměřený: C9H9N5O1; molekulová hmotnost (m.h.) vypočtená: 203,21, naměřená: 203,20.

Krystalická forma l-fenyl-3-(477-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny podle vynálezu má teplotu tání 231 až 232 °C.

Krystalická forma I-fenyI-3-(4//-1.2.4-triazol-4-yl(močoviny podle vynálezu se připraví rekrystalizací surové I-feny I-3-(4/7-1.2.4-triazol-4-yl (močoviny z C1-C4 alkoholu, s výhodou methanolu, ethanolu nebo izopropanolu, nebo z vody. Surová (amorfní) l-fenyl-3-(477-1,2,4triazol-4-yl)močovina se s výhodou připraví reakcí fenylizokyanátu a 4-amino-l,2,4-triazolu v tetrahydrofůranu (THF).

Krystalická forma l-fenyl-3-(477-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny (PTU) podle předkládaného vynálezu jeví zvýšenou biologickou aktivitu oproti amorfní formě v široké škále biologických aktivit, včetně antioxidační, anti-senescentní, podporující nakládání floému, ovlivnění tvorby nadzemní části rostliny i kořene, pro-diferenciační aktivity, které jsou zvláště užitečné v zemědělských, zahradnických, lesnických a biotechnologických aplikacích (např. k ošetření rostlinných pletiv, buněk, orgánů i celých rostlin). Sloučenina PTU (a přípravky je obsahující) mají minimální nebo nulovou toxicitu. To umožňuje jejich použití v širokém rozsahu aplikací. Přesný důvod zvýšené biologické aktivity se zatím nepodařilo identifikovat, může souviset s krystalizačním přečištěním od konkrétních nečistot nebo s fyzikálními změnami při krystalizaci.

Předmětem vynálezu je použití krystalické formy l-fenyl-3-(477-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny podle vynálezu pro ochranu rostlinných buněk in vivo a in vitro proti oxidativnímu a elektrofilnímu stresu.

Předmětem vynálezu je také použití krystalické formy l-fenyl-3-(477-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny podle vynálezu jako antioxidantu pro inhibici lipidové, proteinové a DNA peroxidace v rostlinách in vivo nebo in vitro.

Tento vynález se dále týká použití krystalické formy l-fenyl-3-(477-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny podle vynálezu pro zvýšení výnosu, zlepšení zakořeňování, zvýšení počtu odnoží, zvýšení multiplikace a oddálení senescence v produkci užitkových rostlin a zemědělských plodin, zejména obilovin (pšenice, ječmen, rýže, kukuřice, žito, oves, čirok a příbuzné druhy), řepy (cukrové a krmné řepy), malvic, peckovic a drobného (měkkého) ovoce (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, třešně, jahody, borůvky), luštěnin (fazole, čočka, hrách, sója), olejovin (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokos, Ricinus, kakaové plody, arašídy), tykvovitých (okurky, dýně, melouny), vláknitých rostlin (bavlna, len, konopí, juta), citrusů (pomeranče, citróny, grepy, mandarinky), zeleniny (špenát, skořicovník, kafr) nebo rostlin jako tabák, ořechy, lilek, cukrová

-2CZ 310363 B6 třtina, čaj, vinná réva, chmel, banány a přírodní kaučuk a léčivé rostliny, stejně jako okrasné rostliny. Plodiny zahrnují takové rostliny, které se ukázaly tolerantní vůči různým skupinám růstových regulátorů/faktorů při použití konvenčních šlechtitelských metod nebo při metodách genetického inženýrství.

Předmětem vynálezu je také použití krystalické formy I-feny 1-3-(4//-1.2.4-triazol-4-yl (močoviny podle vynálezu jako růstově-regulačního a prodiferenciačního faktoru. Tyto vlastnosti mohou být využity k optimalizaci podmínek v rostlinné tkáňové kultuře in vitro. Konkrétně pro in vitro zahrnují somatickou embryogenezi, mikropropagaci, androgenezi, gynogenezi, suspenzní a protoplastové kultury.

Krystalická forma l-fenyl-3-(4//-1.2,4-triazol-4-yl)močoviny (PTU) obecného vzorce I může být podle předkládaného vynálezu dále využita v rostlinných tkáňových kulturách k potlačení nežádoucích fyziologických poruch, jako jsou např. hyperhydricita, nekróza vzrostných vrcholů, tvorba chimér, inhibice tvorby kořenů během aklimatizace a časná senescence.

Předmětem vynálezu je rovněž použití krystalické formy l-fenyl-3-(4//-l,2,4-triazol-4yljmočoviny podle vynálezu pro inhibici nebo oddálení senescence rostlinných buněk, pletiv, orgánů i celých rostlin.

Předmětem vynálezu je rovněž použití krystalické formy l-fenyl-3-(4//-l,2,4-triazol-4yljmočoviny podle vynálezu v zemědělství, zahradnictví, lesnictví a v biotechnologiích pro inhibici, oddálení nebo redukci nepříznivých efektů souvisejících se senescencí, a to jak in vivo tak in vitro, tato použití také zahrnují zlepšení celkového vzhledu a kondice rostlin, konkrétně rostlinných epidermálních a mezofylových buněk, a také pro inhibici, oddálení nebo redukci senescence, žloutnutí, ztráty chloroplastů a/nebo chlorofylu.

Výše uvedená použití krystalické formy l-fenyl-3-(4//-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny podle vynálezu obvykle zahrnují aplikaci účinného množství sloučeniny obecného vzorce I na buňky (např. v tkáňové kultuře), rostlinné organely, části rostlin nebo na celé rostliny. Sloučeniny vzorce I lze aplikovat samotné, nebo - obvykleji - v podobě přípravku s nosiči a/nebo pomocnými látkami.

Vynález dále zahrnuje zemědělské a biotechnologické přípravky obsahující krystalickou formu 1fenyl-3-(4//-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny (PTU) a alespoň jednu pomocnou látku. Za tímto účelem jsou přípravky výhodně formulovány jako koncentráty s pevnou účinnou látkou, suspenze, disperse, rozpustné prášky, granuláty, olejové suspenze a také obalované formulace, např. polymemími látkami. Přípravky mohou být sterilizovány a/nebo mohou obsahovat další pomocné látky neutrální povahy, jako jsou konzervační činidla, stabilizátory, smáčedla nebo emulgátory, solubilizační činidla, stejně jako hnojivá, donory stopových prvků nebo jiných prostředků k dosažení speciálních efektů.

V tomto textu termín in vivo znamená použití celé rostliny nebo části rostliny schopné samostatného života. Termín in vitro znamená pěstování buněčných (popř. tkáňových) kultur mimo organismus, ze kterého pochází. V přeneseném slova smyslu to pak znamená ve zkumavce, Erlenmeyerově baňce, Petriho miskách a dalších laboratorních nádobách, kde lze něco pěstovat či kultivovat.

Přípravky

Přípravky obsahující sloučeninu vzorce I (aktivní složka) v krystalické formě, a pokud je třeba, jednu nebo více pomocných látek, jsou připraveny známými způsoby, například smísením nebo mletím účinné látky s pomocnými látkami, jako jsou např. rozpouštědla nebo pevné nosiče. Do přípravků mohou být přidávány povrchově aktivní látky (surfaktanty).

- 3 CZ 310363 B6

Vhodné povrchově aktivní látky jsou neiontové, kationtové a/nebo aniontové povrchově aktivní látky a jejich směsi mající dobré emulzifikační, dispergační a zvlhčovači vlastnosti. Příklady vhodných aniontových, neiontových a kationtových smáčedel jsou shrnuty například ve WO 97/34485.

Také vhodné pro přípravu kompozic, které obsahují sloučeninu l-fenyl-3-(4H-l,2,4-triazol-4yljmočovina (PTU) obecného vzorce I v krystalické formě podle vynálezu, jsou povrchově aktivní látky běžně používané při formulaci prostředků, které jsou popsány např. v McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual MC Publishing Corp., Ridgewood New Jersey, 1981, Stache, H., Tensid- Taschenbuch, Carl Hanser Verlag, MunichNienna, 1981 and M. and J. Ash, Encyclopedia of Surfactants, Vol-111, Chemical Publishing Co., New York, 1980-81.

Formulace přípravku obsahuje váhově od 0,1 do 99 % (w/w), zejména pak od 0,1 do 95 % (w/w) aktivní složky odpovídající látce vzorce I, přičemž obsahuje i od 5 do 99,9 % směsi přísad či nosičů, a to v závislosti na způsobech aplikace, a popřípadě obsahuje i váhově od 0,1 do 25 % smáčedla.

Komerční produkty jsou obvykle připravovány ve formě prášků, smáčivých prášků, granulí, potahovaných granulí, suspenzních koncentrátů. Kompozice může proto obsahovat i další přísady, jakými jsou plniva, pojivá, stabilizátory, např. rostlinné oleje nebo epoxidované rostlinné oleje (epoxidovaný palmový olej 0;l, řepkový nebo olivový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo emulgátory, viskozitní činidla, pojivá, lepidla, a také hnojivá a další aktivní přísady. S výhodou jsou používány přípravky následujícího složení: (% = hmotnostní procento).

Emulgované koncentráty:

aktivní složka: smáčedlo: kapalný nosič:

Prášky:

aktivní složka: pevný nosič:

až 90 %, s výhodou 5 až 20 % až 30 %, s výhodou 10 až 20 % až 94 %, s výhodou 60 až 85 %

0,1 až 10 %, s výhodou 0,1 až 5 % 99,9 až 90 %, s výhodou 99,9 až 95 %

Suspenzní koncentráty:

aktivní složka: voda: smáčedlo:

Smáčívé prášky:

aktivní složka: smáčedlo: pevný nosič:

Granule:

aktivní složka: pevný nosič:

až 75 %, s výhodou 10 až 50 % 94 až 24 %, s výhodou 88 až 30 % až 40 %, s výhodou 2 až 30 %

0,5 až 90 %, s výhodou 1 až 80 % 0,5 až 20 %, s výhodou 1 až 15 % až 95 %, s výhodou 15 až 90 %

0,1 až 30 %, s výhodou 0,1 až 15 %

99,9 až 70 %, s výhodou 99,9 až 85 %.

Pro použití sloučeniny vzorce I v krystalické formě, nebo kompozic ji obsahujících, se používají

-4CZ 310363 B6 rozdílné metody a technologie, kterými jsou například následující:

i) Obalování osiva

a) Obalování osiva smáčivou práškovou formulací sloučeniny vzorce I v krystalické formě, a to mícháním v nádobě až do stejnorodé distribuce na povrchu semen (suché obalování). Při takové proceduře je přibližně 1 až 500 g účinné látky, (4 g až 2 kg smáčivého prášku) používáno na 100 kg osiva.

b) Obalování osiva emulzifikovaným nebo suspenzním koncentrátem sloučeniny vzorce I v krystalické formě, v souladu s metodou a).

c) Obalování osiva cestou máčení semen po dobu 1 až 72 h v tekutině obsahující od 100 do 1000 ppm sloučeniny vzorce I vzniklé rozpuštěním krystalické formy látky vzorce I, a s výhodou následného usušení semen (imerzní obalování).

Obecně je látka podle vynálezu používána v množství od 1 do 1000 g, s výhodou od 5 do 250 g, na 100 kg semen, avšak v závislosti na metodice, která rovněž umožňuje přidání dalších aktivních látek nebo mikroživin; určené koncentrační limity se mohou pohybovat nahoru nebo dolů (opakované obalování).

ii) Aplikace do semenné brázdy

Sloučenina vzorce I v krystalické formě je zavedena do otevřené brázdy oseté semenem ve formě smáčivého prášku nebo granulí. Pak je semenná brázda zaklopena.

Objasnění výkresů

Obr. 1 znázorňuje krystalovou strukturu l-fcnyl-3-(4//-l.2.4-triazol-4-yl)močoviny (PTU) určenou pomocí RTG strukturní analýzy monokrystalu. Z obrázku je patrné, že se jedná o derivát močoviny, kde je jeden atom dusíku substituován 1,2,4-triazolem a na druhém atomu dusíku je navázána fenylová skupina. PTU krystaluje v ortorombické soustavě se specifikací prostorové grupy Pca21.

Obr. 2 znázorňuje XRPD záznam krystalické formy I-feny 1-3-(4//-1.2.4-triazol-4-yl (močoviny (PTU).

Obr. 3 znázorňuje XRPD záznam amorfní formy 1 -feny 1-3-(4//-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny (PTU) připravené dle stavu techniky.

Obr. 4A znázorňuje porovnání XRPD záznamu krystalické a amorfní formy l-fenyl-3-(4//-1,2,4triazol-4-yl)močoviny (PTU) a obr. 4B je zvětšeninou tohoto srovnávacího XRPD záznamu.

Obr. 5 znázorňuje XRPD záznam krystalické formy I-feny 1-3-(4//-1.2.4-triazol-4-yl (močoviny (PTU) s příslušnými vyčíslenými hodnotami difrakčních úhlů 2 Théta.

Obr. 6 znázorňuje XRPD záznam krystalické formy I-feny 1-3-(4//-1.2.4-triazol-4-yl(močoviny (PTU), rekrystalované ze 4 různých rozpouštědel (ethanol, methanol, isopropanol a voda) ve srovnání se surovým produktem, izolovaným po syntéze (PTU) - výsek záznamu s charakteristickými difrakcemi. Záznam dokladuje, že látka PTU krystaluje ze všech výše uvedených rozpouštědel v jediné shodné stabilní krystalické modifikaci.

Obr. 7 znázorňuje anti-senescenční aktivitu roztoku připraveného z krystalické formy l-fenyl-3(4//-1.2.4-triazol-4-yl(močoviny (PTU) v porovnání s roztokem z amorfní formy PTU v

- 5 CZ 310363 B6 senescenčním biotestu na exstirpovaných listových segmentech pšenice kultivovaných ve tmě po dobu 4 dnů. Aktivita je dále porovnána oproti kontrole s DMSO a s nej používanějším klasickým cytokininem 6-benzylaminopurinem (BAP).

Obr. 8 znázorňuje výsledky testování krystalické formy l-fcnyl-3-(4//-l.2.4-triazol-4yljmočoviny (PTU) v porovnání s amorfní formou PTU v amaranthovém biotestu. Aktivita (koncentrace barviva betacyaninu) je porovnána oproti kontrole s DMSO, cytokininovému standardu 6-benzylaminopurinu (BAP) a adeninu (prekurzor cytokininů).

Obr. 9 znázorňuje výsledky testování krystalické formy l-fcnyl-3-(4//-l.2.4-triazol-4yl)močoviny (PTU) v porovnání s amorfní formou PTU v kalusovém biotestu za použití cytokinin-dependentního kalusu tabáku. Proliferační buněčná aktivita PTU je porovnána oproti kontrole s DMSO, cytokininovému standardu 6-benzylaminopurinu (BAP) a adeninu (prekurzor cytokininů).

Příklady uskutečnění vynálezu

Následující příklady slouží k ilustraci vynálezu bez omezení jeho rozsahu. Pokud není zmíněno jinak, všechna procentuální množství jsou založena na hmotnosti sloučenin.

Příklad 1: Příprava l-fenyl-3-(4H-l,2,4-triazol-4-yl)močoviny (PTU) - postup podle US 3836350 (stav techniky)

Fenylizokyanát (1,19 g; 0,01 mol) se předloží do 50 °C míchaného teplého roztoku 4-amino1,2,4-triazolu (0,59 g; 0,007 mol) v THF (25 ml) a výsledná reakční směs se nechá refluxovat 1 hodinu. Poté se ponechá samovolně chladnout na pokojovou teplotu za míchání. Vyloučený produkt se odfiltruje, promyje se THF (3x 5 ml) a vysuší při 60 °C do konstantní hmotnosti.

Výtěžek: 1,60 až 1,80 g (78 až 88 %) amorfirí bílý prášek; HPUC-UV/VIS: 98 %+; MH = 203,20; ESI-MS: [M + H]⁺ = 204,22 (100 %), 205,30 (28 %).

Takto získaný surový produkt PTU byl rekrystalován z různých organických rozpouštědel. Jako velmi výhodné se ukázaly nižší alkoholy (C1-C4). V našem případě byla zvolena následující rozpouštědla: methanol, ethanol a izopropanol, s výhodou ethanol. Samotné provedení krystalizace je následující:

Surový produkt PTU (500 mg) byl za varu (teplota refluxu zvoleného rozpouštědla) rozpuštěn v methanolu (20 ml), nebo ethanolu (20 ml), nebo izopropanolu (110 ml). Po vzniku homogenního roztoku prostého viditelných pevných částic byl roztok ponechán samovolně chladnout za míchání na teplotu 20 °C po dobu 12 hodin. Vyloučený krystalický produkt byl odfiltrován, promyt odpovídajícím vychlazeným (+5 °C) rozpouštědlem (3x 5 ml) a vysušen v horkovzdušné sušárně při 60 °C do konstantní hmotnosti. Takto bylo získáno 191 mg (z methanolu), 341 mg (z ethanolu) a 440 mg (z izopropanolu) rekrystalovaného PTU, vhodného pro biologické aplikace.

Ve všech zvolených případech krystalizace byla obdržena identická krystalická modifikace, charakterizovaná v příkladu 3 práškovou rtg difrakcí (XRPD). XRPD záznam krystalické formy l-fenyl-3-(4H-l,2,4-triazol-4-yl)močoviny (PTU) rekrystalované ze 4 různých rozpouštědel je znázorněn na obr. 6. Takto připravená krystalická forma PTU je přesně krystalograficky definována, její příprava je snadno reprodukovatelná jak v laboratorním, tak i poloprovozním měřítku a je validovatelná. Tímto postupem získaná PTU vykazuje výhodnou rozpustnost ve vodě, která je potřebná pro veškerou biologickou aplikační sféru, s výhodou pro zemědělské aplikace; a překvapivé zvýšení biologické aktivity oproti amorfní formě.

-6CZ 310363 B6

Příklad 2: Stanovení teploty tání připravené krystalické formy l-fcnyl-3-(4//-l.2.4-triazol-4yl)močoviny (PTU)

Teplota tání krystalické PTU byl stanoven na přístroji Búchi Melting point B-540 apparatus a porovnán s teplotou tání amorfní formy PTU připraveného dle dosavadního stavu techniky (příklad 1). Interval teploty tání byl stanoven u krystalické formy l-fcnyl-3-(4//-l.2.4-triazol-4yljmočoviny na 231 až 232 °C a u amorfní formy na 230 až 231 °C.

Příklad 3: Prášková rentgenová difrakce (XRPD) krystalické formy l-fcnyl-3-(4//-l.2.4-triazol4-yl)močoviny (PTU)

Prášková rentgenová difrakční studie byla provedena na difraktometru Bruker D8 Advance ECO s Cu K-alfa zářením a SSD160 detektorem. Přibližně 5 mg vzorku bylo jemně natlačeno do XRPD držáku vzorku. Vzorek byl následně vložen do přístroje v transmisním módu a analyzován za použití tabelovaných experimentálních podmínek viz níže. XRPD záznam krystalické formy PTU (příklad 2) je znázorněn na obr. 2, XRPD záznam amorfní formy PTU (příklad 1) je zobrazen na obr. 3 a srovnání obou XRPD záznamů krystalické a amorfní formy PTU je zobrazeno na obr. 4A a 4B (zvětšený detail XRPD záznamu).

XRPD podmínky měření

Scan axis gonio
počáteční pozice [·21ύ. ]	4.0000
koncová pozice [°2th.j	40.00
velikost scans [-’2tíi.J	0.0100
doba scanu [s]	0.3 (48) s
typ scanu	kontinuální
offset [°2th. ]	0.0000
velikost divergenčni štěrbiny [°]	0.3000
délka vzorku [mm]	10.00
teplota měření [ů c,]	25.00
K-alphal [á]	1.54060
K-alpha2 [á]	1.54443
K-beta [á]	1.39225
K-a2/k-ai poměr	0.50000
nastaveni generátoru	40 ma, 25 kv
goniometrický poloměr [mm]	250.00
dist. fokus-diverg. štěrbiny [mm]	110.00
Ni Kbeta filtr	ano
monochromator dopadajícího paprsku	ne
spinning	ne

V tabulkách jsou uvedeny relativní intenzita záření, d-spacing (mezirovinná vzdálenost) a odpovídající úhly 20 pro krystalickou formu l-fenyl-3-(477-l,2,4-triazol-4-yl)močoviny (PTU).

Tabulka 1: Relativní intenzity difraktovaného záření, úhly, d-spacing získané práškovou difrakcí pro krystalickou formu I-feny 1-3-(4//-1.2.4-triazol-4-yl (močoviny (PTU)

Úhel Γ°1	d-spacing [Á]	Intenzita	Rel. Intenzita [%]
8,251	10,70725	70500	96,70
12,206	7,24512	37100	50,90
15,41	5,7453	4810	6,60

-7CZ 310363 B6

16,484	5,37346	5320	7,30
18,025	4,9173	1310	1,80
18,804	4,71526	15400	21,10
19,831	4,47339	829	1,10
20,394	4,35124	2870	3,90
20,573	4,31368	4910	6,70
21,037	4,21964	72800	100,00
21,968	4,04286	4720	6,50
22,475	3,95282	1910	2,60
24,496	3,63109	4660	6,40
24,842	3,5812	765	1,10
25,098	3,54525	2410	3,30
26,41	3,37209	38700	53,10
27,444	3,24728	1110	1,50
28,086	3,17449	6580	9,00
28,365	3,14394	1110	1,50
29,964	2,97974	389	0,50
30,811	2,89968	7330	10,10
31,291	2,85626	2760	3,80
32,268	2,77202	1290	1,80
32,615	2,74329	937	1,30
33,291	2,68914	853	1,20
34,276	2,61408	966	1,30
34,818	2,5746	153	0,20
35,839	2,5036	160	0,20
36,33	2,47088	138	0,20
37,074	2,42295	412	0,60
38,088	2,36077	1210	1,70
38,295	2,34849	886	1,20
38,608	2,33016	304	0,40
39,22	2,29516	306	0,40

Příklad 4: Ή a ¹³C nukleární magnetická rezonance (NMR) krystalické formy 1-fenyl-3-(477l,2,4-triazol-4-yl)močoviny (PTU) 'H NMR byla měřena na přístroji JEOL 500 SS při teplotě 300 K a frekvenci 500,13 MHz. Vzorky byly připravovány rozpuštěním sloučenin DMSO-d6. Tetramethylsilan (TMS) byl použit jako interní standard. Kalibrace chemického posunu je vztažena ke zbytkovému píku rozpouštědla v Ή DMSO-de, a to 2,50 ppm. Každý vzorek byl připraven v ca. 8 mg koncentraci.

'H-NMR (500 MHz, DMSO-de) δ 7,02-6,99 (m, 1H), 7,30-7,27 (m, 2H), 7,46 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 8,66 (s, 2H), 9,55 (s, 1H), 9,83 (s, 1H);

¹³C-NMR(126 MHz, DMSO-de) δ 118,71, 122,57, 128,69, 138,77, 144,49, 153,76.

Příklad 5: Rozpustnost krystalické formy l-fenyl-3-(4H-l,2,4-triazol-4-yl)močoviny (PTU) ve vodě

Rozpustnost látky ve vodě byla stanovována podle následujícího protokolu. Byl připraven supemasycený roztok vzniklý rozpouštěním krystalické formy PTU ve vodě. Byl zfiltrován od viditelně nerozpuštěných částic a byl obdržen nasycený roztok PTU ve vodě. Nasycený roztok byl zředěn 1:10 000 a změřen na přístroji HPLC Alliance Waters 2690 s chromatografickou kolonou o průměru 2,1 mm a délce 150 mm se sorbentem Cl8 Symmetry o porozitě 5 pm. Vzorek byl rozpuštěn v mobilní fázi (MeOH: HCOONH4 - 1: 9). Vzorek byl eluován v

-8CZ 310363 B6 metanolovém gradientu (10 až 90%, po dobu 35 min) při pH 4 a průtokové rychlosti 0,3 ml/min. Absorbance sloučenin byla detekována v UV oblasti záření 210 až 400 nm. Plocha píku byla stanovena 2729231 a porovnána s plochami píku u dříve změřených konkrétních koncentrací krystalické formy PTU ve vodě. Získaná plocha píku byla porovnána s plochami píku u určitých konkrétních koncentrací látky ve vodě, a tak byla určena výsledná koncentrace nasyceného roztoku PTU.

To tedy znamená, že koncentrace PTU byla přibližně stanovena na 5,3 mM (1,077 g/1), což je řádově lepší rozpustnost ve vodě, než je popsána u jiných volných cytokininových bází, viz tabulka níže.

Volná CK báze	Koncentrace nasyceného roztoku [mM]
o-topolin	0,03
m-topolin	0,06
benzylaminopurin	0,37
6-(3 -methoxybenzylamino)purin	0,21
kinetin	0,14
PTU	5,3

Příklad 6: Stabilitní studie krystalické formy PTU pomocí práškové rtg difrakce

Stabilita vzorku byla testována při uložení I-feny I-3-(4//-1.2.4-triazol-4-yl (močoviny v krystalické formě za přístupu vzduchu při 25 °C. Nebyla pozorována žádná změna struktury ani barvy po 30 dnech uložení. Po těchto 30 dnech byl změřen práškový difraktogram a nebyla zaznamenána žádná změna struktury (změna difraktogramu). Krystalická forma je tedy stabilní.

Příklad 7: Disproporcionační studie krystalické formy I-feny I-3-(4/7-1.2.4-triazol-4-yl (močoviny mg vzorek krystalické I-feny I-3-(4/7-1.2.4-triazol-4-yl (močoviny byl rozpuštěn v 1 ml destilované vody, ponechán 48 hodin v roztoku a pak zkrystalován a byl změřen XRPD difraktogram, aby byly zjištěny případné disproporcionační změny. Z difraktogramu nebyla žádná disproporcionace pozorována, látka svou strukturu nezměnila.

Příklad 8: Monokrystalová rentgenostruktumí analýza krystalické formy PTU a popis molekulové a krystalové struktury krystalické formy PTU

Příprava monokrystalů: Krystaly pro monokrystalovou RTG analýzu byly vypěstovány z roztoků PTU (cca 20 mg) rozpuštěných v methanolu (2 cm³). Roztok byl ponechán k volnému odpařování rozpouštědla po dobu 7 dnů a po této době vznikly průsvitné krystaly, ze kterých byly vybrány vhodní zástupci pro RTG monokrystalovou analýzu.

Monokrystalová RTG difrakce: Pro analýzu byly vybrány podlouhlé průsvitné krystalky. Difrakční data byla měřena za použití čtyřkruhového mikrofokusního difraktometru Supernova s Cu/Κα zářením kolimovaným pomocí tenkovrstvých zrcadel, s použitím uzavřené mikrofokusované RTG trubice, který je vybaven CCD detektorem Atlas S2, pracujícím při teplotě 95 K. Podrobněji jsou podmínky a výsledky RTG měření monokrystalu uvedeny v následujícím protokolu:

Přesnost vazby: C-C = 0,0016 A; Vlnová délka = 1,54184

Buňka: a=9,942(2) b=10,373(2) c=9,472(2)

Úhly: alfa=90 beta=90 gama=90

Teplota: 95 K

-9CZ 310363 B6

Objem

Prostorová grupa Hallova grupa Vzorec sloučeniny Sumární vzorec Molekulová hmotnost

Dx,g cm'³

Z

Mu (mm-1)

F000

F000’ h,k,hnax Nref Tmin,Tmax Tmin’

Vypočteno 976,8(3) Pca21 P 2c -2ac C9 H9 N5 O C9 H9 N5 O 203,21 1,382 4 0,812 424,0 425,33 12,12,11 1964[1047] 0,919, 0,966 0,853

Změřeno 976,9(3) Pca21

P -2xac;-2y C9 H9 N5 O C9 H9N5 Ol 203,20 1,382 4 0,812 424,0

12,12,11 1921

0,742, 1,000

Korekční metoda= # Změřené limity T: T_mm = 0,742 T_max = 1,000

Absolutní korekce = GAUSSIAN

Úplnost dat = 1,83/0,98 Théta(_max) = 73,370

R(reflexe) = 0,0255 (1894) wR2(reflexe) = 0,0707 (1921)

S = 1,497 N_par= 143

Krystalová struktura I-feny 1-3-(4//-l.2.4-triazol-4-yl (močoviny (PTU) byla určena pomocí RTG strukturní analýzy monokrystalu za použití čtyřkruhového mikrofokusního difraktometru Supernova. Z obr. 1 je patrné, že se jedná o derivát močoviny, kde je jeden atom dusíku substituován 1,2,4-triazolem a na druhém atomu dusíku je navázána fenylová skupina. PTU krystaluje v ortorombické soustavě se specifikací prostorové grupy Pca21.

Příklad 9: Schopnost vychytávat volné radikály metodou ORAC (kyslíková radikálová absorpční kapacita)

Test ORAC využívá schopnosti AAPH [2,2'-azobis(2-amidinopropan)dihydrochlorid] tvořit peroxylové radikály při zahřívání v přítomnosti dostatečného množství kyslíku. Tyto radikály zháší a snižují tím fluorescenci sondy. Schopnost l-fcnyl-3-(4//-l.2.4-triazol-4-yl)močoviny (PTU) a srovnávacích cytokininů vychytávat volné radikály in vitro byla stanovena pomocí metody ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity - kyslíková radikálová absorpční kapacita). 100 pl fluoresceinu (500 mM) a 25 μΐ vodného roztoku PTU nebo srovnávací látky byly napipetovány do každé jamky 96-jamkové mikrotitrační desky předehřáté na 37 °C. Samotná reakce byla spuštěna přídavkem 25 μΐ 250 mM AAPH [2,2'-azobis(2-amidinopropan) dihydrochlorid]. Po 5 s třepání byla odečítána fluorescence (Ex. 485 nm, Em. 510 nm) každé 3 min po dobu 90 min pomocí přístroje Infinite 200 (TECAN, Švýcarsko). Plocha pod křivkou byla použitá k vyjádření antioxidační kapacity relativní vůči Troloxu, který je používán jako standard. Látky s ORAC aktivitou vyšší než 1 jsou efektivnější než Trolox, který je hydrofilním ekvivalentem vitaminu E. Trolox, ve vodě rozpustný analog vitaminu E, je známý svou antioxidační aktivitou, u které se také ukázalo, že je odpovědná za jeho ochrannou aktivitu v lidských buňkách. Test ORAC, který se obecně používá pro stanovení antioxidační aktivity, ukázal, že několik cytokininů, jako je kinetin a 6-benzylaminopurin (BAP), bylo spojeno s určitou antioxidační aktivitou vyjádřenou v ekvivalentech Trolox (TE). Ukázalo se, že PTU ve formě roztoku získaného rozpuštěním krystalické formy PTU je mnohem účinnější látkou.

Tabulka 3: Údaje o kyslíkové radikálové absorpční kapacitě (ORAC) vyjádřené v ekvivalentech Troloxu (TE) na ekvimolámím základě.

- 10 CZ 310363 B6

	Průměr (TE)	SD (n=3)
Kinetin (K)	1,201	0,54
6-benzylaminopurin (BAP)	0,402	0,12
1 -fenyl-3 -(4H-1,2,4-triazol-4yl)močovina(PTU)	2,143	1,07

Příklad 10: Anti-senescenční aktivita nové krystalové formy PTU v senescenčním testu na listových segmentech pšenice kultivovaných ve tmě (oddálení senescence - oddálení stárnutí listů).

Semena ozimé pšenice Triticum aestivum cv. Hereward byla promyta pod tekoucí vodou po 24 h a poté vyseta do vermikulitu nasyceného Knopovým živným roztokem. Nádoby se semeny byl umístěny do klimatizované růstové komory s 16-hodinovou světelnou periodou (světelná intenzita 50 mmol.m ýs¹) a teplotou 15 °C. Po 7 dnech měly semenáčky vyvinutý první praporcový list a druhý list začínal prorůstat. Z prvních listů vždy od 5 rostlin byly odebrány vrcholové sekce dlouhé přibližně 35 mm, které byly zkráceny tak, aby jejich váha byla přesně 100 mg. Bazální konce těchto 5 listových segmentů byly umístěny do jamek mikrotitračních polystyrénových destiček obsahujících 150 ml roztoku testované látky (PTU nebo srovnávací cytokinin). Destičky byly umístěny do plastového boxu vystlaného filtračním papírem, který byl nasycen vodou za účelem maximální vzdušné vlhkosti. Po 96 hodinách inkubace ve tmě při 25 °C byly listové sekce vyjmuty a chlorofyl extrahován v 5 ml 80% ethanolu zahřátím při 80 °C po dobu 10 min. Objem vzorku byl poté doplněn na 5 ml přidáním 80% ethanolu. Absorbance extraktů byla měřena při 665 nm. Jako kontroly byly měřeny rovněž chlorofýlové extrakty z listů a listových vrcholů inkubované v deionizované vodě. Vypočtené hodnoty jsou průměrem z 5 opakování a celý experiment byl zopakován minimálně 2krát. V každém experimentu byla otestována aktivita PTU (roztoku vzniklého rozpuštěním krystalické formy vs. amorfní formy) a porovnána s aktivitou cytokininu 6-benzylaminopurinu (BAP), který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na ΙΟ^-3 M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10^-8 až 10^-4 M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2 % a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. Hodnoty IC50 byly stanoveny pro standard, 6-benzylaminopurin (BAP, cytokinin nej častěji používaný v rostlinných biotechnologiích a zemědělství) a pro krystalovou a amorfní formu PTU (Tab. 4).

Testovaná sloučenina PTU vzorce I vykazuje pozitivní vliv na oddálení senescence v segmentech listů pšenice ve tmě. Roztok vzniklý rozpuštěním krystalické formy PTU překonal významně anti-senescenční aktivitu roztoku vzniklého rozpuštěním amorfní formy PTU, obě formy PTU překonaly i BAP (cytokinin standardně používaný v rostlinných biotechnologiích a zemědělství). Obdivuhodný je i kvantitativní účinek na zpomalení senenscence po 4 dnech, neboť po aplikaci roztoku z krystalické formy PTU došlo pouze k degradaci 10,4 % chlorofýlu při 10^-4 M koncentraci, kdežto v případě roztoku z amorfní formy PTU k 18,8 % degradaci a u BAP dokonce k 44,5 % snížení obsahu chlorofýlu v listech (viz obr. 7).

Tabulka 4: Vliv na oddálení senescence v dekapitovaných segmentech listů Triticum aestivum cv. Hereward ve tmě.

Látka	Senescenční biotest (IC50, pM)/s.d.
6-benzylaminopurin (BAP)	10,5±2,2
Krystalická 1 -fenyl-3 -(4H-1,2,4-triazol-4-yl)močovina	0,8±0,8
Amorfní 1 -fenyl-3 -(4H-1,2,4-triazol-4-yl)močovina	5,41±0,13

- 11 CZ 310363 B6

Příklad 11: Anti-senescenční aktivita krystalické formy PTU testované v senescenčním testu na listových segmentech pšenice při působení světla

Schopnost zpomalit degradaci chlorofýlu v listech pšenice byla testována také ve světelných podmínkách. Experiment byl proveden, jak je popsáno v příkladu 10 s modifikacemi takto inkubace listů se sloučeninami byla provedena při periodě osvětlení 8/16 (tma/světlo - pmol.nr ².s^-1) při 22 °C po dobu 7 dnů. Jak je ukázáno v tabulce 5, roztok z krystalické PTU měl silnější pozitivní účinky na oddálení senescence v segmentech listů pšenice ve světelných podmínkách ve srovnání s roztokem z amorfní PTU i ve srovnání s benzylaminopurinem (BAP).

Tabulka 5: Vliv na oddálení senescence v dekapitovaných segmentech listů Triticum aestivum cv. Hereward na světle.

No.	Látka	Senescenční biotest (IC50, pM)/s.d.
1	6-benzylaminopurin (BAP)	12,5	(±3,3)
2	Krystalická 1 -fen vl-3-(4//-1.2.4-triazol-4-vl (močovina (PTU)	0,42	(±0,22)
3	Amorfní 1 -fen vl-3-(4//-1.2.4-triazol-4-vl (močovina (PTU)	2,16	(±0,41)

Příklad 12: Ochrana před peroxidací membránových lipidů v pšenici

Typickým projevem provázejícím senescenci je zvýšení hladiny reaktivních kyslíkových derivátů a následná peroxidace membránových lipidů. Proto byly stanoveny hladiny malonyldialdehydu (MDA), oxidativního markéru poškození membránových lipidů, v oddělených listech pšenice vystavených působení PTU nebo BAPu po dobu čtyř dnů v temnu, jak bylo popsáno v příkladu 10. Hladiny MDA byly stanoveny pomocí kyseliny thiobarbiturové (TBA). 100 mg čerstvého rostlinného materiálu bylo homogenizováno pomocí oscilačního mlýna (MM301, Retsch, Germany), s 1 ml 80% methanolu. Surový extrakt byl centrifúgován při 10,000xg po dobu 5 minut, 100 μΐ alikvot supematantu byl protřepán se 100 μΐ 0,5% (w/v) TBA obsahujícími 0,1% (w/v) trichloroctovou kyselinu, a výsledný roztok byl inkubován 30 minut při 95 °C. Vzorky byly rychle ochlazeny na ledu a centrifúgovány 5 minut při lOOOxg. Absorbance supematantu byla změřena při 532 nm s korekcí při 600 nm a množství vzniklého komplexu MDA-TBA bylo vypočítáno z extinkčního koeficientu 155 mM 'cnr¹. Roztok připravený z krystalické formy 1fcny 1-3-(4//-1.2.4-triazol-4-yl (močoviny výrazně snižuje peroxidací membránových lipidů ve srovnání s neošetřenou kontrolou a vzorky ošetřenými BAP (tab. 6 - hodnoty vyjadřují obsah MDA, což je produkt rozkladu membránových lipidů).

Tabulka 6: Účinek na peroxidací membránových lipidů v průběhu senescence ustřižených listů Triticum aestivum cv. Hereward v temnu.

No.	Testovaná látka	MDA (nmol/g FW)
0	Neošetřená kontrola	21,7 (±2,2)
1	6-benzylaminopurin (BAP)	19,2 (±1,4)
2	Krystalická 1 -fenyl-3 -(4H-1,2,4-triazol-4-yl)močovina	13,8 (±1,1)

Příklad 13: Testování nové krystalické formy PTU v Amaranthovém biotestu

Pro studium cytokininové aktivity byl rovněž použit “amarantový” biotest v následující modifikaci. Semena Amaranthus caudatus var. Atropurpurea byla povrchově sterilizována 10 % /V-chlorbenzensulfonamidem (w/v) po dobu 10 min a poté promyta 5krát deionizovanou vodou.

- 12 CZ 310363 B6

Semena byla rozmístěna v 15 cm Petriho miskách s filtračním papírem saturovaným destilovanou vodou. Po 72 hodinách kultivace při 25 °C ve tmě byly ze semenáčků odstraněny kořeny. Tyto explantáty obsahující 2 kotyledony a hypokotyl byly umístěny do 5 cm Petriho misek na 2 vrstvy filtračního papíru nasyceného 1 ml inkubačního média obsahujícího 10 mol l^HPCfi-KFbPCh, pH 6,8, 5 pmol tyrosinu a testovanou látku. Na misku bylo umístěno 20 explantátů. Veškeré manipulace byly prováděny pod zeleným světlem v temné komoře. Po 48 hodinách inkubace při 25 °C ve tmě byl betacyanin extrahován cestou zmražení explantátů v 3,33 μΜ kyselině octové. Koncentrace betacyaninu byla stanovena porovnáním absorbancí při 537 a 620 nm a vypočtena pomocí vzorce ΔΑ = Assvnm - Ae20nm. Hodnoty byly vyneseny do grafů závislosti AA na koncentraci. Pět replikátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a daný test byl opakován minimálně 2krát. V experimentu byl použit jako kontrolní látka 6-benzylaminopurin (BAP), který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované látky (formy) byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na ΙΟ^-3 M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10^-8 až 10^-4 M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2 % a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. 10^-4 M koncentrace kontrolní látky 6-benzylaminopurinu (BAP) byla postulována jako 100 % biologické aktivity. Roztok připravený z krystalické PTU vykazoval vyšší aktivitu v amaranthovém biotestu než kontrolní cytokinin BAP, a to 107,03% aktivity BAP, kdežto roztok připravený z amorfní PTU 87,97% (obr. 8).

Příklad 12: Testování vlivu na buněčné dělení rostlinných buněk

Stimulační vliv PTU byl testován v kalusovém biotestu za použití cytokinin-dependentního kalusu tabáku. Tento cytokinin-dependentní tabákový kalus Nicotiana tabacum U. cv. Wisconsins 38 byl udržován při 25 °C na modifikovaném mediu Murashige-Skoog (MS) obsahujícím na 1 litr: 4 pmol kys. nikotinové, 2,4 pmol pyridoxin hydrochloridu, 1,2 pmol thiaminu, 26,6 pmol glycinu, 1,37 pmol glutaminu, 1,8 pmol myo-inositolu, 30 g sacharózy, 8 g agaru, 5,37 pmol α-naftyloctové kyseliny a 0,5 pmol 6-benzylaminopurinu. Subkultivace probíhala každé 3 týdny. Čtrnáct dní před započetím biotestu byl kalus přenesen na médium bez 6-benzylaminopurinu (BAP). Stimulační růstová aktivita byla stanovena na základě nárůstu čerstvé hmoty kalusu po 4 týdnech kultivace. Pět replikátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a daný test byl opakován minimálně 2krát. V každém experimentu byla použita jako kontrolní látka 6-benzylaminopurin, který je znám vysokou cytokininovou aktivitou. Testované formy PTU byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na ΙΟ^-3 M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10^-8 až 10^-4 M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2 % a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. Ze získaných dat byla opět vypočítána maximální účinná koncentrace testované formy a její relativní účinnost v této koncentraci (Tab. 7). ΙΟ^-5 M koncentrace kontrolní látky 6-benzylaminopurinu byla postulována jako 100% biologické aktivity.

Krystalická forma I-feny 1-3-(4//-1.2.4-triazol-4-yl (močoviny (PTU) obecného vzorce I vykazovala výraznou cytokininovou aktivitu v kalusovém biotestu ve srovnání s klasickým cytokininem. PTU vykazuje výhodné buněčně-stimulační vlastnosti, které je možné významně využívat v tkáňových kulturách a v rostlinných biotechnologiích, neboť PTU nevykazuje charakteristickou inhibiční aktivitu BAP v kalusovém biotestu při vyšších koncentracích (10^-4 M) a má tak praktické uplatnění v mnohem širším rozsahu koncentrací.

Tabulka 7: Vliv nových PTU na růst cytokinin-dependentního tabákového kalusu Nicotiana tabacum U. Cv. Wisconsins 38

- 13 CZ 310363 B6

č.	Testovaná sloučenina	maximální účinná koncentrace (mol.H)	aktivita (%) [ICUmol.l·1 BA? = ioo%l
1	6-benz.ylaminopuria (BAP)	icu	100 (±11,4)
2	adeniti	10-5	10,4(±0,3)
3	Krystal 1 -fenyi-3-(4H-1 s2344riazol-4-yljmočovína	1CH	98,3 (±10,2)
4	Ainorf l-fenyl-3-(4H-l,2,4-triazoL4-yl)moč.ovma(PTU	ItH	93,6 (±S,4)

Příklad 13 Vliv na růst kořenů Arabídopsís thalíana

Semena Arabídopsís thalíana (ekotyp Columbia) byla sterilizována 70 % ethanolem obsahujícím 0,1% Triton X-100, a poté byla omyta 70 % ethanolem obsahujícím 0,01% Triton X-100. Poté byla semena přenesena do čtvercových vertikálních Petriho desek (11 semen na desku) na pevné medium obsahující MS (2,15 g/1), MES (0,5 g/1), sacharózu (1 g/1), agar (11 g/1), pufrované na pH 5,8, a různé koncentrace testovaných látek. Látky byly rozpuštěny v DMSO a vzhledem k tomu bylo 0,05 % DMSO použito jako kontrolní roztok. Po třídenní inkubaci ve tmě při 4 °C semena klíčila a rostliny dále rostly v růstových komorách (fluorescenční světlo o intenzitě 150 μΕ m^-2 s¹, vlhkost 55 %, 16 h den/8 h noc, 22 °C). Po 7 a 14 dnech byla vyhodnocena délka primárního kořene pomocí software Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD, USA). Počet postranních kořenů byl spočten pod binokulární zvětšovací lupou. Aplikace látky PTU do MS media neměla negativní vliv na prodlužování kořene v rozmezí od 1 μΜ po 100 nM. Naopak, klasické cytokininy jakými jsou trans-zeatin, BAP (kontrola), kinetin, meta-a ortho-topolin a isopentenyladenin, jak známo ze stavu techniky, významně inhibovaly prodlužování a větvení kořene již v nanomolámí koncentraci. PTU navíc mírně zvyšoval počet zakládaných postranních kořenů. Semenáčky Arabídopsís rostoucí na MS médiu obsahujícím PTU nevykazovaly znatelné změny (redukci) v počtu a velikosti zakládaných listů, narozdíl od cytokininů (tab. 8).

Tab. 8: Účinek PTU v porovnání s klasickými cytokininy na růst kořenů Arabídopsís - počet postranních kořenů a délka hlavního kořene.

Testovaná sloučenina	Koncentrace s nejvyšší aktivitou (mol.I1)	Délka hlavního kořene	Počet postranních kořenů
Aktivita (%) [lO^mol.l1 BAP = 100%]
/ram-zcatin	IO~7	88,5 (± 16)	92,1 (± 12)
meto-topolin	io-7	94,8 (± 14)	89,8 (± 10)
ortúo-topolin	ΙΟ7	42,7 (± 17)	59,4 (± 12)
kinetin	ΙΟ7	68,6 (± 12)	73,9 (± 10)
isopentenyladenin	io-7	45,7 (± 16)	62,8 (± 12)
6-(3 -methoxybenzylamino)purin (3MeOBAP)	ΙΟ7	69,3 (± 19)	76,5 (± 14)
PTU	ΙΟ7	218,4 (±28)	237,8 (±21)

Příklad 14: In vitro cytotoxická aktivita (metabolizace kalceinu AM)

Protože toxické sloučeniny negativně ovlivňují metabolické procesy buněk, je mnoho standardních testů cytotoxicity založeno na měření rychlosti metabolizace různých umělých substrátů. Výsledná životaschopnost je pak kvantifikována například pomocí spektrometrie.

- 14 CZ 310363 B6

Testy lze snadno modifikovat pro použití v 96-jamkových destičkách. Pro vyhodnocení cytotoxicity PTU podle vynálezu byl použit mikrotitrační test založený na kvantifikaci metabolizace Calceinu AM. Test je široce používán v programech testování léků a při testování životaschopnosti. V živých buňkách je Calcein AM enzymaticky hydrolyzován a kumulace výsledného kalceinu se projevuje zeleným zbarvením.

Následující buněčné linie - RPMI 8226 (mnohočetný myelom), CEM (T-lymfoblastická leukémie), K562 (chronická myeloidní leukémie), HL-60 (promyelocytámí leukémie), MCF-7 (adenokarcinom prsu), HeLa (karcinom děložního čípku), G361 (maligní melanom), HOS (lidský osteosarkom) a BJ (lidské předkožkové fibroblasty) - byly získány ze sbírky American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Tyto buňky byly udržovány ve standardním médiu DMEM nebo RPMI (Sigma, MO, USA) doplněném tepelně inaktivovaným fetálním hovězím sérem (10 %) 2 mM Z-glutaminem a 19ivotaschostreptomycínem (1%) za standardních podmínek buněčné kultury (37°C) C, 5% CO2 ve vlhkém prostředí) a subkultivovány dvakrát nebo třikrát týdně pomocí standardního trypsinizačního postupu.

Přibližně 10 000 buněk v 80 pl média bylo naočkováno do 96-jamkové mikrotitrační destičky. Po 12 hodinách inkubace byly testované sloučeniny přidány ve 20 μΐ podílech. Kontrolní kultury byly ošetřeny samotným DMSO. Konečná koncentrace DMSO v médiu nepřesáhla 0,5 %. Byla testována sériová, trojnásobná ředění (celkem šest, nej vyšší koncentrace v inkubacích 166 μΜ) každé sloučeniny. Po 72 hodinách inkubace byl přidán roztok Calcein AM (Molecular Probes) do konečné koncentrace 1 pg/ml a buňky byly inkubovány další hodinu. Fluorescence volného kalceinu byla poté kvantifikována s použitím fluorometru Fluoroscan Ascent (Microsystems) a procento přežívajících buněk v každé jamce bylo vypočteno dělením OD získané z každé buňky exponovanými buňkami střední OD získanou z kontrolních jamek x 100 %. Nakonec byly vypočteny hodnoty IC50 (koncentrace způsobující 50% pokles 19ivotasc buněčné esterázy) pro každou sloučeninu generovaných z křivek závislosti odpovědi na dávce (Kryštof et al., 2005, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12, 3283-3286). Zde uvedené hodnoty IC50 jsou průměry získané z alespoň tří nezávislých měření, kde jednotlivé hodnoty replikace spadaly do 20 % průměru. Inhibice růstu byla vypočtena pomocí následující rovnice: IC50 = (průměr FD_jamk_a exponovaná k cytokininu - průměr FDbi_ank) / (průměr FDkontroiní _jamk_y - průměr FDbi_ank) x 100 %. Hodnota IC50, koncentrace léčiva způsobující 50% snížení konverze Calceinu AM, byla vypočtena ze získaných křivek závislosti odpovědi na dávce.

Cytoxicita sloučenin byla testována na panelu buněčných linií různého histogenetického a druhového původu. Nulová cytotoxicita je základním předpokladem pro použití těchto látek v biotechnologických a zemědělských aplikacích. Pro vyhodnocení cytotoxické aktivity byly testovány klasické cytokininy a PTU na panelech obsahujících buněčné linie rozdílného histogenetického a druhového původu (tab. 9). Ukázalo se, že pro všechny testované nádorové linie bylo působení PTU nulové a rovněž pro nemaligní buněčné linie, tzn. NIH3T3 fibroblasty a normální lidské lymfocyty; všechny byly vůči tomuto působení PTU rezistentní. Oproti tomu jsou některé “klasické cytokininy” reprezentované 6-substituovanými puriny (jsou známé z dřívější techniky) cytotoxické. Krystalická forma I-feny 1-3-(4//-1.2.4-triazol-4-yl (močoviny (PTU) obecného vzorce 1 vykazuje nulovou toxicitu pro normální i nádorové buňky v koncentracích vyšších něž 166,7 μΜ a je proto mnohem vhodnější pro zemědělské a biotechnologické aplikace než “klasické cytokininy” (6-substituované deriváty purinu).

Tabulka 9. Cytotoxická aktivita PTU v porovnání s klasickými cytokininy vyjádřená jako hodnoty IC50 ve 3-denním testu Calcein-AM. Prezentované hodnoty jsou průměry alespoň 3 nezávislých 20ivotascho, kde jednotlivé replikáty spadají do 20ivotasc 20% kolem průměru.

- 15 CZ 310363 B6

	Použitá	buněčná	inie / GLo (pmol/L)
Sloučenina	HOS	K-562	MCF7	B16-F0	NIH-3T3	G-361	CEM	HL60
kinetin	>166,7	164,1	>166,7		>166,7		155,1
isopentenyladenin	>166,7	146,9	>166,7		>166,7		92,2	>166,7
benzyladenin	>166,7	138,9	166,1		>166,7		>166,7	>166,7
/ram-zeatin			>166,7		>166,7		>166,7	>166,7
meto-topolin	>166,7	128,4	>166,7	90,6	>166,7	>166,7	90,1	79,2
ort/io-topolin	>166,7	>166,7	>166,7	150	>166,7	103,4	69,2	78
adenin		>166,7	>166,7		>166,7		>166,7	>166,7
PTU	>166,7		>166,7		>166,7		>166,7

Příklad 15: Amesůvtest

Krystalická forma I-feny 1-3-(4//-l.2.4-triazol-4-yl (močoviny obecného vzorce 1 byla testována na mutagenitu bakteriálním testem reverzních mutací. Provedení testu bylo založeno na metodě EU B. 13/14 Mutagenicity - Reverse mutation test using bacteria, která je analogem metodiky OECD Test Guideline No. 471. Byly použity čtyři indikátory kmene Salmonella typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1537 a jeden kmen Escherichia coli WP2 uvrA. Krystalická forma PTU byla rozpuštěna v dimethylsulfoxidu (DMSO) a byla testována v dávkách 10 až 1000 pg na jednu desku, která byla aplikována na plotny v objemu 0,1 ml. Experimenty byly prováděny s metabolickou aktivací se supematantem z krysích jater a směsi kofaktorů stejně jako bez metabolické aktivace. Pracovní postup byl proveden podle dokumentů Metody B. 13/14, Mutagenicity - Reverse mutation test using bacteria, Council Regulation (EC) No.440/2008. Published in O. J. L 142, 2008 a podle metodiky OECD Test Guideline 471, Bacterial Reverse Mutation Test. Adopted July 21, 1997. Při testování v uspořádání uvedeném výše se testovaná látka projevila jako nemutagenní pro všechny použité testovací kmeny s metabolickou aktivací stejně jako bez metabolické aktivace.

Příklad 16 Listová aplikace látky PTU prodlužuje délku života Arabidopsis thaliana ve stresových podmínkách za sucha a snižuje ztráty na výnosu

Mladé rostlinky Arabidopsis thaliana, pěstované v malých květináčích ve hlíně byly postříkány 0,01 μΜ vodným roztokem látky PTU ve fázi 4 pravých listů (do 14 až 20 dnů po zasetí). Kontrolní rostliny byly postříkány vodným roztokem DMSO (c = 0,01% (v/v)) a silwetu (c = 0,001% (v/v)). Kontrolní rostliny byly dále rozděleny na zalévané a rostliny s redukovanou zálivkou (stresované suchem). Ošetřené rostliny látkou PTU měly stejně redukovanou zálivku (stresované suchem). Všechny rostliny byly pěstovány až do fáze jejich přirozené smrti. Kontrolní zalévané rostliny žily v průměru 85 dní, než samovolně uschly. Jejich výnos semen byl v průměru 141 (±22) mg. Kontrolní rostliny s redukovanou zálivkou žily v průměru pouze 61 dní a průměrný výnos byl 95 (±14) mg. Rostliny ošetřené látkou PTU a s redukovanou zálivkou žily v průměru 75 dní a jejich průměrný výnos byl 117 (±16) mg. Tato data jasně ukazují (tab. 10), že PTU signifikantně zvyšuje výnos a životaschopnost rostlin Arabidopsis, které byly vystaveny stresu životního prostředí.

Tabulka 10: Listová aplikace látky PTU redukuje ztráty na výnosu semen Arabidopsis thaliana

	Výnos (mg)	Výnos(%)	benefit
Kontrola zalévaná	141 ±22	100 %
Kontrola s redukovanou zálivkou	95 ±14	67 %
Rostliny s redukovanou zálivkou ± 0,01 μΜ PTU	117 ±16	83 %	+16 %

- 16 CZ 310363 B6

Příklad 17: Aplikace látky PTU zvyšuje výnos semene ječmene v polních podmínkách

V polním pokusu byl zkoumán vliv látky PTU na výnos semen ječmene a na jeho fenotyp. Všechny polní pokusy byly provedeny podle kritérií platných pro Dobrou agrikultumí praxi (Good agricultural practice), tzn. šest ploch o 10 m² bylo použito na jednu variantu. Plodina dále nebyla ošetřena žádným jiným růstovým regulátorem (jen látkou PTU) ani fungicidem. Krystalická forma PTU byla suchým obalováním aplikována na semena v koncentraci 10 μΜ před výsevem. Takto ošetřená semena ječmene byla pěstována na poli v roce 2016 a výnos těchto rostlin byl srovnán s neošetřenou kontrolou (tab. 10). Ošetřené rostliny měly výnos semene 105,3 % oproti kontrole (100%). Analýza fenotypu dále ukázala, že vyšší výnos mohl být způsoben větším počtem odnoží, kterých ošetřené rostliny měly o 14% více než kontrolní rostliny. V polních podmínkách byl testován i vliv listové aplikace látky PTU na výnos ječmene. Uátka PTU (roztok připravený z krystalické formy) byla aplikována na listy ječmene v koncentraci 5 pM (v objemu 200 1 na hektar) ve dvou různých obdobích - BBCH 21-23 a BBCH 51. Obě aplikace vedly ke zvýšení výnosu semene, a to na 106,3 % a 106,8 % oproti kontrole (100 %), respektive (tab. 11).

Tabulka 11: Aplikace látky PTU zvyšuje výnos semene ječmene v polních podmínkách

	Fáze růstu	Výnos(%)	Benefit
Kontrola		100 %
10 pM látka PTU (aplikace na semena)		105,3 %	+ 5,3 %
5 pM látka PTU (listová aplikace)	BBCH 21-23	106,3 %	+ 6,3 %
5 pM látka PTU (listová aplikace)	BBCH 51	106,8 %	+ 6,8 %

Příklad 18: Aplikace látky PTU zvyšuje výnos semene ozimé řepky v polních podmínkách

V tomto pokusu byl sledován vliv listové aplikace látky PTU (koncentrace 1 pM v objemu 300 1 na hektar, roztok připraven z krystalické formy PTU) na výnos ozimé řepky v polních podmínkách. Polní pokusy byly opět provedeny dle kritérií platných pro Dobrou agrikultumí praxi. Uátka PTU byla aplikována na rostliny ve dvou různých obdobích - BBCH 30 a BBCH 33 až 35. V prvním případě došlo ke zvýšení výnosu semene řepky na 106,2 % oproti kontrole a v druhém případě došlo ke zvýšení výnosu semene na 108,8 % oproti kontrole (100 %) (tab. 12). Dále bylo zjištěno, že semena ošetřených rostlin byla mírně těžší, hmotnost tisíce semen u kontroly byla 5,38 g. Hmotnost tisíce semen u ošetřených rostlin byla 5,6 g (BBCH 30) a 5,8 g (BBCH 33 až 35). Tento jev se také podílel na zvýšení celkového výnosu semen.

Tabulka 12: Aplikace látky PTU zvyšuje výnos semene ozimé řepky v polních podmínkách

	fáze růstu	Výnos(%)	benefit
Kontrola		100 %
1 pM látka PTU (listová aplikace)	BBCH 30	106,2 %	+ 6,2 %
1 pM látka PTU (listová aplikace)	BBCH 33 až 35	108,8 %	+ 8,8 %

Příklad 19: Aplikace látky PTU zvyšuje výnos semene pšenice v polních podmínkách

Dále byl sledován vliv aplikace látky PTU na výnos pšenice v polních podmínkách. Uátka byla opět aplikována buď na semena pšenice před výsevem (= moření semen látkou PTU v koncentraci 50 μΜ) nebo na listy (= postřik látkou PTU v koncentraci 5 pM) ve dvou různých období - BBCH 25 a BBCH 51. Všechny polní pokusy byly provedeny dle kritérií platných pro Dobrou agrikultumí praxi. V případě moření semen byl výnos zvýšen na 104,0 % oproti kontrole (100 %). V případě listové aplikace byl výnos zvýšen na 105,9 (BBCH 21) a na 105,0 % (BBCH 51) oproti kontrole (100 %) (tab. 13). Analýza fenotypu zjistila, že ošetřené rostliny měly zhmba

- 17 CZ 310363 B6 o 7 % více odnoží než kontrolní rostliny.

Tabulka 13: Aplikace látky PTU zvyšuje výnos semene pšenice v polních podmínkách

	Fáze růstu	Výnos(%)	Benefit
Kontrola		100
50 μΜ látka PTU (aplikace na semena)		104	+ 4,0 %
5 μΜ látka PTU (listová aplikace)	BBCH 25	105,9	+ 5,9 %
5 pM látka PTU (listová aplikace)	BBCH51	105	+ 5,0 %

Příklad 20: Přípravky

Aktivní složkou v přípravcích je krystalická forma 1 -feny 1-3-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny (PTU) obecného vzorce 1.

AI. Smáčivé prášky Aktivní složka lignosulfonát sodný laurylsulfát sodný diisobutylnaftalensulfonát sodný oktylfenol polyglykol ether (7 až 8 mol ethylen oxid) vysoce disperzní kyselina křemičitá kaolin

a) b) c) d) % 25 % 50 % 80 %

4% - 3% % 3 % - 4 % % 5 % 6 %

1% 2% % 3 % 5 % 10 %

87% 61% 37%

Aktivní složka je důkladně promísena s pomocnými látkami a směs je důkladně rozemleta ve vhodném mlýnu. Suspenzi libovolné koncentrace je možné získat smísením vzniklého prachu s vodou.

A2. Potahované granule

Aktivní složka vysoce disperzní kyselina křemičitá anorganický nosič (0,1 až 1 mm) např. CaCOs nebo S1O2

a)	b)	c)
0,1 %	c 0/ J /0	15 %
0,9 %	2%	2%
99,0 %	93 %	83 %

Aktivní složka je rozpuštěna v methylenchloridu a nasprejována na nosič. Rozpouštědlo je odpařeno ve vakuu.

A3. Potahované granule	a)	b)	c)
Aktivní složka	0,1 %	c 0/ J /0	15 %
polyethylenglykol MW 200	1,0 %	9 o/ Z /0	3 %
vysoce disperzní kyselina křemičitá	0,9 %	1 %	2%
anorganický nosič	98,0 %	92%	80 %
(AE 0,1 až 1 mm)
např. CaCOs nebo S1O2

Jemně rozemletá aktivní složka je v mixéru stejnoměrně nanesena na nosič zvlhčený polyethylenglykolem. Takto jsou získány neprašné granule.

A4. Extrudované granule Aktivní složka lignosulfonát sodný karboxymethylcelulosa

a)

0,1 %

1,5 %

1,4 %

b)

Ώ 0/ 3 /0

0/ Z /0 o/ Z /0

c) c 0/

J /0

Ώ 0/ 3 /0

0/ Z /0

d) %

4%

2%

- 18 CZ 310363 B6 kaolin

97,0 % 93 % 90 % 79 %

Aktivní složka je smísena a rozemleta s pomocnými látkami a složka je zvlhčena vodou. Směs je extrudována a usušena v proudu vzduchu.

A5. Prachy	a)	b)	c)
Aktivní složka	0,1 %	1 %	5%
talek	39,9 %	49%	35 %
kaolin	60,0 %	50%	60%

Prachy k přímému použití jsou získány rozemletím aktivní složky s nosičem ve vhodném mlýnu.

A6. Suspenzní koncentrát	a)	b)	c)	d)
Aktivní složka	Ώ 0/ 3 /0	10%	25 %	50%
ethylen glykol	C 0/ J /0	5 %	5%	5 %
nonylfenol polyglykol ether	-	1 0/ 1 /o	2%	-
(15 mol ethylen oxid)
lignosulfonát sodný	Ώ 0/ 3 /0	Ώ 0/ 3 /0	4%	c 0/ J /0
karboxymethylcelulosa	1 %	1 %	1 %	1 %
37 % vodný roztok formaldehydu	0,2 %	0,2 %	0,2 %	0,2 %
emulse silikonového oleje	0,8 %	0,8 %	0,8 %	0,8 %
voda	86%	78 %	64%	38 %

Jemně rozemletá aktivní složka je smíchána s pomocnými látkami. Vzniklý suspenzní koncentrát umožňuje přípravu suspenze o požadované koncentraci zředěním vodou.

Claims (9)

1. Krystalická forma l-fenyl-3-(4//-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny (PTU) vzorce I

(I) mající charakteristické reflexe ve spektru rentgenové práškové difrakce měřené zářením CuKa:

8,3; 12,2; 18,8; 21,0; 26,4; 30,8 ±0,2° 2-theta.

2. Krystalická forma l-fenyl-3-(4//-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny podle nároku 1, mající další charakteristické reflexe ve spektru rentgenové práškové difrakce měřené zářením CuKa: 15,4; 16,5; 20,6; 22,0; 24,5; 28,1 ±0,2° 2-theta.

3. Krystalická forma I-feny 1-3-(4//-1.2.4-triazol-4-yl (močoviny podle nároku 1 nebo 2, mající teplotu tání 230 až 231 °C.

4. Použití krystalické formy l-fenyl-3-(4//-1.2,4-triazol-4-yl)močoviny podle nároků 1 až 3 jako antioxidační, antisenescenční, proliferaci stimulující a/nebo pro-diferenciační látky u rostlinných buněk, pletiv, orgánů i celých rostlin.

5. Použití krystalické formy l-fenyl-3-(4//-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro zvýšení výnosů u rostlin, zvýšení kvality rostlinných produktů, zvýšení odolnosti rostlin proti stresu, pro urychlení nalévání semen, pro zvětšení velikosti semen a plodů rostlin a/nebo pro zkrácení doby klíčení semen, v zemědělství, zahradnictví, lesnictví a rostlinných biotechnologiích.

6. Použití krystalické formy l-fenyl-3-(4//-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny podle nároků 1 až 3 pro oddálení degradace chlorofylu a oddálení senescence rostlin, rostlinných buněk, pletiv a/nebo orgánů.

7. Použití krystalické formy l-fenyl-3-(4//-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny podle nároků 1 až 3 jako inhibitoru stresu a stresem indukované senescence v produkci plodin.

8. Anti-senescenční, antioxidační a/nebo antistresové přípravky na celé rostliny, rostlinné orgány a/nebo rostlinné buňky, vyznačené tím, že obsahují krystalickou formu l-fenyl-3-(4//-1,2,4-triazol4-yl)močoviny obecného vzorce I podle kteréhokiliv z nároků 1 až 3 a alespoň jednu pomocnou látku.

9. Způsob inhibice senescence a/nebo stresu v rostlinách, v rostlinných orgánech a/nebo v rostlinných buňkách, vyznačený tím, že zahrnuje aplikaci krystalické formy l-fenyl-3-(4//-1,2,4triazol-4-yl)močoviny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 na rostlinu nebo na rostlinné buňky nebo na rostlinné orgány.