CZ2010670A3 - Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny - Google Patents

Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny Download PDF

Info

Publication number
CZ2010670A3
CZ2010670A3 CZ20100670A CZ2010670A CZ2010670A3 CZ 2010670 A3 CZ2010670 A3 CZ 2010670A3 CZ 20100670 A CZ20100670 A CZ 20100670A CZ 2010670 A CZ2010670 A CZ 2010670A CZ 2010670 A3 CZ2010670 A3 CZ 2010670A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
chloroethyl
bromoethyl
chloropropyl
bromopropyl
bromomethyl
Prior art date
Application number
CZ20100670A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ303054B6 (cs
Inventor
Mik@Václav
Szücová@Lucie
Doležal@Karel
Spíchal@Lukáš
Galuszka@Petr
Strnad@Miroslav
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Palackého v Olomouci filed Critical Univerzita Palackého v Olomouci
Priority to CZ20100670A priority Critical patent/CZ303054B6/cs
Priority to EP11781999.5A priority patent/EP2613631B1/en
Priority to PCT/CZ2011/000086 priority patent/WO2012031574A1/en
Priority to US13/821,163 priority patent/US9220269B2/en
Publication of CZ2010670A3 publication Critical patent/CZ2010670A3/cs
Publication of CZ303054B6 publication Critical patent/CZ303054B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/26—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with an oxygen, sulphur, or nitrogen atom directly attached in position 2 or 6, but not in both
    • C07D473/32—Nitrogen atom
    • C07D473/34—Nitrogen atom attached in position 6, e.g. adenine

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Predkládané rešení se týká použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu obecného vzorce I, kde R.sub.6.n. je -NH-furfuryl, -NH-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl), -NH-(3-methylbut-2-en-1-yl), -NH-(4-hydroxy-3-methylbutyl), -NH-(4-hyroxy-1,3-dimethylbut-2-en-1-ylamino), -NH-(4-hydroxy-1,3-dimethylbutylamino), -NH-benzyl, -NH-fenyl, a R.sub.9.n. je C.sub.1.n.-C.sub.3.n. alkyl a C.sub.1.n.-C.sub.3.n. alkenyl, pricemž každá z techto skupin je substituována jedním nebo více atomy halogenu, pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, která zahrnuje napr. stimulaci organogeneze u rostlin vedoucí ke zvetšení korenového systému, urychlení nalévání semen a zvetšení velikosti semen a plodu jednodeložných rostlin a zkrácení doby klícení semen rostlin, prípravku pro klonování rostlinných bunek, orgánu, zárodecných bunek a embryí a rustove-regulacních prípravku.

Description

(57) Anotace:
Předkládané řešení se týká použiti 6-substituovaných 9halogenalkyl purinů obecného vzorce I, kde R<,je -NHíurluryl. -Nll-(4-hydroxy-3-mcthylbut-2-en-l-yl), -Ntl-(3methylbut-2-en-1 -yl), -NH-(4-hydroxy-3-mcthylbutyl), -NH(4-hyroxy-I,3-dimethylbut-2-en-l-ylamíno). -NH-(4-hydroxv1.3-dimethylbutylamino). -NH-benzyl. -NH-těnyL a R?je C|Cjalkyl a C|-Cj alkenyl. přičemž každá z těchto skupinje substituována jedním nebo více atomy halogenu, pna regulaci růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk, která zahrnuje např. stimulaci organogeneze u rostlin vedoucí ke zvětšení kořenového systému, urychlení nalévání semen a zvětšeni velikosti semen a plodit jcdnoděložných rostlin a zkrácení doby klíčen: semen rostlin, přípravků pro klonování rostlinných buněk, orgánů, zárodečných buněk a embryi a rústově-regulačních přípravků.
I i
Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinů pro regulaci růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny
Oblast techniky
Vynález se týká použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinů pro regulaci růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk, přípravků obsahujících tyto deriváty a nových 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinů.
Dosavadní stav techniky
Rostlinné hormony cytokininy (CK) hrají klíčovou roli v různých fyziologických procesech, jako je vývoj, stresové reakce nebo senescence rostlin. Jejich hladiny jsou v různých tkáních nebo buněčných kompartmentech velmi přesně regulovány. Mechanismus regulace CK je zprostředkováván proteiny účastnícími se biosyntézy, aktivace, degradace, transportu nebo percepce CK. Cytokinin dehydrogenasy (CKX, EC 1.5.99.12) jsou enzymy deaktivující CK ireverzibilní degradací jejich molekuly. V rostlinách existuje několik isoforem CKX, které mají různou specifitu vůči cytokininům (Bilyeu et al. 2001, Plant Phys. 125:378; Šmehilová et al. 2009, J.Exper.Bot. 60:2701). Sledování změn hladin transkriptů jednotlivých isoforem CKX v listech huseníčku, kukuřice a ječmene odhalily zvýšenou expresi některých isoforem v průběhu senescence listů a stresu, což vede ke snížení hladiny cytokininů během senescence. Dále bylo zjištěno, že při solném a osmotickém stresu je navíc posílena i biosyntéza CK, což ve výsledku vede k mírnému nárůstu aktivních forem CK (Vyroubalová et al. 2009, Plant Physiol. 151:433). Celkově tato pozorování naznačují významnou roli různých forem CK během různých fyziologických procesů, jako je abiotický stres (Kuiper et al. 1990, Plant and Soil 123, 243; Davies & Zhang 1991, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42,55; Havlová 2008, Plant Cell Env. 31:341) nebo senescence (Eisinger 1977, Plant Phys. 90, 1316; Lara et al. 2004, Plant Cell 16:1276). Přesná role CK v uvedených procesech, zejména senescenci listů, však dosud nebyla objasněna.
Senescence listů je klíčovým krokem životního cyklu jednoletých rostlin, hrající důležitou roli v reprodukci, produktivitě, zvládání stresu a přežití u rostlin. Senescence je posledním krokem vývoje listů, závisejícím na věku, přičemž se ukazuje, že se jedná o složitý a vysoce regulovaný proces. Během tohoto procesu se ve stárnoucím listu remobilizují uložené živiny a nastávají degradační procesy vedoucí k podpoře mladších vyvíjejících se orgánů, jako jsou mladé listy, plody či semena. Jedním z typických vizuálních symptomů senescence listů je ztráta chlorofylových pigmentů (žloutnutí), způsobená náhradou obsahu chloroplastů produkty procesů buněčné degradace. Žloutnutí listů je dále následováno ztrátou vody a případným oddělením listu. Na buněčné nebo molekulární úrovni zahrnují procesy vedoucí k těmto vizuálním symptomům kromě desintegrace chloroplastů také ztrátu proteinů a nukleových kyselin buňky. Molekulární podstata těchto dějů je pod kontrolou velmi rozdílných rostlinných regulačních mechanizmů. Ačkoliv senescence nastává s rostoucím věkem u mnoha druhů, její začátek a progrese může být ovlivňována mnoha faktory prostředí, jako je teplota, nedostatek minerálů a sucho, nebo vnitřními faktory, jako jsou regulátory růstu rostlin. Senescence listů je obecně vyvážena širokým spektrem fytohormonů, přičemž pokles hladiny cytokininů koreluje s procesem senescence v listech (Winkler et al., 2006, J. Exp. Bot. 57:391). Dále bylo ukázáno, že exogenní aplikace cytokininů inhibuje degradaci
U* chlorofylu a proteinů fotosyntetického aparátu (He et al. 2005, J. Exper. Bot. 56, 1117*1128). Strategie oddálení senescence zahrnovala transgenní expresi isopentenyl transferasy (IPT; 2.5.1.27), enzymu podílejícího se na biosyntéze cytokininů. Transgenní rostliny se zvýšenými hladinami cytokininů vykazovaly oddálenou senescenci (Gan et al. 1995, Science 270:1986). Jiný přístup k udržení dostatečných hladin aktivních cytokininů v rostlinných tkáních zahrnuje inhibici cytokinin dehydrogenasy. Cytokinin-deficitní transgenní rostliny však nevykazovaly dřívější nástup senescence listů (Werner et al. 2003, Plant Biol. 8:371). Není tedy zatím prokázáno, zda snížení hladiny cytokininů způsobuje senescenci nebo zda se jedná o průvodní jev senescence. Enzymy považované za důležité v iniciaci a progresi senescence dále zahrnující proteasy, nukleasy a další degradativní enzymy. Předpokládá se, že enzymy podílející se na rozpadu chloroplastů mohou být přímo-indukované cytokininy. Remobilizace živin a udržování aktivity dalších částí rostlin je zajištěno enzymy regulujícími interakce zdroj-sink, především pak enzymy apoplastické floémové vykládací dráhy. Bylo zjištěno, že extracelulámí invertasa, jeden z enzymů regulujících koncentraci hexosových cukrů v pletivech, je koindukovaná cytokininy. Bylo dále ukázáno, že extracelulámí invertasa je potřebná pro oddálení senescence, což znamená, že mechanismus oddálení senescence cytokininy zahrnuje extracelulámí invertasu (Lara et al. 2004, Plant Cell 16:1276). Bylo předpokládáno, že cytokinin dehydrogenásová aktivita se účastní procesu senescence, protože byla zjištěna výrazná upregulace dvou isoforem těchto enzymů deaktivujících cytokininy na , > ϊ 4 I I ί l «» » * Ί ♦ ’ J » I» ί · I » * I ι f · Λ f i » * . »1 * úrovni exprese genů a v měřeních enzymové aktivity (Šromová Lucie, diplomová práce 2006, PřF UP).
Skutečnost, že cytokininy mohou oddalovat senescenci, je známá od první izolace kinetinu (N6-furfurylaminopurin) (Miller et al. 1956, J. Am. Chem. Soc. 78:1375) a testování jeho antisenescenčních vlastností na oddělených listech Xanthia (Richmond & Lang 1957, Science 125:650). Mnoho různých derivátů cytokininů oddaluje senescenci v různých druzích rostlin (Zhang & Letham 1989, J. Plant Growth Regul. 8:181; Kuhnle et al. 1977, Physiol. Plant. 41:14; Eisinger 1977, Plant Physiol. 59:707; Kudryakova et al. 2001, Plant Growth Regul. 56:21). Jsou známy některé deriváty kinetinu (Zhang & Letham 1989, J.Plant Growth Regul. 8:181; Fox et al. 1971, Plant Phys. 47:275). Připravili jsme několik nových derivátů substituovaných krátkými 9-alkylhalogenidy v poloze N9 purinu a stanovili jejich antisenescenční a protistámoucí vlastnosti v různých testech.
Dosud známé cytokininy jsou známé jako látky se stimulační aktivitou na buněčnou proliferaci při optimální koncentraci, avšak typicky při koncentracích převyšujících 10 μΜ se jejich účinky na buněčné dělení mění v inhibiční (Holub et al., 1998, Plant Growth Regul, 26, u'
109x115). Stejně tak je známo a dobře popsáno, že cytokininy působí jako negativní regulátory prodlužování kořene a tvorby postranních kořenů (Werner et al., 2001, Proč Nati
KČ wť
Acad Sci USA. 98, 10487*92; Werner et al., 2003, Plant Cell, 15, 2532«50), a jejich exogenní aplikace v koncentracích převyšujících 1 μΜ často vede ke kompletní inhibici růstu kořene. Tento vynález si klade za cíl poskytnout další N9-substituované cytokininové deriváty, které mají unikátní aktivity v regulaci růstu rostlin, a které přitom nejsou toxické pro rostlinné a zvířecí buňky.
Purinové deriváty substituované v poloze 6 (případně substituovanými) skupinami benzyl, fenyl, furyl, fůrfuryl a naftyl, a v poloze 9 nižšími alkylovými skupinami, případně obsahujícími spojky -O- nebo -S-, spadají do obecného vzorce GB 1,027,756 (1966) pro použití pro podporu růstu a/nebo prevenci rozkladných procesů v rostlinách, v příkladech tohoto dokumentu jsou však uvedeny pouze sloučeniny mající v poloze 9 tetrahydropyranyi, tedy aktivita sloučenin s nižší alkylovou skupinou v poloze 9 není prokázána a nelze ji vzhledem k rozsahu obecného vzorce z tohoto dokumentu vyvozovat. Dále obdobné deriváty, obsahující v poloze 6 případně substituovaný fenyl nebo naftyl a v poloze 9 CI-C6 alkyl nebo fenyl, případně substituovaný fenyl, pro regulaci růstu rostlin spadají do obecného vzorce EP 0155911. Ani v tomto dokumentu není aktivita těchto derivátů prokázána, je prokázána pouze aktivita derivátu majícího v poloze 9 mesithylový substituent. Vzhledem k rozsahu obecného vzorce a strukturní rozdílnosti mesithylu od alkylu nelze činit závěry o skutečné aktivitě 9-alkylových substituentů.
t-z·
Publikace Ramzayeva et al., Žurnál organičeskoj chimii (1988), 1090*1094 popisuje postup substituce 6-substituovaných purinů halogenalkyly. Sloučeniny známé z této publikace obsahují v poloze 6 benzylamino nebo methylthio skupinu a v poloze 9 2-chlorethyl, 2-bromethyl a 3-chlorpropyl skupinu. Tato publikace však nezmiňuje žádné použití uvedených sloučenin.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je použití sloučeniny obecného vzorce I,
kde
R<> je vybráno ze skupiny zahrnující -NH-furfuryl, -NH-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-yl), λ NH-(3-methylbut-2-en-l-yi), -NH-(4-hydroxy-3-methylbutyl), -NH-(4-hydroxy-l ,3-dimethylbut-2-en-l-yl), -NH-(4-hydroxy-l,3-dimethylbutyl), -NH-benzyl, -NH-fenyl, přičemž benzyl, furfuryl a fenyl mohou být nesubstituované nebo substituované 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny zahrnující hydroxy, halogen, methyl a methoxy,
Rq je vybrán ze skupiny zahrnující C1-C3 alkyl a C1-C3 alkenyl, přičemž každá z těchto skupin je substituována jedním nebo více atomy halogenu, pro regulaci růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk.
Halogen je vybrán ze skupiny zahrnující F, Cl, Br, I.
V případě, že sloučeniny podle předloženého vynálezu mají chirální centrum, vynález zahrnuje všechny enantiomery, směsi enantiomerů i racemáty. Vynález dále zahrnuje sloučeniny obecného vzorce I ve formě solí s alkalickými kovy, amoniakem a aminy, stejně jako jejich adičních solí s kyselinami.
S výhodou je R9 C1-C3 alkyl nebo C1-C3 alkenyl, substituovaný na terminálním uhlíku jedním nebo dvěma atomy halogenu, a výhodně je atom halogenu je. vybrán ze skupiny zahrnující chlor a brom. Výhodně je R9 vybráno ze skupiny zahrnující chlormethyl, brommethyl, 2-chlorethyl, 2-bromethyl, 2,2-dichlorethyl, 2,2-dibromethyl, 3-chlorpropyl, 3-brompropyl, 3,3- dichlorpropyl, 3,3-dibrompropyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl.
Ró je s výhodou vybráno ze skupiny zahrnující -NH-furluryl, -NH-(3-methylbut-2-en-l-yl).
Výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou substituované 6-substituované 9-v alkylhologenderiváty adeninu obecného vzorce I ze skupiny zahrnující: 6-(furfuryIamino)-9- (chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(2-chlorbenzylamino)-9-(chlormethyl, 2- chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-chlorbenzylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyljpurin, 6-(3-fluorbenzylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-hydroxybenzylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-methoxybenzylamino)-9-(chiormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-methylbut-2-en-l-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-benzylamino-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamino)-9- (chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purín, 6-(Z)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3- brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(E)-(4-hydroxy-3- methylbut-2-en-l-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-6 bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(Z)-(4- hydroxy- l,3-dimethylbut-2-en-l-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(E)-(4-hydroxy-1,3-dimethylbut-2-en-l-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3— chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(4-hydroxy-3-methylbutylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3- chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl,2-bromvinyl)purin, 6-(4-hydroxy-l,3-dimethylbutylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl,3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl,2-bromvinyljpurin, 6-fenylamino-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-methoxyfenylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(2-methoxybenzylamino)- 9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(2-hydroxybenzylammo)-9-(chlormethyl, 2- chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2- chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(2-fluorbenzylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin.
Předmětem vynálezu je s výhodou použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adeninu obecného vzorce I při stimulaci organogeneze u rostlin vedoucí ke zvětšení kořenového systému. Na rozdíl od dosud známých cytokininů, které ve vyšších koncentracích inhibují růst a vývoj kořene, 6-substituované 9-halogenalkyl deriváty adeninu obecného vzorce I nemají ve vysokých koncentracích negativní vliv na růst kořene vůbec, nebo je tento efekt výrazně potlačen.
Předmětem vynálezu je dále s výhodou použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adeninu obecného vzorce I pro urychlení nalévání semen a zvětšení velikosti semene a plodů jcdnoděložných rostlin a pro zkrácení doby klíčení semen rostlin.
Předmětem vynálezu je také s výhodou použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adeninu obecného vzorce I v tkáňových kulturách k regulaci proliferace a morfogeneze, a k inhibici senescence a stresu. Zvlášť výhodné jsou nové deriváty při použití v kalusových kulturách, neboť na rozdíl od dosud známých cytokininů nevykazují inhibiční účinek na růst a dělení rostlinných buněk při vysokých koncentracích a vykazují minimální toxicitu pro tyto buňky, což umožňuje v porovnání s cytokininy známými ze stavu techniky použití v širokém koncentračním rozmezí bez negativních účinků. Při příjmu 6-substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adeninu obecného vzorce I intaktní rostlinou nedochází na rozdíl od dosud známých cytokininů ke stresové odpovědi projevující se zvýšenou expresí stresových genů.
Předmětem vynálezu je s výhodou použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adeninu obecného vzorce I k oddálení degradace chlorofylu a stárnutí rostlinných pletiv. Tento pozitivní vliv na růst rostlin je způsoben unikátním inhibičním účinkem těchto derivátů na peroxidaci membránových lipidů. 9-halogenalkyl skupina těchto derivátů funguje jako protektivní skupina, která tlumí negativní vliv cytokininů na degradaci membrán, aniž by snížila jejich obecně pozitivní účinky.
Předmětem vynálezu je dále s výhodou použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adeninu obecného vzorce I jako antagonistů cytokininových receptorů, zejména pro zvýšení výnosu a kvality zemědělských produktů u jednoděložných rostlin.
Předmětem vynálezu je s výhodou použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adeninu obecného vzorce I při produkci užitkových rostlin, výhodně jednoděložných. Jednoděložné rostliny (Liliopsida, Monocotyledonaé) jsou třídou krytosemenných rostlin. Hospodářský význam jednoděložných pro člověka je naprosto zásadní. Patří sem totiž všechny pravé obilniny, z nichž nej rozšířenější je pšenice setá (Triticum aestivum), ječmen setý (Hordeum vulgare), oves setý (Avena sativa), proso seté (Panicům sativum), rýže setá (Oryza sativa) a kukuřice setá (Zea mays), vše z čeledi lipnicovité (Poaceae), do této čeledi také patří cukrová třtina. Další důležité hospodářské rostliny jsou palmy, např. kokosovník ořechoplodý (Cocos nucifera) nebo datlovník pravý (Phoenix dactylifera) aj., mnoho dalších známých i méně známých hospodářských rostlin je roztroušeno v jiných čeledích, např. banánovník (Musa), ananasovník chocholatý (Ananas comosus), chřest lékařský (Asparagus officinalis), česnek kuchyňský (Allium sativum), cibule kuchyňská (Allium cepa), vanilka (Vanilla), zázvor (Zingiber) a mnohé další. Mnoho jednoděložných je také pěstováno jako okrasné rostliny, pro ozdobné květy i listy, mnozí původem tropičtí zástupci jsou také rostlinami pokojovými.
Předmětem vynálezu je také s výhodou použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adeninu obecného vzorce I při přípravě přípravků pro klonování rostlinných buněk, orgánů, zárodečných buněk a embryí.
Vynález dále zahrnuje přípravky pro klonování rostlinných buněk, orgánů, zárodečných buněk a embryí obsahující alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I a pomocné látky.
Předmětem vynálezu je konkrétněji použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adeninu obecného vzorce I při přípravě růstově-regulačních přípravků k ošetřování rostlin a jejich orgánů či buněk.
Vynález rovněž zahrnuje růstově-regulační přípravky obsahující alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I a pomocné látky.
Sloučeniny obecného vzorce I jsou používány v nemodifikované formě či ve formě soli, s výhodou společně s pomocnými látkami běžně využívanými v přípravcích, např. rozpouštědly, plnivy či nosiči, které jsou běžně užívané v zemědělství a jsou odborníkovi v oboru dobře známé. Jsou přednostně používány koncentráty aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze a disperze, ředěné emulze, rozpustné prášky, prach, granuláty, krémy, gely, olejové suspenze a rovněž enkapsulované produkty, např. polymerni substance. Ve vztahu k typu přípravku je určena i metoda aplikace, například sprejování, atomizace, poprach, rozptyl, nátěr a polévání, která je zvolena ve vztahu k předurčenému použití a převažujícím okolnostem. Přípravky mohou být sterilizovány anebo obsahují další přídavné látky neutrální povahy, například konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, hnojivá, či donory mikrohnojiv nebo další přípravky za účelem získání speciálních účinků.
Sloučenina obecného vzorce I může být smíchána s dalšími růstovými regulátory za účelem dosažení synergického účinku.
Předmětem předloženého vynálezu jsou dále sloučeniny obecného vzorce Ia,
Re
(Ia)( kde
Rf, je vybráno ze skupiny zahrnující -NH-furfuryl, -NH-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-yl), -NH— (3-methylbut-2-en-1 -yl), -NH-(4-hydroxy-3-methylbutyl), -NH-(4-hydroxy-1,3-dimethylbut-2-en- 1-yl), -NH-(4-hydroxy-l,3-dimethylbutyl), -NH-benzyl, -NH-fenyl, přičemž furfuryl může být nesubstituovaný nebo substituovaný 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny zahrnující hydroxy, halogen, methyl a methoxy, a benzyl a fenyl mohou být nesubstituované nebo substituované 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny zahrnující halogen, methyl a methoxy,
Ry je vybrán ze skupiny zahrnující C1-C3 alkyl a C1-C3 alkenyl, přičemž každá z těchto skupin je substituována jedním nebo více atomy halogenu, za předpokladu, že: je-li R9 2-chlorethyl, Re není -NH-furfuryl, -NH-benzyl, je-li R9 3-chlorpropyl či 2-bromethyl, R$ není -NH-benzyl.
Přípravky
Přípravky obsahující sloučeniny obecného vzorce I (aktivní složka) nebo jejich soli a pokud je třeba, jednu nebo více pevných nebo kapalných pomocných látek, jsou připraveny známými způsoby, například smísením nebo mletím účinné látky s pomocnými látkami, jako jsou např. rozpouštědla nebo pevné nosiče. Do přípravků mohou být přidávány povrchově aktivní látky (surfaktanty).
V závislosti na povaze sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli, která má být formulována, vhodné povrchově aktivní látky jsou neiontové, kationtové a/nebo aniontové povrchově aktivní látky a jejich směsi mající dobré emulzifikační, dispergační a zvlhčovači vlastnosti.
Příklady vhodných aniontových, neiontových a kationtových smáčedel jsou shrnuty například ve WO 97/34'485.
t ·
Pro přípravu formulací sloučeniny obecného vzorce I jsou podle tohoto vynálezu používána smáčedla konvečně používaná při přípravách přípravků, které jsou popsány, např. v
McCutcheon's Detergents and Emulsifíers Annual MC Publishing Corp., Ridgewood New
Jersey, 1981, Stache, H., Tensid- Taschenbuch, Carl Hanser Verlag, MunichNienna, 1981 and M. and J. Ash, Encyclopedia of Surfactants, Vol-111, Chemical Publishing Co., New York, 1980*81.
Formulace přípravku obsahuje váhově od 0,1 do 99 % (w/w), zejména pak od 0,1 do 95 % (w/w) aktivní složky odpovídající látce nebo směsi látek obecného vzorce I, přičemž obsahuje i od 5 do 99,9 % směsi přísad či farmaceutických nosičů, a to v závislosti na způsobech aplikace, a popřípadě obsahuje i váhově od 0,1 do 25 % smáčedla.
Ačkoliv jsou komerční produkty obvykle připravovány ve formě koncentrátů, konečný uživatel upotřebí naředěný přípravek. Kompozice může proto obsahovat i další přísady, jakými jsou stabilizátory, např. rostlinné oleje nebo epoxidizované rostlinné oleje (epoxidizovaný palmový olej 0; 1, řepkový nebo olivový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo emulgátory, viskozitní činidla, pojivá, lepidla, a také hnojivá a další aktivní přísady. S výhodou jsou využívány přípravky následujícího složení: (% = hmotnostní procento)
Emulgované koncentráty:
aktivní složka: 1 až 90 %, s výhodou 5 až 20 %
smáčedlo: 1 až 30 %, s výhodou 10 až 20 %
kapalný nosič: 5 až 94%, s výhodou 60 až 85 %
Prášky:
aktivní složka: 0,1 až 10 %, s výhodou 0,1 až 5 %
pevný nosič: 99,9 až 90 %, s výhodou 99,9 až 95 %
Suspenzní koncentráty:
aktivní složka: 5 až 75 %, s výhodou 10 až 50 %
voda: 94 až 24 %, s výhodou 88 až 30 %
smáčedlo: 1 až 40 %, s výhodou 2 až 30 %
Smáčivé prášky:
aktivní složka: 0,5 až 90 %, s výhodou 1 až 80 %
smáčedlo: 0,5 až 20 %, s výhodou 1 až 15 %
pevný nosič: Granule: 5 až 95 %, s výhodou 15 až 90 %
aktivní složka: 0,1 až 30 %, s výhodou 0,1 až 15 %
pevný nosič: 99,9 až 70 %, s výhodou 99,9 až 85 %
Kompozice mohou rovněž obsahovat další příměsi, jakými jsou stabilizátory, například rostlinné oleje nebo epoxidizované rostlinné oleje (epoxidizovaný kokosový olej, řepkový olej nebo sojový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační látky, regulátory viskozity, pojivá, zahušťovadla, a také hnojivá a další aktivní látky. Pro použití sloučenin obecného vzorce I nebo jejich solí, nebo kompozic je obsahujících, se používají rozdílné metody a technologie, kterými jsou například následující:
i) Obalování osiva
a) Obalování osiva smáčivou práškovou formulací sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli, a to mícháním v nádobě až do stejnorodé distribuce na povrchu semen (suché obalování). Při takové proceduře je přibližně 1 až 500 g sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli, (4 g až 2 kg smáčivého prášku) používáno na 100 kg osiva.
b) Obalování osiva emulzifikovaným koncentrátem sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli, v souladu s metodou a) (mokré obalování).
c) Obalování osiva cestou máčení semen po dobu 1 až 72 h v tekutině obsahující od 100 do 1000 ppm sloučeniny obecného vzorce 1 nebo její soli,) a s výhodou následného usušení semen (imerzní obalování).
Obecně jsou látky vzorce I nebo jejich soli používány v množství od 1 do 1000 g, s výhodou od 5 do 250 g, na 100 kg semen, avšak v závislosti na metodice, která rovněž umožňuje přidání dalších aktivních látek nebo mikroživin; určené koncentrační limity se mohou pohybovat nahoru nebo dolů (opakované obalování).
ii) Aplikace cisternové směsi
Kapalná formulace směsi růstového regulátoru a antidota je používána ve váhovém poměru jednoho k druhému od 10:1 do 1 :100, rychlost aplikace růstového regulátoru od 0,005 do 5,0 kg na hektar. Taková cisternová aplikace směsi se provádí před anebo po setí.
iii) Aplikace do semenné brázdy
Sloučenina obecného vzorce I nebo její sůl, je zavedena do otevřené brázdy oseté semenem ve formě emulzifikováného koncentrátu, smáčivého prášku nebo granulí. Jakmile je semenná brázda zaklopena, je růstový regulátor aplikován cestou obvykle používanou při preemergentním procesu.
iv) Kontrolované uvolňování aktivních látek
Sloučeniny obecného vzorce I nebo jejich soli, jsou aplikovány v roztoku k minerálním granulovaným nosičům nebo polymerizovaným granulím (močovina, formaldehyd) a jsou vysušeny. V případě, že je to žádoucí, tak se provádí obalování, které umožňuje postupné uvolňování látky v měřitelných množstvích po určitou specifickou periodu (obalované granule).
éSeznam-vyobrazenP '
Obr. 1 ukazuje vliv nových sloučenin na růst cytokinin-dependentního kalusu tabáku. A, vliv kinetinu a N9-substituovaných derivátů kinetinu; B, vliv iP a N9-substituovaných derivátů iP. Červené šipky naznačují koncentrační rozsah, ve kterém nové sloučeniny (plná čára), nebo kinetin a iP (čárkovaná čára) stimulují růst kalusu na úroveň vyšší než 50% maximálního růstu indukovaného dosud známými rodičovskými cytokininy. Chybové úsečky naznačují směrodatnou odchylku (n-6).
Obr. 2 naznačuje porovnání účinku sloučeniny 1 and 2 a jejich dosud známého rodičovského cytokininu kinetinu. Vliv nových sloučenin na retenci obsahu chlorofylu v dekapitovaných segmentech listů Triticum aestivuni cv. Hereward v průběhu senescence na světle. Chybové úsečky naznačují směrodatnou odchylku (n=3).
Obr. 3 ukazuje fenotyp kinetin N9-substituovanými deriváty kinetinu ošetřené semenáčky Z. tnays. A a B zleva do prava: DMSO kontrola; 5 μΜ sloučeniny 1; 10 μΜ sloučeniny 1; 5 μΜ kinetin. Celé semenáčky kukuřice (A) s detaily laterálních kořenů (B).
Příklady provedení vynálezu
Výchozím materiálem pro přípravu sloučenin obecného vzorce I je 6-chlorpurin nebo 6-brompurin. Halogenované uhlovodíky byly získány ze Sigmy Aldrich. Výchozí substituované benzylaminy, které nebyly komerčně dostupné (ostatní získány od Sigma Aldrich nebo Olchemim), byly připraveny z odpovídajících aldehydů v přítomnosti katalyzátoru. Ty, které mají více methylových skupin, mohou být s výhodou připraveny z příslušných methylbenzaldehydů. Hydroxyderiváty se připravují demetylací odpovídajících methoxyderivátů 48% HBr v Nj atmosféře.
Elementární analýzy (C, H a N) byly měřeny na EA1108 CHN analyzátoru (Thermo). Na zjišťování bodu tání byl použit přístroj BLJCHI Melting Point B-540. Analytická tenkovrstvá chromatografie (TLC) byla prováděna na destičkách silikagelu 60 WF254 (Měrek), v mobilní fázi CHCErMeOILkonc. NH4OH (8:2:0,2, v/v/v). ES+ hmotová spektra byla naměřena za použití přímého nástřiku na Waters ZMD 2000 hmotovém spektrometru. Hmotnostní interval při měření byl 10 až 1500 u. Spektra byla měřena za použití cyklických skenů o délce 3,0 sekundy, při napětí na vstupní štěrbině 25 V a teplotě vypařovacího bloku 150 °C, desolvatační teplotě 80 °C a průtoku desolvataěního plynu 200 1/hodinu. Získaná data byla zpracována pomocí programu MassLynx data systém. NMR spektra byla měřena na přístroji Bruker Avance AV 300 při teplotě 27 °C a frekvenci 300,3 MHz (lH) respektive 75,48 MHz (13C). Vzorky byly připraveny rozpuštěním daných látek v DMSO-í/í. Tetramethylsilan (TMS) byl použit jako interní standard.
Příklad 1
Příprava 6-furfurylamino-9-(2-chlorethyl)purinu (1)
Kinetin (2 g, 9,3 mmol), l-brom-2-chlorethan (1,3 g, 9,1 mmol) a uhličitan draselný (2,5 g, 24 mmol) byly míchány ve 100 ml dimethylsulfoxidu (DMSO) po 18 hodin. Směs byla nalita na 200 ml ledové tříště, extrahována do ethyl acetátu a sušena nad Na2SO4. Ethybacetátová frakce byla odpařena na odparce do úplného oddestilování rozpouštědla. Surový produkt v podobě bílé práškovité látky byl krystalizován z methanolu. Výtěžek 80 %, 'H NMR (DMSO-ίήί): 4.07(2H, t, >5,82), 4.52(2H, t, >5,82), 4.70(2H, s(br)), 6.23(1H, d, >2.67), 6,35(1H, m), 7.53(1H, d, >2,67), 8,22(2H, m), 8.25(1H, s)
Příklad 2
Příprava 6-furfurylamÍno-9-(2-bromethyl)purinu (2)
Kinetin (2 g, 9,3 mmol) a uhličitan draselný (2,4 g, 23 mmol) byly smíchány ve 100 ml dimethylformamidu (DMF). K reakční směsi byl přidán 1,2-dibromethan (5,2 g, 27,6 mmol) a reakční směs byla míchána při pokojové teplotě po 12 h, vstupu vlhkosti bránila sušicí trubička naplněná CaCl2. Rozpouštědlo bylo odpařeno na žlutě zbarvený odparek a bylo přidáno 100 g ledu. Směs byla míchána 1 hodinu, dokud se nevyloučila bílá sraženina a nerozpustil led. Pevná látka byla odfiltrována, promyta studenou vodou a sušena při 50 °C. Produkt byl překry stal ován z methanolu. Výtěžek 60 %, NMR (DMSO-í/s): 3.95(2H, t, >5.91), 4.58(2H, t, >5.91), 4.69(2H, s(br)), 6.23(1H, d, >2.94), 6.36(1H, t, >2.94), 7.54(1H, d, >2.94), 8.15-(2H, m), 8.24(1H, s)
Příklad 3
Příprava 6-[(3-methylbut-2-en-1 -yl)amino]-9-(2-bromethyl)purinu (3)
Směs 6-[(3-methylbut-2-en-l-yl)amino]purinu (2 g, 9,8 mmol), 1,2-dibromethanu (12,94 g, 6 ml, 69 mmol) a uhličitanu draselného (2,5 g, 24 mmol) byla míchána v 50 ml DMSO po 12 h. Reakční směs pak byla nalita na ledovou tříšť a po rozpuštění ledu bylo přidáno 30 ml ethylacetátu. Ethylacetátová vrstva byla přečištěna aktivním uhlím a SiO2 a pak bylo odpařeno rozpouštědlo. Surový produkt byl krystalizován z methanolu, byla získána žlutá látka. Výtěžek: 70 %, .'Η NMR (DMSO-í/6): 1.75(3H, s), 1.59(3H,s), 4.12(2H, t, J=5.76), 4.10(2H, s(br)), 4,6(2H, t, J=5.76), 5.3(1H, t, J=6.57), 8.1(1 H, s(br))> 8.3(1H, s).
Příklad 4
Příprava 6-[(3-methylbut-2-en-l -yl)amino]-9-(2-chlorethyl)purinu (4)
6-[(3-methylbut-2-en-l-yl)amino]purin (2 g, 9,8 mmol), 1 -brom-2-chlorethan (1,4 g, 9,8 mmol) a K7CO3 (3 g, 29 mmol) byly míchány v 50 ml DMSO 12 h. Reakční směs byla nalita na led (200 ml) a extrahována do ethyl acetátu (50 ml). Rekrystalizací z hexanu byly získány bílé krystaly.Výtěžek: 6(^/03 .'Η NMR (DMSO-t/6): 1.66(3H, s), 1.70(3H, s), 4.06(2H, t, J=5,76), 4.10(2H, s(br), H12), 4.50(2H, t, J=5,76), 5,31(1H, t, 1=6,57), 7,767(1H, s(br)), 8,15(1H, s), 8.2O(1H, s).
Příklad 5
Příprava 6-benzylamino-9-(2-bromethyl)purinu (20)
Benzylaminopurin (1 g, 4.43 mmol), K2CO3 (2.45 g, 17.8 mmol) a 1,2-dibromethan (1.15 mL, 1 1 ' ř ‘ U
13.3 mmol) bylo mícháno 16 hodin za laboratorní-teploty pod CaCl2 zátkou v DMF (30 mL). Odparek, po zakoncentrování na rotační vakuové odparce, byl rozředěn vodou (30 mE) a extrahován do ethyl acetátu (EtOAc) (3x 15 mL). Organické frakce byly spojeny, promyty vodou (2x 10 mL), vysušeny Na2SO4, přečištěny karbofiltrací a zákoneentrovány na RVO. Surový produkt byl purifikován pomocí Flash chromatografie - chloroform:methanol (9:1) byl použit jako eluent. Výtěžek 82 %.
Tabulka 1: Látky připravené způsobem podle příkladů N5
č. R6 R9 Elementární analýza
vypočteno/nalezeno
%C %H %N ES MS [M+H]+
5 furfurylamino chlormethyl 50,1/49,9 3,8/3,8 26,6/26,7 264
6 furfurylamino brommethyl 42,9/43,0 3,3/3,4 22,7/22,5 309
1 furfurylamino 2-chlorethyl 51,9/52,0 4,4/4,5 25,2/25,2 278
2 furfurylamino 2-bro methyl 44,7/44,8 3,8/3,9 21,7/21,9 323
7 furfurylamino 3-chlorpropyl 53,5/53,6 4,8/4,7 24,0/23,7 292
8 furfurylamino 3-brompropyl 46,4/46,1 4,2/4,2 20,8/21,1 337
9 furfurylamino 2-chlorvinyl 52,3/52,1 3,7/3,6 25,4/25,2 276
10 furfurylamino 2-bromvinyl 45,0/45,1 3,2/3,2 21,9/21,6 321
11 furfurylamino 2,2dichlorethyl 46,2/46,5 3,6/3,4 22,4/22,7 313
12 (3-methylbut-2-en-l yl)amino chlormethyl 52,5/52,4 5,6/5,5 27,8/27,5 252
13 (3-methylbut-2-en-l- yl)amino brommethyl 44,6/44,9 4,8/4,6 23,7/24,0 297
3 (3 -methy lbut-2-en-1 yl)amino 2-bromethyl 46,5/46,3 5,2/5,2 22,6/22,1 310
4 (3-methylbut-2-en-1 y!)amino 2-chlorethyl 54,2/54,6 6,1/6,2 26,4/26,2 266
14 (3-methylbut-2-en-l yl)amino 3-brompropyl 48,2/48,2 5,6/5,6 21,6/21,3 325
15 (3-methylbut-2-en-l yl)amino 3-chlorpropyl 55,8/56,0 6,5/6,1 25,0/24,6 280
16 (3 -methy lbut- 2 -en-1 yl)amino 2-chlorvinyl 54,7/54,3 5,4/5,3 26,6/26,3 264
17 (3-methylbut-2-en-1 yl)amino 2-bromvinyl 46,8/46,7 4,6/4,3 22,7/22,4 309
18 (3-methylbut-2-en-1 yl)amino 2,2- dichlorethyl 48,0/48,4 5,0/5,2 23,3/23,0 301
19 benzylamino chlormethyl 57,0/58,3 4,4/4,5 25,6/25,7 274
20 benzy lamino 2-chlorethyl 58,4/58,7 4,9/5,0 24,3/24,2 288
« 4 · ♦ · « ♦k · »4 1'1 *4 .·>· i
I 1 « « » ··.
21» * · »·4»·
21 benzylamino 3-chlorpropyl 59,7/60,1 5,3/5,5 23,2/23,5 302
22 benzylamino brommethyl 49,1/49,1 3,8/3,9 22,0/21,8 319
23 benzylamino 2-bromethyl 50,6/50,5 4,3/4,2 21,1/21,4 333
24 benzylamino 3-brompropyl 52,0/52,3 4,7/4,9 20,2/20,5 347
25 benzylamino 2-chlorvinyl 58,9/59,8 4,2/4,1 24,5/24,2 286
26 benzylamino 2-bromvinyl 50,9/50,7 3,7/3,6 21,2/21,5 331
27 benzylamino 2,2- dichlorethyl 52,2/52,5 4,1/4,3 21,7/21,4 323
28 fenylamino chlormethyl 55,5/55,1 3,9/3,7 27,0/27,3 260
29 fenylamino 2-chlorethyl 57,0/57,1 4,4/4,5 25,6/25,4 274
30 fenylamino 3-chlorpropyl 58,4/58,4 4,9/4,9 24,3/24,2 288
31 fenylamino brommethyl 47,4/47,8 3,3/3,5 23,0/23,2 305
32 fenylamino 2-bromethyl 49,1/49,2 3,8/3,9 22,0/22,3 319
33 fenylamino 3-brompropyl 50,6/50,4 4,3/4,5 21,1/21,4 333
34 fenylamino 2-bromvinyl 49,4/49,1 3,2/3,0 22,2/21,8 317
35 fenylamino 2-chlorvinyl 57,5/57,9 3,7/3,9 25,8/26,0 272
36 fenylamino 2,2- dichlorethyl 50,7/50,5 3,6/3,7 22,7/22,8 309
37 3-methoxy benzylamino chlormethyl 55,4/55,2 4,7/4,7 23,1/23,4 304
38 3-methoxy benzylamino 2-chlorethyl 56,7/56,4 5,1/5,2 22,0/22,1 318
39 3 -methoxy benzylamino 3-chlorpropyl 57,9/58,0 5,5/5,2 21,1/21,5 332
40 3 -methoxy benzylamino brommethyl 48,3/48,3 4,1/4,2 20,1/20,0 349
41 3 -methoxy benzylamino 2-bromethyl 49,7/49,6 4,5/4,4 19,3/19,1 363
42 3 -methoxy benzylamino 3-brompropyl 51,1/51,3 4,8/4,9 18,6/19,0 377
43 3-methoxy benzy lamino 2-chlorvinyl 57,1/57,3 4,5/4,5 22,2/22,6 316
44 3 -methoxy benzylamino 2-bromvinyl 50,0/49,7 3,9/3,6 19,4/19,1 361
45 3 -methoxybenzylamino 2,2- dichlorethyl 51,2/51,5 4,3/4,3 19,9/20,1 353
46 3-hydroxybenzy lamino chlormethyl 53,9/54,2 4,2/4,3 24,2/24,6 290
47 3 -hydroxybenzylamino 2-chlorethyl 55,4/55,3 4,7/4,8 23,1/23,2 304
48 3 -hydroxybenzylamino 3-chlorpropyl 56,7/56,4 5,1/5,0 22,0/21,8 318
49 3-hydroxybenzylamino brommethyl 46,7/46,8 3,6/3,6 21,0/21,3 335
50 3-hydroxybenzylamino 2-bromethyl 48,3/48,0 4,1/4,4 20,1/20,5 349 I
51 3 -hydroxy benzy lam ino 3-brompropyl 49,7/49,5 4,5/4,4 19,3/19,1 363
52 3 -hydroxy benzy lamino 2-chlorvinyl 55,7/55,8 4,0/4,1 23,2/23,5 302
53 3 -hydroxy benzy 1 amino 2-bromvinyl 48,6/48,4 3,5/3,7 20,2/21,9 347
54 3 -hydroxybenzy lamino 2,2- dichlorethyl 49,7/49,8 3,9/4,0 20,7/20,8 339
55 2-methoxybenzylamino chlormethyl 55,4/55,1 4,7/4,4 23,1/22,8 304
56 2-methoxybenzylamino 2-chlorethyl 56,7/56,8 5,1/5,2 22,0/22,1 318
57 2-methoxybenzylamino 3-chlorpropyl 57,9/57,8 5,5/5,5 21,1/21,0 332
58 2-methoxybenzylamino brommethyl 48,3/48,2 4,1/4,0 20,1/20,3 349
59 2 -methoxy benzylamino 2-bromethyl 49,7/50,0 4,5/4,7 19,3/19,4 363
60 2-methoxybenzylamino 3-brompropyl 51,1/51,4 4,8/4,9 18,6/18,4 377
61 2-methoxybenzylamino 2-bromvinyl 50,0/49,9 3,9/3,9 19,4/19,4 361
62 2-methoxybenzylamino 2-chlorvinyl 57,1/57,4 4,5/4,6 22,2/22,6 316
63 2-methoxybenzylamino 2,2- dichlorethyl 51,2/51,0 4,3/4,5 19,9/20,3 353
64 2-hydroxybenzylamino chlormethyl 53,9/53,7 4,2/4,1 24,2/24,1 290
65 2-hydroxybenzylamino 2-chlorethyl 55,4/55,3 4,7/4,8 23,1/23,2 304
66 2-hydroxybenzylamino 3-chlorpropyl 56,7/56,8 5,1/5,1 22,0/21,9 318
67 2-hydroxybenzylamino brommethyl 46,7/46,8 3,6/3,7 21,0/21,3 335
68 2-hydroxybenzylamino 2-bromethyl 48,3/48,1 4,1/4,3 20,1/20,4 349
69 2-hydroxybenzylamino 3-brompropyl 49,7/49,3 4,5/4,2 19,3/19,5 363
70 2-hydroxybenzylamino 2-chlorvinyl 55,7/56,0 4,0/4,1 23,2/23,7 302
71 2-hydroxybenzylamino 2-bromvinyl 48,6/48,9 3,5/3,7 20,2/20,1 347
72 2 -hydroxybenzy lamino 2,2- , dichorethyl 49,7/49,6 3,9/3,9 20,7/20,9 339
73 2-fluorbenzylamino chlormethyl 53,5/53,4 3,8/3,8 24,0/23,7 292
74 2-fluorbenzylamino 2-chlorethyl 55,0/55,1 4,3/4,3 22,9/23,1 306
75 2-fluorbenzylamino 3-chlorpropyl 56,3/56,7 4,7/4,9 21,9/21,9 320
76 2-fluorbenzylamino brommethyl 46,5/46,1 3,3/3,0 20,8/20,6 337
77 2-fluorbenzylamino 2-bromethyl 48,0/48,2 3,7/3,8 20,0/20,4 351
78 2-fluorbenzylamino 3-brompropyl 49,5/49,6 4,2/4,2 19,2/19,6 365
79 2-fluorbenzylamino 2-bromvinyl 48,3/48,3 3,2/3,1 20,1/19,8 349
80 2-fluorobenzylamino 2-chlorvinyl 55,4/55,6 3,7/3,8 23,1/23,4 304
81 2-fluorobenzylamino 2,2- dichlorethyl 49,4/49,1 3,6/3,4 20,6/20,2 341
82 3-fluorbenzylamino chlormethyl 53,5/53,7 3,8/4,0 24,0/24,3 292
83 3-fluorbenzy lamino 2-chlorethyl 55,0/55,2 4,3/4,3 22,9/23,1 306
84 3 - fluorbenzy 1 amino 3-chlorpropyl 56,3/56,5 4,7/4,7 21,9/22,2 320
85 3 -fluorbenzylamino brommethyl 46,5/46,1 3,3/2,9 20,8/20,5 337
86 3 -fluorbenzylamino 2-bromethyl 48,0/48,0 3,7/3,7 20,0/20,2 351
87 3-fluorbenzylamino 3-brompropyl 49,5/49,4 4,2/4,2 19,2/19,5 365
88 3-fluorbenzylamino 2-chlorvinyl 55,4/55,5 3,7/3,7 23,1/23,4 304
89 3-fluorbenzylamino 2-bromvinyl 48,3/48,2 3,2/3,0 20,1/19,8 349
90 3 -fluorbenzy 1 amino 2,2- dichlorethyl 49,4/49,9 3,6/3,6 20,6/20,8 341
91 2-chlorbenzylamino chlormethyl 50,7/50,8 3,6/3,9 22,7/23,1 309
92 2-chlorbenzy lamino 2-chlorethyl 52,2/51,9 4,1/3,8 21,7/21,5 323
93 2-chlorbenzylamino 3-chlorpropyl 53,6/53,2 4,5/4,4 20,8/20,5 337
94 2-chlorbenzy lamino brommethyl 44,3/44,1 3,1/3,0 19,9/19,7 353
95 2-chlorbenzylamino 2-bromethyl 45,9/46,2 3,6/3,7 19,1/19,3 367
96 2-chlorbenzylamino 3-brompropyl 47,3/47,5 4,0/4,2 18,4/18,7 381
97 2-chlorbenzylamino 2-chlorvinyl 52,5/52,2 3,5/3,3 21,9/21,6 321
98 2-chlorbenzylamino 2-bromvinyl 46,1/46,3 3,0/3,1 19,2/19,4 365
99 2-chlorbenzylamino 2,2- dichlorethyl 47,2/47,3 3,4/3,4 19,6/19,9 357
100 3-chlorbenzylamino chlormethyl 50,7/50,5 3,6/3,3 22,7/22,4 309
101 3 -chlorbenzylamino 2-chlorethyl 52,2/52,2 4,1/4,0 21,7/22,0 322
102 3 -chlorbenzylam ino 3-chlorpropyl 53,6/53,7 4,5/4,5 20,8/21,0 337
103 3 -chlorbenzy lamino brommethyl 44,3/44,3 3,1/3,0 19,9/197 353
104 3 -chlorbenzylamino 2-bromethyl 45,9/45,9 3,6/3,6 19,1/19,0 367
105 3 -chlorbenzylamino 3-brompropyl 47,3/47,1 4,0/3,8 18,4/18,1 381
106 3-chlorbenzylamino 2-chlorvinyl 52,5/53,7 3,5/3,8 21,9/22,2 321
107 3-chlorbenzy lamí no 2-bromvinyl 46,1/46,3 3,0/3,0 19,2/19,6 365
108 3-chlorbenzy lamino 2,2- díchlorethyl 47,2/47,3 3,4/3,4 19,6/19,8 357
109 (Z)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-1 -yl)amino brommethyl 42,3/42,3 4,5/4,2 22,4/22,1 313
110 (Z)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-l -yl)amino 2-bromethyl 44,2/44,2 4,9/5,1 21,5/21,5 327
111 (Z)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-1 -yl)amino 3-brompropyl 45,9/45,7 5,3/5,1 20,6/20,3 341
112 (Z)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-l -yl)amino chlormethyl 49,4/49,7 5,3/5,5 26,2/25,4 268
113 (Z)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-1 -y l)amino 2-chlorethyl 51,2/51,2 5,7/5,7 24,9/25,1 282
114 (Z)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-1 -yl)amino 3-chlorpropyl 52,8/52,8 6,1/6,3 23,7/24,0 296
115 (Z)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-1 -y l)amino 2-chlorvinyl 51,5/51,8 5,0/5,3 25,0/25,4 280
116 (Z)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-1 -yl)amino 2-bromvinyl 44,5/44,7 4,4/4,5 21,6/21,9 325
117 (Z)-(4-hydroxy-3 methylbut-2-en-1 -yl)amino 2,2- . dichlorethyl 45,6/45,4 4,8/4,8 22,2/21,9 317
118 (E)-(4-hy droxy-3methylbut-2-en-1 -yl)amino brommethyl 42,3/42,1 4,5/4,3 22,4/22,1 313
119 (E)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-1 -y l)amino 2-bromethyl 44,2/44,2 4,9/5,1 21,5/21,5 327
120 (E)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-l -yl)amino 3-brompropyl 45,9/45,8 5,3/5,1 20,6/20,4 341
121 (E)-(4-hydroxy-3 methylbut-2-en-1 -yl)amino chlormethyl 49,4/49,5 5,3/5,4 26,2/26,4 268
122 (E)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-1 -y l)amino 2-chlorethyl 51,2/51,4 5,7/5,9 24,9/25,1 282
123 (E)-(4-hydroxy-3methyibut-2-en-1 -yl)amino 3-chlorpropyl 52,8/52,4 6,1/6,0 23,7/23,4 296
124 (E)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-1 -yl)amino 2-chlorvinyl 51,5/51,4 5,0/5,0 25,0/24,6 280
125 (E)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-1 -yl)amino 2-bromvinyl 44,5/44,7 4,4/4,5 21,6/21,8 325
126 (E)-(4-hydroxy-3 methylbut-2-en-1 -yl)amino 2,2- dichlorethyl 45,6/45,7 4,8/5,0 22,2/22,6 317
127 6-(Z)-(4-hydroxy-1,3dimethy lbut-2-en-1 ylamino) chlormethyl 51,2/51,5 5,7/5,6 24,9/24,7 282
128 6-(Z)-(4-hydroxy-1,3dimethylbut-2-en-1 ylamino) 2-chlorethyl 52,8/52,9 6,1/6,1 23,7/23,9 296
128 6-(Z)-(4-hydroxy-1,3dimethylbut-2-en-1 ylamino) 3-chlorpropyl 54,3/54,0 6,5/6,2 22,6/22,3 310
129 6-(Z)-(4-hydroxy-1,3- dimethylbut-2-en-1 ylamino) brommethyl 44,2/44,5 4,9/4,7 21,5/21,3 327
130 6-(Z)-(4-hydroxy-l,3dimethylbut-2-en-1 ylamino) 2-bromethyl 45,9/45,7 5,3/5,1 20,6/20,4 341
131 6-(Z)-(4-hydroxy-1,3dimethylbut-2-en-1 ylamino) 3-brompropyl 47,5/47,4 5,7/5,7 19,8/19,6 355
132 6-(Z)-(4-hydroxy-l,3dimethylbut-2-en-1 ylamino) 2-chlorvinyl 53,2/53,5 5,5/5,4 23,8/24,0 294
133 6-(Z)-(4-hydroxy-1,3dimethylbut-2-en-1 ylamino) 2-bromvinyl 46,2/46,1 4,8/5,0 20,7/21,0 339
134 6-(Z)-(4-hydroxy-1,3- dimethylbut-2-en-l- 2,2dichlorethyl 47,3/47,1 5,2/5,3 21,2/21,0 331
i l
y lamino)
135 6-(E)-(4-hydroxy-1,3dimethylbut-2-en-1 ylamino) chlormethyl 51,2/51,4 5,7/5,9 24,9/24,6 282
136 6-(E)-(4-hydroxy-1,3dimethylbut-2-en-1 ylamino) 2-chlorethyl 52,8/52,5 6,1/5,9 23,7/23,4 296
137 6-(E)-(4-hydroxy-1,3dimethylbut-2-en-1 ylamino) 3-chlorpropyl 54,3/54,5 6,5/6,7 22,6/22,8 310
138 6-(E)-(4-hydroxy-l,3methylbut-2-en-1 -ylamino) brommethyl 44,2/44,1 4,9/4,8 21,5/21,3 327
139 6-(E)-(4-hydroxy-1,3dimethylbut-2-en-1 ylamino) 2-bromethyl 45,9/46,2 5,3/5,5 20,6/20,9 341
140 6-(E)-(4-hydroxy-1,3dimethylbut-2-en-1 ylamino) 3-brompropyl 47,5/47,3 5,7/5,3 19,8/19,4 355
141 6-(E)-(4-hydroxy-1,3dimethylbut-2-en-1 ylamino) 2-chlorvinyl 53,2/53,6 5,5/5,8 23,8/24,0 294
142 6-(E)-(4-hydroxy-1,3dimethylbut-2-en-l ylamino) 2-bromvinyl 46,2/46,1 4,8/4,6 20,7/20,5 339
143 6-(E)-(4-hydroxy-1,3dimethylbut-2-en-1 ylamino) 2,2- dichlorethyl 47,3/47,6 5,2/5,4 21,2/21,5 331
144 3 -methoxyfenylamino chlormethyl 53,9/53,8 4,2/4,2 24,2/24,1 290
145 3 -methoxyfenylamino 2-chlorethyl 55,4/55,5 4,7/4,6 23,1/23,2 304
146 3 -methoxyfenylamino brommethyl 46,7/46,9 3,6/3,9 21,0/21,4 335
147 3 -methoxy fenylamino 2-bromethyl 48,3/48,7 4,1/4,3 20,1/20,2 349
148 3-methoxyfenylamino 3-brompropyl 49,7/49,6 4,5/4,5 19,3/19,1 363
149 3-methoxyfenylamino 3-chlorpropyl 56,7/56,4 5,1/5,2 22,0/22,1 318
150 3-methoxyfenylamino 2-chlorvinyl 55,7/55,8 4,0/4,2 23,2/23,5 302
151 3-methoxyfenylamino 2-bromvinyl 48,6/48,9 3,5/3,8 20,2/20,5 347
152 3 -methoxy feny 1 am ino 2,2- dichlorethyl 49,7/49,9 3,9/3,8 20,7/20,4 339
153 4-hydroxy-3methylbuty lamino chlormethyl 49,0/48,2 6,0/5,8 26,0/26,3 270
154 4-hydroxy-3methylbutylamino 2-chlorethyl 50,8/50,5 6,4/6,1 24,7/24,3 284
155 4-hydroxy-3methy lbuty lamino 3-chlorpropyl 52,8/52,7 6,1/6,0 23,7/23,6 296
156 4-hydroxy-3methylbutylamino brommethyl 42,1/42,3 5,1/5,4 22,3/22,5 315
157 4-hydroxy-3methy lbuty lamino 2-bromethyl 43,9/44,0 5,5/5,6 21,3/21,4 329
158 4-hydroxy-3methylbuty lamino 3-bropřopyl 45,6/45,8 5,9/6,0 20,5/20,2 343
159 4-hydroxy-3methylbuty lamino 2-chlorvinyl 51,2/51,1 5,7/5,9 24,9/25,2 282
160 4-hydroxy-3methylbuty lamino 2-bromvinyl 44,2/44,4 4,9/5,1 21,5/21,8 327
161 4-hydroxy-3methylbuty lamino 2,2- dichlorethyl 45,3/45,1 5,4/5,3 22,0/21,7 319
162 4-hydroxy-l,3dimethylbutylamino chlormethyl 50,8/50,7 6,4/6,3 24,7/24,5 284
163 4-hydroxy-l,3dimethylbutylamino 2-chlorethyl 52,4/52,3 6,8/6,7 23,5/23,1 298
164 4-hydroxy-l,3dimethy Ibutyl amino 3-chlorpropyl 53,9/54,2 7,1/7,4 22,5/22,7 312
165 4-hydroxy-l,3dimethylbutylamino brommethyl 43,9/43,7 5,5/5,3 21,3/21,1 329
166 4-hydroxy-l,3dimethylbutylamino 2-bromethyl 45,6/45,8 5,9/6,1 20,5/20,7 343
167 4-hydroxy-l,3- dimethylbutylamino 3-brompropyl 47,2/47,0 6,2/6,2 19,7/19,4 357
168 4-hydroxy-l,3dimethylbutylamino 2-chlorvinyl 52,8/52,7 6,1/6,1 23,7/23,9 296
169 4-hydroxy-l,3dimethylbutylamino 2-bromvinyl 45,9/45,7 5,3/5,2 20,6/20,4 341
170 4-hydroxy-l,3dimethy 1 buty lamí no 2,2- dichlorethyl 47,0/46,9 5,8/5,7 21,1/21,4 333
Příklad 6
Testování vlivu nových látek na buněčné dělení rostlinných buněk
Stimulační vliv nově připravených derivátů byl testován v kalusovém biotestu za použití cytokinin-dependentního kalusu tabáku. Tento cytokinin-dependentní tabákový kalus Nicotiana tabacum L. cv. Wisconsins 38 byl udržován při 25 °C na modifikovaném mediu Murashige-Skoog (MS) obsahujícím na 1 litr: 4 pmol kys. nikotinové, 2,4 pmol pyridoxin hydrochloridu, 1,2 pmol thiaminu, 26,6 pmol glycinu, 1,37 μπιο! glutaminu, 1,8 pmol myoinositolu, 30 g sacharosy, 8 g agaru, 5,37 pmol α-naftyloctové kyseliny a 0,5 pmol 6-benzylaminopurinu. Subkultivace probíhala každé 3 týdny. Čtrnáct dní před započetím biotestu byl kalus přenesen na médium bez 6-benzylaminopurinu. Stimulační růstová aktivita byla stanovena na základě nárůstu čerstvé hmoty kalusu po 4 týdnech kultivace. Šest replikátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a daný test byl opakován minimálně 2krát, V každém experimentu byly testovány nové sloučeniny, které byly porovnány s aktivitou jejich N9-nesubstituovaných rodičovských cytokininů Kin a iP, které je známy jako velmi aktivní cytokininy. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na 10‘3 M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10 ’s až ΙΟ'4 M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2 % a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu.
Ze získaných dat byla opět vypočítána maximální účinná koncentrace testované látky. Byla vypočtena relativní účinnost látky při této koncentraci (tabulka 2). Aktivita získaná při 10'6 M N9-nesubstituovaných rodičovských cytokininů Kin a 10‘5fiP byla postulována jako 100% biologické aktivity.
Látka účinkující jako cytokinin by měla mít stimulační vliv na buněčné dělení rostlinných buněk. Výsledky v tabulce 2 naznačují, že nově připravené substituované deriváty obecného vzorce I vykazovaly silnou cytokininovou aktivitu v kalusovém biotestu ve srovnání s dosud známým cytokininy Kin a iP.
Tabulka 2:Vliv nových sloučenin na růst cytokinin-dependentního tabákového kalusu Nicotiana tabacum L. cv. Wisconsins 38
č. Testovaná sloučenina nej účinnější koncentrace (mol.l·1) aktivita (%) [ 10* mol.l·' Kin = 100%] aktivita (%) [10’5 mol.l·1 iP = 100%]
6-furfurylaminopurin (Kin) 10'6 100
1 6-furfurylamino-9-(2-chlorethyl)purin 10s 120 (±6)
2 6-furfúry lam ino-9-(2 - bromethy l)purin 10’5 110 (±3)
6-(3-methy lbut-2-en-1 -yl)aminopurin (iP) 10’5 100
3 6-((3-methylbut-2-en-l-yl)ainino)-9-(2- bromethyl)purin 10-5 103 (±4)
4 6-((3-methylbut-2-en-l-yl)amino)-9-(2- chlorethyl)purin ícr5 112 (±7)
Příklad 7
Stimulace buněčné proliferace při vysokých koncentracích
Cytokininy jsou známé jaké látky se stimulační aktivitou na buněčnou proliferaci při optimální koncentraci, avšak typicky při koncentracích převyšujících 10 μΜ se jejich účinky 11' na buněčné dělení mění v inhibiční (Holub et al, 1998, Plant Growth Regul, 26, 109x115, 1998). Z těchto důvodů byl testován i účinek vysokých koncentrací nově připravených derivátů s pomocí cytokinin-dependentního kalusu tabáku tak .jak je popsáno v příkladu 6. Nové sloučeniny 1, 2 a 4 byly testovány ve vysokých koncentracích (1-100 μΜ) a jejich aktivity byly porovnány s aktivitami s příslušnými N9-nesubstítuovanými rodičovskými cytokininy. Jak je ukázáno na obr.l, N9-alkyl substituce mají preventivní účinky vůči typické inhibiční cytokininové aktivitě na buněčnou proliferaci ve vysokých koncentracích převyšujících 10 μΜ a dokonce i v nejvyšší aplikované koncentraci (100 μΜ) vykazují sloučeniny 1, 2 a 4 dále silný stimulační efekt, kdežto/jejich N9-nesubstituované rodičovské cytokininy (Kin, iP) inhibovaly silně růst kalusu (Obr. 1).
Nové sloučeniny obecného vzorce I jsou proto schopné stimulovat buněčnou proliferaci v mnohem širším koncentračním rozpětí než dosud známé cytokininy a na rozdíl proti nim nemají negativní (inhibiční) efekt když jsou aplikovány ve vysokých koncentracích. Z těchto důvodů jsou oproti látkám známým zprior-art mnohem vhodnější pro praktické použití v rostlinných biotechnologiích.
Příklad 8
Antisenescenční aktivity nových látek při testování v senescenčním biotestu na segmentech listů pšenice
Semena ozimé pšenice Triticum aestivum cv. Hereward byla promyta pod tekoucí vodou po 24 hMf a poté vyseta do vermikulitu nasyceného Knopovým živným roztokem. Nádoby se semeny bybj umístěny do klimatizované růstové komory s 16/8 hodinovou světelnou periodou (světelná intenzita 50 mmol.mÁs'1) a teplotou 15 °C. Po 7 dnech měly semenáčky vyvinutý první praporcový list a druhý list začínal prorůstat. Z prvních listů vždy od 5 rostlin byly odebrány vrcholové sekce dlouhé přibližně 35 mm, které byly zkráceny tak, aby jejich váha byla přesně 100 mg. Bazální konce těchto 5 listových segmentů byly umístěny do jamek mikrotitračních polystyrénových destiček obsahujících 150 ml roztoku testovaného derivátu. Destičky byly umístěny do plastového boxu vystlaného filtračním papírem, který byl nasycen vodou za účelem maximální vzdušné vlhkosti. Po 96 hodinách inkubace ve tmě při 25 °C byly listové sekce vyjmuty a chlorofyl extrahován v 5 ml 80% ethanolu zahřátím při 80 °C po dobu 10 min. Objem vzorku byl poté doplněn na 5 ml přidáním 80% ethanolu. Absorbance extraktů byla měřena při 665 nm. Jako kontroly byly měřeny rovněž chlorofylové extrakty z listů a listových vrcholů inkubované v deionizované vodě. Vypočtené hodnoty jsou průměrem z 5 opakování a celý experiment byl zopakován minimálně 2-krát. V každém experimentu byla otestována aktivita nových sloučenin a porovnána s aktivitou N9— nesubstituovaného rodičovského cytokininu, který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na 10'3 M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem
I I v koncentračním rozsahu 10'8 až ΙΟ“4 M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0.2% a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. 10’4 M koncentrace kontrolní látky Kin byla postulována jako 100% biologické aktivity.
Látky účinkující jako cytokininy by měly mít pozitivní vliv na oddálení senescence v segmentech listů pšenice ve tmě. Nově připravené substituované cytokininy obecného vzorce I vykazovaly silnější cytokininové aktivity ve srovnání s dosud známým cytokininem kinetinem (Kin).
Tabulka 3
Vliv nových sloučenin na oddálení senescence v dekapitovaných segmentech listů Triticum aestivum cv. Hereward ve tmě.
č. Testovaná sloučenina nejúčinnější koncentrace (moLl*1) aktivita (%) [10'4mol.r‘ Kin = 100%]
6-furfurylaminopurin io* 100
1 6-íurfury lam ino-9-(2 -c hlorethy l)purin 10* 120 (±15)
2 6-ftirfurylamino-9-(2-bromethyl)purin 10* 102 (±3)
Příklad 9
Antisenescenění aktivita nových slučenin při testování v senescenčním biotestu na segmentech listů pšenice při působení světla
Schopnost nových sloučenin bránit degradaci chlorofylu dekapitovaných listech pšenice byla rovněž testována za přítomnosti světla. Tento experiment byl proveden jak je popsáno ,'J Ί v příkladu 7 v následující modifikaci - inkubace listů se sloučeninou bylp realizováno za konstantního světla (100 pmol.nfÁs’1) při 22°C. Jak je ukázáno na obr. 2 nové sloučeniny vykazovaly silnější pozitivní účinky na oddálení senescence v segmentech listů pšenice za přítomnosti světla v porovnání s N9-nesubstituovaným rodičovským cytokininem Kin. Sloučenina 1 a 2 bránila degradaci chlorofylu s vysokou účinností, která dosáhla 32-krát a 18krát menší EC5o než dosud známý cytokinin Kin. Nově připravené substituované cytokininy obecného vzorce I vykazovaly silnější antisenescenční aktivity na světle ve srovnání s dosud známým cytokininem kinetinem (Kin).
Tabulka 4
Vliv nových sloučenin na oddálení senescence v dekapitovaných segmentech listů Triticum aestivum cv. Hereward na světle.
č. Testovaná sloučenina nejúčinnější koncentrace (mol.r1) aktivita (%) [ 10“* mokl1 Kin = 100%]
6-fiirfury lam inop urin 10“4 100
1 6-furfurylamino-9-(2-chlorethyl)purin 10’5 116(±7)
2 6-furfurylamino-9-(2’bromethyl)purin 10“* 121(±8)
Příklad 10
Ochrana před peroxidací membránových lipidů v pšenici
Typickým projevem provázejícím senescenci je zvýšení hladiny reaktivních kyslíkových derivátů a následná peroxidace membránových lipidů. Proto byly stanoveny hladiny MDA, oxidativního markéru poškození mebránových lipidů, v extirpovaných listech pšenice vystavených působení připravených derivátů a kinetinu po dobu čtyř dnů v temnu, jak bylo popsáno v příkladu 7. Hladiny MDA byly stanoveny pomocí kyseliny thiobarbiturové (TBA). 100 mg čerstvého rostlinného materiálu bylo homogenizováno pomocí oscilačního mlýnu (MM301, Retsch, Germany) s 1 mL 80% methanolu. Surový extrakt byl centrifugován při 10,000xg po dobu 5 minut, lOOJgÚ alikvot supematantu byl protřepán se 100 pL 0,5% (w/v) TBA obsahujícími 0.1% (w/v) trichloroctovou kyselinu, a výsledný roztok byl inkubován 30 minut při 95 °C. Vzorky byly rychle ochlazeny na ledu a centrifugovány 5 minut při lOOOxg. Absorbance supematantu byla změřena při 532 nm s korekcí při 600 nm a množství vzniklého komplexu MDA-TBA bylo vypočítáno z extinkčního koeficientu 155 mM^cm'1.
Nové deriváty 1 a 2 významně snižovaly peroxidaci membránových lipidů ve srovnání s neošetřenou kontrolou (Tabulka 5 - hodnoty vyjadřují obsah MDA, oxidativního markéru poškození mebránových lipidů). Látky 1 a 2 snižovaly míru peroxidace membránových lipidů v extirpovaných listech pšenice na 67, resp. 69% původní hodnoty.
Nově připravené deriváty obecného vzorce I tak chrání před negativním účinkem reaktivních kyslíkových derivátů, které jsou akumulovány v tkáních během senescence listu v temnu.
Tabulka 5
Efekt nových látek na peroxidaci membránových lipidů v průběhu senescence extirpovaných listů Triticum aestivum cv. Hereward v temnu.
No Testovaná sloučenina MDA (nmol/g FW)
Neošetřená kontrola 18,9 (±2,2)
1 6-furfurylamino-9-(2-chlorethyl)purin 12,8 (±1,0)
2 6-furfury lam in o-9-( 2-bromethy l)purin 13,2 (±1,5)
Příklad 11
Testování nových látek v amarantovém biotestu
Pro studium cytokininové aktivity byl rovněž použit “amarantový” biotest v následující modifikaci. Semena Amaranthus caudatus var. Atropurpurea byla povrchově sterilizována 10% N-chlorbenzensulfonamidem (w/v) po dobu 10 min a poté promyta 5-krát deionizovanou vodou. Semena byla rozmístěna v 15’cm Petriho miskách s filtračním papírem saturovaným destilovanou vodou. Po 72 hodinách kultivace při 25 °C ve tmě byly ze semenáčků odstraněny kořeny. Tyto explantáty obsahující 2 kotyledony a hypokotyl byly umístěny do 5cm Petriho misek na 2 vrstvy filtračního papíru nasyceného 1 ml inkubačního média obsahujícího 10 pmol Na2HPO4-KH2PO4, pH 6,8, 5 μπιοί tyrosinu a testovaný cytokinin. Na misku bylo umístěno 20 explantátů. Veškeré manipulace byly prováděny pod zeleným světlem v temné komoře. Po 48 hodinách inkubace při 25 °C ve tmě byl betacyanin extrahován cestou zmražení explantátů ve 4 ml 3,33 μΜ kyselině octové. Koncentrace betacyaninu byla stanovena porovnáním absorbancí při 537 a 620 nm a vypočtena pomocí vzorce ΔΑ - A537nni - A620nm- Hodnoty byly vyneseny do grafů závislosti ΔΑ na koncentraci. Pět replikátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a daný test byl opakován minimálně 2-krát. V každém experimentu byla otestována aktivita nových sloučenin a porovnána s aktivitou N9-nesubstituováného rodičovského cytokininu iP, který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na 10'3 M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10'8 až !0‘4 M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2% a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. Aktivita získaná při 10'4 M iP byla postulována jako 100 %.
Látka účinkující jako cytokinin by měla mít stimulační vliv na indukci betacyaninu v amarantovém biotestu. Výsledky v Tab. 6 ukázaly, že nově připravené substituované cytokininy obecného vzorce I vykazovaly silnější cytokininové aktivity v amarantovém biotestu ve srovnání s dosud známým cytokininem ÍP.
Tabulka 6
Vliv nových sloučenin na tvorbu betacyaninu v hypokotylech Amaranthu ve tmě
č. Testovaná sloučenina nejúčinnější koncentrace (molT1) aktivita (%) [lO^molT1 iP = 100%]
6-(3-methylbut-2-en-l-yl)aminopurin (iP) 10’4 100
3 6-((3-methylbut-2-en-1 -yl)amino)-9-(2bromethyljpurin ío·4 116 (±9)
4 6-((3-methylbut-2-en-1 -yl)amino)-9-(2chlorethyl)purin ío-4 128 (±11)
Příklad 12
N9-halogenalkyl substituent cytokininu zabraňuje inhibičnímu efektu dosud známého cytokininu na růst kořene kukuřice
Cytokininy jsou známé jako negativní regulátory prodlužování kořene a tvorby postranních kořenů (Werner et al. 2001) a jejich exogenní aplikace v koncentracích převyšujících 1 μΜ často vede ke kompletní inhibici růstu kořene. Abychom prozkoumaly in vivo efekt nových derivátů na růst a vývoj kořene, semena kukuřice (Zea mays cv. CELLUX, Morseva, Česká republika) byly nabobtnány ve vodovodní vodě a ponechány ke klíčení ve tmě na zvlhčeném filtračním papíře. Po dvou dnech byly vyklíčené semenáčky přeneseny do provzdušňovaných hydroponických nádob naplněných Hoaglandovým roztokem (15 rostlin na 1 litr Hoaglandova roztoku). Rostliny byly pěstovány v komoře při režimu 16 hpdj světlo (250 μΕ. * nÚ.s’1) při 27°C a 8 hp^tma při 20°C. Živný roztok obsahoval 5 μΜ a 10 μΜ koncentraci 6- furfurylamino-9-(2-chlorethyl)purinu nebo 5 μΜ cytokinin kinetin (Kin). Všechny roztoky včetně negativní kontroly obsahovaly DMSO ve výsledné koncentraci 0..01%.
Obr. 3 dokumentuje, že po aplikaci 5 μΜ látky 1 byl fenotyp kořene i prýtu rostlin kukuřice téměř identický s negativní kontrolu ošetřenou DMSO (Obr. 3). Když byla látka 1 aplikovaná v koncentraci 10 μΜ, byla detekována pouze slabá redukce délky hlavního a vedlejších kořenů, zatímco již 5 μΜ koncentrace kinetinu způsobila dramatické ztloustnutí a zkrácení hlavního kořene a úplnou inhibici tvorby postranních kořenů (Obr. 3).
VP14 je gen kódující 9-cis-epoxykarotenoid dioxygenasu, enzym zodpovědný za biosyntézu kys. abscisové (Schwarz et al., 2003, Plant Phys., 131, 1591-1601). Kys. abscisová slouží kromě jiného jako spouštěč exprese genů odpovědi na stres (Tan et al., 1997, Proč Nati Acad Sci USA, 94, 12235*40). Zvýšená exprese tohoto genu tak ukazuje na to, že rostlina se vyskytuje ve stresových podmínkách. 5-týdenní rostliny kukuřice byly vyjmuty šetrně ze substrátu a po dobu 3 dnů byly kultivovány ve vodném roztoku testované látky v koncentraci 5 μΜ. Poté byl metodou kvantitativní polymerázové řetězové reakce detekován a vyhodnocen počet transkriptů genu VP14 v kořenech a listech rostlin. Tab. 7 dokumentuje, že zatímco dosud známý cytokinin kinetin výrazně zvyšuje expresi VP14 v kořenech i listech kukuřice, látka 1 nezpůsobovala žádnou stresovou odpověď.
To naznačuje, že nově připravené substituované deriváty obecného vzorce I nemají negativní efekt na růst a vývoj kořene ve vysokých koncentracích, na rozdíl od dosud známých cytokininů, a mohou tak být s výhodou užity pro kořenové aplikace v širším koncentračním rozmezí než dosud známé cytokininy.
Tabulka 7
Vliv nových sloučenin na expresi stresového genu VP14 v intaktních rostlinách kukuřice Zea mays. (Relativní hodnoty počtu transkriptů, vztaženo k neošetřené kontrole.)
No Testovaná sloučenina relativní množství transkriptů
kořen list
NeoŠetřená kontrola 1 1
6-furfijrylaminopurin 3,4 (±0,8) 16,3 (±4,0)
1 6-furfiirylamino-9-(2-chlorethyl)purin 0,4 (±0,1) 1,1 (±0,3)
Příklad 13
Přípravky
Aktivní složkou v přípravcích může být kterákoliv sloučenina obecného vzorce I.
Al. Emulgovatelné koncentráty a) b) c) d)
Aktivní složka 5% 10% 25% 50%
dodecylbenzensulfonát vápenatý 6% 8% 6% 8%
polyoxyethylovaný ricinový olej
(polyglykol ether ricinového oleje) 4% - 4% 4%
(36 mol ethylenOxid)
oktylfenol polyglykol ether - 2 % - 2%
(7+8 mol ethylenpxid)
cyklohexanon - - 10% 20%
směs aromatických uhlovodíků 83 % 82% 53% 18%
C9-C12
Emulze o vyžadované finální koncentraci mohou být získány z takového koncentrátu zředěním vodou.
A2. Roztoky a) b) c) d)
Aktivní složka 5 % 10% 50%
1 -metho xy-3 -( 3 -metho xy- 7
propoxy) ^propan - 20% 2Q% -
polyethylenglykol MW 400 20% Λ 10% - -
N-methyl-2-pyrrolidon - - 3Q% Λ 10%
směs aromatických uhlovodíků 75% 60% - -
C9-C12
Roztoky jsou vhodné k aplikaci ve formě mikrokapének.
A3. Smáčívé prášky a) b) c) d)
Aktivní složka 5% 25 % 50% 80%
lignosulfonát sodný 4% - 3 % -
laurylsulfát sodný 2% 3% - 4 %
di i sobuty lnaftalensulfonát - 6% 5% 6%
sodný
oktylfenol polyglykol ether - 1 % 2% -
(7-1-8 mol ethylenOxid)
vysoce disperzní kyselina křemičitá 1 % 3% 5% 10%
kaolin 87% 61 % 37% -
Aktivní složka je důkladně promísena s pomocnými látkami a směs je důkladně rozemleta ve vhodném mlýnu. Suspenzi libovolné koncentrace je možné získat smísením vzniklého prachu s vodou.
A4. Potahované granule a) b) c)
Aktivní složka 0.1 % 5% 15%
vysoce disperzní kyselina křemičitá 0.9 % 2% 2%
anorganický nosič 99.0 % 93 % 83 %
(0,1 »1 mm) např. CaCO3 nebo SiO2
Aktivní složka je rozpuštěna v methylenchloridu a nasprejována na nosič. Rozpouštědlo je odpařeno ve vakuu.
A5. Potahované granule a) b) c)
Aktivní složka 0.1 % 5% 15%
polyethylenglykol MW 200 1.0% 2% 3 %
vysoce disperzní kyselina křemičitá 0,9 % 1 % 2%
anorganický nosič 98,0 % 92% 80%
(AE 0,1 <4 mm) např. CaCO-, nebo SiO2
Jemně rozemletá aktivní složka je v mixéru stejnoměrně nanesena na nosič zvlhčený polyethylenglykolem. Takto jsou získány neprašné granule.
A6. Extrudované granule a) b) c) d)
Aktivní složka OJ % 3 % 5% 15 %
lignosulfonát sodný 1.5 % 2% 3 % 4%
karboxymethylcelulosa 1.4% 2% 2% 2%
kaolin 97,0 % 93 % 90% 79%
Aktivní složka je smísena a rozemleta s pomocnými látkami a složka je zvlhčena vodou. Směs je extrudována a usušena v proudu vzduchu.
A7. Prachv a) b) c)
Aktivní složka 0.1 % 1 % 5 %
talek 39,9 % 49% 35%
kaolin 60.0 % 50% 60%
Prachy k přímému použití jsou získány rozemletím aktivní složky s nosičem ve vhodném mlýnu.
A8. Susnenzní koncentrát a) b) c) d)
Aktivní složka 3% 10% 25% 50%
ethylen glykol 5 % 5% 5 % 5%
nonylfenol polyglykol ether- 1 % 2% -
< v (15 mol ethylen oxid)
lignosulfonát sodný 3 % 3 % 4% 5 %
karboxymethylcelulosa 1 % 1 % 1 % 1%
37 % vodný roztok formaldehydu 0.2 % 0.2 % 0.2 % 0.2%
emul$e silikonového oleje 0.8 % 0.8 % 0.8 % 0.8;%
voda 86% 78% 64% 38%
Jemně rozemletá aktivní složka je smíchána s pomocnými látkami. Vzniklý suspenzní koncentrát umožňuje přípravu suspenze o požadované koncentraci zředěním vodou.
Příklad 14
Gel
Názvy složek jsou uváděny v souladu s terminologií registračních úřadů. Obsah složek je uváděn v gramech na 100 g.
Gel /100 g
Aktivní látka 6-furfurylamino-9-(2-chlorethyl)purin) 1,0 g
butylhydroxytoluen (Nipanox BHT) 0,2 g
butylparaben (Nipabutyl) 0,2 g
diethylenglykol monoethyl ether (Transcutol P) 10,0 g
bezvodá koloidní silika (Zeopharm 177) 5,0 g
propylenglykol laurát (Lauroglycol FCC) 83,6 g
Konzistence gelu může být dále modifikována přidáním bezvodé koloidní siliky.
Účinek aktivní látky může být zvýšen pomocí transdermálního systému Transcutol P/Lauroglycol FCC. Bezvodá koloidní silika pravděpodobně zpomalí penetraci účinné látky, což povede k protrahovanému účinku.

Claims (12)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použití sloučeniny obecného vzorce I, kde
    Ró je vybráno ze skupiny zahrnující -NH-furfuryl, -NH-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-yl), χ ~NH-(3-methylbut-2-en-1 -y 1), -NH-(4-hydroxy-3-methylbutyl), -NH-(4-hydroxy-1,3— dimethylbut-2-en-l-yl), -NH-(4-hydroxy-l,3-dimethylbutyl), -NH-benzyl, -NH-fenyl, přičemž benzyl, furfuryl a fenyl mohou být nesubstituované nebo substituované 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny zahrnující hydroxy, halogen, methyl a methoxy,
    Rq je vybrán ze skupiny zahrnující C1-C3 alkyl a C1-C3 alkenyl, přičemž každá z těchto skupin je substituována jedním nebo více atomy halogenu, pro regulaci růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk.
  2. 2. Použití podle nároku 1, kde sloučenina obecného vzorce I je vybrána ze skupiny zahrnující
    6-(furfurylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3— brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvínyl)purin, 6-(2-chlorbenzylamino)-9— (chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-chlorbenzylamino)-9-(chloimethyl, 2— chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-fluorbenzylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3- chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2- bromvinyl)purin, 6-(3-hydroxybenzylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-methoxybenzylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2- 35 bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichiorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-methylbut--
    2- en-1-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-- brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-benzylamino-9— (chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2- dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(Z)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(E)-(4-hydroxy-3-~ methylbut-2-en-l-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2— bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(Z)-(4-hydroxy-1,3-dimethylbut-2-en-l-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(E)-(4-hydroxy-l,3-dimethylbut-2-en-l-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyí, 2— bromvinyl)purin, 6-(4-hydroxy-l,3-dimethylbutylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl,3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl,2— bromvinyl)purin, 6-(4-hydroxy-3-methylbutylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3- chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl,2— bromvinyl)purin, 6-fenylamino-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2— bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-methoxyfenylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl,
  3. 3- brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(2-methoxybenzylamino)— 9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(2-hydroxybenzylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2--~ chlorvinyl, 2-bromvÍnyl)purin, 6-(2-fluorbenzylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3- chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2bromvinyl)purin.
    3. Použití podle nároku 1, kde regulace růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk zahrnuje stimulaci organogeneze u rostlin vedoucí ke zvětšení kořenového systému.
  4. 4. Použití podle nároku 1, kde regulace růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk zahrnuje urychlení nalévání semen a zvětšení velikosti semene a plodů jednoděložných rostlin a zkrácení doby klíčení semen rostlin.
  5. 5. Použití podle nároku 1, kde regulace růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk zahrnuje regulaci proliferace a morfogeneze a inhibici senescence a stresu.
  6. 6. Použití podle nároku 1, kde regulace růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk zahrnuje oddálení degradace chlorofylu a stárnutí rostlinných pletiv.
  7. 7. Použití podle nároku 1, kde regulace růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk zahrnuje zvýšení výnosu a kvality zemědělských produktů u jednoděložných rostlin.
  8. 8. Použití sloučenin obecného vzorce I podle nároku 1 při přípravě přípravků pro klonování rostlinných buněk, orgánů, zárodečných buněk a embryí.
  9. 9. Použití sloučenin obecného vzorce I podle nároku 1 při přípravě růstově-regulačních přípravků k ošetřování rostlin a jejich orgánů či buněk.
  10. 10. Přípravky pro klonování rostlinných buněk, orgánů, zárodečných buněk a embryí, vyznačené tím, že obsahují alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I, jak je definována v nároku 1, a pomocné látky.
  11. 11. Růstově-regulační přípravky, vyznačené tím, že obsahují alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I, jak je definována v nároku 1, a pomocné látky.
  12. 12. Sloučeniny obecného vzorce Ia,
CZ20100670A 2010-09-07 2010-09-07 Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny CZ303054B6 (cs)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20100670A CZ303054B6 (cs) 2010-09-07 2010-09-07 Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny
EP11781999.5A EP2613631B1 (en) 2010-09-07 2011-09-02 Use of 6-substituted 9-halogenalkyl purines for regulation of growth and development of whole plants, plant cells and plant organs; novel 6-substituted 9-halogenalkyl purines
PCT/CZ2011/000086 WO2012031574A1 (en) 2010-09-07 2011-09-02 Use of 6 - substituted 9 - halogenalkyl purines for regulation of growth and development of whole plants, plant cells and plant organs; novel 6 - substituted 9 -halogenalkyl purines
US13/821,163 US9220269B2 (en) 2010-09-07 2011-09-02 Use of 6-substituted 9-halogenalkyl purines for regulation of growth and development of whole plants, plant cells and plant organs; novel 6-substituted 9-halogenalkyl purines

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20100670A CZ303054B6 (cs) 2010-09-07 2010-09-07 Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2010670A3 true CZ2010670A3 (cs) 2012-03-14
CZ303054B6 CZ303054B6 (cs) 2012-03-14

Family

ID=44946903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20100670A CZ303054B6 (cs) 2010-09-07 2010-09-07 Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9220269B2 (cs)
EP (1) EP2613631B1 (cs)
CZ (1) CZ303054B6 (cs)
WO (1) WO2012031574A1 (cs)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016095881A1 (en) * 2014-12-15 2016-06-23 Univerzita Palackeho V Olomouci Substituted 6-anilino-9-heterocyclylpurine derivatives for inhibition of plant stress
PH12018502599B1 (en) 2016-06-14 2023-05-10 Syngenta Participations Ag Use of 6-anilino purine derivatives to improve heat stress tolerance of rice seedlings
CR20200259A (es) * 2017-12-12 2020-11-12 Syngenta Participations Ag Regulación del crecimiento de plantas
CN110407836B (zh) * 2019-08-15 2022-03-29 沈阳化工研究院有限公司 一种9-（2-甲氧基乙基）-9h-嘌呤-6-胺衍生物及其应用
CN110642859B (zh) * 2019-10-11 2021-11-09 青岛科技大学 一种含嘧啶硫酮嘌呤类化合物及其用途
CZ309368B6 (cs) * 2020-05-17 2022-10-12 Univerzita Palackého v Olomouci Mesylátové soli heterocyklických cytokininů, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použití

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA657337A (en) * 1963-02-05 D. Zwahlen Kenneth Substituted adenines
NL262940A (cs) * 1960-03-31
US3213095A (en) 1963-04-04 1965-10-19 American Cyanamid Co N-benzylation of adenine
US3228937A (en) * 1963-07-17 1966-01-11 Shell Oil Co Adenine derivative
GB2041359B (en) * 1979-01-10 1982-12-15 Ici Ltd Purine derivatives and their use in the defoliation of cotton plants
EP0155911A1 (de) * 1984-03-19 1985-09-25 Ciba-Geigy Ag Purinderivate zur Regulierung des Pflanzenwachstums
EP0457773A4 (en) * 1989-01-31 1993-03-10 Whitby Research Incorporated N?6 -substituted 9-methyladenines: a new class of adenosine receptor antagonists
EP0888057B1 (en) 1996-03-15 2001-09-05 Syngenta Participations AG Herbicidal synergistic composition and method of weed control
DE60118521T2 (de) * 2000-01-07 2006-10-12 Universitaire Instelling Antwerpen Purin derivate, ihre herstellung und verwendung
CZ294535B6 (cs) 2001-08-02 2005-01-12 Ústav Experimentální Botaniky Avčr Heterocyklické sloučeniny na bázi N6-substituovaného adeninu, způsoby jejich přípravy, jejich použití pro přípravu léčiv, kosmetických přípravků a růstových regulátorů, farmaceutické přípravky, kosmetické přípravky a růstové regulátory tyto sloučeniny obsahující
PL1746889T3 (pl) * 2004-05-12 2010-01-29 Bayer Cropscience Ag Regulacja wzrostu roślin
US7960397B2 (en) * 2007-12-28 2011-06-14 Institute Of Experimental Botany, Academy Of Sciences Of The Czech Republic 6,9-disubstituted purine derivatives and their use as cosmetics and cosmetic compositions

Also Published As

Publication number Publication date
EP2613631A1 (en) 2013-07-17
US9220269B2 (en) 2015-12-29
WO2012031574A1 (en) 2012-03-15
EP2613631B1 (en) 2016-04-13
US20130210632A1 (en) 2013-08-15
CZ303054B6 (cs) 2012-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2203451B1 (en) Substituted 6-(alkylbenzylamino)purine derivatives for use as cytokinin receptor antagonists and preparations containing these derivatives
ES2431926T3 (es) Derivados de 6-anilinopurina sustituidos como inhibidores de citocinina oxidasa/deshidrogenasa y preparaciones que contienen estos derivados
CZ2010670A3 (cs) Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny
EP3233860B1 (en) Substituted 6-anilino-9-heterocyclylpurine derivatives for inhibition of plant stress
WO2012135366A1 (en) Composition and method for stress mitigation in plants
Bíbová et al. New generation of Arabidopsis thaliana cytokinin oxidase/dehydrogenase inhibitors affect shoot/root growth and seed yield
US10550144B2 (en) 6-aryl-9-glycosylpurines and use thereof
EP4153592B1 (en) Mesylate salts of heterocyclic cytokinins, compositions containing these derivatives and use thereof
CZ310363B6 (cs) Krystalická forma 1-fenyl-3-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)močoviny, přípravky ji obsahující, a její použití
CZ2014613A3 (cs) Deriváty 1,2,3-thiadiazol-5-yl močoviny, jejich použití pro regulaci senescence rostlin a přípravky obsahující tyto deriváty
CZ306009B6 (cs) Použití N-furfuryl-N´-1,2,3-thiadiazol-5-yl močoviny pro inhibici senescence, stresu a oxidativního poškození

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20220907