CZ303054B6 - Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny - Google Patents

Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny Download PDF

Info

Publication number
CZ303054B6
CZ303054B6 CZ20100670A CZ2010670A CZ303054B6 CZ 303054 B6 CZ303054 B6 CZ 303054B6 CZ 20100670 A CZ20100670 A CZ 20100670A CZ 2010670 A CZ2010670 A CZ 2010670A CZ 303054 B6 CZ303054 B6 CZ 303054B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
bromoethyl
chloroethyl
chloropropyl
bromomethyl
hydroxy
Prior art date
Application number
CZ20100670A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2010670A3 (cs
Inventor
Mik@Václav
Szücová@Lucie
Doležal@Karel
Spíchal@Lukáš
Galuszka@Petr
Strnad@Miroslav
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Palackého v Olomouci filed Critical Univerzita Palackého v Olomouci
Priority to CZ20100670A priority Critical patent/CZ2010670A3/cs
Priority to PCT/CZ2011/000086 priority patent/WO2012031574A1/en
Priority to EP11781999.5A priority patent/EP2613631B1/en
Priority to US13/821,163 priority patent/US9220269B2/en
Publication of CZ303054B6 publication Critical patent/CZ303054B6/cs
Publication of CZ2010670A3 publication Critical patent/CZ2010670A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/26—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with an oxygen, sulphur, or nitrogen atom directly attached in position 2 or 6, but not in both
    • C07D473/32—Nitrogen atom
    • C07D473/34—Nitrogen atom attached in position 6, e.g. adenine

Abstract

Predkládané rešení se týká použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu obecného vzorce I, kde R.sub.6.n. je -NH-furfuryl, -NH-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl), -NH-(3-methylbut-2-en-1-yl), -NH-(4-hydroxy-3-methylbutyl), -NH-(4-hyroxy-1,3-dimethylbut-2-en-1-ylamino), -NH-(4-hydroxy-1,3-dimethylbutylamino), -NH-benzyl, -NH-fenyl, a R.sub.9.n. je C.sub.1.n.-C.sub.3 .n.alkyl a C.sub.1.n.-C.sub.3 .n.alkenyl, pricemž každá z techto skupin je substituována jedním nebo více atomy halogenu, pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, která zahrnuje napr. stimulaci organogeneze u rostlin vedoucí ke zvetšení korenového systému, urychlení nalévání semen a zvetšení velikosti semen a plodu jednodeložných rostlin a zkrácení doby klícení semen rostlin; prípravku pro klonování rostlinných bunek, orgánu, zárodecných bunek a embryí a rustove-regulacních prípravku.

Description

(57) Anotace;
Předkládané řešení se týká použití 6-substituovaných 9halogenalkyl purinů obecného vzorce 1, kde R6 je -NHfurfuryl, -NH-{4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-yl). -NH-Í3methylbut*2-en-1-yl), -NH-(4-hydroxy-3-methylbutyl), -NH(4-hyroxy-i.3-dímethylbut-2-en-l-ylamino), -NH-(4-hydroxy1,3-dímethyl butylamino), -NH-benzyl, -NH-fenyl, a R9je Cr C3alkyl a Cj-Cjalkenyl, přičemž každáz těchto skupin je substituována jedním nebo více atomy halogenu, pro regulaci růstu a vývoje rostl in, rostl inných orgánů a buněk, která zahrnuje např. stimulaci organogeneze u rostlin vedoucí ke zvětšení kořenového systému, urychlení nalévání semena zvětšení velikosti semen a plodů jednoděložných rostlin a zkrácení doby klíčení semen rostlin; přípravků pro klonování rostlinných buněk, orgánů, zárodečných buněk a embryí a růstovč-regulačnich přípravků.
Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinů pro regulaci růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk, nové 6-substítuované 9-halogenalkyl puriny
Oblast techniky
Vynález se týká použití 6-substituovaných 9—halogenalkyl purinů pro regulaci růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk, přípravků obsahujících tyto deriváty a nových 6substituovaných 9-halogenalkyl purinů.
io
Dosavadní stav techniky
Rostlinné hormony cytokininy (CK) hrají klíčovou roli v různých fyziologických procesech, jako je vývoj, stresové reakce nebo senescence rostlin. Jejich hladiny jsou v různých tkáních nebo buněčných kompartmentech velmi přesně regulovány. Mechanismus regulace CK je zprostředkován proteiny účastnícími se biosyntézy, aktivace, degradace, transportu nebo percepce CK. Cytokinin dehydrogenasy (CKX, EC 1.5.99.12) jsou enzymy deaktivující CK ireverzibilní degradací jejich molekuly. V rostlinách existuje několik isoforem CKX, které mají různou spe20 cifitu vůči cytokininům (Bilyeu et al. 2001, Plant. Phys. 125:378; Šmehilová ct al. 2009, J. Exper. Bot. 60:2701). Sledování z měn hladin transkriptu jednotlivých isoforem CKX v listech huseníčku, kukuřice a ječmene odhalily zvýšenou expresi některých isoforem v průběhu senescence listů a stresu, což vede ke snížení hladiny cytokininů během senescence. Dále bylo zjištěno, že pri solném a osmotickém stresu je navíc posílena i biosyntéza CK, což ve výsledku vede k mírnému nárůstu aktivních forem CK (Vyroubalová et al. 2009, Plant Physiol. 151:433). Celkově tato pozorování naznačují významnou roli různých forem CK během různých fyziologických procesů, jako je abiotický stres (Kuiper et al. 1990, Plant and Soil 123, 243; Davies & Zhang 1991, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42,55; Havlová 2008, Plant Cell. Env. 31:341) nebo senescence (Eisinger 1977, Plant Phys. 90, 1316; Lara et al. 2004, Plant Cell 16:1276). Přesná role CK
3o v uvedených procesech, zejména senescenci listů, však dosud nebyla objasněna.
Senescence listů je klíčovým krokem životního cyklu jednoletých rostlin, hrající důležitou roli v reprodukci, produktivitě, zvládání stresu a přežití u rostlin. Senescence je posledním krokem vývoje listů, závisejícím na věku, přičemž se ukazuje, že se jedná o složitý a vysoce regulovaný proces. Během tohoto procesu se ve stárnoucím listu nemobilizují uložené živiny a nastávají degradační procesy vedoucí k podpoře mladších vyvíjejících se orgánů, jako jsou mladé listy, plody či semena. Jedním z typických vizuálních symptomů senescence listů je ztráta chlorofylových pigmentů (žloutnutí), způsobená náhradou obsahu chloroplastů produkty procesů buněčné degradace. Žloutnutí listů je dále následováno ztrátou vody a případným oddělením listu. Na buněčné nebo molekulární úrovni zahrnují procesy vedoucí k těmto vizuálním symptomům kromě desintegrace chloroplastů také ztrátu proteinů a nukleových kyselin buňky. Molekulární podstata těchto dějů je pod kontrolou velmi rozdílných rostlinných regulačních mechanizmů. Ačkoliv senescence nastává s rostoucím věkem u mnoha druhů, její začátek a progrese může být ovlivňována mnoha faktory prostředí, jako je teplota, nedostatek minerálů a sucho, nebo vnitřními faktory, jako jsou regulátory růstu rostlin. Senescence listů je obecně vyvážena širokým spektrem fytohormonů, přičemž pokles hladiny cytokininů koreluje s procesem senescence v listech (Winkler et al., 2006, J. Exp. Bot. 57:391). Dále bylo ukázáno, že exogenní aplikace cytokininů inhibuje degradaci chlorofylu a proteinů fotosyntetického aparátu (He et al. 2005, J. Exper. Bot. 56, 1117 až 1128). Strategie oddálení senescence zahrnovala transgenní expresi isopentenyl transferasy (IPT; 2.5.1.27), enzymu podílejícího se na biosyntéze cytokininů. Transgenní rostliny se zvýšenými hladinami cytokininů vykazovaly oddálenou senescenci (Gan et al. 1995, Science 270:1986). Jiný přístup k udržení dostatečných hladin aktivních cytokininů v rostlinných tkáních zahrnuje inhibici cytokinin dehydrogenasy. Cytokinin-deficitní transgenní rostliny však nevykazovaly dřívější nástup senescence listů (Werner et al. 2003, Plant Biol. 8:371). Není tedy zatím prokázáno, zda snížení hladiny cytokininů způsobuje senescenci nebo zda se jedná o průvodní jev
- i setiescence. Enzymy považované za důležité v iniciaci a progresi senescence dále zahrnující proteasy, nukleasy a další degradativní enzymy. Předpokládá se, že enzymy podílející se na rozpadu chloroplastů mohou být přímo-indukované cytokininy. Remobilizace živin a udržování aktivity dalších částí rostlin je zajištěno enzymy regulujícími interakce zdroj-sink, především pak enzymy apoplastické floémové vykládací dráhy. Bylo zjištěno, že extracelulární invertasa, jeden z enzymů regulujících koncentraci hexosových cukrů v pletivech, je koindukovaná cytokininy. Bylo dále ukázáno, že extracelulární invertasa je potřebná pro oddálení senescence, což znamená, že mechanismus oddálení senescence cytokininy zahrnuje extracelulární invertasu (Lara et al. 2004, Plant Cell 16:1276). Bylo předpokládáno, že cytokinin dehydrogenásová aktivita se účastní procesu senescence, protože byla zjištěna výrazná upregulace dvou isoforem těchto enzymů deaktivujících cytokininy na úrovni exprese genů a v měřeních enzymové aktivity (Sromová Lucie, diplomová práce 2006, PřF UP).
Skutečnost, že cytokininy mohou oddalovat senescenci, je známá od první izolace kinetinu (N6furfurylaminopurin) (Miíler et al. 1956, J. Am. Chem. Soc. 78:1375) a testování jeho antisenescenčních vlastností na oddělených listech Xanthia (Richmond & Lang 1957, Science 125:650), Mnoho různých derivátů cytokininů oddaluje senescenci v různých druzích rostlin (Zhang & Letham 1989, J. Plant Growth Regul. 8:181; Kuhnle et al. 1977, Physiol. Plant 41:14; Eisinger 1977, Plant Physiol. 59:707; Kudryakova et al. 2001, Plant Growth Regul. 56:21). Jsou známy některé deriváty kinetinu (Zhang & Letham 1989, J. Plant. Growth Regul. 8:181; Fox et al. 1971, Plant Phys. 46:275). Připravili jsme několik nových derivátů substituovaných krátkými 9-alkylhalogenidy v poloze N9 purinu a stanovili jejich antisenescenční a protistámoucí vlastnosti v různých testech.
Dosud známé cytokininy jsou známé jako látky se stimulační aktivitou na buněčnou proliferaci při optimální koncentraci, avšak typicky při koncentracích převyšujících 10 μΜ se jejich účinky na buněčné dělení mění v inhibiční (Holub et al., 1998, Plant Growth Regul, 26, 109 až 115). Stejně tak je známo a dobře popsáno, že cytokininy působí jako negativní regulátory prodlužování kořene a tvorby postranních kořenů (Werner et al., 2001, Proč. Nati. Acad Sci USA. 98, 10487 až 92; Werner et al., 2003, Plant. Cell, 15, 2532 až 50), a jejich exogenní aplikace v koncentracích převyšujících 1 μΜ často vede ke kompletní inhibici růstu kořene. Tento vynález si klade zacil poskytnout další N9-substituované cytokininové deriváty, které mají unikátní aktivity v regulaci růstu rostlin, a které přitom nejsou toxické pro rostlinné a zvířecí buňky.
Purinové deriváty substituované v poloze 6 (případně substituovanými) skupinami benzyl, fenyl, furyl, furfuryl a naftyl, a v poloze 9 nižšími alkylovými skupinami, případně obsahujícími spojky -O- nebo -S-, spadají do obecného vzorce GB i 027 756 (1966) pro použití pro podporu růstu a/nebo prevenci rozkladných procesů v rostlinách, v příkladech tohoto dokumentu jsou však uvedeny pouze sloučeniny mající v poloze 9 tetrahydropyranyl, tedy aktivita sloučenin s nižší alkylovou skupinou v poloze 9 není prokázána a nelze ji vzhledem k rozsahu obecného vzorce z tohoto dokumentu vyvozovat. Dále obdobné deriváty, obsahující v poloze 6 případně substituovaný idi_yi iicďo iiaiL^i α v pvioze 9 Cr—alkyl ΐΐνίυ fenyl, připadne substituovaný fenyl, pro regula ci růstu rostlin spadají do obecného vzorce EP 0 155 911. Ani v tomto dokumentu není aktivita těchto derivátů prokázána, je prokázána pouze aktivita derivátu majícího v poloze 9 mesithylový substituent. Vzhledem k rozsahu obecného vzorce a strukturní rozdílnosti mesithylu od alkylu nelze činit závěry o skuteční aktivitě 9-alkylových substituentů.
Publikace Ramzayeva et al., Žurnál organičeskoj chimii (1988), 1090 až 1094 popisuje postup substituce 6-substituo váných purinů halogenalkyly. Sloučeniny známé z této publikace obsahují v poloze 6 benzylamino nebo methylthio skupinu a v poloze 9 2- chlorethyl, 2-bromethyl a 3chloropropyl skupinu. Tato publikace však nezmiňuje žádné použití uvedených sloučenin.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je použití sloučeniny obecného vzorce I,
*9 q kde io R6 je vybráno ze skupiny zahrnující -NH-furfuryl, - NH- (4-hydroxv 3 methylbut-2- tín- l -yl). -NH-(3-methylbut-2~en-l-yl), -NH-(4-hydroxy-3-methylbutyl), -NH-(4-hydroxy-lJdimethylbut-2—en-l-yl), -NH—(4--hydroxyL3 d i methyl butyl), -NH-benzyl, -NH-fenyl, přičemž benzyl, furfuryl a fenyl mohou být nesubstituované nebo substituované 1 az 3 substituenty vybranými ze skupiny zahrnující hydroxy, halogen, methyl a methoxy,
Rq je vybrán ze skupiny zahrnující C|-C3 alkyl a Ci~C3 alkenyl, přičemž každá z těchto skupin je substituována jedním nebo více atomy halogenu, pro regulaci růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk.
Halogen je vybrán ze skupiny zahrnující F, Cl, Br, I.
V případě, že sloučeniny podle předloženého vynálezu mají chirální centrum, vynález zahrnuje všechny enantiomery, směsi enantiomerů i racemáty. Vynález dále zahrnuje sloučeniny obecného vzorce I ve formě solí s alkalickými kovy, amoniakem a aminy, stejně jako jejich adičních solí s kyselinami.
S výhodou je R9 C|-C3 alkyl nebo Ci-C3 alkenyl, substituovaný na terminálním uhlíku jedním nebo dvěma atomy halogenu, a výhodně je atom halogenu vybrán ze skupiny zahrnující chlor a brom. Výhodně je R9 vybráno ze skupiny zahrnující chlormethyl, brommethyl, 2-chlorethyl, 2bromethyl, 2,2-dichlorethyl, 2,2-dibromethyl, 3-chlorpropyl, 3-brompropyl, 3,3-dichlorpropyl, 3,3-dibrompropyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl.
R« je s výhodou vybráno ze skupiny zahrnující -NH-furfuryl, -NH-(3-methylbut-2-en-l-yl).
Výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou substituované 6-substituované 9-alkylhalogenderiváty adeninu obecného vzorce I ze skupiny zahrnující: 6-(furfury lam i no)-9-( chlormethyl, 2chlorethyl, 3—chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(2-chIorbenzylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlor40 propyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3“-chlorbenzylamino)-9-(chIonnethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-fluorbenzyIamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-hydroxybenzyIamino)-9-(chlormethyl,
2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2- 3 CZ 303054 Β6 chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-methoxybenzylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyi, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6{3-methylbut-2-en-l-ylamino)-9—(chlormethyl. 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6benzylamino~9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2—chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(4-hydroxy-3-methylbut-2—en-1ylamino)~9-<chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(Z)-(4—hydroxy-3-methylbut-2en-l-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(E)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(Z)-(4-hydroxy-l,3dimethylbut-2-en-1-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(E)-(4—hydroxy-1,3-dimethylbut-2-en-l-ylamÍno)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6—(4— hydroxy-3-methylbutylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(4-hydroxy1,3-dimethylbutylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-fenylamino~9(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2~bromvinyl)purin, 6-(3-methoxyfenylamino)-9-(chlomnethyl, 2chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyt, 2-bromvinyl)purin, 6-(2-methoxybenzylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purín, 6-(2-hydroxybenzylamino)-9-(chlonnethyl, 2-chlorethyl, 3—chlorpropyl, brommethyl, 2bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(2-fluorbenzylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin.
Předmětem vynálezu je s výhodou použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adeninu obecného vzorce I při stimulaci organogeneze u rostlin vedoucí ke zvětšení kořenového systému. Na rozdíl od dosud známých cytokininů, které ve vyšších koncentracích inhibují růst a vývoj kořene, 6-substituované 9-halogenalkyl deriváty adeninu obecného vzorce I nemají ve vysokých koncentracích negativní vliv na růst kořene vůbec, nebo je tento efekt výrazně potlačen.
Předmětem vynálezu je dále s výhodou použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adeninu obecného vzorce I pro urychlení nalévání semen a zvětšení velikosti semene a plodů jednoděložných rostlin a pro zkrácení doby klíčení semen rostlin.
Předmětem vynálezu je také s výhodou použití 6—substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adenir-».i 1 i . L·» i l+ι L· 1I OA o mnrťnfTíinťiTa O L· senescence a stresu. Zvlášť výhodné jsou nové deriváty při použití v kalusových kulturách, neboť na rozdíl od dosud známých cytokininů nevykazují inhibiční účinek na růst a dělení rostlinných buněk při vysokých koncentracích a vykazují minimální toxicitu pro tyto buňky, což umožňuje v porovnání s cytokininy známými ze stavu techniky použití v širokém koncentračním rozmezí bez negativních účinků. Při příjmu 6-substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adeninu obecného vzorce I intaktní rostlinou nedochází na rozdíl od dosud známých cytokininů ke stresové odpovědi projevující se zvýšenou expresí stresových genů.
Předmětem vynálezu je s výhodou použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adeninu obecného vzorce 1 k oddálení degradace chlorofylu a stárnutí rostlinných pletiv. Tento pozitivní vliv na růst rostlin je způsoben unikátním inhibičním účinkem těchto derivátů na peroxidaci membránových lipidů. 9-halogenalkyl skupina těchto derivátů funguje jako protektivní skupina,
-4CZ 303054 Β6 která tlumí negativní vliv cytokininů na degradaci membrán, aniž by snížila jejich obecně pozitivní účinky.
Předmětem vynálezu je dále s výhodou použití 6—substituovaných 9-halogen alkyl derivátů adeninu obecného vzorce I jako antagonistů cytokin i nových receptorů, zejména pro zvýšení výnosu a kvality zemědělských produktů u jednoděložných rostlin.
Předmětem vynálezu je s výhodou použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl derivátů adeninu obecného vzorce I při produkci užitkových rostlin, výhodně jednoděložných. Jednoděložné rostliny (Liliopsida, Monocotyledonae) jsou třídou krytosemenných rostlin. Hospodářský význam jednoděložných pro člověka je naprosto zásadní. Patří sem totiž všechny pravé obilniny, z nichž nejrozšířenější je pšenice setá (Triticum aestivum), ječmen setý (Hordeum vulgare), oves setý (Avena sativa}, proso seté (Panicům sativum), rýže setá (Oryza sativa) a kukuřice setá (Zea mays), vše z čeledi li pníc ovité (Poaceae), do této čeledi také patří cukrová třtina. Další důležité hospodářské rostliny jsou palmy, např. kokosovník ořechoplodý (Cocos nucifera) nebo datlovník pravý (Phoenix dactylifera) aj., mnoho dalších známých i méně známých hospodářských rostlin je roztroušeno v jiných Čeledích, např. banánovník (Musa), ananasovník chocholatý (Ananas comosus), chřest lékařský (Asparagus officinalis}, česnek kuchyňský (Allium sativum}. cibule kuchyňská (Allium cepa), vanilka (Vanilla), zázvor (Zingiber) a mnohé další. Mnoho jednoděložných je také pěstování jako okrasné rostliny, pro ozdobné květy i listy, mnozí původem tropičtí zástupci jsou také rostlinami pokojovými.
Předmětem vynálezu je také s výhodou použití 6-substituovaných 9-halogenaIkyl derivátů adeninu obecného vzorce I při přípravě přípravků pro klonování rostlinných buněk, orgánů, zárodečných buněk a embryí.
Vynález dále zahrnuje přípravky pro klonování rostlinných buněk, orgánů, zárodečných buněk a embryí obsahující alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I a pomocné látky.
Předmětem vynálezu je konkrétněji použití 6-substituovaných 9-halogen alkyl derivátů adeninu obecného vzorce I pří přípravě růstově—regulačních přípravků k ošetřování rostlin ajejich orgánů či buněk.
Vynález rovněž zahrnuje růstově-regu lační přípravky obsahující alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I a pomocné látky.
Sloučeniny obecného vzorce I jsou používány v nemodifikované formě či ve formě soli, s výhodou společně s pomocnými látkami běžně využívanými v přípravcích, např. rozpouštědly, plnivy ČÍ nosiči, které jsou běžně užívané v zemědělství a jsou odborníkovi v oboru dobře známé. Jsou přednostně používány koncentráty aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze a disperze, ředěné emulze, rozpustné prášky, prach, granuláty, krémy, gely, olejové suspenze a rovněž enkapsulované produkty, např. polymerní substance. Ve vztahu k typu přípravku je určena i metoda aplikace, například sprejování, atomizace, poprach, rozptyl, nátěr a polévání, která je zvolena ve vztahu k předurčenému použití a převažujícím okolnostem. Přípravky mohou být sterilizovány anebo obsahují další přídavné látky neutrální povahy, například konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadia anebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, hnojivá, Či donory mikrohnojiv nebo další přípravky za účelem získání speciálních účinků.
Sloučenina obecného vzorce I může být smíchána s dalšími růstovými regulátory za účelem dosažení synergického účinku.
Předmětem předloženého vynálezu jsou dále sloučeniny obecného vzorce la,
-5 CZ 303054 B6
Re
da), kde
R6 je vybráno ze skupiny zahrnující -NH-furfuryl, -NH-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-yl), -NH-(3-methylbut-2-en-l-yl), -NH-(4-hydroxy-3-methylbutyl), -NH-(4-hydroxy-l ,3-dimethylbut-2-en-l-yl), -NH-(4-hydroxy-l .3-dimethylbutyl), -NH-benzyl, -NH-fenyl, přičemž furfuryl může být nesubstituovaný nebo substituovaný 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny zahrnující hydroxy, halogen, methyl a methoxy, a benzyl a fenyl mohou být nesubstituované nebo substituované 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny zahrnující halogen, methyl a methoxy,
Ro je vybrán ze skupiny zahrnující C1-C3 alkyl a CHJ alkenyl, přičemž každá z těchto skupin je substituována jedním nebo více atomy halogenu, za předpokladu, že: je-li R9 2-chlorethyl, Rft není -NH-furfuryl, -NH-benzyl, je-li R9 3 —chlorpropyl či 2-bromethyl, RŘ není -NH-benzyl.
Přípravky
Přípravky obsahující sloučeniny obecného vzorce I (aktivní složka) nebojejich soli a pokud je třeba, jednu nebo více pevných nebo kapalných pomocných látek, jsou připraveny známými způsoby, například smísením nebo mletím účinné látky s pomocnými látkami, jako jsou např. rozpouštědla nebo pevné nosiče. Do přípravků mohou být přidávány povrchově aktivní látky (surfaktanty).
V závislosti na povaze sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli, která má být formulována, vhodné povrchově aktivní látky jsou neiontové, kationtové a/nebo aniontové povrchově aktivní látky a jejich směsi mající dobré emulzifikační, dispergaění a zvlhčovači vlastnosti. Příklady vhodných aniontových, neiontových a kationtových smáčedel jsou shrnuty například ve WO 97/34 485.
O-,— '------- ---..1 í _ 1 _ „ . X „ _ Z I M -11 1 j-w zn Λ 1 nm» 1 TtÍa/A *-»**»
A I AJ piipiťLVU ICllllUiaiwl aiUUVVIJinj vuwnvnv VZ.VIVV ijavw |7WIV LVI1VIV rjMUlVijU T Uiiw Lř4l*k4 čedla konvečně používaná při přípravách přípravků, které jsou popsány, např. v „McCutcheons Detergents and Emulsifiers Annual“ MC Publishíng Corp., Ridgewood New Jersey, 1981, Stache, H., „Tensid- Taschenbuch“, Carl Hanser Verlag, MunichNienna, 1981 and M. and
J. Ash, „Encyclopedia of Surfactants“, Vol-111, Chemical Publishing Co., New York, 1980 až 81.
Formulace přípravku obsahuje váhově od 0,1 do 99 % (w/w), zejména pak od 0,1 do 95 % (w/w) aktivní složky odpovídající látce nebo směsi látek obecného vzorce I, přičemž obsahuje i od 5 do
99,9 % směsi přísad či farmaceutických nosičů, a to v závislosti na způsobech aplikace, a popřípadě obsahuje i váhově od 0,1 do 25 % smáěedla.
Ačkoliv jsou komerční produkty obvykle připravovány ve formě koncentrátů, konečný uživatel upotřebí naředěný přípravek. Kompozice může proto obsahovat i další přísady, jakými jsou stabi-6CZ 303054 B6 lizátory, např. rostlinné oleje nebo epoxidizované rostlinné oleje (epoxidizovaný palmový olej 0;l, řepkový nebo olivový olej), odpěňovaČe, např. silikonový olej, konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla nebo emulgátory, viskozitní činidla, pojivá, lepidla, a také hnojivá a další aktivní přísady. S výhodou jsou využívány přípravky následujícího složení: (% = hmotnostní procento).
Emulgované koncentráty:
aktivní složka: smáčedlo: kapalný nosič: Prášky:
aktivní složka: pevný nosič:
l až 90 %, s výhodou 5 až 20 % až 30 %, s výhodou 10 až 20 % 5 až 94 %, s výhodou 60 až 85 %
0,1 až 10 %, s výhodou 0,1 až 5 %
99,9 až 90 %, s výhodou 99,9 až 95 %
Suspenzní koncentráty:
aktivní složka:
voda;
smáčedlo:
Smáčivé prášky aktivní složka: smáčedlo: pevný nosič:
Granule:
aktivní složka: pevný nosič:
až 75 %, s výhodou 10 až 50 % 94 až 24 %, s výhodou 88 až 30 % 1 až 40 %, s výhodou 2 až 30 %
0,5 až 90 %, s výhodou 1 až 80 % 0,5 až 20 %, s výhodou 1 až 15 % 5 až 95 %, s výhodou 15 až 90 %
0,1 až 30 %, s výhodou 0,1 až 15 %
99,9 až 70 %, s výhodou 99,9 až 85 %
Kompozice mohou rovněž obsahovat další příměsi, jakými jsou stabilizátory, například rostlinné oleje nebo epoxidizované rostlinné oleje (epoxidizovaný kokosový olej, řepkový olej nebo sojový olej), odpěftovače, např. silikonový olej, konzervační látky, regulátory viskozity, pojivá, zahušťovadla, a také hnojivá a další aktivní látky. Pro použití sloučenin obecného vzorce I nebo jejich solí, nebo kompozic je obsahujících, se používají rozdílné metody a technologie, kterými jsou například následující:
i) Obalování osiva
a) Obalování osiva smáčivou práškovou formulací sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli, a to mícháním v nádobě až do stejnorodé distribuce na povrchu semen (suché obalování). Při takové proceduře je přibližně 1 až 500 g sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli, (4 g až 2 kg smáčivého prášku) používáno na 100 kg osiva.
b) Obalování osiva emulzifíkovaným koncentrátem sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli, v souladu s metodou a) (mokré obalování).
c) Obalování osiva cestou máčení semen po dobu 1 až 72 h v tekutině obsahující od 100 do 1000 ppm sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli, a s výhodou následného usušení semen (imerzní obalování).
Obecně jsou látky vzorce I nebojejich soli používány v množství od 1 do 1000 g, s výhodou od 5 do 250 g, na 100 kg semen, avšak v závislosti na metodice, která rovněž umožňuje přidání dalších aktivních látek nebo mikroživin; určené koncentrační limity se mohou pohybovat nahoru nebo dolů (opakované obalování).
ii) Aplikace cisternové směsi
Kapalná formulace směsi růstového regulátoru a antidotaje používána ve váhovém poměru jednoho k druhému od 10:1 do 1:100, rychlost aplikace růstového regulátoru od 0,005 do 5,0 kg na hektar. Taková cisternová aplikace směsi se provádí před anebo po setí.
iii) Aplikace do semenné brázdy
Sloučenina obecného vzorce I nebo její sůl, je zavedena do otevřené brázdy oseté semenem ve formě emulzifíkovaného koncentrátu, smáčivého prášku nebo granulí. Jakmile je semenná brázda zaklopena, je růstový regulátor aplikován cestou obvykle používanou při preemergentním procesu.
iv) Kontrolované uvolňování aktivních látek
Sloučeniny obecného vzorce 1 nebojejich soli, jsou aplikovány v roztoku k minerálním granulovaným nosičům nebo polymerizovaným granulím (močovina, formaldehyd) a jsou vysušeny. V případě, že je to žádoucí, tak se provádí obalování, které umožňuje postupné uvolňování látky v měřitelných množstvích po určitou specifickou periodu (obalované granule).
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ukazuje vliv nových sloučenin na růst cytokin i n-dependentního kalusu tabáku. A, vliv kinetinu a N9-substituovaných derivátů kinetinu; B, vliv iP na N9_substituovaných derivátů iP. Červené šipky naznačují koncentrační rozsah, ve kterém nové sloučeniny (plná čára), nebo kinetin a iP (čárkovaná čára) stimulují růst kalusu na úroveň vyšší než 50 % maximálního růstu indukovaného dosud známými rodičovskými cytokininy. Chybové úsečky naznačují směrodatnou odchylku (n=6).
Obr. 2 naznačuje porovnání účinku sloučeniny 1 a 2 ajejich dosud známého rodičovského cytokininu kinetinu. Vliv nových sloučenin na retenci obsahu chlorofylu v dekapdováných segmentech listů TriiÍcum aestivum cv. Hsreward v průběhu ssnsscence na světle. Chybové naznačují směrodatnou odchylku (n=3).
Obr. 3 ukazuje fenotyp kinetin N9-substituovanými deriváty kinetinu ošetřené semenáčky Z. mays. A a B zleva do prava: DMSO kontrola; 5 μΜ sloučeniny 1; 10 μΜ sloučeniny 1; 5 μΜ kinetin. Celé semenáčky kukuřice (A) s detaily laterálních kořenů (B).
Příklady provedení vynálezu
Výchozím materiálem pro přípravu sloučenin obecného vzorce l je 6-chlorpurin nebo 6-brompurin. Halogenované uhlovodíky byly získány ze Sigmy Aldrich. Výchozí substituované benzylaminy, které nebyly komerčně dostupné (ostatní získány od Sigma Aldrich nebo Olchemim), byly připraveny z odpovídajících aldehydů v přítomnosti katalyzátoru. Ty, které mají více methy-8CZ 303054 B6 lových skupin, mohou být s výhodou připraveny z příslušných methylbenzaldehydů. Hydroxyderiváty se připravují demethylací odpovídajících methoxy der i vátu 48% HBr v N2 atmosféře.
Elementární analýzy (C, H a N) byly měřeny na EA1108 CHN analyzátoru (Thermo). Na zjišťování teploty tání byl použit přístroj BUCHI Melting Point B-540. Analytická tenkovrstvá chromatografíe (TLC) byla prováděna na destičkách silikagelu 60 WF?54 (Merck), v mobilní fázi CHCI3:MeOH:konc. NH4OH (8:2:0,2, v/v/v). ES+ hmotová spektra byla naměřena za použití přímého nástřiku na Waters ZMD 2000 hmotovém spektrometru. Hmotnostní interval při měření byl 10 až 1500 u. Spektra byla měřena za použití cyklických skenů o délce 3,0 sekundy, při napětí na vstupní štěrbině 25 V a teplotě vypařovacího bloku 150°C, desolvatační teplotě 80 °C a průtoku desolvatační ho plynu 200 1/hodínu. Získaná data byla zpracována pomocí programu MassLynx data systém. NMR spektra byla měřena na přístroji Bruker Avance A V 300 při teplotě 27 °C a frekvenci 300,3 MHz ( H) respektive 75,48 MHz (' C). Vzorky byly připraveny rozpuštěním daných látek v DMSO-d,;. Tetramethylsilan (TMS) byl použit jako interní standard.
Příklad 1
Příprava 6-furfurylamino-9-(2-chlorethyl)purinu (1)
Kinetin (2 g, 9,3 mmol), l-brom-2-chlorethan (1,3 g, 9,1 mmol) a uhličitan draselný (2,5 g, 24 mmol) byly míchány ve 100 ml dimethylsulfoxidu (DMSO) po 18 hodin. Směs byla nalita na 200 ml ledové tříště, extrahována do ethylacetátu a sušena nad Na2SO4. Ethylacetátová frakce byla odpařena na odparce do úplného oddestilování rozpouštědla. Surový produkt v podobě bílé prásko vité látky byl krystalizován z methanolu. Výtěžek 80 %, *H NMR (DMSO-ύή;): 4,07 (2H, t. J = 5,82), 4,52 (2H, t, J - 5,82), 4,70 (2H, s(br)). 6,23 (1H, d, J ’ 2,67), 6,35 (1H, m), 7,53 (1H, d, J = 2,67), 8,22 (2H, m), 8,25 (IH, s)
Příklad 2
Příprava 6—furfurylamino--9 {2 bromethyl)purinii (2)
Kinetin (2 g, 9,3 mmol) a uhličitan draselný (2,4 g, 23 mmol) byly míchány ve 100 ml dimethylformamidu (DMF). K reakční směsi byl přidán 1,2-dibromethan (5,2 g, 27,6 mmol) a reakční směs byla míchána při pokojové teplotě po 12 h, vstupu vlhkosti bránila sušicí trubička naplněná CaCl2. Rozpouštědlo bylo odpařeno na žlutě zbarvený odparek a bylo přidáno 100 g ledu. Směs byla míchána 1 hodinu, dokud se nevyloučila bílá sraženina a nerozpustil led. Pevná látka byla odfiltrována, promyta studenou vodou a sušena při 50 °C. Produkt byl pře krystalován z methanolu. Výtěžek 60 %, *H NMR (DMSO-^): 3,95 (2H, t, J = 5,91), 4,58 (2H, t, J = 5,91), 4,69 (2H s(br)), 6,23 (IH, d, J = 2,94), 6,36 (IH, t, J = 2,94), 7,54 (IH, d, J - 2,94), 8,15 -(2H, m), 8,24 (IH, s).
Příklad 3
Příprava 6-[(3-methylbut-2-en-l~yl)amino]-9-(2-bromethyl)purmu (3)
Směs 6--[(3 rnethylbut-2- en -l -yl)amino]purinu (2 g, 9,8 mmol), 1,2-dibromethanu (12,94 g, 6 ml, 69 mmol) a uhličitanu draselného (2,5 g, 24 mmol) byla míchána v 50 ml DMSO po 12 h. Reakční směs pak byla nalita na ledovou tříšť a po rozpuštění ledu bylo přidáno 30 ml ethylacetátu. Ethylacetátová vrstva byla přečištěna aktivním uhlím a SiO2 a pak bylo odpařeno rozpouštědlo. Surový produkt byl krystalizován z methanolu, byla získána žlutá látka. Výtěžek: 70 %. lH NMR (DMSO-4í): L75 (3H, s), 1,59 (3H, s), 4,12 (2H, t, J = 5,76), 4,10 (2H, s(br)),
4,6 (2H, t, J = 5,76), 5,3 (IH, t, J = 6,57), 8,1 (IH, s(br)), 8,3 (IH, s).
Příklad 4
Příprava 6-[(3-methylbut-2-en-l-yl)amino]-9-(2-chlormethyl)purinu (4)
Směs 6~[(3-Methylbut-2-en-l-yl)amino]purÍn (2 g, 9,8 mmol), 1-brom-2-chlorethan (1,4 g, 9,8 mmol) a K2CO3 (3 g, 29 mmol) byly míchány v 50 ml DMSO 12 h. Reakční směs byla nalita na led (200 ml) a extrahována do ethylacetátu (50 1). Rekry stal izaci z hexanu byly získány bílé krystaly. Výtěžek: 60 %. lH NMR (DMSO-x/J: 1,66 (3H, s), 1,70 (3H, s), 4,06 (2H, t, J = 5,76),
4,10 (2H, s(br), H12), 4,50 (2H, t, J = 5,76), 5,31 (IH, t, J = 6,57), 7,767 (IH, s(br)), 8,15 (IH, s),
8,20 (IH, s).
Příklad 5
Příprava 6-benzylamino-9-(2-bromethyl)purinu (20)
Benzylaminopurin (1 g, 4,43 mmol), K2CO3 (2,45 g, 17,8 mmol) a 1,2-dibromethan (1,15 ml, 13,3 mmol) bylo mícháno 16 hodin za teploty místnosti pod CaCb zátkou v DMF (30 ml).
Odparek, po zakoncentrování na rotační vakuové odparce, byl rozředěn vodou (30 m l) a extrahován do ethylacetátu (EtOAc) (3x 15 ml). Organické frakce byly spojeny, promyty vodou (2x 10 ml), vysušeny Na^SO^ přečištěny karbofiltrací a zakoncentrovány na RVO. Surový produkt byl purifikován pomocí Flash chromatografie - chloroform:methanol (9:1) byl použit jako eluent. Výtěžek 82 %.
- 10CZ 303054 B6
Tabulka 1: Látky připravené způsobem podle příkladů 1 až 5
R6 R9 Elementární analýza vypočteno/nalezeno
%C %H %N ES MS [M+H]+
5 furfurylamino chlormethyl 50,1/49,9 3,8/3,8 26,6/26,7 264
6 furfurylamino brommethyl 42,9/43,0 3,3/3,4 22,7/22,5 309
1 furfurylamino 2-chlorethyl 51,9/52,0 4,4/4,5 25,2/25,2 278
2 furfurylamino 2-bromethyl 44,7/44,8 3,8/3,9 21,7/21,9 323
7 furfurylamino 3-chlorpropyl 53,5/53,6 4,8/4,7 24,0/23,7 292
8 furfurylamino 3-brompropyl 46,4/46,1 4,2/4,2 20,8/21,1 “Ί 337
9 furfurylamino 2-chlorvinyl 52,3/52,1 3,7/3,6 25,4/25,2 276
10 furfurylamino 2-brom vinyl 45,0/45,1 3,2/3,2 21,9/21,6 321
11 furfurylamino 2,2- dichlorethyl 46,2/46,5 3,6/3,4 22,4/22,7 313
12 (3-methy lbut-2-en-1 - yl)amino chlormethyl 52,5/52,4 5,6/5,5 27,8/27,5 252
13 (3-methylbut-2-en-l- yl)amino brommethyl 44,6/44,9 4,8/4,6 23,7/24,0 297
3 (3 -methy lbut-2-en-1 - yl)amino 2-bromethyl 46,5/46,3 5,2/5,2 22,6/22,1 310
4 (3-methy lbut-2-en-1 - yl)amino 2-chlorethyl 54,2/54,6 6,1/6,2 26,4/26,2 266
14 (3 -methy Íbut-2-en-1 - yl)amino 3-brompropyl 48,2/48,2 5,6/5,6 21,6/21,3 325
15 (3-methylbut-2-en-l - yl)amino 3-chlorpropyl 55,8/56,0 6,5/6,1 25,0/24,6 280
16 (3-methylbut-2-en- i - yl)amino 2-chlorvinyl 54,7/54,3 5,4/5,3 26,6/26,3 264
17 (3 -methy lbut-2 -en-1 - yl)amino 2-brom vinyl 46,8/46,7 4,6/4,3 22,7/22,4 309
18 (3 -methy lbut-2-en-1 - yl)amino 2,2- dichlorethyl 48,0/48,4 5,0/5,2 23,3/23,0 301
19 benzylamino chlormethyl 57,0/58,3 4,4/4,5 25,6/25,7 274
20 benzy lamino 2-chlorethyl 58,4/58,7 4,9/5,0 24,3/24,2 288
- 11 CZ 303054 B6
21 benzylamino 3-chlorpropyl 59,7/60,1 5,3/5,5 23,2/23,5 302 Z]
22 benzylamino brommethyl 49,1/49,1 3,8/3,9 22,0/21,8 319
23 benzylamino 2-bromethyl 50,6/50,5 4,3/4,2 21,1/21,4 333
24 benzylamino 3-brompropyl 52,0/52,3 4,7/4,9 20,2/20,5 347
25 benzylamino 2-chlorvinyl 58,9/59,8 4,2/4,1 24,5/24,2 286
26 benzylamino 2-bromvinyl 50,9/50,7 3,7/3,6 21,2/21,5 331
27 benzylamino 2,2- dichlorethyl 52,2/52,5 4,1/4,3 21,7/21,4 323
28 fenylamino chlormethyl 55,5/55,1 3,9/3,7 27,0/27,3 260
29 fenylamino 2-chlorethyl 57,0/57,1 4,4/4,5 25,6/25,4 274
30 fenylamino 3-chlorpropyl 58,4/58,4 4,9/4,9 24,3/24,2 288
31 fenylamino brommethyl 47,4/47,8 3,3/3,5 23,0/23,2 305
32 fenylamino 2-bromethyl 49,1/49,2 3,8/3,9 22,0/22,3 319
33 fenylamino 3-brompropyl 50,6/50,4 4,3/4,5 21,1/21,4 333
34 fenylamino 2-bromvinyl 49,4/49,1 3,2/3,0 22,2/21,8 317
35 fenylamino 2-chlorvinyl 57,5/57,9 3,7/3,9 25,8/26,0 272
36 fenylamino 2,2- dichlorethyl 50,7/50,5 3,6/3,7 22,7/22,8 309
37 3 -methoxy benzylamino chlormethyl 55,4/55,2 4,7/4,7 23,1/23,4 304
38 3-methoxybenzylamino 2-chlorethyl 56,7/56,4 5,1/5,2 22,0/22,1 318
39 3-methoxybenzylamino 3-chlorpropyl 57,9/58,0 5,5/5,2 21,1/21,5 332
40 3 -methoxy benzylami no brommethyl 48,3/48,3 4,1/4,2 20,1/20,0 349
41 3 -methoxy benzylamino 2-bromethyl 49,7/49,6 4,5/4,4 19,3/19,1 363
42 3-methoxybenzylamino 3-brompropyl 51,1/51,3 4,8/4,9 18,6/19,0 377
43 3 -methoxybenzy lamino 2-chlorvinyl 57,1/57,3 4,5/4,5 22,2/22,6 316
44 3 -methoxy benzylamino 2-bromvinyl 50,0/49,7 3,9/3,6 19,4/19,1 361
45 3-methoxybenzylamino 2,2- dichlorethyl 51,2/51,5 4,3/4,3 19,9/20,1 353
46 3-hydroxy benzylamino chiormetnyi 53,9/34,2 4 rf Z 2no
47 3-hydroxy benzylamino 2-chlorethyl 55,4/55,3 4,7/4,8 23,1/23*2 304
48 3-hydroxy benzylamino 3-chlorpropyl 56,7/56,4 5,1/5,0 22,0/21,8 318
49 3 -hydroxybenzylamino brommethyl 46,7/46,8 3,6/3,6 21,0/21,3 335
- 12 CZ 303054 B6
50 3-hydroxybenzylamino 2-bromethyl 48,3/48,0 4,1/4,4 20,1/20,5 349
51 3-hydroxybenzylamino 3-brompropyl 49,7/49,5 4,5/4,4 19,3/19,1 363
52 3 -hydroxybenzylamino 2-chlorvinyl 55,7/55,8 4,0/4,1 23,2/23,5 302
53 3 -hydroxybenzylamino 2-bromvinyl 48,6/48,4 3,5/3,7 20,2/21,9 347
54 3 -hydroxybenzylamino 2,2- dichlorethyl 49,7/49,8 3,9/4,0 20,7/20,8 339
55 2-methoxybenzylamino chlormethyl 55,4/55,1 4,7/4,4 23,1/22,8 304
56 2- methoxy benzy lamino 2-chlorethyl 56,7/56,8 5,1/5,2 22,0/22,1 318
57 2- methoxy benzy 1 amino 3-chlorpropyl 57,9/57,8 5,5/5,5 21,1/21,0 332
58 2-methoxybenzylamino brommethyl 48,3/48,2 4,1/4,0 20,1/20,3 349
59 2-methoxybenzylamino 2-bromethyl 49,7/50,0 4,5/4,7 19,3/19,4 363
60 2-methoxybenzylamino 3-brompropyl 51,1/51,4 4,8/4,9 18,6/18,4 377
61 2-methoxybenzylamino 2-bromvinyl 50,0/49,9 3,9/3,9 19,4/19,4 361
62 2-methoxybenzylamino 2-chlorvinyl 57,1/57,4 4,5/4,6 22,2/22,6 316
63 2 -methoxy benzylamino 2,2- dichlorethyl 51,2/51,0 4,3/4,5 19,9/20,3 353
64 2-hydroxybenzylamino chlormethyl 53,9/53,7 4,2/4,1 24,2/24,1 290
65 2-hy droxy benzy lamino 2-chlorethyl 55,4/55,3 4,7/4,8 23,1/23,2 304
66 2-hydroxybenzylamino 3-chlorpropyl 56,7/56,8 5,1/5,1 22,0/21,9 318
67 2-hydroxy benzy 1 amino brommethyl 46,7/46,8 3,6/3,7 21,0/21,3 335
68 2-hydroxybenzylamino 2-bromethyl 48,3/48,1 4,1/4,3 20,1/20,4 349
69 2-hydroxybenzylamino 3-brompropyl 49,7/49,3 4,5/4,2 19,3/19,5 363
70 2-hydroxybenzylamino 2-chlorvinyl 55,7/56,0 4,0/4,1 23,2/23,7 302
71 2-hydroxybenzylamino 2-bromvinyl 48,6/48,9 3,5/3,7 20,2/20,1 347
72 2-hydroxybenzylamino 2,2- dichlorethyl 49,7/49,6 3,9/3,9 20,7/20,9 339
73 2-fluorbenzylamino chlormethyl 53,5/53,4 3,8/3,8 24,0/23,7 292
74 2-fluorbenzy lamino 2-chlorethyl 55,0/55,1 4,3/4,3 22,9/23,1 306
75 2-fluorbenzylamino 3-chlorpropyl 56,3/56,7 4,7/4,9 21,9/21.9 320
76 2-fluorbenzylamino brommethyl 46,5/46,1 3,3/3,0 20,8/20,6 337
77 2-fluorbenzylamino 2-bromethyl 48,0/48,2 3,7/3,8 20,0/20,4 351
78 2-fluorbenzylamino 3-brompropyl 49,5/49,6 4,2/4,2 19,2/19,6 365
-13CZ 303054 B6
79 2-fluorbenzylamino 2-bromvinyl 48,3/48,3 3,2/3,1 20,1/19,8 349
80 2-fluorbenzy 1 am ino 2-chlorvinyl 55,4/55,6 3,7/3,8 23,1/23,4 304
81 2-fluorbenzylamino 2,2- dichlorethyl 49,4/49,1 3,6/3,4 20,6/20,2 341
82 3 -fluorbenzy lamino chlormethyl 53,5/53,7 3,8/4,0 24,0/24,3 292
83 3 -fluorbenzy lamino 2-chlorethyl 55,0/55,2 4,3/4,3 22,9/23,1 306
84 3 -fluorbenzy lamino 3-chlorpropyl 56,3/56,5 4,7/4,7 21,9/22,2 320
85 3-fluorbenzylamino bronunethyl 46,5/46,1 3,3/2,9 20,8/20,5 337
86 3-fluorbenzylamino 2-bromethyl 48,0/48,0 3,7/3,7 20,0/20,2 351
87 3 -fluorbenzylammo 3-brompropyl 49,5/49,4 4,2/4,2 19,2/19,5 365
88 3 -fluorbenzy lamino 2-chlorvinyl 55,4/55,5 3,7/3,7 23,1/23,4 304
89 3-fluorbenzylamino 2-bromvinyl 48,3/48,2 3,2/3,0 20,1/19,8 349
90 3 -fluorbenzy lamino 2,2- dichlorethyl 49,4/49,9 3,6/3,6 20,6/20,8 341
91 2-chlorbenzylamino chlormethyl 50,7/50,8 3,6/3,9 22,7/23,1 309
92 2-chlorbenzylamino 2-chlorethyl 52,2/51,9 4,1/3,8 21,7/21,5 323
93 2-chlorbenzylamino 3-chlorpropyl 53,6/53,2 4,5/4,4 20,8/20,5 337
94 2-chlorbenzylamino brommethyl 44,3/44,1 3,1/3,0 19,9/19,7 353
95 2-chlorbenzy lamino 2-bromethyl 45,9/46,2 3,6/3,7 19,1/19,3 367
96 2-chlorbenzyIamino 3-brompropyl 47,3/47,5 4,0/4,2 18,4/18,7 381
97 2-chlorbenzy lamino 2-chlorvinyl 52,5/52,2 3,5/3,3 21,9/21,6 321
98 2-chlorbenzylamino 2-bromvinyl 46,1/46,3 3,0/3,1 19,2/19,4 365
99 2-chlorbenzylamino 2,2- dichlorethyl 47,2/47,3 3,4/3,4 19,6/19,9 357
100 3-chlorbenzy lamino chlormethyl 50,7/50,5 3,6/3,3 22,7/22,4 309
101 3 -chlorbenzy lamino 2-chlorethyl 52,2/52,2 4,1/4,0 21,7/22,0 322
102 3 -chlorbenzy lamino 3-chlorpropyl 53,6/53,7 4,5/4,5 20,8/21,0 337
103 3 -chlorbenzy lami no brommethyl 44,3/44,3 3,1/3,0 19,9/197 353
104 3 -chlorbenzy lamino 2-bromethyl 45,9/45,9 3,6/3,6 19,1/19,0 367
105 3-chlorbenzy lamino 3-brompropyl 47,3/47,1 4,0/3,8 18,4/18,1 381
106 3-chlorbenzy lamino 2-chlorvinyl 52,5/53,7 3,5/3,8 21,9/22,2 321
107 3-chlorbenzy lamino 2-bromvinyl 46,1/46,3 3,0/3,0 19,2/19,6 365
- 14CZ 303054 B6
108 3 -chlorbenzy lamino 2,2- dichlorethyl 47,2/47,3 3,4/3,4 19,6/19,8 357
109 (Z)-(4-hydroxy-3- methy lbut-2-en-1 -yl)amino brommethyl 42,3/42,3 4,5/4,2 22,4/22,1 313
110 (Z>(4-hydroxy-3- methy lbut-2-en-1 -y l)amino 2-bromethyl 44,2/44,2 4,9/5,1 21,5/21,5 327
lil (Z)-(4-hydroxy-3- methylbut-2-en-1 -yl)amino 3-brompropyl 45,9/45,7 5,3/5,1 20,6/20,3 341
112 (Z)-(4-hydroxy-3- methylbut-2-en-1 -y l)amino chlormethyl 49,4/49,7 5,3/5,5 26,2/25,4 268
113 (Z)-(4-hydroxy-3- methylbut-2-en-l -yl)amino 2-chlorethyl 51,2/51,2 5,7/5,7 24,9/25,1 282
114 (Z)-(4-hydroxy-3- methylbut-2-en-1 -yl)amino 3-chlorpropyl 52,8/52,8 6,1/6,3 23,7/24,0 296
115 (Z)-(4-hydroxy-3- methylbut-2-en-1 -yl)amino 2-chlorvinyl 51,5/51,8 5,0/5,3 25,0/25,4 280
116 (Z)-(4-hydroxy-3- methylbut-2-en-1 -yl)amino 2-bromvinyl 44,5/44,7 4,4/4,5 21,6/21,9 325
117 (Z)-(4-hydroxy-3- methylbut-2-en-1 -yl)amino 2,2- dichlorethyl 45,6/45,4 4,8/4,8 22,2/21,9 317
118 (E)-(4-hydroxy-3- methyibut-2-en-1 -y l)amino brommethyl 42,3/42,1 4,5/4,3 22,4/22.1 313
119 (E)-(4-hydroxy-3- methylbut-2-en-l-yl)amino 2-bromethyl 44,2/44,2 4,9/5,1 21,5/21,5 327
120 (E)-(4-hydroxy-3- methylbut-2-en-1 -yl)amino 3-brompropyl 45,9/45,8 5,3/5,1 20,6/20,4 341
121 (E)-(4-hy droxy-3 - methylbut-2-en-l -yl)amino chlormethyl 49,4/49,5 5,3/5,4 26,2/26,4 268
122 (E)-(4-hydroxy-3- methylbut-2-en-1 -yl)amino 2-chlorethyl 51,2/51,4 5,7/5,9 24,9/25,1 282
123 (E)-(4-hydroxy-3- methylbut-2-en-1 -yl)amino 3-chlorpropyl 52,8/52,4 6,1/6,0 23,7/23,4 296
- 15CZ 303054 B6
124 (E)-(4-hydroxy-3 - methylbut-2-en- 1-y l)amino 2-chlorvinyl 51,5/51,4 5,0/5,0 25,0/24,6 280
125 (E)-(4-hydroxy-3 - methy lbut-2-en-1 -y l)amino 2-bromvinyl 44,5/44,7 4,4/4,5 21,6/21,8 325
126 (E)-(4-hydroxy-3- methy lbut-2-en-1 -yl)amino 2,2- dichlorethyl 45,6/45,7 4,8/5,0 22,2/22,6 317
127 6-(Z)-(4-hydroxy-1,3- dimethylbut-2-en-l - ylamino) chlormethyl 51,2/51,5 5,7/5,6 24,9/24,7 282
128 6-(Z)-(4-hydroxy-l,3- dimethylbut-2-en-1 - ylamino) 2-chlorethyl 52,8/52,9 6,1/6,1 23,7/23,9 296
128 6-(Z)-(4-hydroxy-l,3- dimethylbut-2-en-1 - ylamino) 3-chlorpropyl 54,3/54,0 6,5/6,2 22,6/22,3 310
129 6-(Z)-(4-hydroxy-l,3- dimethylbut-2-en-l - ylamino) brommethyl 44,2/44,5 4,9/4,7 21,5/21,3 327
130 6-(Z)-(4-hydroxy-1,3- dimethylbut-2-en-1 - ylamino) 2-bromethyl 45,9/45,7 5,3/5,1 20,6/20,4 341
131 6-(Z)-(4-hydroxy-l,3- dimethy lbut-2-en-1 - ylamino) 3-brompropyl 47,5/47,4 5,7/5,7 19,8/19,6 355
132 6-(Z)-(4-hydroxy-l,3- dimethy lbut-2-en-1 - ylamino) 2-chlorvinyl 53,2/53,5 5,5/5,4 23,8/24,0 294
133 6-(Z>(4-hydroxy-1 ,3- dimethylbut-2-en-1 - ylamino) 2-bromvinyl 46,2/46,1 4,8/5,0 20,7/21,0 339
134 6-(Z)-(4-hydroxy-1,3- dimethylbut-2-en-l -ylamino 2,2- dichlorethyl 47,3/47,1 5,2/5,3 21,2/21,0 331
- 16CZ 303054 B6
ylamino)
135 6-(E)-(4-hydroxy-1,3- dimethylbut-2-en-1 - ylamino) chlormethyl 51,2/51,4 5,7/5,9 24,9/24,6 282
136 6-(E)-(4-hydroxy-1,3- dimethy Ibut-2-en-1 - ylamino) 2-chlorethyl 52,8/52,5 6,1/5,9 23,7/23,4 296
137 6-(E)-(4-hydroxy-1,3dimethylbut-2-en-l - ylamino) 3-chlorpropyl 54,3/54,5 6,5/6,7 22,6/22,8 310
138 6-(E)-(4-hydroxy-1,3 - methyíbut-2-en-1 -ylamino) brommethyl 44,2/44,1 4,9/4,8 21,5/21,3 327
139 6-(E)-(4-hydroxy-1,3- dimethy lbut-2-en-1 - ylamino) 2-bromethyl 45,9/46,2 5,3/5,5 20,6/20,9 341
140 6-(E)-(4-hydroxy-1,3- dimethylbut-2-en-1 - ylamino) 3-brompropyl 47,5/47,3 5,7/5,3 19,8/19,4 355
141 6-(E)-(4-hy droxy-1,3 - dimethy lbut-2-en-1 - ylamino) 2-chlorvinyl 53,2/53,6 5,5/5,8 23,8/24,0 294
142 6-(E)-(4-hy droxy-1,3- dimethylbut-2-en-1 - ylamino) 2-brom vinyl 46,2/46,1 4,8/4,6 20,7/20,5 339
143 6-(E)-(4-hydroxy-1,3- dimethylbut-2-en-1 - ylamino) 2,2- dichlorethyl 47,3/47,6 5,2/5,4 21,2/21,5 331
144 3-methoxyfenylamino chlormethyl 53,9/53,8 4,2/4,2 24,2/24,1 290
145 3-methoxyfenylamino 2-chlorethyl 55,4/55,5 4,7/4,6 23,1/23,2 304
146 3 -methoxyfenylamino brommethyl 46,7/46,9 3,6/3,9 21,0/21,4 335
147 3 -methoxyfenylamino 2-bromethyl 48,3/48,7 4,1/4,3 20,1/20,2 349
148 3 -methoxyfenylamino 3-brompropyl 49,7/49,6 4,5/4,5 19,3/19,1 363
- 17CZ 303054 B6
149 3 -methoxy feny lamino 3-chlorpropyI 56,7/56,4 5,1/5,2 22,0/22,1 318
150 3 -methoxyfeny lamino 2-chlorvinyl 55,7/55,8 4,0/4,2 23,2/23,5 302
151 3 -methoxyfeny lamino 2-bromvinyl 48,6/48,9 3,5/3,8 20,2/20,5 347
152 3-methoxyfeny lamino 2,2- dichlorethyl 49,7/49,9 3,9/3,8 20,7/20,4 339
153 4-hydroxy-3- methylbuty lamino chlormethyl 49,0/48,2 6,0/5,8 26,0/26,3 270
154 4-hydroxy-3- methylbutylamino 2-chlorethyl 50,8/50,5 6,4/6,1 24,7/24,3 284
155 4-hydroxy-3- methylbuty lamino 3-chlorpropyl 52,8/52,7 6,1/6,0 23,7/23,6 296
156 4-hydroxy-3- methylbuty lamino brommethyl 42,1/42,3 5,1/5,4 22,3/22,5 315
157 4-hydroxy-3- methylbuty lamino 2-bromethyl 43,9/44,0 5,5/5,6 21,3/21,4 329
158 4-hydroxy-3- methylbuty lamino 3-brompropyl 45,6/45,8 5,9/6,0 20,5/20,2 343
159 4-hydroxy-3- methylbuty lamino 2-chlorvinyl 51,2/51,1 5,7/5,9 24,9/25,2 282
160 4-hydroxy-3- methylbuty lam ino 2-bromvinyl 44,2/44,4 4,9/5,1 21,5/21,8 327
161 4-hydroxy-3- methylbuty lamino 2,2- dichlorethyl 45,3/45,1 5,4/5,3 22,0/21,7 319
162 4-hydroxy-l,3- dimethylbutylamino chlormethyl 50,8/50,7 6,4/6,3 24,7/24,5 284
163 4-hydroxy-l,3- dimethylbutylamino 2-chlorethyl 52,4/52,3 6,8/6,7 23,5/23,1 298
164 4-hydroxy-l,3- j;„ j - 3-chlorpropyl 53,9/54,2 7,1/7,4 22,5/22,7 312
165 4-hydroxy-l,3- dimethylbutylamino brommethyl 43,9/43,7 5,5/5,3 21,3/21,1 329
- 18CZ 303054 B6
166 4-hydroxy-1,3- dimethylbutylamino 2-bromethyl 45,6/45,8 5,9/6,1 20,5/20,7 343
167 4-hydroxy-l,3- dimethy Ibuty lamino 3-brompropyl 47,2/47,0 6,2/6,2 19,7/19,4 357
168 4-hydroxy-1,3- dimethylbutylamino 2-chlorvinyl 52,8/52,7 6,1/6,1 23,7/23,9 296
169 4-hydroxy-l,3- dimethyibutylamino 2-bromvinyl 45,9/45,7 5,3/5,2 20,6/20,4 341
170 4-hydroxy-1,3- dimethylbutylamino 2,2- dichlorethyl 47,0/46,9 5,8/5,7 21,1/21,4 333
Příklad 6
Testování vlivu nových látek na buněčné dělení rostlinných buněk
Stimulační vliv nově připravených derivátů byl testován v kalusovém biotestu za použití cytokinin-dependentního kalusu tabáku. Tento cytokinin-dependentní tabákový kalus Nicotiana io tabacum L. cv, Wisconsins 38 byl udržován při 25 °C na modifikovaném médiu MurashigeSkoog (MS) obsahujícím na 1 litr; 4 μιηοΐ kys. nikotinové, 2,4 μπιοί pyridoxin hydrochloridu,
1,2 μιηοΐ thiaminu, 26,6 μπιοί glycinu, 1,37 μιηοΐ glutaminu, 1,8 μπιοί myoinositolu, 30 g sacharosy, 8 g agaru, 5,37 μηιοί α-naftyloctové kyseliny a 0,5 μπιοί 6-benzylaminopurinu. Subkuitivace probíhala každé 3 týdny. Čtrnáct dní před započetím biotestu byl kalus přenesen na médium bez 6-benzylaminopurinu. Stimulační růstová aktivita byla stanovena na základě nárůstu čerstvé hmoty kalusu po 4 týdnech kultivace. Šest replikátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a druhý test byl opakován minimálně 2-krát. V každém experimentu byly testovány nové sloučeniny, které byly porovnány s aktivitou jejich N9-nesubstituovaných rodičovských cytokininů Kin a iP, které je známý jako velmi aktivní cytokininy. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na 10~3M. Tento zásadní roztok byí dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10”8 až 10“* M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2 % a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu.
Ze získaných dat byla opět vypočítána maximální účinná koncentrace testované látky. Byla vypočtena relativní účinnost látky při této koncentraci (tabulka 2). Aktivita získaná při 10 6 M N9-substituováných rodičovských cytokininů Kin a 10“5M iP byla postulována jako 100 % biologické aktivity.
Látka účinkující jako cytokinin by měla mít stimulační vliv na buněčné dělení rostlinných buněk. Výsledky v tabulce 2 naznačují, že nově připravené substituované deriváty obecného vzorce I vykazovaly silnou cytokininovou aktivitu v kalusovém biotestu ve srovnání s dosud známým cytokininy Kin a iP.
- 19CZ 303054 B6
Tabulka 2: Vliv nových sloučenin na růst cytokinin-dependentního tabákového kalusu Nicotiana tabacum L. cv. Wisconsins 38
č. Testovaná sloučenina nej účinnější koncentrace (mol.r1) aktivita (%) [10-6 mol.!1 Kin = 100%] aktivita (%) [10s mol.r1 iP = 100%]
6-furfurylamínopurm (Kin) io-6 100
1 6- furfury lamino-9-(2-ch 1 orethy l)purin IO3 120 (±6)
2 6-furfurylamino-9-(2-bromethy l)purin IO’5 110 (±3)
6-(3-methylbut-2-en-l -yl)aminopurin (iP) 10'3 100
3 6-((3-methylbut-2-en-l-yl)amino)-9-(2“ bromethyl)purin 10’3 103(+4)
4 6-((3 -methy lbut-2-en-1 -y l)amino)-9-(2chlorethyl)purin 105 112 (±7)
Příklad 7 io Stimulace buněčné proliferace při vysokých koncentracích
Cytokininy jsou známé jako látky se stimulační aktivitou na buněčnou proliferaci při optimální koncentraci, avšak typicky při koncentracích převyšujících 10 μΜ se jejich účinky na buněčné dělení mění v inhibiční (Holub et al, 1998, Plant Growth Regul, 26, 109 až 115, 1998). Z těchto důvodů byl testován i účinek vysokých koncentrací nově připravených derivátů s pomocí cytokinin-dependentního kalusu tabáku tak, jak je popsáno v příkladu 6. Nové sloučeniny 1, 2 a 4 byly testovány ve vysokých koncentracích (1 až 100 μΜ) ajejich aktivity byly porovnány s aktivitami s příslušnými N9-nesubstituovanými rodičovskými cytokininy. Jak je ukázáno na obr.l. N9-alkyl substituce mají preventivní účinky vůči typické inhibiční cytokininové aktivitě na buněčnou proliferaci ve vysokých koncentracích převyšujících 10 μΜ a dokonce i v nej vyšší aplikované koncentraci (100 μΜ) vykazují sloučeniny 1, 2 a 4 dále silný stimulační efekt, zatímco jejich N9-nesubstituované rodičovské cytokininy (Kin, iP) inhibovaly silně růst kalusu (Obr. 1).
Nové sloučeniny obecného vzorce I jsou proto schopné stimulovat buněčnou proliferaci v mnohem širším koncentračním rozpětí než dosud známé cytokininy a na rozdíl proti nim nemaj í negativní (inhibiční) efekt když jsou aplikovány ve vysokých koncentracích. Z těchto důvodů jsou oproti látkám známým ze stavu techniky mnohem vhodnější pro praktické použití v metlínnvch biotechnologiích.
Příklad 8
Antisenescenční aktivity nových látek při testování v senescenčním biotestu na segmentech listů pšenice
Semena ozimé pšenice Triticum aestivum cv. Hereward byla promyta pod tekoucí vodou po 24 h a poté vyseta do vermikulítu nasyceného Knopovým živným roztokem. Nádoby se semeny byly umístěny do klimatizované růstové komory s 16/8 hodinovou světelnou periodou (světelná inten40 žita 50 mmol.mXs'1) a teplotou 15 °C. Po 7 dnech měly semenáčky vyvinutý první praporcový list a druhý list začínal prorůstat. Z prvních listů vždy od 5 rostlin byly odebrány vrcholové sekce
-20CZ 303054 B6 dlouhé přibližně 35 mm, které byly zkráceny tak, aby jejich váha byla přesně 100 mg. Bazální konce těchto 5 listových segmentů byly umístěny do jamek mikrotitracních polystyrénových destiček obsahujících 150 ml roztoku testovaného derivátu. Destičky byly umístěny do plastového boxu vystlaného fdtračním papírem, který byl nasycen vodou za účelem maximální vzdušné vlhkosti. Po 96 hodinách inkubace ve tmě při 25 °C byly listové sekce vyjmuty a chlorofyl extrahován v 5 ml 80% ethanolu zahřátím při 80 °C po dobu 10 min. Objem vzorku byl poté doplněn na 5 ml přidáním 80% ethanolu. Absorbance extraktů byla měřena při 665 nm. Jako kontroly byly měřeny rovněž chlorofylové extrakty z listů a listových vrcholů inkubované v deionizované vodě. Vypočtené hodnoty jsou průměrem z 5 opakování a celý experiment byt zopakován minimálně 2-krát. V každém experimentu byla otestována aktivita nových sloučenin a porovnána s aktivitou N9-nesubstituovaného rodičovského cytokininu, který je znám velmi vysokou cytokin i novou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v d imethy 1 sulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na 10-3 M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10'8 až 10 4 M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2 % a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. 10 4 M koncentrace kontrolní látky Kin byla postulována jako 100 % biologické aktivity.
Látky účinkující jako cytokininy by měly mít pozitivní vliv na oddálení senescence v segmentech listů pšenice ve tmě. Nově připravené substituované cytokininy obecného vzorce I vykazovaly silnější cytokininové aktivity ve srovnání s dosud známým cytokininem kinetinem (Kin).
Tabulka 3
Vliv nových sloučenin na oddálení senescence v de kap ito váných segmentech listů Triticum aestivum cv. Hereward ve tmě.
č. Testovaná sloučenina nej účinnější koncentrace (mol.l'1) aktivita (%) [lO^molT1 Kin = 100%]
6-furfury laminopurin 100
1 6-furfurylamino-9-(2-chlorethyl)purin I0-4 120 (±15)
2 6 - furfury lamino-9-(2 -bromethy l)purin 1(J 102 (±3)
Příklad 9
Antisenescenční aktivita nových sloučenin pri testování v senescenčním biotestu na segmentech listů pšenice při působení světla
Schopnost nových sloučenin bránit degradaci chlorofylu v dekapitovaných listech pšenice byla rovněž testována za přítomnosti světla. Tento experiment byl proveden jak je popsáno v příkladu 7 v následující modifikaci - inkubace listů se sloučeninou byla realizována za konstantního světla (100 gmol.m ís 4) pri 22 °C. Jak je ukázáno na obr. 2 nové sloučeniny vykazovaly silnější pozitivní účinky na oddálení senescence v segmentech listů pšenice za přítomnosti světla v porovnání s N9-nesubstituovaným rodičovským cytokininem Kin. Sloučenina 1 a 2 bránila degradaci chlorofylu s vysokou účinností, která dosáhla 32-krát a 18-krát menší EC50 než dosud známý cytokinin Kin. Nově připravené substituované cytokininy obecného vzorce I vykazovaly silnější antisenescenční aktivity na světle ve srovnání s dosud známým cytokininem kinetinem (Kin).
•2! CZ 303054 B6
Tabulka 4
Vliv nových sloučenin na oddálení senescence v dekapitovaných segmentech listů Triticum 5 aestivum cv. Hereward ve světle.
e. Testovaná sloučenina nejúčinnější koncentrace (mol.1·*) aktivita (%) [lO^mol.r1 Kin = 100%]
6-furfurylaminopurin 10* 100
1 6-furfury lamino-9-(2-chlorethyl)purin i O'5 116 (±7)
2 6-fiirfurylamino-9-(2-bromethyl)purin i(Z 121 (±8)
io Příklad 10
Ochrana před peroxidací membránových lipidů v pšenici
Typickým projevem provázejícím senescenci je zvýšení hladiny reaktivních kyslíkových derivátů i5 a následná peroxidace membránových lipidů. Proto byly stanoveny hladiny MDA, oxidativního markéru poškození membránových lipidů, v extirpováných listech pšenice vystavených působení připravených derivátů a kinetinu po dobu čtyř dnů v temnu, jak bylo popsáno v příkladu 7. Hladiny MDA byly stanoveny pomocí kyseliny thiobarbiturové (TBA). 100 mg čerstvého rostlinného materiálu bylo homogenizováno pomocí oscilačního mlýnu (MM301, Retsch, Germany) s 1 ml
80% methanolu. Surový extrakt byl centrifugován při lOOOOxg po dobu 5 minut, Ι00μ1 alikvot supernatantu byl protřepán se 100 μί 0,5% (w/v) TBA obsahujícími 0,1% (w/v) trichloroctovou kyselinu, a výsledný roztok byl inkubován 30 minut při 95 °C. Vzorky byly rychle ochlazeny na ledu a centrifugovány 5 minut při lOOOxg. Absorbance supernatantu byla změřena při 532 nm s korekcí při 600 nm a množství vzniklého komplexu MDA-TBA bylo vypočítáno z extinkčního koeficientu 155 mM^cm’1.
Nové deriváty 1 a 2 významně snižovaly peroxidací membránových lipidů ve srovnání s neošetřenou kontrolou (Tabulka 5 - hodnoty vyjadřují obsah MDA, oxidativního markéru poškození membránových lipidů). Látky 1 a 2 snižovaly míru peroxidace membránových lipidů v extirpo30 váných listech pšenice na 67, resp. 69 % původní hodnoty.
Nově připravené deriváty obecného vzorce I tak chrání před negativním účinkem reaktivních kyslíkových derivátů, které jsou akumulovány v tkáních během senescence listu v temnu.
Tabulka 5
Efekt nových na peroxidací membránových lipidů v průběhu senescence extirpovaných listů Triticum aestivum cv. Hereward v temnu.
No Testovaná sloučenina MDA (nmol/g FW)
Neošetřená kontrola 18,9 (±2,2)
1 6-furfury lamino-9-(2-chlorethy l)purin 12,8 (±1,0)
2 6-furťury lamino-9-(2-bromethy l)purin 13,2 (±1,5)
-22CZ 303054 B6
Příklad 11
Testování nových látek v amarantovém biotestu
Pro studium cytokininové aktivity byl rovněž použit „amarantový“ biotest v následující modifikaci. Semena Amaranthus caudatus var. Atropurpurea byla povrchově sterilizována 10% Nchlorbenzensulfonamidem (w/v) po dobu 10 min a poté promyta 5-krát deionizovanou vodou. Semena byla rozmístěna v 15cm Petriho miskách s filtračním papírem saturovaným destilovanou vodou. Po 72 hodinách kultivace pri 25 °C ve tmě byly ze semenáčků odstraněny kořeny. Tyto explantáty obsahující 2 kotyledony a hypokotyl byly umístěny do 5 cm Petriho misek na 2 vrstvy filtračního papíru nasyceného 1 ml inkubačního média obsahujícím 10 pmol Na2HPO4-KH2PO4, pH 6,8, 5 μ mol tyrosinu a testovaný cytokin in. Na misku bylo umístěno 20 exp lan tátů. Veškeré manipulace byly prováděny pod zeleným světlem v temné komoře. Po 48 hodinách inkubace při 25 °C ve tmě byl betacyanin extrahován cestou zmražení explantátů ve 4 ml 3,33 μΜ kyselině octové. Koncentrace betacyaninu byla stanovena porovnáním absorbancí při 537 a 620 nm a vypočtena pomocí vzorce AA = A537nm — A620nm· Hodnoty byly vyneseny do grafů závislosti ΔΑ na koncentraci. Pět replikátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a daný test byl opakován minimálně 2—krát. V každém experimentu byla otestována aktivita nových sloučenin a porovnána s aktivitou N9-nesubstituovaného rodičovského cytokininu iP, který je znám velmi vysokou cytokin inovou aktivitou. Testované cytokin i ny byly rozpuštěny v d i methyl sul fox idu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na 10“3 M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu IO-8 až 1CT* M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2 % a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. Aktivita získaná při 10 4 M iP byla postulována jako 100 %.
Látka účinkující jako cytokinin by měla mít stimulační vliv na indukci betacyaninu v amarantovém biotestu. Výsledky v Tab. 6 ukázaly, že nově připravené substituované cytokíniny obecného vzorce I vykazovaly silnější cytokininové aktivity v amarantovém biotestu ve srovnání s dosud známým cytokininem iP.
Tabulka 6
Vliv nových sloučenin na tvorbu betacyaninu v hypokotylech Amaranthu ve tmě
č. Testovaná sloučenina nej účinnější koncentrace (rnolT1) aktivita (%) [10-mol.r1 iP = 100%]
6-(3 -methy lbut-2 -en-1 -y l)aminopurin (iP) 10'4 100
3 6-((3-methylbut-2-en~l-yl)amino)-9-(2- bromethyl)purin io- 116 (±9)
4 6-((3-methylbut-2-en-l-yl)amino)-9-(2- chlorethyOpurin io- 128 (±11)
Příklad 12
N9-halogenalkyl substituent cytokininu zabraňuje inhibičnímu efektu dosud známého cytokininu na růst kořene kukuřice
Cytokininy jsou známé jako negativní regulátory prodlužování kořene a tvorby postranních kořenů (Werner et al. 2001) a jejich exogenní aplikace v koncentracích převyšujících 1 μΜ často vede
- 23 CZ 303054 B6 ke kompletní inhibici růstu kořene. Abychom prozkoumaly in vivo efekt nových derivátů na růst a vývoj kořene, semena kukuřice (Zea mays cv. CELLUX, Morseva, Česká republika) byly nabobtnány ve vodovodní vodě a ponechány ke klíčení ve tmě na zvlhčeném filtračním papíře. Po dvou dnech byly vyklíčené semenáčky přeneseny do provzdusnovaných hydroponických nádob naplněných Hoaglandovým roztokem (15 rostlin na 1 litr Hoaglandova roztoku). Rostliny byly pěstovány v komoře při režimu 16 h světlo (250 pE.rnXs ') při 27 °C a 8 h tma při 20 °C. Živný roztok obsahoval 5 μΜ a 10 μΜ koncentraci 6~furfurylamino-9-(2-chlorethyl)purinu nebo 5μΜ cytokinin kinetin (Kin). Všechny roztoky včetně negativní kontroly obsahovaly DMSO ve výsledné koncentraci 0,01 %.
Obr. 3 dokumentuje, že po aplikaci 5μΜ látky 1 byl fenotyp kořene i prýtu rostlin kukuřice téměř identický s negativní kontrolu ošetřenou DMSO (Obr. 3). Když byla látka 1 aplikovaná v koncentraci 10 μΜ, byla detekována pouze slabá redukce délky hlavního a vedlejších kořenů, zatímco již 5 μΜ koncentrace kinetinu způsobila dramatické ztloustnutí a zkrácení hlavního kořene a úplnou inhibici tvorby postranních kořenů (Obr. 3).
VP14 je gen kódující 9-cis-epoxykarotenoid dioxygenasu, enzym zodpovědný za biosyntézu kys. abscisové (Schwarz et al., 2003, Plant Phys., 131, 1591-1601). Kys. abscisová slouží kromě jiného jako spouštěč exprese genů odpovědi na stres (Tan et al., 1997, Proč. Nati. Acad Sci USA, 94, 12235 až 40). Zvýšená exprese tohoto genu tak ukazuje na to, že rostlina se vyskytuje ve stresových podmínkách. 5-týdenní rostliny kukuřice byly vyjmuty šetrně ze substrátu a po dobu 3 dnů byly kultivovány ve vodném roztoku testované látky v koncentraci 5 μΜ. Poté byl metodou kvantitativní polymerázové řetězové reakce detekován a vyhodnocen počet transkriptů genu VP14 v kořenech a listech rostlin. Tab. 7 dokumentuje, že zatímco dosud známý cytokinin kinetin výrazně zvyšuje expresi VP14 v kořenech i listech kukuřice, látka 1 nezpůsobovala žádnou stresovou odpověď.
To naznačuje, že nově připravené substituované deriváty obecného vzorce I nemají negativní efekt na růst a vývoj kořene ve vysokých koncentracích, na rozdíl od dosud známých cytokininů, a mohou tak být s výhodou užity pro kořenové aplikace v širším koncentračním rozmezí než dosud známé cytokininy.
Tabulka 7
Vliv nových sloučenin na expresi stresového genu VP14 v intaktních rostlinách kukuřice Zea mays. (Relativní hodnoty počtu transkriptů, vztaženo k neošetřené kontrole.)
No Testovaná sloučenina relativní množství transkriptů
kořen list
Neušetřená Runiroia 1 1
6-furfiiry laminopurin 3,4 (±0,8) 16,3 (±4,0)
1 6-furťurylamino-9-(2-chlorethyl)purin 0,4 (±0,1) 1,1 (±0,3)
Příklad 13
Přípravky
Aktivní složkou v přípravcích může být kterákoliv sloučenina obecného vzorce I.
-24CZ 303054 B6
A1. Emulgovatelné koncentráty a) b) c) d)
Aktivní složka 5% 10% 25% 50%
dodecyl benzensulfonát vápenatý polyoxyethylovaný ricinový olej 6% 8% 6% 8%
(polyglykol ether ricinového oleje) (36 mol ethylenoxid) 4% — 4% 4%
oktyl fenol polyglykol ether(7 až 8 mol ethylenoxid) 2% — 2%
cyklohexanon - - 10% 20%
směs aromatických uhlovodíků 83 % 82% 53% 18%
Cq~C]2
Emulze o vyžadované finální koncentraci mohou být získány z takového koncentrátu zředěním vodou.
A2. Roztoky a) b) c) d)
20 Aktivní složka 5 % 10% 50% 90%
1 -methoxy-3-(3-methoxypropoxy)propan 20% 20% —
polyethylenglykol MW 400 20% 10% - -
N-methyl-2-pyrrolidon - - 30% 10%
25 směs aromatických uhlovodíků 75 % 60% - -
Roztoky jsou vhodné k aplikaci ve formě mikrokapének.
30 A3. Smáčivé prášky a) b) c) d)
Aktivní složka 5% 25% 50% 80%
lignosulfonát sodný 4% - 3% -
laurylsulfát sodný 2% 3 % - 4%
35 diisobutylnaftalensulfonát sodný — 6% 5% 6%
oktylfenol polyglykol ether - 1 % 2% -
(7 až 8 mol ethylenoxid) vysoce disperzní kyselina křemičitá l % 3% 5% 10%
40 kaolin 87% 61 % 37% —
Aktivní složka je důkladně promísena s pomocnými látkami a směs je důkladně rozemleta ve vhodném mlýnu. Suspenzi libovolné koncentrace je možné získat smísením vzniklého prachu s vodou.
- 75 CZ 303054 B6
A4. Potahové granule a) b) c)
Aktivní složka 0,1 % 5% 15%
vysoce disperzní kyselina křemičitá 0,9 % 2% 2 %
anorganický nosič 99,0 % 93% 83 %
(0,1 až 1 mm) např. CaCO-s nebo SiO2
Aktivní složka je rozpuštěna v methylenchloridu a nasprejována na nosič. Rozpouštědlo je odpařeno ve vakuu.
A5. Potahované granule a) b) c)
Aktivní složka 0,1 % 5% 15%
polyethylenglykol MW 200 1,0% 2% 3%
vysoce disperzní kyselina křemičitá 0,9 % 1 % 2%
anorganický nosič 98,0 % 92% 80%
(AE 0,1 až 1 mm) např. CaCO3 nebo SiO2
Jemně rozemletá aktivní složka je v mixéru stejnoměrně nanesena na nosič zvlhčený polyethylenglykolem. Takto jsou získány neprašné granule.
A6. Extrudované granule a) b) c) d)
Aktivní složka 0,1 % 3 % 5% 15%
lignosulfonát sodný 1,5 % 2% 3% 4%
karboxymethylcelulosa 1,4% 2% 2% 2%
kaolin 97,0 % 93% 90% 79%
Aktivní složka je smísena a rozemleta s pomocnými látkami a složka je zvlhčena vodou. Směs je extrudována a usušena v proudu vzduchu.
A7. Prachy a) b) c)
Aktivní složka 0,1 % 1 % 5%
s 1 1 LaiCN 39,9 % 49 % 35 %
kaolin 60,0 % 50% 60%
Prachy k přímému použití jsou získány rozemletím aktivní složky s nosičem ve vhodném mlýnu.
A8. Suspenzní koncentrát a) b) c) d)
Aktivní složka 3 % 10% 25% 50%
ethylenglykol 5% 5% 5 % 5%
nonylfenol polyglykol ether(15 mol ethylenoxid) 1 % 2% —
lignosulfonát sodný 3% 3 % 4% 5%
-26CZ 303054 B6
karboxy methy lcelulosa l % 1 % 1 % 1 %
37 % vodný roztok formaldehydu 0,2 % 0,2 % 0,2 % 0,2 %
emulze silikonového oleje 0,8 % 0,8 % 0,8 % 0,8 %
voda 86% 78% 64% 38%
Jemně rozemletá aktivní složka je smíchána s pomocnými látkami. Vzniklý suspenzní koncentrát umožňuje přípravu suspenze o požadované koncentraci zředěním vodou.
Příklad 14
Gel
Názvy složek jsou uváděny v souladu s terminologií registračních úřadů. Obsah složek je uváděn ts v gramech na 100 g.
Gel /100 g
Aktivní látka 6-furfurylamino-9-(2-chlorethyl)purin) ÚO g
butyl hydroxy toluen (Nipanox BHT) 0,2 g
butylparaben (Nipabutyl) 0,2 g
diethylenglykol monoethyl ether (Transcutol P) 10,0g
bezvodá koloidní silika (Zeopharm 177) 5,0 g
propylenglykol laurát (Lauroglycol FCC) 83,6 g
Konzistence gelu může být dále modifikována přidáním bezvodé koloidní siliky.
Účinek aktivní látky může být zvýšen pomocí transdermálního systému Transcutol P/Lauroglycol FCC. Bezvodá koloidní silika pravděpodobně zpomalí penetraci účinné látky, což povede k protrahovanému účinku.

Claims (12)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použití sloučeniny obecného vzorce I, «9 (η kde
    Ré je vybráno ze skupiny zahrnující -NH-furfuryl, -NH-(4—hydroxy-3-methylbut-2-en-lyl), -NH--(3-methyÍbut-2-en-l-yl)1 -NH—(4-hydroxy-3-methylbutyl), -NH—(4-hydroxy-l ,3dímethylbut-2-en-l-yl), -NH-(4—hydroxy-1,3—dimethyl butyl), -NH-benzyl, -NH-fenyl, přičemž benzyl, furfuryl a fenyl mohou být nesubstituované nebo substituované 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny zahrnující hydroxy, halogen, methyl a methoxy,
    Roje vybrán ze skupiny zahrnující C]-C3 alkyl a Ci-C3 alkenyl, přičemž každá z těchto skupin je substituována jedním nebo více atomy halogenu, pro regulaci růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk.
  2. 2. Použití podle nároku 1, kde sloučenina obecného vzorce I je vybrána ze skupiny zahrnující 6-(furfurylamino)-9-(chlonnethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(2-chlorbenzylammo)-9(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-chlorbenzy lam ino)-9-( chlormethyl, 2—chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvÍnyl)purin, 6-(3-fluorbenzylamino)-9—(chlormethyl, 2—chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6(3-hydroxy benzy lam ino)-9-{chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(3-methoxybenzy 1amino)-9-(chlonnethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyk 2—chlor1/iny!, 2—bromv!ny!)purin, 6—(3—methy !but—2—en—1—y lam ino)—9—(chíormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-benzylamino-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2—chlorvínyl, 2-bromvinyl)purin, 6— (4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamÍno)-9-(chIormethyl, 2-chlorethyl, 3—chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyI)purin, 6-(Z)(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamÍno)-9-(chlonnethyl, 2—chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(E)(4-hydroxy-3-methylbut-2-en~l-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvínyl)purin, 6-(Z)(4-hydroxy-l ,3-dimethylbut-2-en~l-ylamino)-9~(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6(E)-(4-hydroxy-l ,3-dimethylbut-2-en-l-ylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)-28CZ 303054 B6 purin, 6-(4-hydroxy-l,3-dimetehy Ibuty lamino) -9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6(4-hydroxy-3-methylbutylamino)-9~(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-fenylamino-9(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyI)purin, 6-(3-methoxyfenylamino)-9-(chlormethyl, 2chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(2-methoxy benzy lam ino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(2-hydroxybenzylamino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyl)purin, 6-(2-fluorbenzyl· amino)-9-(chlormethyl, 2-chlorethyl, 3-chlorpropyl, brommethyl, 2-bromethyl, 3-brompropyl, 2,2-dichlorethyl, 2-chlorvinyl, 2-bromvinyí)purin.
  3. 3. Použití podle nároku 1, kde regulace růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk zahrnuje stimulaci organogeneze u rostlin vedoucí ke zvětšení kořenového systému.
  4. 4. Použití podle nároku 1, kde regulace růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk zahrnuje urychlení nalévání semen a zvětšení velikosti semene a plodů jednoděložných rostlin a zkrácení doby klíčení semen rostlin.
  5. 5. Použití podle nároku 1, kde regulace růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk zahrnuje regulaci proliferace a morfogeneze a inhibici senescence a stresu.
  6. 6. Použití podle nároku 1, kde regulace růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk zahrnuje oddálení degradace chlorofylu a stárnutí rostlinných pletiv.
  7. 7. Použití podle nároku 1, kde regulace růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk zahrnuje zvýšení výnosu a kvality zemědělských produktů u jednoděložných rostlin.
  8. 8. Použití sloučenin obecného vzorce 1 podle nároku l při přípravě přípravků pro klonování rostlinných buněk, orgánů, zárodečných buněk a embryí.
  9. 9. Použití sloučenin obecného vzorce í podle nároku 1 při přípravě růstově-regulačních přípravků k ošetřování rostlin a jejich orgánů či buněk.
  10. 10. Přípravky pro klonování rostlinných buněk, orgánů, zárodečných buněk a embryí, vyznačené tím, že obsahují alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I, jak je definována v nároku 1, a pomocné látky.
  11. 11. Růstově-regu lační přípravky, vyznačené tím, že obsahují alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I, jakje definována v nároku l, a pomocné látky.
  12. 12. Sloučeniny obecného vzorce la,
CZ20100670A 2010-09-07 2010-09-07 Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny CZ2010670A3 (cs)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20100670A CZ2010670A3 (cs) 2010-09-07 2010-09-07 Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny
PCT/CZ2011/000086 WO2012031574A1 (en) 2010-09-07 2011-09-02 Use of 6 - substituted 9 - halogenalkyl purines for regulation of growth and development of whole plants, plant cells and plant organs; novel 6 - substituted 9 -halogenalkyl purines
EP11781999.5A EP2613631B1 (en) 2010-09-07 2011-09-02 Use of 6-substituted 9-halogenalkyl purines for regulation of growth and development of whole plants, plant cells and plant organs; novel 6-substituted 9-halogenalkyl purines
US13/821,163 US9220269B2 (en) 2010-09-07 2011-09-02 Use of 6-substituted 9-halogenalkyl purines for regulation of growth and development of whole plants, plant cells and plant organs; novel 6-substituted 9-halogenalkyl purines

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20100670A CZ2010670A3 (cs) 2010-09-07 2010-09-07 Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ303054B6 true CZ303054B6 (cs) 2012-03-14
CZ2010670A3 CZ2010670A3 (cs) 2012-03-14

Family

ID=44946903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20100670A CZ2010670A3 (cs) 2010-09-07 2010-09-07 Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9220269B2 (cs)
EP (1) EP2613631B1 (cs)
CZ (1) CZ2010670A3 (cs)
WO (1) WO2012031574A1 (cs)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016095881A1 (en) * 2014-12-15 2016-06-23 Univerzita Palackeho V Olomouci Substituted 6-anilino-9-heterocyclylpurine derivatives for inhibition of plant stress
US10798943B2 (en) 2016-06-14 2020-10-13 Syngenta Participations Ag Use of 6-anilino purine derivatives to improve heat stress tolerance of rice seedlings
JP7411550B2 (ja) * 2017-12-12 2024-01-11 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 植物成長の調節
CN110407836B (zh) * 2019-08-15 2022-03-29 沈阳化工研究院有限公司 一种9-（2-甲氧基乙基）-9h-嘌呤-6-胺衍生物及其应用
CN110642859B (zh) * 2019-10-11 2021-11-09 青岛科技大学 一种含嘧啶硫酮嘌呤类化合物及其用途
CZ309368B6 (cs) * 2020-05-17 2022-10-12 Univerzita Palackého v Olomouci Mesylátové soli heterocyklických cytokininů, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použití

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA657337A (en) * 1963-02-05 D. Zwahlen Kenneth Substituted adenines
GB953897A (en) * 1960-03-31 1964-04-02 Shell Int Research Substituted adenines and living plant materials preserved therewith
GB1027756A (en) * 1963-07-17 1966-04-27 Shell Int Research Compounds, compositions and method for promoting growth and/or preventing decay processes of plants or plant tissues
GB2041359A (en) * 1979-01-10 1980-09-10 Ici Ltd Purine derivatives and their use in the defoliation of cotton plants
EP0155911A1 (de) * 1984-03-19 1985-09-25 Ciba-Geigy Ag Purinderivate zur Regulierung des Pflanzenwachstums
WO1990009178A1 (en) * 1989-01-31 1990-08-23 Whitby Research, Inc. N6-substituted 9-methyladenines: a new class of adenosine receptor antagonists
WO2001049688A1 (en) * 2000-01-07 2001-07-12 Universitaire Instelling Antwerpen Purine derivatives, process for their preparation and use thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3213095A (en) * 1963-04-04 1965-10-19 American Cyanamid Co N-benzylation of adenine
CA2243696C (en) 1996-03-15 2008-09-23 Novartis Ag Herbicidal synergistic composition and method of weed control
CZ294535B6 (cs) * 2001-08-02 2005-01-12 Ústav Experimentální Botaniky Avčr Heterocyklické sloučeniny na bázi N6-substituovaného adeninu, způsoby jejich přípravy, jejich použití pro přípravu léčiv, kosmetických přípravků a růstových regulátorů, farmaceutické přípravky, kosmetické přípravky a růstové regulátory tyto sloučeniny obsahující
BRPI0511064A (pt) * 2004-05-12 2007-12-26 Bayer Cropscience Gmbh regulação de crescimento da planta
US7960397B2 (en) * 2007-12-28 2011-06-14 Institute Of Experimental Botany, Academy Of Sciences Of The Czech Republic 6,9-disubstituted purine derivatives and their use as cosmetics and cosmetic compositions

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA657337A (en) * 1963-02-05 D. Zwahlen Kenneth Substituted adenines
GB953897A (en) * 1960-03-31 1964-04-02 Shell Int Research Substituted adenines and living plant materials preserved therewith
GB1027756A (en) * 1963-07-17 1966-04-27 Shell Int Research Compounds, compositions and method for promoting growth and/or preventing decay processes of plants or plant tissues
GB2041359A (en) * 1979-01-10 1980-09-10 Ici Ltd Purine derivatives and their use in the defoliation of cotton plants
EP0155911A1 (de) * 1984-03-19 1985-09-25 Ciba-Geigy Ag Purinderivate zur Regulierung des Pflanzenwachstums
WO1990009178A1 (en) * 1989-01-31 1990-08-23 Whitby Research, Inc. N6-substituted 9-methyladenines: a new class of adenosine receptor antagonists
WO2001049688A1 (en) * 2000-01-07 2001-07-12 Universitaire Instelling Antwerpen Purine derivatives, process for their preparation and use thereof

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Eugene Fox J. et al.: Phytochemistry 1973, 12 (7), str. 1531-1533 *
Eugene Fox J. et al.: Plant Physiology 1971, 47, str. 275-281 *
Matsubara S.: Phytochemistry 1980, 19 (11), str. 2239-2253 *
Nisler J., et al.: Phytochemistry 2010, 71, str. 823-830; tab. 1 a 3 *
Ren Zhnag et al.: Journal of Plant Growth regulation 1989, 8, str. 181-197 *
Shaw G. et al.: Experentia 1968, 24 (11), str. 1089-1184 *

Also Published As

Publication number Publication date
US9220269B2 (en) 2015-12-29
WO2012031574A1 (en) 2012-03-15
CZ2010670A3 (cs) 2012-03-14
EP2613631B1 (en) 2016-04-13
EP2613631A1 (en) 2013-07-17
US20130210632A1 (en) 2013-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2203451B1 (en) Substituted 6-(alkylbenzylamino)purine derivatives for use as cytokinin receptor antagonists and preparations containing these derivatives
US8222260B2 (en) Substituted 6-anilinopurine derivatives as inhibitors of cytokinin oxidase/dehydrogenase and preparations containing these derivatives
CZ303054B6 (cs) Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny
US10662194B2 (en) Substituted 6-anilino-9-heterocyclylpurine derivatives for inhibition of plant stress
US20150119247A1 (en) Composition and Method for Stress Mitigation in Plants
EP4121415B1 (en) Inhibitors of cytokinin oxidase derived from 1-[2-(hydroxyalkyl)phenyl]-3-ylurea, use thereof and preparations containing these derivatives
EP4153592B1 (en) Mesylate salts of heterocyclic cytokinins, compositions containing these derivatives and use thereof
US10550144B2 (en) 6-aryl-9-glycosylpurines and use thereof
Bíbová et al. New Generation of Arabidopsis thaliana Cytokinin Oxidase/Dehydrogenase Inhibitors Affect Shoot/Root Growth and Seed Yield
NZ617147B2 (en) Composition and method for stress mitigation in plants

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20220907