FI111219B - Menetelmä ja koostumus nisäkkään ihon kosmeettisen ulkonäön parantamiseksi - Google Patents

Description

111219

Menetelmä ja koostumus nisäkkään ihon kosmeettisen ulkonäön parantama, seksi

Tekniikan ala ( 5 Tämä keksintö kohdistuu menetelmiin ja koostumuksiin vanhenemisen haitallisten vaikutusten vähentämiseksi nisäkässoluissa lisäämättä solujen kasvunopeutta tai koko-naisproliferaatiokapasiteettia.

Erityisemmin keksintö koskee tapoja käyttää tunnet-10 tuja yhdisteitä, kinetiiniä ja muita 6-(substituoitu amino) puriinisytokiniinejä vanhenemisen haitallisten vaikutusten vastustamiseksi nisäkässoluilla viljelmässä ja in vivo, mukaan lukien ihmisihon soluilla, ja koostumuksia tällaisten menetelmien suorittamiseksi.

15 Keksinnön tausta

Solun vanhenemisprosessin estäminen on ollut biologisen tieteen alituinen, vaikkakin vaikeasti tavoitettava kohde. Vanhenemisprosessin estämisestä olisi joukko merkittäviä, käytännöllisiä seurauksia. Esimerkiksi arvokkai-20 den tuotteiden tuotanto soluilla viljelmässä paranisi jos solut säilyttäisivät nuorten solujen ominaispiirteensä. Solujen vanhenemisen estämisellä ihmisihossa tai muissa elimissä olisi merkittävä arvo johtuen siihen liittyvästä rakenteellisen ja toiminnallisen eheyden säilymisestä. Ihon • 1 ·.· 25 tapauksessa solun vanhenemisen haitallisten vaikutusten parantamiseen liittyisi edullisesti myös kosmeettisen eheyden säilyminen.

Joukon tuntomerkkejä on tunnistettu erottavan nuoret ja vanhentuneet solut toisistaan. Havaitaan esimerkiksi, 30 että nuoret nisäkässolut, mukaan lukien ihmisen side-kudosemosolut, näyttävät vakioviljelmässä terveiltä ja puhtailta; niillä on säännöllinen, pitkä, ohut sukkulamai-nen morfologia; ne ovat pakkautuneet tiiviisti järjestyksiin yhteenkasvuvaiheen lähestyessä kasvatusväliaineilla; 35 niissä ei tapahdu keskinäistä ylikasvua; niissä on harvoin 111219 2 useampia kuin yksi· tuma; ja ne tuottavat kasvatusväliai-neeseen vähän solujäännettä. Toisaalta sidekudosemosoluil-la, jotka ovat vanhoja, on useita ikään liittyviä oireita, kuten litistynyt ja epäsäännöllinen morfologia, epänormaa-5 Iin suuri koko, niukka kasvu, alhainen solusaanto kasva-tusväliaineen yksikköalaa kohden, monitumaisten solujen merkittävä esiintymistaajuus, trypsinisoinnin vaikeus, ja suuri solujäänteenmuodostusnopeus kasvatusväliaineessa. Morfologiset ominaispiirteet, jotka erottavat nuoret solut 10 vanhoista, samoin kuin vanhoissa soluissa havaittu auto-fluoresenssin korkea taso, heijastavat erilaisia fysiologisia ja biokemiallisia ominaispiirteitä, jotka erottavat nuoret solut vanhoista, mukaan lukien suuri vaste kasvutekijöihin ja suuremmat DNA- ja proteiinisynteesinopeudet 15 nuorissa soluissa.

Morfologiset, fysiologiset ja biokemialliset ominaispiirteet nuorien solujen erottamiseksi vanhoista on tunnistettu paljolti nisäkässolujen, mukaan lukien ihmis-solujen (tavallisesti sidekudosemosolujen) tutkimuksista 20 viljelmässä. Näissä tutkimuksissa viljelmässä olevien so lujen "ikää" mitataan tapahtuneiden solulukumäärien kahdentumisten lukumäärällä, jotka kahdentumiset ovat tapahtuneet primäärisestä viljelmästä (tehty kudoksesta) kiinnostuksen kohteena olevaan viljelmään, joka on peräisin 25 tai polveutuu primäärisestä viljelmästä.

Vielä, soluviljelmillä tehdyissä tutkimuksissa havaitut ominaispiirteet, jotka erottavat nuoret solut vanhoista, kuuluvat soluille, joita esiintyy in vivo elävissä nisäkkäissä ja joilla on useita yhteisiä viljeltyjen side-30 kudosemosolujen ominaispiirteitä, kuten samanlaisia bioke- miallisia ominaispiirteitä ja tiukka kasvun kontrolli (ts. tiukka proliferatiivinen kontrolli). Ihon ihokerroksen (ts. dermis) sidekudosemosolut ja ruoansulatuskanavan si-säseinämän epiteelin alla oleva sidekudoskerros ovat esi-35 merkkejä soluista, joilla on samanlaiset vanhenemisomi- 111219 3 naispiirteet kuin viljelmässä sidekudosemosoluilla havaitut.

Eräs mitta tällaisten sidekudosemosolujen "iästä" elävän nisäkkään kudoksissa, jotka normaalisti jakautuvat , 5 jaksottain tiukan kontrollin alaisina, on solujen ja nii den esi-isien suunnilleen nisäkkään syntymääjankohdasta lähtien tapahtuneiden solujakaumien lukumäärä. Koska solu-jakautuminen tapahtuu jaksottain, on nisäkkään kronologisen iän ja solujen ja niiden syntymänaikaisten esi-isien 10 välisillä solujakautumisilla mitatun iän välillä tyypillisesti korrelaatiota.

Eräs toinen viljelmässä olevien sidekudosemosolujen ominaisuus on solujen "proliferatiivinen kokonaiskapasiteetti ". Tämä mitataan solulukumäärän kahdentumisten koko-15 naisluvulla, joita kahdentumisia viljelmässä voi tapahtua ennen kuin viljelmä kasvu päättyy, johtuen siinä olevien "vanhentuneiden" solujen kuolemasta (kasvun ja jakautumisen loppumisesta). Ihmisen sidekudosemosoluviljelmillä, tämä proliferatiivinen kokonaiskapasiteetti on tyypilli-20 sesti noin 45 - 60 kahdentumista primääriselle viljelmälle. Kuten tekniikan alalla ymmärretään, viljelmän kasvun päättyminen ilmenee hyvin nopeasti, kasvunopeuden (mitattuna kahdentumisajan käänteisluvulla) laskiessa nuorille soluille ominaisista lähes normaaleista arvoista nollaan 25 vain muutaman kahdentumisen aikana. Normaalien sideku-dosemosolujen viljelmissä, ts. joissa solut eivät vielä ole muuttuneet kuolemattomaan tai "syöpämäiseen" tilaan, "proliferatiivinen kokonaiskapasiteetti" alenee funktiona kahdentumisten lukumäärästä, joka erottaa viljelmän pri-30 määrisestä viljelmästä, josta se johdettiin. Muita viljel-tyjen normaalien solujen "proliferatiiviseen kokonaiskapasiteettiin" liittyviä käsitteitä' ovat solujen "odotettavissa oleva elinikä" ja "normaali elinkaari". Normaalien solujen "odotettavissa oleva elinikä" tai "normaali elin-35 kaari" on "proliferatiivinen kokonaiskapasiteetti" primää- 111219 4 risellä viljelmällä, josta viljelmä, jossa solut ovat, oli peräisin.

Se tosiseikka, että normaaleilla sidekudosemoso-luilla, erityisesti ihmisperäisillä, on viljelmässä tar-5 kasti määritelty (muutaman kahdentumisen puitteissa) pro-liferatiivinen kokonaiskapasiteetti, on osoitus tiukasta proliferatiivisesta kontrollista, jonka alaisia tällaiset solut ovat. Toisinaan soluja, joilla normaalisti on rajallinen proliferatiivinen kokonaiskapasiteetti, voidaan 10 muuttaa niin, että ne menettävät tämän rajoituksen. Tällaisten solujen viljelmiä voidaan toisinaan kasvattaa sukupolvien ajan ilman mitään selvää sukupolvien lukumäärän rajaa; tällaisten solujen sanotaan olevan kuolemattomaksi tehtyjä. Kuolemattomuus on eräs syöpäsolujen ominaisuus. 15 Syöpäsolut ovat vähäisen proliferatiivisen kontrollin alai sia tai ilman proliferatiivista kontrollia.

Proliferatiivisen kokonaiskapasiteetin mittausta soluille in vivo elävissä nisäkkäissä, kuten ihon dermiksen tai suoliston epiteelin alaisen sidekudoskerroksen 20 sidekudosemosoluille, ei voida mitata yksinkertaisesti kuten viljelmässä oleville sidekudosemosoluille, kahdentumisten määrättynä lukumääränä, joka on rajoittunut nisäkäslajille ominaiselle kapealle alueelle (esimerkiksi 45 -60 ihmisellä, kuten edellä ilmaistiin; noin 10 hiirellä). 25 On kuitenkin selvää, että tällaisilla elävissä nisäkkäissä olevilla soluilla, jos solut ovat normaaleja, on rajallinen jakautumiskapasiteetti, ja ne ovat tiukan proliferatiivisen kontrollin alaisia.

Esimerkiksi, sidekudosemosoluilla primäärisissä 30 viljelmissä, jotka on perustettu aikuisen ihmisen ihosta ! olevilla normaaleilla soluilla, tiedetään olevan alhaisem pi proliferatiivinen kokonaiskapasiteetti kuin sidekudos-emosoluissa primäärisissä viljelmisssä, jotka on perustettu ihmisen sikiön tai vastasyntyneen ihosta olevilla 35 normaaleilla soluilla. Itse asiassa suurella ihmisluovut- 111219 5 tajien lukumäärällä tehdyistä tutkimuksista ilmenee, että sidekudosemosoluilla primäärisissä viljelmissä, jotka on perustettu normaaleilla ihokerrossoluilla, on viljelmässä proliferatiiviset kokonaiskapasiteetit, jotka ovat kään-5 teisesti suhteessa luovuttajan ikään.

Viljelmässä olevien, kuolemattomaksi tehtyjen jäi "syöpämäiseen tilaan" muutettujen solujen rajallisen pro-liferatiivisen kokonaiskapasiteetin ominaisuuteen liittyy usein epänormaalisti lisääntynyt proliferaationopeus, jota 10 kutsutaan tässä "kasvunopeudeksi." Proliferaationopeus, tai kasvunopeus, on mitta nopeudesta, jolla solut jakautuvat.

Samalla lailla tiukan proliferatiivisen kontrollin menetystä, joka on tunnusomaista syöpäsoluille in vivo, 15 seuraa yleensä epänormaalisti lisääntynyt solujen kasvunopeus .

Tähänastisissa pyrkimyksissä vanhenevien solujen "nuoren" fenotyypin säilyttämiseksi in vivo ovat solujen kasvunopeudet poikkeuksetta kasvanut. On kuitenkin havait-20 tu, että solujen kasvunopeuden lisääminen, joka välttämättä lisää solujakautumisnopeutta, lisää vaaraa että solut muuttuisivat kuolemattomiksi tai syöpämäiseen tilaan.

Samalla lailla käsittelyjen, jotka lisäävät keinotekoisesti viljelmässä olevien solujen proliferatiivista 25 kokonaiskapasiteettia sen normaalin rajan yläpuolelle, on keksitty lisäävän kuolemattomaan tai syöpämäiseen tilaan muuttumisen vaaraa.

Vaarat transformaation aiheuttamisessa puuttumalla solujen tiukkaan proliferatiiviseen kontrolliin, puuttu-30 maila kasvunopeuksiin ja/tai proliferatiivisen kokonaiska-. pasiteetin rajoihin, johtuen luultavasti tällaisen puuttu- misen vaikutuksista solujen genomeihin tai biokemiallisiin mekanismeihin geeniekspression kontrolloimiseksi.

Lisäksi käsittelyt, jotka, ainakin viljelmissä ole-35 villa soluilla, lisäävät kasvunopeutta tai proliferatii- 111219 6 vista kokonaiskapasiteettia, kuten orvaskedestä ja verihiutaleista peräisin olevat kasvutekijät, insuliini, glu-kokortikoidit, Panax ginseng-uutteet, ja gibberelliinikas-vihormonit, ovat yleensä tehokkaita säilyttämään vain 5 "nuorien" solujen "nuoren" fenotyypin, mihin käsittelyjä vähiten tarvitaan. "Vanhoilla" soluilla, niillä, joiden normaalista elinkaaresta ainakin noin 80 - 90 % on ohi, on vähän jos lainkaan vastetta käsittelylle edes näiden aineiden korkeilla konsentraatioilla (paljon korkeammilla 10 kuin konsentraatiot, jotka ovat tehokkaita "nuorilla" so luilla, joiden elinkaarista on kulunut vähemmän kuin noin puolet).

Mitä hyvänsä koostumusta, jota on määrä käyttää parantamaan vanhenemisen haitallisia vaikutuksia soluilla, 15 ja jotka lisäävät solujen kasvunopeutta tai proliferatii- vista kokonaiskapasiteettia, in vivo tai viljelmässä, on tarkasteltava varovaisuudella, ainakin sikäli kuin koostumusta on määrä käyttää kudoksilla (ts. iho, suolen seinämä) , jotka sisältävät soluja, jotka normaalisti ovat tiukan 20 proliferatiivisen kontrollin alaisia.

Ennen tätä keksintöä ei ole ollut käytettävissä koostumuksia parantamaan vanhenemisen haitallisia vaikutuksia solujen morfologisiin, fysiologisiin ja biokemiallisiin ominaispiirteisiin ilman mahdollisesti haitallisia I* 25 solujen kasvunopeuden tai proliferatiivisen kokonaiska pasiteetin kasvuja.

Tähän keksintöön kuuluu sidekudosemosolujen tehtävän ymmärtäminen, erityisesti ihmisihossa. Sidekudosemosolut syntetisoivat joukkoa komponentteja, joita vaaditaan 30 pitämään yllä ihon kosmeettista eheyttä. Näitä kom- ·. ponentteja ovat mm. kollageeni ja elastiini, jotka ovat kuituproteiineja, jotka ovat vastuussa ihon ja muiden pintakudosten kolmiulotteisesta rakenteesta; fibronektiini, proteiini, joka on vastuussa solun ankkuroitumisesta ja 35 solun morfologian ylläpidosta; ja joukko proteii nikasvutekijöitä, jotka ovat välttämättömiä epiteelin ja 7 111219 tyvisolukerrosten ja näiden alla olevien sidekudoskerrosten ylläpidossa. Johtuen sidekudosemosolujen proteiinisynteesin tärkeästä merkityksestä ihon ja muiden pintakudosten terveyden ylläpidossa ja koska saatavilla olevat todisteet 5 osoittavat, että sidekudosemosolujen proteiinibiosyn- teettinen aktiivisuus vähenee merkittävästi iän myötä (esimerkiksi odotettavissa olevan eliniän tasolla noin 70 % viljelmässä olevien, sikiöperäisten ihmisen sidekudosemosoluj en kollageenisynteesin nopeus on vain noin 50 %, 10 verrattuna synteesinopeuteen tällaisilla sidekudos- emosoluilla, joiden ikä on alle 20 % odotettavissa olevasta eliniästä), menetelmät ja koostumukset parantamaan vanhenemisen haitallisia vaikutuksia sidekudosemosolujen proteiinibiosynteettiseen aktiivisuuteen in vivo tällaisten 15 sidekudosemosolujen proliferatiiviseen kokonaiskapasi teettiin tai kasvunopeuteen vaikuttamatta olisi erityisen edullista.

Tähään keksintöön kuuluu 6-(substituoitu amino)pu-riinisytokiniinit, joita ovat mm. kinetiini ja sen 6-amino-20 puriinianalogit ja jotka ovat kaavan I mukaisia: HNR1 r * CX)

N N H

jossa Ri on furfuryyli, fenyyli, bentsyyli, n-alkyyli, jossa on 4, 5 tai 6 hiiltä, (sykloheksyyli)metyyli, 3,3-dime-30 tyyliallyyli tai 3-hydroksimetyyli-3-metyyliallyyli.

. *. Sytokiniinit ovat kasvihormonien luokka, jotka mää ritellään niiden kyvyllä edistää solujakautumista kasviku-dosviljelmissä standardiväliaineissa, jotka sisältävät auksiineja (eräs toinen kasvihormonien luokka) samoin kuin 35 vitamiineja, mineraalisuoloja ja sokeria.

111219 8

Ribonukleotidit, joissa sytokiniini, erityisesti kinetiini (6-furfuryyliaminopuriini) , tseatiini (6-(3-hydr-oksimetyyli-3-metyyliallyyli)aminopuriini) tai 6-(3,3-dimetyyliallyyli)aminopuriini, on emäsosa, on tunnistettu 5 joidenkin siirtäjä-RNA'iden komponenteiksi määrätyissä kasvi- ja eläinsoluissa.

Kinetiinin tiedetään muodostavan komplekseja veh-nänalkiouutteiden määrättyjen RNA'ta sitovien proteiinien kanssa, ja on ehdotettu, että se edistää proteiinisynteesiä 10 kasveissa. Spirin ja Ajtkhozhin, Trends in Biochem. Sei., huhtikuu, 1985, s. 162.

Lisäksi kinetiiniä on käytetty proteiinirikkaan hiivan tuotannossa käyttäen tavanomaisia kasvatusmenetelmiä lisäten kasvatusväliaineeseen kinetiiniä. DD-patentti-15 julkaisu 148,889 (1981) (Derwent World Patent Index Abst ract) . Kinetiinin on myös kuvattu lisäävän mikrobikasvus-tojen kasvua. Merck Index, 10. painos, kohta 5148 (Merck and Co., Rahway, New Jersey, U.S.A., 1983).

Lopuksi, JP-hakemusjulkaisussa 60-19709 (1985) ku- 20 vataan koostumus, joka sisältää enintään 1 % kinetiiniä ja enintään 20 % karakterisoimatonta lithospermum-juuriuu-tetta, jonka sanotaan kiihdyttävän solujakautumista ihmisen iholla ja täten estävän ihon vanhenemista.

Keksinnön yhteenveto , 25 Nyt on hämmästyttävästi keksitty, että nisäkässolu- jen alistaminen erilaisille 6-(substituoitu amino)puriini-sytokiniineille parantaa vanhenemisen haitallisia vaikutuksia tällaisilla soluilla viivyttämällä, ja jopa kääntämällä toisinpäin, ikään liittyviä morfologisia muutoksia, 30 joita normaalisti tapahtuu solujen vanhetessa, ja että ] tällaisella altistuksella on tämä parantava vaikutus solu jen kasvunopeutta tai proliferatiivista kokonaiskapasiteettia lisäämättä.

Tähän keksintöön perustuen aikaansaadaan uusia koos-35 tumuksia ja menetelmiä vanhenemisen haitallisten vaikutusten parantamiseksi, mukaan lukien toisinpäin kääntä- 9 111219 miseksi, nisäkässoluilla, mukaan lukien tällaisilla soluilla viljelmässä ja in vivo, kuten ihmisen iholla.

Siten keksinnön mukaiset menetelmät ja koostumukset ovat muiden sovellutusten ohella käyttökelpoisia hidasta-5 maan ja kääntämään toisinpäin ihmisen ihon kosmeettisen eheyden heikkenemistä, joka normaalisti liittyy vanhenemiseen .

Kuten edellä esitettiin, kaikki koostumukset, joita tähän asti on ollut saatavilla parantamaan vanhenemisen 10 haitallisia vaikutuksia nisäkässolujen biokemiallisiin, fysiologisiin tai morfologisiin ominaispiirteisiin, lisäävät myös ei-toivotusti solujen kasvunopeutta tai prolife-ratiivista kokonaiskapasiteettia.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 15 Eräässä näkökannassa keksintö koskee menetelmää nisäkkään ihon kosmeettisen ulkonäön parantamiseksi, jossa menetelmässä levitetään nisäkkään iholle koostumusta, joka sisältää tehokkaan määrän 6-(substituoitua amino)puriini-sytokiniiniä, jolla on kaava

20 ui D

H ^R1 "

N H

jossa Ri on furfuryyli, fenyyli, bentsyyli, n-alkyyli, jossa on 4, 5 tai 6 hiiliatomia, (sykloheksyyli)metyyli, 3-hydroksimetyyli-3-metyyliallyyli tai 3,3-dimetyyliallyyli; 30 jolloin levitetty määrä on riittävä parantamaan nisäkkään ihon kosmeettista ulkonäköä, mutta ei merkittävästi muuta nisäkkään ihon kasvunopeutta ja proliferatiivista kokonaiskapasiteettia .

Eräässä toisessa näkökannassa keksintö koskee koos-35 tumusta, joka on sopiva levitettäväksi paikallisesti ihmisen iholle ihmisen ihon kosmeettisen ulkonäön 111219 10 parantamiseksi. Koostumukselle on tunnusomaista, että koostumus sisältää tehokkaan määrän 6-(substituoitua amino)-puriinisytokiniiniä, jolla on kaava H ^ .^Ri 5 0c>

"-N

N H

10 jossa Ri on furfuryyli, fenyyli, bentsyyli, n-alkyyli, jossa on 4, 5 tai 6 hiiliatomia, (sykloheksyyli)metyyli, 3-hydroksimetyyli-3-metyyliallyyli tai 3,3-dimetyyliallyyli; jolloin määrä on riittävä parantamaan ihmisen ihon 15 kosmeettista ulkonäköä, mutta ei merkittävästi muuta ihmisen ihon kasvunopeutta ja proliferatiivista kokonaiskapasiteettia .

Keksintö koskee myös menetelmää nisäkässoluviljelmän käsittelemiseksi normaalisti nisäkässolujen ikääntymisen 20 ohessa tapahtuvien morfologisten muutosten hidastamiseksi tai viivyttämiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista, että annostellaan viljelmään tehokas määrä 6-(substituoitua amino)puriinisytokiiniä, jolloin 6-(substituoitudulla amino)puriinisytokiniinilla on kaava 25 H. /Rl __^-N (I) N \ • 30

N H

jossa Ri on furfuryyli, fenyyli, bentsyyli, n-alkyyli, jossa on 4, 5 tai 6 hiiliatomia, (sykloheksyyli)metyyli, 3-35 hydroksimetyyli-3-metyyliallyyli tai 3,3-dimetyyliallyyli; ja jolloin annosteltu määrä on riittävä hidastamaan ja 11 111219 viivyttämään normaalisti nisäkässolujen ikääntymisen ohessa tapahtuvia morfologisia muutoksia, mutta ei merkittävästi muuta ihmisen ihon kasvunopeutta ja proliferatiivista kokonaiskapasiteettia.

5 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniinejä, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisissa menetelmissä ja koostumuksissa haitallista ikävaikutusta parantavasti tehokkaana yhdisteenä, ovat mm. kinetiini, tseatiini, 6—(3,3— dimetyyliallyyli)aminopuriini, 6-(bentsyyli)aminopuriini, 10 6-(fenyyli)aminopuriini, 6-(n-alkyyli)aminopuriini, jossa n-alkyyliryhmässä on 4, 5 tai 6 hiiltä, ja 6-(sykloheksyy-li)metyyliaminopuriini. Edullisin on kinetiini (6-(furfu-ryyli)aminopuriini).

Nisäkässoluja, joita keksinnön mukaisilla menetel-15 millä ja koostumuksilla voidaan käsitellä, ovat mm.

ihmissolut ja viljellyt solut, samoin kuin elävissä nisäkkäissä in vivo esiintyvät solut.

Jos solut ovat viljelmässä, ne voivat olla peräisin mistä hyvänsä kudoksesta. Menetelmiä ja koostumuksia 20 käytetään edullisesti sidekudosemosoluilla ihmisen kudoksissa in vivo, kuten ihmisen ihon sidekudosemosoluilla .

Siten tähän keksintöön liittyy edelleen tapoja, ja koostumuksia näiden suorittamiseksi, hidastaa (tai kääntää " 25 toisinpäin) vanhenemiseen normaalisti liittyvää ihon kosmeettisen eheyden rappeutumista.

Keksinnön mukaiset menetelmät ja koostumukset ovat tehokkaita 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniinin hämmästyttävän ja edullisen alhaisilla konsentraatioilla. 30 Konsentraatiot ovat kudosviljelyväliaineessa tyypillisesti / välillä 10"6 ja 5 x 10”4 M. Näillä konsentraatioilla, syto- kiniinillä ei ilmeisesti ole toksista vaikutusta nisäkäs-soluihin.

Hämmästyttävästi, ja erityisen edullisesti, keksin-35 non mukaiset menetelmät eivät merkittävästi vaikuta menetelmien mukaisesti käsiteltyjen solujen kasvunopeuteen tai 111219 12 proliferatiiviseen kokonaiskapasiteettiin. Keksinnön mukaiset koostumukset ja menetelmät eivät vaikuta DNA-syn-teesin nopeuteen tai määrään. Toisin kuin muut koostumukset vanhenevien solujen "nuoren" fenotyypin säilyttämiseksi tai 5 palauttamiseksi, keksinnön mukaiset koostumukset ja menetelmät eivät vaikuta tiukkaan proliferatiiviseen kontrolliin, jonka alaisina useiden solujen on pysyttävä toimiakseen normaalisti in vivo, kuten sidekudosemosolujen ja orvaskeden ja muun epiteelin määrättyjen solujen.

10 Nisäkässoluilla "vanhenemisen haitallisten vaiku tusten parantamisella" tarkoitetaan, että hidastetaan tai käännetään toisinpäin edellä kuvatut morfologiset muutokset, joita normaaleissa nisäkässoluissa "vanhetessa" normaalisti tapahtuu viljelmässä tai in vivo.

15 Ammattimies voi saada selville sisältääkö koostumus, jolle nisäkässolut alistetaan keksinnön mukaisen menetelmän suorituksessa, 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniiniä määrän, joka on soluilla tehokas vanhenemisen haitallisten vaikutusten parantamiseen. Ammattimies voi helposti erottaa 20 vanhenemiseen liittyvät morfologiset muutokset tutkimalla mikroskoopilla soluja, jotka on poistettu viljelmästä, otettu kudoksesta elävänä näytteenä, tai otettu vastaavilla tavoilla.

Viljelmässä olevien nisäkässolujen tapauksessa, ” 25 jotka solut on kasvatettu suoraan kudoksesta ilman DNA- tekniikkoja tai joita voi olla muutettu geneettisesti millä hyvänsä erilaisista tunnetuista yhdistelmä-DNA-tekniikoista tuottamaan haluttua tuotetta, ja joita, kuten tekniikan alalla ymmärretään, voidaan käyttää arvokkaiden 30 proteiinien, kuten lymfokiinien tai hormonien valmistukseen _ diagnostisiin, terapeuttisiin tai muihin sovellutuksiin, vanhenemisen haitallisten vaikutusten parantaminen tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä ja koostumuksilla pitää solut edullisella tavalla "nuorempina" kuin ne tosiasiassa 35 ovat. Itse asiassa 6-(substituoitu amino)puriini-sytokiniinin tehokkaan määrän lisääminen lukuisia sukupol- 111219 13 via eläneiden ja vanhenevien solujen tunnusomaiset morfologiset ominaispiirteet omaavien nisäkässolujen kasvatus-väliaineeseen muuttaa morfologiset ominaispiirteet takaisin nuorempien solujen ominaispiirteiksi.

5 Edut, jotka tämän keksinnön mukaisilla koostumuk silla ja menetelmillä saadaan säilytettäessä, ja vanhenemisen haitallisten vaikutusten toisinpäin kääntämisen tapauksessa, parannettaessa funktionaalista eheyttä nisäkäs-soluilla iholla, ja, erityisesti, säilytettäessä ihmisen 10 ihon kosmeettista eheyttä, ovat ilmeisiä ja ne on kuvattu edellä.

Keksinnön mukaiset koostumukset voivat olla missä hyvänsä joukosta muotoja riippuen solujen luonteesta ja solujen ympäristöistä, joihin keksinnön mukaisesti on määrä 15 lisätä haitallista ikävaikutusta parantavia määriä 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniinejä.

Viljelmässä kasvatusväliaineen hauteessa tai suspensiossa olevilla soluilla keksinnön mukainen koostumus on mitä hyvänsä nisäkässoluilla käytettyä kasvatusväliainetta, 20 jota on täydennetty määrällä välillä noin 10~6 M (ts. 1 μΜ) ja noin 5 x 10"4 M 6-(substituoitu amino)pu-riinisytokiniiniä. Edullisilla kaavan I mukaisilla syto-kiniineillä HNR.

25 I 1 ΐ il / (I)

N

H

30 jossa Ri on furfuryyli, fenyyli, bentsyyli, n-alkyyli, jossa on 4, 5 tai 6 hiiltä, (sykloheksyyli) metyyli (-CH2 (C6Hh)), 3-hydroksimetyyli-3-metyyliallyyli 111219 14 ^ ch2oh (-CH2CH=C tai ^CH3 5 tai 3,3-dimetyyliallyyli, (-CH2CH=C(CH3) 2) , konsentraatio-alue kasvatusväliaineessa on välillä 0,2 ja 100 ppm. Edullisimmalla sytokiniinillä, kinetiinillä, edullinen kon-sentraatioalue on noin 25 - 250 μΜ (ts. noin 5-50 ppm) 10 väliaineessa.

Viljelmässä olevien solujen tapauksessa keksinnön mukainen menetelmä haitallista ikävaikutusta parantavan 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniinimäärän antamiseksi soluille suoritetaan yksinkertaisesti kylvettämällä tai 15 kasvattamalla soluja kasvatusväliaineessa, joka on keksinnön mukaista koostumusta.

Keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan soluilla in vivo nisäkkäissä, edullisesti ihmisen ihon sidekudos-kerroksen sidekudosemosoluilla (tai muilla aktiivisilla 20 soluilla, esimerkiksi keratinosyyteillä) altistamalla tällaiset solut haitallista ikävaikutusta parantavalle 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniinin määrälle.

Yleensä tällainen altistus toistetaan aika-ajoin ajanjakson aikana, jolloin haitallisia ikävaikutuksia so-I'. 25 luihin halutaan parantaa keksinnön mukaisesti. Altistuksen taajuus riippuu osallisena olevista soluista, siitä missä nisäkässolut sijaitsevat ja 6-(substituoitu amino)-puriinisytokiniinin konsentraatiosta konsentraatioalueella tyypillisesti välillä noin 10 ja 1 000 ppm.

30 Ihmisihon sidekudosemosoluilla (tai muilla aktiivi- ' silla soluilla, kuten keratinosyyteillä) keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan lisäämällä ihon ulkopinnalle keksinnön mukaista koostumusta, joka on ihovoidetta, voidetta, pesunestettä, geeliä, liuosta, hajustetta, kiinteää 35 ainetta tai vastaavaa, joka on fysiologisestiy hyväksyttävää ihon ulkopinnalle lisättäväksi ja joka sisältää 111219 15 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniiniä sopivassa väliaineessa tehokkaassa konsentraatiossa, ts. konsentraatiossa, joka on tehokas tunkeutumaan ihoon konsentraatiossa, joka on tehokas parantamaan mainitussa ihossa vanhenemisen hai-5 tallisia vaikutuksia aktiivisiin soluihin (esimerkiksi sidekudosemosoluihin).

Ihmisen iholla käytettävät keksinnön mukaiset koostumukset formuloidaan 6-(substituoitu amino)puriinisyto-kiniinillä, edullisesti yhdellä edellä määritellyn kaavan I 10 mukaisista, tehokkaalla konsentraatioalueella, tyypilli sesti välillä noin 0,5 ja 500 ppm ihovoide-, voide-, pesuneste-, geeli-, liuos- tai kiinteässä perusaineessa tai väliaineessa, jonka tiedetään tekniikan alalla olevan ei-toksista ja dermatologisesti hyväksyttävää. Ihmisen iholla 15 käytettävään keksinnön mukaiseen koostumukseen liuotetun, suspendoidun, dispergoidun tai vastaavalla tavalla saatetun 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniinin konsentraatio (tai paino-osa) on sellainen, että 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniiniä vapautuu ihon aktiivisiin solui-20 hin kuten sidekudosemosoluihin välillä noin 0,2 ja 100 ppm. Yleensä pehmittävät tai voitelevat väliaineet, jotka auttavat ihon kostutuksessa, ovat edullisempia kuin haihtuvat väliaineet kuten etanoli, jotka kuivattavat ihoa.

Esimerkkejä sopivista perusaineista tai väliaineista ”, 25 ihmisen iholla käytettävistä keksinnön mukaisista koos tumuksista ovat vaseliini, vaseliini plus haihtuvat sili-konit, lanoliini, kylmä ihovoide (cold cream) (USP), ja hydrofiilinen voide (USP). Eräässä keksinnön mukaisessa edullisessa koostumuksessa on välillä noin 10 ja 100 ppm 30 kinetiiniä yhdistelmänä sopivan voide- tai ihovoideperus- , aineen kanssa.

Hyväksyttävän väliaineen valinnan määrää suuressa määrin tapa, jolla 6-(substituoitu amino)puriinisytoki- * niiniä on määrä antaa. Tällaisiin menetelmiin luetaan mm. 35 paikallinen anto. Sopivia farmaseuttisesti ja dermatologi sesti hyväksyttäviä väliaineita paikalliseen antoon ovat 111219 16 mm. sellaiset, jotka soveltuvat käytettäväksi pesunesteissä, ihovoiteissa, liuoksissa, geeleissä, laastareissa ja vastaavissa. Yleensä väliaine on luonteeltaan joko orgaanista tai vesipohjaista emulsiota ja 6-(substituoitu ami-5 no)puriinisytokiniini voi olla dispergoituna, suspendoituna tai liuotettuna. Väliaine voi sisältää farmaseuttisesti hyväksyttäviä pehmittäviä aineita, ihon läpäisyn edistäjiä, väriaineita, hajusteita, emulgoimisaineita, sakeutusaineita ja liuottimia. Seuraavassa on yksityiskohtaisempi kuvaus 10 tällaisista muodoista: 1. Pesunesteet

Pesunesteet voivat sisältää tehokkaan määrän 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniiniä (esimerkiksi määrän, joka on tehokas vapauttamaan ihon aktiivisiin soluihin 15 kuten sidekudosemosoluihin); 1-50 %, edullisesti 3 - 15 % pehmittävää ainetta; loppuosan 100 %:iin ollessa vettä ja/tai C2- ja/tai C3-alkoholia, tai veden ja alkoholin seosta. Tunnetaan useita pehmittäviä aineita. Esimerkkejä tällaisista pehmittävistä aineista ovat seuraavat: 20 a. Hiilivetyöljyt ja -vahat. Esimerkkejä ovat mine raaliöljy, vaseliini, parafiini, seresiini, otsokeriitti, mikrokiteinen vaha, polyetyleeni ja perhydroskvaleeni.

b. Silikoniöljyt kuten dimetyylipolysiloksaanit, metyylifenyylipolysiloksaanit, vesiliukoiset ja alkoholi- 25 liukoiset silikoni/glykoli-kopolymeerit.

c. Triglyseridirasvat ja -öljyt kuten sellaiset, jotka ovat kasvis-, eläin- tai meriperäisiä. Esimerkkejä ovat mm. (muttei rajoittuen) risiiniöljy, safloriöljy, puuvillansiemenöljy, maissiöljy, oliiviöljy, turskanmaksa- 30 öljy, manteliöljy, avokadoöljy, palmuöljy, seesamiöljy ja ! soijaöljy.

d. Asetoglyseridiesterit, kuten asetyloidut mono-glyseridit.

e. Etoksyloidut glyseridit, kuten etoksyloitu gly- 35 seryylimonstearaatti.

111219 17 f. Cio-20-rasvahappojen alkyyliesterit. Tässä käyttökelpoisia ovat rasvahappojen metyyli-, isopropyyli- ja bu-tyyliesterit. Esimerkkejä ovat mm. (mutteivät rajoittuen) heksyylilauraatti, isoheksyylilauraatti, isoheksyylipalmi- 5 taatti, isopropyylipalmitaatti, isopropyylimyristaatti, de- kyylioleaatti, isodekyylioleaatti, heksadekyylistearaatti, dekyylistearaatti, isopropyyli-isostearaatti, di-iso-propyyliadipaatti, di-isoheksyyliadipaatti, diheksyylide-kyyliadipaatti, di-isopropyylisebasaatti, lauryylilaktaat-10 ti, myristyylilaktaatti ja setyylilaktaatti.

g. Cio-20-rasvahappojen alkenyyliesterit. Esimerkkejä näistä ovat (muttei rajoittuen) oleyylimyristaatti, oleyy-listearaatti ja oleyylioleaatti.

h. C9-22~rasvahapot. Sopivia esimerkkejä ovat mm.

15 (muttei rajoittuen) pelargoni-, lauriini-, myristiini-, palmitiini-, steariini-, isosteariini-, hydroksisteariini-, oleiini-, linoleiini-, risinoleiini-, arakidoni-, beheeni-ja erukahappo.

i. Cio-22-rasva-alkoholit. Esimerkkejä tyydyttävistä 20 rasva-alkoholeista ovat lauryyli-, myristyyli-, setyyli-, heksadekyyli-, stearyyli-, isostearyyli-, hydroksistearyy-li-, oleyyli-, risinoleyyli-, behenyyli-, erusyyli- ja 2-oktyylidodekyylialkoholi.

j. Rasva-alkoholieetterit. Etoksyloituja Cio-20-ras- 25 va-alkoholeja ovat mm. (muttei rajoittuen) lauryyli-, se tyyli-, stearyyli-, isostearyyli-, oleyyli- ja/tai koles-terolialkoholit, joihin on kiinnittynyt 1-50 etyleeniok-sidiryhmää tai 1-50 propyleenioksidiryhmää.

k. Eetteriesterit, kuten etoksyloitujen rasva-alko- 30 holien rasvahappoesterit.

• · · l. Lanoliini ja johdannaiset. Lanoliini, lanoliini-öljy, lanoliinivaha, lanoliinialkoholit, lanoliinirasva-hapot, isopropyylilanolaatti, etoksyloitu lanoliini, etok-syloidut lanoliinialkoholit, etoksyloitu kolesteroli, pro- 35 poksyloidut lanoliinialkoholit, asetyloitu lanoliini, ase- tyloidut lanoliinialkoholit, lanoliinialkoholit linoleaat- 111219 18 ti, lanoliinialkoholien risinoleaatti, lanoliinialkoholien risinoleaatin asetaatti, etoksyloitujen alkoholien esterien asetaatti, lanoliinin hydrogenolyysi, etoksyloitu hyd-rogenoitu lanoliini, etoksyloitu sorbitolilanoliini ja 5 nestemäiset ja puolikiinteät lanoliiniabsorptioemäkset ovat kuvaavia lanoliinista johdettuja pehmittäviä aineita.

m. Monenarvoiset alkoholit ja polyeetterijohdannaiset. Näistä ovat esimerkkejä propyleeniglykoli, dipropy-leeniglykoli, polypropyleeniglykoli (molekyylimassa 2 000 - 10 4 000), polyoksietyleeni/polyoksipropyleeni-glykolit, poly- oksipropyleeni/polyoksietyleeni-glykolit, glyseroli, etoksyloitu glyseroli, propoksyloitu glyseroli, sorbitoli, etoksyloitu sorbitoli, hydroksipropyyli sorbitoli, poly-etyleeniglykoli (molekyylimassa 200 - 6 000), metoksipoly-15 etyleeniglykolit 350, 550, 750, 2 000, 5 000, poly[ety- leenioksidi]homopolymeerit (molekyylimassa 100 000 - 5 000 000), polyalkyleeniglykolit ja johdannaiset, heksy-leeniglykoli (2-metyyli-2,4-pentaanidioli) , 1,3-buty- leeniglykoli, 1,2,β-heksaanitrioli, etoheksadioli USP (2-20 etyyli-1,3-heksaanidioli), C15-18-visinaalinen glykoli ja trimetylolipropaanin polyoksipropyleenijohdannaiset.

n. Monenarvoisen alkoholin esteri. Etyleeniglykoli-mono- ja -dirasvahappoesterit, dietyleeniglykolimono- ja -dirasvahappoesterit, polyetyleeniglykolin (molekyylimassa 25 200 - 6 000) mono- ja dirasvahappoesterit, propyleenigly- kolimono- ja -dirasvahappoesterit, polypropyleeniglykoli 2 000 mono-oleaatti, polypropyleeniglykoli 2 000 monostea-raatti, etoksyloitu propyleeniglykolimonostearaatti, gly-seryylimono- ja -di-rasvahappoesterit, polyglyserolipoly-30 rasvahappoesterit, etoksyloitu glyseryylimonostearaatti, > · · ,* 1,3-butyleeniglykolimonostearaatti, 1,3-butyleeniglykoli- distearaatti, polyoksietyleenipolyolirasvahappoesteri, sorbitaanirasvahappoesterit ja polyoksietyleenisorbitaa-nirasvahappoesterit ovat tyydyttäviä monenarvoisen alkoho-35 Iin estereitä.

111219 19 o. Vahaesterit kuten mehiläisvaha, valaanpääöljy, myristyylimyristaatti ja stearyylistearaatti.

p. Mehiläisvahajohdannaiset, esimerkiksi polyok-sietyleenisorbitolimehiläisvaha. Nämä ovat mehiläisvahan 5 reaktiotuotteita vaihtelevan etyleenioksidipitoisuuden omaavan etoksyloidun sorbitolin kanssa, muodostaen eette-riesterien seosta.

q. Kasvisvahat, mukaan lukien (muttei rajoittuen) karnauba- ja kandelillavaha.

10 r. Fosfolipidit kuten lesitiini ja johdannaiset.

s. Sterolit. Kolesterolit ja kolesterolirasvahap-poesterit ovat esimerkkejä näistä.

t. Amidit, kuten rasvahappoamidit, etoksyloidut rasvahappoamidit, ja kiinteät rasvahappoalkanoliamidit.

15 Edullisesti pesunesteet sisältävät lisäksi 1 - 10 %, edullisemmin 2 - 5 % emulgoimisainetta. Emulgoimisaineet voivat olla ionittomia, anionisia tai kationisia. Esimerkkejä tyydyttävistä ionittomista emulgoimisaineista ovat mm. (mutta rajoittumatta) Ci8-20_rasva-alkoholit, Cio-20_ 20 rasva-alkoholit, jotka on kondensoitu 2-20 etyleenioksi-di- tai propyleenioksidimoolin kanssa, alkyylifenolit, joissa alkyylissä on 6 - 12 hiiliatomia ja jotka on kondensoitu 2-20 etyleenioksidimoolin kanssa, etyleenioksi-din mono- ja -dirasvahappoesterit, etyleeniglykolin mono-V. 25 ja dirasvahappoesterit, joissa rasvahapporyhmä sisältää 10 - 20 hiiliatomia, dietyleeniglykoli, polyetyleeniglykolit, joiden molekyylimassa on 200 - 6 000, propyleeniglykolit, joiden molekyylimassa on 200 - 3 000, glyseroli, sorbitoli, sorbitaani, polyoksietyleenisorbitoli, polyoksiety- 30 leenisorbitaani ja hydrofiiliset vahaesterit. Sopivia ·[ anionisia emulgoimisaineita ovat mm. (muttei rajoittuen) rasvahapposaippuat, esimerkiksi natrium-, kalium- ja tri-etanoliamiinisaippuat, joissa rasvahapporyhmä sisältää 10 - 20 hiiliatomia. Muita sopivia anionisia emulgoimisaineita 35 ovat mm. (muttei rajoittuen) alkalimetalli-, ammonium- tai substituoitu ammonium-alkyylisulfaatit, alkyyliaryylisul- t 111219 20 fonaatit, ja alkyylietoksieetterisulfonaatit, joissa on 10 - 30 hiiliatomia alkyyliryhmässä. Alkyylietoksi eetterisulf onaatit sisältävät 1-50 etyleenioksidiyk-sikköä. Tyydyttäviä kationisia emulgoimisaineita ovat mm.

5 kvaternäärinen ammonium-, morfolinium- ja pyridinium-yhdisteet. Määrätyillä edeltävissä kappaleissa kuvatuista pehmittävistä aineista on myös emulgoivia ominaisuuksia. Tällaista pehmittävää ainetta sisältävää pesunestettä formuloitaessa ei tarvita muuta emulgoimisainetta, vaikka sitä 10 voidaan sisällyttää koostumukseen.

Pesunesteen loppuosa 100 %:iin on vettä ja/tai C2-tai C3-alkoholia. Pesunesteet formuloidaan yksinkertaisesti sekoittamalla yhteen kaikki komponentit. Edullisesti 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniini on seoksessa liuo-15 tettuna.

Voidaan sisällyttää tavanomaisia mahdollisia komponentteja. Eräs tällainen lisäaine on sakeutusaine tasolla 1 - 10 % koostumuksesta. Esimerkkejä sopivista sakeu- tusaineista ovat mm. (muttei rajoittuen): verkkoutetut 20 karboksipolymetyleenipolymeerit, etyyliselluloosa, poly-etyleeniglykolit, traganttikumi, karaijakumi, ksantaaniku-mit ja bentoniitti, hydroksietyyliselluloosa ja hydroksi-propyyliselluloosa.

2. Ihovoiteet 25 Ihovoiteet sisältävät tehokkaan määrän 6-(substitu oitu amino)puriinisytokiniiniä (esimerkiksi tehokkaan määrän vapauttamaan 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniiniä ihon aktiivisiin soluihin, kuten sidekudosemosoluihin tasolla välillä noin 0,2 ja 100 ppm) ; 5 - 50 %, edullisesti 30 10 - 25 % pehmittävää ainetta, jolloin loppuosa 100 %:iin * on vettä. Edellä kuvattuja pehmittäviä aineita voidaan käyttää myös voidekoostumuksissa. Mahdollisesti ihovoide-muoto sisältää sopivaa edellä kuvattua emulgoimisainetta. Emulgoimisainetta sisällytettäessä sitä on koostumuksessa 35 tasolla 3 - 50 %, edullisesti 5 - 20 %.

111219 21 3. Liuokset

Liuosmuoto sisältää tehokkaan määrän 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniiniä (esimerkiksi tehokkaan määrän vapauttamaan 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniiniä ihon 5 aktiivisiin soluihin, kuten sidekudosemosoluihin tasolla välillä noin 0,2 ja 100 ppm); loppuosan 100 %:iin ollessa vettä ja/tai sopivaa orgaanista liuotinta. Sopivia orgaanisia materiaaleja, jotka ovat käyttökelpoisia liuottimena tai liuotinjärjestelmän osana, ovat seuraavat: pro-10 pyleeniglykoli, polyetyleeniglykoli (molekyylimassa 200 - 600), polypropyleeniglykoli (molekyylimassa 425 - 2 025), glyseroli, sorbitoliesterit, 1,2,6-heksaanitrioli, etanoli, isopropanoli, dietyylitartraatti ja/tai butaanidioli. Tällaiset liuotinjärjestelmät voivat sisältää myös vettä.

15 Näitä liuosmuodossa olevia koostumuksia voidaan levittää iholle sellaisenaan, tai muuten ne voidaan formuloida aerosoliksi ja lisätä iholle suihkeena. Aerosoli-koostumukset sisältävät lisäksi 25 - 80 %, edullisesti 30 -50 % sopivaa ponneainetta.

20 Esimerkkejä tällaisista ponneaineista ovat kloora tut, fluoratut ja/tai kloorifluoratut alempimolekyylimas-saiset hiilivedyt. Ponnekaasuina käytetään myös typpioksi-duulia, hiilidioksidia, butaania ja propaania. Näitä ponneaineita käytetään, kuten tekniikan alalla ymmärretään, 25 määrä ja paineessa, joka on sopiva astian sisällön ulot työntämiseen.

4. Geelit

Geelikoostumukset voidaan formuloida yksinkertaisesti sekoittamalla sopivaa sakeutusainetta edellä kuvat-30 tuihin liuoskoostumuksiin. Esimerkkejä sopivista sakeutus-'* aineista on kuvattu aikaisemmin pesunesteiden kohdalla.

Geeliytetyt koostumukset sisältävät tehokkaan määrän 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniiniä (esimerkiksi tehokkaan määrän vapauttamaan 6-(substituoitu amino)pu-35 riinisytokiniiniä ihon aktiivisiin soluihin, kuten sidekudosemosoluihin tasolla välillä noin 0,2 ja 100 ppm); 5 - 111219 22 75 %, edullisesti 10 - 50 % aikaisemmin kuvattua orgaanista liuotinta; 0,5 - 20 %, edullisesti 1 - 10 % sakeutus- ainetta; loppuosan 100 %:iin ollessa vettä.

5. Kiinteät aineet 5 Kiinteissä muodoissa olevilla koostumuksilla on käyttöä puikkotyyppisinä koostumuksina, jotka on tarkoitettu levitettäväksi huulille tai kehon muille osille. Tällaiset koostumukset sisältävät tehokkaan määrän 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniiniä (esimerkiksi te-10 hokkaan määrän vapauttamaan 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniiniä ihon aktiivisiin soluihin, kuten sidekudos-emosoluihin tasolla välillä noin 0,2 ja 100 ppm) ja 50 -98 %, edullisesti 60 - 90 % aikaisemmin kuvattuja pehmittäviä aineita. Tämä koostumus voi lisäksi sisältää 1 -15 20 %, edullisesti 5 - 15 % sopivaa sakeutusainetta, ja mahdollisesti emulgoimisaineita ja vettä. Kiinteässä muodossa olevissa koostumuksissa käytetään sopivasti sakeu-tusaineita, jotka on kuvattu aikaisemmin pesunesteiden yhteydessä.

20 Eräs esimerkki keksinnön mukaisesta koostumuksesta, joka soveltuu ihmisen kasvojen iholle levitettäväksi, koostuisi 10 - 100 ppm:stä kinetiiniä perusaineessa, joka on valmistettu sekoittamalla (painon mukaan) 10 osaa gly-serolimonostearaattia, 10 osaa setyylialkoholia, 30 osaa :\ 25 valaanpääöljyä, 10 osaa Tween 20:tä (sorbitaanimonostea- raatin polyoksialkyleenijohdannainen), 10 osaa Span 20:tä (sorbitaanimonolauraatti) , 12,5 osaa glyserolia ja 100 osaa vettä. Esimerkkejä haitallista ikävaikutusta parantavista aktiivisista valmistusaineista, joita voitaisiin käyttää 30 kinetiinin sijasta, ovat tseatiini, 6-(3,3-dime-tyyliallyyli)aminopuriini, 6-bentsyyliaminopuriini, tai kinetiinin ja 6-(n-heksyyli)aminopuriinin tai 6-bentsyy-liaminopuriinin yhdistelmä.

Tällaiseen paikalliseen käyttöön tarkoitetussa kek-35 sinnön mukaisessa koostumuksessa voidaan käyttää myös muita valmistusaineita, kuten säilöntäaineita (esimerkiksi 111219 23 metyyliparabeeniä tai etyyliparabeeniä), hajusteita, värejä tai vastaavia, joiden tiedetään tekniikan alalla aikaansaavan iholle paikallisesti lisättäville koostumuksille halutun stabiilisuuden, tuoksun ja värin, tai muita 5 haluttavia ominaisuuksia, kuten suojan auringon valoke-miallisilta säteiltä.

Keksinnön mukainen koostumus voi myös sisältää muita haitallista ikävaikutusta parantavia aktiivisia valmistusaineita kuin 6-(substituoitu amino)puriinisytokiniinejä. 10 Eräällä tällaisten sytokiniinien yksinään käytön edulla, joka on, ettei käsiteltävien solujen kasvunopeuteen ja proliferatiiviseen kokonaiskapasiteettiin vaikuteta merkittävästi, on kuitenkin taipumus laimentua jos käytetään muita tällaisia valmistusaineita, jotka lisäävät käsitel-15 tyjen solujen kasvunopeutta ja/tai proliferatiivista kokonaiskapasiteettia. Seurauksena keksinnön mukaiset edulliset koostumukset sisältävät ainoana haitallista ikävaikutusta parantavana valmistusaineena 6-(substituoitu amino) puriinisytokiniiniä.

20 Ihmisen iholla käytettäviä keksinnön mukaisia koos tumuksia lisätään edullisesti kerran päivässä ihon alueille, joita keksinnön mukaisella menetelmällä halutaan käsitellä.

Keksinnön mukaista menetelmää käytetään henkilön 25 iholla lisäämällä sille, edullisesti päivittäin, edellä kuvattua keksinnön mukaista koostumusta, joka soveltuu ihmisen ihon hoitoon, ennalta määräämättömän ajanjakson ajan, ts. niin pitkään kuin henkilö tahtoo nauttia keksinnön mukaisen menetelmän ja koostumuksen aikaansaamasta 30 vanhenemisen haitallisten ihovaikutusten parantamisesta.

' . Keksinnön mukaisen koostumuksen kerran päivässä tapahtuvaa lisäystä vaaditaan ainakin noin kuukauden ajan, ja jopa ainakin noin vuoden ajan riippuen henkilön iästä, tilasta iholla, jolle koostumusta lisätään, ja 6-(substituoitu 35 amino)puriinisytokiniinin konsentraatiosta (tai paino- osasta) koostumuksessa, ennen kuin edulliset vaikutukset, 111219 24 proteiinisynteesinopeuden alenemisen hidastuminen ja ikään liittyvien morfologisten muutosten viivyttäminen ihon ty-visolukerroksen sidekudosemosoluissa, alkavat ilmetä ihon pinnalla. Jos keksinnön mukaisen menetelmän käyttö lopete-5 taan, menetelmän mukaisesti parannetut ikääntymisvaikutuk-set ovat seurauksena jonkin ajan kuluttua.

Keksintöä kuvataan nyt seuraavissa esimerkeissä.

Esimerkki I

Kinetiinin vaikutus lyhytaikaiseen solun kasvuun 10 Kinetiinin vaikutuksia lyhytaikaiseen solun kasvuun normaaleilla diploidisilla ihmisen alkion ihon sidekudos-emosoluilla, kannalla, jota kutsutaan nimellä KIS, tutkittiin menetelmillä, joita kutsutaan tekniikan alalla "yksivaiheisiksi kasvukäyräkokeiksi". Tätä varten yhtä 15 suuret lukumäärät KIS-soluja (105) lisättiin useisiin kas-vatuspulloihin, jotka sisälsivät Dulbecco'n modifioitua Eagle'n väliainetta (DMEM), jota on täydennetty 10 %:lla naudan sikiön seerumia, antibiooteilla ja glutamiinilla. Pulloihin lisättiin eri tilavuudet kinetiinin kantaliuok-20 siä, jotka oli valmistettu tasapainotettuun suolaliuokseen (Hank'in puskuri), jotta saataisiin kasvatusväliaineen lopulliset konsentraatiot 40 μΜ, 80 μΜ ja 200 μΜ kinetii-niä. Sitten viljelmiä inkuboitiin 37 °C:ssa ilmakehässä, jossa oli 5 % C02:ta. Kaikki kokeet tehtiin kolmella rin-”, 25 nakkaismäärityksellä.

Jotta määritettäisiin eri kinetiiniannoksilla käsiteltyjen solujen kiinnittymistaajuus, yhtä kasvatuspullojen sarjaa jokaisesta annoksesta käytettiin 6 tuntia siir-rostuksen jälkeen kasvatuspullon pohjaan kiinnittyneiden 30 solujen lukumäärän laskemiseen. Tämä tehtiin poistamalla _·[ . solut ensin trypsinisoimalla, suspendoimalla ne uudelleen tuoreeseen väliaineeseen ja laskemalla niiden lukumäärän Coulter-laskuria käyttämällä.

Kinetiinillä käsiteltyjen ja käsittelemättömien 35 solujen kasvunopeuksien tai proliferaationopeuksien arvioimiseksi solumäärä määritettiin jokaisessa sarjassa joka 111219 25 24. tunti kuten edellä. Tätä seurattiin kunnes kaikki viljelmät koska yhtyvät eikä solumäärä kasvanut edelleen (tavallisesti 8-10 päivää). Saatiin seuraavat tulokset.

1. Normaaleilla ihmissoluissa ei nähdä haitallisia 5 morfologisia vaikutuksia käsiteltäessä erilaisilla kine- tiiniannoksilla arvioituna solujen mikroskooppisella tutkimuksella valomikroskoopin alla.

2. Kinetiinillä ei ollut selviä toksisia vaikutuksia ihmissoluihin, koska käsiteltyjen ja käsittelemättömi- 10 en solujen välillä ei ollut eroa solun kiinnittymisessä, väliaineen solujäänteessä ja solumäärässä kasvatusväliai-neen yksikköpinta-alaa kohden.

3. Sekä kinetiinillä käsitellyillä että käsittelemättömillä ihmissoluilla nähtiin sama kasvunopeus ja ne 15 kasvoivat yhtenäisiksi samassa ajassa. Tämä on selvä todiste siitä, ettei kinetiini lisännyt solujen kasvunopeuksia viljelmässä. Tämän lisätodiste esitetään esimerkissä II.

Esimerkki 11 20 Kinetiinin vaikutus pitkäaikaiseen kasvunopeuteen ja proliferatiiviseen kokonaiskapasiteettiin

Kinetiinin vaikutuksia KIS-solujen pitempiaikaiseen kasvunopeuteen ja proliferatiiviseen kokonaiskapasiteettiin tutkittiin menetelmällä, joka tunnetaan tunnetaan 25 tekniikan alalla "pitkäikäisyyskäyräkokeina". Tätä varten ainakin 16 rinnakkaista KIS-solujen viuljelmää ylläpidettiin 40 μΜ kinetiinin läsnä ollessa väliaineessa yhdessä yhtäsuuren lukumäärän kanssa käsittelemättömiä kontrolli-viljelmiä. Kaikki kokeet aloitettiin populaation kahdentu-30 mistasolta (PDL) 6, joka on aikaisemman määrityksen mukaan noin 12 % normaalista odotettavissa olevasta eliniästä (ts. solujen proliferatiivinen kokonaiskapasiteetti on noin PDL = 50) in vitro.

' Menetelmät solujen viljelemiseksi, trypsinisoimi- 35 seksi ja solulukujen laskemiseksi olivat kuten esimerkissä 111219 26 I kuvattiin. Pitkäaikaistutkimuksia varten viljelmistä tehtiin kuitenkin sarja-aliviljelmät joka kerta kun ne kasvoivat yhteen. Tätä viljelmien sarja-aliviljelmien tekemistä jatkettiin kunnes kaikissa viljelmissä loppui yh-5 teenkasvaminen huolimatta viikottaisista kasvatusväliai-neiden vaihtamisista 4-5 viikon ajan. Kinetiinillä käsitellyillä ja käsittelemättömillä viljelmillä saadun PDL:n tarkkojen lukumäärien arvioimiseksi solut ainakin neljässä yhteenkasvaneessa kasvatuspullossa 16 rinnakkain kasvavas-10 sa viljelmässä jaettiin nuorina alaosiin lohkomissuhteessa 1:4,, ja 1:2, kun niiden kasvunopeus alkoi hidastua vanhenemisesta johtuen. Viljelmässä solujen siirrostuksen ja yhteenkasvun välillä tapahtuneiden PD'iden lukumäärä määritettiin yhtälöllä: log N/log 2, jossa N = solujen luku-15 määrä yhteenkasvaneessa viljelmässä jaettuna tuohon pulloon alunperin siirrostettujen solujen lukumäärällä. Lopuksi laskettiin kullekin viljelmälle kumulatiivinen PDL niiden elinkaaren lopussa in vitro.

Kumulatiivisessa PDL'ssä ei ollut elinkaaressa eroa 20 ihmissoluilla, jotka oli kasvatettu ilman kinetiiniä tai kinetiinin ollessa jatkuvasti läsnä kasvatusväliaineessa. Tässä kokeiden sarjassa molemmat viljelmien tyypit saavuttivat maksimi-PDL'n alueella 47 - 49. Tämä tarkoittaa, että solujen proliferatiivinen kokonaiskapasiteetti ei 25 merkittävästi muuttunut kun kasvatusväliaineessa oli läsnä kinetiiniä.

Kronologisen ajan suhteen kinetiinillä käsitellyt solut näyttivät kuitenkin elävän pitempään (217 päivää) kuin kontrollit (196 päivää). Tämä johtuu siitä, että 30 elinkaarensa lopussa (ts. kun yhteenkasvua ei enää voitu "" saavuttaa), kinetiinillä käsitellyillä soluilla jatkui paljon terveemmiltä näyttäminen ainakin kahden viikon ajan ja ilman, että väliaineeseen tuli merkittäviä lukumääriä kuolleita soluja.

111219 I

27

Kasvunopeuksien suhteen, kulmakertoimia polulaation kahdentumien lukumäärien käyristä ajan funktiona sekä ki-netiinillä käsitellyillä että käsittelemättömillä soluilla ei voitu kokeellisesti erottaa toisistaan. Siten kinetii-5 nillä käsitektyjen ja käsittelemättömien, kontrollivil-jelmien kasvunopeudet eivät olleet merkittävän erilaisia.

Kinetiini ei merkittävästi muuttanut viljelmässä olevien ihmissolujen normaalin elinkaaren (ts. proliferatiivisen kokonaiskapasiteetin) geneettisesti määräytyvää, synnyn-10 näistä rajaa.

DNA-synteesi ja kasvunopeus

Sytokiniinien, mukaan luettuna kinetiinin, tiedetään auttavan suorittamaan kasveissa solujakautumisen, ts. sytokineesin, viimeiset vaiheet. Tämä viittasi siihen, 15 että sytokiniinit voisivat vaikuttaa nisäkässoluissa DNA-synteesiin tavalla, joka lisäisi vaaraa, että tällaiset solut muuttuisivat sytokiniinien läsnä ollessa syöpä-mäiseen tilaan.

Sen vuoksi suoritettiin kokeita, jotta nähtäisiin 20 kinetiinin vaikutukset viljelmässä olevien ihmissolujen DNA-synteesiin käyttäen menetelmiä, jotka perustuvat "nuclear track"-autoradiografiaan ja happooniiukenematto-man materiaalin 3H-tymidiinin vastaanottoon.

Autoradiografiaa varten KIS-soluja kasvatettiin 25 steriloiduilla peitinlasikaistaleilla joko kinetiinin eri konsentraatioiden läsnä ollessa (40 - 200 μΜ) tai ilman sitä. Eri käsittelykestojen jälkeen viljelmiin lisättiin 3H-tymidiiniä [(1 pCi/ml) 3,7 x 104 Bq] joko lyhyeksi ajaksi (2 tuntia) jotta määritettäisiin tänä ajankohtana 30 syklissä olevien solujen lukumäärä, tai pitempiä ajanjak- V soja (24 - 48 tuntia) viljelmässä solusyklin S-faasiin s pääsemiseen kykenevien solujen lukumäärän arvioimiseksi.

Leimausajanjakson edettyä loppuun solut käsiteltiin va-kiomenetelmillä autoradiografiaa varten. Laskettiin aina-35 kin 500 solua käyttäen mikroskooppia, kussakin kaistalees- 111219 28 sa suoritettiin altistuksen jälkeen kehitys ja värjäys. Täten määritettiin jakautumissyklin läpikäyneiden solujen (jotka olivat ottaneet vastaan radioaktiivista tymidiiniä ja sisällyttäneet sen juuri syntetisoituun DNA:hansa, 5 tuottaen autoradiografisesti tummia ytimiä) ja syklin lä-pikäymättömien solujen %-osuus. Kinetiinillä käsitellyillä ja käsittelemättömillä soluilla havaittiin 2 tunnin ja pidemmän (24 - 48 tuntia) leimauksen jälkeen olevan kokeellisesti toisistaan erottumattomat syklin läpikäyneiden 10 ja läpikäymättömien solujen %-osuudet.

Samalla lailla arviot 3H-tymidiinin vastaanotosta kinetiinillä käsitellyillä ja käsittelemättömillä KIS-so-luilla joko 90 min tai 72 tunnin leimauksen jälkeen dpm:nä happooniiukenemattomasta materiaalista/106 solua mitattuna 15 tuikelaskurilla eivät osoittaneet DNA-synteesin stimuloi- tumista kinetiinillä käsiteltäessä.

Kuten esimerkissä I ilmaistaan, ovat useat toisistaan riippumattomat kokeet osoittaneet, ettei kinetiini indusoi mitään solujen lisäproliferaatiota ihmissoluvil-20 jelmissä. Tämän esimerkin kokeet osoittavat, ettei kinetiini stimuloi DNA-synteesiä tai aja soluja uusiin solu-sykleihin nopeammin kuin kontrollisolut tulevat tällaisiin sykleihin. Siten kinetiini ei muuta ihmissolujen kasvunopeuksia solutasolla.

. · 25 Esimerkki lii » »i

Kinetiinin vaikutus solumorfologiaan

Solujen morfologian ikäänliittyvät muutokset solujen sarja-aliviljelmien aikana on vanhenemisen tutkimukseen osallistuvien solubiologien hyvin tuntema ilmiö. Vil-30 jelmässä olevat nuoren ihmisen sidekudosemosolut ovat . ohuita, pitkiä, sukkulamaisia, ja ne ovat yhteenkasvun lähestyessä pakkautuneet tiiviisti järjestelmiksi. Vanhat solut, joilla takana on enemmän kuin 90 % elinkaaresta, ovat hyvin suurikokoisia, hyvin paljon litistyneitä, sään-35 nöttömän muotoisia, sisältävät paljon solurakkuloita ja 111219 29 sisältävät lukuisia nk. "jäännöskappaleita" ("residual bodies"), joilla on intensiivinen autofluoresenssi UV-sä-teillä viritettäessä fluoresenssimikroskoopilla tarkastellessa.

5 KIS-soluja, joita kasvatettiin kun läsnä oli 40 μΜ kinetiiniä ja ilman kinetiiniä, verrattiin morfologisesti tasolla PDL = 44. Kinetiinillä käsitellyillä soluilla ei ollut vanhoille soluille tyypillistä morfologiaa. Kinetiinillä käsitellyt solut eivät olleet merkittävästi suu-10 rikokoisempia kuin nuoret (esimerkiksi PDL = 14) solut, kun taas käsittelemättömät solut olivat. Kinetiinillä käsiteltyjen solujen sukkulamainen ulkonäkö säilyi suuressa määrin; ne eivät sijainneet epäsäännöllisissä paikoissa; eivätkä ne sisältäneet yhtä paljon solurakkuloita tai 15 jäännöskappaleita kinetiinillä käsittelemättömiin verrattuna. Tämä dramaattinen jonkin verran nuorekkaan ulkonäön säilyminen, jopa elämän viimeisten vaiheiden aikana, on merkittävä todiste kinetiinin todiste, konsentraatioilla luokkaa 10"6 - 10'4 M, viivyttää ikään liittyvien oireiden 20 alkamista.

Eräässä toisessa kokeiden sarjassa keksittiin, että solut, jotka jo olivat vanhentuneet (esimerkiksi PDL yli 40), voivat palautua morfologisesti jonkin verran nuorekkaampaan ulkonäköön kun kasvatusvällaineeseen lisättiin 25 eri konsentraatioita kinetiiniä. Palautumisen aste riippuu »· vanhuusiän äärimmäisyydestä, joka on saavutettu jo ennen kinetiinille altistamista, nuorempien solujen palautuessa pidemmälle, ja väliaineeseen lisätystä kinetiinikonsent- raatiosta ja kinetiinin läsnäoloajän pituudesta. Esimer- 30 kiksi kun kasvatusväliaineessa oli ollut 2-3 viikon ajan T 200 μΜ kinetiiniä, KIS-solut, joilla on takana yli 80 % « elinkaaresta (yli 40 PDL), alkoivat näyttää soluilta, joiden PDL =30-35.

"Vanhan" morfologian palautumisen nopeus kinetiinin 35 väliaineesta poistamisen jälkeen on yhä epävarmaa, mutta 111219 30 kokeet osoittavat, että se on paljon pienempi kuin palautuminen nuorempaan morfologiaan sen jälkeen kun kinetiiniä lisätään väliaineeseen.

Solusaanto ja koko 5 Yksi solun vanhenemisen parametri viljelmässä on solusaannon (ts. solujen lukumäärä yhteenkasvaneessa kerroksessa) aleneminen viljelmien saavuttaessa korkean iän. Tämä johtuu pääasiassa siitä seikasta, että solut muuttuvat vähitellen suuremmiksi iän mukaan. Sen vuoksi, jos 10 viljelypullojen pinta-ala pysyy samana, niin solujen lukumäärä pulloa kohden pienenee kun solut saavuttavat elinkaarensa loppupään, kun aika-ajoin valmistetaan aliviljel-mät. Yhtä KIS-solujen viljelmien sarjaa kasvatettiin valmistamalla aika-ajoin aliviljelmät ilman että väliaineissa 15 oli kinetiiniä. Toinen KIS-solujen viljelmien sarja käsiteltiin samalla tavalla paitsi, että väliaineisiin sisällytettiin 40 μΜ kinetiiniä. Käsittelemättömillä soluilla solusaanto pysyi lähes vakiona tasolla noin 1,5 xl06/25 cm2 kunnes PDL oli 43, ja aleni sitten tasolle noin 3,5 x 20 10s/25 cm2 kun PDL oli 48, jolloin kasvu pysähtyi. Käsitel lyillä soluilla solusaanto pysyi lähes vakiona tasolla noin 1,5 x 106/25 cm2, kunne PDL oli 48, ja aleni sitten tasoon noin 7 x 10s/25 cm2 kun PDL oli 49, jolloin kasvu päättyi. Tämä "nuorien" solujen solusaanto-ominaisuuden 25 säilyminen jopa elämän viimeisen vaiheen aikana kine-tiinillä käsitellyillä soluilla on hyvin merkittävää joidenkin vanhenemisen oireiden alkamisen viivyttämisessä ihmissoluissa kinetiinikäsittelyllä.

Vaikka tämä keksintö kuvataan tässä jonkinasteisel-30 la spesifisyydellä, ammattimiehet ymmärtävät kuvatun kek-V sinnön henkeen kuuluvat modifikaatiot ja muunnelmat. Myös tällaiset modifikaatiot ja muunnelmat on tarkoitettu seu-raaviin patenttivaatimuksiin kuuluviksi.

Claims (18)

111219

1. Menetelmä nisäkkään ihon kosmeettisen ulkonäön parantamiseksi, tunnettu siitä, että levitetään 5 nisäkkään iholle koostumusta, joka sisältää tehokkaan määrän 6-(substituoitua amino)puriinisytokiniiniä, jolla on kaava n R, N 10 i jC') <n 15 jossa Ri on furfuryyli, fenyyli, bentsyyli, n-alkyyli, jossa on 4, 5 tai 6 hiiliatomia, (sykloheksyyli)metyyli, 3-hydroksimetyyli-3-metyyliallyyli tai 3,3-dimetyyliallyyli; jolloin levitetty määrä on riittävä parantamaan nisäkkään ihon kosmeettista ulkonäköä, mutta ei merkittävästi muuta 20 nisäkkään ihon kasvunopeutta ja proliferatiivista kokonaiskapasiteettia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nisäkkään iho on ihmisen iho; jolloin koostumus on formuloitu nisäkkään ihon pinnalle !!' 25 levitettäväksi ihonpesunesteeksi, voiteeksi, ihovoiteeksi, kiinteäksi puikoksi tai suihkeeksi; ja jolloin parannus kosmeettisessa ulkonäössä ilmenee ryppyjen lukumäärän tai syvyyden vähenemisenä nisäkkään ihossa tai ryppyjen kehittymisen viivästymisenä nisäkkään ihossa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, .·. tunnettu siitä, että Ri on furfuryyli tai 3- hydroksimetyyli-3-metyyliallyyli.

4. Patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että levitettävä määrä on noin 35 0,2 - 1000 ppm. 111219

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että levitettävä määrä on noin 0,5 - 500 ppm.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että levitettävä määrä on noin 10 - 100 ppm.

7. Koostumus, joka on sopiva levitettäväksi paikallisesti ihmisen iholle ihmisen ihon kosmeettisen ulkonäön parantamiseksi, tunnettu siitä, että 10 koostumus, sisältää tehokkaan määrän 6-(substituoitua amino)-puriinisytokiniiniä, jolla on kaava H .Ri 15 (I) N N H jossa Ri on furfuryyli, fenyyli, bentsyyli, n-alkyyli, 20 jossa on 4, 5 tai 6 hiiliatomia, (sykloheksyyli)metyyli, 3-hydroksimetyyli-3-metyyliallyyli tai 3,3-dimetyyliallyyli; jolloin määrä on riittävä parantamaan ihmisen ihon kosmeettista ulkonäköä, mutta ei merkittävästi muuta ihmisen ihon kasvunopeutta ja proliferatiivista I* 25 kokonaiskapasiteettia.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että koostumus on formuloitu ihmisen ihon pinnalle levitettäväksi ihonpesunesteeksi, voiteeksi, ihovoiteeksi, kiinteäksi puikoksi tai 30 suihkeeksi; jolloin parannus kosmeettisessa ulkonäössä ·’ ilmenee ryppyjen lukumäärän tai syvyyden vähenemisenä nisäkkään ihossa tai ryppyjen kehittymisen viivästymisenä nisäkkään ihossa.

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että Ri on furfuryyli tai 3- hydroksimetyyli-3-metyyliallyyli. 111219

10. Patenttivaatimuksen 7-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrä on noin 0,2 - 1000 ppm.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrä on noin 0,5 - 500 ppm.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrä on noin 10 - 100 ppm.

13. Menetelmä nisäkässoluviljelmän käsittelemiseksi normaalisti nisäkässolujen ikääntymisen ohessa tapahtuvien morfologisten muutosten hidastamiseksi tai viivyttämiseksi, 10 tunnettu siitä, että annostellaan viljelmään tehokas määrä 6-(substituoitua amino)puriinisytokiiniä, jolloin 6-(substituoitudulla amino)puriinisytokiniinilla on kaava H. ^Rl

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että nisäkässolut ovat side- kudosemosoluja.

15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Ri on furfuryyli tai 3-hydroksimetyyli-3-metyyliallyyli. 111219

15 N ^ (I) L L) 20 jossa Ri on furfuryyli, fenyyli, bentsyyli, n-alkyyli, jossa on 4, 5 tai 6 hiiliatomia, (sykloheksyyli)metyyli, 3-hydroksimetyyli-3-metyyliallyyli tai 3,3-dimetyyliallyyli; ja jolloin annosteltu määrä on riittävä hidastamaan ja ’} 25 viivyttämään normaalisti nisäkässolujen ikääntymisen ohessa tapahtuvia morfologisia muutoksia, mutta ei merkittävästi muuta ihmisen ihon kasvunopeutta ja proliferatiivista kokonaiskapasiteettia.

16. Patenttivaatimuksen 13 - 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että annosteltava määrä on noin 0,2 - 1000 ppm.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että annosteltava määrä on noin 0,5 - 500 ppm.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että annosteltava määrä on noin 10 - 100 ppm. 111219