DE69734661T2

DE69734661T2 - Foerderung der wundheilung durch chemisch modifizierte tetracycline

Info

Publication number: DE69734661T2
Application number: DE69734661T
Authority: DE
Inventors: S. Nungavaram RAMAMURTHY; M. Lorne GOLUB; F. Thomas MCNAMARA
Original assignee: Research Foundation of State University of New York
Current assignee: Research Foundation of State University of New York
Priority date: 1996-08-01
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2017-08-02
Also published as: CA2261805A1; JP2000516214A; US5827840A; EP0923378A1; EP0923378B1; KR20000029753A; DK0923378T3; AU3823497A; ATE309804T1; KR100494206B1; EP0923378A4; CA2261805C; ES2255107T3; DE69734661D1; WO1998005340A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Tetracyclinen für die Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Wundheilung. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von chemisch modifizierten Tetracyclinen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Wundheilung von akuten oder nicht-chronischen Wunden bei Subjekten, deren Wundheilung beeinträchtigt ist.
Die medizinische Bedeutung der Wundheilung kann nicht überbewertet werden. Sie ermöglicht es uns, traumatische Verletzungen, chirurgische Eingriffe und Wunden aufgrund von mikrobiellen oder anderen physikalischen oder chemischen Mitteln zu überwinden. Die Fähigkeit zur Wundheilung ist für den Menschen von zentraler Bedeutung. Herkömmlicherweise ist man der Auffassung, dass ein Haupthindernis bei der Wundheilung in Infektionen durch Bakterien und andere Mikroorganismen besteht. Diesbezüglich wurden chemische und physikalische Barrieren gegen Infektionen entwickelt und eingesetzt. Chemische Barrieren umfassen allgemeine antiseptische Mittel und Verfahren, wobei Lister und andere Personen Pionierarbeit geleistet haben. Bei der chemischen Hemmung von Mikroorganismen hat mit der Entwicklung von Antibiotika ein neues Zeitalter begonnen. Diese können topisch eingesetzt werden, eignen sich aber auch zur Verabreichung an Menschen und Tiere auf verschiedenen systemischen Wegen. Physikalische Barrieren greifen im Gegensatz dazu die mikrobiellen Elemente nicht an, sondern behindern deren physikalischen Zutritt zu Wunden, wobei sie die Wunden gegen Infektionen schützen, aber auch einen Schutz gegen erneute Verletzungen bieten. Es fand auch eine kombinierte Anwendung von chemischen und physikalischen Barrieren statt, z. B. durch Einverleibung eines Antibiotikums in einen Wundverband.
Eine besonders erfolgreiche Klasse von Antibiotika sind die Tetracycline. Diese Verbindungen, wie Tetracyclin, Sporocyclin und dergl., stellen Antibiotika mit einem breiten Wirkungsspektrum dar, die sich zur Verwendung gegen eine Vielzahl von Bakterien eignen. Die Ausgangsverbindung Tetracyclin weist die folgende allgemeine Strukturformel auf
Nachstehend wird das Nummerierungssystem für den Kern mit mehreren Ringen angegeben:
Tetracyclin sowie das 5-OH-Derivat (Terramycin) und das 7-Cl-Derivat (Aureomycin) kommen in der Natur vor und stellen bekannte Antibiotika dar. Natürliche Tetracycline können ohne Verlust ihrer antibiotischen Eigenschaften modifiziert werden, obgleich hierfür bestimmte Elemente der Struktur erhalten bleiben müssen. Die Modifikationen, die an der grundlegenden Tetracyclinstruktur vorgenommen werden können oder nicht, werden in einem Übersichtsartikel von Mitscher (1978) beschrieben. Gemäß Mitscher können Modifikationen an den Positionen 5–9 des Tetracyclin-Ringsystems vorgenommen werden, ohne dass ein vollständiger Verlust der antibiotischen Eigenschaften eintritt. Jedoch führen Veränderungen an der Grundstruktur des Ringsystems oder ein Ersatz von Substituenten in den Positionen 1–4 oder 10–12 im allgemeinen zu synthetischen Tetracyclinen mit einer erheblich geringeren oder im wesentlichen gar keinen antibakteriellen Aktivität. Beispielsweise wird 4-Dedimethylaminotetracyclin im allgemeinen als nicht-antibakterielles Tetracyclin angesehen.
Die Verwendung von Tetracyclin-Antibiotika ist zwar im allgemeinen bei der Behandlung von Infektionen wirksam, kann aber zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Beispielsweise kann die Langzeitverabreichung von antibiotischen Tetracyclinen gesunde Flora verringern oder beseitigen, z. B. die Darmflora, und kann zur Bildung von antibiotisch resistenten Organismen oder zum übermäßigen Wachstum von Hefen und Pilzen führen.
Antibakterielle Tetracycline können enteral oder parenteral verabreicht werden, sie können aber auch topisch als Inhibitoren von bakteriellem Wachstum verwendet werden. Derartige Verbindungen und andere Antibiotika werden in Verbindung mit physikalischen Barrieren, wie Bandagen, verwendet.
Die US-Patentschrift 5 229 380 betrifft ein Verfahren, mit dem Zwölffingerdarm- und Magengeschwüre und chronische Gastritis zum Stillstand gebracht und behandelt werden können, wobei eine wirksame Menge an [4S-(4α,4aα,5aα,12aα)]-4,7-Bis-(dimethylamino)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydro-3,10,12,2a-tetrahydroxy-1,11-dioxo-2-naphthacencarboxamid-monohydrochlorid verabreicht wird.
Berg et al. beschreiben im US-Patent 4 841 962 die Verwendung von Antibiotika und anderen Typen von chemischen Mitteln in Wundverbänden. Beispielsweise schlagen Berg et al. vor, Tetracyclin einer Kollagenmatrix, die an einem Verband haftet, einzuverleiben, um es an einer Wundstelle freizusetzen. Die Literaturstelle Berg et al. enthält jedoch keine Beschreibung oder einen Hinweis über die Verwendung von Tetracyclin für andere als antibiotische Zwecke. Ferner findet sich darin keine Offenbarung über eine Verhinderung des Kollagenabbaus bei der Heilung von Wunden.
Weitere Beispiele für antibakterielle Mittel, die Wundverbänden einverleibt werden, sind beispielsweise aus dem US-Patent 5 081 106 (Bentley et al.) bekannt, worin Kollagen-Gelatine-Verbände mit einem Gehalt an Iod beschrieben sind, sowie aus US-Patent 5 227 168 (Chvapil et al.), worin ein Kollagen-Verband mit einem Gehalt an stabilisierten Chlorverbindungen beschrieben ist.
Das US-Patent 4 950 483 (Ksander et al.) erläutert die Verwendung einer implantierbaren Wundheilungsmatrix, die aus Kollagenfibrillen gebildet ist, die ein Antibiotikum oder ein anderes biologisch aktives Mittel, wie FGF oder TGF-β, enthalten können. Ksander et al. geben an, dass sich die Matrix selbst zur Förderung der Gewebereparatur eignet. Verwiesen wird auch auf die US-Patente 5 024 841 und 5 110 604 (Chu et al.). Weitere US-Patente beschreiben weitere Verfahren und Produkte zum Implantieren von Kollagen in Wunden, um die Heilung zu erleichtern, z. B. US-Patent 4 837 024 (Michaeli).
Obgleich die Verhinderung von bakteriellen Infektionen bei Wunden wichtig ist, ist die Reparatur des verletzten Gewebes von wesentlicher Bedeutung, da selbst die reinste Wunde eine Wunde bleibt, wenn keine Rekonstruktion unter Bildung von intaktem neuem Gewebe erfolgt. Die an der Reparatur von Hautwunden beteiligten Verfahren sind bekanntermaßen komplex (vergl. Clark, 1993). Es sind mehrere getrennte, jedoch überlappende Vorgänge beteiligt, einschließlich Entzündung, Bildung von neuem Gewebe und Remodellierung der darunter liegenden extrazellulären Bindegewebematrix (ECM). Der Vorgang der Bildung von neuem Gewebe umfasst Vorgänge der Reepithelisierung, um rasch die schützende Barriere der Haut gegen eine bakterielle Invasion wieder herzustellen, sowie die Bildung von Granulationsgewebe, ein facettenreicher Vorgang, der tiefer im Gewebe abläuft und längere Zeit benötigt, bis er eingeleitet und beendet wird.
Kollagen stellt die Hauptkomponente von Bindegewebematrices dar, nicht nur in der Haut, sondern auch in anderen Geweben, wie Knochen, Synovialhaut, Auge, Sehnen, Knorpel und Zahnfleisch. Die Abscheidung und Anreicherung von Kollagen während der akuten Wundheilung beginnt mit dem Einsetzen der Bildung von Granulationsgewebe und setzt sich über die gesamte ausgedehnte Phase der Matrixremodellierung fort. Jedoch ist die Entfernung von Kollagen zum frühen Zeitpunkt beim Wundreparaturvorgang für das Debridement der Wunde und für die Vorbereitung einer einwandfreien Rekonstruktion der Epidermis wesentlich. Der Abbau von Kollagen wird durch Säugetier-Kollagenase, eine gut charakterisierte Matrix-Metalloproteinase vermittelt, die bald nach Auftreten einer Wunde erzeugt wird (Inoue et al., 1995). Somit gilt die kollagenolytische Aktivität als ein normales Merkmal der akuten Wundreparatur. Tatsächlich hat es auf den ersten Blick den Anschein, dass ungewöhnlich hohe Grade des Kollagen-Abbaus beim Debridement und bei der Remodellierung von Geweben, die sich von einer dermalen Beeinträchtigung erholen, günstig sind. Man weiß jedoch, dass die Erzeugung von Kollagenase auch im Übermaß erfolgen kann.
Kürzlich wurde eine neue Klasse von Verbindungen definiert, die strukturell mit antibiotischen Tetracyclinen verwandt sind, bei denen jedoch durch chemische Modifikation die antibiotische Aktivität im wesentlichen oder vollständig beseitigt worden ist. Es wurde festgestellt, dass diese als chemisch modifizierte Tetracycline (CMTs) bekannten Verbindungen eine Anzahl von interessanten Eigenschaften besitzen, z. B. bewirken sie in vivo eine Hemmung von übermäßiger kollagenolytischer Aktivität (vergl. beispielsweise Golub et al., 1991; Ryan et al., 1996).
Ein Vorschlag zur Verwendung von CMTs bei der Unterstützung der Heilung von chronischen Wunden wurde im US-Patent 4 704 383 (McNamara et al.) gemacht. In dieser Druckschrift wird angegeben, dass Tetracycline bei der Behandlung von ulzerativen Läsionen, wie Decubitus-Geschwüren, diabetischen Geschwüren und Epidermolysis bullosa, topisch auf die Haut aufgetragen werden können. Eine derartige Anwendung ist mit der Wirkung von Tetracyclinen als Inhibitoren von übermäßiger Kollagenase-Aktivität bei Zuständen, bei denen eine derartige übermäßige Aktivität festgestellt wird, verwandt. Die in der Druckschrift von McNamara et al. erwähnten chronischen Geschwüre sind typisch für Geschwüre, die sich aufgrund einer übermäßigen kollagenolytischen Aktivität ergeben oder dieser zuzuschreiben sind. Derartige Geschwüre heilen nicht spontan, wobei eine normale Heilungsgeschwindigkeit nicht im entferntesten erreicht wird und häufig überhaupt keine Heilung erfolgt. Mit Sicherheit ermöglicht eine Langzeitanwendung von Antibiotika bei diesen Bedingungen eine Heilung an sich, was unterstreicht, dass eine mikrobielle Hemmung zwar einen wichtigen Gesichtspunkt darstellt, dass aber Antibiotika die zugrundeliegenden Mechanismen (des Wirtsstoffwechsels), durch die das ulzerierte Gewebe repariert wird, nicht fördern. Obgleich CMTs offensichtlich bei der Behandlung von Wunden, die sich aufgrund einer übermäßigen kollagenolytischen Aktivität ergeben, wertvoll sind, ist aus dem Patent von McNamara et al. nicht ersichtlich, ob die Verwendung von CMTs überhaupt bei akuten Wunden, die durch andere Ursachen herbeigeführt werden, geeignet ist. Auch finden sich in dieser Druckschrift keine Hinweise darauf, dass eine Hemmung der kollagenolytischen Aktivität von Nutzen bei anderen Typen von Wunden sein könnte.
Das US-Patent 5 196 196 (Scott et al.) beschreibt die Verwendung von Protease-Inhibitoren, die von Bindegewebszellen sezerniert werden, in Wundverbänden als Mittel zur Regulation der Aktivität von Enzymen (Serinproteasen), die bei der Remodellierung oder Zerstörung von Geweben beteiligt sind. Derartige Inhibitoren benötigen aber rekombinante Techniken zu ihrer Identifizierung und komplizierte biotechnologische Vorgänge zu ihrer Erzeugung, weswegen ihre Herstellung mit erheblichen Kosten verbunden ist.
Im Hinblick auf die vorstehenden Überlegungen ist klar ersichtlich, dass die gemäß dem Stand der Technik eingesetzten Verfahren zur Förderung der Heilung von akuten traumatischen Wunden auf eine Anzahl von Wegen begrenzt sind. Beispielsweise gibt es gemäß dem Stand der Technik keine wirksamen Maßnahmen zur Förderung physiologischer Vorgänge, die bei der Heilung von akuten traumatischen Wunden, wie Risswunden, Abschürfungen und Schnitten, beteiligt sind. Demzufolge besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, die vorstehenden Einschränkungen in der medizinischen Praxis zu überwinden, indem ein Weg zur Förderung der Heilung von akuten oder nicht-chronischen Wunden bereitgestellt wird.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Es wurde nunmehr festgestellt, dass diese und weitere Ziele erfindungsgemäß erreicht werden können. Erfindungsgemäß wird die Verwendung (Benutzung) einer Tetracyclinverbindung zur Herstellung eines Medikaments zum Fördern der Wundheilung der Haut und anderen epithelisierten oder mukosalen Geweben bereitgestellt. Demzufolge wird erfindungsgemäß die Verwendung einer Tetracyclinverbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Wundheilung bei einem Säuger mit einer akuten traumatischen Wunde in einem epithelisierten Gewebe bereitgestellt, wobei die Tetracyclinverbindung in einer Menge benutzt wird, die im wesentlichen keine antibakterielle Aktivität aufweist, jedoch die Wundheilung beim Subjekt wirkungsvoll verbessert.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist es bevorzugt, dass die Tetracyclinverbindung im wesentlichen nicht systemisch absorbiert wird. Zu bevorzugten Tetracyclinverbindungen gehören beispielsweise CMT-2 (Tetracylinonitril) und CMT-6 (4-Hydroxy-4-dedimethylaminotetracyclin). Eine bevorzugte Verwendung beinhaltet die Verabreichung der Tetracyclinverbindung auf topischem Wege auf epithelisiertes oder mukosales Gewebe. Außerdem wird die Tetracyclinverbindung zur Herstellung des Medikaments zusammen mit einer entzündungshemmenden Menge eines nicht-steroidalen, entzündungshemmenden Arzneistoffes verwendet.
In einem bevorzugten Fall weist der Säuger ein beeinträchtigtes Wundheilungsvermögen im epithelisierten Gewebe auf und das Medikament verbessert das Wundheilungsvermögen beim Säuger, und zwar bis zu Niveaus, die in der Population als normal angesehen werden, oder auch darüber hinaus. In diesem Fall ist die beeinträchtigte Wundheilung typischerweise durch eine erhöhte proteolytische Aktivität in der Haut oder einem anderen epithelisierten Gewebe des Subjekts charakterisiert. Die erhöhte proteolytische Aktivität kann die Folge einer erhöhten kollagenolytischen Aktivität und/oder einer erhöhten gelatinolytischen Aktivität sein.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird erfindungsgemäß die Verwendung einer Tetracyclinverbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Vermehrung des Kollagens im epithelisierten Gewebe mit einer akuten Wunde bereitgestellt, wobei die Tetracyclinverbindung in einer Menge in das epithelisierte Gewebe eingebracht wird, die im wesentlichen keine antibakterielle Aktivität aufweist, die jedoch ausreichend ist, um den Kollagengehalt im epithelisierten Gewebe zu erhöhen.
Bei dieser Ausführungsform beinhaltet die erfindungsgemäße Verwendung einer Tetracyclinverbindung das Einbringen einer Tetracyclinverbindung in die Haut oder ein anderes epithelisiertes Gewebe in einer Menge, die im wesentlichen keine antibakterielle Aktivität aufweist, die jedoch ausreichend ist, den Kollagengehalt des epithelisierten Gewebes zu erhöhen, um das Kollagen oder Bindegewebe, das aufgrund der Verletzung verloren gegangen ist, zu ersetzen. Das Medikament kann zur Erhöhung des Kollagenspiegels in der Haut oder anderen epithelisierten Geweben eines Subjekts mit abnormal niedrigem Kollagenspiegel in seinem Gewebe verwendet werden.
Erfindungsgemäß wird ferner ein Wundverband zur Heilung einer akuten traumatischen Wunde der Haut oder eines anderen epithelisierten Gewebes bereitgestellt. Der Wundverband umfasst folgendes: eine Trägergrundlage und eine Tetracyclinverbindung in einer Menge, die im wesentlichen keine antibakterielle Aktivität aufweist, die jedoch ausreicht, die Heilung des epithelisierten Gewebes zu fördern. Der Wundverband kann ferner einen nicht-steroidalen entzündungshemmenden Arzneistoff in einer Menge, die ausreicht, die Entzündung im epithelisierten Gewebe zu hemmen, enthalten.
Diese und weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der ausführlichen Beschreibung und den Beispielen, die nachstehend vorgelegt werden. Die ausführliche Beschreibung und die Beispiele fördern das Verständnis der Erfindung, sind jedoch nicht als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung zu verstehen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Akte dieses Patents enthält mindestens eine Farbzeichnung. Kopien dieses Patents mit einer oder mehreren Farbzeichnungen werden vom Patentamt auf Anforderung und nach Entrichtung der erforderlichen Gebühr bereitgestellt.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung wurden im Hinblick auf die Erläuterung und die Beschreibung der Erfindung ausgewählt, sollen aber in keiner Weise den Schutzumfang der Erfindung beschränken. Die bevorzugten Ausführungsformen bestimmter Aspekte der Erfindung werden in der beigefügten Zeichnung dargestellt.
1 ist ein Computer-Abtastdiagramm eines PAGE-Gels zur Darstellung des Einflusses einer Tetracyclin (CMT-6)-Behandlung auf die Kollagenase-Aktivität bei der Wundheilung, bestimmt unter Verwendung von [³H-Methyl]-Kollagen als Substrat.
2 ist ein Fluorogramm eines PAGE-Gels zur Darstellung des Einflusses einer Tetracyclin (CMT-2)-Behandlung auf die Kollagenase-Aktivität bei der Wundheilung, bestimmt unter Verwendung von [³H-Methyl]-Kollagen als Substrat.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung ist auf die Förderung der Heilung von akuten traumatischen Wunden in epithelisierten Geweben abgestellt. Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Tetracyclinverbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Wiederherstellung oder Verbesserung der Heilung von akuten traumatischen Wunden der Haut und anderer epithelisierter Gewebe. Bei den verwendeten Tetracyclinverbindungen handelt es sich vorzugsweise um chemisch modifizierte Tetracycline, die im allgemeines ein geringes oder gar kein antimikrobielles Vermögen aufweisen. Jedoch können erfindungsgemäß auch subantibakterielle Dosen von typischerweise antibakteriellen Tetracyclinen verwendet werden.
Das erfindungsgemäß unter Verwendung einer Tetracyclinverbindung hergestellte Medikament eignet sich zur Verwendung für die Förderung der Heilung von akuten traumatischen Wunden bei Säugern. Akute traumatische Wunden treten typischerweise plötzlich auf, z. B. in Form von Läsionen bei einer traumatischen Schädigung. Die Klasse von Wunden, die einer Behandlung durch das erfindungsgemäß unter Verwendung einer Tetracyclinverbindung hergestellten Medikaments zugänglich ist, umfasst akute traumatische Wunden, die einer Primärheilung unterliegen, und akute traumatische Wunden, die einer Sekundärheilung unterliegen. Somit eignet sich das unter erfindungsgemäßer Verwendung einer Tetracyclinverbindung hergestellte Medikament zur Besserung der Heilung von Wunden, die einer Primärheilung unterliegen, die durch Wundheilung ohne Granulationsbildung charakterisiert sind. Typisch für derartige Wunden sind chirurgische Schnitte. Das Medikament eignet sich auch zur Unterstützung der Heilung von Wunden, die einer Sekundärheilung unterliegen, d. h. Wunden, bei denen die Heilung durch Granulationsbildung charakterisiert ist. Wunden mit Sekundärheilung sind beispielsweise Risse, Stiche, Abschürfungen und dergl. Die akuten traumatischen Wunden, die erfindungsgemäß behandelbar sind, können auch als "nicht-chronische" Wunden bezeichnet werden.
Wunden, die im allgemeinen als "chronisch" oder von langer Dauer und/oder spontanen oder nicht-traumatischen Ursprungs sind, fallen nicht unter den Umfang der Erfindung. Beispielsweise ist das erfindungsgemäß unter Verwendung einer Tetracyclinverbindung hergestellte Medikament nicht für ulzerative Läsionen oder Erosionen, wie Decubitus-Geschwüre (Durchliegen), diabetische Geschwüre, Epidermolysis bullosa und sterile korneale Geschwüre oder dergl., bestimmt.
Das erfindungsgemäß unter Verwendung einer Tetracyclinverbindung hergestellte Medikament fördert die Heilung von geschnittener, gerissener, perforierter oder abgeschürfter Haut (Cutis) bei dem der Behandlung unterliegenden Subjekt. Epidermale, dermale und darunter liegende subkutane Gewebe können bei derartigen akuten kutanen oder mukosalen Wunden beteiligt sein und die Heilung lässt sich bei beliebigen oder sämtlichen dieser Gewebetypen erfindungsgemäß verbessern. Ferner kann das Medikament zur Besserung der Heilung anderer epithelisierter Gewebe verwendet werden, z. B. von beliebigen Geweben, bei denen eine Epithelschicht verletzt ist, entweder mit oder ohne Verletzung der darunter liegenden Stütz- oder Bindegewebe. Der Ausdruck "epithelisiertes Gewebe" wird allgemein auf Haut oder beliebige andere Gewebe angewandt, die ein Epithel (dieser Ausdruck wird in der herkömmlichen Bedeutung verwendet) aufweisen oder damit verbunden sind. Weitere Gewebe innerhalb der Bedeutung des Ausdrucks "epithelisierte Gewebe" (und somit für die erfindungsgemäße Behandlung geeignet) umfassen (ohne Beschränkung hierauf) mukosale Gewebe in der Mundhöhle und anderen Körperhöhlen. Funktionell eignet sich das Medikament zur Behandlung beliebiger, akut traumatisierter Körpergewebe, bei denen die Hemmung der kollagenolytischen Aktivität bei der Besserung der Heilung des Gewebes von Vorteil ist.
Die erfindungsgemäß behandelbaren Zustände treten bei Säugetiersubjekten auf. Säuger umfassen beispielsweise Menschen, sowie Haustiere, wie Hunde und Katzen, Labortiere, wie Ratten und Mäuse, und landwirtschaftlich genutzte Tiere, wie Pferde und Rinder.
Zu den Vorteilen des erfindungsgemäß unter Verwendung einer Tetracyclinverbindung hergestellten Medikaments gehört die Verwendungsmöglichkeit zur Verbesserung der Integrität der heilenden Haut durch Verringerung der Granulationsmenge während des Heilungsvorgangs. Eine Granulation ist durch die Bildung von kleinen, abgerundeten Gewebemassen in den Wunden charakterisiert, die weitgehend aus Kapillaren und Fibroblasten bestehen, wobei häufig gleichzeitig entzündliche Zellen vorhanden sind. Somit lässt sich überschüssiges Narbengewebe vermindern, wobei sich gleichzeitig eine verringerte Entstellung oder Verzerrung der Haut, die mit der Narbenbindung verbunden ist, ergibt.
Die erfindungsgemäße Verwendung einer Tetracyclinverbindung zur Herstellung eines Medikaments beinhaltet die Verwendung der Tetracyclinverbindung in einer Menge, die im wesentlichen keine antibakterielle Aktivität aufweist, jedoch die Heilung einer akuten traumatischen Wunde in einem epithelisierten Gewebe verbessert. Vorzugsweise ist die Tetracyclinverbindung chemisch so modifiziert, dass ihre antimikrobiellen Eigenschaften verringert oder beseitigt sind. Verfahren zur Verringerung der antimikrobiellen Eigenschaften von Tetracyclinen werden von Mitscher (1978) beschrieben. Wie Mitscher betont, führt eine Modifikation von Tetracyclin in den Positionen 1, 2, 3, 4, 10 oder 12a zu einem Verlust von antibiotischer Aktivität. Die Verwendung von derartigen, chemisch modifizierten Tetracyclinen wird erfindungsgemäß bevorzugt, da sie in höheren Konzentrationen als antimikrobielle Tetracycline verwendet werden können, während bestimmte Nachteile, wie ein unterschiedsloses Abtöten von wertvollen Mikroorganismen und das Auftreten von resistenten Mikroorganismen, Nachteile, die häufig mit der Verwendung von antimikrobiellen oder antibakteriellen Mengen derartiger Verbindungen verbunden sind, vermieden werden.
Bei den bevorzugten, chemisch modifizierten Tetracyclinen handelt es sich um solche Produkte, denen die Dimethylaminogruppe in der Position 4 der Ringstruktur fehlt. Zu derartigen chemisch modifizierten Tetracyclinen gehören beispielsweise 4-Dedimethylaminotetracyclin (CMT-1), 4-Dedimethylamino-5-oxytetracyclin, 4-Dedimethylamino-7-chlortetracyclin (CMT-4), 4-Hydroxy-4-dedimethylaminotetracyclin (CMT-6), 5a,6-Anhydro-4-hydroxy-4-dedimethylaminotetracyclin, 6-Demethyl-6-desoxy-4-dedimethylaminotetracyclin (CMT-3), 4-Dedimethylamino-12a-desoxytetracyclin (CMT-7) und 6-α-Desoxy-5-hydroxy-4-dedimethylaminotetracyclin (CMT-8). Ferner eignen sich Tetracycline, die in der 2-Kohlenstoffposition modifiziert sind, zur Herstellung eines Nitrils, wie Tetracyclinonitril, als antibakterielle, Antimetalloproteinase-Mittel.
Zu weiteren Beispielen für Tetracycline, die im Hinblick auf eine verringerte antimikrobielle Aktivität modifiziert sind, gehören 6-α-Benzylthiomethylentetracyclin, das mono-N-alkylierte Amid von Tetracyclin, 6-Fluor-6-demethyltetracyclin oder 11α-Chlortetracyclin.
Ein besonders bevorzugtes CMT ist 4-Hydroxy-4-dedimethylaminotetracyclin (hier als CMT-6 bezeichnet), von dem festgestellt wurde, dass es in signifikanter Weise den Kollagengehalt in heilenden Wunden verbessert. Ein weiteres, hochgradig bevorzugtes CMT ist Tetracyclinonitril (CMT-2), das offensichtlich noch wirksamer bei der Wundheilung ist. Tatsächlich werden CMT-2 und CMT-6 bei der Einnahme nicht in erheblichem Maße im Blutkreislauf resorbiert und unterliegen im allgemeinen einer begrenzten biologischen Verteilung. CMT-2, CMT-6 und weitere CMTs, die eine derartige, im wesentlichen lokale Verteilung aufweisen, werden wegen ihrer lokalisierten Wirksamkeit bei der Hemmung der kollagenolytischen Aktivität an einer Verletzungsstelle, ohne dass sie eine breitere systemische Hemmung der proteolytischen Aktivität bewirken, bevorzugt. Beispielsweise wäre eine topische Anwendung dieser nicht-resorbierbaren CMTs bei oralen Läsionen erstrebenswert, da die CMTs auch nach dem Schlucken nicht in einem signifikanten Umfang resorbiert würden.
Erfindungsgemäß können auch Tetracyclinverbindungen verwendet werden, die eine antibakterielle Aktivität besitzen. Jedoch werden derartige Verbindungen in Mengen verwendet, die im wesentlichen keine antibakterielle Wirkung besitzen, die aber eine Besserung der Heilung von akuten traumatischen Wunden im epithelisierten Gewebe bewirken. Zu bevorzugten Verbindungen dieses Typs gehören Tetracyclin, Doxycyclin, Demeclocyclin und Minocyclin.
Die erfindungsgemäß zur Herstellung eines Medikaments verwendeten Tetracyclinverbindungen weisen offensichtlich ihre günstige Wirkung in dosisabhängiger Art und Weise auf. Es wurde nämlich beobachtet, dass innerhalb breiter Grenzen eine Verabreichung größerer Mengen einer Tetracyclinverbindung die Wundheilung in höherem Maße bessert, als dies bei Verabreichung einer geringeren Menge der Fall ist. Außerdem wurde eine Wirksamkeit in Dosierungen, die unter der Konzentration liegt, bei der eine toxische Wirkung festgestellt wird, beobachtet.
Bei der erfindungsgemäß verwendeten Menge der Tetracyclinverbindung handelt es sich um eine Menge, die antikollagenolytisch wirksam ist, ohne antimikrobiell wirksam zu sein. Eine Menge einer Tetracyclinverbindung ist dann antikollagenolytisch wirksam, wenn sie in signifikanter Weise die kollagenolytische Aktivität verringert. Eine Tetracyclinverbindung ist nicht antimikrobiell wirksam, wenn sie in signifikanter Weise das Wachstum von Mikroorganismen verhindert.
Die maximale Dosierung für ein Subjekt ist die höchste Dosierung, die keine unerwünschten oder unverträglichen Nebenwirkungen hervorruft. Beispielsweise kann die Tetracyclinverbindung in einer Menge von etwa 0,1 mg/kg/Tag bis etwa 30 mg/kg/Tag und vorzugsweise von etwa 1 mg/kg/Tag bis etwa 18 mg/kg/Tag verabreicht werden. Für die erfindungsgemäßen Zwecke umfassen Nebenwirkungen eine klinisch signifikante, antimikrobielle oder antibakterielle Aktivität sowie toxische Wirkungen. Beispielsweise würde eine Dosis von mehr als etwa 50 mg/kg/Tag wahrscheinlich Nebenwirkungen bei den meisten Säugern, einschließlich Menschen, hervorrufen. Auf jeden Fall stützt sich der Arzt auf das einschlägige Fachwissen. Die Erfindung umfasst ohne Einschränkungen Dosierungen, die zur Erzielung der beschriebenen Erscheinungen wirksam sind.
Eine topische Anwendung von Tetracyclinverbindungen in Mengen bis zu etwa 25% (Gew./Gew.) in einem Träger eignet sich daher je nach der Indikation. Insbesondere wird angenommen, dass eine Anwendung von Tetracyclinverbindungen in Mengen von etwa 0,1 bis etwa 10% in wirksamer Weise die erfindungsgemäße Heilung fördert. Es wird angenommen, dass diese Mengen keine signifikante Toxizität bei dem behandelten Subjekt herbeiführen.
Erfindungsgemäß kommt eine kombinierte oder koordinierte topische und systemische Verabreichung der Tetracyclinverbindungen in Betracht. Beispielsweise kann eine nicht-resorbierbare Tetracyclinverbindung, wie CMT-2 oder CMT-6, topisch verabreicht werden, während eine Tetracyclinverbindung, die zu einer erheblichen Resorption und wirksamen systemischen Verteilung im Subjekt befähigt ist, wie CMT-1, CMT-3, CMT-7 oder CMT-8, systemisch verabreicht wird.
Die Tetracyclinverbindung kann auch zusammen mit einem Mittel verabreicht werden, das zur Hemmung einer Entzündung im Gewebe, bei dem eine akute traumatische Wunde vorliegt, befähigt ist. Zu bevorzugten entzündungshemmenden Mitteln, die zur gemeinsamen Verabreichung geeignet sind, gehören nicht-steroidale, entzündungshemmende Arzneistoffe (NSAIDs). Das NSAID kann aus den verschiedenen Klassen derartiger Verbindungen ausgewählt werden. Zu derartigen Klassen gehören beispielsweise Salicylate, wie Acetylsalicylsäure und Diflunisal; Essigsäuren, wie Indomethacin, Sulindac, Tolmetin, Diclofenac und Etodolac; Propionsäuren, wie Flurbiprofen, Naproxen und Ketoprofen; und Fenamate, wie Meclofenamat; und Oxicame, wie Piroxicam. Im allgemeinen handelt es sich bei der Menge des NSAID um eine Menge, die zur Hemmung der Entzündung im betroffenen Gewebe ausreichend ist. Die entzündungshemmende Menge hängt von dem verwendeten NSAID und von anderen ersichtlichen Faktoren ab und lässt sich vom erfahrenen Arzt leicht bestimmen.
Die bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung im Medikament, das erfindungsgemäß unter Verwendung einer Tetracyclinverbindung hergestellt worden ist, umfasst eine Kombination der Tetracyclinverbindung in einem geeigneten pharmazeutischen Träger (Vehikel) oder Exzipiens, wie es dem Fachmann geläufig ist. Die hochgradig bevorzugte Abgabeart umfasst eine topische Anwendung. Demgemäß eignet sich der Träger vorzugsweise für die topische Verwendung. Zu Zusammensetzungen, die für eine derartige topische Anwendung als geeignet angesehen werden, gehören Gele, Salben, Lotionen und dergl. Die antimikrobielle Menge der Tetracyclinverbindung kann zusammen mit einer Trägergrundlage oder Matrix oder dergl. einverleibt werden, um einen hochgepackten chirurgischen oder Brandverband oder -bandage, die direkt auf eine Wunde aufgebracht werden können, bereitzustellen. Derartige Verbände können mit oder ohne Anwendung von erleichternden, pharmazeutisch verträglichen Substanzen, wie antibiotischen Cremes, verwendet werden. Man kann sich einer Verabreichung mit zeitlicher Verzögerung oder gesteuerter Abgabe bedienen, indem man beispielsweise die Tetracyclinverbindung zusammen mit einem biologisch verträglichen Polymeren unter gleichzeitiger Ausformung zu einem faserartigen Material aufbringt. Tatsächlich eignen sich resorbierbare Kollagen-Matrices für eine zeitlich verzögerte Abgabe von Medikamenten (vergl. z. B. die US-Patente 4 440 680 (Cioca); 4 407 787 (Stemberger); und 4 294 241 (Miyata). Diese können zur erfindungsgemäßen Abgabe von Tetracyclinverbindungen verwendet werden. Gegebenenfalls kann eine antibiotische Nichttetracyclin-Verbindung der nicht-mikrobiellen Menge der Tetracyclinverbindung und dem Träger zugesetzt werden, um ein mikrobielles Wachstum an der Wundstelle zu hemmen. Alternativ können die Mittel zur Abgabe der Tetracyclinverbindung zusammen mit dem pharmazeutischen Träger in Form einer Kapsel, einer verpressten Tablette, Pille, Lösung oder Suspension, die sich für die orale Verabreichung an das Subjekt eignen, vorliegen. Zu Zusammensetzungen, die in Betracht kommen, gehören solche, die zusammen mit Trägern, die sich zur Verabreichung auf oralem Wege, topischem Wege, durch Injektion oder durch andere Maßnahmen eignen, zubereitet werden.
Die erfindungsgemäße Verwendung einer Tetracyclinverbindung zur Herstellung eines Medikaments erhöht die Geschwindigkeit der Kollagenanreicherung in heilendem, epithelisiertem Gewebe. Demgemäß wird erfindungsgemäß die Geschwindigkeit der Heilung von akuten traumatischen Wunden durch Hemmung von Säugetier-Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) insbesondere von Kollagenase und Gelatinase, erhöht, wodurch die Geschwindigkeit des Kollagen-Abbaus im heilenden Gewebe vermindert wird. (Es ist möglich, dass die beobachtete Geschwindigkeit der Zunahme des Kollagengehalts teilweise eine erhöhte Kollagen-Synthese und/oder -Sekretion widerspiegelt.) Offensichtlich hemmen Tetracyclinverbindungen Neutrophilen-Kollagenase sowie Fibroblasten-Kollagenase. Beispielsweise haben Chang et al. (1996) gezeigt, dass Diabetes in Zusammenhang steht mit erhöhten Mengen an Kollagenase vom Leukozytentyp und Gelatinase in der Haut, die vermutlich durch (Cytokin-stimulierte) Fibroblasten gebildet werden. Demgemäß wird angenommen, dass das erfindungsgemäß unter Verwendung einer Tetracyclinverbindung hergestellte Medikament in wirksamer Weise die Heilung von akuten traumatischen Wunden verstärkt, indem es Fibroblasten-Kollagenase, die normalerweise bei der Geweberemodellierung aktiv ist, oder Neutrophilen-Leukozyten-Kollagenase, ein Enzym, das typischerweise in den frühen Stadien der Wundheilung aktiv ist, wodurch geschädigtes Gewebe zum Zeitpunkt des Auftretens der Entzündung zerstört wird, hemmt. Das Medikament eignet sich insbesondere zur Hemmung der Kollagenase vom Neutrophilen-Typ.
Da ferner die Neutrophilen-Kollagenase und die Fibroblasten-Kollagenase an der Verletzungsstelle zu verschiedenen Zeitpunkten erzeugt werden, fällt es unter den Umfang der Erfindung, für ein zeitgestütztes Vorgehen zu sorgen, das eine Folge von zwei oder mehr spezifisch wirkenden Tetracyclinverbindungen umfasst, z. B. die frühere Hemmung der Neutrophilen-Kollagenase beim Heilungsvorgang und die spätere Hemmung von Fibroblasten-Kollagenase. Alternativ könnte eine Störung eines einzelnen Typs von kollagenolytischer Aktivität bei bestimmten Individuen die Anwendung einer Vorgehensweise, die auf die Hemmung dieser einzelnen Aktivitätsquelle abgestellt ist, indizieren.
Die erfindungsgemäße Verwendung einer Tetracyclinverbindung zur Herstellung eines Medikaments eignet sich insbesondere für Subjekte, bei denen der Heilungsprozess beeinträchtigt ist. Beispielsweise kann in Fällen, bei denen die Kollagenasespiegel in Reaktion auf eine akute traumatische Schädigung steigen, die aber nicht wieder fallen, wie es normalerweise der Fall wäre, die Schädigung chronisch werden, so dass die Heilung übermäßig lange dauert. Das erfindungsgemäß unter Verwendung einer Tetracyclinverbindung hergestellte Medikament kann zur Überwindung der fehlenden Fähigkeit der Haut, den Grad der kollagenolytischen Aktivität zu verringern, verwendet werden, was eine Erhöhung der Kollagenabscheidung und eine gleichzeitige normalisierte Heilung ermöglicht und die Induktion einer chronischen Läsion verhindert.
Somit ist die Verwendung von chemisch modifizierten Tetracyclinen zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Medikaments bei Personen mit akuter oder nicht-chronischer Beeinträchtigung der Wundheilung und insbesondere bei Personen, die an Diabetes leiden, wertvoll. Es ist bekannt, dass eine beeinträchtigte Wundheilung eine der zahlreichen Komplikationen von schlecht kontrolliertem Diabetes mellitus ist. Es wurden mehrere durch Diabetes induzierte Abnormalitäten im Kollagen-Stoffwechsel identifiziert, einschließlich pathologisch überschüssige Kollagenase und Gelatinase im Zahnfleisch und der Haut der Streptozotocin-diabetischen Ratte (Ramamurthy et al., 1983; Chang et al., 1996). Wir haben nunmehr gezeigt, dass derartige Abnormalitäten in wirksamer Weise gehemmt werden können, wobei sich bei Personen, die an derartigen Zuständen leiden, die Heilung von akuten Wunden wiedererlangen lässt.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, ein tieferes Verständnis der Erfindung zu erreichen. Die speziellen Materialien und. Bedingungen, die angewandt werden, dienen lediglich zur weiteren Erläuterung der Erfindung und stellen keine Einschränkung des vernünftigen Schutzumfangs der Erfindung dar.
Beispiel 1
Ausgewachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (Körpergewicht etwa 350 g) wurden auf folgende experimentelle Gruppen aufgeteilt:
Gruppe I (n = 4 Ratten): nicht-diabetische Kontrolltiere, die mit Vehikel allein behandelt wurden (NDC-Gruppe);
Gruppe II (n = 3 Ratten): unkontrollierte diabetische Tiere, die mit Vehikel allein behandelt wurden (D-Gruppe); und
Gruppe III (n = 3 Ratten): diabetische Tiere, die topisch mit CMT-6 (1% Suspension in einem Petrolatum-Träger auf Mineralölbasis) behandelt wurden.
Zu Beginn des Experiments (T = 0) erhält die entsprechende Anzahl an Ratten eine Verabreichung von Streptozotocin (STZ) (70 mg/kg) durch intravenöse Injektion in die Schwanzvene, um Diabetes und Hyperglykämie gemäß dem Verfahren von Yu et al. (1993) herbeizuführen. 21 Tage nach der STZ-Injektion wurden sämtliche Ratten betäubt, und 6 kreisförmige Wunden wurden in der gesamten Dicke mit einer Biopsie-Stanze mit 6 mm Durchmesser in der dorsalen Haut der einzelnen Ratten erzeugt (man ließ die Wunden durch sekundäre Wundheilung heilen). Nach der Erzeugung der Wunden wurde mit dem Auftragung des Petrolatum-Trägers entweder allein oder mit einem Gehalt an CMT-6 begonnen, wobei die Auftragung 1-mal täglich 7 Tage lang erfolgte.
Nach der 7-tägigen Periode wurden die Wunden chirurgisch präpariert und geprüft, und zwar sowohl histologisch als auch biochemisch. Für die erstgenannte Analyse wurden Hautbiopsien in 10% neutral gepuffertem Formalin aufbewahrt, sodann geschnitten und mit Mason-Trichrome gefärbt, das Kollagenfasern (der Hauptstrukturbestandteil des dermalen Bindegewebes) blau färbt. Für die letztgenannte Untersuchung wurden Hautbiopsien bei 37°C getrocknet, gewogen und anschließend in 6 M HCl (106°C, 24 Stunden, in einem geschlossenen Teströhrchen) hydrolysiert, um das Kollagenprotein zu Aminosäuren aufzubrechen. Anschließend wurde Hydroxyprolin kolorimetrisch analysiert, d. h. ein Aminosäure-"Marker" von Kollagen, und zwar gemäß dem Verfahren von Stegmann (1958).
In sämtlichen drei Gruppen von Ratten war das Epithel 7 Tage nach Erzeugung der Wunde über der heilenden Dermis offensichtlich vollständig wiederhergestellt. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Die Trichrome-Färbung wird qualitativ angegeben. Der Gehalt an Hydroxyprolin in den Hautproben wird als μg/mg trockenes Gewebe (± Standardfehler des Mittelwerts) angegeben.
Proben der heilenden Haut, die zur Darstellung des Kollagengehalts gemäß den vorstehenden Angaben gefärbt worden waren, wurden einer mikroskopischen Analyse unterzogen (durch Photomikrographie bestätigt). Eine Mikrophotographie der heilenden Haut einer normalen Ratte (Gruppe I) zeigte eine dichte Kollagenfärbung. Im Gegensatz dazu zeigte eine Mikrophotographie der heilenden Haut einer unbehandelten diabetischen Ratte (Gruppe II) nur eine sehr leichte Kollagenfärbung, was die Beeinträchtigung der Heilung bei diesen Tieren erläutert. Schließlich zeigte eine Mikrophotographie der heilenden Haut einer diabetischen Ratte, die gemäß den vorstehenden Angaben mit 1% CMT-6 behandelt worden war, (Gruppe III) einen Kollagengehalt in der Haut, der gegenüber den unbehandelten diabetischen Ratten erheblich erhöht war. Diese Daten sind qualitativ in Tabelle 1 zusammengestellt.
Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 dargelegt, wurde durch Herbeiführung eines diabetischen Zustands bei den Ratten der Kollagengehalt der heilenden Wunde im Vergleich zu normalen Kontrolltieren verringert. Dieser Schluss beruhte auf einer 31%igen Verringerung des Hydroxyprolingehalts und auf einer Verminderung der Trichrome-Blaufärbung der Kollagenfasern, verglichen mit der NDC-Gruppe. Dagegen zeigten die Ratten der Gruppe III (diabetische Ratten plus CMT-6) einen Kollagengehalt der heilenden Haut, der gegenüber den unbehandelten diabetischen Tieren um 25% erhöht war, und zwar auf der Basis der Hydroxyprolin-Messungen. Dieses Ergebnis stimmt mit der erhöhten Trichrome-Färbung von Kollagen auf der Grundlage der histologischen Beobachtung überein.
Beispiel 2
Es wurde ein ähnliches Experiment wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass zwei Konzentrationen an CMT-6 in dem Petrolatum-Träger auf Mineralöl suspendiert wurden, d. h. es wurden Suspensionen mit 1% und 3% CMT-6 getestet. In diesem Fall wurden 21 ausgewachsene männliche Ratten auf 4 experimentelle Gruppen verteilt:
Gruppe I (n = 4 Ratten): nicht-diabetische Kontrolltiere (NDC), die täglich durch topische Anwendung des Trägers allein behandelt wurden;
Gruppe II (n = 5 Ratten): unkontrollierte diabetische Tiere (D), die auf die vorstehende Weise mit dem Träger allein behandelt wurden;
Gruppe III (n = 6 Ratten): unkontrollierte diabetische Ratten, die täglich mit 1% CMT-6 in Petrolatum behandelt wurden; und
Gruppe IV (n = 6 Ratten): unkontrollierte diabetische Ratten, die täglich mit 3% CMT-6 in Petrolatum behandelt wurden.
Wie in Beispiel 1 wurden nach Ablauf von 7 Tagen die Ratten betäubt. Hautbiopsien wurden ausgeschnitten, hydrolysiert und kolorimetrisch auf den Gehalt an Hydroxyprolin analysiert. Die Analysenergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt, wobei der Gehalt an Hydroxyprolin als μg Hydroxyprolin/mg trockenes Gewebe (± Standardfehler des Mittelwerts) angegeben wird.
Tabelle 2
Bei diesem Experiment wird durch Induktion von Diabetes der Kollagengehalt der heilenden Haut bei den Tieren der Gruppe II um 24% unter die Kontrolle (Gruppe I) verringert (Tabelle 2). Jedoch wurde durch Behandlung der diabetischen Ratten mittels topischer Verabreichung von 1% CMT-6 (Gruppe III) und 3% CMT-6 (Gruppe IV) der Wund-Kollagengehalt um 42% bzw. 74% im Vergleich zu den unbehandelten diabetischen Tieren (Gruppe II) erhöht. Dies zeigt klar eine dosisabhängige Wirkung auf die Wundheilung.
Beispiel 3
In diesem Experiment wurden ausgewachsene männliche Ratten auf vier verschiedene experimentelle Gruppen verteilt, wobei n = 4–6 Ratten pro Gruppe:
Gruppe I: Diabetische Ratten mit Träger allein;
Gruppe II: Diabetische Ratten mit 1% CMT-6;
Gruppe III: Diabetische Ratten mit 3% CMT-6; und
Gruppe IV: Diabetische Ratten mit 1% CMT-2.
Man bediente sich des vorstehend beschriebenen Wundtests. Am Tag 7 nach der Wundenbildung und nach täglicher topischer Anwendung entweder von Träger allein oder CMT-6 oder CMT-2 wurden die Wunden chirurgisch ausgeschnitten. Die Kollagenase-Aktivität wurde gemäß dem Verfahren von Golub et al. (1985) gemessen.
Nachstehend wird die Messung der Kollagenase-Aktivität kurz beschrieben: die einzelnen Hautbiopsien wurden gewogen und extrahiert. Die Extrakte wurden partiell durch Fällung mit Ammoniumsulfat gereinigt. Aliquotanteile der Hautextrakte wurden sodann mit [³H-Methyl]-Kollagen bei 22°C inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden durch SDS-PAGE/Fluorographie getrennt. Die Fluorogramme wurden mit einem Laser-Densitometer zur Bestimmung der Kollagenase-Aktivität gescannt. (Dieser Test wurde in Abwesenheit von Aminophenylquecksilberacetat (APMA) durchgeführt, um aktive, nicht-latente Kollagenase gemäß den Angaben von Golub et al. (1994) zu bestimmen.)
1 zeigt das elektrophoretische Muster von [³H-Methyl]-Kollagen nach Inkubation mit Hautextrakten diabetischer Ratten der Gruppen I–III. Bahnen 2–4: t = 0; Bahnen 5–7: Placebo (Träger allein); Bahnen 8–10: 1% CMT-6; und Bahnen 11–13: 3% CMT-6. Die Bahn 1 ist eine Kontrollprobe von Kollagen ohne Hautextrakt, wobei das Muster von nicht-abgebautem Kollagen, einschließlich der α-, β- und γ-Kollagenkomponenten, ersichtlich ist. Bemerkenswert ist die hohe Kollagenase-Aktivität in der diabetischen Rattenhaut bei t = 0 (α^A-Fragmente) (Bahnen 2–4), die bei der mit Placebo behandelten (Behandlung mit Vehikel) Haut der diabetischen Tiere noch höher ist (Bahnen 5–7). Die Behandlung mit CMT-6 verringerte die übermäßige Kollagenase-Aktivität, wie sich durch (i) einen verminderten Verlust der α-, β- und γ-Kollagenkomponenten und (ii) eine verminderte Bildung von durch α^A-Kollagenase vermittelten Abbauprodukten zeigt. Eine dosisabhängige Wirkung von CMT-6 ist ersichtlich (Bahnen 8–13).
2 zeigt das elektrophoretische Muster von [³H-Methyl]-Kollagen nach Inkubation mit Hautextrakten von mit Placebo (Träger) behandelten diabetischen Ratten (Bahnen 1–2) und von mit 1% CMT-2 behandelten diabetischen Ratten (Bahnen 3–5). Wie in der vorstehenden 1 ist ein hohes Maß der Kollagenase-Aktivität bei der mit Placebo behandelten Haut ersichtlich, während ferner eine besonders erhebliche Hemmung der Kollagenase-Aktivität durch CMT-2 ersichtlich ist.
Der Abbau des radioaktiv markierten [³H-Methyl]-Kollagens durch die Hautextrakte ergab hochmolekulare Fragmente (α₁ ^A und α₂ ^A) von Kollagen, die in charakteristischer Weise durch Säugetier-Kollagenase erzeugt werden. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.
Tabelle 3
Ein densitometrisches Scannen der Fluorogramme (1 und 2, Tabelle 3) zeigte, dass 47% des [³H]-Kollagensubstrats durch die Hautproben der mit Vehikel behandelten diabetischen Ratten abgebaut wurde. Die Behandlung der diabetischen Ratten mit 1% oder 3% CMT-6 oder mit 1% CMT-2 verminderte in erheblichem Maße diese hohe Kollagenase-Aktivität. Speziell verringerte 1% CMT-6 die kollagenolytische Aktivität bei den diabetischen Ratten um 83%; 3% CMT-6 verringerte die Aktivität um 87% und 1% CMT-2 verringerte die Aktivität um 100%. (In einem getrennten Experiment (Daten nicht aufgeführt) zeigte die Haut von nicht-diabetischen Kontrollratten am 7. Tag einen etwa 19%igen Abbau von Kollagen, verglichen mit dem 47%igen Abbau, der sich bei diesem Experiment in der diabetischen Gruppe ergab. Die topische Anwendung von 3% CMT-6 verringerte nicht in signifikanter Weise (p > 0,05) die kollagenolytische Aktivität in der NDC-Rattenhaut.)
Beispiel 4
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Experimenten wurde eine Studie über die Wirkung von CMT-6 auf die Kollagenase- und Gelatinase-Aktivität bei normalen und SZT-diabetischen Ratten durchgeführt. 24 Ratten wurden in sechs experimentelle Gruppen eingeteilt:

I: Normale Ratten (n = 4 Ratten) wurden nur mit Petrolatum-Träger behandelt;
II: Normale Ratten (n = 3 Ratten) wurden mit 3% CMT-6 behandelt;
III: Diabetische Ratten (n = 6 Ratten) blieben unbehandelt, Testzeitpunkt = 0;
IV: Diabetische Ratten (n = 4 Ratten) wurden nur mit Träger allein behandelt, Testzeitpunkt = 7 Tage;
V: Diabetische Ratten (n = 4 Ratten) wurden mit 1% CMT-6 behandelt; und
VI: Diabetische Ratten (n = 3 Ratten) wurden mit 3% CMT-6 behandelt.

Die Ratten wurden gemäß dem vorstehend angegebenen Verfahren behandelt, ausgenommen die Ratten der Gruppe III, die an dem Tag, an dem die Wunden erzeugt wurden, getestet wurden. Gewebebiopsien wurden halbiert, wobei die eine Hälfte zur Extraktion von Kollagenase und Gelatinase und die andere Hälfte zum Testen des Gehalts an Kollagen verwendet wurde. Der Kollagengehalt und die Kollagenase-Aktivität wurden gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren getestet. Die Gelatinase-Aktivität wurde unter Verwendung von denaturiertem Kollagen (Gelatine) als Substrat getestet. Radioaktiv markiertes [³H-Methyl]-Gelatinesubstrat wurde 4 Stunden mit dem extrahierten Enzym bei 37°C inkubiert. Die unverdaute Gelatine wurde durch Zugabe von nicht-markierter Gelatine und 45% TCA gefällt. Nach Zentrifugation wurden die Überstände mit einem Gehalt an den Gelatine-Abbauprodukten in einem Flüssigszintillations-Spektrometer ausgezählt.
Die beiden MMPs (Kollagenase und Gelatinase) wurden sowohl bei fehlender Aktivierung mit APMA als auch unter Inkubation der Enzymextrakte mit APMA getestet. Die Ergebnisse ohne Aktivierung sind in der nachstehenden Tabelle 4 aufgeführt. Die Kollagenase-Aktivität wird als Geschwindigkeit des Kollagen-Abbaus angegeben, d. h. ng Kollagen abgebaut/Stunde/mg Protein (± Standardfehler des Mittelwerts). Die Gelatinase-Aktivität wird als Geschwindigkeit des Gelatine-Abbaus angegeben, d. h. μg Gelatine abgebaut/Stunde/mg Protein (± Standardfehler des Mittelwerts).
Tabelle 4
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, waren sowohl die Kollagenase als auch die Gelatinase-Konzentrationen bei den mit Vehikel behandelten diabetischen Wundgeweben erhöht. Es waren im wesentlichen sämtliche (90–95%) der MMPs in den Extrakten aktiv und es lag nur sehr wenig APMA-aktivierbares oder latentes MMP vor. Durch Scannen des Fluorogramms ergab sich, dass 48% des Kollagens durch die diabetischen Rattengewebe abgebaut wurden. Zum Zeitpunkt 0 enthielten die Hautgewebe der diabetischen Ratten ebenfalls aktive Kollagenase und aktive Gelatinase. Bei den mit 1% oder 3% CMT-6 behandelten Wunden waren die Konzentrationen an Kollagenase und Gelatinase in dosisabhängiger Weise verringert. Normale Rattenhaut zeigte zum Zeitpunkt 0 keine Kollagenase-Aktivität. Jedoch induzierte eine Verwundung der nicht-diabetischen Rattenhaut eine erhöhte Kollagenase-Aktivität (17% Kollagen abgebaut), wobei eine Behandlung der Wunden mit 3% CMT-6 in signifikanter Weise die aktive Gelatinase (p < 0,05) verminderte, wobei die Kollagenase in einem Ausmaß, das nicht signifikant war, vermindert wurde.
Vorstehend wurden die derzeit bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass andere und weitere Ausführungsformen realisiert werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Sämtliche derartigen weiteren Modifikationen und Abänderungen fallen unter den Schutzumfang der hier vorgelegten Ansprüche.
Bibliographie

Chang, K-M, ME Ryan, LM Golub, NS Ramamurthy, and TF McNamara, "Local and systemic factors in periodontal disease increase matrix-degrading enzyme activities in rat gingiva: Effect of minocycline activity," Res. Commun. Mol. Pathol. and Pharmacol. 91 (3): 303–318 (1996).
Clark, RAF, "Biology of dermal wound repair", Dermatol. Clinics 11 (4): 647–666 (1993).
Golub et al., J. Periodontal Res. 20: 12 (1985).
Golub, LM, NS Ramamurthy, TF McNamara, RA Greenwald, and BR Rifkin, "Tetracyclines inhibit connective tissue breakdown: New therapeutic implications for an old family of drugs", Crit. Rev. in Oral Biol. and Med. 2 (2): 297–322 (1991).
Golub et al., J.A.D.A. 125: 163 (1994).
Inoue, M, G Kratz, A Haegerstrand, and M Stähle-Bäckdahl, "Collagenase expression is rapidly induced in wound-edge keratinocytes after acute injury in human skin, persists during healing, and stops at re-epithelialization", J. Invest. Dermatol. 144 (4): 479–483 (1995).
Mitscher, LA, The Chemistry of the Tetracycline Antibiotics, Ch. 6, Marcel Dekker, New York (1978).
Ramamurthy, NS, LM Golub, and M Leung, "The effect of diabetes on lysyl oxidase activity and extractability of newly synthesized collagen in rat gingiva and skin," Gerodontology 2: 15–19 (1983).
Ryan, ME, NS Ramamurthy, and LM Golub, "Matrix metalloproteases and their inhibition in periodontal treatment," Curr. Opin. Periodontol. 3: 85–96 (1996).
Stegmann, H, "A microcolorimetric assay for hydroxyproline", Hoppe-Seylers Z Physiol. Chem. 311: 41–45 (1958).

Claims

Benutzung einer Tetracyclinverbindung zur Herstellung eines Medikamentes zum Fördern der Wundheilung bei einem Säugetier mit einer akuten traumatischen Wunde in einem epithelialisierten Gewebe, wobei die Tetracyclinverbindung in einer Menge benutzt wird, die im wesentlichen keine antibakterielle Aktivität aufweist, jedoch die Wundheilung beim Patienten wirkungsvoll verbessert.
Benutzung nach Anspruch 1, wobei der Patient eine beeinträchtigte Wundheilungsfähigkeit aufweist.
Benutzung nach Anspruch 1, wobei die Tetracyclinverbindung im wesentlichen nicht systemisch absorbiert wird.
Benutzung nach Anspruch 1, wobei das Medikament, das die Tetracyclinverbindung enthält, dem epithelialisierten Gewebe topisch verabreicht wird.
Benutzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Tetracyclinverbindung CMT-2 oder CMT-6 ist.
Benutzung nach Anspruch 2, wobei die beeinträchtigte Wundheilung durch erhöhte proteolytische Aktivität in dem epithelialisierten Gewebe des Säugetieres gekennzeichnet ist.
Benutzung nach Anspruch 6, wobei die erhöhte proteolytische Aktivität erhöhte kollagenolytische Aktivität oder erhöhte gelatinolytische Aktivität oder beide umfaßt.
Benutzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das epithelialisierte Gewebe Haut ist.
Benutzung nach Anspruch 1, a) umfassend die Benutzung einer ersten Tetracyclinverbindung zur Herstellung eines ersten Medikamentes zur topischen Verabreichung, wobei die erste Tetracyclinverbindung im wesentlichen unfähig zur systemischen Verteilung in dem Säugetier ist, und b) die Benutzung einer zweiten Tetracyclinverbindung zur Herstellung eines zweiten Medikamentes zur systemischen Verabreichung, wobei die zweite Tetracyclinverbindung zu einer wesentlichen systemischen Verteilung in dem Säugetier fähig ist.
Benutzung nach Anspruch 1, wobei die Tetracyclinverbindung bei der Herstellung des Medikamentes zusammen mit einer entzündungshemmenden Menge eines nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneimittels benutzt wird.
Benutzung nach Anspruch 1 einer Tetracyclinverbindung zur Herstellung eines Medikamentes, wobei das Medikament zum Vermehren von Kollagen in epithelialisiertem Gewebe mit einer akuten Wunde ist, wobei die Tetracyclinverbindung in einer Menge in das epithelialisierte Gewebe eingebracht wird, die im wesentlichen keine antibakterielle Aktivität aufweist, die jedoch ausreichend ist, um den Kollagengehalt in dem epithelialisierten Gewebe zu erhöhen.
Benutzung nach Anspruch 11, wobei die Tetracyclinverbindung im wesentlichen nicht systemisch absorbiert wird.
Benutzung nach Anspruch 11, wobei die Tetracyclinverbindung CMT-2 oder CMT-6 ist.
Benutzung nach Anspruch 11, wobei das epithelialisierte Gewebe epithelialisiertes Gewebe eines Patienten ist, der ungewöhnlich niedrige Gehalte an Kollagen aufweist.
Benutzung nach Anspruch 11, wobei der erhöhte Kollagengehalt mit einer Abnahme der kollagenolytischen Aktivität in dem epithelialisierten Gewebe verbunden ist.
Benutzung nach Anspruch 11, wobei das epithelialisierte Gewebe Haut ist.
Benutzung nach Anspruch 11, wobei die Tetracyclinverbindung, die zur Herstellung des Medikamentes benutzt wird, zusammen mit einer entzündungshemmenden Menge eines nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneimittels in das epithelialisierte Gewebe eingebracht wird.