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Die
vorliegende Erfindung zielt auf die Verwendung von Hylauronsäurederivaten
zur Herstellung von Biomaterialien zur Vorbeugung der Bildung und
zur Behandlung von Hautnarben, wobei die Hyaluronsäurederivate
wahlweise mit zusätzlichen
pharmakologisch oder biologisch aktiven Substanzen kombiniert werden.
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Eine
Hautnarbe ist das Ergebnis der Reparaturprozesse, welche die Kontinuität der geschädigten Haut
wiederherstellen. Normalerweise führt dieser Reparaturprozess
zur Bildung von neuem Gewebe mit einem Erscheinungsbild, welches
sich sichtbar von der umgebenden Haut unterscheidet. Insbesondere
kann dem Narbengewebe die Pigmentierung fehlen oder es kann zu viel
davon aufweisen oder es kann eingesenkt, glänzend, rauh, normotroph, zurückgezogen
sein oder es kann ihm Elastizität
fehlen. Auf der mikroskopischen Ebene ist Narbengewebe durch eine
im Überfluss
vorhandene und unorganisierte Ablagerung von Kollagen gekennzeichnet,
welche in dicken, dichten, verdrehten Bündeln angeordnet ist. Der Narbenbildungsprozess dauert
ziemlich lange, da die Umformungsphase für Jahre aktiv bleibt. In einigen
Fällen
kann der Narbenbildungsprozess während
der anfänglichen
Umformungsphase pathologisch werden, wobei hypertrophe Narben oder
Keloide gebildet werden. Hypertrophe Narben sind durch übermäßige Verdickungen
gekennzeichnet, aber ohne irgendeine Ausbreitung über das
Wundgebiet hinaus. Im Gegensatz dazu gibt es im Fall von Keloiden
neben der Verdickung des neu gebildeten Gewebes auch eine Kolonisierung
des umgebenden Gebiets. Die Bildung von sowohl hypertrophen Narben
als auch von Keloiden scheint mit einem Ungleichgewicht des Immunsystems
verknüpft
zu sein. Vom histologischen Gesichtspunkt sind beide durch ein moderates
Ausmaß von
Zellinfiltration und durch eine übermäßige und
unorganisierte Ablagerung von dicken Kollagen bündeln gekennzeichnet. Narben
können
funktionelle Schwierigkeiten verursachen und sind unansehlich. Die
hauptsächlichen
funktionellen Schwierigkeiten treten auf, wenn sich die Narbe auf
kritischen Gebieten der Haut wie z.B. an den Gelenken bildet. In
diesem Fall kann eine mangelhafte Elastizität des Narbengewebes zu einer
fehlerhaften Funktion des Gelenks selbst führen.
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Die
normale Wundheilung in Reaktion auf eine Verletzung des Gewebes
umfasst mehrere integrierte Prozesse: Entzündung, Produktion von Granulationsgewebe,
Bildung der extrazellulären
Matrix, Kontraktion der Wunde und schließlich die Narbenbildung. In
den Endphasen der Wundheilung zersetzen sich die Fibroblasten und
produzieren Bündel
von Kollagenfasern. Diese Bündel
werden dicker und sind entlang der Linien der Spannung angeordnet,
welcher die Gewebe ausgesetzt sind. In Folge dieser Veränderungen
nimmt die Dehnungsfähigkeit
der Wunde allmählich
zu. Die so entstandene Narbe enthält praktisch keine Zellen und weist
weniger Makrophagen, Blutgefäße und Fibroblasten
auf als nicht verletztes Gewebe.
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Narben
können
normotroph, atroph, hypertroph oder keloidartig sein. Sowohl hypertrophe
als auch keloidartige Narben sind anomale Reaktionen auf eine Gewebeverletzung.
Hypertrophe Narben reifen und flachen mit der Zeit ab, normalerweise
nach 6 Monaten. Das Keloid erscheint als eine glänzende, glatte, erhabene Vermehrung
des Narbengewebes mit typischen, krebsartigen Ausläufern über die
Stelle der ursprünglichen Verletzung
hinaus. Keloide unterscheiden sich von hypertrophen Narben dadurch,
dass ihre Entwicklung verzögert
ist, wobei diese manchmal Monate nach der Verletzung des Gewebes
auftreten. Keloide bilden sich nicht zurück und sie verursachen häufig Schmerzen,
Jucken und Brennen. Keloide treten häufiger bei Afro-amerikanern,
Hispano-amerikanern und bei Personen mit einer persönlichen
oder familiären
Vorgeschichte von Keloiden auf.
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Bei
atrophen Narben liegt eine Verdünnung
der Haut und ein Verlust des normalen Aufbaus vor. Striae distensae,
sogenannte Schwangerschaftsstreifen, sind eine häufige atrophe Hautnarbe, die
dazu neigt, in Perioden rascher Gewichtszunahme und in Gegenwart
von überschüssigen Glucocorticoid
ebenso wie im Spätstadium
der Schwangerschaft aufzutreten.
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Eine
Behandlung mit intraläsionalen
Steroiden, 10 bis 40 mg/ml einmal im Monat für bis zu 6 Monate, kann Keloide
und hypertrophe Narben wirksam abflachen. Es hat sich gezeigt, dass
Cryotherapie (eine 30 Sekunden dauernde Anwendung einmal im Monat
für 3 Monate)
sicher und wirksam ist. Eine örtliche
Abdeckung mit einem Silikongel, welches zuerst bei Brandnarben eingesetzt
worden ist, wurde zur Behandlung von Keloiden und hypertrophen Narben
eingesetzt. Es tritt keine Freisetzung von Silikon in die Haut auf
und es gibt keine ungünstigen
Nebenwirkungen dieser Behandlung. Der Wirkmechanismus ist unbekannt.
Mögliche
Nebenwirkungen einer intraläsionalen
Behandlung mit Corticosteroiden umfassen Atrophie, Pigmentverlust,
Telangiektasie sowie Geschwürbildung
und Dosis-abhängige systemische
Wirkungen.
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Keloide
sind proliferative Hautwucherungen, die nach einer Hautverletzung
entstehen. Im Unterschied zu hypertrophen Narben erstreckt sich
das Narbengewebe über
die Grenzen der ursprünglichen
Verletzung hinaus. Die erste Beschreibung eines Keloids bietet die
Smyth-Papyrusrolle über
chirurgische Techniken in Ägypten
1700 vor Christus. In der Folgezeit hat Alibert 1806 den Begriff „cheloide" benutzt, der sich
von dem griechischen „chele" oder Krebszange
ableitet, um das seitliche Wachstum des Gewebes in die normale Haut zu
beschreiben. Zusätzlich
zu der kosmetischen Verunstaltung, welche diese Narben für die betroffenen
Patienten darstellen, können
diese eitrig, weich sein und können
durch sekundäre
Infektionen kompliziert sei.
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Keloide
treten am häufigsten
im Alter zwischen 10 und 30 Jahren auf. Dunkel pigmentierte Menschen sind
anfälliger
für proliferative
Narbenbildung als solche mit heller Haut. Die Bildung von Keloiden
tritt vor allem an Stellen auf, an denen die Konzentrationen von
Melanocyten am höchsten
sind. Darüber
hinaus hat man Schwangerschaft und Pubertät, Zeiten erhöhter physiologischer
Aktivität
der Hypophyse, mit einer erhöhten Keloidbildung
in Verbindung gebracht. Es ist berichtet worden, dass die Inzidenz
bei 4,5% in schwarzen Bevölkerungsgruppen
bzw. bei 16% in hispano-amerikanischen Bevölkerungsgruppen liegt. Genaue
Zahlen zur Inzidenz von hypertrophen Narben sind nicht bekannt.
Die Vererbungsmuster von Keloiden sind autosomal dominant und autosomal
rezessiv, und man hat diese genetisch mit HLA B14, B21, Bw16, Bw35,
DR5 und DQw3 in Verbindung gebracht.
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Keloide
unterscheiden sich von hypertrophen Narben vom klinischen und histologischen
Bild her. Vom klinischen Bild her haben Keloide eine tiefrote oder
violette Farbe mit erhabenem verhärtetem Gewebe, welches über die
ursprünglichen Wundgrenzen
hinaus reicht. Hypertrophe Narben haben eine weniger eindrucksvolle
weiße
oder rosa Farbe mit einem festen Gewebe, das auf die ursprüngliche
Wundgrenze beschränkt
ist. Vom histologischen Bild her sind Keloide aus unorganisierten,
dicken, hyalinisiertem Kollagen mit einer markanten Mucoid-Matrix
aufgebaut, wohingegen hypertrophe Narben durch weniger, organisiertere
Kollagenfasern mit einer spärlichen
Mucoid-Matrix gekennzeichnet sind. Die Fibroblastenkonzentration
ist bei hypertrophen Narben ausgeprägter. Hypertrophe und keloidale
Narbenbildung tritt in dunkel pigmentierten Rassen häufiger auf.
Während
erhöhter
hormoneller Stimulierung liegt eine erhöhte proliferative Narbenbildung
vor. Keloide sind durch unorganisiertere, verdickte Kollagenfasern
und durch eine markante Mucoid-Matrix gekennzeichnet.
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Darüber hinaus
dürfen
die ästhetischen
Probleme, die auf Grund der Narbenbildung entstehen, nicht unterschätzt werden,
da Vernarbung häufig
psychologische Störungen
verursacht, insbesondere wenn sie das Gesicht betrifft.
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Die
heute verwendeten Methoden, um Narben weniger stark sichtbar zu
machen, sind chirurgischer Natur wie z.B. die Technik, bei der gedehnte
Hautstreifen eingesetzt werden. Diese Technik umfasst die Dehnung
von Hautarealen mittels subkutaner Wirkstoffe. Sobald man eine genügend große Menge
Haut erhalten hat, um das vernarbte Gebiet abzudecken, wird die
Narbe chirurgisch entfernt und die gedehnte Haut wird an die Stelle
verpflanzt.
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Bis
heute gibt es keine wirksamen pharmakologischen Therapien, um die
normotrophe Narbenbildung zu heilen, pathologische Narbenbildung
kann pharmakologisch mit Cortisonderivaten und in manchen Fällen mit
starken Immunsuppressoren wie z.B. Cyclosporin behandelt werden.
Um die Elastizität
des Narbengewebes zu verbessern und dessen Reabsorption zu induzieren,
werden weich machende Zusammensetzungen wie z.B. Cremes und adhäsive Silikonfilme
für verlängerte Anwendungen
eingesetzt. Neben den lokalen Behandlungen unterzieht man die Patienten
Therapien mit Instrumenten, die dafür konstruiert sind, das vernarbte Gebiet
durch Ansaugen zu massieren, um dessen Elastizität und Weichheit wiederherzustellen.
Diese Hilfsmittel haben jedoch diverse Nachteile wie z.B. die Notwendigkeit,
eine oder mehrere Operationen am Patienten durchzuführen und,
im Fall einer pharmakologischen Therapie, deren Beschränkung auf
die Behandlung der pathologischen Narbenbildung und deren nicht
erwiesene Wirksamkeit. Schließlich bringen
die Produkte zur lokalen Anwendung und die therapeutischen Verfahren
einigermaßen
gute Ergebnisse im Hinblick auf die Funktionalität, aber schlechte ästhetische
Resultate.
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Es
ist wohlbekannt, dass eine tägliche
Verabreichung von Hyaluronsäure
zu einer narbenfreien Gewebereparatur in einem fötalen Tiermodell führen kann
und dass dieses Glycosaminoglycan eine wichtige Rolle bei der Wiederherstellung
der Haut spielt. Darüber
hinaus hat die technische Praxis uns gelehrt, dass langfristige
hohe Mengen von Hyaluronsäure
eine der grundlegenden Bedingungen schaffen, um eine narbenfreie Hautreparatur
zu erhalten (West D. C. et al., J. Biochem. Cell Biol. 1997, 29,
201–210,
Iocono, J. A. J. Pediatric Surg. 1998, 33, 564–567).
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Hyaluronsäure ist
ein Polysaccharidether, der aus abwechselnden Resten von D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosamin
aufgebaut ist. Es handelt sich um ein geradkettiges Polymer mit
einem Molekulargewicht, das zwischen 50.000 und 13.000.000 Da variieren
kann, je nach der Quelle, aus der es erhalten wurde, und je nach
den verwendeten Herstellungsmethoden. Es kommt in der Natur in den
perizellulären
Gelen vor, der Grundsubstanz des Bindegewebes von Wirbeltier Organismen,
bei denen es einen der Hauptbestandteile in der synovialen Gelenkflüssigkeit,
in der Gallerte des Glaskörpers,
in den Geweben der menschlichen Nabelschnur und in den Hahnenkämmen darstellt.
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In
den letzten Jahren sind verschiedene Hyaluronsäurederivate synthetisiert worden,
um Verbindungen mit pharmakologischen Eigenschaften zu erhalten
oder solche, die in verschiedene Formen von biologisch abbaubaren
und bioverträglichen
Biomaterialien zur Verwendung in den verschiedenen Gebieten der
Medizin, der Chirurgie und der Gewebetechnik verarbeitet werden
können.
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Zum
Beispiel sind vollständige
oder partielle Ester der Hyaluronsäure und die autovernetzten
Derivate der Hyaluronsäure
bekannt, ebenso wie deren Verwendung auf dem pharmazeutischen, auf
dem kosmetischen und auf dem Gebiet der biologisch abbaubaren Materialien
(US-Patent Nr. 4,851,521; 4,965,353; 5,676,964).
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Darüber hinaus
weisen Hyaluronsäurederivate
auf Grund der Einfügung
spezifischer Moleküle
in ihre Struktur neue Eigenschaften auf, welche die Ausgangshyaluronsäure nicht
besitzt. Zum Beispiel weisen die sulfatierten Derivate der Hyaluronsäure gerinnungshemmende
Eigenschaften auf und sind resistent gegenüber Hyaluronidase (WO 95/25751,
WO 98/45335).
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Schließlich ist
die Verwendung von N-sulfatierten Derivaten bei der Vorbeugung der
pathologischen Narbenbildung wie z.B. der hypertrophen Narbenbildung
und der Keloide bekannt. Jedoch ist von diesen Derivaten niemals
berichtet worden, dass sie in der Lage dazu sind, der Bildung von
normotrophen Vernarbungen vorzubeugen.
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Es
ist jetzt unerwarteterweise gefunden worden, dass Hyaluronsäurederivate
wirksam dabei sind, das Ausmaß der
normotrophen Narbenbildung zu vermindern und dass diese Aktivität höher ist
als diejenige der Hyaluronsäure
selbst.
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Das
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Verwendung eines Hyaluronsäurederivats
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der normotrophen
Narbenbildung auf der Haut bereitzustellen, gegebenenfalls in Verbindung
mit mindestens einer zusätzlichen
pharmakologisch oder biologisch aktiven Verbindung, wobei das Hyaluronsäurederivat
ein Ester der Hyaluronsäure
ist, worin 50 bis 80% der Carboxylfunktionen mit Benzylalkohol verestert
sind.
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Zur
Herstellung der verschiedenen, in der vorliegenden Erfindung verwendeten
Hyaluronsäurederivate
ist es möglich,
Hyaluronsäuren
jedes beliebigen Ursprungs zu verwenden, wie z.B. die Säuren, welche
aus den vorstehend erwähnten,
natürlichen
Ausgangsmaterialien extrahiert worden sind, zum Beispiel aus Hahnenkämmen. Die
Herstellung solcher Säuren
ist in der Literatur beschrieben: bevorzugt werden aufgereinigte Hyaluronsäuren verwendet.
Gemäß der Erfindung
werden insbesondere Hyaluronsäuren
eingesetzt, welche molekulare Fraktionen der vollständigen Säuren umfassen,
welche direkt durch eine Extraktion der organischen Materialien
erhalten wurden mit Molekulargewichten, die innerhalb eines weiten
Bereiches variieren, zum Beispiel von etwa 90–80% (MG = 11,7–10,4 Millionen)
bis 0,2% (MG = 30.000) des Molekulargewichts der vollständigen Säure, die
ein Molekulargewicht von 13 Millionen hat, bevorzugt zwischen 5%
und 0,2%. Solche Fraktionen können
durch verschiedene, in der Literatur beschriebene Methoden erhalten
werden, wie z.B. durch Hydrolysieren, Oxidieren, enzymatische oder
physikalische Prozeduren wie z.B. mechanische oder Bestrahlungsprozeduren.
Ursprüngliche
Extrakte werden daher häufig
im Laufe derselben Aufreinigungsprozeduren gebildet (siehe zum Beispiel
den Artikel von Balazs et al., welcher vorstehend in „Cosmetics
and Toiletries" zitiert
worden ist). Die Auftrennung und Aufreinigung der erhaltenen molekularen
Fraktionen werden durch bekannte Techniken bewerkstelligt, zum Beispiel
durch Molekularfiltration.
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Eine
aufgereinigte HY-Fraktion, die sich für eine Verwendung gemäß der Erfindung
eignet, ist diejenige, die als „nicht-entzündliches
NIF-NaHa-Natriumhyaluronat bekannt ist, welches von Balazs in der
Broschüre „Healon" – A guide to its use in Ophthalmic
Surgery, D. Miller & R.
Stegmann, Hrsg. John Wiley & Sons,
NY 81983, S. 5 beschrieben wurde.
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Besonders
wichtig als Ausgangsmaterial für
die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Derivate sind zwei
gereinigte aus Hyaluronsäure
erhältliche
Fraktionen, zum Beispiel diejenigen, die aus Hahnenkämmen extrahiert
sind, und als „Hyalastin" und „Hyalectin" bekannt sind. Die
Hyalastin-Fraktion hat ein durchschnittliches Molekulargewicht von
etwa 50.000 bis 100.000, während
die Hyalectin-Fraktion ein durchschnittliches Molekulargewicht von
etwa 500.000 bis 730.000 hat. Eine kombinierte Fraktion dieser zwei
Fraktionen ist ebenfalls isoliert worden und wurde charakterisiert,
dass sie ein Durchschnitts-Molekulargewicht von etwa 250.000 bis
etwa 350.000 aufweist. Diese kombinierte Fraktion kann in einer
Ausbeute von 80% der gesamten, in dem jeweiligen Ausgangsmaterial
verfügbaren
Hyaluronsäure
erhalten werden, während
die Hyalectin-Fraktion in einer Ausbeute von 30% und die Hyalastin-Fraktion
in einer Ausbeute von 50% der Ausgangs-HY erhalten werden kann.
Die Herstellung dieser Fraktionen und die Verwendungen bei der Erzeugung
von Derivaten sind in
EP
0216453 B1 beschrieben.
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Die
Salzbildung von HY mit den vorstehenden Metallen zur Herstellung
der Ausgangssalze für
den jeweiligen Veresterungsprozess der vorliegenden Erfindung vorstehend
beschrieben wird auf eine per se bekannte Art und Weise durchgeführt, zum
Beispiel indem man HY mit der errechneten Menge Base reagieren lässt, zum
Beispiel mit alkalischen Hydraten oder basischen Salzen solcher
Metalle wie z.B. Carbonaten oder Bicarbonaten.
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Die
Hyaluronsäurederivate,
welche für
die Herstellung der Biomaterialien gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können,
sind die Ester der Hyaluronsäure,
worin ein Teil der Carboxylfunktionen mit Benzylalkohol verestert
sind (
EP 0 216 453
B1 ).
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Die
Hyaluronsäurederivate
sind partielle Ester mit Benzylalkohol.
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Der
Grad der Veresterung der Hyaluronsäure mit den vorstehend erwähnten Alkoholen
variiert zwischen 50 und 80%. Normalerweise verstärkt ein
hoher Grad der Veresterung der Hyaluronsäure bis zur vollständigen Veresterung
den lipophilen Charakter und vermindert daher deren Löslichkeit
in Wasser.
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In
den partiellen Estern können
die nicht veresterten Carboxylgruppen frei gehalten werden oder
können
in Salze überführt werden.
Es ist möglich,
anorganische Salze zu bilden, die von den Alkalimetallen wie z.B.
Kalium und insbesondere Natrium und Ammonium abgeleitet sind oder
die von Erdalkalimetallen wie z.B. Calcium- oder Magnesium- oder
Aluminiumsalzen abgeleitet sind. Besonders interessant sind die
Salze mit organischen Basen, insbesondere Stickstoff enthaltende
Basen und deshalb aliphatische, arylaliphatische, cycloaliphatische
oder heterocyclische Amine.
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Diese
Ammoniumsalze können
sich von therapeutisch verträglichen,
aber inaktiven Aminen ableiten oder von Aminen mit therapeutischer
Wirkung. Von den erstgenannten sollten vor allem die aliphatischen
Amine in Betracht gezogen werden, wie z.B. Mono-, Di- und Trialkylamine
mit Alkylgruppen, welche maximal 18 Kohlenstoffatome besitzen, oder
Arylalkylamine mit der gleichen Anzahl von Kohlenstoffatomen in
dem aliphatischen Teil und wobei Aryl eine Benzolgruppe bedeutet,
die gegebenenfalls durch 1 und 3 Methylgruppen oder durch Halogene
oder durch Atome von Hydroxylgruppen substituiert sind. Die biologisch
inaktiven Basen für die
Bildung von Salzen können
auch cyclisch sein, wie z.B. monocyclische Alkylenamine mit Ringen
zwischen 4 und 6 Kohlenstoffatomen, die in der Ringstruktur gegebenenfalls
durch Heteroatome unterbrochen sein können, ausgewählt aus
der Gruppe von Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, wie z.B. Piperidin
oder Morpholin, und die zum Beispiel durch Amin- oder Hydroxylfunktionen
substituiert sein können,
wie z.B. Aminoethanol, Ethylendiamin, Ephedrin oder Cholin.
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Es
ist auch möglich,
quaternäre
Ammoniumsalze der partiellen Ester zu bilden, zum Beispiel die Tetraalkylammoniumsalze
mit der vorstehend erwähnten
Zahl von Kohlenstoffatomen und bevorzugt Salze eines solchen Typs,
in dem die vierte Alkylgruppe zwischen 1 und 4 Kohlenstoffatome
aufweist, zum Beispiel eine Methylgruppe.
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Zu
den biologisch aktiven Aminen, deren therapeutische Aktivitäten ausgenutzt
werden können,
gehören
alle Stickstoff enthaltenden und basischen Arzneistoffe wie z.B.
diejenigen, die zu den folgenden Gruppen gehören:
Alkaloide, Peptide,
Phenothiazine, Benzodiazepine, Thioxanthene, Hormone, Vitamine,
Antikonvulsiva, Antipsychotika, Antiemetika, Anaesthetika, Hypnotika,
Appetitzügler,
Beruhigungsmittel, Muskelrelaxantien, koronäre Vasodilatatoren, Antineoplastika,
Antibiotika, antibakterielle Wirkstoffe, antivirale Wirkstoffe,
Anti-Malaria-Wirkstoffe,
Carboanhydrase-Hemmer, nicht-steroidale entzündungshemmende Wirkstoffe,
Vasokonstriktoren, cholinerge Agonisten, cholinerge Antagonisten,
adrenerge Agonisten, adrenerge Antagonisten, narkotische Antagonisten.
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Verfahren zur Herstellung
von HY-Estern
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Verfahren A:
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Die
Ester der Hyaluronsäure
können
gemäß der Erfindung
durch Verfahren hergestellt werden, die per se für die Veresterung von Carbonsäuren bekannt
sind, zum Beispiel durch Behandlung der freien Hyaluronsäure mit
dem gewünschten
Alkohol in Gegenwart von katalysierenden Substanzen wie z.B. von
starken anorganischen Salzen oder Ionenaustauschern des sauren Typs
oder mit einem Veretherungsmittel, welches in der Lage ist, den
gewünschten
Alkoholrest in Gegenwart von anorganischen oder organischen Basen
einzuführen.
Als Veretherungsmittel kann man diejenigen verwenden, die in der
Literatur bekannt sind, wie z.B. besonders die Ester verschiedener
anorganischer Säuren
oder von organischen Sulphonsäuren
wie z.B. Wasserstoffsäuren,
das sind halogenierte Kohlenwasserstoffe wie z.B. Methyl- oder Ethyljodid
oder neutrale Sulfate oder Hydrocarbylsäuren, Alfite, Carbonate, Silikate,
Phosphite oder Hydrocarbylsulfonate wie z.B. Toluol- oder p-Toluolsulfonat
oder Methyl- oder Ethyl-Chlorsulfonat. Die Reaktion kann in einem
geeigneten Lösungsmittel
ablaufen, zum Beispiel einem Alkohol, bevorzugt demjenigen Alkohol,
welcher der Alkylgruppe entspricht, die in die Carboxylgruppe eingeführt werden
soll. Die Reaktion kann jedoch auch in unpolaren Lösungsmitteln
ablaufen, wie z.B. in Ketonen, Ethern wie z.B. Dioxan oder in aprotischen
Lösungsmitteln
wie z.B. Dimethylsulfoxid. Als Base kann man zum Beispiel ein Hydrat
eines Alkali- oder eines Erdalkalimetalls oder Magnesium- oder Silberoxid
oder ein basisches Salz von einem dieser Metalle wie z.B. ein Carbonat
und von den organischen Basen, eine tertiäre azotierte Base wie z.B.
Pyridin oder Collidin einsetzen. An Stelle der Base kann man auch
einen Ionenaustauscher des basischen Typs verwenden.
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Ein
anderes Veresterungsverfahren verwendet die Metallsalze oder Salze
mit organischen azotierten Basen, zum Beispiel Ammonium- oder Ammoniumersatzsalze.
Bevorzugt werden die Salze der Alkali- oder Erdalkalimetalle eingesetzt,
es können
aber auch andere metallische Salze verwendet werden. Die Veresterungsmittel
sind auch in diesem Fall die vorstehend erwähnten und dasselbe gilt für die Lösungsmittel.
Es ist bevorzugt, aprotische Lösungsmittel
zu verwenden, zum Beispiel Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid.
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In
den nach diesem Verfahren oder gemäß dem anderen nachstehend beschriebenen
Verfahren erhaltenen Estern können
die freien Carboxylgruppen der partiellen Ester falls gewünscht in
einer per se bekannten Art und Weise in Salze überführt werden.
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Verfahren B:
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Die
Hyaluronsäureester
der vorliegenden Erfindung können
jedoch auch vorteilhafterweise durch das in
EP 0216453 B1 beschriebene
Verfahren hergestellt werden. Das Verfahren besteht daraus, ein
quaternäres Ammoniumsalz
eines sauren Polysaccharids, welches Carboxylgruppen enthält, mit
einem Veretherungsmittel zu behandeln, vorzugsweise in einem aprotischen
organischen Lösungsmittel.
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Von
den Hyaluronsäureestern
sind diejenigen mit einem Veresterungsgrad zwischen 65% und 80% besonders
bevorzugt.
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Die
Hyaluronsäurederivate
können
in verschiedenen Formen hergestellt werden wie z.B. in Form von Gelen,
von Leitkanälen,
von Schwämmen,
von Vliesfolien, von Fäden,
von nicht perforierten oder perforierten Membranen, von Mikrosphären, von
Nanosphären,
von Gazekompressen und deren Verbindungen, wahlweise zusammen mit
einem oder mehreren zusätzlichen
pharmazeutisch verträglichen
Trägern
oder Excipienten.
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Die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch pharmakologisch oder
biologisch aktive Substanzen wie z.B. Antibiotika, Wachstumsfaktoren,
Antimykotika, antimikrobielle Wirkstoffe, antivirale Wirkstoffe,
desinfizierende Wirkstoffe, Anaesthetika und Phospholipide enthalten.
Diese aktiven Substanzen können
auch in einem Vehikel eingeschlossen und freigesetzt werden, wobei
Hyaluronsäure
und ihre Derivate in Form von Mikrosphären und Nanosphären und
auch in Form der früher
beschriebenen Biomaterialien vorliegen können.
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Beispiel 1
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Verminderung der Fläche von
Hautvernarbungen in einem Rattenmodell nach Behandlung der Wunde
mit dem Benzylester der Hyaluronsäure (HYAFF® 11)
mit 75% Veresterung und mit der Hyaluronsäure/Hyalastin-Fraktion
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Die
Tiere wurden durch eine intramuskuläre Injektion von Ketamin/Xilazin
(0,1 mg/g oder 2,5 ml Lösung)
sediert. Eine Anästhesie
durch die Inhalation von Metophan wurde ebenfalls durchgeführt und
die Atmungsrate wurde überwacht,
um eine ausreichende Beatmung sicher zu stellen. Die Rücken der
Tiere wurden rasiert, gewaschen und mit Chlorhexidin und einer Jodatlösung desinfiziert.
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Maximal
4 Vollhautverletzungen wurden an jedem Tier angebracht, wobei eine
Stanze mit einem Durchmesser von 6 mm benutzt wurde.
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Die
Wunden wurden, wie in Tabelle 1 beschrieben, behandelt:
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Zwei
der Wunden in jedem Tier wurden behandelt und zwei wurden als Kontrolle
verwendet, um eine interne Kontrolle für die Stelle zu haben. Die
behandelten Flächen
(3 pro Behandlungsgruppe) wurden zu vorgegebenen Zeitpunkten entfernt
(1, 3, 7, 14, 28, 42 Tage). Die Proben wurden in Schnitte geschnitten
und mit Mallory's-Dreifach-Färbelösung angefärbt. Die
Schnitte wurden mit einem optischen Mikroskop untersucht und das
vernarbte Gebiet wurde vermessen. Dir graphische Darstellung 1 zeigt
Werte, die als Prozentsätze
des Narbengebiets der behandelten Stellen im Vergleich zu denen
der unbehandelten Stellen ausgedrückt sind, und jeder Wert entspricht
dem Mittelwert von drei Bestimmungen in drei verschiedenen Tieren.
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Es
ist offensichtlich, dass eine einzige Anwendung des partiellen Benzylesters
der Hyaluronsäure
(HYAFF® p75%)
der Bildung von Vernarbungen besser vorbeugen kann als eine einzige
Anwendung von Hyaluronsäure
(60 mg/ml). In der Tat kann man schon am 14. Tag beobachten, dass
die Narbengebiete der mit HYAFF® p75%
behandelten Gruppe 40% weniger ausgedehnt sind als die Kontrollgebiete,
während
im Fall der Stellen, welche mit Hyaluronsäure behandelt wurden, die Narbengebiete
ausgedehnter sind als die Kontrollgebiete.
