ITPD20120173A1 - "nuovo sistema di rilascio di proteine idrofobiche" - Google Patents

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ITPD20120173A1
ITPD20120173A1 IT000173A ITPD20120173A ITPD20120173A1 IT PD20120173 A1 ITPD20120173 A1 IT PD20120173A1 IT 000173 A IT000173 A IT 000173A IT PD20120173 A ITPD20120173 A IT PD20120173A IT PD20120173 A1 ITPD20120173 A1 IT PD20120173A1
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amide
sustained release
timp
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IT000173A
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Monica Campisi
Cristian Guarise
Davide Renier
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Fidia Farmaceutici
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Description

Descrizione “Nuovo sistema di rilascio dì proteine idrofobiche"
CAMPO DELL’INVENZIONE
Il primo farmaco ottenuto ingegnerizzando un sistema vivente (batterico) è stato l'insulina, approvato dalla Food and Drug Administratìon (PDA) nel 1982. Anche l'ormone della crescita umano, precedentemente estratto dai cadaveri, fu rapidamente ingegnerizzato. Nel 1986 la FDA approvò il primo vaccino umano ricombinante, contro l'epatite B. La produzione industriale di farmaci utilizzando i sistemi vìventi come bioreattori si è da allora largamente diffusa, diventando attualmente la via preferita di sintesi di numerosi farmaci, in particolare per il costo di produzione relativamente basso.
Infatti, sono molte le proteine umane studiate ad uso terapeutico (e non) prodotte tramite la tecnologia della bioingegnerizzazione tra cui l' eritropoietina (per la cura dell’anemia), l' interleuchina 2 (per il trattamento del carcinoma renale), l' IL-1 Ra (antagonista recettoriale dell'IL-1 ), il glucagone, l'interferone, l’enzima DNasi umano, la calcitonina ed altre ancora.
Questi farmaci sono di natura prevalentemente proteica o polìpeptidica e vengono somministrati generalmente per vìa parenterale in quanto la somministrazione orale determinerebbe la rapida degradazione del principio attivo. La via parenterale, tuttavia, per le ripetute somministrazioni ai fini dell’efficacia terapeutica può risultare problematica per la complìance del paziente. Infatti, queste proteine generalmente presentano un 'emitiva molto bassa per cui, ad esempio, l'ormone della crescita hGH (prodotto per via genica) richiede iniezioni giornaliere. Conseguentemente, per diminuire il numero di somministrazioni ed accrescere la compliance del paziente, sono state molte le sperimentazioni atte a sviluppare sistemi di rilascio di proteine/farmaco con aumentata emivita.
Questi sistemi di rilascio devono garantire il mantenimento dell’ attività del farmaco, quindi devono assicurare l’integrità della struttura tridimensionale della proteina/farmaco, ma le situazioni di stress che possono verificarsi durante la loro preparazione, come la presenza di solvente organico e/o variazioni di temperatura e di pH, possono determinare la deamidazione o l’ossidazione della catena proteica con conseguente sua denaturazione e perdita dell’attività terapeutica.
Come sistema di rilascio di piccoli peptidi risulta noto, ad esempio, l utilizzo di microsfere di PLGA ( Poly lactìc-glycolic acid) con ottimi risultati (Hutchinson F.G., Biochem. Soc. Trans., 1985, 13:520-523), tuttavia non è stato possibile il suo impiego per la formulazione di un depot nel rilascio di hGH, per la denaturazione della proteina che creava problemi infiammatori.
La contìnua ricerca di sistemi di rilascio di proteine/farmaco privi di tossicità con inalterata efficacia del principio attivo veicolato, ha portato all 'utilizzo di polimeri naturali per formulazioni che (a causa/grazie alla loro associazione col principio attivo) possono presentare una modifica nella cinetica del farmaco a loro associato. L’acido ialuronico (HA) è un etero- polisaccaride composto da residui alternati di acido D-glucuronico e N-acetil-D-glucosammina. E’ un polimero naturale a catena lineare con peso molecolare variabile tra ì 50.000 e i 13 x 10<6>Da, a seconda della fonte dalla quale viene ottenuto e dai metodi di preparazione impiegati
E' presente in natura nei geli pericellulari, nella sostanza fondamentale del tessuto connettivo degli organismi vertebrati (dei quali rappresenta uno dei componenti principali), nel fluido sinoviale delle articolazioni, nell’ umor vitreo e nel cordone ombelicale.
L’HA gioca quindi un ruolo biologico importante negli organismi viventi, fornendo anche supporto meccanico alle cellule di molti tessuti, come pelle, tendini, muscoli e cartilagine,
Per le sue proprietà l’acido ialuronico agisce nella protezione dei tessuti dai radicali liberi, nel controllo dei processi infiammatori e nella stimolazione dell' angiogenesi, risultando particolarmente efficace nella modulazione di tutte le principali fasi della cicatrizzazione (EPI 196179),
E noto l' utilizzo del suddetto polisaccaride come veicolo di farmaci di vari natura, in semplice associazione o salificati con l’acido ialuronico, poiché le sue peculiari proprietà di biocompatibilità, biodegradabilità, non-immunogenecità, viscosità e idratabìlità, lo rendono particolarmente indicato come sistema di rilascio di farmaci e molecole sia a livello topico che sistemico (EPG197718, EP0445255). Il suddetto polisaccaride è stato studiato anche come drug delivery di proteine particolari, come l'ILRa (US ,096,728), l' eritropoietina (Hahn SK. et al., Int J Pharm., 2006, 28, 322:44-51), l insulina (Nomura M. et al., J Pharm Pharmacol, 1994, 46:768-770) e l’ormone della crescita (Kim SJ. et al., Journal of Control led Release, 2005, 104:323-335), l'interferone e l'ormone follìcolo stimolante (US 8, 025, 900).
In tutti questi casi, l'associazione del farmaco al polisaccaride ha determinato un rilascio “prolungato” della proteina veicolala, ma non sufficiente per permettere la diminuzione del numero di somministrazioni del farmaco stesso.
Infatti, l' ΗΑ è un polisaccaride completamente naturale e viene rapidamente degradato dagli enzimi presenti nell’organismo (ialuronidasi) liberando (in tempi relativamente rapidi) il farmaco ad esso associato. Per questi motivi, l’HA è stato modificato chimicamente sia nei sui gruppi carbossilìci che idrossilici per dar luogo a derivati crossiinkati (US4,582,865; US4,713,448; US5,67Ó,964; US4, 957,74; US5,827,937) o derivatizzati con altri polimeri naturali o sintetici, o con molecole di varie dimensioni e caratteristiche chimico-fisiche (US4,85 1 ,521 ); tuttavia, i processi dì preparazione di questi derivati spesso compromettono l integrità del l agente farmacologico veicolato .
Oggetto della presente invenzione sono nuovi sistemi di rilascio comprendenti specìfiche amidi dell' acido ialuranico in associazione con proteine terapeuticamente e/o biologicamente attive a carattere prevalentemente idrofobico, per un rilascio sostenuto e prolungato nel tempo che aumenta sia l' efficacia del farmaco che la compliance del paziente.
Vengono di seguito elencati alcuni esempi di proteine terapeuticamente e/o biologicamente attive con carattere prevalentemente idrofobico, oggetto della presente invenzione: L'insulina è un ormone proteico dalle proprietà anaboliche, prodotto dalle cellule beta delle isole di Langerhans all’intemo dei pancreas; è formata da due catene unite da due ponti solfuro. La sua funzione piu nota consiste nella regolazione dei livelli di glucosio ematico per la riduzione della glicemia, Questa proteina viene quindi utilizzata per la cura del diabete dì tipo I o di tipo 2 con produzione di insulina assente o molto scarsa. La somministrazione dell’ormone avviene mediante iniezione sottocutanea (infatti, se iniettata direttamente in circolo determina un assorbimento troppo rapido del farmaco con possibili ipoglicemie). L’approccio terapeutico è basato su un numero giornaliero variabile di rilevazioni della glicemia del paziente con conseguenti somministrazioni a dosaggi calibrati dì insulina (da 3 in su), L’ormone della crescita o GH ( growth hormone) è un ormone peptidìco dell’adenoipofisi composto da 191 amminoacidi per un peso di 22.005 Da. La sua funzione principale consiste nella stimolazione dello sviluppo dell'organìsmo umano (e di molti altri vertebrati) promuovendo l accrescimento e la divisione mitotica delle cellule di quasi tutti ì tessuti corporei (promuove, in modo particolare, la crescita del tessuto osseo, cartilagineo e connetti vale).
Durante l'infanzia, l iposecrezione di GH determina nanismo ipofisario mentre l' ipersecrezione causa gigantismo ipofisario. Se l'ipersecrezione inizia dopo il termine del l accrescimento, in genere a causa di un tumore, si ha acromegalia in cui le ossa della faccia, delle mani e dei piedi si ingrandiscono notevolmente.
Viene quindi utilizzato sia nei pazienti ancora in fase di crescita che negli adulti sofferenti di tumore ipofisario.
Il GH viene utilizzato come terapia di cura anche in patologie che non sono causate da un deficit di GH, come la sindrome di , la malattia renale cronica, la ISS (bassa statura di natura idiopatica), la sclerosi multipla, per aumentare la perdita di peso nei pazienti obesi, nella fibromialgia, nella Crohn's disease e nella colite ulcerosa.
Recentemente è stata sperimentata, con ottimi risultati, la somministrazione intra- articolare del hGH come terapia di cura della patologia osteoartrosica (OA), con cui si dimostra l'efficacia del suddetto ormone anche nella riparazione del danno cartilagineo OA (E PI 153607; Kim SB et al., J Korean Med Sci., 2010, 25:776-80),
La calcitonina, CT, è un ormone costituito da un polipeptìde di 32-aminoacidi prodotto, negli esseri umani, dalle cellule parafollicolari (note anche come cellule C) della tiroide. La principale funzione della calcitonina consìste nell 'abbassare la concentrazione di calcio nel sangue contrastando gli effetti dell'ormone paratiroideo paratormone. Tale meccanismo di regolazione del calcio è stato riscontrato nei pesci, rettili, uccelli e mammiferi. L’ormone calcitonina agisce anche a livello renale stimolando l'eliminazione tabulare di calcio. La sCT (CT di salmone) viene generalmente utilizzata nel trattamento dell’ osteoporosi, nell' ipercalcemia nelle metastasi ossee e nella terapia del morbo di Paget
Anche in questo caso, recenti dati sperimentali hanno evidenziato l’efficace effetto della calcitonina conte terapìa di cura delfosteoartrosi: la sua somministrazione si è infatti rivelata efficace nel proteggere le superfici articolari dall 'erosione determinata dalla patologia OA (Manicourt DH et al., J Musculoskelet Neuronal Internet, 2005, 5(3): 285-293),
IL1-Ra è l’antagonista recettoriale della citochina IL- 1. potente induttore dei processi infiammatori sia locali che sistemici. IL- 1 viene prodotta principalmente dai linfociti B, T e dai macrofagi dopo stimolo batterico o stimolazione da parte dì altre citochine; viene anche secreta dai macrofagi alveolari, dalle cellule endoteliali, epiteliali e muscolari lisce, dai fibroblasti, dagli osteoclasti, dai sinoviociti e da molti altri tipi cellulari. IL- 1 è coinvolta in patologìe particolarmente gravi come la psoriasis e lo shock settico partecipando, inoltre, alla patogenesi di alcuni tipi di neoplasie. In combinazione con altre citochine, IL- 1 rappresenta uno dei maggiori mediatori dei processi infiammatori risultando così coinvolta in molte patologie come, ad esempio, l osteoporosi, l artrite reumatoide (RA), l’artrite psoriasica e l artrosi (OA): infatti, elevate quantità di IL- 1 sono state trovate nel liquido sinoviale di pazienti affetti da artrite reumatoide e/ o osteoartrosi. L’espressione di IL-1 è cruciale per la patogenesi dell'OA: infatti, IL- 1 promuove la sìntesi, la secrezione e l' attivazione delle metalloproteasi (MMP), enzimi proteasici prodotti dai condrociti, responsabili della degradazione della matrice cartilaginea.
Tutti i dati sperimentali relativi al processo OA supportano fortemente il concetto che IL- 1 e TNFa rappresentino il principale sistema catabolico coinvolto nella distruzione dei tessuti articolari: infatti, è stato dimostrato che bloccando la produzione e/o l'attivazione di IL-1, si previene e/o si diminuisce la distruzione della matrice articolare (Caron J.P. et al., Arthritis Rheum, 1996, 39; 1535- 1544).
Attualmente , per contrastare gli effetti di questa citochina vengono impiegati nuovi farmaci contenenti l antagonista recettoriale IL-1 Ra, in quanto il blocco del recettore si è rivelato un efficace modo per curare quelle patologie in cui IL- 1 è tra i protagonisti (Burger D, et al,, Cytokìne Reference, Oppenheim JJ e Feldmann M, Eds, New York, London, Academic Press, 2000, p. 319-336; Jiang Y, et al., Arthrìtis Rheum, 2000, 43(5): 1001 -9).
IL- 1 Ra è una proteina umana che agisce come inibitore della suddetta interleuchina, tuttavia, ì farmaci contenenti IL-1Ra (come il Kineret ® a base di anakinra, i.e. la forma ricombinante nonglicosìlata della proteina umana IL-1 Ra) hanno una half-life molto breve che spesso compromette il risultato clinico. Diviene quindi importante formulare una nuova composizione farmaceutica contenente IL- 1 Ra per poter somministrare il farmaco in modo sostenuto e prolungato, garantendo una half-life maggiore per risultati clinici consolidati.
II Fattore stimolante le colonie granulocitarie (G-CSF) è una glicoproteina di 174- 180 aminoacidi capace di stimolare il midollo osseo a produrre granulociti e staminali rilasciati successivamente nel letto circolatorio. Questo fattore di crescita è risultato attivo anche come neurotrofìna e per questo motivo è attualmente studiato per il trattamento dell’ ischemia cerebrale e la sclerosi laterale amiotrofica . Viene normalmente utilizzato nei pazienti oncologici per contrastare la neutropenia legata alla chemioterapia; infine, recenti studi sperimentali hanno evidenziato come il trattamento endovenoso con G-CSF favorisca la rigenerazione delle cellule cardiache danneggiate.
Il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) è una proteina biologicamente attiva costituita da un dimero composto da due polipeptidi collegati mediante ponte disolfuro, designati A e B. Sintetizzata prevalentemente nei megacariociti, nell’uomo rappresenta il principale agente mitogeno sierico per le cellule di origine mesenchimale. Viene impiegata per favorire la cicatrizzazione dì ferite/ulcere poiché è un mediatore della formazione dello stroma connettivale e, per tutti questi motivi, attualmente è anche utilizzata nel promuovere la formazione di nuovo tessuto osseo,
Il Fattore di crescita trasformante- β (TGFβ) è un peptide che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del sistema immunitario, nella rigenerazione tissutale, nella differenziazione cellulare e nell'embriogenesi. Viene prevalentemente utilizzato come agente cicatrizzante poiché in grado di aumentare l' healìng di ferite/ulcere cutanee e di favorire la chiusura delle fratture ossee; per i suddetti motivi è utilizzato anche nel trattamento dell osteoporosi e delOA. Infine, dati sperimentali hanno evidenziato che il TGFβ possiede anche proprietà cardioprotettive dopo danno ischemico cardiaco.
Il fattore di crescita dell'epidermide (EGF) è un fattore di crescita che svolge un ruolo importante nel regolare la crescita, la proliferazione e la differenziazione cellulare. L'EGF umano è una proteina di 6045 dalton, composta da 53 residui amminoacidi e tre ponti disolfuro intramolecolari. È presente nelle piastrine, macrofagi, urina, saliva, latte, plasma.
È una proteina usata come gastroprotettivo perché in grado di stimolare la proliferazione delle cellule della mucosa gastrointestinale; è utilizzata per promuovere la rigenerazione dei tessuti cutanei poiché capace di stimolare la formazione di nuovo tessuto di granulazione nella cura di ferite/ulcere cutanee venose o di altra natura. Infine, applicazioni topiche di EGF hanno evidenziato ottimi risultati nella rigenerazione di tessuto corneale danneggiato, ad esempio dopo chirurgia corneale o nel caso di patologie degenerative come la cheratite.
Il fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF-B) è un fattore di crescita proteico coinvolto sia nella vasculogenesi (intesa come genesi ex novo di un sistema circolatorio in età embrionale), la neurogenesi e l'angiogenesi. E anche un agente neuroprotettivo in grado di proteggere i neuroni da danni di tipo ischemico NMDA-mediati.
L'eritropoietina o EPO è un ormone glicoproteico prodotto negli esseri umani dai reni e, in misura minore, dal fegato e dal cervello, che ha come funzione principale la regolazione dell'eritropoiesi (produzione dei globuli rossi da parte del midollo osseo).
L'EPO è stata prodotta anche in laboratorio e utilizzata come farmaco per curare le anemie in pazienti affetti da malattie renali o da malattie del sangue, o per permettere un recupero più veloce dopo la somministrazione di chemioterapia nei pazienti affetti da cancro. In studi recenti è stato osservato un ruolo neuroprotettivo di EPO come agente antinfiammatorio,
L'eritropoietina è una molecola glicoproteica del peso di circa 30(X)0 D. Finalmente, dal 1989 lΕΡΟ è stata resa disponibile come farmaco per i pazienti anemici in dialisi. Successivamente, il suo impiego è stato esteso anche ai pazienti con insufficienza renale cronica in trattamento conservativo, contribuendo a migliorarne la qualità di vita. La produzione farmaceutica di eritropoietina si realizza con la metodica del DNA ricombinante.
Il fattore di crescita nervoso o NGF, è una proteina secreta nellipotalamo, dalla tiroide e dall’ ipofisi; viene prodotta anche dalle cellule muscolari lisce e dai fibroblasti. La forma attiva è l'NGFβ di 26KDa, omodimero con due ponti disolfuro che legano due catene proteiche di 1 18 aminoacidi. È responsabile del differenziamento e della funzionalità dei neuroni sìa del SN periferico che dei neuroni colinergici del SNC. Per questi motivi viene utilizzato come terapia delle patologie neurodegenerative come la demenza, l'NGF si è inoltre dimostrata utile per combattere il glaucoma.
La transferrina è la principale proteina di trasporto del ferro nel torrente circolatorio. Sintetizzata dal fegato e dal sistema monocitico-macrofagico, la transferrina è in grado di legare in modo molto stabile, ma reversibile, il ferro assorbito a livello intestinale e quello proveniente dalla degradazione dei globuli rossi, veicolandolo alle sedi di utilizzo (in particolare il midollo osseo) e di deposito (in particolare il fegato).
Dal punto di vista strutturale, si tratta di una glicoproteina formata da una catena polipeptidìca di 679 aminoacidi con peso molecolare di circa 80 KD, possiede due siti dì legame per lo ione ferrico (Fe<3+>) mentre non presenta affinità per lo ione ferroso (Fé<2+>); la sua emivita è di circa 8 giorni.
La transferrina è sintetizzata prevalentemente a livello epatico e i suoi valori di riferimento nel sangue sono 200-360 mg/dL. I livelli di transferrina aumentano durante l'uso della pillola anticoncezionale, durante la gravidanza e nei casi di livelli insufficienti di ferro. Diminuiscono invece per la sindrome nefrosica, malattie del fegato, malnutrizione, malattie infiammatorie croniche, neoplasie, terapie con ferro o con cortisonici. Una diminuzione fisiologica può esserci in età neonatale o in età senile. Le TIMPs sono proteine inibitrici delle metalloproteasi, enzimi coinvolti nella degradazione della matrice cartilaginea; nella famiglia delle TIMPs troviamo le forme TIMP-2, TIMP-3 e T1MP-4 prodotte dai condrociti, fibroblasti, sinoviociti, osteoblasti, neuroni, macrofagi, cellule muscolari lisce, epatocitì e altre ancora. Svolgono quindi un ruolo protettivo verso i condrociti e l’erosione cartilaginea che si verifica nella patologia OA.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE Oggetto della presente invenzione sono nuove composizioni farmaceutiche comprendenti specifiche amidi dell’ acido ialuronico in associazione (quindi non chimicamente legate) con proteine a carattere prevalentemente idrofobico, terapeuticamente e/o biologicamente attive, per la preparazione di un nuovo sistema di rilascio di proteine/farmaco a rilascio sostenuto e prolungato.
Infatti, questi nuovi sistemi determinano;
* Il rilascio delle sopra descrìtte proteine in modo sostenuto, per un periodo di tempo prolungato (vs la stessa proteina somministrata tal quale). Questo continuativo rilascio aumenta la finestra terapeutica del farmaco, poiché esso non viene rilasciato nella sua maggiore quantità nell’ immediato periodo che segue la sua somministrazione (come generalmente avviene per il farmaco somministrato tal quale), ma la sua somministrazione come sistema di rilascio in associazione a specifiche amidi dell' HA, ne modula sia la quantità rilasciata (in rapporto al tempo), sia il periodo di rilascio (nella sostanza, si ottiene l aumento progressivo della quantità di proteina rilasciata nel tempo, per un periodo finale dì rilascio maggiore rispetto a quello che si verifica nel caso della sua somministrazione come tale): in conclusione, viene profondamente modificato il profilo cinetico di rilascio della proteina/farmaco e, quindi, il suo profilo d’efficacia terapeutica.
* Il nuovo sistema di rilascio si presenta come privo di tossicità perché biocompatiblle e biodegradabile, in grado di determinare lo slow release della proteina/farmaco veicolata garantendone il mantenimento dell’attività terapeutica, quindi è assicurata l integrità della struttura tridimensionale del principio attivo che non subisce alcuna denaturazione. * il sistema di rilascio oggetto dell’ invenzione non causa alcuna modifica chimica della proteina veicolata in quanto è formato dall’ associazione tra particolari amidi dell' HA e le proteine veicolate ad esse associate/miscelate. Non viene quindi stabilito alcun legame chimico di natura covalente tra veicolo e farmaco, garantendo così l integrità strutturale della proteina/farmaco.
• Queste nuove caratteristiche aumentano notevolmente la compliance del paziente poiché il farmaco può essere somministrato come da nuova farmacocinetica, quindi con diverse posologìe: maggiori intervalli nei tempi di somministrazioni e modifiche nelle quantità di farmaco somministrate, portando così a
* Maggior efficacia e minori effetti collaterali.
Le proteine farmacologicamente e/o biologicamente attive oggetto della presente invenzione devono possedere carattere prevalentemente idrofobico misurato secondo l indice GRAVY (Grand Average of Hydropathy): il valore di GRAVY per un peptìde o proteina è calcolato come la somma dei hydropathy values di tutti gli aminoacidi presenti nella proteina stessa, divisa per il numero dei loro residui nella sequenza proteica. Infatti, ogni aminoacido possiede un dato hydropathy index che va dal 4,5 dell' isoleucìna (aa. con residuo formato da radicale idrocarburico aromatico che conferisce alla molecola un chiaro carattere non polare, quindi idrofòbico), al valore -4,5 dell'Arginina, aminoacido con residuo a carica positiva (Kyte J, et al., J. Mol. Biol., 1982, 157:105-132). Da questa scala si evince che tanto maggiore è Vhydropathy index tanto maggiore è l' idrofobicità dell' aminoacido analizzato (Figura 1). Per determinare facilmente il valore di GRAVY delle proteine analizzate, viene generalmente usato il programma ProtParam (Gasteìger E. et al,, Protein Identification and Analysìs Toois on thè ExPASy Server, JM Walker ed., The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press, 2005, 571-607), il quale fornisce varie proprietà chimico-fìsiche delle proteine studiate analizzando la sequenza delle stesse; grazie ad esso, inserendo la suddetta sequenza aminoacìdica, il programma elabora il GRAVY della proteina di cui si vuol conoscere il grado di idrofòbìcità.
Nella presente invenzione la Richiedente intende descrivere e rivendicare come proteine a carattere prevalentemente idrofobico, quelle che posseggono un indice GRAVY non inferiore a -0,5 per arrivare a valori positivi: anche in questo caso, tanto maggiore è l' indice GRAVY, tanto maggiore è l idrofobicita della proteina analizzata.
Alcuni esempi dì proteine a carattere prevalentemente idrofobico oggetto della presente invenzione sono dì seguito elencate:
*Insulina: indice GRAVY = 0,2
*Ormone della crescita umano. hGH: indice GRAVY = -0,3 * Calcitonina, sCT (CT di salmone): indice GRA VY = -0,5*L'antagonista recettorlaie di IL-1, IL-1Ra : indice GRAVY = -0,4
* (Granulocyte -Colony Stimulating Factor , G-CSF: indice GRAVY = 0,2
*Platelet-derived growth factor, PDGF: indice GRAVY — -0,5 (è preferito PDGF-BB = -0,1)
* Transforming growth factor TGF-β: indice GRAVY = -0,3 * Epidermal growth factor , EOF: indice GRAVY = -0,5
* Vascular endothelial growth factor B, VEGF-B: indice GRAVY = -0,2.
*Eritropoietina (umana) o EPO; indice GRAVY = -0,03.
* Nerve growth factor o NGFβ: indice GRAVY = -0,3.
* Transferrina (umana): indice GRAVY = -0,2.
* Tissue inhibitor of metalloproteinas (umana). ΤΪΜΡ-2:
indice GRAVY = -0,2.
* Tìssue inhibitor of memilloproteinase- 3 fumana). TIMP-3:
ìndice GRAVY = -0,3.
* Tissue inhibitor of metallo p ro teinase-4 (umana), T1MP-4:
indice GRAVY = -0,18.
La Richiedente di seguito ha dimostrato come le amidi dell’acido ialuronico oggetto della presente invenzione, di seguito elencate, formino un sistema di rilascio tale in grado di determinare il rilascio sostenuto e prolungato delle proteine a carattere idrofobico contenute in esso, mentre ha provato che proteine a carattere prevalentemente idrofilo, in associazione con le stesse amidi non formano sistemi di rilascio adeguati ad un loro rilascio sostenuto e prolungato nel tempo.
Le amidi di HA atte alla formazione dei suddetti sistemi di rilascio oggetto della presente invenzione sono:
• Esadecilamide di HA: amide dì HA con amina esadecilica, avente una percentuale di amidazione molare, determinata mediante 1 H-NMR, compresa tra il 5-20%, preferibilmente tra il 6- 12%, ancor più preferibilmente compresa tra 8-9%. • Ottilamide di HA: amide di HA con amina ottilica, avente una percentuale di amidazione molare, determinata mediante 1H-NMR, compresa tra il 5-25%, preferibilmente tra il 10-15%, ancor più preferibilmente compresa tra 10- 11 %.
• Dodecilamide di HA: amide di HA con amina dodecilica, avente una percentuale di amidazione molare, determinata mediante 1H-NMR, compresa tra il 5-25%, preferibilmente tra il 10-15%, ancor più preferibilmente compresa tra 10-1 1 %.
* Tert-butilamide di HA: amide di HA con anima tert- butilica, avente una percentuale di amidazione molare, determinata mediante 1H-NMR, compresa tra il 5-20%, preferibilmente tra il 6- 12%, ancor più preferibilmente compresa tra 7-8%. • Benzilamide di HA: amide di HA con amina benzìlìca, avente una percentuale di amidazione molare, determinata mediante 1H-NMR, compresa tra il 5-20%, preferibilmente tra il 6-15%, ancor più preferibilmente compresa tra 8-9%. L’HA utilizzato per la preparazione delle suddette amidi può derivare da qualsiasi fonte, ad esempio, per estrazione da creste di gallo (EPO138572), per via fermentativa (ad esempio da Streptococco equi come noto all’esperto del ramo), o per via tecnologica (ad esempio da Bacillus, WO20 12/032 154), ed avere un peso molecolare medio ponderale (determinato con il metodo del limìtìng viscosity number : Terbojevich et al., Carbohydrate Research, 1986, 149:363-377) compreso tra i 400 e 3x l0<6>Da, in particolare tra 50-730 KDa, tra 750-1230KDa o tra 1500-2500KDa, ancor più in particolare compreso tra 150-250KDa e/o tra 500-730 K Da.
Le sopraelencate amidi di HA, oggetto dell’ invenzione, possono essere preparate come da brevetto EP1095064 che, inoltre, ne descrive diversi utilizzi tra cui la formazione di sistemi dì rilascio di sostanze farmacologicamente attive, senza tuttavia fare alcuna distinzione tra specie chimica dei farmaci utilizzati e tipologia di amide selezionata e, soprattutto, senza descrivere l effetto ottenuto. La Richiedente, al contrario, descrive e rivendica particolari amidi dell’ HA, come l' esadecilamide, l' ottilamide. la dodecilamide, la tert-butilamide e la benzilamide, con particolari percentuali di amidazione e selezionati intervalli di MW, in associazione con proteine a carattere prevalentemente idrofobico (quindi con indice GRAVY superiore a -0,5) terapeuticamente e/o biologicamente attive, per la preparazione di un nuovo sistema di rilascio sostenuto e prolungato delle suddette proteine/farmaco provandone l’efficacia: la Richiedente descrive come preferite le seguenti proteine:
• Insulina
• hGH
• sCT
• IL-1Ra
• G-CSF
• PDGF
• TGF-β
• EGF
• VEGF-B
• EPO
• NGFβ
• Transferrina
• TIMP-2. TlMP-3, TlMP-4.
Queste proteine possono essere prodotte per estrazione da tessuto, o essere proteine ricombinanti ottenute mediante tecniche di ingegneria genetica come noto all’esperto del ramo.
Ulteriore oggetto dell’invenzione sono nuovi sistemi di rilascio comprendenti:
I . l’esadecilamide e/o l' ottilamide. e/o la dodecilamide. e/o la tert- butilamide e/o la benzilamide dell’ HA, in associazione con
2. Insulina, e/o hGH. e/o sCT, e/o IL-IRa, e/o G-CSF, e/o PDGF. e/o TGF-β . e/o EGF e/o VECF-B, e/o EPO, e/o NGFβ. e/o Transferrina. e/o ΤIΜΡ-2. e/o TIMP-3. e/o TIMP-4, eventualmente in associazione
3- ad agenti stabilizzanti (quando necessario) ed eccipienti. In modo particolare, oggetto dell’ invenzione è il sistema comprendente:
1. lesadecilamìde di HA e
2. hGH e/o sCT
3, eventualmente in associazione ad agenti stabilizzanti ed eccipienti.
1 nuovi sistemi sono utilizzabili nel rilascio sostenuto e prolungato degli agenti attivi che contengono in quanto modificano la finestra terapeutica della proteina/farmaco associata: sono quindi possibili schemi posologici differenti con maggior compliance del paziente. A seconda della proteina presente nel nuovo sistema di rilascio, sarà stabilito l’utilizzo del sistema stesso, ad esempio, il sistema di rilascio comprendente :
* l’amide esadecilica di HA con hGH o con sCT viene qui descritto preferenzialmente con uso intra -articolare come terapia di cura dell’OA, dell'artrite reumatoide e psoriasica, osteoporosi.
La Richiedente, di seguito ha dimostrato come questo nuovo sistema di rilascio determini il rilascio continuo di hGH nel liquido sinoviale dell’articolazione trattata per un maggiore effetto terapeutico, senza tuttavia permettere all’ agente attivo di passare nel plasma (abbassando la sua concentrazione nell’ articolazione) ed evitando così effetti collaterali sistemici del farmaco stesso.
Oggetto della presente invenzione è inoltre il sistema comprendente;
*una o più amidi di HA precedentemente elencate e descritte, con insulina; questo nuovo sistema viene descritto dalla Richiedente come nuovo depot nel rilascio prolungato di insulina per il trattamento delle patologie diabetiche che richiedono minori somministrazioni dì farmaco.
Oggetto della presente invenzione è inoltre il sistema comprendente:
* una o più amidi di HA precedentemente elencate e descritte, preferenzialmente l' esadecilamìde. in associazione con proteine come PDGF. e/o TGF-β, e/o EGF. e/o VEGP-B. per uso iniettivo, o intra- artico lare, o topico, oppure per somministrazione orale.
I fattori proteici sopra descritti (PDGF, TGF-β, EGF, VEGF-B) sono fattori di crescita di cui è nota la presenza, in modo particolarmente concentrato, nel plasma umano arricchito in piastrine, definito PRP, Il nuovo sistema di rilascio che li contiene, sarà preferenzialmente utilizzabile nel trattamento dei danni articolari OA, nelle tendiniti, nella riparazione del danno muscolare cardiaco, nella riparazione di lacerazioni/fratture/cavità ossee per favorire la formazione di nuovo tessuto osseo, ed infine, nell' healing di ulcere/ferite/lacerazioni cutanee per favorire la formazione di nuovo tessuto connettìvale.
Oggetto della presente invenzione è anche il sistema comprendente:
* una o più amidi di HA precedentemente elencate e descritte, preferenzialmente l’esadecilamide. in associazione con gli inibitori delle metalloproteasi ΤΙΜP-2. e/o TIMP-3 e/o TIMP-4, per uso iniettivo. preferenzialmente intra-articolare.
Il nuovo sistema di rilascio che li contiene, sarà preferenzialmente utilizzabile nel trattamento del danno cartilagineo articolare OÀ e nella riparazione delle erosioni osteo-condrali.
Di seguito sono descritti gli esempi di preparazione dei nuovi sistemi di rilascio e le sperimentazioni effettuate dalla Richiedente per dimostrare l’efficacia dei suddetti sistemi oggetto della presente invenzione,
ESEMPIO 1: Sintesi del derivato esadecilamidico dì HA di MW medio ponderale compreso tra 500-730 kDa, Hyadd4 con percentuale di amidazione molare compresa tra 8-9%.
5,00 g di acido ìaluronico sale sodico di origine fermentativa con MW compreso tra 500-730kDa, vengono disciolti in 250 mi di acqua e la soluzione risultante viene fatta percolare attraverso una colonna di vetro pre-riempita con 100 mi di resina Dowex in forma di tetrabutilammonio. La soluzione dì HA, in forma di sale di TBA, eluita viene raccolta e liofilizzala.
2 g di prodotto così ottenuto, vengono discioltì in 200 mi di Dimetilsolfossido (DMSO) e addizionati di 64 μl dì acido metansolfonico; successivamente vengono aggiunti 52.8 mg di 1,1 ’-carbonildiimidazolo e si lascia sotto blanda agitazione per 1h a temperatura ambiente, Successivamente vengono aggiunti 582.3 mg di esadecilammina e la reazione di amidazione viene condotta a 42 °C per 24 ore.
La reazione viene arrestata aggiungendo 5 mi di una soluzione acquosa satura di NaC1 e, a distanza di 30 minuti, vengono aggiunti 1.5 volumi di etanolo assoluto per isolare il derivato ottenuto, Il precipitato viene lavato in etanolo/H20 80:20 e infine ìn etanolo assoluto, per poi essere essiccato in alto vuoto a 40°C.
Sì ottengono L3 g di derivato, il cui grado di amidazione viene determinato mediante 1H-NMR,
ESEMPIO 2; Sintesi del derivato ottilamidico di HA di MW medio ponderale compreso tra 500-730 kDa. Hyadd2 con percentuale di amidazione molare compresa tra 10-1 1%,
5.00 g di acido ialuronìco sale sodico di origine fermentativa con MW compreso tra 500-730kDa, vengono discioltì in 250 mi dì acqua e la soluzione risultante viene fatta percolare attraverso una colonna di vetro pre-riempita con 100 mi di resina Dowex in forma di tetrabutilammonio. La soluzione di HA, in forma di sale di TBA, eluita viene raccolta e liofilizzata.
2 g di prodotto cosi ottenuto, vengono disciolti in 200 ml di Dimetiìsolfossido (DMSO ) e addizionati di 64 μl di acido metansolfonìco; successivamente vengono aggiunti 61 ,4 mg di 1 ,1 ’ -carbonildiimidazolo e si lascia sotto blanda agitazione per 1h a temperatura ambiente. Successivamente vengono aggiunti 330 mg di ottilammina e la reazione di amidazione viene condotta a 42°C per 24 ore.
La reazione viene arrestata aggiungendo 5 mi di una soluzione acquosa satura di NaC1 e, a distanza di 30 minuti, vengono aggiunti L5 volumi di etanolo assoluto per isolare il derivato ottenuto. Il precipitato viene lavato in etanolo/H20 80:20 e infine in etanolo assoluto, per poi essere essiccato in alto vuoto a 40°C.
Si ottengono 1.2 g di derivato, il cui grado di amidazione viene determinato mediante 1H-NMR.
ESEMPIO 3: Sintesi del derivato dodecilamidico di HA di MW medio ponderale compreso tra 500-730 kDa. Hvadd3 con percentuale di amidazione molare compresa tra 1 U- 1 1 %.
5.00 g di acido ialuronico sale sodico di origine fermentativa con MW compreso tra 50Q-730kDa, vengono dìsciolti in 250 mi di acqua e la soluzione risultante viene fatta percolare attraverso una colonna di vetro pre- riempita con 100 ml di resina Dowex in forma di tetrabutilammonio. La soluzione di HA, in forma di sale di TBA, eluda viene raccolta e liofilizzata.
2 g di prodotto così ottenuto, vengono disciolti in 200 ml di Dimetilsolfossido (DMSO) e addizionati di 64 μl di acido metansoifonico; successivamente vengono aggiunti 54,2 mg di 1 ,1-carbonildiimidazolo e sì lascia sotto blanda agitazione per 1h a temperatura ambiente. In seguito vengono aggiunti 448 mg di dodecilammina e la reazione di amidazione viene condotta a 42<º>C per 24 ore.
La reazione viene arrestata aggiungendo 5 mi di una soluzione acquosa satura di NaC1 e, a distanza di 30 minuti, vengono aggiunti 1 ,5 volumi di etanolo assoluto per isolare il derivato ottenuto. Il precipitato viene lavato in etanolo/H20 80:20 e infine in etanolo assoluto, per poi essere essiccato in alto vuoto a 40ºC.
Si ottengono 1 .25 g di derivato, il cui grado di amidazione viene determinato mediante 1 H-NMR,
ESEMPIO 4; Sintesi del derivato tert-butilamidico di HA di MW medio ponderale compreso tra 500-730 kDa, Hvadd6 con percentuale di amidazione molare compresa tra 7-8%.
5.00 g di acido ialuronico sale sodico di origine fermentativa con MW compreso tra 5Q0-73QkDa vengono diseiolti in 250 mi di acqua e la soluzione risultante viene fatta percolare attraverso una colonna di vetro pre-rìempita con 100 mi di resina Dowex in forma di tetrabutilammonio. La soluzione di HA, in forma dì sale di TBA, eluita viene raccolta e liofilizzata.
2 g di prodotto così ottenuto, vengono disciolti in 200 mi di Dimetilsolfossido (DMSO) e addizionati di 64 μl di acido metansolfonico; successivamente vengono aggiunti 53 mg di 1 ,1-carbonildiimidazolo e si lascia sotto blanda agitazione per 1h a temperatura ambiente. In seguito vengono aggiunti 178 mg di tertbutilammina e la reazione di amìdazione viene condotta a 42°C per 24 ore.
La reazione viene arrestata aggiungendo 5 mL di una soluzione acquosa satura dì NaC1 e, a distanza di 30 minuti, vengono aggiunti L5 volumi di etanolo assoluto per isolare il derivato ottenuto, 11 precipitato viene lavato in etanolo/H 20 80:20 e infine in etanolo assoluto, per poi essere essiccati) in alto vuoto a 40°C.
Si ottengono 1 ,25 g di derivato, il cui grado di amidazione viene determinato mediante IH-NMR,
ESEMPIO 5: Sintesi del derivato benzilammidico di HA di MW medio ponderale compreso tra 500-730 kDa, Hyadd1 con percentuale di amidazione molare compresa tra 8-9%.
5.00 g di acido ialuronico sale sodico di origine fermentativa con MW compreso tra 500-730kDa vengono disciolti in 250 mi di acqua e la soluzione risultante viene fatta percolare attraverso una colonna di vetro pre-riempita con 100 mi di resina Dowex in forma di tetrabutilammonio. La soluzione di HA, in forma di sale di TBA, eluda viene raccolta e liofilizzata.
2 g di prodotto così ottenuto, vengono disciolti in 200 ml di Dimetìlsolfossido (DMSO) e addizionati di 64 μl di acido metansolfonico; successivamente vengono aggiunti 54,0 mg di 1.1 ’-carbonildiimidazolo e si lascia sotto blanda agitazione per 1h a temperatura ambiente. In seguito vengono aggiunti 260 mg dì benzilammina e la reazione di amidazìone viene condotta a 42°C per 24 ore.
La reazione viene arrestata aggiungendo 5 mi dì una soluzione acquosa satura di NaC1 e, a distanza di 30 minuti, vengono aggiunti 1.5 volumi dì etanolo assoluto per isolare il derivato ottenuto. Il precipitato viene lavato in etanolo/H2G 80:20 e infine in etanolo assoluto, per poi essere essiccato in alto vuoto a 40°C,
Si ottengono 1.25 g di derivato, il cui grado di amidazìone viene determinato mediante 1H-NMR.
ESEMPIO 6: preparazione di formulazioni contenenti HA e hGH in rapporto 10:1 e 20: 1 p/p
8 mg di Acido laluronìco sale sodico di origine fermentativa con MW compreso tra 150-250KDa (LMW) e tra 500-730kDa (MMW), vengono sciolti in 1 mi di tampone fosfato a pH=7.4. A dissoluzione completata, vengono aggiunti 0.8 mg di hGH per ottenere un rapporto in peso polisaccaride/proteina di 10: 1, e 0.4 mg di hGH per ottenere un rapporto in peso polisaccaride/proteina di 20: 1. 1 due componenti vengono opportunamente miscelati in modo che la composizione sia uniforme. Il grado di loading viene calcolato diluendolo 1: 10 in tampone e misurando assorbanza UV a 280 nm, che mediante una curva di taratura fornisce il valore di concentrazione del GH.
ESEMPIO 7: preparazione della formulazione contenente il sistema di rilascio formato da esadecilamide di HA e hGH in rapporto 10:1 p/p
8 mg di un derivato esadecilamìdico dell’ HA, Hyadd4 preparato come nel l Esempio 1 , vengono sciolti in 1 ml di tampone fosfato a pH=6.9. A dissoluzione completata, vengono aggiunti 0,8 mg dì hGH, previamente disciolti in una soluzione acquosa, e opportunamente miscelati in modo che la composizione sia uniforme e la proteina venga intrappolata all’ interno del gel. 11 grado di loading del gel viene calcolato diluendolo 1 :10 in tampone e misurando assorbanza UV a 280 nm, che mediante una curva di taratura fornisce il valore di concentrazione del GH.
ESEMPIO 8: preparazione della formulazione contenente il sistema di rilascio formato da tert-butìlamide di HA e di hGH. 10:1 p/p
8 mg di Hyadd6 preparato come nel l’Esempio 4, vengono sciolti in 1 ml di tampone fosfato a pH=6.9 (8 mg/ml). A dissoluzione completata, vengono aggiunti 0.8 mg di hGH, previamente disciolti in una soluzione acquosa, e opportunamente miscelati in modo che la composizione sia uniforme e la proteina venga intrappolata all' interno del gel. Il grado di loadìng del gel viene calcolato diluendolo 1 : 10 in tampone e misurando assorbanza U V a 280 nm, che mediante una curva di taratura fornisce il valore di concentrazione del GH.
ESEMPIO 9: preparazione della formulazione contenente il sistema di rilascio formato da ottilamide di HA e di hGH, 10:1 p/p 8 mg di Hyadd2 preparato come nell’Esempio 2, vengono sciolti in 1 mi di tampone fosfato a pH-6.9 (8 mg/ml). A dissoluzione completata, vengono aggiunti 0.8 mg di hGH, previamente disciolti in una soluzione acquosa, e opportunamente miscelati in modo che la composizione sia uniforme e la proteina venga intrappolata all’ interno del gei. Il grado di loading del gel viene calcolato diluendolo 1 :10 in tampone e misurando assorbanza UV a 280 firn, che mediante una curva di taratura fornisce il valore di concentrazione del GH.
ESEMPIO 10; preparazione della formulazione contenente il sistema di rilascio formato da dodecilamide di HA e di hGH, 10:1 p/p
8 mg di Hyadd3 preparato come nell 'Esempio 3, vengono sciolti in 1 ml di tampone fosfato a pH-6,9 (8 mg/ml), A dissoluzione completata, vengono aggiunti 0.8 mg di hGH, previamente dìscìolti in una soluzione acquosa, e opportunamente miscelati in modo che la composizione sìa uniforme e la proteina venga intrappolata all' interno del gel. Il grado dì loading del gel viene calcolato diluendolo 1 :10 in tampone e misurando assorbanza UV a 280 nm, che mediante una curva di taratura fornisce il valore dì concentrazione del GH,
ESEMPIO 11: preparazione della formulazione contenente il sistema di rilascio formato da benzilamide di HA e di hGH, 10; 1
8 mg di Hyadd1 preparato come nell’Esempio 5, vengono sciolti in 1 ml di tampone fosfato a pH-6.9 (8 mg/ml). A dissoluzione completata, vengono aggiunti 0.8 mg di hGH, previamente disciolti in una soluzione acquosa, e opportunamente miscelati in modo che la composizione sia uniforme e la proteina venga intrappolata all’interno del gel, Il grado di loading del gel viene calcolato diluendolo 1 : 10 in tampone e misurando assorbanza UV a 280 nm, che mediante una curva di taratura fornisce il valore di concentrazione del GH,
ESEMPIO 12; preparazione della formulazione contenente il sistema di rilascio formato da esadecilamide di HA e sCT in rapporto 10: 1 p/p
8 mg di Hyadd4 preparato come nell' Esempio 1 , vengono sciolti in l ml di tampone fosfato a pH=6.9, A dissoluzione completata, vengono aggiunti 0.8 mg di calci tonina da salmone, sCT previamente disciolta in tampone fosfato, per ottenere un rapporto p/p dì 10: 1 , e opportunamente miscelati in modo che la proteina venga intrappolata all’ interno dei gel. Il grado dì loading del gel viene calcolato diluendolo 1 : 10 in tampone e misurando assorbanza UV a 280 nm, che mediante una curva dì taratura fornisce il valore di concentrazione di calcitonina.
ESEMPIO 13: preparazione della formulazione contenente il sistema di rilascio formalo da esadecilamide di HA e di IL-1Ra.
10: 1 p/p
8 mg di Hyadd4 preparato come nell’Esempio 1 , vengono sciolti in 1 mi di tampone fosfato a pH=6,9. A dissoluzione completata, vengono aggiunti 0,8 mg di IL- 1Ra, opportunamente miscelati in modo che la composizione sia uniforme e la proteina venga intrappolata all’ interno del gel. Il grado di loading del gel viene calcolato diluendolo 1 :10 in tampone e misurando assorbanza UV a 280 nm, che mediante una curva di taratura fornisce il valore di concentrazione del l IL- 1 Ra,
ESEMPIO 14; preparazione di una formulazione a base di esadecilamide di HA e di RNasi 10/1 p/p
8 mg di Hyadd4 preparato come nell 'Esempio 1, vengono sciolti in 1 mi di tampone fosfato a pH=6.9. A dissoluzione completata, vengono aggiunti 0.8 mg di RNasi previamente disciolti in tampone fosfato, e opportunamente miscelati in modo che la proteina venga intrappolata all’ interno del gel. Il grado di loading del gel viene calcolato diluendolo 1 : 10 in tampone e misurando assorbanza U V a 280 nm, che mediante una curva di taratura fornisce il valore di concentrazione di RNAsi.
ESEMPIO 15: preparazione della formulazione contenente il sistema di rilascio formato da esadecilamide di HA e di insulina.
10:1 p/p
8 mg di Hyadd4 preparato come nell 'Esempio 1, vengono sciolti in 1 ml dì tampone fosfato a pH— 6.9. A dissoluzione completata, vengono aggiunti 0,8 mg di insulina previamente disciolti in tampone fosfato, e opportunamente miscelati in modo che la proteina venga intrappolata all’ interno del gel Il grado di loadìng del gel viene calcolato diluendolo 1:10 in tampone e misurando assorbanza UV a 280 nrn, che mediante una curva di taratura fornisce il valore di concentrazione di insulina.
ESEMPIO 16: Studio dì rilascio di hGH formulato con HA o con ammidi dell' HA
Le formulazioni preparate come negli Esempi 6-1 1, vengono introdotte in tubi da dialisi con cut-off da 100kDa e immerse in tampone fosfato a pH 7 sotto blanda agitazione per monitorarne il rilascio dal compartimento donatore. Per confronto, 0.8 mg di hGH vengono miscelati a 1 mi di tampone fosfato (PBS) e la formulazione viene introdotta in tubo da dialisi.
Durante tutti gli esperimenti vengono mantenute le condizioni sink, A tempi prestabiliti vengono prelevate aliquote da 50 μl dal compartimento donatore e diluite 1 : 10 per la determinazione del contenuto di proteina nel tempo. L’analisi viene effettuata in parallelo mediante lettura UV a 280 nm e mediante RP-HPLC a 220 nm per determinare sia la quantità di proteina rimanente che l’eventuale degradazione. Misure dì scattering vengono inoltre effettuate per studiare l’eventuale aggregazione della proteina formulata. Infine vengono effettuati dei prelievi dal compartimento ricevente per verificare che la quantità di proteina rilasciata corrisponda a quella che scompare dal compartimento donatore e, a conferma che il GH rilasciato non ha subito alcuna degradazione strutturale, sono state effettuate misurazioni di Spettrometria di Massa (Esi-Tof). Le curve di rilascio vengono costruite riportando la percentuale di proteina che viene rilasciata nel tempo, Figure 2 , 3, 4 e 5,
RISULTATI
Figura 2 mostra il profilo di rilascio di hGH determinato dal sistema formato da Hyadd4 e hGH vs il controllo rappresentato dalla proteina stessa preparata in PBS,
Figura 3 evidenzia invece i profili dì rilascio della proteina hGH formulata in associazione con HA LMW e HA MMW: in entrambi ì casi sono stati testati due diversi rapporti ponderali di HA con hGH (10:1 e 20: 1 ) poiché, con questo esperimento la Richiedente intende dimostrare che l associazione di proteine a carattere idrofobico con quantitativi anche molto elevati dì HA di diverso MW, non elicita alcun cambiamento nel profilo di rilascio della proteina stessa vs il profilo che si ottiene preparandola in PBS, cioè in solvente acquoso.
Figura 4 confronta i profili di rilascio dì hGH da sistemi di rilascio formali dalle amidi oggetto della presente invenzione e hGH, vs il controllo rappresentato da hGH in PBS,
Figura 5 evidenzia il tempo di rilascio del 50% di hGH dai sistemi di rilascio formati dalle amidi oggetto della presente invenzione, sempre vs il controllo come sopra scritto.
Confrontando Figura 3 con Figura 2 e 4 si può affermare che i sistemi di rilascio formati dalle amidi di HA (sopra descritte e rivendicate) con proteine a carattere prevalentemente idrofobico (in questo caso hGH), determinano in modo chiaramente significativo il rilascio sostenuto e prolungato nel tempo della proteina stessa, sia vs il controllo rappresentato dalla proteina analizzata in PBS, sia vs la proteina formulata in HA a diverso MW e a diverso rapporto ponderale. Non è, quindi, la concentrazione e/o il MW del polisaccaride che determina una modifica nel profilo di rilascio delle proteine a carattere idrofobico studiate, ma la natura chimica del polimero. Tutto questo è ancor più evidente in Figura 5 in cui vengono messi a confronto i tempi di rilascio del 50% di hGH; la figura mostra come i nuovi sistemi di rilascio oggetto della presente invenzione sono in grado di dilatare i tempi dì rilascio vs il controllo (hGH in PBS) anche di 3 volte.
ESEMPIO 17: Studio di rilascio di sCT, di IL1-Ra e di insulina vs il profilo di rilascio della proteina a carattere idrofilo RNase A Le formulazioni preparate come descritto negli Esempi 12-15, vengono introdotte ognuna in un tubo da dialisi con cut-off da 100kDa e immerse in tampone fosfato a pH 7 sotto blanda agitazione. Per confronto 0.8 mg di calcitonina o IL-1Ra o insulina o RNase vengono miscelati a 1 ml di tampone fosfato e le formulazioni sono introdotte in tubo da dialisi per monitorarne il rilascio dal comparii mento donatore nel tempo.
Durante tutti gli esperimenti vengono mantenute le condizioni sink. A tempi prestabiliti vengono prelevale aliquote da 10 μl dal compartimento donatore e diluite 1 :10 per la determinazione del contenuto di proteina nel tempo. L’analisi viene effettuata in parallelo mediante lettura UV a 280 nm per determinare la quantità di proteina rimanente. Misure di scattering vengono inoltre effettuate per studiare l’eventuale aggregazione della proteina formulata. Infine vengono effettuati dei prelievi dal compartimento ricevente per verificare che la quantità di proteina rilasciata corrisponda a quella che scompare via dal compartimento donatore. Le curve di rilascio vengono costruite riportando la percentuale di proteina che viene rilasciata nel tempo vs il suo controllo.
La proteina RNase A possiede un indice GRAVY = -0.67 e, quindi, non può essere classificata come proteina a carattere prevalentemente idrofobico, ma idrofilo. Viene di seguito descritta in quanto la Richiedente paragona il suo profilo di rilascio vs quello risultante dal sistema di rilascio Hyadd in associazione a proteine a carattere prevalentemente idrofobico, dimostrandone le differenze.
RISULTATI
Le Figure 6-8 evidenziano i profili di rilascio delle 3 proteine a carattere prevalentemente idrofobico analizzate: in tutti e 3 i casi il sistema formato dall’esadeeilamide di HA in associazione con le suddette proteine determina il rilascio sostenuto e prolungato delle stesse anche per tempi molto più lunghi rispetto al controllo, Figura 9, al contrario, dimostra come l’associazione della stessa esadecilamide in identico rapporto ponderale (10:1 p/p) con la proteina RNase a carattere prevalentemente idrofilo, con indice GRAVY = -0,67, determini un profilo di rilascio del tutto similare a quello prodotto dalla stessa proteina quando formulata in PBS.
ESEMPIO 18: Studio di rilascio di hGH in liquido sinoviale umano (LS) proveniente da pazienti osteoartrosìci.
L’ormone hGH viene dapprima legato covalentemente ad una sonda fluorescente (Cy5.5), di modo da essere inequivocabilmente riconosciuto in presenza delle altre proteine sinoviali. A tale scopo 1.5 mg di hGH vengono sciolti in 2 ml di tampone borato a pH 8, cui vengono aggiunti 2 mg di Cy5.5 previamente disciolti in 60 μl di DM SO. La reazione di marcatura viene condotta al riparo dalla luce, sotto blanda agitazione per 18h, Successivamente viene effettuata la purificazione mediante dialisi contro tampone fosfato per 4 giorni e contro acqua MìlliQ per l giorno. La proteina marcata viene poi analizzata mediante gel fiitration al fine di verificarne la purezza.
Una formulazione a base di Hyadd4 e hGH-Cy5.5, viene preparata come descritto nell’Esempio 7 con un rapporto in peso di 10:1. I due componenti vengono opportunamente miscelati in modo che la composizione sia uniforme e la proteina venga intrappolata all’ interno del gel. Il gel cosi ottenuto viene introdotto in un tubo da dialisi con cut off di 100 kDa e immerso in un medium costituito da PBS e liquido sinoviale proveniente da pazienti osteoartrosici (v/v 1 : 1 ) e mantenuto sotto blanda agitazione.
A tempi prestabiliti viene determinata la quantità di proteina rilasciata nel tempo nel compartimento ricevente. Le analisi vengono effettuate mediante RP-HPLC con rivelatore m fluorescenza per determinare non solo il contenuto in hGH ma anche per verificare che la proteina non abbia subito fenomeni di degradazione. La curva di rilascio viene costruita riportando la percentuale di proteina che viene rilasciata nel tempo fino a 48h, RISULTATI
Figure 10 evidenzia il risultato ottenuto: il rilascio in LS di hGH dal sistema formato da Hyadd4 in associazione con la proteina studiata, dimostra come venga mantenuto inalterato il profilo sostenuto e prolungato di rilascio precedentemente dimostrato in Figura 2, Quindi, si può affermare che la proteina/farmaco facente parte del sistema Hyadd è protetta e non soggetta a fenomeni di degradazione in un medium di rilascio ricco di enzimi, di proteine anche di natura sconosciuta e di molecole pro-infiammatorie, qual è il liquido sinoviale di pazienti OA.
ESEMPIO 19: Studio di farmacocinetica del sistema formato da Hvadd4 e hGH. dopo sommmistrazione intra- articolare in articolazione di ratto.
8 mg dì Hyadd4, preparato come nell’Esempio 1 , vengono sciolti in un mi di tampone fosfato a pH=6.9 e sterilizzati mediante calore umido a 121<º>C. Successivamente, in ambiente asettico, vengono aggiunti 0.8 mg dì hGH, previamente disciolti in una soluzione acquosa e sterilizzati mediante filtrazione su filtri in cellulosa rigenerata da 0.2 micron, e opportunamente miscelati in modo che la composizione sia uniforme e la proteina venga intrappolata all’ interno del gel.
Per lo studio in vivo viene iniettato nel ginocchio di ratto un quantitativo di formulazione equivalente a 100μg di proteina/animale. A tempi prestabiliti (0.15, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24, 48 h), vengono prelevati campioni di plasma e sottoposti a test ELISA per la valutazione della concentrazione di hGH passato in plasma dopo somministrazione La, L’esperimento viene effettuato in triplo.
Per confronto, un gruppo di animali viene trattato con una quantità equivalente di hGH libero (100μg) sempre somministrato per via intra-articolare. Le curve di farmacocinetica sono state ricavate plottando la concentrazione di hGH in ng/ml trovata in plasma in funzione del tempo, Fino a 48h.
RISULTATI
Figura 1 1 evidenzia come è possibile ritrovare nel plasma la proteina iniettata immediatamente dopo l’iniezione intra-articolare. Al contrario, grazie al rilascio sostenuto della proteina determinato dai sistema Hyadd, essa rimane in situ , quindi in cavità articolare, non passa nel torrente circolatorio potendo così elicìtare tutto il suo effetto nella sede di iniezione.

Claims (10)

  1. “Nuovo sistema di rilascio di proteine idrofobiche” RIVENDICAZIONI 1. Nuovo sistema di rilascio sostenuto di proteine terapeuticamente e/o biologicamente attive comprendente a) l’amide dell’acido ialuronico (HA) e b) una proteina a carattere prevalentemente idrofobico dove l’amide dell’acido ialuronico è lesadecilamide e/o l’ottilamide e/o la dodecilamide e/o la tert-butilamide e/o la benzilamide e la proteina a carattere prevalentemente idrofobico ha un indice GRAVY superiore a -0,5. 2. Nuovo sistema di rilascio sostenuto di proteine secondo rivendicazione 1 in cui a) Fesadeeilamide di HA è l’amide di HA con l’amina esadecilica con percentuale di amidazione molare compresa tra il 5-20%, preferibilmente tra il 6-12%, ancor più preferibilmente compresa tra 8-9%; b) l’ottilamide di HA è l’amide di HA con l’amina ottilica con percentuale di amidazione molare compresa tra il 5-25%, preferibilmente tra il 10-15%, ancor più preferibilmente compresa tra 10-11%; c) la dodecilamide di HA è lamide di HA con lamina dodecilica con percentuale di amidazione molare compresa tra il 5-25%, preferibilmente tra il 10-15%, ancor più preferibilmente compresa tra 10-11%; d) la tert-butilamide di HA è l’amide di HA con l amina tertbutilica con percentuale di amidazione molare compresa tra il 5-20%, preferibilmente tra il 6-12%, ancor più preferibilmente compresa tra 7-8%; e) la benzilamide di HA è l’amide di HA con ramina benzilica con percentuale di amidazione molare compresa tra il 5-20%, preferibilmente tra il 6-15%, ancor più preferibilmente compresa tra 8-9%. 3. Nuovo sistema di rilascio sostenuto di proteine secondo rivendicazione 1 e 2 in cui lΉΑ utilizzato per la preparazione delle amidi ha un peso molecolare medio ponderale compreso tra i 400 e 3xl0<6>Da, in particolare tra 50-730KDa, tra 750-1230KDa o tra 1500-2500KDa, ancor più in particolare compreso tra 150-250KDa e/o tra 500-730KDa. 4. Nuovo sistema di rilascio sostenuto di proteine secondo le rivendicazioni 1-3 in cui le proteine terapeuticamente e/o biologicamente attive a carattere prevalentemente idrofobico sono l’insulina e/o l’hGH e/o l’sCT e/o l’IL- 1Ra e/o il G-CSF e/o il PDGF e/o il TGF-β e/o l’EGF e/o il VEGF-B e/o lΈΡΟ e/o il NGFβ e/o la transferrina e/o TIMP-2 e/o TIMP-3 e/o TIMP-4. 5. Nuovo sistema di rilascio sostenuto di proteine secondo rivendicazione 4 in cui l’amide dell’ HA è l’esadecilamide e la proteina terapeuticamente e/o biologicamente attiva è l’hGH e/o sCT eventualmente in associazione ad agenti stabilizzanti ed eccipienti. 6. Nuovo sistema di rilascio sostenuto di proteine secondo rivendicazione 4 in cui la proteina terapeuticamente e/o biologicamente attiva è l’insulina eventualmente in associazione ad agenti stabilizzanti ed eccipienti. 7. Nuovo sistema di rilascio sostenuto di proteine secondo rivendicazione 4 in cui l’amide dell’ HA è l’esadecilamide e la proteina terapeuticamente e/o biologicamente attiva è il PDGF e/o TGF-β e/o EGF e/o VEGF-B eventualmente in associazione ad agenti stabilizzanti ed eccipienti. 8. Nuovo sistema di rilascio sostenuto di proteine secondo rivendicazione 4 in cui l’amide dell’HA è l’esadecilamide e la proteina terapeuticamente e/o biologicamente attiva è Γ inibitore delle metalloproteasi TIMP-2 e/o TIMP-3 e/o TIMP-4 eventualmente in associazione ad agenti stabilizzanti ed eccipienti. 9. Nuovo sistema di rilascio sostenuto di proteine secondo rivendicazione 5 per uso intra-articolare nel trattamento di osteoartrosi o artrite reumatoide o psoriasica e/o osteoporosi. 10. Nuovo sistema di rilascio sostenuto di proteine secondo rivendicazione 7 per uso iniettivo o intra-articolare o topico oppure per somministrazione orale nel trattamento dei danni articolari osteoartrosici o nelle tendiniti o nella riparazione del danno muscolare cardiaco o nella riparazione di fratture/cavità ossee o nella cicatrizzazione di ulcere/ferite/lacerazioni cutanee. 1 1. Nuovo sistema di rilascio sostenuto di proteine secondo rivendicazione 8 per uso iniettivo o intra-articolare nel trattamento del danno cartilagineo articolare osteoartrosico e/o nella riparazione delle erosioni osteo-condrali. “Nuovo sistema di rilascio di proteine idrofobiche” RIVENDICAZIONI 1. New sustained release system of therapeutically and/or biologically active proteins comprising a) a hyaluronic acid amide and b) a mainly hydrophobic protein wherein the hyaluronic acid amide is hexadecylamide and/or octylamide and/or dodecylamide and/or tert-butylamide and/or benzyl amide and the mainly hydrophobic protein has a GRAVY index higher than -0,5.
  2. 2. New sustained release system according to claim 1 wherein a) hexadecylamide is the HA amide with hexadecylamine with a molar amidation percentage ranging of from 5-20%, preferably 6-12% and even more preferably 8-9%; b) octylamide is the HA amide with octylamine with a molar amidation percentage ranging of from 5-25%, preferably 10-15% and even more preferably 10-11 %; c) dodecylamide is the HA amide with dodecyl amine with a molar amidation percentage ranging of from 5-25%, preferably 10-15% and even more preferably 10-11%; d) tert-butylamide is the HA amide with tert-butylamine with a molar amidation percentage ranging of from 5-20%, preferably 6-12% and even more preferably 7-8%; e) benzylamide is the HA amide with benzylamine with a molar amidation percentage ranging of from 5-20%, preferably 6-15% and even more preferably 8-9%.
  3. 3. New sustained release system of proteins according to claim 1 and 2 wherein HA used for the preparation of amides has a weight-average molecular weight (MW) ranging between 400 and 3xl0<6>Da, preferably between 50-730KDa, between 750-1230KDA or between 1500-2500KDa, even more preferably between 150-250KDa and/or 500-730KDA.
  4. 4. New sustained release system of proteins according to claim 1-3 wherein the mainly hydrophobic therapeutically and/or biologically active proteins are insulin and/or hGH and/or sCT and/or IL-1Ra and/or G-CSF and/or PDGF and/or TGF-β and/or EGF and/or VEGF-B and/or EPO and/or NGFβ and/or transferrin and/or TIMP-2 and/or TIMP-3 and/or TIMP-4.
  5. 5. New sustained release system of proteins according to claim 4 wherein the HA amide is the hexadecylamide and the therapeutically and/or biologically active protein is hGH and/or sCT optionally in association with stabilizing agents and excipients.
  6. 6. New sustained release system of proteins according to claim 4 wherein the therapeutically and/or biologically active protein is insulin optionally in association with stabilizing agents and excipients.
  7. 7. New sustained release system of proteins according to claim 4 wherein the HA amide is the hexadecylamide and the therapeutically and/or biologically active protein is PDGF and/or TGF-β and/or EGF and/or VEGF-B optionally in association with stabilizing agents and excipients.
  8. 8. New sustained release system of proteins according to claim 4 wherein the HA amide is the hexadecylamide and the therapeutically and/or biologically active protein is the metalloprotease inhibitor TIMP-2 and/or TIMP-3 and/or TIMP-4 optionally in association with stabilizing agents and excipients.
  9. 9. New sustained release system of proteins according to claim 5 for use in the intra-articular treatment of osteoarthrosis or rheumatoid or psoriasic arthritis and/or osteoporosis.
  10. 10. New sustained release system of proteins according to claim 7 for use in the injective or intra-articular or topical or oral treatment of osteoarthrosic articular damage or tendinitis or in the repair of cardiac muscle or in the repair of bone fractures/cavities or in the healing of cutaneous ulcers/lesions/lacerations. .New sustained release system of proteins according to claim 8 for use in the injective or intra-articular treatment of osteoarthrosic articular cartilage damage and/or in the osteochondral erosive damage repair
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BORZACCHIELLO A ET AL: "Effect of hyaluronic acid amide derivative on equine synovial fluid viscoelasticity", JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH, WILEY, NEW YORK, NY, US, vol. 92A, no. 3, 1 March 2010 (2010-03-01), pages 1162 - 1170, XP002619476, ISSN: 0021-9304, [retrieved on 20090325], DOI: 10.1002/JBM.A.32455 *

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