KR20180049887A - 페길레이션된 에리스로포이에틴을 포함하는 신규한 제제 - Google Patents

페길레이션된 에리스로포이에틴을 포함하는 신규한 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 제제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질을 포함하는 신규한 제제는 위 제제에 포함된 성분들의 유기적 결합에 의해 물리적 불안정성 및 화학적 변성을 개선하고, 장기간 보관에 따른 물리화학적 변성을 최소화하여 안정성을 향상시킬 수 있으며, 제제의 점도가 낮아 단회 투여용 주사제 등의 의약 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

페길레이션된 에리스로포이에틴을 포함하는 신규한 제제{The novel formulation comprising a PEGylated Erythropoietin}
본 발명은 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 신규한 제제에 관한 것이다.
에리스로포이에틴(Erythropoietin, EPO)은 1906년 적혈구 조혈을 조절할 수 있는 체액성 인자의 존재 가능성이 보고되면서 처음 알려지기 시작하였다. 1957년 에리스로포이에틴이 신장에서 생성된다는 것이 밝혀졌고(Nature, March 1957, 179, 633-634), 상기 에리스로포이에틴은 골수에서 적혈구 선구물질의 분화를 자극하고, 적혈구 전구체 상의 수용체와 결합하여 생물학적 활성을 나타냄이 보고되었다(Blood, 1991 Feb, 1:77(3), 419-434). 이후, 에리스로포이에틴에 대한 다양한 연구가 꾸준히 진행되고 있다.
다양한 연구 결과 중 하나의 예로 에리스로포이에틴은 적혈구 생성이 낮거나 결손 적혈구의 생성으로 인한 혈액질환의 치료 효과 또는 만성 신부전증환자의 빈혈 치료 및 화학요법을 받는 에이즈 및 암 환자의 빈혈 치료 효과를 나타냄이 밝혀졌다. 그러나, 에리스로포이에틴 그 자체를 포함하는 제제는 단백질 제제의 특성상 체내 반감기가 짧아 자주 투여해야 하는 단점이 있었다.
한편, 대표적인 생체 고분자 물질인 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)이 단백질과 결합시 분자의 용해성을 증가시키고, 단백질의 생체 내 안정성을 개선시킬 뿐만 아니라, 장관 시스템, 신장, 비장, 및 간에 의한 소실의 연장 효과를 나타냄이 알려진 후, 폴리에틸렌 글리콜과 에리스로포이에틴을 결합한 결합체의 연구가 활발히 이루어졌다.
일 예로, WO 제94/28024호에는 에리스로포이에틴과 폴리에틸렌 글리콜의 결합체가 개시되어 있고, 미국특허 제6,340,742호에는 에리스로포이에틴의 표면의 아미노기에 폴리에틸렌 글리콜의 유도체를 결합한 결과 반감기가 증가됨이 개시되어 있다.
다만, 페길레이션된 단백질이라고 하더라도, 함께 사용되는 성분들에 따라 약물의 효능, 보관 안정성 등에 큰 차이가 나타날 수 있으며, 이에 따라 동일한 단백질 제제라고 하더라도 최적의 효과를 나타낼 수 있는 제제에 대한 연구가 여전히 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 페길레이션된 에리스로포이에틴을 포함하는 제제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 본 발명의 성분을 포함하는 페킬레이션된 에리스로포이에틴의 신규 제제의 우수성을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
WO 제94/28024호 미국특허 제6,340,742호
Nature, March 1957, 179, 633-634 Blood, 1991 Feb, 1:77(3), 419-434
본 발명의 목적은 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 목적은 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 제제를 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 제제를 제공한다.
본 발명에 따른 제제는 위 제제 성분들의 유기적 결합에 의해 단백질의 응집, 변성, 침전 및 흡착 등의 물리적 불안정성뿐만 아니라 탈아민화(deamination), 라세미화(racemization), 가수분해(hydrolysis), 산화(oxidation) 및 β-제거(β-elimination) 등의 화학적 변성 또한 개선할 수 있다. 또한, 장기간 보관에 따른 물리화학적 변성을 최소화하여 안정성을 향상시키고, 제제의 점도가 낮아 단회 투여용 주사기에 충진하여 사용하기 용이하며, 국내등록특허 제10-0758044호와 달리 황산나트륨을 사용하지 않기 때문에 황산염에 의해 발생하는 특유의 불쾌한 냄새가 없다. 이러한 본원 발명에 따른 효과는 약리학적으로 허용되는 상기 부형제들과 이의 적절한 양의 유기적 조합에 의해 이루어진다.
상기 제제는 액상일 수 있으며, 구체적으로 수용액일 수 있으며, 본 발명에서 상기 제제는 등장액일 수 있다.
본 발명에서 용어 "페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO)"은 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유도체와 결합된 에리스로포이에틴 단백질로서, 구체적으로 상기 결합은 공유결합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유도체를 단백질에 페길레이션(Pegylation)시키는데 사용되는 결합일 수 있다.
상기 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질 및 이의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지된 단백질 또는 제조 방법일 수 있고, 예를 들어 EP-A 539,176, EP-A 605,963, EP-A 584,876, WO 92/16555, WO 93/25212, WO 94/20069, WO 94/28024, WO 95/11924, WO 97/04796, WO 98/324666, 미국특허 제5,359,030호, 미국특허 제4,179,337호, 대한민국 특허 공개공보 제2010-0052730호 및 미국특허 제5,324,650호에 개시된 것일 수 있다.
바람직하게 상기 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질은 에리스로포이에틴의 C-말단(C-terminal)을 포함하는 아미노산의 카르복실기에 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유도체가 중합된 형태를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제제는 에리스로포이에틴의 C-말단(C-terminal)을 포함하는 아미노산의 카르복실기에 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유도체가 중합된 형태를 가지는 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질에 대하여 장기간 보관에 따른 안정성 증진 및 변성 최소화의 측면에서 가장 우수한 장점을 가진다.
위 C-말단(C-terminal)에 결합되는 PEG는 하기 화학식 1로 표시되는 PEG 일 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00001
여기서 상기 n은 250 내지 2,500 일 수 있다.
본 발명에서 용어 "에리스로포이에틴(EPO)"는 골수에서 적혈구 선구물질의 분화를 자극하고, 적혈구 전구체 상의 수용체와 결합하여 생물학적 활성을 나타내는 당단백질로서, 인간 에리스로포이에틴일 수 있다.
본 발명에서, 상기 "에리스로포이에틴"은 "EPO"와 혼용되어 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 에리스로포이에틴은 부위 지정 돌연변이(site directed mutagenesis) 또는 자연발생적 돌연변이(accidentally through mutation) 등에 의해 의도적으로 변형된 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 상기 에리스로포이에틴은 글리코실화를 위한 1 내지 6개의 추가의 부위를 갖는 유사체, 당단백질의 카르복실 말단에 1개 이상의 추가의 아미노산을 갖고 추가의 아미노산이 1 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 유사체, 및 1개 이상의 글리코실화 부위의 재배열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 유사체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 에리스로포이에틴의 제조 및 정제는 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 방법으로 제조 및 정제할 수 있다. 구체적으로 상기 에리스로포이에틴은 CHO 세포(Chinese hamster ovary cell)를 이용해 생산되는 인간 재조합 에리스로포이에틴일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인간 재조합 에리스로포이에틴은 총 165개의 아미노산으로 구성되며 2개의 이황화 결합이 존재할 수 있다.
상기 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질의 농도는 50 내지 1,500 ug/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로 100 내지 1,200 ug/mL일 수 있다.
본 발명의 제제는 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함한다.
본 발명의 제제는 계면활성제를 포함하며, 상기 계면활성제는 비이온계면활성제일 수 있으며, 바람직하게 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 및 플루로닉 F68으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 제제에 포함되는 계면활성제의 농도는 총 제제의 0.005 내지 0. 03 %(중량/중량)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시양태 따르면, 계면활성제는 폴리소르베이트 20이며, 0.01 %(중량/중량)으로 제제에 포함된다.
본 발명의 제제는 등장화제를 포함하며, 상기 등장화제는 인산나트륨 또는 염산 나트륨일 수 있다. 본 발명의 제제에 포함되는 등장화제의 농도는 총 제제의 0.05 내지 0.3 %(중량/중량)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시양태에 따르면, 등장화제는 염화나트륨이며, 0.1 %(중량/중량)으로 제제에 포함된다.
본 발명의 제제는 아미노산을 포함하며, 상기 아미노산은 글리신, 디글리신, 라이신, 아르기닌, 히스티딘 및 아스파르트 산으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 즉 글리신 또는 디글리신의 중성 아미노산; 라이신, 아르기닌 및 히스티딘으로부터 선택되는 어느 하나의 염기성 아미노산; 및 아스파르트 산의 산성 아미노산에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 제제에 포함되는 아미노산의 농도는 총 제제의 0.5 내지 3 %(중량/중량)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시양태에 따르면, 상기 아미노산의 함량은 1 %(중량/중량)으로 제제에 포함된다.
본 발명의 제제는 폴리올을 포함하며, 상기 폴리올은 만니톨, 소르비톨, 글리세롤, 트레할로스 및 수크로스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 제제에 포함되는 폴리올의 농도는 총 제제의 0.5 내지 3 %(중량/중량)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일시양태에 따르면, 폴리올은 만니톨이며, 1 %(중량/중량)으로 제제에 포함된다.
본 발명의 제제는 완충제를 포함하며, 상기 완충제는 인산염 또는 구연산염일 수 있다. 본 발명의 제제에 포함되는 완충제의 농도는 10 내지 100 mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 본 발명에 따른 완충제는 제제의 pH를 5.5 내지 7.0, 구체적으로 5.8 내지 6.5, 보다 구체적으로 6.0 내지 6.2로 유지하기 위해 제제에 포함될 수 있다.
본 발명의 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 제제는 PEG-EPO, 구연산염, 폴리소르베이트 20, 디글리신, 염화나트륨 및 만니톨을 포함하는 제제일 수 있다.
본 발명의 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 제제는 PEG-EPO, 구연산염, 폴리소르베이트 20, 글리신, 염화나트륨 및 만니톨을 포함하는 제제일 수 있다.
본 발명의 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 제제는 PEG-EPO, 구연산염, 폴리소르베이트 20, 아르기닌, 염화나트륨 및 만니톨을 포함하는 제제일 수 있다.
본 발명의 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 제제는 PEG-EPO, 구연산염, 폴리소르베이트 20, 히스티딘, 염화나트륨 및 만니톨을 포함하는 제제일 수 있다.
본 발명의 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 제제는 PEG-EPO, 구연산염, 폴리소르베이트 20, 라이신, 염화나트륨 및 만니톨을 포함하는 제제일 수 있다.
본 발명의 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 제제는 PEG-EPO, 구연산염, 폴리소르베이트 20, 아스파르트산, 염화나트륨 및 만니톨을 포함하는 제제일 수 있다.
본 발명의 제제는 사용 전 저장을 위해 멸균 조건 하에서 기밀 밀봉된 용기 형태로 제공될 수 있다. 상기 멸균 조건은 증기 멸균 처리(수증기 포화 상태의 분위기 하에서의 가열 처리; 예컨대 증기 멸균, 고압 증기 멸균(오토크레이브) 등) 또는 열수 멸균 처리(예컨대, 열수 샤워 멸균, 열수 스프레이 멸균 등)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 제제를 포함하는 용기를 멸균하는데 사용되는 당업계의 일반적인 조건일 수 있다. 본 발명의 제제가 주사제로 사용될 수 있는 특성상, 상기 용기는 단회 투여를 위해 미리 충진된 주사기일 수 있다.
본 발명은 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 제제를 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물은 에리스로포이에틴을 포함하고 있어, 만성신부전 환자 또는 항암제 투여 환자의 빈혈을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질을 포함하는 신규한 제제는 위 제제에 포함된 성분들의 유기적 결합에 의해 물리적 불안정성 및 화학적 변성을 개선하고, 장기간 보관에 따른 물리화학적 변성을 최소화하여 안정성을 향상시킬 수 있으며, 제제의 점도가 낮아 단회 투여용 주사제 등의 의약 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide](EDC)를 링커로 하는 에리스로포이에틴의 C-말단을 포함하는 카르복실기와 메톡시-PEG-하이드라자이드의 접합과정을 나타내는 개략도이다 (R은 에리스로포이에틴, R'는 메톡시-PEG-하이드라자이드를 의미한다).
도 2는 본 발명의 일실시양태에 따른 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질을 포함하는 제제의 Monomer 순도 측정을 통한 장기간 보관 안정성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 아미노산의 종류를 달리하는 본 발명의 실시양태들에 따른 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질을 포함하는 제제의 Monomer 순도 측정을 통한 장기간 보관 안정성을 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 내지 6: PEG-EPO 제제의 제조
본 발명에서는 특히 에리스로포이에틴의 C-말단(C-terminal)을 포함하는 아미노산의 카르복실기에 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유도체를 중합하기 위하여 메톡시-PEG-하이드라자이드를 사용하였다. 상기 메톡시-PEG-하이드라자이드와 에리스로포이에틴과의 결합반응은 수성완충용액, 예를 들어 50 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES)에서 실시하였다. 한편, 에리스로포이에틴의 C-말단을 포함하는 아미노산의 카르복실기와 메톡시-PEG-하이드라자이드는 zero length crosslinking 제제인 카보디이미드(carbodiimides), 구체적으로는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide](EDC)에 의해 아마이드 결합을 통해 접합된다(도 1). 하기에서는 상기 과정을 통해 제조된 95% 이상의 모노-PEG-EPO가 함유된 조성물을 사용하였다.
실시예 1의 PEG-EPO 제제를 다음과 같이 제조하였다.
20 mM 구연산염에서 상기에서 제조된 PEG-EPO을 일회용 투석용 막을 이용하여 버퍼 교환을 하였다. 투석 용액은 12시간 단위로 3회 교체하였다. 20 mM 구연산염으로 치환된 PEG-EPO 함유 용액을 SEC-HPLC 방법을 이용하여 200 ug/mL의 농도로 제조한 후 0.02 % (중량/중량) 폴리소르베이트 20, 2 % (중량/중량) 디글리신, 0.2 % (중량/중량) 염화나트륨 및 2 % (중량/중량) 만니톨을 20 mM 구연산염에 용해한 2배 농축 제형 버퍼와 1 대 1로 섞어서 등장액을 제조하였다. 이렇게 제조된 PEG-EPO 제제의 조성은 20 mM 구연산염 용액에, 0.01 % (중량/중량) 폴리소르베이트 20, 1 % (중량/중량) 디글리신, 0.1 % (중량/중량) 염화나트륨 및 1 % (중량/중량) 만니톨, 100 ug/mL PEG-EPO 이다.
실시예 2의 PEG-EPO 제제를 다음과 같이 제조하였다.
20 mM 구연산염에서 상기에서 제조된 PEG-EPO을 일회용 투석용 막을 이용하여 버퍼 교환을 하였다. 투석 용액은 12시간 단위로 3회 교체하였다. 20 mM 구연산염으로 치환된 PEG-EPO 함유 용액을 SEC-HPLC 방법을 이용하여 200 ug/mL의 농도로 제조한 후 0.02 % (중량/중량) 폴리소르베이트 20, 2 % (중량/중량) 글리신, 0.2 % (중량/중량) 염화나트륨 및 2 % (중량/중량) 만니톨을 20 mM 구연산염에 용해한 2배 농축 제형 버퍼와 1 대 1로 섞어서 등장액을 제조하였다. 이렇게 제조된 PEG-EPO 제제의 조성은 20 mM 구연산염 용액에, 0.01 % (중량/중량) 폴리소르베이트 20, 1 % (중량/중량) 글리신, 0.1 % (중량/중량) 염화나트륨 및 1 % (중량/중량) 만니톨, 100 ug/mL PEG-EPO 이다.
실시예 3의 PEG-EPO 제제를 다음과 같이 제조하였다.
20 mM 구연산염에서 상기에서 제조된 PEG-EPO을 일회용 투석용 막을 이용하여 버퍼 교환을 하였다. 투석 용액은 12시간 단위로 3회 교체하였다. 20 mM 구연산염으로 치환된 PEG-EPO 함유 용액을 SEC-HPLC 방법을 이용하여 200 ug/mL의 농도로 제조한 후 0.02 % (중량/중량) 폴리소르베이트 20, 2 % (중량/중량) 아르기닌, 0.2 % (중량/중량) 염화나트륨 및 2 % (중량/중량) 만니톨을 20 mM 구연산염에 용해한 2배 농축 제형 버퍼와 1 대 1로 섞어서 등장액을 제조하였다. 이렇게 제조된 PEG-EPO 제제의 조성은 20 mM 구연산염 용액에, 0.01 % (중량/중량) 폴리소르베이트 20, 1 % (중량/중량) 아르기닌, 0.1 % (중량/중량) 염화나트륨 및 1 % (중량/중량) 만니톨, 100 ug/mL PEG-EPO 이다.
실시예 4의 PEG-EPO 제제를 다음과 같이 제조하였다.
20 mM 구연산염에서 상기에서 제조된 PEG-EPO을 일회용 투석용 막을 이용하여 버퍼 교환을 하였다. 투석 용액은 12시간 단위로 3회 교체하였다. 20 mM 구연산염으로 치환된 PEG-EPO 함유 용액을 SEC-HPLC 방법을 이용하여 200 ug/mL의 농도로 제조한 후 0.02 % (중량/중량) 폴리소르베이트 20, 2 % (중량/중량) 히스티딘, 0.2 % (중량/중량) 염화나트륨 및 2 % (중량/중량) 만니톨을 20 mM 구연산염에 용해한 2배 농축 제형 버퍼와 1 대 1로 섞어서 등장액을 제조하였다. 이렇게 제조된 PEG-EPO 제제의 조성은 20 mM 구연산염 용액에, 0.01 % (중량/중량) 폴리소르베이트 20, 1 % (중량/중량) 히스티딘, 0.1 % (중량/중량) 염화나트륨 및 1 % (중량/중량) 만니톨, 100 ug/mL PEG-EPO 이다.
실시예 5의 PEG-EPO 제제를 다음과 같이 제조하였다.
20 mM 구연산염에서 상기에서 제조된 PEG-EPO을 일회용 투석용 막을 이용하여 버퍼 교환을 하였다. 투석 용액은 12시간 단위로 3회 교체하였다. 20 mM 구연산염으로 치환된 PEG-EPO 함유 용액을 SEC-HPLC 방법을 이용하여 200 ug/mL의 농도로 제조한 후 0.02 % (중량/중량) 폴리소르베이트 20, 2 % (중량/중량) 라이신, 0.2 % (중량/중량) 염화나트륨 및 2 % (중량/중량) 만니톨을 20 mM 구연산염에 용해한 2배 농축 제형 버퍼와 1 대 1로 섞어서 등장액을 제조하였다. 이렇게 제조된 PEG-EPO 제제의 조성은 20 mM 구연산염 용액에, 0.01 % (중량/중량) 폴리소르베이트 20, 1 % (중량/중량) 라이신, 0.1 % (중량/중량) 염화나트륨 및 1 % (중량/중량) 만니톨, 100 ug/mL PEG-EPO 이다.
실시예 6의 PEG-EPO 제제를 다음과 같이 제조하였다.
20 mM 구연산염에서 상기에서 제조된 PEG-EPO을 일회용 투석용 막을 이용하여 버퍼 교환을 하였다. 투석 용액은 12시간 단위로 3회 교체하였다. 20 mM 구연산염으로 치환된 PEG-EPO 함유 용액을 SEC-HPLC 방법을 이용하여 200 ug/mL의 농도로 제조한 후 0.02 % (중량/중량) 폴리소르베이트 20, 2 % (중량/중량) 아스파르트산, 0.2 % (중량/중량) 염화나트륨 및 2 % (중량/중량) 만니톨을 20 mM 구연산염에 용해한 2배 농축 제형 버퍼와 1 대 1로 섞어서 등장액을 제조하였다. 이렇게 제조된 PEG-EPO 제제의 조성은 20 mM 구연산염 용액에, 0.01 % (중량/중량) 폴리소르베이트 20, 1 % (중량/중량) 아스파르트산, 0.1 % (중량/중량) 염화나트륨 및 1 % (중량/중량) 만니톨, 100 ug/mL PEG-EPO 이다.
위 실시예 1 내지 6의 제형 및 이의 조성을 하기 표 1에 나타내었다.
실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6
PEG-EPO 100 ug/mL
PEG-EPO		 100 ug/mL
PEG-EPO		 100 ug/mL
PEG-EPO		 100 ug/mL
PEG-EPO		 100 ug/mL
PEG-EPO		 100 ug/mL
PEG-EPO
계면활성제 0.01%(w/w)
폴리솔베이트20		 0.01%(w/w)
폴리솔베이트20		 0.01%(w/w)
폴리솔베이트20		 0.01%(w/w)
폴리솔베이트20		 0.01%(w/w)
폴리솔베이트20		 0.01%(w/w)
폴리솔베이트20
등장화제 0.1 %(w/w)
염화나트륨		 0.1 %(w/w)
염화나트륨		 0.1 %(w/w)
염화나트륨		 0.1 %(w/w)
염화나트륨		 0.1 %(w/w)
염화나트륨		 0.1 %(w/w)
염화나트륨
아미노산 1 % (w/w)
디글리신		 1 % (w/w)
글리신		 1 % (w/w)
아르기닌		 1 % (w/w)
히스티딘		 1 % (w/w)
라이신		 1 % (w/w)
아스파르트산
폴리올 1 % (w/w)
만니톨		 1 % (w/w)
만니톨		 1 % (w/w)
만니톨		 1 % (w/w)
만니톨		 1 % (w/w)
만니톨		 1 % (w/w)
만니톨
완충제 20 mM
구연산염		 20 mM
구연산염		 20 mM
구연산염		 20 mM
구연산염		 20 mM
구연산염		 20 mM
구연산염
한편, 비교예 1의 PEG-EPO 제제를 다음과 같이 제조하였다.
메티오닌 1.49 mg/mL, 무수황산나트륨 5.68 mg/mL, 인산나트륨 (Sodium phosphate monobasic monohydrate) 1.38 mg/mL, 만니톨 30 mg/mL, 0.1 mg/mL 플루로닉 F68, 및 PEG-EPO를 넣어 등장액을 제조하였다.
실시예 7: 구성성분이 상이한 PEG-EPO 제제의 보관 안정성
상기 제조된 실시예 1 및 비교예 1의 PEG-EPO 제제의 보관 안정성을 비교하였다.
구체적으로, 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 PEG-EPO 제제를 유리 바이알 (1 ml)에 담아 가혹조건(40℃)에서 4주간 보관하면서, 일주일 간격으로 샘플을 취하여 SEC-HPLC 방법을 통해 PEG-EPO 모노머(monomer)의 순도를 분석하였다.
그 결과를 도 1 및 표 2에 나타내었다.
도 1 및 표 2에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1의 PEG-EPO 제제가 비교예 1의 제제가 비해 PEG-EPO 모노머의 순도가 높게 나타남을 확인하였다.
모노머 순도(%)
0주 1주 2주 3주 4주
실시예 1 100 97.01 96.42 95.91 94.23
비교예 1 100 95.27 94.04 92.50 91.32
구체적으로, 비교예 1의 제제는 보관 2주 후부터 모노머의 순도가 95% 이하로 감소하여, 보관 4주시 91.32%로 감소하였다. 이에 반해, 실시예 1의 제제는 보관 3주시에도 95% 이상의 높은 순도를 나타내며, 보관 4주시에도 94.23%로 높은 순도를 나타내었다.
이를 통해, 본원 발명의 제제의 구성성분들의 유기적 조합에 의해 PEG-EPO 보관 안정성이 우수하고, 용액상태에서 장기간 보관시 발생할 수 있는 PEG-EPO의 변성을 최소화할 수 있는 효과를 나타냄을 확인하였다. 특히 에리스로포이에틴의 C-말단(C-terminal)을 포함하는 아미노산의 카르복실기에 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유도체가 중합된 형태를 가지는 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질에 대하여 상업적 제형보다도 훨씬 우수한 장기간 보관에 따른 안정성 증진 및 변성 최소화 효과를 보임이 확인되었다.
실시예 8: 아미노산의 종류가 상이한 PEG-EPO 제제의 보관 안정성
상기 실시예 1 내지 실시예 6의 PEG-EPO 제제의 보관 안정성을 비교하였다.
구체적으로, 실시예 1 내지 실시예 6의 PEG-EPO 제제를 유리 바이알(1 ml)에 담아 가혹조건(40℃)에서 4주간 보관하면서, 일주일 간격으로 샘플을 취하여 SEC-HPLC 방법을 통해 PEG-EPO 모노머(monomer)의 순도를 분석하였다.
그 결과를 도 2 및 표 3에 나타내었다.
도 2 및 표 3에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 제제의 구성성분들의 유기적 조합에 의해 PEG-EPO 보관 안정성이 우수하고, 용액상태에서 장기간 보관시 발생할 수 있는 PEG-EPO의 변성을 최소화할 수 있는 효과를 나타냄을 확인하였다.
모노머 순도(%)
0주 1주 2주 3주 4주
실시예 1 100 97.88 97.75 93.35 94.40
실시예 2 100 97.49 97.92 94.40 94.93
실시예 3 100 96.44 98.12 95.30 94.79
실시예 4 100 97.31 96.85 94.66 92.69
실시예 5 100 98.07 98.12 94.66 95.40
실시예 6 100 96.31 97.90 96.66 94.80
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.
따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (22)

  1. 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질(PEG-EPO), 계면활성제, 등장화제, 아미노산, 폴리올 및 완충제를 포함하는 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 페길레이션된 에리스로포이에틴 단백질은 에리스로포이에틴의 C-말단(C-terminal)을 포함한 아미노산의 카르복실기에 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)이 중합된 형태를 가지는 것인, 제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 에리스로포이에틴은 CHO 세포(Chinese hamster ovary cell)를 이용해 생산되는 인간 재조합 에리스로포이에틴인 것인, 제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 페길레이션된 에리스로포이에틴의 제제 내 농도는 50 내지 1,500 ug/mL인, 제제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 페길레이션된 에리스로포이에틴의 제제 내 농도는 100 내지 1,200 ug/mL인, 제제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 pH는 5.5 ~ 7.0 인, 제제.
  7. 제1항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 및 플루로닉 F68으로부터 선택되는 어느 하나인, 제제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 계면활성제의 농도는 총 제제의 0.005 내지 0. 03 %(중량/중량)인, 제제.
  9. 제1항에 있어서, 상기 등장화제는 인산나트륨 또는 염산 나트륨인, 제제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 등장화제의 농도는 0.05 내지 0.3 %(중량/중량)인, 제제.
  11. 제1항에 있어서, 상기 아미노산은 글리신 또는 디글리신의 중성 아미노산; 라이신, 아르기닌 및 히스티딘으로부터 선택되는 어느 하나의 염기성 아미노산; 및 아스파르트 산의 산성 아미노산에서 선택된 어느 하나 이상인, 제제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 아미노산의 농도는 총 제제의 0.5 내지 3 %(중량/중량)인, 제제.
  13. 제1항에 있어서, 상기 폴리올은 만니톨, 소르비톨, 글리세롤, 트레할로스 및 수크로스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 제제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폴리올의 농도는 총 제제의 0.5 내지 3 %(중량/중량)인, 제제.
  15. 제1항에 있어서, 상기 완충제는 인산염 또는 구연산염인, 제제.
  16. 제15항에 있어서, 상기 완충제의 농도는 10 내지 100 mM인, 제제.
  17. 제1항에 있어서, 계면활성제로 폴리소르베이트 20; 등장화제로 염화나트륨; 아미노산으로 글리신, 디글리신, 라이신, 아르기닌, 히스티딘 및 아스파르트 산으로부터 선택된 어느 하나인 아미노산; 폴리올로 만니톨; 및 완충제로 구연산염을 포함하는, 제제.
  18. 제1항에 있어서, 상기 제제는 액상인, 제제.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 제제를 포함하며, 사용 전 저장을 위해 멸균 조건 하에서 기밀 밀봉된 용기,
  20. 제19항에 있어서, 상기 용기는 단회 투여를 위해 미리 충진된 주사기인 것을 특징으로 하는 것인, 용기.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 제제를 포함하는 약제학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 제제를 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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