JP2005170877A

JP2005170877A - 核酸の肝臓へのターゲティング

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Publication number: JP2005170877A
Application number: JP2003414504A
Authority: JP
Inventors: Masaya Yamamoto; 雅哉山本; Yasuhiko Tabata; 泰彦田畑
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-12-12
Filing date: 2003-12-12
Publication date: 2005-06-30

Abstract

【課題】肝細胞への核酸のターゲティングの効率および細胞内取込の効率を高めるための製剤を提供すること。
【解決手段】核酸とカチオン化プルラン誘導体から形成されるポリイオンコンプレックスを含む、肝臓デリバリー用製剤が開示される。好ましくは、本発明において用いられるプルランの分子量は、３０，０００−６０，０００である。また好ましくは、ポリイオンコンプレックス中の、カチオン化プルラン誘導体中のアミノ基のモル数と核酸中のリン酸基のモル数との比は３−７である。
【選択図】なし

Description

本発明は、遺伝子治療において核酸を肝臓へターゲティングするための水溶性高分子製剤に関する。

遺伝子治療とは、遺伝子を人為的に補いあるいは遺伝子発現を人為的に抑制することによって細胞の機能をコントロールし、病気の治療を行う方法である。このような遺伝子治療において用いるための、遺伝子を効率よく発現させることができるベクターの開発が必要とされている。遺伝子の発現ベクタ一には大きく分けて、ウイルスを用いる場合と用いない場合とがある。発現効率の高いことから、これまでは主として、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ改変ウイルス、などのウイルス自体がベクターとして用いられている。しかしながら、ウイルス本来の毒性、免疫原性などによる問題があり、これを解決するべく、分子生物学的研究が進められている。一方、後者のウイルスを用いない方法には、非ウイルス性遣伝子キャリアあるいは電気、超音波などの物理刺激の利用があるが、いずれの場合も、その遺伝子導入効率がきわめて低い。これまでに、リン酸カルシウムあるいはカチオン性高分子あるいはリポソームなどの非ウイルス性遺伝子キャリアが研究開発されている。また、それらに電気的刺激を組み合わせる方法も考案されている。

遺伝子治療の開発において解決すべき課題としては、生体内における遺伝子の分解を抑制すること、標的臓器へのターゲティングの効率を高めること、標的臓器における安定な徐放化を可能とすること、および細胞内への遺伝子導入効率を高めることなどがある。遺伝子導入には体内法と体外法とがある。体外法では，遺伝子をベクターと組み合わせ、細胞と培養することが行われ、いかに細胞とうまく遺伝子を相互作用させるかが鍵となる。一方、体内法では、それに加えて、遺伝子の体内での安定性を高め、また遺伝子をいかに特定部位にターゲティングできるかが、遺伝子レベルの発現を大きく左右する。例えば、カチオン性遣伝子キャリアは、タンパク質、脂質、血球細胞などの生体成分と相互作用しやすく、その体内動態の制御がきわめて難しい。そこで、特定細胞あるいは組織に対する親和性の高い分子およびポリエチレングリコールなどにより生体成分との相互作用を少なくすることによって、遣伝子の体内動態を修飾、およびその安定性の向上が試みられている。

遺伝子のターゲティングおよび細胞内導入の効率を高めるために、遺伝子を高分子キャリアと組み合わせたドラッグデリバリーシステムが提案されている。このような高分子キャリアの１つにプルランがある。プルランは天然の多糖類であり、肝臓に高い親和性をもつとともに（Yamaoka et al., Drug Delivery, 1, 75-82 (1993)）、肝実質細胞に発現しているアシアロ糖タンパク質レセプターを介して肝細胞へ取り込まれること（Kaneo et al., J. Control Release, 70, 365-373 (2001)）が知られている。したがって、このような特性をもつプルランを遺伝子のＤＤＳキャリアとして利用すれば、遺伝子の肝臓へのターゲティングが可能になると考えられる。例えば、特開２００３−１０４９１４は、プラスミドＤＮＡとプルラン−ＤＴＰＡとを金属配位結合を介して結合させることにより得られる、肝臓へのターゲティングのための複合体を開示する。

本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
特開２００３−１０４９１４ Yamaoka et al., Drug Delivery, 1, 75-82 (1993) Kaneo et al., J. Control Release, 70, 365-373 (2001)

本発明は、核酸と水溶性高分子とをイオン結合により結合させることにより、肝細胞への核酸のターゲティングの効率および細胞内取込の効率を高めることを目的とする。

本発明者らは、プルランにカチオン基を導入してカチオン化プルラン誘導体を作製し、これと核酸とをイオン結合により結合させてポリイオンコンプレックスを形成させることにより、肝細胞への核酸の取込効率が高まることを見いだした。

本発明は、核酸とカチオン化プルラン誘導体から形成されるポリイオンコンプレックスを含む、肝臓デリバリー用製剤を提供する。好ましくは、本発明において用いられるプルランの分子量は、３０，０００−６０，０００である。また好ましくは、ポリイオンコンプレックス中の、カチオン化プルラン誘導体中のアミノ基のモル数と核酸中のリン酸基のモル数との比は３−７である。

プルランは、デンプンの部分加水分解物を原料としてAureobasidium pullulans菌により発酵産生されるα−グルカンであり、ブドウ糖３個よりなるマルトトリオースがα−１，６結合で連鎖した直鎖状の水溶性高分子である。食品添加剤および医薬品補助剤として広く使われており、種々の分子量の製品が市販されている。プルランは、肝臓に高い親和性をもつとともに、肝実質細胞に発現しているアシアロ糖タンパク質レセプターを介して肝細胞へ取り込まれることが知られている。好ましくは、本発明において用いられるプルランの分子量は、約１０，０００以上、より好ましくは約２０，０００以上、さらに好ましくは約３０，０００以上、最も好ましくは約４０，０００以上である。また好ましくは、本発明において用いられるプルランの分子量は、約８０，０００以下、より好ましくは約７０，０００以下、さらに好ましくは約６０，０００以下、最も好ましくは約５０，０００以下である。

本発明においては、核酸とのポリイオンコンプレックスを形成させるために、プルランにカチオン基を導入したカチオン化プルラン誘導体を用いる。カチオン化の工程は、生理条件下でカチオン化する官能基を導入し得る方法であれば特に限定されないが、プルラン分子上の水酸基に１、２または３級のアミノ基またはアンモニウム基を温和な条件下で導入する方法が好ましい。例えばエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−ジアミノプロパン等のアルキルジアミンや、トリメチルアンモニウムアセトヒドラジド、スペルミン、スペルミジンまたはジエチルアミド塩化物等を、種々の縮合剤、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、塩化シアヌル、Ｎ，Ｎ'−カルボジイミダゾール、臭化シアン、ジエポキシ化合物、トシルクロライド、ジエチルトリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ペンタン酸ジ無水物等のジ無水物化合物、トリシルクロリド等を用いて反応させることができる。特に、エチレンジアミンまたはスペルミンを反応させる方法が簡便且つ汎用性があり好適である。

本発明において用いる核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体、ｓｉＲＮＡ、ＰＮＡ、ならびに、糖、リン酸または塩基に修飾を有するこれらの誘導体が含まれる。核酸の例としては、肝疾患の治療に有用なタンパク質等をコードする遺伝子、これを含有するベクター、肝疾患、例えば癌等に対して使用しうるアンチセンスＤＮＡおよびデコイＤＮＡ（例えば、ＮＦκＢ等）を挙げることができる。肝疾患の治療に必要なタンパク質等をコードする遺伝子としては、ホルモン等の低分子量ペプチド、あるいはインターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子あるいはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）類等のタンパク質、これらのタンパク質の生理活性部位の部分ペプチド等、またはこれらタンパク質およびペプチドの中和抗体およびレセプターのアゴニスト等の遺伝子が挙げられる。ホルモン等の低分子量ペプチドとしては、特に治療に好適なものであれば限定するものではないが、ＩＦＮ等のものが挙げられる。細胞成長因子の例としては、ｈＧＨ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＩＧＦ等、およびこれらのフラグメント、例えばＨＧＦの分子内断片であるＮＫ４が挙げられる。

治療上有用なタンパク質をコードするＤＮＡは、既知の配列に基づいてゲノムまたはｃＤＮＡライブラリからクローニングにより入手してもよく、化学合成により製造してもよい。タンパク質をコードするＤＮＡは、導入された細胞内でそのタンパク質の機能が発現されることができるようにプラスミドベクター中に導入して用いる。プラスミドベクターは、細胞内でＤＮＡが転写され、それにコードされるタンパク質が適切に発現されるような様式で配列された、プロモーター領域、開始コドン、終止コドンおよびターミネーター領域等を含む。このようなプラスミドベクターは、当分野において入手可能な発現ベクターに所望のＤＮＡを適当な制限酵素部位を利用して挿入することによって容易に調製することができる。また、導入すべきＤＮＡの塩基配列に基づいて、合成、半合成の手段により調製することも可能である。プラスミドベクター中のプロモーターの種類、開始コドン、終止コドン、ターミネータ領域は特に限定されるものではない。

本発明の製剤中のＤＮＡから発現されるタンパク質は、治療上の所望の活性を有する限り、そのアミノ酸配列中の1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。さらに、別のタンパク質またはそのフラグメントとの融合タンパク質として産生されてもよい。したがって、ＤＮＡは、そのような改変型のタンパク質をコードするものであってもよい。このような改変型タンパク質をコードするＤＮＡを部位特異的突然変異法、遺伝子組換え法または合成法により作成する方法は当該技術分野においてよく知られている。

ポリイオンコンプレックスは、核酸とカチオン化プルラン誘導体がイオン結合により結合することにより形成される複合体である。ポリイオンコンプレックスは、核酸とカチオン化プルラン誘導体とを、適当な緩衝溶液中で混合し、所定の時間放置することにより形成することができる。反応は室温で行うことができる。ポリイオンコンプレックスの形成は、混合液の濁度を指標として測定することができる。本発明においては、ポリイオンコンプレックスの特性を表すパラメータとして、Ｎ／Ｐ比を用いる。Ｎ／Ｐ比とは、カチオン化プルラン誘導体中のアミノ基のモル数と核酸中のリン酸基のモル数との比率である。目的とする治療、用いる核酸およびカチオン化プルラン誘導体に応じて、肝細胞中への取込に最適なＮ／Ｐ比を選択することができる。好ましくは、ポリイオンコンプレックス中のＮ／Ｐ比は３−７であり、より好ましくは４−６である。本発明にしたがって核酸とカチオン化プルラン誘導体とのポリイオンコンプレックスを形成することにより、核酸の負電荷が中和されるとともに、その電気的反発の緩和による分子サイズの減少が生じる。また、製剤中で核酸が安定化される。さらに、プルランと肝細胞との高い親和性により、核酸を高い効率で肝細胞中に取り込ませることができる。

本発明のポリイオンコンプレックスは水溶性であり、そのまま緩衝液、生理食塩水、注射用溶媒等の希釈剤に溶解してアッセイあるいは治療に用いることができる。あるいは、凍結乾燥した後に、使用時に希釈剤に溶解してから用いてもよい。投与方法としては、静脈内投与、動脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、体腔内投与等が挙げられる。特に好ましくは静脈内投与である。あるいは、カテーテルを用いて直接門脈に注入してもよい。

本発明の製剤の投与量は、治療的応答をもたらすに十分であるように適宜選択することができる。投与量は、通常成人患者当たり、核酸の量として約０．００１〜約１００μｇの範囲、好ましくは、約０．０１〜約１０μｇの範囲から選択される。また１回の投与で効果が不十分であった場合は、投与を複数回行うことも可能である。

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

カチオン化プルラン誘導体の作製
カチオン化プルラン誘導体の作製は、プルランの水酸基へのＮ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，４−ブタンジアミン（スペルミン）の導入反応により行った。分子量の異なるプルラン（東京化成工業製、重量平均分子量（Ｍｗ）：２００，０００、昭和電工製、重量平均分子量：２００，０００、４８，０００、２３，７００、１２，２００および５，８００）を脱水ジメチルスルホキシドに溶解させた（１０ｍｇ／ｍｌ）。次に、種々の濃度のＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、およびスペルミンを加え、室温で２０時間撹拌した。反応溶液を蒸留水に対して２日間透析し、凍結乾燥することにより、スペルミン導入カチオン化プルラン誘導体を得た。

スペルミン導入カチオン化プルラン誘導体のスペルミンの導入率は、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法を用いたアミノ基の定量によって算出した。すなわち、スペルミン導入カチオン化プルラン誘導体の水溶液１００μｌに、０．２Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）１００μｌ、４ｗｔ％の炭酸水素ナトリウム水溶液２００μｌ、０．１ｗｔ％のＴＮＢＳ水溶液２００μｌを加え、３７℃で２時間反応させた。この反応溶液の４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。この吸光度値とβ−アラニンを用いた検量線から、プルランの水酸基あたりのスペルミンの導入モル比を算出し、スペルミン導入率（導入％）とした。

表１に、作製したカチオン化プルラン誘導体の作製条件およびスペルミン導入率を示す。プルラン、スペルミンおよびＣＤＩの濃度をそれぞれ変化させることによって、カチオン化プルラン誘導体のスペルミン導入率を変化させることができた。

カチオン化プルラン誘導体とプラスミドＤＮＡとのポリイオンコンプレックス形成
プラスミドＤＮＡ遺伝子として、ルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡを用いた。アンピシリン耐性遺伝子を含むルシフェラーゼのプラスミドＤＮＡを大腸菌にトランスフォームした後、アンピリシン含有ＬＢ培地にて、３７℃で１８時間培養した。増殖した大腸菌を遠心回収し、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡの純度評価として、得られたプラスミドＤＮＡ水溶液の２８０ｎｍに対する２６０ｎｍの比を測定したところ、１．８−２．０の間であった。

ほぼ同じスペルミン導入率（３０％）で分子量の異なるカチオン化プルラン誘導体とプラスミドＤＮＡとのポリイオンコンプレックスを用いて、カチオン化プルラン誘導体とプラスミドＤＮＡとのポリイオンコンプレックスのキャラクタリゼーションを行った。プラスミドＤＮＡ水溶液（２５μｇ／ｍｌ）と濃度の異なるカチオン化プルラン誘導体とを、１５０ｎＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）中で混合し、室温で１５分間静置することにより、両者のポリイオンコンプレックスを形成させた。スペルミン導入カチオン化プルラン誘導体とプラスミドＤＮＡとの混合モル比（Ｎ／Ｐ比）は、（カチオン化プルラン誘導体のアミノ基モル数）／（プラスミドＤＮＡのリン酸基モル数）である。

得られたポリイオンコンプレックスの分子サイズを、動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて測定した。この水溶液をＡｒレーザーを備えたＤＬＳ装置（大塚電子製）にて測定した（検出角度９０°、３７℃）。ポリイオンコンプレックスの流体力学的半径Ｒは、測定によって得られた散乱強度−時間相関関数およびＥｉｎｓｔｅｉｎ−Ｓｔｏｋｅｓの式：Ｒ＝ｋＴ／３πηＤ（ｋ：ボルツマン定数、Ｔ：絶対温度、η：溶媒の粘度、Ｄ：核酸係数）とから付属の解析ソフトにより算出した。

図１に分子量の異なるカチオン化プルラン誘導体（Ｎ／Ｐ＝５）とプラスミドＤＮＡとのポリイオンコンプレックスの見かけの分子サイズを示す。分子量が５，８００および１２，２００のプルランでは、元のプラスミドＤＮＡに比べて大きな分子サイズを認めたが、分子量が２３，７００から２００，０００のプルランでは、分子量の増加とともに分子サイズが減少することがわかった。プラスミドＤＮＡはポリアニオンであるため、その分子鎖は、電気的反発力で広がっていると考えられる。カチオン化プルラン誘導体とのポリイオンコンプレックス形成により、電気的中和と分子鎖のからまりとによって、この分子鎖の広がりが変化すると考えられる。分子量の低いプルランでは分子鎖が短く、十分にプラスミドＤＮＡ分子を凝縮させることができないため、分子サイズが低下しなかったと考えられる。一方、分子量が大きくなると、ポリイオンコンプレックスによりプラスミドＤＮＡ分子は効率よく凝縮され、分子サイズが低下したと考えられる。

また、図２は、ポリイオンコンプレックスの分子サイズに与えるＮ／Ｐ比の影響を示す（Ｍｗ＝４８，０００）。Ｎ／Ｐ比の増加とともに、分子サイズは低下し、その値はＮ／Ｐ＝１０以上でプラトーになった。これらの結果は、コンプレックス形成によるプラスミドＤＮＡの分子サイズの低下には、ある量のカチオン化プルラン誘導体で十分であることを示している。それ以上の添加では、ポリイオンコンプレックス形成に関与しない余剰のプルラン誘導体が増加していると考えられる。

濁度測定
表２に示される種々の条件下にて作製したポリイオンコンプレックス水溶液の濁度測定を行った。用いた波長は５００ｎｍであり、水溶液の吸光度変化を濁度として測定した。

表２に示す種々の条件下で作製したポリイオンコンプレックスの濁度測定の結果を図３に示す。いずれの分子量のプルランを用いた場合でも、Ｎ／Ｐ比の増加にともない溶液濁度が増加し、その値はＮ／Ｐ比５以上で一定となった。分子量２３，７００および４８，０００のプルランが、他の分子量のものに比べて溶液濁度が高い傾向を示した。図４は種々のイオン強度の分子量４８，０００のプルラン（Ｎ／Ｐ＝５）を用いて濁度測定を行った結果を示す。図より明らかなように、イオン強度が高くなるにしたがって、濁度の減少が認められた。

インターカレーターとプラスミドＤＮＡとの相互作用の評価
２０μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ水溶液にエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ、０．４μｇ／ｍｌ）を加え、ＥｔＢｒをＤＮＡ分子へインターカレートさせた。濃度の異なるカチオン化プルラン誘導体水溶液をこの水溶液に加えた。カチオン化プルラン誘導体水溶液の混合前後の蛍光強度（励起波長５１０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍ）を測定し、もとのプラスミドＤＮＡ／ＥｔＢｒの蛍光強度を１００％として相対蛍光強度を算出した。一般に、ＤＮＡにＥｔＢｒがインターカレートすることによって蛍光が生じる。プラスミドＤＮＡとカチオン化プルラン誘導体とがポリイオンコンプレックスを形成すると、ＥｔＢｒがプラスミドＤＮＡにインターカレートできなくなり、プラスミドＤＮＡから遊離する。すなわち、相対蛍光強度が減少することは、カチオン化プルラン誘導体とプラスミドＤＮＡとの相互作用が起こっていることを示している。減少の強さはプラスミドＤＮＡカチオン化プルラン誘導体との相互作用の強さに対応すると考えられる。図５に異なる分子量のカチオン化プルラン誘導体との混合によるプラスミドＤＮＡ−ＥｔＢｒ複合体の蛍光強度の変化を示す。用いるプルランの分子量によらず、Ｎ／Ｐ比の増加にともない、相対蛍光強度の減少が認められた。また、Ｎ／Ｐ比が低い場合、分子量２３，７００および４８，０００のプルランが他の種類のプルランに比べて、減少傾向が強いことがわかった。

プラスミドＤＮＡ水溶液（１０μｇ／ｍｌ）とカチオン化プルラン誘導体（Ｍｗ＝２３，７００、スペルミン導入率３１．３％））水溶液とを０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で混合し、異なるＮ／Ｐ比をもつポリイオンコンプレックスを得た。得られたポリイオンコンプレックスをＥｔＢｒ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含んだアガロース（１ｗｔ％）水溶液から作製したゲルを用いて、１００Ｖ、３０分の条件で電気泳動した。電気泳動用緩衝液は、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む４４５ｍＭトリス−ほう酸緩衝液（ｐＨ８．３）である。ＵＶトランスイルミネーター（ＧｅｌＤｏｃ２０００：日本バイオ・ラッドラボラトリーズ製）により、電気泳動されたプラスミドＤＮＡを観察した。図６に結果を示す。Ｎ／Ｐ比の増加にともなって泳動バンドは薄くなり、Ｎ／Ｐ比が１以上においては、バンドが認められなくなった。これは、前述のＥｔＢｒ排除が起こることによって、プラスミドＤＮＡのバンドが消失したものと考えられる。

細胞へのインビトロ遺伝子導入実験
細胞としてヒト肝癌由来株ＨｅｐＧ２細胞を用いた。６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ製）に、４×１０⁴細胞／ｃｍ²（４×１０⁵細胞／ウエル）の細胞を播種し、１０ｖｏｌ％の仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＭＥＭ（ＭＥＭ−ＦＣＳ）中にて、５％ＣＯ₂・９５％空気、３７℃で２４時間培養した。血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ製）培地へ交換した後、ルシフエラーゼ−プラスミドＤＮＡとカチオン化プルラン誘導体とのポリイオンコンプレックス、または対照としてルシフエラーゼ−プラスミドＤＮＡを加えて、６時間培養した。次に、培地をＭＥＭ−ＦＣＳに交換し、さらに４２時間培養を続けた。培地を除去し、細胞をＰＢＳでよく洗浄した後、細胞溶解液（２５ｍＭトリス−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）、２ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭ１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）を加え、細胞を溶解させた。細胞溶解液中のルシフェラーゼタンパク質の化学発光を測定することによって、遺伝子発現を定量した。また、Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎａｔｅ（ＢＣＡ）法にて細胞溶解液中の総タンパク質量を測定した。統計分析は、ＡＮＯＶＡを用いた。ｐ値が０．０５より低いとき有意差があるとした。

図７は、プラスミドＤＮＡとカチオン化プルラン誘導体とからなる種々のポリイオンコンプレックスを用いたＨｅｐＧ２細胞へのインビトロ遺伝子導入結果を示す（プラスミドＤＮＡ量５μｇ／ウエル、Ｎ／Ｐ＝５、白バー：アシアロフェツインなし、黒バー：アシアロフェツインあり、*ｐ＜０．０５）。図から明らかなように、分子量４８，０００のプルランが最も高い遺伝子発現を示した。一方、いずれのコンプレックスにおいても、ＨｅｐＧ２細胞表面に発現しているアシアロ糖夕ンパク質レセプターに結合するアシアロフェツイン（１ｍｇ／ｍｌ）をコンプレックスと同時添加した場合、遺伝子発現が低下した。このことは、カチオン化プルランとプラスミドＤＮＡとのポリイオンコンプレックスが、主としてアシアロ糖タンパク質レセプ夕ーを介して細胞内に取り込まれていることを示唆している。

図８は、ＨｅｐＧ２細胞への遺伝子発現に与えるＮ／Ｐ比の影響について調べた結果を示す（プラスミドＤＮＡ量５μｇ／ウエル、Ｍｗ＝４８，０００、スペルミン導入率２９．０％、白バー：アシアロフェツインなし、黒バー：アシアロフェツインあり、*ｐ＜０．０５）。Ｎ／Ｐ比が５の場合、最も高い遺伝子発現を示した。Ｎ／Ｐ比が低い場合には、ポリイオンコンプレックスは十分正電荷を帯びていないため負電荷を帯びている細胞膜との相互作用が弱く、また、コンプレックスの分子サイズも大きいため遺伝子導入効率が低いと考えられる。

カチオン性高分子は、負電荷をもつ細胞膜と強く相互作用することにより、細胞に対して高い毒性を示すことが知られている。図９は細胞毒性に関するデータを示す（プラスミドＤＮＡ量５μｇ／ウエル、Ｍｗ＝４８，０００、スペルミン導入率２９．０％、白バー：アシアロフェツインなし、黒バー：アシアロフェツインあり）。Ｎ／Ｐ比の増加にしたがって遣伝子導入実験後の細胞の総タンパク質量が減少し、細胞数が低下していることがわかった。Ｎ／Ｐ比がより高くなるとフリーのカチオン化プルラン誘導体が多くなり、その細胞毒性により遺伝子発現が低下すると考えられる。

図１０は異なる量のプラスミドＤＮＡを含むポリイオンコンプレックスを用いたＨｅｐＧ２細胞へのインビトロ遺伝子導入についての結果を示す（Ｍｗ＝４８，０００、スペルミン導入率２９．０％、Ｎ／Ｐ＝５、白バー：アシアロフェツインなし、黒バー：アシアロフェツインあり、*ｐ＜０．０５）。プラスミドＤＮＡの濃度が５μｇ／ウエルの場合に最も高い遺伝子発現を示し、それよりも高いあるいは低いプラスミドＤＮＡ投与量では発現レベルは低くなった。また、いずれの投与量においてもアシアロフェツインの添加により発現レベルは低下した。これは、ポリイオンコンプレックスによる遺伝子発現が、アシアロ糖タンパク質レセプターを介していることを示している。また、図１１に示すように、プラスミドＤＮＡの投与量の増加とともに、細胞の総タンパク質量の減少が認められ、ポリイオンコンプレックスの濃度の増加により細胞が死んでいることがわかった（プラスミドＤＮＡ量５μｇ／ウエル、Ｍｗ＝４８，０００、スペルミン導入率２９．０％、白バー：アシアロフェツインなし、黒バー：アシアロフェツインあり）。以上のことより、プラスミドＤＮＡ投与量が低い場合には遺伝子発現が起こらず、逆に高い投与量のポリイオンコンプレックスは細胞毒性を誘発し、その結果、遺伝子発現レベルが低下したと考えられる。

図１は、カチオン化プルラン誘導体とプラスミドＤＮＡとのポリイオンコンプレックスの見かけの分子サイズを示す。図２は、ポリイオンコンプレックスの分子サイズに与えるＮ／Ｐ比の影響を示す。図３は、ポリイオンコンプレックスの濁度測定の結果を示す。図４は、種々のイオン強度の分子量４８，０００のプルランを用いて濁度測定を行った結果を示す。図５は、カチオン化プルラン誘導体との混合によるプラスミドＤＮＡ−ＥｔＢｒ複合体の蛍光強度の変化を示す。図６は、ポリイオンコンプレックスの電気泳動の結果を示す。図７は、ポリイオンコンプレックスを用いたＨｅｐＧ２細胞へのインビトロ遺伝子導入結果を示す。図８は、ＨｅｐＧ２細胞への遺伝子発現に与えるＮ／Ｐ比の影響を示す。図９は、ポリイオンコンプレックスの細胞毒性に関するデータを示す。図１０は、ポリイオンコンプレックスを用いたＨｅｐＧ２細胞へのインビトロ遺伝子導入の結果を示す。図１１は、ポリイオンコンプレックスを用いてＨｅｐＧ２細胞へインビトロ遺伝子導入したときの細胞の総タンパク質量を示す。

Claims

核酸とカチオン化プルラン誘導体から形成されるポリイオンコンプレックスを含む、肝臓デリバリー用製剤。
前記プルランの分子量が３０，０００−６０，０００である、請求項１記載の製剤。
前記ポリイオンコンプレックス中の、カチオン化プルラン誘導体中のアミノ基のモル数と核酸中のリン酸基のモル数との比が３−７である、請求項１記載の製剤。