KR20170097124A - 세포에 핵산을 도입하기 위한 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포를 핵산으로 형질감염시키기 위한 비히클로서 유용한 알킬렌 아민 부분들의 특징적인 조합을 포함하는 중합체에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 또한 핵산 및 상기와 같은 중합체를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 사용하여 세포를 형질감염시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 또한, 본 발명은 약학 조성물 및 용도에 관한 것이다.

Description

세포에 핵산을 도입하기 위한 조성물{COMPOSITIONS FOR INTRODUCING NUCLEIC ACID INTO CELLS}
본 발명은 세포를 핵산, 특히 RNA로 형질감염시키기 위한 비히클로서 유용한 특징적인 알킬렌 아민 반복 단위를 포함하는 중합체에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 또한 적어도 하나의 핵산 및 상기와 같은 알킬렌 아민 반복 단위를 포함하는 중합체를 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 사용하여 세포를 형질감염시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 또한, 본 발명은 약학 조성물 및 용도에 관한 것이다.
핵산 요법의 실행가능성은 궁극적으로 핵산을 세포에 전달하기에 효율적인 방법의 유효성에 달려있다.
핵산 전달에서 일반적으로, 네이키드 핵산의 사용이 적합하며 일부의 경우에 세포의 형질감염에 충분하다(Wolff et al. 1990, Science, 247, 1465-1468). 그러나, 대부분의 예상되는 실제 용도에서는 상기 핵산을, 전달 중 분해로부터 상기 핵산을 보호하고/하거나 표적 조직에 대한 및 상기 조직 중의 분포를 촉진하고/하거나 세포 흡수를 촉진하고 적합한 세포내 가공을 가능하게 하는 적어도 제2 작용제와 제형화하는 것이 유리하거나 또는 심지어 필요하다. 핵산 전달을 위한 상기와 같은 제형을 과학 문헌에서는 벡터로서 지칭한다. 핵산의 벡터화를 위한 광범위하게 다양한 화합물들, 소위 형질감염 시약들이 앞서 기재되었다. 이들 화합물은 대개 다중양이온 또는 리피도이드와 같은 양이온성 지질 또는 지질-형 화합물을 포함하는 조성물이다(US 8,450,298). 핵산과 다중양이온과의 복합체를 폴리플렉스라 지칭하고, 양이온성 지질과의 복합체는 리포플렉스라 지칭한다(Felgner et al. 1997, Hum Gene Ther, 8, 511-512). 다중양이온 및 지질을 모두 포함하는 복합체가 또한 기재되었다(Li and Huang in "Nonviral Vectors for Gene Therapy", Academic Press 1999, Chapter 13, 295-303). 형질감염 시약을 사용하여 핵산을 결합시키고 압축시켜 나노미터 크기 범위의 1차 복합체를 생성시킨다. 염-함유 매질에서 상기 복합체는 응집(또한 염-유발된 응집으로서 공지되어 있다)하는 경향이 있으며, 이는 세포 배양물에서의 형질감염 또는 생체내 국소화된 투여에 유리할 수 있다((Ogris et al. 1998, Gene Ther, 5, 1425-1433; Ogris et al. 2001, AAPS PharmSci, 3, E21). 폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 중합체에 의한 표면 차폐에 의해 응집이 회피될 수 있고 핵산과 형질감염 시약과의 복합체가 안정화될 수 있다. 차폐는 또한 형질감염 시약과의 핵산 복합체에 의한 보체 활성화 및 상기 복합체의 옵소닌화를 피하는데 사용된다(Finsinger et al. 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192). 형질감염 시약에 의한 핵산의 압축은 상기 핵산을 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 보호할 뿐만 아니라 상기 핵산을 엔도시토시스에 의한 세포 흡수에 적합하게 한다. 다수의 선형 및 분지된 다중양이온이, 예를 들어 비제한적으로 폴리(에틸렌이민), 폴리(아미도아민) 덴드리머, 폴리(2-(디메틸아미노)에틸 메트아크릴레이트)(pDMAEMA) 또는 폴리(N-(2-하이드록시프로필)메트아크릴아미드)(pHPMA)의 양이온성 유도체, 폴리(베타-아미노 에스테르)(Akinc et al. 2003, Bioconj Chem 14(5):979-88), 천연 및 합성 양이온성 폴리(아미노산) 또는 펩티드, 예를 들어 폴리(리신), 히스톤, HMG 단백질 또는 양이온성 탄수화물, 예를 들어 키토산이 핵산과 결합하고 이를 압축시키는데 적합하다. 상기 언급된 1차-, 2-차 및/또는 3차 아민을 함유하는 중합체들 외에, 구아니딜 부분을 함유하는 구조물들이 핵산 복합체화 및 전달 목적에 중요한 부류의 분자이다. 아르기닌 기반의 구조물과 같은 구아니딜 변형된 중합체(Yamanouchi et al. 2008, Biomaterials 29(22):3269-77), 아르기닌으로 변형된 PAMAM(Son et al. 2013, Bull. Korean Chem. Soc. Vol 34 No. 3) 또는 구아디닐화된-PEI(Lee et al. 2008, Bull. Korean Chem. Soc. 2008, Vol. 29, No. 3)가 상기와 같은 시스템의 효율을 두드러지게 하였다. 특히 RNA 상호작용의 경우에, 상기 구아니딜 부분의 분자 특징은 특유의 결합 성질을 나타낸다(Calnan et al. 19991, Science 252(5009), 1167-1171). 상기와 같은 구조물의 생성을 위해서 문헌[Katritzky and Rogovoy (Katritzky & Rogovoy 2005, ARKIVOC (iv) 49-87)]에 재고찰된 바와 같은 방법을 사용할 수 있다. 종종, 폴리플렉스를, 세포 표적화 또는 세포내 표적화 부분 및/또는 막-탈안정화 성분, 예를 들어 불활성화된 바이러스(Curiel et al. 1991, ProcNatl Acad Sci USA, 88, 8850-8854), 바이러스 캡시드 또는 바이러스 단백질 또는 펩티드(Fender et al. 1997, Nat Biotechnol, 15, 52-56, Zhang et al. 1999, Gene Ther, 6, 171-181) 또는 막-파괴성 합성 펩티드(Wagner et al. 1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89, 7934-7938, Plank et al. 1994, J Biol Chem, 269, 12918-12924)를 함유하도록 추가로 변형시킨다.
엔소시토시스 흡수시, 복합체는 세포내 소낭, 예를 들어 엔도솜 및 리소솜내로 격리되고 여기에서 세포 분해 기구에 노출된다. 따라서, 세포내 소낭으로부터의 탈출이, 기능성 바이러스 감염을 위해 또한 적용되는 요건인 효율적인 기능 핵산 전달에 필수적인 것으로 인식되었다((Wagner et al. 1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89, 7934-7938, Plank et al. 1994, J Biol Chem, 269, 12918-12924). 바이러스 감염성을 위해 특성이 진화되어 온 기전들은 합성 벡터에 의한 효율적인 핵산 전달을 성취하도록 모방되었다. 이 때문에, 양친성 막-탈안정화 펩티드, 예를 들어 INF, GALA 및 KALA 펩티드 또는 멜리틴 및 멜리틴 유도체(Boeckle et al. 2006, J Control Release, 112, 240-248)가 엔도솜 탈출 기능성을 갖는 다중양이온성 형질감염 시약을 보완하는데 대단히 성공적으로 사용되었다(Plank et al. 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35). 리포플렉스에서, 상기와 같은 기능성은 세포막과 융합하는 그의 지질 부분의 능력에 의해 타고난다(Xu and Szoka 1996, Biochemistry, 35, 5616-5623, Zelphati and Szoka 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 11493-11498). 보우시프(Boussif) 등의 중요 논문(Boussif et al. 1995, Proc Natl Acad Sci USA, 92, 7297-7301) 이래로, 폴리플렉스의 엔도솜 탈출 기능성이 물리-화학적 수단에 의해 실현될 수 있음이 공지되었다. 폴리(에틸렌이민)(PEI)을 다중양이온으로서 사용하여 폴리플렉스를 형성시키는 경우, 산성 pH에서 그의 완충 능력은 엔도솜 탈출을 촉발하기에 충분하다. 엔도솜의 관강은 엔도솜막 중에 존재하는 양성자 펌프에 의해 산성화되는 것으로 공지되어 있다(Lafourcade et al. 2008, PLoS One, 3, e2758). 이러한 산성화는 일부 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 또는 아데노바이러스의 엔도솜 탈출에 촉발인자이다. 실험적 증거에 의해 지지되는, 소위 양성자 스펀지 이론은 PEI의 화학 구조 특징을 포함하는 중합체의 추정적인 기계적 작용을 기재한다: PEI의 아미노 그룹의 상당 부분은 중성(생리학적) pH에서 양성자화되지 않는다(Ziebarth and Wang 2010, Biomacromolecules, 11, 29-38). 양성자화되고 따라서 양으로 하전된 아미노 그룹 덕분에, PEI-유사 중합체는 핵산과 결합하여 상기를 압축시킬 수 있다. 양성자화되지 않은 아민은 산성 pH에서 양성자화될 수 있으며, 따라서 엔도솜내에서 완충 능력을 가질 수 있다. 상기 양성자 펌프에 의한 엔도솜 산성화는 클로라이드 이온의 축적이 딸려 온다(Sonawane et al. 2003, J Biol Chem, 278, 44826-44831). 엔도솜 관강 중 PEI와 같은 완충 분자의 존재하에서, 상기 양성자 펌프는 자연적인 산성 엔도솜 pH에 도달할 때까지 부재할 것이므로, 보다 많은 양성자를, 클로라이드 축적과 함께 상기 엔도솜 관강내로 왕복수송할 것이다. 상기 엔도솜내 이온의 불균형 축적은 상기 소낭의 삼투성 탈안정화에 이르게 하고, 이는 최종적으로 소낭 파열 및 상기 핵산 복합체의 세포질내로의 방출에 이르게 할 것으로 생각된다.
상기 양성자 스펀지 이론을 근거로, 다수의 연구자는 산성 pH에서 완충 능력을 갖는 아민을 포함하는 신규의 중합체 라이브러리를 생성시키는데 있어서 PEI의 구조적 특징을 습득하였다. US 7,780,957 및 US 7,829,657에서 카타오카(Kataoka) 등은 카복실산 측쇄가 산성 pH에서 양성자화 가능한 아민 측쇄로 유도체화되는 폴리(글루탐산) 또는 폴리(아스파트산) 주쇄를 기본으로 하는 중합체를 기재한다. 그러나, 다중양이온에서 형질감염-증대 부분으로서 작용하는 교번하는 비-일치성 알킬렌 아민 단위를 함유하는 올리고(알킬렌 아민)의 풍부 구조 공간은 조사되지 않았다. 특히, 이전에는 mRNA 형질감염에 대해서 조사되지 않았다.
대조적으로, 카타오카 등의 다수의 과학 논문은 폴리{N-[N'-(2-아미노에틸)-2-아미노에틸]아스파트아미드}에 집중하였다. 우치다(Uchida) 등의 간행물(2011, J Am Chem Soc, 133, 15524-15532)에서, 같은 그룹은 일반식 -(CH2-CH2-NH)m-H의 측쇄 중에 반복하는 아미노에틸렌 단위를 갖는 일련의 N-치환된 폴리아스파트아미드를 조사하였다. 흥미롭게도, 상기 저자들이 플라스미드 DNA의 형질감염에서 상기 중합체 계열의 효율을 검사했을 때, 다수의 세포주에 대한 엔도솜 탈출 및 형질감염의 효율에 대한 중합체 측쇄 중의 반복하는 아미노에틸렌 단위의 독특한 홀수-짝수 효과가 관찰되었다. 짝수의 반복하는 아미노에틸렌 단위를 갖는 중합체(PA-E)로부터의 폴리플렉스는 현저한 독성없이, 홀수의 반복하는 아미노에틸렌 단위를 갖는 중합체(PA-O)의 경우보다 10배 더 높은 형질감염 효율을 성취하였다. 이러한 홀수-짝수 효과는 상기 중합체의 완충 성능뿐만 아니라 엔도솜 pH에서 막 완전성을 선택적으로 붕괴시켜 상기 PA-E 폴리플렉스의 매우 유효한 엔도솜 탈출을 유도하는 그의 능력과 잘 일치하였다. 더욱 또한, 상기 중합체 측쇄 중의 양성자화된 아미노 그룹들 사이에 정확한 간격으로 다가의 하전된 배열을 형성시키는 것은 상기 엔도솜 막의 유효한 붕괴, 따라서 상기 폴리플렉스의 세포질내로의 운반을 촉진하는데 필수적인 것으로 나타났다(Abstract from Uchida et al. 2011, J Am Chem Soc, 133, 15524-15532). 흥미롭게, 같은 그룹의 연구자들이 1,2-디아미노에탄 측쇄를 갖는 폴리(아스파트아미드) 유도체, [PAsp(DET)]를 1,3-디아미노프로판 측쇄를 갖는 유사체, [PAsp(DPT)]에 비교했을 때, 그들은, 입자 크기 및 ζ-전위에서 [PAsp(DET)]에 대한 물리화학적 차이는 무시할만하다 하더라도, PAsp(DPT) 폴리플렉스가 N/P 비와 함께 점진적으로 증가된 세포독성으로 인해, 높은 N/P 비에서 플라스미드 DNA의 형질감염 효능의 현저한 강하를 나타냄을 관찰하였다((Miyata et al. 2008, J Am Chem Soc, 130, 16287-16294). 따라서, 상기 홀수-짝수 법칙을 근거로, 3개의 양성자화 가능한 아미노 그룹 및 프로필렌 이격자 그룹을 포함하는 중합체는 PAsp(DET)보다 열등하고 1,3-디아미노프로판-포함 측쇄는 독성 문제와 관련됨을 예상할 수 있다. mRNA 형질감염에 대한 상기와 같은 중합체의 구조-활성 관계에 대해 공지된 것은 없다.
문헌[M. Kramer, "Polymeric Nanocarriers with Dendritic Core-Shell Architectures", Dissertation, Albert-Ludwigs-Universitat Freiburg i.Br., 2004]은 프로필렌이민 측쇄 또는 말단 그룹에 그래프트화될 수 있는 PEI 기반의 덴드리머의 입자를 사용하는 유전자 형질감염을 기재한다.
기엘(Geall)과 동료들은 하기 화학식을 갖는 폴리아민 부분을 갖는 콜레스테롤-폴리아민 카바메이트를 기재하였다:
-NH-CH2-(CH2)n-CH2-NH-CH2-(CH2)m-CH2-NH-CH2-(CH2)n-NH2,
상기 식에서, m = 0, 1 또는 2 및 n = 0 또는 1(Geall et al. 1999, FEBS Lett, 459, 337-342). 이들은 송아지 흉선 DNA의 응축에서 상기 물질의 pKa 값 및 상기 물질의 특성을 조사하였다. 이들은 콜레스테롤 폴리아민 카바메이트를 따라 있는 양전하의 부위화학적(regiochemical) 분포가 DNA 결합 친화성 및 리포펙션 효율의 조절에 중요한 역할을 함을 발견하였다. 이들은 상기 조사된 콜레스테롤-폴리아민 카바메이트 중에서, 폴리아민 부분, -HN-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH2(프로필/부틸/프로필)을 구성하는 스페르민이 세포 배양물에서 베타 갈락토시다제-암호화 플라스미드 DNA의 형질감염시 단연 가장 높은 정보제공 유전자 발현을 생성시키는 반면, 예를 들어 -HN-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH2(에틸/프로필/에틸)은 3- 내지 10배 덜 효율적임을 발견하였다. 따라서, 카타오카 등의 교시(홀수-짝수 법칙) 및 기엘 등의 발견에 비추어, 당해 분야의 숙련가는 핵산 전달과 관련하여 후자의 구조를 버릴 것이다.
왕(Wang) 등은 플라스미드 DNA에 대한 효율적이고 저세포독성인 형질감염 시약으로서 폴리(메틸 메트아크릴레이트)-그래프트-올리고아민을 기재하였다((Wang et al. 2010, Molecular BioSystems, 6, 256-263). 상기 중합체는 폴리(메틸 메트아크릴레이트)의, 화학식 H2N-CH2-CH2-(NH-CH2-CH2)m-NH2(여기에서 m = 1, 2, 또는 3)의 올리고아민에 의한 가아미노분해에 의해 수득되었다. 상기 저자들은 형질감염 효율이 아민의 증가하는 길이에 따라 증가함을 발견하였다.
오우(Ou) 등은 N,N'-시스타민비스아크릴아미드와의 공-중합에 의해 구조 Dde-NH-(CH2)a-NH-(CH2)b-NH-(CH2)a-NH-Dde를 갖는 말단 보호된 올리고 아민으로부터 유도된 폴리(디설파이드 아미도 아민)을 기재하였다(Ou et al. 2009, Biomaterials 30, 5804-5814; WO 2010/065660). 이들은 조합 a = 2 및 b = 2, a = 2 및 b = 3, a = 3 및 b = 2, a = 3 및 b = 3, a = 3 및 b = 4(스페르민)를 조사하였다. Dde는 2-아세틸디메돈 보호 그룹이다. 상기 보호 그룹의 제거 후에, 상기 합성은 폴리(디설파이드 아미도 아민)을 제공하며, 여기에서 상기 내부의 원래 2차 아민은 상기 중합체 주쇄의 부분으로서 3차 아민으로 되고 상기 말단 아민은 계류 중인 에틸렌 또는 프로필렌 아민 측쇄의 부분으로 된다. 상기와 같은 중합체는 핵산 전달에 적합한 pH 범위에서 완충 능력을 가지며 플라스미드 DNA의 세포내로의 형질감염에 유용하다.
최근에, 새로운 부류의, 지질과 유사하나 비지질성인 합성 구조물(소위 리피도이드)의 시험관내 및 생체내 핵산 전달에 대한 유용성이 발견되었다(US 8,450,298; Love et al. 2010, PNAS 107, 1864-1869; WO2006/138380; Akinc et al. 2008, Nat Biotechnol 26, 561-569). 리피도이드는 아민-함유 화합물을 지방족 에폭사이드, 아크릴레이트, 아크릴아미드 또는 알데히드와 반응시킴으로써 수득된다. 상기 저자/발명자들은 리피도이드 라이브러리를 수득하는 합성 과정 및 시험관내에서 핵산의 세포로의 전달에 유용성을 갖는 유용한 화합물의 선택을 위한 선별 과정을 제공하였다.
상기로부터 자명한 바와 같이, 다수의 연구 개발 작업은 과거에는 플라스미드 DNA, 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 핵산 유사체와 같은 다른 핵산 분자들의 전달에 대해 수행되었다. mRNA 전달은 그다지 깊이 조사되지는 않았다. 일부 저자는 DNA 또는 siRNA 전달에 대해 잘 작용하는 화합물 및 제형들이 mRNA 전달에도 마찬가지로 작용할 것임을 주장하고 있다. 그러나, 플라스미드 DNA 또는 siRNA와 대조적으로, mRNA는 단일 가닥 분자이다. 따라서, 단지 구조적 고려사항만을 근거로도, DNA 또는 siRNA 전달에 대해 상이한, mRNA 전달을 위한 화합물 및 제형에 대해 상이한 요구들이 예상될 수 있다.
상기 인용된 선행 문헌은 세포내로의 이중 가닥 핵산, 예를 들어 플라스미드 DNA 또는 siRNA의 전달을 기재하고 있으나, 상기 기재된 방법 및 화합물이 단일 가닥 핵산, 예를 들어 mRNA를 세포내로 전달할 수 있는지의 여부는 공지되어 있지 않다. 현저하게, 앞서 mRNA 형질감염이 세포내로의 플라스미드 DNA 형질감염과 실질적으로 상이한 것으로 관찰되었다(Bettinger et al. 2001, Nucleic Acids Res, 29,3882-91, Uzgun et al, 2011, Pharm Res, 28, 2223-32).
상기와 일치하도록, 본 발명자들은 RNA의 세포로의 전달, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA의 전달에서의 적합성에 대해 WO 2011/154331에 개시된 100개가 넘는 중합체 계열 구성원을 선별했을 때, 상기 화합물들 중 어느 것도 상기 mRNA에 의해 암호화된 유전자의 발현을 생성시키는 방식으로 mRNA를 형질감염시키는데 유용하지 않음을 발견하였다. 대조적으로, 이들 화합물은 모두 플라스미드 DNA 및/또는 siRNA 전달에는 효율적이다. 따라서, 세포내로의 이중 가닥 핵산의 전달에 대해 확립된 법칙을 단일 가닥 mRNA에 연역적으로 적용하지 못한다. WO 2011/154331의 명세는 화학식 HOOC-Z-R-NH-[(CH2)b-NH]a-H(여기에서 Z는 일련의 메틸렌 또는 다양한 다른 그룹이고, R은 메틸렌 또는 카복시 잔기이고, a 및 b는 각각 독립적으로 1-7 또는 2-7의 정수이다)에 상응하는 2 내지 60 단위의 올리고(알킬렌 아미노)산 단위인 화학적으로 정의된 올리고머를 포함한다. 상기 계열의 올리고머들은 소위 양성자 스펀지 효과를 발휘할 수 있는 양성자화 가능한 아미노 그룹을 포함하며 시험관내 및 생체내에서 플라스미드 DNA 및 siRNA의 형질감염에 매우 활성인 것으로 입증되었다. 중요하게, WO 2011/154331 및 관련된 과학 간행물은 서열-한정된 올리고머/중합체 라이브러리가 화학식 HOOC-Z-R-NH-[(CH2)b-NH]a-H에 상응하는 구성 블록으로부터 어떻게 확립될 수 있는지에 대해 매우 상세히 교시하고 있다.
따라서 본 발명에 근원하는 기술적 과제는 세포내에 또는 조직에 높은 효율로, 핵산 및 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥-RNA, 예를 들어 mRNA의 전달에 적합한 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제는 특허청구범위에서 특성화되고 하기의 일반적인 설명 및 실시예에 더욱 상세히 예시되는 바와 같은 실시태양들의 제공에 의해 수행되었다.
놀랍게도, 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA에 의한 세포의 형질감염을 위한 조성물 중에 교번하는 길이의 알킬렌 아민 반복 단위의 통계/무작위 배열을 함유하는 공중합체가 교번하지 않는 길이의 알킬렌 아민 반복 단위의 유사한 배열을 함유하는 중합체보다 일관되게 더 효능 있음이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 첫 번째 태양에서 하기 화학식 a1 및 a2의 반복 단위 중에서 독립적으로 선택된 다수의 반복 단위 a, 및 하기의 화학식 b1 내지 b4의 반복 단위 중에서 독립적으로 선택된 다수의 반복 단위 b를 포함하는 통계 공중합체를 제공한다:
[화학식 a1]
Figure pct00001
[화학식 a2]
Figure pct00002
[화학식 b1]
Figure pct00003
[화학식 b2]
Figure pct00004
[화학식 b3]
Figure pct00005
[화학식 b4]
Figure pct00006
상기 식들에서,
상기 반복 단위 a의 합 대 반복 단위 b의 합의 몰비는 0.7/1.0 내지 1.0/0.7의 범위 내에 있고,
상기 공중합체 중에 함유된 반복 단위 a 및/또는 b의 질소 원자들 중 하나 이상은 양성자화되어 양이온성 공중합체를 제공할 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA, 및 상기 공중합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 공중합체의 제조 방법뿐만 아니라 본 발명에 따른 조성물 및 약학 조성물을 포함한다.
더욱 추가의 태양은 표적 세포내에 또는 조직에 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA를 전달하기 위한 본 발명에 따른 조성물 또는 본 발명에 따른 공중합체의 용도, 및 본 발명에 따른 조성물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 세포내에 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA를 전달하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 공중합체는 보다 짧은 반복 단위 a를 보다 긴 반복 단위 b와 통계 공중합체, 특히 무작위 공중합체의 형태 및 한정된 비로 겸비한다. 상기 반복 단위 a 및 b의 이러한 배열은 세포내에 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA를 전달하기 위한 비히클로서 상기 생성되는 공중합체의 적합성에 관하여 뜻밖의 장점을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 공중합체는 하기 화학식 a1 및 a2의 반복 단위 중에서 독립적으로 선택된 다수의 반복 단위 a, 및 하기의 화학식 b1 내지 b4의 반복 단위 중에서 독립적으로 선택된 다수의 반복 단위 b를 포함하는 통계 공중합체이다:
화학식 a1
Figure pct00007
화학식 a2
Figure pct00008
화학식 b1
Figure pct00009
화학식 b2
Figure pct00010
화학식 b3
Figure pct00011
화학식 b4
Figure pct00012
상기 식들에서,
상기 반복 단위 a의 합 대 반복 단위 b의 합의 몰비는 0.7/1.0 내지 1.0/0.7의 범위 내에 있고,
상기 공중합체 중에 함유된 반복 단위 a 및/또는 b의 질소 원자들 중 하나 이상은 양성자화되어 양이온성 공중합체를 제공할 수 있다.
상기 공중합체는, 임의의 반복 단위 a 및 임의의 반복 단위 b가 상기 공중합체 거대분자 중에 통계학적으로 분포되어 있는 통계 공중합체이다. 상기는 전형적으로는 중합 반응 동안 생성되는 단량체들의 혼합물, 상기 중합 반응 동안 생성되는 상기 반복 단위 a와 단량체, 상기 반복 단위 b의 공중합으로부터 수득된다. 바람직하게, 상기 공중합체는 임의의 반복 단위 a 및 임의의 반복 단위 b가 상기 중합체 거대분자 중에 무작위로 분포되어 있는 무작위 공중합체이다.
본 발명에 따른 공중합체는 선형, 분지된 또는 수지상 공중합체일 수 있다. 숙련된 독자에 의해 이해되는 바와 같이, 2의 원자가(즉 이웃하는 단위에 대한 개방 결합)를 갖는 화학식 a1, b1 또는 b3의 반복 단위는 상기 공중합체 구조를 선형 방식으로 확대되게 한다. 따라서, 본 발명의 선형 공중합체는 화학식 a1의 반복 단위 및 화학식 b1 및 b3의 반복 단위 중 하나 이상의 유형(그러나 화학식 a2, b2 또는 b4의 반복 단위는 아님)을 포함한다. 추가로 이해되는 바와 같이, 3의 원자가를 갖는 화학식 a2, b2 또는 b4의 반복 단위의 존재는 상기 공중합체 구조 중에 분지점을 제공한다. 따라서, 분지된 공중합체는 화학식 a2, b2 및 b4의 반복 단위 중 하나 이상의 유형을 포함하고, 화학식 a1, b1 및 b3의 반복 단위 중 하나 이상의 유형을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 공중합체는 상기 정의된 화학식 a1 및 a2의 반복 단위 중에서 독립적으로 선택된 다수의 반복 단위 a, 및 상기 정의된 화학식 b1 내지 b4의 반복 단위 중에서 독립적으로 선택된 다수의 반복 단위 b를 포함한다. 상기 정의된 화학식 a1 및 a2의 반복 단위 중에서 독립적으로 선택된 다수의 반복 단위 a, 및 상기 정의된 화학식 b1 및 b2의 반복 단위 중에서 독립적으로 선택된 다수의 반복 단위 b를 포함하는 공중합체가 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 공중합체는 반복 단위 a2, b2 및 b4 중에서 선택된 반복 단위 중 하나 이상의 유형을 포함하고 화학식 a1, b1 및 b3의 반복 단위 중 하나 이상의 유형을 임의로 추가로 포함하는 분지된 공중합체, 및 특히 화학식 a2의 반복 단위를 포함하고 화학식 b2 및 b4의 반복 단위 중 하나 이상의 유형을 포함하고 화학식 a1, b1 및 b3의 반복 단위 중 하나 이상의 유형을 임의로 추가로 포함하는 공중합체인 것이 또한 바람직하다. 상기와 일치하도록, 보다 바람직한 공중합체는 따라서 화학식 a2의 반복 단위 및 화학식 b2의 반복 단위를 포함하고 화학식 a1 및 b1의 반복 단위 중 하나 이상의 유형을 임의로 추가로 포함하는 분지된 공중합체이다.
본 발명에 따른 공중합체에서, 상기 반복 단위 a 및 반복 단위 b의 총수는 전형적으로 20 이상, 바람직하게는 50 이상, 및 보다 바람직하게는 100 이상이다. 전형적으로, 상기 반복 단위 a 및 반복 단위 b의 총수는 5,000 이하, 바람직하게는 2,500 이하, 보다 바람직하게는 1,000 이하 및 특히 500 이하이다.
더욱 또한, 본 발명에 따른 공중합체는 상기 반복 단위 a 및 b가 상기 공중합체의 모든 반복 단위 중 80 몰% 이상, 보다 바람직하게는 90 몰% 이상을 차지하는 것이 바람직하다. a1 및 a2 중에서 선택된 반복 단위 a 및 b1 및 b2 중에서 선택된 반복 단위 b가 상기 공중합체의 모든 반복 단위 중 80 몰% 이상, 보다 바람직하게는 90 몰% 이상을 차지하는 공중합체가 더욱 바람직하다. 상기 공중합체의 반복 단위가 전부 반복 단위 a 또는 b인 것, 특히 상기 공중합체의 반복 단위가 전부 a1 및 a2 중에서 선택된 반복 단위 a 또는 b1 및 b2 중에서 선택된 반복 단위 b인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 공중합체의 중량 평균 분자량은, 예를 들어 선형 폴리(에틸렌 옥사이드) 표준에 대한 크기 배제 크로마토그래피를 통해 측정된 바와 같이, 일반적으로 1,000 내지 500,000 Da, 바람직하게는 2,000 내지 250,000 Da 및 보다 바람직하게는 5,000 내지 50,000 Da의 범위이다.
본 발명에 따른 공중합체의 말단 그룹은 전형적으로 하기 화학식 c1 내지 c3의 그룹, 바람직하게는 하기 화학식 c1 및 c2의 그룹 중에서 독립적으로 선택된 그룹 c 중 하나 이상의 유형을 포함한다:
[화학식 c1]
Figure pct00013
[화학식 c2]
Figure pct00014
[화학식 c3]
Figure pct00015
바람직하게, 상기 공중합체 중의 말단 그룹은 하기 화학식 c1 내지 c3의 그룹, 바람직하게는 화학식 c1 및 c2의 그룹 중에서 독립적으로 선택된 그룹 c 중 하나 이상의 유형으로 이루어진다. 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 상기 말단 그룹의 수는 본 발명에 따른 공중합체의 구조에 따라 변한다. 선형 공중합체는 단지 2개의 말단을 갖는 반면, 분지된, 특히 수지상 공중합체 중에는 보다 많은 수의 말단 그룹이 함유된다. 추가로 이해되는 바와 같이, 또한 상기 공중합체 중에 함유된 말단 그룹 c의 질소 원자 중 하나 이상을 양성자화시켜 양이온성 공중합체를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 공중합체에서, 상기 반복 단위 a의 합 대 상기 반복 단위 b의 합의 몰비는 0.7/1.0 내지 1.0/0.7의 범위내, 및 바람직하게는 0.8/1.0 내지 1.0/0.8의 범위내에 있다. 상기 몰비를 예를 들어 NMR을 통해 측정할 수 있다. 따라서, 상기 비는 대개 본 발명에 따른 공중합체의 다수의 거대분자에 대해 측정되며, 전형적으로 상기 다수의 거대분자 중의 반복 단위 a의 합 대 반복 단위 b의 합의 전체 비를 가리키는 것으로 이해될 것이다.
상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 공중합체의 질소 원자들 중 하나 이상을 양성자화시켜 양이온성 형태, 전형적으로는 올리고양이온성 또는 다중양이온성 형태의 공중합체를 생성시킬 수 있다. 상기 반복 단위 a 또는 b 또는 상기 말단 그룹 c 중의 1차, 2차 또는 3차 아미노 그룹은 특히 생리학적 유체를 포함한 수성 용액 및 수 중에서 양성자 수용체로서 작용할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 공중합체는 전형적으로 7.5 이하 pH의 수성 용액 중에서 전체적인 양전하를 갖는다. 본 명세서에서 지칭되는 바와 같은 수성 용액은 용매가 50%(부피/부피) 이상, 바람직하게는 80 또는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 100%의 물을 포함하는 용액이다. 또한, 본 발명에 따른 조성물이 예를 들어 혈액 및 폐 유체를 포함한, 7.5 이하의 pH를 갖는 생리학적 유체와 접촉하는 경우, 상기 조성물은 전형적으로 질소 원자가 양성자화된 반복 단위 a 및 b를 함유한다. 본 발명에 따른 조성물에 사용되는 공중합체의 pKa 값을 자동 pKa 적정기를 사용하여 산-염기 적정에 의해 측정할 수 있다. 이어서 주어진 pH 값에서 순 전하를 예를 들어 헨더슨-하셀바흐식으로부터 계산할 수 있다. 임의의 전하가 다수의 염기성 중심에 걸쳐 공유될 수 있으며 상기 전하는 반드시 단일 점에 기인할 수 있는 것은 아니다. 전형적으로 생리학적 pH의 용액 중에서, 본 발명에 따른 조성물에 사용되는 공중합체는 양성자화된 상태의 아미노 그룹을 갖는 반복 단위 및 양성자화되지 않은 상태의 아미노 그룹을 갖는 반복 단위를 포함한다.
그러나, 숙련된 독자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명에 따른 공중합체뿐만 아니라 본 발명에 따른 조성물은 또한 양이온성 형태로 상기 공중합체를 함유하는 무수염으로서 제공될 수 있다.
추가로 이해되는 바와 같이, 상기 공중합체 및 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA를 포함하는 본 발명에 따른 조성물 중의 양성자화된 아미노 그룹의 양전하에 대한 카운터이온(음이온)은 전형적으로 상기 핵산 중에 함유된 음이온 부분에 의해 제공된다. 상기 양으로 하전된 그룹이 상기 핵산 중의 음이온성 부분에 비해 과잉으로 존재하는 경우, 양전하는 다른 음이온, 특히 생리학적 유체 중에서 전형적으로 접하게 되는 것들, 예를 들어 Cl- 또는 HCO3 -에 의해 균형을 이룰 수 있다.
상기와 일치하도록, 본 발명에 따른 바람직한 공중합체는 무작위 공중합체이며, 여기에서
모든 반복 단위의 80 몰% 이상, 보다 바람직하게는 모든 반복 단위가
하기 화학식 a1 및 a2의 반복 단위 중에서 독립적으로 선택된 다수의 반복 단위 a, 및 하기의 화학식 b1 및 b2의 반복 단위 중에서 독립적으로 선택된 다수의 반복 단위 b에 의해 형성되며:
화학식 a1
Figure pct00016
화학식 a2
Figure pct00017
화학식 b1
Figure pct00018
화학식 b2
Figure pct00019
상기 식들에서,
상기 반복 단위 a의 합 대 반복 단위 b의 합의 몰비는 0.7/1.0 내지 1.0/0.7의 범위 내, 보다 바람직하게는 0.8/1.0 내지 1.0/0.8의 범위내에 있다;
상기 공중합체의 말단 그룹은
하기 화학식 c1 및 c2의 그룹 중에서 독립적으로 선택된 그룹 c에 의해 형성된다:
화학식 c1
Figure pct00020
화학식 c2
Figure pct00021
상기 식들에서
상기 공중합체 중에 함유된 반복 단위 a 및/또는 b 및/또는 말단 그룹 c의 질소 원자들 중 하나 이상은 양성자화되어 양이온성 공중합체를 제공할 수 있다. 상기 공중합체는 임의로 단위 a1 및/또는 b1과 함께 단위 a2 및 b2를 포함하는 분지된 공중합체인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 공중합체를 편의상 폴리알킬렌이민, 예를 들어 분지된 또는 선형 폴리에틸렌이민(PEI)의 제조에 대해 공지된 과정과 유사한 과정에 의해 제조할 수 있다. 상기 공중합체의 생성에 사용되는 단량체를 상응하게 조절해야 함을 알 것이다. 본 발명과 관련하여, 상기 단량체를 편의상 정량적인 방식으로, 상기 공중합체 중의 단위 a 및 b의 비가 중합이 가해지는 단량체 혼합물 중에서 상응하게 단량체 비를 조절함으로써 조절될 수 있도록 반응시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 폴리에틸렌이민(또한 폴리아지리딘으로서 지칭됨)을 예를 들어 아지리딘의 개환 중합을 통해 제조할 수 있지만, 본 발명에 따른 공중합체를 아지리딘, 아제티딘, 및 적용 가능한 경우 피롤리딘, 또는 바람직한 실시태양에서, 아지리딘 및 아제티딘을 포함하거나 이들로 이루어지는 단량체 혼합물의 개환 중합을 통해 제조할 수 있다. "적용 가능한 경우"란 표현은 상기 피롤리딘에 의해 형성되는 반복 단위 b3 및 b4 또는 말단 그룹 c3의 존재 또는 부재를 지칭함을 알 것이다. 상기 비-치환된 환상 아민의 개환 중합은 대개 분지된 공중합체를 유도한다. 본 발명에 따른 선형 공중합체를 예를 들어 적합한 N-치환된 아지리딘, N-치환된 아제티딘 및 N-치환된 피롤리딘 또는 N-치환된 아지리딘 및 N-치환된 아제티딘의 중합을 통해 제조할 수 있으며, 이어서 예를 들어 상기 생성되는 폴리알킬렌이민 쇄에 부착된 N-치환체를 가수분해에 의해, 예를 들어 문헌[Katrien F. Weyts, Eric J. Goethals, New synthesis of linear polyethyleneimine, Polymer Bulletin, January 1988, Volume 19, Issue 1, pp 13-19]에 공개된 과정과 유사하게 절단시킬 수 있다.
덴드리머(또는 수지상 공중합체)의 제조를 위해서, 합성 전략을 폴리에틸렌이민 또는 폴리프로필렌아민 덴드리머의 제조에 대해 공지된 바와 유사하게 적용할 수 있다. 폴리프로필렌이민 덴드리머를, 1차 아민에 대한 마이클 부가에 이어서 이종으로 촉매화된 수소화의 반복적인 시퀀스를 사용하여 아크릴로니트릴 구성 블록으로부터 합성할 수 있다(Newkome and Shreiner Poly(amidoamine), polypropylenimine, and related dendrimers and dendrons possessing different 12 branching motifs: An overview of the divergent procedures. Polymer 49 (2008) 1-173; De Brabander-Van Den Berg et al. Large-scale production of polypropylenimine dendrimers, Macromolecular Symposia (1994) 77 (1) 51-62). 폴리에틸렌이민 덴드리머를 1차 아민에 대한 비닐 브로마이드 구성 블록의 마이클 부가에 이어서 가브리엘 아민 합성 방법을 사용하는 알킬브로마이드의 아민으로의 전환의 반복적인 시퀀스를 사용하여 생성시킬 수 있다(Yemul & Imae, Synthesis and characterization of poly(ethyleneimine) dendrimers, Colloid Polym Sci (2008) 286:747-752). 따라서 당해 분야의 숙련가는 예를 들어 프로필렌이민 및 에틸렌이민의 엄격하게 교번하는 층을 갖는 덴드리머를 생성시킬 수 있을 것일 뿐만 아니라 생성시킬 수 있다. 유사하게 화학식 a2, b2 및 b4의 반복 단위 및 바람직하게는 반복 단위 a2 및 b2의 무작위 조성물을 포함하거나 상기 조성물로 이루어지는 층들을 갖는 덴드리머 세대를 생성시킬 수 있다.
아지리딘 및 아제티딘, 또는 아지리딘, 아제티딘 및 피롤리딘의 개환 중합을 용액 중에서, 예를 들어 수 중에서 수행할 수 있다. 전체 단량체 농도는 특별히 제한되지 않지만, 전형적인 농도 범위는 10% 중량/중량 내지 80% 중량/중량, 바람직하게는 30% 중량/중량 내지 60% 중량/중량이다. 전형적으로, 상기 중합은 양성자에 의해 개시되며, 따라서 브론스테드산, 특히 무기산, 예를 들어 황산을 상기 반응 시스템에 가하는 것이 바람직하다. 소량의 산이면, 예를 들어 단량체의 전체 농도를 기준으로 0.001 내지 0.01 당량이면 일반적으로 충분하다. 상기 반응은 예를 들어 50 내지 150 ℃, 특히 90 내지 140 ℃의 온도 범위에서 편리한 속도로 진행된다. 상기 범위에서, 보다 높은 분자량의 공중합체는 대개 보다 높은 온도에서, 보다 낮은 분자량의 공중합체는 보다 낮은 온도에서 진행된다.
핵산
상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 중심 태양은 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA, 및 본 발명에 따른 상기 공중합체를 포함하는 조성물이다.
"핵산"이란 용어는 모든 형태의 천연 유형의 핵산뿐만 아니라 화학적으로 및/또는 효소적으로 합성된 핵산을 포함하며, 또한 핵산 유사체 및 핵산 유도체, 예를 들어 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 올리고뉴클레오시드 티오포스페이트 및 포스포트리에스테르, 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, 양이온성 올리고뉴클레오티드(US6017700 A, WO/2007/069092), 치환된 리보-올리고뉴클레오티드 또는 포스포로티오에이트를 포함한다. 더욱 또한, "핵산"이란 용어는 또한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 임의의 분자를 지칭한다. 본 발명의 조성물 중에 포함되는 핵산의 서열 또는 크기에 관한 제한은 없다. 상기 핵산은 우세하게는 본 발명의 조성물이 전달되는 생물학적 표적에서 성취하고자 하는 생물학적 효과에 의해 한정된다. 예를 들어, 유전자 또는 핵산 요법에의 적용의 경우에, 상기 핵산 또는 핵산 서열을, 발현시키고자 하는 유전자 또는 유전자 단편에 의해 또는 결함 유전자 또는 임의의 유전자 표적 서열의 의도된 치환 또는 수복에 의해 또는 억제하거나, 녹-다운시키거나 또는 하향 조절하고자 하는 유전자의 표적 서열에 의해 한정시킬 수 있다.
바람직하게, "핵산"이란 용어는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. RNA에 관하여, 원칙적으로 임의의 유형의 RNA를 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 RNA는 단일 가닥 RNA이다. "단일 가닥 RNA"란 용어는 2개 이상의 별도의 쇄가 상기 별도의 쇄들의 하이브리드화로 인해 이중 가닥 분자를 형성하는 RNA 분자와 대조적으로 단일의 연속적인 리보뉴클레오티드 쇄를 의미한다. "단일 가닥 RNA"란 용어는 상기 단일 가닥 분자 자체가 고리, 2차 또는 3차 구조와 같은 이중 가닥 구조를 형성함을 배제하지 않는다.
"RNA"란 용어는 아미노산 서열을 암호화하는 RNA뿐만 아니라 아미노산 서열을 암호화하지 않는 RNA도 포함한다. 게놈의 80% 초과가 단백질을 암호화하지 않는 기능성 DNA 요소를 함유함이 제시되었다. 이들 비암호화 서열은 조절성 DNA 요소(전사 인자, 조절인자 및 동시조절인자 등에 대한 결합 부위) 및 결코 단백질로 번역되지 않는 전사물을 암호화하는 서열을 포함한다. 상기 전사물(상기 게놈에 의해 암화되고 RNA로 전사되지만 단백질로 번역되지 않는다)을 비암호화 RNA(ncRNA)라 칭한다. 따라서, 하나의 실시태양에서 상기 RNA는 비암호화 RNA이다. 바람직하게, 상기 비암호화 RNA는 단일 가닥 분자이다. 연구들은 ncRNA가 유전자 조절, 게놈 완전성의 유지, 세포 분화 및 발생에 중요한 참가자이며 다양한 인간 질병에서 잘못 조절됨을 입증하고 있다. 상이한 유형의 ncRNA들이 존재한다: 짧은(20-50 nt), 중간(50-200 nt), 및 긴(>200 nt) ncRNA. 짧은 ncRNA는 마이크로RNA(miRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), piwi-상호작용 RNA(piRNA), 및 전사 개시 RNA(tiRNA)를 포함한다. 중간 ncRNA의 예는 작은 핵 RNA(snRNA), 작은 핵소체 RNA(snoRNA), 전달 RNA(tRNA), 전사 출발-부위-결합 RNA(TSSaRNA), 프로모터-결합 작은 RNA(PASR), 및 프로모터 상류 전사물(PROMPT)이다. 긴 비암호화 RNA(lncRNA)는 긴-유전자간 비암호화 RNA(lincRNA), 안티센스-lncRNA, 인트론 lncRNA, 전사된 초-보존 RNA(T-UCR) 및 기타(Bhan A, Mandal SS, ChemMedChem. 2014 Mar 26. doi: 10.1002/cmdc.201300534)를 포함한다. 상기 언급한 비-암호화 RNA 중에서 오직 siRNA만이 이중 가닥이다. 따라서, 바람직한 실시태양에서 상기 비암호화 RNA는 단일 가닥이므로, 상기 비암호화 RNA는 siRNA가 아닌 것이 바람직하다. 또 다른 실시태양에서 상기 RNA는 암호화 RNA, 즉 아미노산 서열을 암호화하는 RNA이다. 상기와 같은 RNA 분자를 또한 mRNA(전령 RNA)라 칭하며 상기 분자는 단일 가닥 RNA 분자이다. 상기 핵산을 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지된 합성 화학 및 효소학적 방법에 의해, 또는 재조합 기술의 사용에 의해 제조하거나, 또는 천연 공급원으로부터 단리하거나, 또는 이 둘의 조합에 의해 수득할 수 있다. 상기 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드는 비천연 뉴클레오티드를 임의로 포함할 수 있으며 이는 단일 또는 이중 또는 삼중 가닥일 수 있다. "핵산"은 또한 센스 및 안티-센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드, 즉 DNA 및/또는 RNA 중의 특정한 뉴클레오티드 서열에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
바람직하게, 본 발명과 관련하여 핵산이란 용어는 RNA, 보다 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 특히 mRNA 및 가장 바람직하게는 변형된 mRNA를 지칭한다.
전령 RNA(mRNA)는, 중간 운반자로서 유전 정보를 세포핵 중의 DNA로부터 세포질(여기에서 단백질로 번역된다)로 가져가는 뉴클레오시드로서 주로 아데노신, 시티딘, 유리딘 및 구아노신을 갖는 뉴클레오시드 포스페이트 구성 블록으로 형성되는 공중합체이다. 따라서 상기는 유전자 발현에 대한 대안으로서 적합하다.
본 발명과 관련하여, mRNA는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 분자(상기는 세포내에 들어오면 단백질 또는 그의 단편의 발현에 적합하거나 또는 단백질 또는 그의 단편으로 번역될 수 있다)를 의미하는 것으로 이해해야 한다. 여기에서 "단백질"이란 용어는 임의의 종류의 아미노산 서열, 즉 각각이 펩티드 결합을 통해 연결되는 2개 이상의 아미노산의 쇄를 포함하며 펩티드 및 융합 단백질을 또한 포함한다.
상기 mRNA는, 세포 또는 세포의 부근에서 기능하는 것이 필요하거나 이로운 단백질 또는 그의 단편, 예를 들어 그의 결여 또는 결함 형태가 질병 또는 병에 대한 촉발인자이나 제공되면 질병 또는 병을 순하게 하거나 예방할 수 있는 단백질, 또는 세포 또는 그의 부근에서 신체에 이로운 과정을 촉진할 수 있는 단백질을 암호화하는 리보뉴클레오티드 서열을 함유한다. 상기 mRNA는 상기 보체 단백질 또는 그의 기능성 변체에 대한 서열을 함유할 수 있다. 더욱이, 상기 리보뉴클레오티드 서열은 인자, 유도인자, 조절인자, 자극인자 또는 효소로서 작용하는 단백질, 또는 그의 기능성 단편을 암호화할 수 있으며, 이때 상기 단백질은 질환, 특히 대사 질환을 치유하거나 또는 생체내 과정들, 예를 들어 새로운 혈관, 조직 등의 형성을 개시하기 위해서 필요한 기능을 갖는 것이다. 여기에서, 기능성 변체는 세포에서 필요한 기능을 갖거나 또는 그의 결여 또는 결함 형태가 병원성인 단백질의 기능을 수행할 수 있는 단편을 의미하는 것으로 이해된다. 또한, 상기 mRNA는 추가의 기능성 영역 및/또는 3' 또는 5' 비암호화 영역을 또한 가질 수 있다. 상기 3' 및/또는 5' 비암호화 영역은 상기 RNA의 안정화에 기여하는 단백질-암호화 서열 또는 인공 서열에 자연적으로 인접하고 있는 영역일 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 각각의 경우에 통상적인 실험에 의해 상기에 적합한 서열들을 결정할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 상기 mRNA는 특히 번역을 개선시키기 위해서 3' 말단에 m7GpppG 캡, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및/또는 폴리A 꼬리를 함유한다. 상기 mRNA는 번역을 촉진하는 추가의 영역을 가질 수 있다.
바람직한 실시태양에서 상기 mRNA는 변형된 및 변형되지 않은 뉴클레오티드의 조합을 함유하는 mRNA이다. 바람직하게, 상기는 WO2011/012316에 기재된 바와 같은 변형된 및 변형되지 않은 뉴클레오티드의 조합을 함유하는 mRNA이다. 상기 중에 기재된 mRNA는 증가된 안정성 및 감소된 면역원성을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기와 같은 mRNA 중 시티딘 뉴클레오티드의 5 내지 50% 및 유리딘 뉴클레오티드의 5 내지 50%가 변형된다. 상기 아데노신- 및 구아노신-함유 뉴클레오티드가 변형될 수 있다. 상기 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드는 변형되지 않거나 부분적으로 변형될 수 있으며, 바람직하게는 변형되지 않은 형태로 존재한다. 바람직하게 상기 시티딘 및 유리딘 뉴클레오티드의 10 내지 35%는 변형되고 특히 바람직하게 상기 변형된 시티딘 뉴클레오티드의 함량은 7.5 내지 25%의 범위내에 있고 상기 변형된 유리딘 뉴클레오티드의 함량은 7.5 내지 25%의 범위내에 있다. 실제로, 변형된 시티딘 및 유리딘 뉴클레오티드 각각의 비교적 낮은 함량, 예를 들어 단지 10%는 목적하는 성질을 성취할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 변형된 시티딘 뉴클레오티드는 5-메틸시티딘 잔기이고 상기 변형된 유리딘 뉴클레오티드는 2-티오유리딘 잔기인 것이 특히 바람직하다. 가장 바람직하게, 상기 변형된 시티딘 뉴클레오티드의 함량 및 상기 변형된 유리딘 뉴클레오티드의 함량은 각각 25%이다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 mRNA는 오직 적합한 세포에서만 목적하는 mRNA의 활성을 허용하기 위해서 표적 결합 부위, 표적화 서열 및/또는 마이크로-RNA 결합 부위와 결합할 수 있다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 RNA는 3' 폴리A 꼬리의 하류에서 마이크로-RNA 또는 shRNA와 결합할 수 있다.
더욱 또한, "핵산(들)"이란 용어는 최신 기술로 공지된 DNA 또는 RNA 또는 그의 하이브리드 또는 그의 임의의 변형을 지칭할 수 있다(예를 들어 변형에 대해서 US 8278036, WO 2013/052523, WO 2011/012316, US 5525711, US 4711955, US 5792608 또는 EP 302175, Lorenz et al. 2004, Bioorg Med Chem Lett, 14, 4975-4977; Soutschek et al. 2004, Nature, 432, 173-178을 참조.). 상기와 같은 핵산(들)은 단일- 또는 이중-가닥, 선형 또는 환상, 천연 또는 합성이며, 어떠한 크기 제한도 없다. 예를 들어, 상기 핵산 분자(들)는 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 또는 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA, 안타고미르, 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), tRNA 또는 긴 이중-가닥 RNA 또는 상기와 같은 RNA를 암호화하는 DNA 구조물 또는 키메라플라스트(Colestrauss et al. 1996, Science, 273, 1386-1389), 또는 앱타머, 간헐적으로 반복되는 회문구조 염기 서열 집합체(RNA-유도 부위-특이적 DNA 절단을 위한 "크리스퍼")(Cong et al. 2013, Science, 339, 819-823), 또는 RNA 및 DNA일 수 있다. 상기 핵산 분자(들)는 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체, 바이러스 DNA 또는 RNA, 박테리오파지 DNA, 암호화 및 비-암호화 단일 가닥(mRNA) 또는 이중 가닥 RNA 및 올리고뉴클레오티드(들)의 형태로 존재할 수 있으며, 여기에서 상술한 바와 같은 당 주쇄 및/또는 염기에서의 최신식 변형 및 3'- 또는 5'-변형 중 어느 하나가 포함된다. 특히 바람직한 실시태양에서 상기 핵산은 RNA, 보다 바람직하게는 mRNA 또는 siRNA이다.
상기 핵산(들)은 표적 세포에서 발현시키고자 하는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수있다. 당해 분야의 숙련가들에게 주지된 방법을 사용하여 재조합 핵산 분자를 구성할 수 있다; 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y.] 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기재된 기법을 참조.
바람직한 실시태양에서, 상기 핵산은 상기에 나열된 모든 핵산 유형 및 변형 및 치료학적 또는 예방적 효과를 가질 수 있는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 것들을 포함한 치료학적으로 또는 약학적으로 활성인 핵산이다. 일반적으로, 치료학적 또는 예방적 효과를, 상기 핵산과 세포 분자 및 세포소기관과의 상호작용에 의해 성취할 수 있다. 상기와 같은 상호작용은 단독으로 예를 들어, 몇몇 CpG 올리고뉴클레오티드 및 톨-유사 및 다른 세포 외 또는 세포 내 수용체와 특이적으로 상호작용하도록 설계된 서열의 경우에서와 같이, 선천적인 면역계를 활성화시킬 수 있다. 더욱 또한, 세포 중 핵산의 흡수 또는 도입이, 핵산 중에 포함된 유전자와 같은 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하고자 의도되거나, 도입된 외인성 핵산의 세포내 존재의 결과로서 내인성 유전자 발현의 하향조절, 침묵화 또는 녹다운을 위해 의도되거나, 또는 내인성 핵산 서열의 변형, 예를 들어 내인성 핵산 서열의 선택된 염기 또는 전체 신장부의 회복, 절제, 삽입 또는 교환을 위해 의도되거나, 또는 도입된 외인성 핵산의 세포내 존재 및 상호작용의 결과로서 실질적으로 임의의 세포 과정을 방해하기 위해 의도될 수 있다. 도입된 외인성 핵산의 과발현이, 특히 내인성 유전자가 결함성이거나 침묵성이어서, 몇 가지 언급하자면, 낭성 섬유증, 혈우병 또는 근이영양증과 같은 다수의 대사 및 유전성 질병의 경우에서와 같이 유전자 발현의 존재하지 않거나, 불충분하거나, 결합성이거나 기능이상성인 생성물을 유도하는 경우에, 내인성 유전자 발현을 보상하거나 보완하고자 의도될 수 있다. 도입된 외인성 핵산의 과발현이 또한, 상기 발현 생성물이 임의의 내인성 세포 과정, 예를 들어 유전자 발현, 신호 전달 및 다른 세포 과정의 조절과 상호작용하거나 상기 과정을 방해하도록 의도될 수 있다. 도입된 외인성 핵산의 과발현이 또한, 형질감염되거나 형질도입된 세포가 존재하거나 또는 존재하게 만드는 유기체의 상황에서 면역 응답을 생성시키도록 의도될 수 있다. 예로는 백신화를 목적으로 세포가 항원을 제공하도록 하기 위한 항원-제공 세포, 예를 들어 수지상 세포의 유전자 변형이 있다. 다른 예는 종양-특이성 면역 응답을 이끌어내기 위한 종양에서의 사이토킨의 과발현이다. 더욱 또한, 도입된 외인성 핵산의 과발현이 또한, 세포 요법을 위해 생체내 또는 생체외에서 일시적으로 유전자 변형된 세포, 예를 들어 재생의학을 위해 변형된 T-세포 또는 전구체 또는 줄기 또는 다른 세포를 생성시키도록 의도될 수 있다.
치료학적 목적을 위한 내인성 유전자 발현의 하향조절, 침묵화 또는 녹다운은 예를 들어 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드, tRNA, 긴 이중 가닥 RNA에 의한 RNA 간섭(RNAi)에 의해 성취될 수 있으며, 이때 상기와 같은 하향조절은 서열-특이성이거나 비특이성일 수 있고 또한 긴 이중 가닥 RNA가 세포에 도입되는 경우와 같이 세포사를 유도할 수 있다. 내인성 또는 기존 유전자 발현의 하향조절, 침묵화 또는 녹다운은 바이러스 감염 및 암을 포함한 후천성, 유전성 또는 자발적으로 발생하는 질병의 치료에 유용할 수 있다. 세포내로의 핵산의 도입을, 예를 들어 바이러스 감염 또는 종양 형성의 예방을 위한 예방적 수단으로서 실행할 수 있음을 또한 고려할 수 있다. 내인성 유전자 발현의 하향조절, 침묵화 또는 녹다운을 전사 수준 및 번역 수준으로 실행할 수 있다. 다수의 기전들이 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들어 후성적 변형, 크로마틴 구조의 변화, 도입된 핵산에 의한 전사 인자들의 선택적 결합, 통상적이지 않은 염기 짝짓기 기전, 예를 들어 3중 나선 형성을 포함한 염기 짝짓기에 의한 게놈 DNA, mRNA 또는 다른 RNA 종들 중의 상보성 서열에의 도입된 핵산의 하이브리드화를 포함한다. 유사하게, 유전자 수복, 염기 또는 서열 변화를 엑손 스키핑을 포함하여 게놈 수준 및 mRNA 수준에서 성취할 수 있다. 염기 또는 서열 변화를 예를 들어 RNA-유도 부위-특이성 DNA 절단에 의해, 트랜스-이어맞추기, 트랜스-이어맞추기 리보자임, 키메라플라스트, 이어맞추기복합체-매개된 RNA 트랜스-이어맞추기를 이용하는 절단 및 페이스트 기전에 의해, 또는 그룹 II 또는 재표적화된 인트론의 이용에 의해, 또는 바이러스에 의해 매개되는 삽입적 변이도입을 이용하거나 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스 인티그라제 시스템을 사용하는 표적화된 게놈 삽입을 이용함으로써 성취할 수 있다. 핵산은 살아있는 시스템의 형성 플랜의 담체이며 다수의 세포 과정들에 직접적이고 간접적인 방식으로 참여하기 때문에, 이론적으로 외부로부터 세포 내로의 핵산의 도입에 의해 임의의 세포 과정이 영향을 받을 수 있다. 현저하게, 상기 도입을 생체내에서 및 세포 또는 기관 배양물에서의 생체외에서 직접 수행한 다음 상기와 같이 변형된 기관 또는 세포를 수용자에게 이식할 수 있다. 활성제로서 핵산을 갖는 본 발명의 복합체는 상술한 모든 목적에 유용할 수 있다.
조성물
상기에 개시한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA, 및 본 발명에 따른 공중합체를 포함한다.
본 발명은 또한 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA, 및 본 발명에 따른 공중합체로 이루어지는 조성물을 포함한다. 그러나, 상기 조성물은 추가의 성분, 예를 들어 상기 핵산의 세포에 및 세포내로의 전달 중 이펙터 기능을 발휘하는 성분 및/또는 지질 제형용 성분을 또한 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 핵산 및 본 발명에 따른 공중합체를 합한 중량은 상기 조성물의 전체 중량의 50 중량% 이상, 바람직하게는 70 중량% 이상을 차지한다.
본 발명에 따른 조성물은 일반적으로 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA와 상기 공중합체 및 임의의 추가적인 성분과의 회합을 제공하며, 이들은 유한 실체로 회합하고, 적용 중, 예를 들어 목적하는 경로의 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA 전달 중 생물학적 표적 또는 생물학적 표적의 주변에 도달할 때까지 상기 성분들의 상당 부분의 회합을 유지하기에 충분히 안정하다는 것이 이해될 것이다.
본 발명에 따른 공중합체 중의 양성자화 가능한 아미노 그룹의 존재로 인해, 상기 공중합체는 상기 공중합체가 양성자의 존재하에서, 예를 들어 수 또는 수성 용액 중에서, 또는 양성자 공여 산의 존재하에서 양이온, 전형적으로 다수의 양이온성 부분을 함유하는 올리고- 또는 다중양이온을 형성하도록, 화학식 a 및/또는 b의 반복 단위 중에 양전하를 포함할 수 있다. 따라서, 바람직하게, 본 발명에 따른 조성물은 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA, 및 양이온성 공중합체인 본 발명에 따른 공중합체의 복합체를 함유하거나 상기 복합체로 이루어진다. 양이온성 공중합체 및 음이온성 핵산은 상기와 같은 복합체 중에서 일반적으로 정전기적 상호작용을 통해 회합하는 것으로 이해될 것이다. 그러나, 수소 결합 및 공유 결합을 포함한 다른 인력에 의한 상호작용이 또한 상기 복합체의 안정화에 참여할 수 있다.
본 발명의 조성물에서, 상기 공중합체 및 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA는 전형적으로, 예를 들어 0.25/1 내지 50/1, 바람직하게는 0.5/1 내지 30/1, 보다 바람직하게는 1/1 내지 20/1의 중량 공중합체/중량 핵산(w/w) 비로 함유된다.
보다 바람직하게, 상기 조성물이 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA, 및 본 발명에 따른 양이온성 공중합체의 복합체를 함유하는 경우에, 본 발명의 조성물 중의 상기 공중합체 및 핵산의 상대적인 비를 상호 전하 중화도를 고려하여 선택할 수 있다. 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA에서, 상기 핵산과 양이온성 공중합체와의 복합체의 전달에서, 일반적으로 적어도 상기 핵산의 음전하의 전하 중화, 바람직하게는 상기 핵산의 음전하의 과잉-보상에 이르는 상기 양이온성 공중합체의 양을 주어진 양의 상기 핵산과 혼합한다.
양이온성 공중합체와 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA간에 적합한 비는 젤 지연 분석, 형광 소광법, 예를 들어 에티디움 브로마이드 치환/소광 분석, 입자 크기분류 및 제타 전위 측정에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 공중합체와 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA간의 유용한 비는 대개, 아가로스 젤에서 전기영동이 수행될 때 상기 양이온성 공중합체와의 복합체 중에 포함되는 핵산의 적어도 부분적인, 바람직하게는 완전한 지연에 의해, 핵산 중에 삽입시 에티디움 브로마이드, 리보그린(RiboGreen) 또는 요요(YOYO)와 같은 염료의 고도의 형광 소광에 의해, 또는 공중합체 및 핵산 혼합시 (나노)입자의 형성에 의해 특성화된다.
본 발명의 화학적으로 잘-한정된 양이온성 공중합체를 함유하는 조성물에 대해서, 상기 계산된 N/P 비는 상기 공중합체 및 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA의 상대적인 비를 선택하고 한정하기에 적합한 인자이다. 상기 N/P 비는 본 발명의 조성물 중의 핵산의 포스페이트 그룹에 대한 본 발명의 공중합체의 반복 단위 a 및 b 중의 양성자화 가능한 질소 원자의 몰비를 표시한다. 상기 N/P 비는 상기와 같은 핵산과 양이온성 비히클과의 복합체의 특성화를 위해 확립된 매개변수이다. 숙련된 독자는 이웃하는 반복 단위에 상기 반복 단위 a 및 b를 연결시키는 아미노 그룹 및 말단 아미노 그룹 중의 질소 원자가 양성자화 가능한 질소 원자로서 간주됨을 알 것이다. 다른 한편으로, 아미드 결합(본 발명의 공중합체 중에는 일반적으로 존재하지 않는) 중의 질소 원자는 양성자화 가능한 질소 원자로서 포함되지 않을 것이다. 본 발명의 양이온성 공중합체 및 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA를 함유하는 본 발명의 조성물에 대해서, 상기 N/P 비를 편의상 예를 들어 하기 식에 따라 계산할 수 있다:
Figure pct00022
상기에서, wp는 상기 공중합체의 중량(그램)이고, n은 반복 단위당 양성자화 가능한 아미노 그룹의 수이고, Mwp는 상기 공중합체 중에 함유된 반복 단위 a 및 b의 평균 분자량이고, wna는 핵산의 중량(그램)이고, Mbase는 상기 핵산 중 뉴클레오티드의 평균 분자량, 예를 들어 RNA의 경우에 346 g/mol이다.
구체적으로, 본 발명의 공중합체에 대해서, n은 1이다. Mwp를 예를 들어 NMR을 통해 측정된 상기 중합된 반복 단위들의 비, 및 그들 각각의 분자량을 근거로 계산할 수 있다. 예를 들어, 0.9/1.0의 a/b의 몰비로, 각각 42 g/mol(a2) 및 56 g/mol(b2)의 분자량을 갖는 중합된 단위 a2 및 b2를 함유하는 분지된 공중합체에서, Mwp를 하기와 같이 계산한다:
Figure pct00023
본 발명에 따른 핵산 전달을 위한, 본 발명에 따른 공중합체 및 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA로 이루어지는 본 발명에 따른 2원 복합체에서, 바람직하게는 최종 2원 조성물의 양의 제타 전위를 생성시키는 N/P 비를 제공하는, 상기 공중합체 대 핵산의 상대적인 양을 사용해야 한다. 본 발명과 관련하여, 본 발명의 2원 조성물에 대해서, 1 내지 100의 N/P 비가 바람직하며, 3 내지 60의 N/P 비가 보다 바람직하고, 4 내지 44의 N/P 비가 가장 바람직하다.
본 발명의 조성물은 다른 성분들, 특히 세포에 및 세포내로의 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA 전달 중 이펙터 기능을 발휘할 수 있는 성분들을 포함한다. 상기와 같은 성분은 비제한적으로 다중음이온, 지질,양이온성 펩티드를 포함한 본 발명의 공중합체 이외의 다중 양이온, 차폐 올리고머 또는 중합체, 폴록사머(또한 플루로닉으로서 공지됨), 폴록사민, 표적화 리간드, 엔도솜분해제, 세포 침투 및 신호 펩티드, 자기 및 비-자기 나노입자, RNAse 억제제, 형광 염료, 방사성 동위원소 또는 의료 영상화용 콘트라스트제일 수 있다. "이펙터 기능"이란 용어는 생물학적 표적 또는 생물학적 표적의 주변에서 또는 상기 중에서 상기 조성물의 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA의 의도된 생물학적 효과의 성취를 지지하는 임의의 기능을 포함한다. 예를 들어, 핵산 전달용 조성물을 충전 물질로서 비-암호화 핵산 또는 비-핵산 다중음이온을 포함하도록 제형화하였다(Kichler et al. 2005, J Gene Med, 7, 1459-1467). 상기와 같은 충전 물질은 상기와 같은 충전 물질의 부재하에서 더 높은 핵산 용량으로 획득된 효과의 범위 또는 정도를 유지하면서 의도하는 생물학적 효과를 갖는 핵산의 용량을 감소시키기에 적합하다. 비-핵산 다중음이온이 또한 감소된 독성으로 연장된 생체내 유전자 발현을 획득하는데 사용되었다(Uchida et al. 2011, J Control Release, 155, 296-302). 본 발명의 조성물은 또한 리포폴리플렉스에서의 경우와 같이 양이온성, 음이온성 또는 중성 지질을 포함할 수 있다(Li and Huang in "Nonviral Vectors for Gene Therapy", Academic Press 1999, Chapter 13, 295-303). 더욱 또한, 본 발명의 조성물은 본 발명의 공중합체 이외의 올리고- 또는 다중양이온을 포함할 수 있다. 상기와 같은 추가적인 올리고- 또는 다중양이온은 핵산의 목적하는 압축 정도를 성취하는데 유용하거나, 또는 다중양이온성 펩티드의 경우에 앞서 기재된 바와 같은 핵 국소화 신호 기능을 가질 수 있다(Ritter et al. 2003, J Mol Med, 81, 708-717). 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)과 같은 차폐 중합체를 또한 본 발명의 조성물 중에 포함시킬 수 있으며 이는 흔히 폴리플렉스 및 리포플렉스를 생물학적 환경에서 응집 및/또는 원치않는 상호작용(옵소닌화), 예를 들어 혈청 성분, 혈액 세포 또는 세포외 기질과의 상호작용에 대해 안정화시키는데 사용된다. 차폐는 또한 핵산-포함 조성물의 독성을 감소시키기에 적합할 수 있다(Finsinger et al. 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192). 차폐 중합체, 예를 들어 PEG를 본 발명의 공중합체에 직접 공유 결합시킬 수 있다. 상기 결합을, 예를 들어 말단 그룹 c, 또는 화학식 a1, b1 또는 b3의 반복 단위의 아미노 그룹에 대해 성취할 수 있다.
폴리비닐 유도체, 예를 들어 PVP 및 폴록사머는 근육내 주사시 형질감염을 증대시키는데 유용한 것으로 밝혀졌으며(Mumper et al. 1996, Pharm Res, 13, 701-709, Lemieux et al. 2000, Gene Ther, 7, 986-991) 따라서 본 발명의 조성물 중에 포함시키기에 유용할 수 있다.
핵산 전달을 위한 조성물 중에 포함되는 항체를 포함하는 표적화 리간드가 표적 세포의 우선적이고 개선된 형질감염에 유용하다(Philipp and Wagner in "Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy", 3rd Edition, Chapter 15. CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009). 표적화 리간드는 본 발명의 조성물에 직접적인 또는 간접적인 방식으로 표적 인식 및/또는 표적 결합 기능을 부여하는 임의의 화합물일 수 있다. 대부분의 일반적인 용어에서, 표적은 표적화 리간드가 분자 상호작용을 통해 특이적으로 결합할 수 있고 상기와 같은 결합이 최종적으로 표적 조직 중에 및/또는 표적 세포에 또는 상기 세포 중에 상기 조성물 중에 포함된 핵산의 우선적인 축적을 유도하는 특유의 생물학적 구조이다. PEG 쇄와 유사하게, 표적화 리간드를 예를 들어 말단 그룹 c, 또는 화학식 a1, b1 또는 b3의 반복 단위의 아미노 그룹에 결합시킬 수 있다.
더욱 또한, 엔도솜분해제, 예를 들어 엔도솜분해성 펩티드(Plank et al. 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35) 또는 엔도시토시스된 핵산의 엔도솜 방출을 증대시키기에 적합한 임의의 다른 화합물이 본 발명의 조성물의 유용한 성분이다. 유사하게, 세포 침투성 펩티드(또 다른 상황에서 또한 단백질 형질도입 도메인으로서 공지됨)(Lindgren et al. 2000, Trends Pharmacol Sci, 21, 99-103)가 핵산의 세포내 전달을 매개하기 위한 본 발명의 조성물의 유용한 성분일 수 있다. 소위 TAT 펩티드가 상기 부류내에 있으며 또한 핵 국소화 기능을 갖는다(Rudolph et al. 2003, J Biol Chem, 278, 11411-11418).
본 발명의 조성물 중에 포함될 수 있는 자기 나노입자는 자기력에 의한 전달의 물리적 표적화 및 핵산 전달 효율의 극적인 증대에 유용하다(또한 마그네토펙션(Magnetofection)으로서 공지된 기전)(EP1297169; Plank et al. 2011, Adv Drug Deliv Rev, 63, 1300-1331). 유사하게, 본 발명의 조성물은 또한 초음파 및 임의로 자기장 인가를 통한 핵산 전달의 물리적 증대 및 표적화에 사용되는 비-자기 또는 자기 미세기포일 수 있다(Holzbach et al. 2010, J Cell Mol Med, 14, 587-599, Vlaskou et al. 2010, Adv Funct Mater, 20, 3881-3894). 양자점(Zintchenko et al. 2009, Mol Ther, 17, 1849-1856), 방사능 추적자 및 의료 영상화용 콘트라스트제를 핵산 전달의 추적 및 핵산 전달용 조성물의 생체분포를 측정하기에 유리하게 사용할 수 있다. 요약하면, 핵산 전달에 대한 다수의 이펙터들이 기재되었으며 이들은 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA 및 본 발명에 따른 공중합체를 포함하는 조성물에 유용한 성분일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 중에 포함된 각 성분의 물질의 양에 관하여 큰 정도의 유연성이 존재함은 당해 분야의 숙련가들에게 주지되어 있다. 예를 들어, 소위 단일분자 2원 폴리플렉스가 플라스미드 DNA에 대해 기재되었으며, 이때 상기 조성물은 상기 다중양이온 및 플라스미드 DNA의 혼합시 형성되는 나노입자들로 이루어지며 이들은 정확하게 단일 플라스미드 DNA 분자를 포함하고 다수의 다중양이온 분자로서 전하 중화 또는 전하 과잉보상(음성에 대한 양성)이 요구된다(DeRouchey et al. 2006, J Phys Chem B. 110(10):4548-54). 종종 형질감염에 사용되는 N/P 비에서의 복합체인 PEI-DNA의 경우에, 형광 보정 분광학에 의해 상기 복합체가 평균 3.5(+/- 1)개의 DNA 플라스미드 분자 및 30개의 PEI 분자를 함유하는 반면 상기 복합체의 제조에 사용되는 PEI 분자의 약 86%는 유리 형태로 존재함이 밝혀졌다(Clamme et al. 2003, Biophys J 84,1960-1968). 다른 극단적인 경우에, 추정상 다수(수십 내지 수백)의 성분 분자를 포함하는 PEI 및 플라스미드 DNA의 응집된 복합체는 작은 별개의 PEI-DNA 나노입자보다 형질감염에서 더 양호하게 수행되는 것으로 밝혀졌다(Ogris et al. 1998, Gene Ther, 5, 1425-1433; Ogris et al. 2001, AAPS PharmSci, 3, E21). 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 입자, 특히 몇몇 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA 분자를 포함하는 나노입자일 수 있으나, 또한 거시적 물체, 예를 들어 막대한 수의 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA 분자를 포함하는 침전물 또는 건조 분말일 수 있다. 요약하면, 본 발명의 조성물은 자기-조립 전 성분들의 투입비를 특징으로 한다. 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA 성분에 비해 개별적인 성분의 전형적인 투입 w/w 비는 1 내지 50이다. 상기 N/P 비는 본 발명의 공중합체가 화학적으로 잘 한정되는 경우 상기 공중합체 및 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA를 함유하는 2원 조성물에 대한 투입비의 적합한 척도이다. 상기에 나타낸 바와 같이, 1 내지 100의 N/P 비의 값이 바람직하고, 3 내지 60의 N/P 비가 보다 바람직하며, 4 내지 44의 N/P 비가 가장 바람직하다.
본 발명의 조성물이 추가의 성분들을 포함하는 경우, N/P 비의 할당은 모호해질 수 있다. 이 경우에, 적합한 투입비는 비제한적으로 젤 지연 분석, 형광 소광 분석, 예를 들어 에티디움 브로마이드 치환/소광 분석을 포함한 실험에 의해, 입자 크기분류 및 제타 전위 측정에 의해 및 기능성 분석, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 형질감염 분석에 의해 측정된다. 추가적인 다중음이온 또는 차폐 중합체를 포함하는 3원 복합체에서, 순 전하비(음성에 대한 양성)는 1 미만일 수 있으며 제타 전위는 중성 또는 음성일 수 있다.
본 발명의 조성물을 하기에 기재하는 바와 같이 생성시킬 수 있다. 전형적으로, 음전하를 갖는 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA 및 바람직하게는 양이온성 형태인 본 발명의 공중합체는 특히 적합한 용매 중에서 접촉시킬 때 자기-조립할 수 있다. 상기 자기-조립 과정 후 본 발명의 조성물을 임의의 통합되지 않은 성분들로부터 분리시킬 수 있으며 같은 단계에서 현탁 매질을 원심분리 또는 한외여과 또는 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석 또는 임의의 관련 방법에 의해 대체시킬 수 있다. 정제되거나 정제되지 않은, 본 발명 조성물의 성분들의 화학량론을 다양한 분석 방법들, 예를 들어 분광학적 방법, 예를 들어 UV/VIS 분광분석법 또는 형광 보정 분광학(DeRouchey et al. 2006, J Phys Chem B. 110(10):4548-54)에 의해, 개별적인 성분들의 직교 형광 또는 방사성 동위원소 표지화에 의해, NMR 및 IR 분광학 또는 크로마토그래피 분석 및 상기 조성물 분해시 정량분석에 의해 측정할 수 있다. 분해는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 헤파린과 같은 과잉의 다중음이온의 첨가 또는 나트륨 도데실설페이트의 첨가에 의해 성취될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물의 생성 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 공중합체를 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성시키고 정제할 수 있다. 상기 공중합체를 수성 용액 또는 건조된 형태, 예를 들어 건조된 분말(이 경우 상기를 상기 조성물의 생성 전에 수성 매질, 바람직하게는 물에 재용해시킬 수 있다)로 보관할 수 있다. 상기 용액의 pH를 필요한 경우 산, 바람직하게는 염산 또는 시트르산으로 중성 또는 약간 산성(pH 4.5 이하)으로 조정한다. 상기 조성물 중에 포함되는 핵산인 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA의 경우에, 상기 pH를 약 4.5 내지 5.5, 바람직하게는 약 4.9 내지 5.1, 보다 바람직하게는 약 5.0으로 조절하는 것이 바람직하다. 핵산을 당해 분야의 숙련가에게 주지된 최신 기술 수준에 따라 생성시키고 정제한다. 상기 핵산을 수성 매질, 바람직하게는 수 중의 용액으로서 제공한다. 임의로, 상기 공중합체 또는 핵산으로서 상기 RNA 또는 둘 다를 이펙터 분자, 예를 들어 표적화 리간드, 신호 펩티드, 세포 침투 펩티드, 엔도솜분해 물질 또는 차폐 중합체와 화학적으로 연결시킨다. 그러나, 상기 이펙터 분자의 화학적 성질에 따라, 상기 분자를 화학 결합에 의해 부착시킬 필요가 없고 오히려 상기 조성물의 다른 성분들 중 어느 하나와의 비-공유 결합, 즉 정전기적, 소수성 또는 반데르 발스 상호작용에 기반한 자기-조립에 의해 본 발명의 조성물 중에 통합시킬 수 있다. 이를 위해서, 이온 강도, 대이온의 유형, pH 또는 개별적인 성분 용액의 유기 용매 함량을 조절하는 것이 유리할 수 있다.
상술한 혼합 과정에 대한 대안으로서, 상기 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA, 및 공중합체 성분을 예를 들어 문헌[Hirota et al. (Hirota et al. 1999, Biotechniques, 27, 286-290)] 또는 문헌[Kasper et al. (Kasper et al. 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185)]에 기재된 바와 같은 미세-혼합용 자동 장치로 또는 문헌[Xuan et al. (Xuan et al. 2010, Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16)]에 재고찰된 바와 같은 미세유동적 초점화에 의해 혼합할 수 있다.
이어서 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA를 포함하는 본 발명의 조성물을 상기 성분들의 용액의 혼합시 자기-조립에 의해 제조할 수 있다. 자기-조립은 피펫팅 및 진탕/와동을 사용하는 수동 혼합에 의해, 또는 예를 들어 문헌[Hirota et al. (Hirota et al. 1999, Biotechniques, 27, 286-290)] 또는 문헌[Kasper et al. (Kasper et al. 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185)]에 기재된 바와 같은 미세-혼합용 자동 장치를 사용하거나 또는 문헌[Xuan et al. (Xuan et al. 2010, Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16)]에 재고찰된 바와 같은 미세유동적 초점화에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물이 상기 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA, 및 본 발명의 공중합체 외에 추가의 성분들을 포함하는 경우에, 연속적인 혼합이 필요할 수 있다. 이 경우에, 상기 공중합체 및 상기 핵산의 자기-조립 후에 임의의 추가의 성분을 가하거나, 또는 혼합 전에 상기 중 어느 하나에 상기 성분을 가할 수 있다. 혼합 단계들의 가장 적합한 순서는 추가적인 성분들의 화학적 성질에 따라 변할 것이다. 예를 들어, 상기 추가적인 성분이 음으로 하전된 경우, 상기 성분을 상기 공중합체와의 혼합 전에 상기 핵산 성분에 또는 상기 공중합체 및 상기 핵산의 예비-형성된 복합체에(이때 본 발명의 공중합체는 상기 핵산 및 음이온성의 추가적인 성분의 음전하의 합에 대한 양전하의 비에 관하여 과잉으로 존재한다) 가하는 것이 가장 적합할 수 있다. 이와 역으로, 상기 추가적인 성분이 양이온성인 경우, 상기 성분을 상기 핵산과의 혼합 전에 본 발명의 공중합체에 가하는 것이 가장 적합할 수 있다. 또는, 상기를 상기 핵산의 음전하를 부분적으로 중화시키는 화학량론으로 사용한 다음 본 발명의 공중합체의 용액과 혼합할 수도 있다. 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA 포함 마그네토펙션용 복합체의 경우에, 염-유발된 콜로이드 응집이 핵산, 다중양이온 또는 양이온성 지질 및 자기 입자를 포함하는 조성물의 제조에 적합한 수단인 것으로 나타났다(EP1297169). 양이온성 올리고뉴클레오티드 성분인 상기 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA의 특별한 경우에, 다중음이온을 사용하여 본 발명의 공중합체를 상기 핵산과 자기-조립시킬 수 있다. 이 경우에, 본 발명의 공중합체를 상기 양이온성 올리고뉴클레오티드와 혼합한 다음 상기 다중음이온과 혼합한다. 본 발명의 조성물을 수득하기 위해 다수의 제형화 옵션을 이용할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 쉽게 자명할 것이다. 개별적인 성분들의 농도는 본 발명의 조성물의 의도된 용도에 따라 선택된다. 적합한 매개변수는 상기 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA 성분의 최종 농도, 및 상술한 바와 같은 성분들의 비이다. 세포 배양시 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA 전달의 경우, 1 내지 100 ㎍/㎖의 최종 핵산 농도가 일반적으로 바람직하다. 생체내 용도를 위해서, 유용한 예시적인 최종 핵산 농도는 5 ㎎/㎖ 이하일 수 있다.
본 발명의 조성물을 수성 현탁액 중에서 보관하거나 또는 건조시킬 수 있다. 따라서, 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 조성물을 건조한 형태로, 임의로 동결-건조된 형태로 보관한다. 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 건조되거나 동결건조된 복합체 또는 조성물은 또한 동결건조보호제를 포함한다. 동결건조보호제는 (동결-)건조된 물질을 보호하는 분자이다. 상기와 같은 분자는 전형적으로 다가 화합물, 예를 들어 당(모노-, 디- 및 폴리사카라이드), 다가알콜 및 이들의 유도체이다. 트레할로스 및 슈크로스가 건조 공정에 대한 천연 보호제인 것으로 공지되어 있다. 트레할로스는 가뭄 기간(탈수가사상태로서 또한 공지됨) 동안 가사상태로 있는 다양한 식물, 진균 및 무척추동물에 의해 생성된다. 당, 예를 들어 트레할로스, 락토오스, 라피노스, 슈크로스, 만노스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트린, 우레아, 말토덱스트린, 프럭탄, 말토올리고사카라이드, 만노-올리고사카라이드, 사이클로이눌로헥사오스, 하이드록시에틸 전분, 덱스트란, 이눌린, 폴리비닐피롤리돈 또는 아미노산, 예를 들어 트립토판, 글리신 및 페닐알라닌이 본 발명의 범위에서 특히 적합한 동결건조보호제이다. 가장 바람직하게는 트레할로스가 상기 상황에 사용된다.
약학적 태양
추가의 태양에서, 본 발명은 조직에 또는 표적 세포내로의 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA의 전달을 위한 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 공중합체의 용도에 관한 것이다. "세포에 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA를 전달한다"란 용어는 바람직하게는 세포내로의 상기 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA의 전달을 의미한다. 상기 용도는 생체내 또는 시험관내에서 있을 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물을 표적 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 표적 세포 또는 조직에의 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA의 전달 방법에 관한 것이다. 상기와 같은 방법은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 상기 접촉시킴은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 수단 및 방법에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법을 시험관내에서 수행하는 경우, 상기 접촉시킴을, 배양 배지에서 상기 조성물의 존재하에서 상기 세포를 배양하거나 또는 상기 세포에 상기 조성물을 가함으로써 성취할 수 있다. 상기 방법을 생체내에서 수행하는 경우, 상기 세포 또는 조직과 접촉시킴을, 예를 들어 당해 분야의 숙련가에게 공지된 투여 경로에 의해, 특히 유전요법 분야에 통상적으로 사용되는 임의의 투여 경로에 의해 개인에게 상기 조성물을 투여함으로써 성취할 수 있다. 상기 조성물을 제형화하고 상기 조성물을 개인에게 투여하는 가능한 방식을 또한 하기에 추가로 기재한다.
"생체내"란 용어는 살아있는 유기체의 신체에 대해 수행되는 임의의 적용을 지칭하며, 여기에서 상기 유기체는 바람직하게는 다세포, 보다 바람직하게는 포유동물 및 가장 바람직하게는 인간이다. "시험관내"란 용어는 단리된 살아있는 유기체의 신체 부분 및 상기 유기체의 밖, 예를 들어 세포, 조직 및 기관의 외부에 대해 수행되는 임의의 적용을 지칭하며, 여기에서 상기 유기체는 바람직하게는 다세포, 보다 바람직하게는 포유동물 및 가장 바람직하게는 인간이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 조성물을 약학 조성물 자체로서 사용될 수 있음을 알 것이다. "약학 조성물"이란 용어는 피실험자에게 투여될 수 있는 본 발명의 조성물의 약학적으로 허용 가능한 형태를 지칭한다. 상기 약학 조성물은 치료법(예방학 포함)에 의해 인간 또는 동물 신체의 치료에 사용하기에 적합하다.
"약학적으로 허용 가능한 형태"란 용어는 상기 조성물이 약학 조성물로서 제형화됨을 의미하며, 여기에서 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학 담체의 예는 당해 분야에 주지되어 있으며 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 유화액, 예를 들어 오일/수 유화액, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 상기와 같은 담체를 포함하는 조성물을 주지된 통상적인 방법에 의해 제형화할 수 있다. 이들 약학 조성물을 상기 피실험자에게 적합한 용량으로 투여할 수 있다. 상기 투여 섭생은 주치의 및 임상적 인자들에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에 주지된 바와 같이, 임의의 하나의 피실험자에 대한 투여량은 다수의 인자들, 예를 들어 상기 피실험자의 크기, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동반 투여되는 다른 약물에 따라 변한다. 전형적인 활성 물질 용량은, 예를 들어 1 ng 내지 수 그램의 범위일 수 있다. 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA, 치료법에 적용되는, 발현 또는 발현의 억제를 위한 핵산의 투여량은 상기 범위에 상응해야 하나; 상기 예시적인 범위의 위 또는 아래 용량이, 특히 상기 언급한 인자들을 고려하여 고려된다. 일반적으로, 상기 약학 조성물의 규칙적인 투여로서 섭생은 하루에 체중 킬로그램당 0.1 ㎍ 내지 10 ㎎ 단위의 범위이어야 한다. 상기 섭생이 연속적인 주입인 경우, 상기는 또한 각각 체중 킬로그램당 1 ㎍ 내지 10 ㎎ 단위의 범위이어야 한다. 진행을 주기적인 평가에 의해 모니터할 수 있다. 투여량은 다양할 것이나, 본 발명의 조성물의 구성성분으로서 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA의 정맥내 투여에 바람직한 투여량은 상기 핵산 분자의 대략 106 내지 1019 사본이다.
상기 "투여된"이란 용어는 상기 조성물의 피실험자의 신체 내로의 도입에 적합한 임의의 방법을 포함한다. 적합한 조성물의 투여를 상이한 방식으로, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 경피, 척추강내, 근육내, 국소, 피내, 비내, 흡입에 의한 폐 또는 기관지내 또는 경구 또는 직장 투여에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 조성물을 특히 문헌[Shea et al. (Shea et al. 1999, Nat Biotechnol, 17, 551-554)] 및 EP1198489에 기재된 바와 같은 유전자-활성화된 기질로서 투여할 수 있다.
원칙적으로, 본 발명의 약학 조성물을 국소 또는 전신 투여할 수 있다. 투여는 바람직하게는 비경구에 의해, 예를 들어 정맥내일 것이나, 다른 투여 방식들도 본 발명의 범위내에 있다. 예를 들어 혈관 중 부위로의 카테터에 의한, 표적 부위로의 직접적인 투여가 또한 고려될 수 있다. 투여는 예를 들어 표적 부위, 예를 들어 종양내로의 직접 주사에 의해 또한 발생할 수 있다. 에어로졸 또는 분무 또는 경구 투여에 의한 투여가 또한 본 발명의 범위내에 있다. 비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 유화액을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 플루오로카본, 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일, 및 주사성 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트이다. 수성 담체는 물, 알콜/수성 용액, 유화액 또는 현탁액(염수 및 완충 매질 포함)을 포함한다. 비경구용 비히클은 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화 나트륨, 유산화 링거, 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유동 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예를 들어 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것들) 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제들, 예를 들어 항균제, 산화방지제, 킬레이트제, 및 불활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다. 더욱 또한, 상기 약학 조성물은 상기 약학 조성물의 의도된 용도에 따라 추가적인 작용제, 예를 들어 인터류킨 또는 인터페론을 포함할 수도 있다.
또 다른 실시태양에서 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을, 상기 조성물 중에 함유된 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA가 예방적 또는 치료학적 효과를 야기하도록 환자에게 투여함을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다. 특히, "환자"란 용어는 동물 및 인간을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물을 투여함으로써, 질병을 치료하거나 예방할 수 있다. "질병"이란 용어는 본 발명의 실시태양을 사용함으로써 치료되거나, 예방되거나 백신화될 수 있는 임의의 인지 가능한 병적인 상태를 지칭한다. 상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 상기 질병은 유전되거나, 후천적이거나, 감염성 또는 비-감염성이거나, 연령-관련되거나, 심혈관, 대사, 장, 신생물(특히 암) 또는 유전성일 수있다. 질병은 예를 들어 생리학적 과정, 분자 과정, 유기체내 생화학적 반응(이는 차례로 예를 들어 유기체의 유전자 장비에 기반할 수 있다), 행동, 사회 환경적 인자, 예를 들어 화학물질 또는 방사선에의 노출에 근거할 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물은 특허 출원 WO2011/012316에 개시된 바와 같이 치료에 사용된다.
상술한 치료 방법과 일치하도록, 본 발명은 또 다른 실시태양에서 질병에 의해 병든 환자의 신체내 조직 또는 기관에 본 발명의 조성물 중에 함유된 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 예를 들어 mRNA를 제공함으로써 치료될 수 있는 질병의 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가의 예시를 위해서, 본 발명의 바람직한 태양들을 하기 태양에서 요약하며, 이들 태양은 선행하는 일반적인 개시의 부분을 형성하고, 상기 중에 개시된 바람직한 실시태양들을 또한 적용한다.
1. 하기 화학식 a1 및 a2의 반복 단위 중에서 독립적으로 선택된 다수의 반복 단위 a, 및 하기의 화학식 b1 내지 b4의 반복 단위 중에서 독립적으로 선택된 다수의 반복 단위 b를 포함하는 통계 공중합체:
화학식 a1
Figure pct00024
화학식 a2
Figure pct00025
화학식 b1
Figure pct00026
화학식 b2
Figure pct00027
화학식 b3
Figure pct00028
화학식 b4
Figure pct00029
상기 식들에서,
상기 반복 단위 a의 합 대 반복 단위 b의 합의 몰비는 0.7/1.0 내지 1.0/0.7의 범위 내에 있고,
상기 공중합체 중에 함유된 반복 단위 a 및/또는 b의 질소 원자들 중 하나 이상은 양성자화되어 양이온성 공중합체를 제공할 수 있다.
2. 태양 1의 공중합체로, 반복 단위 a2, b2 및 b4 중에서 선택된 반복 단위들 중 하나 이상의 유형을 포함하는 분지된 또는 수지상 공중합체인 공중합체.
3. 태양 1의 공중합체로, 반복 단위 a1 및 b1을 포함하는 선형 공중합체인 공중합체.
4. 태양 1 내지 3 중 어느 하나에서, 반복 단위 a 및 b가 공중합체 중의 모든 반복 단위의 80 몰% 이상을 차지하는 공중합체.
5. 태양 1 내지 3 중 어느 하나에서, 공중합체 중의 반복 단위가 모두 반복 단위 a 및 b인 공중합체.
6. 태양 1 내지 3 중 어느 하나에서, a1 및 a2 중에서 선택된 반복 단위 a 및 b1 및 b2 중에서 선택된 반복 단위 b가 공중합체 중의 모든 반복 단위의 80 몰% 이상을 차지하는 공중합체.
7. 태양 1 내지 3 중 어느 하나에서, 공중합체 중의 반복 단위가 모두 a1 및 a2 중에서 선택된 반복 단위 a 및 b1 및 b2 중에서 선택된 반복 단위 b인 공중합체.
8. 태양 1 내지 7 중 어느 하나의 공중합체로, 무작위 공중합체인 공중합체.
9. 태양 1 내지 8 중 어느 하나에서, 반복 단위 a 및 반복 단위 b의 총수가 20 이상, 바람직하게는 50 이상 및 보다 바람직하게는 100 이상인 공중합체.
10. 태양 1 내지 9 중 어느 하나에서, 반복 단위 a 및 반복 단위 b의 총수가 5,000 이하, 바람직하게는 2,500 이하, 및 보다 바람직하게는 1,000 이하인 공중합체.
11. 태양 1 내지 10 중 어느 하나의 공중합체로, 2,000 내지 250,000 Da, 바람직하게는 5,000 내지 50,000 Da 범위의 중량 평균 분자량을 갖는 공중합체.
12. 태양 1 내지 11 중 어느 하나에서, 공중합체의 말단 그룹이 하기 화학식 c1 내지 c3의 그룹 중에서 독립적으로 선택된 그룹 c의 하나 이상의 유형을 포함하는 공중합체:
화학식 c1
Figure pct00030
화학식 c2
Figure pct00031
화학식 c3
Figure pct00032
13. 태양 12에서, 공중합체의 말단 그룹이 화학식 c1 및 c2의 그룹 중에서 독립적으로 선택된 그룹 c 중 하나 이상의 유형을 포함하는 공중합체.
14. 태양 1 내지 13 중 어느 하나에서, 반복 단위 a 대 반복 단위 b의 몰비가 0.8/1.0 내지 1.0/0.8의 범위내에 있는 공중합체.
15. 태양 1 내지 14 중 어느 하나의 공중합체로, 양이온성 공중합체인 공중합체.
16. 태양 1 내지 15 중 어느 하나의 공중합체로, 아지리딘, 아제티딘 및 임의로 피롤리딘을 포함하는 단량체 혼합물을 중합시킴으로써 수득될 수 있는 공중합체.
17. 핵산 및 태양 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 공중합체를 포함하는 조성물.
18. 태양 17에서, 핵산이 RNA인 조성물.
19. 태양 17에서, 핵산이 단일 가닥 RNA인 조성물.
20. 태양 17에서, 핵산이 mRNA, 바람직하게는 변형된 mRNA인 조성물.
21. 태양 17 내지 20 중 어느 하나에서, 공중합체가 양이온성 공중합체이고, 상기 양이온성 공중합체가 핵산과 복합체를 형성하는 조성물.
22. 태양 1 내지 21 중 어느 하나의 조성물로, 동결건조된 형태인 조성물.
23. 태양 22에서, 동결건조보호제를 또한 포함하는 조성물.
24. 태양 23에서, 동결건조보호제가 트레할로스인 조성물.
25. 태양 1 내지 22 중 어느 하나의 조성물로, 약학 조성물인 조성물.
26. 태양 17 내지 25 중 어느 하나의 조성물 및 임의로 추가의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
27. 핵산을 세포내로 전달하기 위한 태양 1 내지 16 중 어느 하나의 공중합체의 용도.
28. 핵산을 세포내로 전달하기 위한 태양 17 내지 26 중 어느 하나의 조성물 또는 약학 조성물의 용도.
29. 태양 27 또는 28에서, 핵산이 RNA인 용도.
30. 태양 27 또는 28에서, 핵산이 단일 가닥 RNA인 용도.
31. 태양 27 또는 28에서, 핵산이 mRNA, 바람직하게는 변형된 mRNA인 용도.
32. 태양 17 내지 26 중 어느 하나의 조성물 또는 약학 조성물을 표적 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 표적 세포 또는 조직에 핵산을 전달하기 위한 방법.
33. 아지리딘, 아제티딘 및 임의로 피롤리딘을 포함하는 단량체 혼합물을 중합시키는 단계를 포함하는, 태양 1 내지 15 중 어느 하나의 공중합체의 생성 방법.
실시예
실시예 1
물질:
화학적으로 변형된 Luc mRNA의 생성
시험관내-전사(IVT)를 위한 주형을 생성시키기 위해서 플라스미드 pVAXA120-Luc를 Notl에 의한 제한 절단에 의해 선형화하였다. 주형을 클로로포름-에탄올-침전에 의해 추가로 정제하였다. 주형의 품질을 고유 아가로스젤 전기영동에 의해 측정하였다. IVT를 리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 T7 RNA 폴리머라제를 함유하는 표준 IVT 믹스로 수행하였다. 변형을 25%의 5-메틸-시티딘-5'-트리포스페이트 및 25%의 2-티오-유리딘-5'-트리포스페이트를 사용하여 도입시켰다. 우두 바이러스 캡핑 효소, rGTP 및 메틸 공여체로서 S-아데노실 메티오닌(SAM)을 사용하여 캡핑을 수행하여 상기 mRNA의 5' 말단에 7-메틸구아닐레이트 캡-0 구조(m7GpppG)를 가하였다. mRNA의 정제를 암모늄 아세테이트 침전에 의해 수행하였다. 변형된 Luc RNA를 아쿠아 애드 인젝터빌리아(aqua ad injectabilia)에 재현탁시키고 품질 조절을 UV-측정, 고유 아가로스 젤 전기영동 및 NIH3T3 세포에서의 형질감염을 사용하여 수행하였다.
중합체 반복 단위의 중합체 및 평균 분자량:
중합체를 1:0, 0.8:1 및 0:1의 단량체들의 몰비(E:P)로 아지리딘(E), 아제티딘(P) 또는 아지리딘(E) 및 아제티딘(P)의 화학량론적 혼합물로부터 합성하였다. 아지리딘 및 아제티딘을 수중 상기 단량체들의 용액(단량체(들)의 총 농도: 50% w/w)으로부터 출발하여 단독 중합 및 공중합시켰다. 중합을 0.001 당량의 황산으로 130 ℃에서 20 내지 70시간 동안 수행하였다. 각각 1:0 및 0:1의 E:P 비를 갖는 단독중합체를 비교 목적으로 생성시켰다.
이와 같은 방식으로, 상기 단량체들의 화학량론을 반영하는 에틸아민(-CH2-CH2-N<; "E"; 분자량 42 g/mol) 및 프로필아민(-CH2-CH2-CH2-N<; 분자량 56 g/mol) 반복 단위의 무작위 분지된 공중합체를 제조하였다. 상기 중합된 단위의 평균 분자량을 하기 식에 따라 계산하였다:
Figure pct00033
이는 하기의 결과를 생성시킨다:
Figure pct00034
모액:
중합체 모액: 아쿠아 애드 인젝터빌리아 중의 0.5 ㎎/㎖
mRNA 모액: 아쿠아 애드 인젝터빌리아 중의 0.05 ㎎/㎖ 모액
N/P 비 및 중합체와의 mRNA 복합체의 제조
상기 N/P 비는 중합체-mRNA 복합체의 제조에 사용되는, 주어진 양의 중합체 중의 질소 대 주어진 양의 mRNA 중의 포스페이트의 투입 몰비를 반영한다. mRNA 중의 리보뉴클레오티드 모노포스페이트의 평균 분자량은 346 g/mol이다. 따라서, 목적하는 N/P 비에서 mRNA의 주어진 중량(wRNA)에 필요한 주어진 농도(cpolymer)의 중합체 모액의 부피(vpolymer)는 하기와 같다:
Figure pct00035
상응하게, 하기 표에서 주어진 중합체 모액의 부피를 주어진 부피의 아쿠아 애드 인젝터빌리아로, 96-웰 플레이트의 각각 A 및 E 열의 개별적인 웰에서 25 ㎕로 희석하였다.
Figure pct00036
후속으로, 25 ㎕의 mRNA 모액(1.25 ㎍ mRNA에 상응함)을 상기 중합체 용액에 가하여 목적하는 N/P 비를 제공하였다. 각각 B 내지 D 및 F 내지 H 열의 웰에 25 ㎕의 아쿠아 애드 인젝터빌리아를 각각 제공하였다. 30분 배양 후에, 각각 A 또는 E 열 중의 복합체 25 ㎕를 다채널 피펫터를 사용하여 각각 B 또는 F 열로 옮기고, 혼합하였다. 후속으로, 25 ㎕를 각각 B열에서 C열로, 또는 F열에서 G열로 옮기고, 혼합하고 각각 C에서 D로 또는 G에서 H로 옮겼다.
세포, 형질감염 및 루시페라제 분석
HEK293 세포(DSMZ ACC305, Lot21)를 DMEM, MEM, MEM(각각 10% FBS + 1% P/S 포함)에서 배양하였다. 형질감염 24시간 전에, 상기 세포를 96-웰 플레이트 중의 100 ㎕의 세포 배양 배지 중에 5,000 세포의 밀도로 시딩하였다.
20 ㎕의 각각의 상기 중합체-mRNA 복합체 연속 희석물을, 웰당 125/62.5 ng mRNA에 상응하게 상기 세포로 옮겼다. 24시간 배양 후에, 상기 세포 배양 상등액을 제거하고, 상기 세포를 PBS로 세척하고 이어서 100 ㎕의 용해 완충제(25 mM 트리스 HCl, 0.1% 트리톤X100, pH 7.8)를 제공하였다.
루시페라제 분석: 80 ㎕의 상기 용해물을 백색 96-웰 플레이트의 웰에 충전하고 왈락 빅터(Wallac Victor)2(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))에서 루시페라제 활성 측정을 위해 사용하였다. 상기 목적을 위해서 100 ㎕의 루시페라제 분석 시약(0.5 mM D-루시페린, 0.3 mM 코엔자임 A, 33 mM DTT, 0.5 mM ATP, 1 mM 마그네슘 카보네이트, 2.7 mM 마그네슘 설페이트, 0.1 mM EDTA, 20 mM 트리신)을 가하고 화학발광을 측정하였다. 실험을 3회 중복 수행하였다.
결과:
상기 실험은 공중합체와 복합체를 형성한 화학적으로 변형된 Luc mRNA(0.8/1)가 분지된 PEI(1/0) 또는 PPI(0/1)와 복합체를 형성한 경우보다 세포의 형질감염 후에 보다 효율적으로 발현됨을 나타낸다(도 1). 이는 함께 본 발명의 목적이 본 발명에 따른 방법 및 약학 제제에 의해 적합하게 다루어질 수 있음을 나타낸다.
실시예 2
돼지의 폐에 대한, 공중합체와 제형화된 개똥벌레 루시페라제(Luc)를 암호화하는 화학적으로 변형된 mRNA의 생체내 에어로졸 적용
화학물질
상기 실시예 1을 참조.
화학적으로 변형된 Luc mRNA의 생성
상기 실시예 1을 참조.
실험 과정
아자페론 2 ㎎/㎏ 체중, 케타민 15 ㎎/㎏ 체중, 아트로핀 0.1 ㎎/㎏ 체중의 예비투약에 의해 돼지의 진정을 개시한 다음 측부 귓바퀴 정맥에 정맥 라인을 삽입하였다. 상기 돼지를 필요에 따라 프로포폴 3 내지 5 ㎎/㎏ 체중의 정맥내 주사에 의해 마취시켰다. 필요에 따라 1% 프로포폴의 연속적인 정맥내 주입에 의해 마취를 유지시켰다. 환기 매개변수를 호기종말성 이산화탄소에 합치시키고 필요에 따라 조절하였다. 마취, 호흡 및 심혈관 매개변수를 맥박산소측정법, 카프노그래피, 직장 온도 탐침 및 반사반응 상태를 사용하여 연속적으로 모니터하였다. 상기 돼지에게 균형잡힌 전해질 용액을 10 ㎖/㎏/h로 주입하였다. 상기 마취의 지속기간은 대략 80 내지 120분이었다. 상기 돼지를 에어로졸 적용(에어로넵(Aeroneb) 메쉬 분무기) 완료 후 진정 후에 측부 귀 정맥을 통해 펜토바르비탈 100 ㎎/㎏을 일시주사하여 죽였다. 폐를 절제하고 슬라이스된 대략 1 ㎝ 두께의 조직 시편을 다양한 폐 영역으로부터 수집한 다음 배양기 중의 세포 배양 배지에서 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다(5% 이산화 탄소). 루시페라제 활성의 측정을 위해서 조직 시편을 PBS 중의 D-루시페린 기질(100 ㎍/㎖)을 포함하는 배지 욕에서 37 ℃에서 30분 동안 배양하고 생체외 루시페라제 생물발광 영상화(IVIS 100, 제노젠(Xenogen), 미국 알라메다 소재)를 수행하였다.
공중합체-mRNA 폴리플렉스의 제조
폴리플렉스를 2 채널 주사기 펌프(KDS-210-CE, KD 사이언티픽)를 사용하여 형성시켰다. mRNA 및 공중합체(0.8/1, 1/0, 0/1 또는 PEI 25 kDa)를 각각 12.0 ㎖의 2차 증류수에서 희석하여 500 ㎍/㎖ mRNA의 농도(10의 N/P 비에 상응하는 공중합체 또는 분지된 PEI 25 kDa의 농도)를 생성시켰다. 상기 두 용액을 모두 5 ㎖/분의 속도로 주사기 펌프의 회수 기능을 사용하여 별도의 20 ㎖ 주사기에 충전하였다. 상기 두 샘플을 모두 혼합하기 위해서 상기 2개의 주사기를 튜빙(세이프플로우 익스텐션 세트(Safeflow Extension Set), B.Braun)을 통해 t-피스에 연결하였다. 혼합을 40 ㎖/분의 속도로 상기 주사기 펌프의 주입 기능을 사용하여 수행하였다. 상기 복합체를 사용 전에 주변 온도에서 30분 동안 배양하였다. 본 발명의 과정 내에서 복합체 형성을 위한 어떠한 완충제도 없이 오직 물만 사용하는 것(그렇지 않으면 나노입자들이 마우스 폐에서 응집되거나 효과가 없을 수도 있기 때문이다(Rudolph et al., J. Mol Ther. 2005, 12: 493-501))이 특히 유리한 것으로 관찰되었다.
결과:
상기 실험은 중합체와 복합체를 형성한(0.8/1) 화학적으로 변형된 Luc mRNA가 PEI 25 kDa(1/0) 또는 PPI(0/1)와 복합체를 형성한 경우보다 폐 에어로졸 전달시 돼지의 폐 세포에서 더 효율적으로 발현됨을 보인다(도 2). 함께 이는 본 발명의 목적이 본 발명에 따른 방법 및 약학 제제에 의해 적합하게 다루어질 수 있음을 보인다.
실시예 3
마우스의 폐에 대한, 공중합체와 제형화된 개똥벌레 루시페라제(Luc)를 암호화하는 화학적으로 변형된 mRNA의 생체내 적용
화학물질
상기 실시예 1을 참조.
화학적으로 변형된 Luc mRNA의 생성
상기 실시예 1을 참조.
실험 과정
분지된 0.8/1(에틸아민/프로필렌 단위) 공중합체("br-Homo") 및 개똥벌레 루시페라제를 암호화하는 mRNA, 및 분지된 폴리에틸렌이민("br-PEI") 및 상기 mRNA의 폴리플렉스를 제조하고 이들 중 어느 하나를 기관내 액체(n=3)(100 ㎕ 부피 중의 25 ㎍의 mRNA)로서 또는 고압 마이크로스프레이어(Microsprayer) 장치(펜센츄리(PennCentury), 미국 소재)를 사용하여 기관내 스프레이(50 ㎕ 부피 중의 12.5 ㎍의 mRNA)로서 적용하였다. 모든 실험은 지방 당국(오버바이에른 정부)에 의해 승인되었으며 독일 동물 복지법에 따라 수행되었다. 다자란 암컷 Balb/c 마우스를 이소플루란 흡입 챔버에서 마취시켰다. 후속으로, 상기 시험 제형들을 맞춤 광원 및 작은 동물 설압자를 사용하여 기관내에 직접 적용하였다. 수분내에 동물이 마취로부터 회복하였다. 6시간 후에 동물을 펜타니/미다졸람/메데토미딘(0.05/5.0/0.5 ㎎/㎏ BW)의 복강내 주사를 통해 마취시켰다. D-루시페린(50 ㎕ PBS 중에서 희석된 1.5 ㎎)을 상기 마취된 동물의 코 안에 적용하여 심부 기도내로 흡입시켰다. 생물발광 영상화를 IVIS 루미나(Lumina) XR 영상화 시스템(퍼킨 엘머, 미국 소재)을 사용하여 수행하였다. 결과를 도 3에 나타낸다.
[도면의 간단한 설명]
도 1
폴리플렉스를 지시된 N/P 비에서 0.8/1, 1/0 또는 0/1(에틸아민/프로필아민 단위) 공중합체 및 개똥벌레 루시페라제를 암호화하는 mRNA를 사용하여 형성시켰다. 24시간 후에, 상이한 양의 mRNA(125 또는 62.5 ng)로 형질감염된 HEK293 세포를 용해시키고 루시페라제 활성에 대해 분석하였다.
도 2
폴리플렉스를 10의 N/P 비에서 0.8/1, 1/0 또는 0/1(에틸아민/프로필아민 단위) 공중합체, PEI(및 상업적으로 입수할 수 있는 분지된 PEI, 25 kDa, 시그마 알드리치) 및 개똥벌레 루시페라제를 암호화하는 mRNA를 사용하여 형성시켰다. 돼지에서 에어로졸 투여 24시간 후에, 폐를 절제하고 폐 조직 슬라이스상에서의 생물발광 영상화에 의해 개똥벌레 루시페라제 활성을 분석하였다.
도 3
분지된 0.8/1(에틸아민/프로필아민 단위) 공중합체("br-Homo") 및 개똥벌레 루시페라제를 암호화하는 mRNA, 및 분지된 폴리에틸렌이민("br-PEI") 및 상기 mRNA의 폴리플렉스들을 기관내 액체로서 및 기관내 스프레이로서 마우스에게 적용하였다. 도면은 IVIS 루미나 XR 영상화 시스템(퍼킨 엘머, 미국 소재)을 사용한 생물발광 영상화 시험의 결과를 나타낸다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식 a1 및 a2의 반복 단위 중에서 독립적으로 선택된 다수의 반복 단위 a, 및 하기의 화학식 b1 내지 b4의 반복 단위 중에서 독립적으로 선택된 다수의 반복 단위 b를 포함하는 통계 공중합체:
    화학식 a1
    Figure pct00037

    화학식 a2
    Figure pct00038

    화학식 b1
    Figure pct00039

    화학식 b2
    Figure pct00040

    화학식 b3
    Figure pct00041

    화학식 b4
    Figure pct00042

    상기 식들에서,
    상기 반복 단위 a의 합 대 반복 단위 b의 합의 몰비는 0.7/1.0 내지 1.0/0.7의 범위 내에 있고,
    상기 공중합체 중에 함유된 반복 단위 a 및/또는 b의 질소 원자들 중 하나 이상은 양성자화되어 양이온성 공중합체를 제공할 수 있다.
  2. 제1항에 있어서,
    반복 단위 a2, b2 및 b4 중에서 선택된 반복 단위들 중 하나 이상의 유형을 포함하는 분지된 또는 수지상 공중합체인 공중합체.
  3. 제1항에 있어서,
    반복 단위 a1 및 b1을 포함하는 선형 공중합체인 공중합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    반복 단위 a 및 b가 공중합체 중의 모든 반복 단위의 80 몰% 이상을 차지하는 공중합체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    a1 및 a2 중에서 선택된 반복 단위 a 및 b1 및 b2 중에서 선택된 반복 단위 b가 공중합체 중의 모든 반복 단위의 80 몰% 이상을 차지하는 공중합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    공중합체의 말단 그룹이 하기 화학식 c1 내지 c3의 그룹 중에서 독립적으로 선택된 그룹 c 중 하나 이상의 유형을 포함하는 공중합체:
    화학식 c1
    Figure pct00043

    화학식 c2
    Figure pct00044

    화학식 c3
    Figure pct00045
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    반복 단위 a 대 반복 단위 b의 몰비가 0.8/1.0 내지 1.0/0.8의 범위내에 있는 공중합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    아지리딘, 아제티딘 및 임의로 피롤리딘을 포함하는 단량체 혼합물을 중합시킴으로써 수득될 수 있는 공중합체.
  9. 핵산 및 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 공중합체를 포함하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    핵산이 mRNA인 조성물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    공중합체가 양이온성 공중합체이고, 상기 양이온성 공중합체가 핵산과 복합체를 형성하는 조성물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 임의로 추가의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  13. 핵산을 세포내로 전달하기 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 공중합체, 또는 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 약학 조성물의 용도.
  14. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 약학 조성물을 표적 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 표적 세포 또는 조직에 핵산을 전달하기 위한 방법.
  15. 아지리딘, 아제티딘 및 임의로 피롤리딘을 포함하는 단량체 혼합물을 중합시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 공중합체의 생성 방법.
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