MX2009001207A

MX2009001207A - Policonjugados para el suministro in vivo de polinucleotidos.

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Publication number: MX2009001207A
Application number: MX2009001207A
Authority: MX
Inventors: David L Lewis; James E Hagstrom; Hans Herweijer; Andrei Blokhin; Jason Klein; David B Rozema; Vladimir Trubetskoy; Darren H Wakefield; Jon A Wolff; So Wong
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2006-08-18
Filing date: 2007-08-17
Publication date: 2009-02-11
Also published as: WO2008022309A2; JP5735573B2; CN102614528A; CA2660842C; AU2007285782B2; IL196508A; EP2061443A4; IL196508A0; JP2010521133A; NO20090422L; US8137695B2; KR101133799B1; US20090023890A1; EP2061443A2; US20080281044A1; JP5274461B2; US7985406B2; KR20090042918A; CA2660842A1; WO2008022309A3

Abstract

La presente invención se dirige a compuestos, composiciones y métodos que son útiles para suministrar polinucleótidos u otras moléculas impermeables hacia la célula a células de mamífero. Se describen sistemas de policonjugados que incorporan actividades de fijación como objetivo, anti-opsonización, anti-agregación y transfección en vehículos de suministro in vivo, biocompatibles, pequeños. En uso de múltiples uniones reversibles que conectan partes componentes proporciona una modulación de actividad fisiológicamente sensible.

Description

POLICONJUGADOS PARA EL SUMINISTRO IN VIVO DE POLINUCLEOTIDOS Antecedentes de la Invención El suministro de compuestos de polinucleótidos y otros compuestos impermeables hacia las membranas dentro de células vivas esta restringido sumamente por los sistemas complejos de la membrana de la célula. Los fármacos utilizados en terapias antisentido y génicas son polímeros hidrófilos relativamente grandes y frecuentemente también tienen una carga negativa alta. Ambas características físicas imposibilitan su difusión directa a través de la membrana celular. Por esta razón, la barrera principal para el suministro de polinucleótidos es el suministro del polinucleótido al interior de la célula. Se han desarrollado numerosos. reactivos de transfección para suministrar polinucleótidos a células in vitro. Sin embargo, el suministro in vivo de polinucleótidos se complica por la toxicidad, interacciones con el suero y pobre fijación como objetivo de reactivos de transfección que son efectivos in vitro. Los reactivos de transfección que funcionan bien in vitro, polímeros catiónicos y lípidos, desestabilizan típicamente las membranas celulares y forman partículas grandes. La carga catiónica del reactivo de transfección facilita el enlace de ácido nucleico así como también el enlace de células. La desestabilización de las membranas REF: 199605 facilita el suministro del polinucleótido impermeable hacia la membrana a través de una membrana celular. Estas propiedades vuelven a los reactivos de transfección ineficaces o tóxicos in vivo. La carga catiónica da por resultado la interacción con componentes del suero, lo cual causa la desestabilización de la interacción de polinucleótido-reactivo de transfección y una pobre biodisponibilidad y fijación como objetivo. La carga catiónica también puede conducir a la toxicidad in vivo. La actividad en la membrana del reactivo de transfección, el cual puede ser efectivo in vitro, conduce frecuentemente a la toxicidad in vivo. Para el suministro in vivo, un complejo de transfección (reactivo de transfección en asociación con el ácido nucleico a ser suministrado) debe ser pequeño, menor de 100 nm de diámetro y preferiblemente menor de 50 nm. Los complejos aún más pequeños, menores de 20 nm o menores de 10 nm serian todavía más útiles. Los complejos de transfección más grandes de 100 nm tienen un acceso muy pequeño a las células diferentes de las células de los vasos sanguíneos in vivo. Los complejos in vitro también tienen carga positiva. Esta carga positiva es necesaria para la unión del complejo a la célula y para la fusión, desestabilización o alteración de la membrana. La carga catiónica en los complejos de transfección in vivo conduce a interacciones adversas en el suero y por lo tanto a una pobre biodisponibilidad. Los complejos con carga casi neutra o negativa tendrían mejores capacidades de distribución y fijación como objetivo in vivo. Sin embargo, los complejos de transfección in vitro se asocian con el ácido nucleico por vía de interacciones de carga-carga (electrostáticas) . Los polímeros y lípidos con carga negativa no interactúan con ácidos nucleicos con carga negativa. Además, estos complejos electrostáticos tienden a agregarse o desintegrarse cuando se exponen a concentraciones fisiológicas de sal o componentes del suero. Finalmente, los complejos de transfección que son efectivos in vitro frecuentemente son tóxicos in vivo. Los polímeros y lípidos utilizados para la transfección alteran o desestabilizan las membranas celulares. El balanceo de esta actividad con el suministro de ácido nucleico se logra más fácilmente in vitro que in vivo. Mientras que varios grupos han hecho mejoramientos crecientes hacia el perfeccionamiento en el suministro de genes a células in vivo, permanece la necesidad de una formulación que suministre de manera efectiva un polinucleótido junto con un agente de suministro a una célula objetivo sin la toxicidad asociada normalmente con la administración in vivo de los reactivos de transfección. La presente invención proporciona composiciones y métodos para el suministro y liberación de un polinucleótido a una célula utilizando sistemas de suministro de conjugados biológicamente lábiles. Breve Descripción de la Invención En una modalidad preferida, la invención presenta una composición para suministrar un polinucleótido a una célula in vivo que comprende un polímero activo en la membrana enmascarado reversiblemente que está conjugado reversiblemente a un polinucleótido. El polímero está unido, por vía de una o más primeras uniones covalentes reversibles, a uno o más agentes de enmascaramiento y está unido además, por vía de una o más segundas uniones covalentes reversibles, a uno o más polinucleótidos . Las primeras y segundas uniones covalentes reversibles pueden comprender enlaces reversibles que son escindidos bajo condiciones idénticas o similares o pueden ser escindidos bajo condiciones distintas, es decir pueden comprender enlaces reversibles ortogonales. El conjugado de polinucleótido-polímero se administra a un mamífero en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable . En una modalidad preferida, se dan a conocer Polímeros de membrana activa que comprenden: copolímeros aleatorios de éter polivinílico . Los copolímeros de éter polivinílico se pueden sintetizar a partir de dos, tres o más monómeros diferentes. Los monómeros se pueden seleccionar de la lista que comprende: éter vinilico protegido con amino tal como éteres vinilicos que contienen ftalimido, éter vinilico de butilo, éter vinilico de dodecilo, éter vinilico de octadecilo. Un copolímero aleatorio de éter polivinílico preferido comprende tres monómeros: un monómero que contiene amina, un éter vinilico de butilo y un éter vinilico de octadecilo . En una modalidad preferida, una o más características biofísicas del polímero activo en la membrana son protegidas o modificadas reversiblemente por un agente de enmascaramiento. Los agentes de enmascaramiento se pueden seleccionar del grupo que comprende estabilizadores estéricos, grupos de fijación como objetivo y agentes modificadores de carga. El agente de enmascaramiento puede mejorar la biodistribución o fijación como objetivo del conjugado de polímero-polinucleótido al inhibir las interacciones no específicas del polímero con componentes del suero o células no fijadas como objetivo. El agente de enmascaramiento también puede reducir la agregación del polímero o conjugado de polímero-polinucleótido. Los agentes de enmascaramiento que contienen grupos de fijación como objetivo pueden mejorar la fijación como objetivo específica para células o la incorporación a las células al fijar como objetivo el sistema de conjugado a un receptor de la superficie celular. El agente de enmascaramiento se puede conjugar al polímero activo en la membrana antes de o subsecuente a la conjugación del polímero a un polinucleotido . En una modalidad preferida, el polinucleotido que puede ser suministrado a células utilizando los sistemas de conjugados descritos se puede seleccionar del grupo que consiste de: ADN, ARN, polinucleótidos de bloqueo, oligonucleótidos antisentido, plásmidos, vectores de expresión, oligonucleótidos, ARNip, microARN, ARNm, ARNhp y ribosimas . En una modalidad preferida, el (los) agente (s) de enmascaramiento y el (los) polinucleotido ( s ) se une (n) covalentemente al polímero activo en la membrana por vía de uniones reversibles. Mientras que el enmascaramiento del polímero y la unión del polinucleotido al polímero son importantes, estas uniones pueden interferir con la actividad de transfección del polímero o la actividad del polinucleotido. Al unir el agente de enmascaramiento y el polinucleotido al polímero por vía de uniones reversibles que son escindidas en un tiempo apropiado, la actividad se reincorpora al polímero -y el polinucleotido se libera. Las uniones covalentes reversibles contienen enlaces reversibles o lábiles los cuales se pueden seleccionar del grupo que comprende: enlaces fisiológicamente lábiles, enlaces celulares fisiológicamente lábiles, enlaces lábiles al pH, enlaces muy lábiles al pH, enlaces extremadamente lábiles al pH, enlaces enzimáticamente escindibles y enlaces de disulfuro. La presencia de dos uniones reversibles que conectan el polímero al polinucleótido y un agente de enmascaramiento proporcionan un co-suministro del polinucleótido con un polímero de suministro y la fijación como objetivo e inactivación selectivas del polímero de suministro por el agente de enmascaramiento. La reversibilidad de las uniones proporciona la liberación del polinucleótido del polímero activo en la membrana y la activación selectiva del polímero activo en la membrana. En una modalidad preferida, se describe una composición que comprende: un polímero de suministro unido covalentemente a: a) uno o más grupos de fijación como objetivo estabilizadores esféricos o modificadores de cargas por vía de una o más uniones reversibles; y b) uno o más polinucleótidos por vía de una o más uniones reversibles. En una modalidad, la unión covalente reversible del agente de fijación como objetivo, estabilizador esférico o modificador de carga es ortogonal a la unión covalente reversible del polinucleótido. En una modalidad preferida, se describe un sistema de conjugado de polímero para el suministro de un polinucleótido a una célula y la liberación del polinucleótido dentro de la célula que comprende: el polinucleótido conjugado reversiblemente a un polímero activo en la membrana el cual se conjuga reversiblemente por si mismo a un agente de enmascaramiento. Los enlaces de conjugación pueden ser los mismos o pueden ser diferentes. Además, los enlaces de conjugación se pueden escindir bajo condiciones idénticas o diferentes. En una modalidad preferida, se describe un sistema de conjugado de polímero para el suministro de una molécula impermeable hacia la membrana a una célula y la liberación de la molécula en la célula. El sistema de conjugado de polímero comprende la molécula impermeable hacia la membrana unida reversiblemente a un polímero activo en la membrana en donde una pluralidad de agentes de enmascaramiento se unen al polímero activo en la membrana por vía de enlaces covalentes reversibles. Los Polímeros de membrana activa pueden ser tóxicos o pueden no fijarse como objetivo cuando se aplican in vivo. La unión reversible de un agente de enmascaramiento inhibe o altera reversiblemente las interacciones con la membrana, interacciones con el suero, interacciones con la célula, toxicidad o carga del polímero. Un enlace covalente, reversible, preferido comprende: un enlace lábil, un enlace fisiológicamente lábil o un enlace escindible bajo condiciones intracelulares de mamíferos. Un enlace lábil preferido comprende un enlace lábil al pH. Un enlace lábil al pH preferido comprende un enlace de maleamato. Otro enlace lábil preferido comprende un enlace de disulfuro. Las moléculas impermeables hacia la membrana incluyen, pero no están limitadas a: polinucleótidos, proteínas, anticuerpos y fármacos impermeables hacia las membranas. En una modalidad preferida, un polinucleótido se une al polímero en presencia de un exceso de polímero. El polímero en exceso puede ayudar en la formulación del conjugado de polinucleótido-polímero . El polímero en exceso puede reducir la agregación del conjugado durante la formulación del conjugado. El conjugado de polinucleótido-polímero puede separarse del polímero en exceso antes de la administración del conjugado a la célula o el organismo. Alternativamente, el conjugado de polinucleótido-polímero puede ser co-administrado con el polímero en exceso a la célula o el organismo. El polímero en exceso puede ser el mismo que el polímero o puede ser diferente. En una modalidad preferida, los conjugados de polímeros de la invención se pueden utilizar para el suministro in vitro de un polinucleótido u otra molécula impermeable hacia la membrana. Para el suministro in vitro, el enmascaramiento ' reversible del polímero mejora la actividad de transfección de algunas poliaminas de otra manera ineficaces, tal como polilisina. El enmascaramiento reversible también puede mejorar la utilidad de otros Polímeros de membrana activa al reducir su toxicidad o limitar su carácter de alteración de la membrana para los endosomas . En una modalidad preferida, se describe un sistema para suministrar un polinucleótido a una célula in vivo que comprende: unir covalentemente un grupo de fijación como objetivo a un polinucleótido, unir covalentemente un segundo grupo de fijación como objetivo a un polímero activo en la membrana e inyectar el polinucleótido y polímero activo en la membrana dentro de un organismo. Los objetivos, características y ventajas adicionales de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada cuando se toma junto con las figuras anexas. Breve Descripción de las Figuras FIGURA 1. Esquema de reacción para la polimerización de polímeros de éter polivinilico. FIGURA 2. Figura que ilustra varias modalidades de los agentes de enmascaramiento de la invención. FIGURA 3. Diagrama que ilustra conjugados reversibles de polinucleótido-polímero y enmascaramiento reversible del conjugado por maleamatos (cuyo título es "Formulación de Conjugados de ARNip-Polímero"). FIGURAS 4A-4B. Micrografía que muestra el suministro fijado como objetivo a hepatocitos del hígado de polímero de PBAVE enmascarado con la Figura 4A) CDM-PEG (izquierda) o la Figura 4B) CDM-PEG más CDM-Pip-LBA.

FIGURA 5. Micrografia que muestra el suministro de un conjugado enmascarado de polinucleótido-polimero enmascarado a hepatocitos in vivo. FIGURA 6. Gráfica que ilustra la reducción del gen objetivo in vivo después del suministro de ARNip de ppara mediado por el policonj ugado . FIGURAS 7A-7D. Micrografías que -muestran el suministro de ADNbc al hígado in vivo con la (Figura 7A) ADN-DW1360-CD -PEG/NAG, (Figura 7B) ADN + DW1360-CDM-PEG/NAG (polinucleótido no conjugado al polímero, (Figura 7C) ADN-DWl360-CDM-PEG/glucosa y (Figura 7D) ADN-DW1360-CDM-PEG/Manosa . ADN etiquetado con Cy3 = cuadrante izquierdo superior en cada panel, actina teñida con faloidina ALEXA-488MR = cuadrante derecho superior, núcleos = cuadrante izquierdo inferior e imagen compuesta = cuadrante derecho inferior. FIGURAS 8A-8C. Gráficas y transferencia que ilustran la reducción de la expresión del gen objetivo en hígados de ratones después de la inyección intravenosa de policonjugados de ARNip. (Figura 8A) Reducción de niveles de ARNm de apoB en el hígado después del tratamiento con policonjugados de ARNip de apoB. (Figura 8B) Niveles en el suero de la proteína apoB-100 en ratones tratados con el policonj ugado de ARNip de apoB. (Figura 8C) Reducción de niveles de ARNm de ppara en el hígado después de la inyección intravenosa de policonjugados de ARNip de ppara.

FIGURAS 9A-9B. Gráfica que ilustra la respuesta a la dosis del policonjugado de ARNip de apoB-1. (Figura 9A) Reducción del ARNm de apoB después de la inyección de diluciones en serie del policonjugado de ARNip de apoB-1. (Figura 9B) Reducción del ARNm de apoB después de la inyección de cantidades variantes de ARNip. FIGURA 10. Gráfica que ilustra los niveles de colesterol en ratones tratados con el policonjugado de ARNip de apoB-1. FIGURAS 11A-11C. Micrografías que muestran la acumulación de lípidos en el hígado de ratones después del suministro del policonjugado de la (Figura 11A) ARNip de ApoB o (Figura 11B) ARNip de control negativo de GL3 o (Figura 11C) solución salina sola. FIGURAS 12A-12B. Gráfica que ilustra la inhibición de la expresión de genes (Figura 12A) y la disminución resultante en el colesterol en el suero (Figura 12B) y los días 2-15 después de la administración del conjugado de ARNip de apoB-1 en ratones en el día 0. FIGURA 13. Micrografía que muestra el suministro in vivo de anticuerpos a hepatocitos por vía de la administración del anticuerpo conjugado reversiblemente a DW1360 y enmascarado con CDM-PEG y CDM-NAG. El cuadrante izquierdo superior muestra los anticuerpos etiquetados, el cuadrante derecho superior muestra la actina, el cuadrante izquierdo inferior muestra los núcleos y el cuadrante derecho inferior muestra una imagen compuesta. FIGURA 14. Gráfica que ilustra la reducción de un gen en hepatocitos primarios transíectados con el ARNip de ApoB suministrado con un reactivo de transfección in vitro comercial o con cantidades variantes del policon ugado de ARNip de ApoB. FIGURA 15. Gráfica que ilustra la transfección de conjugados de ARNip a células Hepa-lclc7 in vitro: Conjugado solo = ARNip-PLL enmascarado. FIGURA 16. Gráfica que ilustra la fluorescencia de DPH en presencia de PBAVE. FIGURAS 17A-17C. Gráficas que ilustran Figura 17A) Perfiles de elución de estándares de PEG en la columna Shodex SB-803MR (cuyo titulo es "GPC de Estándares de PEG en Shodex SB-803-HQMR") , Figura 17B) Diagrama de calibración para la columna Shodex SB-803MR (cuyo titulo es "calibración en columna de GPC Shodex SB-803-HQMR con PEGs") y Figura 17C) Cálculo de peso molecular para el polímero de PBAVE. FIGURAS 18A-18C. Gráficas que ilustran Figura 18A) Perfiles de elución de estándares de ácido nucleico etiquetados con Cy3 y conjugado enmascarado de polinucleótido-polímero (cuyo título es "SEC S-500 del complejo de CDM") , Figura 18B) Diagrama de calibración para la cromatografía de exclusión de tamaño Sephacryl S-500MR y Figura 18C) Cálculo de peso molecular para el conjugado enmascarado de polinucleótido-polimero . FIGURAS 19A-19D. Micrografias que muestran el suministro de polinucleótidos in vivo a tumores positivos en el receptor de galactosa de ratón (Figuras 19A-19B) o tumores negativos en el receptor de galactosa (Figuras 19C-19D) utilizando conjugados de oligonucleótido-polimero-CDM/PEG/NAG (Figuras 19A, 19C) o conjugados de oligonucleótido-polimero-CDM/PEG/glucosa (Figuras 19B, 19D) . Descripción Detallada de la Invención La presente invención se dirige a compuestos, composiciones y métodos útiles para suministrar polinucleótidos u otras moléculas impermeables hacia las células a células de mamíferos. En este documento se describe un sistema de policonj ugado para suministrar polinucleótidos u otras moléculas impermeables hacia la membrana a células in vivo. El sistema de policonjugado incorpora actividades de fijación como objetivo, anti-opsonización, anti-agregación, y transfección en un vehículo de suministro pequeño inferior a 50 nanómetros. Un componente clave del sistema es la reversibilidad de enlaces que conectan las partes componentes. Un primer componente de los conjugados de suministro de polinucleótidos in vivo descritos comprende una unión covalente fisiológicamente reversible del polinucleótido a un polímero activo en la membrana. Una unión covalente del polinucleótido al polímero activo en la membrana asegura que el polinucleótido no sea disasociado fácilmente del polímero cuando se administra in vivo o ex vivo en presencia del suero y de esta manera proporciona un co-suministro del polinucleótido con el polímero activo en la membrana a la célula objetivo. Sin embargo, la unión covalente de un polinucleótido a un polímero puede volver inactivo al polinucleótido. Por lo tanto, la unión del polinucleótido al polímero activo en la membrana se realiza a través de una unión o enlace fisiológicamente reversible. Al utilizar una unión fisiológicamente reversible, el polinucleótido puede ser escindido del polímero, liberando el polinucleótido para acoplarse en interacciones funcionales con los componentes de la célula. Al seleccionar una unión reversible apropiada, es posible formar un conjugado que libere el polinucleótido solo después de que ha sido suministrado a una ubicación deseada, tal como el citoplasma de una célula. Un segundo componente de los conjugados de suministro de polinucleótidos in vivo descritos comprende una modificación reversible del polímero activo en la membrana. La modificación reversible del polímero activo en la membrana reduce las interacciones con el suero no productivo y con células no fijadas como objetivo y reduce la toxicidad. El agente de enmascaramiento también puede agregar una función deseada al conjugado tal como el mejoramiento de la interacción con células fijadas como objetivo o el mejoramiento de la endocitosis del conjugado. El polímero se enmascara por medio de la unión covalente de un agente de enmascaramiento al polímero por vía de una unión covalente fisiológicamente reversible. El agente de enmascaramiento puede ser un estabilizador esférico, grupo de fijación como objetivo o modificador de carga. Los agentes de enmascaramiento pueden proteger al polímero de interacciones no específicas, incrementar el tiempo de circulación, mejorar las interacciones específicas, inhibir la toxicidad o alterar la carga del polímero. Cada una de estas modificaciones puede alterar la actividad del polímero en la membrana, volviendo al polímero modificado incapaz de facilitar el suministro del polinucleótido . Por lo tanto, la unión del agente de enmascaramiento al polímero activo en la membrana se realiza a través de un enlace fisiológicamente reversible. Al utilizar una unión fisiológicamente reversible, el agente de enmascaramiento puede ser escindido · del polímero, desenmascarando en consecuencia el polímero y restaurando la actividad del polímero desenmascarado. Al seleccionar una unión reversible apropiada, es posible formar un conjugado que restaure la actividad del polímero activo, en la membrana después de que ha sido suministrado o fijado como objetivo a un tipo de célula o ubicación celular deseado. La invención incluye sistemas de suministro de conjugados de la estructura general: N-lZ-P- (L2-M)y, en donde N es un polinucleótido u otra molécula impermeable hacia la célula, L1 es una unión reversible, P es un polímero, L2 es una segunda unión reversible y M es un agente de enmascaramiento. El agente de enmascaramiento M protege o modifica una propiedad o interacción de P. y es un número entero mayor que 0. Un polímero preferido es un polímero activo en la membrana. Otro polímero preferido es un polímero de transfección . Una pluralidad de agentes de enmascaramiento se puede unir a un polímero individual. La pluralidad de agentes de enmascaramiento se puede unir al polímero por vía de una pluralidad de uniones reversibles. Con la escisión de la unión reversible L2, la propiedad o interacción enmascarada se restituye al polímero P. El agente de enmascaramiento M puede agregar una actividad, tal como el enlace a receptores celulares, al polímero P. El enlace reversible de L1 puede ser el mismo o diferente del (ortogonal al) enlace reversible de L2. El enlace reversible de la unión reversible L1 o L2 se selecciona de tal manera que la escisión ocurra en una condición fisiológica deseada, tal como aquella presente en un tejido, órgano u ubicación subcelular deseados o en respuesta a la adición de un agente exógeno farmacéuticamente aceptable. El polinucleótido N y el agente de enmascaramiento M se pueden unir al polímero P en cualquier parte a lo largo de la longitud del polímero P. Polímeros Un polímero es una molécula compuesta por un enlace repetitivo en su conjunto de unidades más pequeñas denominadas monómeros. Un polímero puede ser de tipo lineal, red ramificada, estrella, peine o escalera. La cadena principal de un polímero está compuesta de los átomos cuyos enlaces se requieren para la propagación de la longitud del polímero. Por ejemplo, el poli-L-lisina , el átomo de carbono de carbonilo, a-carbono y los grupos a-amina se requieren para la longitud del polímero y por lo tanto son los átomos principales de la cadena. Una cadena lateral de un polímero está compuesta de los átomos cuyos enlaces no se requieren para la propagación de la longitud del polímero. Un polímero puede ser un homopolímero en el cual se utiliza un monómero individual o un polímero puede ser un copolimero en el cual se utilizan dos o más monómeros diferentes. Los copolimero pueden ser alternantes, aleatorios (estadísticos) de bloque e injerto (peine). Los polímeros alternantes contienen monómeros en un orden repetitivo definido, tal como -[A-B]n-. Los monómeros de polímeros alternantes no se homopolimerizan típicamente, en lugar de eso reaccionan juntos para producir el copolimero alternante . Los monómeros en copolímeros aleatorios no tienen un orden o arreglo definido a lo largo de cualquier cadena determinada, tal como: -An-Bm-. Las composiciones generales de estos polímeros son reflejantes de la relación de los monómeros de entrada. Sin embargo, la relación exacta de un monómero con respecto a otro puede diferir entre cadenas. La distribución de monómeros también puede diferir a lo largo de la longitud de un polímero individual. También, las propiedades químicas de un monómero pueden afectar su velocidad de incorporación en un copolímero aleatorio y su distribución dentro del polímero. De esa manera, mientras que la relación de monómeros en un polímero aleatorio es dependiente de la relación de entrada del monómero, la relación de entrada no puede igualar exactamente la relación de los monómeros incorporados. Un polímero de bloque tiene un segmento o bloque de un polímero (poliA) seguido por un segmento o bloque de un segundo polímero (poliB) : es decir, -poliA-poliB- . El resultado es que diferentes cadenas de polímeros se unen en una configuración de cabeza a cola. De esta manera, un polímero de bloque es un ordenamiento lineal de bloques de diferente composición monomérica. Generalmente, aunque no se requiere, los bloques de polímeros son homopolímeros con el polímero A que está compuesto de un monómero diferente del polímero B. Un copolímero dibloque es poliA-poliB y un copolímero tribloque es poliA-poliB-poliA. Si A es un grupo hidrófilo y B es un grupo hidrófobo, el copolimero de bloque resultante puede considerarse un surfactante polimérico. Un polímero de injerto es un tipo de copolimero de bloque en el cual las cadenas de un monómero son injertadas sobre cadenas laterales del otro monómero, como en (donde n, m, x, y, y z son números enteros): Bn I - (A) X-A- (A) y-A- (A) z- I Monómeros Se puede utilizar una amplia variedad de monómeros en los procesos de polimerización. Los monómeros pueden ser catiónicos, aniónicos, zwitteriónicos , hidrófilos, hidrófobos, lipófilos, anfipáticos o anfotéricos. Por sí mismos, los monómeros pueden ser polímeros. Los. monómeros pueden contener grupos químicos que se pueden modificar antes o después de la polimerización. Estos monómeros pueden tener grupos reactivos seleccionados del grupo que comprende: amina (primaria, secundaria y terciaria) , amida, ácido carboxílico, éster, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, haluro de alquilo, aldehido y cetona. Preferiblemente, el grupo reactivo se puede modificar después de la conjugación del polinucleótido o en una solución acuosa. Para aquellas personas expertas en el campo de la polimerización, existen varias categorías de procesos de polimerización. Por ejemplo, la polimerización puede ser de cadena o por pasos. Polimerización por pasos En la polimerización por pasos, la polimerización ocurre en una forma paso a paso. El crecimiento del polímero ocurre por medio de la reacción entre monómeros, oligómeros y polímeros. No es necesario un iniciador puesto que la misma reacción ocurre completamente y no hay un paso de terminación, de modo que los grupos finales aún son reactivos. La velocidad de polimerización disminuye a medida que los grupos funcionales se consumen. Un polímero se puede crear utilizando la polimerización por pasos por medio del uso de monómeros que tienen dos grupos reactivos (A y B) en el mismo monómero (heterobifuncional) , en donde A comprende un grupo reactivo y B comprende un grupo reactivo con A (un grupo reactivo el cual forma un enlace covalente con A) . La polimerización de A-B produce -[A-B]n-. Los grupos reactivos A y B se pueden unir por medio de un enlace covalente o una pluralidad de enlaces covalentes, formando en consecuencia el monómero del polímero. Un polímero también se puede crear utilizando la polimerización por pasos por medio del uso de monómeros homobifuncionales de tal manera que A-A + B-B produce - [A-A-B-B]n-. Géneralmente, estas reacciones pueden involucrar la acilación o alquilación. Los dos grupos reactivos de un monómero se pueden unir por medio de un enlace covalente individual o una pluralidad de enlaces covalentes. Si un grupo reactivo A es una amina entonces B es un grupo reactivo con amina, el cual se puede seleccionar del grupo que comprende: isotiocianato, isocianato, azida de acilo, N-hidroxi-succinimida, cloruro de sulfonilo, aldehido (que incluye formaldehido y glutaraldehido) , cetona, epóxido, carbonato, imidoéster, carboxilato activado con una carbodiimida, alquilfosfato, arilhaluros (difluoro-dinitrobenzeno) , anhídrido, haluro ácido, éster p-nitrofenílico, éster o-nitrofenílico, éster pentaclorofenílico, éster pentafluorofenílico, carbonil-imidazol, carbonil-piridinio y carbonil-dimetilaminopiridinio . En otros términos, cuando el grupo reactivo A es una amina entonces B puede ser un agente de acilación o alquilación o agente de aminación. Si el grupo reactivo A es un sulfhidrilo (tiol) entonces B es un grupo reactivo con tiol, el cual se puede seleccionar del grupo que comprende: un derivado de yodoacetilo, maleimida, derivado de aziridina, derivado de acriloilo, derivados de fluorobenceno y derivado de disulfuro (tal como un disulfuro de piridilo o derivados de ácido 5-tio-2-nitrobenzoico (TNB) ) . Si el grupo reactivo A es carboxilato entonces el grupo reactivo B es un grupo reactivo con carboxilato, el cual se puede seleccionar del grupo que comprende: diazoacetato y una amina en la cual se utiliza una carbodiimida . Se pueden utilizar otros aditivos tales como carbonildiimidazol, dimetilamino-piridina (DMAP) , N-hidroxisuccinimida o alcohol utilizando carbodiimida y DMAP. Si el grupo reactivo A es un hidroxilo entonces el grupo reactivo B es un grupo reactivo con hidroxilo, el cual se puede seleccionar del grupo que comprende: epóxido, oxirano, un carbamato activado, éster activado y haluro de alquilo. Si el grupo reactivo A es un aldehido o cetona entonces el grupo reactivo B es un grupo reactivo con aldehido o cetona, el cual se puede seleccionar del grupo que comprende: hidrazina, un derivado de hidrazida, amina (para formar una Base Schiff que puede ser reducida o no por agentes de reducción tal como NaCNBH3) y un compuesto de hidroxilo . Un polímero se puede crear utilizando la polimerización por pasos por medio del uso de monómeros bifuncionales y otro agente, de tal manera que A-A más otro agente produce -[A-A]n-. Si el grupo reactivo A es un grupo sulfhidrilo (tiol) entonces se puede convertir a enlaces de disulfuro por medio de agentes de oxidación tales como yodo (I2), peryodato de sodio (NaI04) u oxígeno (02) . Si el grupo reactivo A es una amina, se puede convertir a un tiol por medio de la reacción con 2-Iminotiolato (reactivo de Traut) el cual entonces se somete a la oxidación y la formación de disulfuro. Los derivados de disulfuro (tal como un disulfuro de piridilo o derivados de TNB) también se pueden utilizar para catalizar la formación de enlaces de disulfuro. Los grupos reactivos A o B en cualquiera de los ejemplos anteriores también pueden ser un grupo fotorreactivo tal como un derivado de azida de arilo (que incluye azida de arilo halogenada) , diazo, benzofenona, alquino o diazirina. Las reacciones de los grupos amina, hidroxilo, sulfhidrilo o carboxilato producen enlaces químicos que se describen como amidas, amidinas, disulfuros, éteres, ésteres, enaminas, iminas, ureas, isotioureas, isoureas, sulfonamidas , carbamatos, enlaces de alquilamida (aminas secundarias) y enlaces individuales de carbono-nitrógeno en los cuales el carbono contiene un grupo hidroxilo, tioéter, diol, hidrazona, diazo o sulfona. Polimerización en cadena En la polimerización de reacción en cadena, el crecimiento del polímero ocurre por la adición sucesiva de unidades de monómero a una variedad limitada de cadenas presentes. Los mecanismos de iniciación y propagación son diferentes y hay típicamente un paso de terminación de cadena. Las reacciones de Polimerización en cadena pueden ser radicales, aniónicas o catiónicas. Los monómeros para la Polimerización en cadena se pueden seleccionar de los grupos que comprenden: grupos vinilo, éter vinilico, acrilato, metacrilato, acrilamida y metacrilamida . La polimerización en cadena también se puede realizar por medio de la polimerización de apertura de ciclos o anillos. Se pueden utilizar varios tipos diferentes de iniciadores de radicales libres que incluyen, pero no están limitados a: peróxidos, peróxidos de hidroxi y compuestos de azo tales como diclorhidrato de 2 , 2 ' -Azobis ( -amidinopropano) (AAP) . Actividad de Transfección El término transfección se refiere a la transferencia de un polinucleótido u otro compuesto biológicamente activo desde el exterior de una célula al interior de una célula de tal manera que el polinucleótido o compuesto biológicamente activo es funcional. Los ejemplos de reactivos de transfección para el suministro de polinucleótidos a células in vitro incluyen, pero no están limitados a: liposomas, lipidos, poli'aminas, productos precipitados de fosfato de calcio, proteínas de histona, polietilenimina y complejos de polianfolito y combinaciones de éstos. Muchos reactivos de transfección in vitro son catiónicos, lo cual permite que el reactivo se asocie con, o forme un complejo con, ácidos nucleicos con carga negativa por vía de una interacción electrostática.

Polímeros de membrana activa Los Polímeros de membrana activa son polímeros anfipáticos que son capaces de inducir uno o más de los siguientes efectos en una membrana biológica: una alteración o perturbación de la membrana que permite que las moléculas que no son permeables hacia la membrana entren a una célula o a través de la membrana, formación de poros en la membrana, fisión de las membranas o perturbación o disolución de la membrana. Como se utiliza en este documento, una membrana, o membrana celular, comprende una bicapa de lípidos. Los Polímeros de membrana activa de la invención incluyen aquellos polímeros que facilitan el suministro de un polinucleótido u otra molécula impermeable hacia la membrana desde el exterior de una célula al interior de la célula y preferiblemente al citoplasma de la célula. La alteración o perturbación de la membrana se puede definir funcionalmente por la actividad del polímero o compuesto en por lo menos uno de los siguientes ensayos: lisis de glóbulos rojos (hemolisis), fuga de liposomas, fusión de liposomas, fusión de células, lisis de células y liberación de endosomas. Los Polímeros de membrana activa que pueden causar la lisis de las membranas celulares también se denominan polímeros líticos para la. membrana. Los Polímeros de membrana activa que pueden causar la perturbación de endosomas o lisosomas se consideran endosomolíticos . El efecto de los Polímeros de membrana activa sobre una membrana celular puede ser transitorio. La actividad en la membrana de un polímero se deriva de su afinidad por la membrana, lo cual causa una desnaturalización o deformación de la estructura de bicapa. Los Polímeros de membrana activa pueden ser polímeros anfipáticos sintéticos o no naturales. Los Polímeros de membrana activa pueden tener actividad de transfección in vitro. Los Polímeros de membrana activa pueden ser catiónicos, aniónicos, anfipáticos, anfotéricos, activos en la superficie o combinaciones de éstos. El suministro de un polinucleótido, u otra molécula impermeable hacia la membrana, a una célula es mediado por el polímero activo en la membrana que altera o desestabiliza la membrana plasmática o una membrana de vesícula interna (tal como un endosoma o lisosomas), que incluye la formación de un poro en la membrana o la alteración de la función endosomal o lisosomal . Como se utiliza en este documento, los Polímeros de membrana activa son distintos de una clase de polímeros denominados péptidos o polímeros penetradores de células representados por compuestos tales como el péptido rico en arginina derivado de la proteína TAT del VIH, el péptido de antenapedia, péptido VP22, transportano, péptidos artificiales ricos en arginina, polímeros artificiales ricos en guanidinio y similares. Mientras que los compuestos penetradores de células aparecen para transportar algunas moléculas a través de una membrana, desde un lado de una bicapa de lipidos al otro lado de la bicapa de lipidos> aparentemente sin requerir endocitosis y sin alterar la integridad de la membrana, su mecanismo no se entiende y la actividad misma es polémica. Polímeros endosomolíticos Los polímeros endosomolíticos son polímeros que, en respuesta a un cambio en el pH, son capaces de causar la alteración o lisis de un endosoma o proporcionar el escape de un compuesto normalmente impermeable hacia la membrana, tal como un polinucleótido o proteína, de una vesícula encerrada en una membrana interna celular, tal como un endosoma o lisosoma. La liberación endosomal es importante para el suministro de una amplia variedad de moléculas las cuales se someten a la endocitosis pero son incapaces de la difusión a través de las membranas celulares. Los polímeros endosomolíticos se someten a un cambio en sus propiedades fisicoquímicas sobre un intervalo de pH fisiológicamente relevante (usualmente pH 5.5 - 8) . Este cambio puede ser un cambio en la solubilidad del polímero, capacidad para interactuar con otros compuestos y un cambio en la hidrofobicidad o hidrofilicidad. Los polímeros endosomolíticos ejemplares pueden tener grupos titulables por pH o grupos o enlaces lábiles al pH. Como se utiliz.a en este documento, los grupos titulables por pH aceptan o donan reversiblemente protones en agua como una función del pH bajo condiciones fisiológicas, es decir un intervalo de pH de 4-8. Los grupos titulables por pH tiene valores pKa' s en el intervalo de 4-8 y actúan como amortiguadores dentro de este intervalo de pH. De esta manera, los grupos titulables por pH ganan o pierden carga en el ambiente de pH más bajo de un endosoma. Los grupos titulables en un pH fisiológico se pueden determinar experimentalmente al conducir una titulación de ácido-base y determinar experimentalmente si el grupo amortigua dentro del intervalo de pH de 4-8. Los ejemplos de grupos que pueden exhibir amortiguamiento dentro de este intervalo de pH incluyen pero no están limitados a: ácidos carboxilicos , imidazol, imidazol N-sustituido, piridina, fenoles y poliaminas. Los polímeros con grupos titulables por pH pueden alterar las vesículas internas por medio del comúnmente llamado efecto esponja de protones. Por lo tanto, se puede considerar que un polímero activo en la membrana enmascarado reversiblemente, en donde los agentes de enmascaramiento están unidos al polímero por vía de enlaces lábiles al pH, es un polímero endosomolítico. Un subconjunto de compuestos endosomolíticos son los compuestos fusogénicos, que incluyen péptidos fusogénicos. Los péptidos fusogénicos pueden facilitar la liberación endosomal de agentes tales como compuestos oligoméricos al citoplasma. Se cree que los péptidos fusogénicos cambian la conformación en el pH ácido, desestabilizan de manera efectiva la membrana endosomal mejorando en consecuencia el suministro citoplásmico de los contenidos endosomales. Los péptidos fusogénicos ejemplares incluyen péptidos suministrados desde polimixina B, influenza HA2 , GALA, KALA, EALA, melitina y péptidos derivados de melitina, péptido ß-amiloide de Alzheimer y similares. Polianfolitos Un polianfolito es un polímero que contiene 0 unidades monoméricas tanto aniónicas como catiónicas. Más específicamente, como se utiliza en este documento, un polianfolito contiene una pluralidad de monómeros aniónicos y una pluralidad de unidades catiónicas. Un polímero de polianfolito puede contener opcionalmente unidades monoméricas no iónicas. En soluciones acuosas, los polianfolitos se precipitan cerca de sus puntos isoeléctricos. Un polianfolito se puede formar por medio de la polimerización de monómeros aniónicos y catiónicos, inclusive monómeros poliméricos. Alternativamente, un polianfolito se puede formar al modificar más de uno, pero no todos, de los grupos cargados en un polímero. Si los grupos cargados se modifican reversiblemente, se forma un polianfolito reversible.

Anfipático Los polímeros anfipáticos o anfifilicos, son bien conocidos y reconocidos en el campo y tienen grupos o partes tanto hidrófilas (polares, solubles en agua) como hidrófobas (no polares, lipófilas, insolubles en agua) . Los grupos hidrófilos indican en términos cualitativos que la porción química prefiere el agua. Típicamente, estos grupos químicos son solubles en agua y son donantes o receptores de enlaces de hidrógeno con el agua. Un grupo hidrófilo puede estar cargado o no cargado. Los grupos cargados pueden tener carga positiva (aniónicos) o carga negativa (catiónicos) o ambas. Un compuesto anfipático puede ser un polianión, policatión, z itterión o polianfolito . Los ejemplos de grupos hidrófilos incluyen compuestos con las siguientes porciones químicas; carbohidratos, polioxietileno, ciertos péptidos, oligonucleótidos y grupos que contienen aminas, amidas, alcoxiamidas , ácidos carboxílicos, azufres o hidroxilos. Los grupos hidrófobos indican en términos cualitativos que la porción química evita el agua. Típicamente, estos grupos químicos no son solubles en agua y tienden a no formar enlaces de hidrógeno. Los grupos lipófilos se disuelven en grasas, aceites, lípidos y solventes no polares y tienen una capacidad pequeña o nula para formar enlaces de hidrógeno. Los hidrocarburos (que contienen dos o más átomos de carbono) . Ciertos hidrocarburos sustituidos, colesterol, derivados de colesterol y ciertos péptidos son ejemplos de grupos hidrófobos. Como se utiliza en este documento, con respecto a los polímeros antipáticos, una parte se define como una molécula derivada cuando un enlace covalente se rompe y se reemplaza por hidrógeno. Por ejemplo, en butilamina, un rompimiento entre los enlaces de carbono y nitrógeno, con el reemplazo por átomos de hidrógeno, da por resultado amoníaco (hidrófilo) y butano (hidrófobo) . Sin embargo, si el 1, 4-diaminobutano es escindido en los enlaces de nitrógeno-carbono y reemplazado por átomos de hidrógeno, las moléculas resultantes son nuevamente amoníaco (2x) y butano. Sin embargo, el 1 , , -diaminobutano no se considera antipático debido a que la formación de la parte hidrófoba requiere el rompimiento de dos enlaces. Un polímero de origen natural es un polímero que se puede encontrar en la naturaleza. Los ejemplos incluyen polinucleótidos , proteínas, colágeno y polisacáridos (almidones, celulosa, glicosaminoglicanos , quitina, agar, agarosa) . Un polímero natural se puede aislar de una fuente biológica o puede ser sintético. Un polímero sintético se formula o manufactura por medio de un proceso químico "por el hombre" y no es creado por un proceso biológico de origen natural. Un polímero no natural es un polímero sintético que no está hecho a partir de materiales o monómeros de origen natural (animal o vegetal) (tales como: aminoácidos, nucleótidos y sacáridos) . Un polímero puede ser completa o parcialmente natural, sintético o no natural. Un polímero puede tener uno o más enlaces lábiles, o escindibles. Si los enlaces lábiles son escindibles en condiciones fisiológicas o condiciones fisiológicas celulares, el polímero es biodegradable . El enlace escindible puede ser ya sea en la cadena principal o en una cadena secundaria. Si el enlace escindible ocurre en la cadena principal, luego la escisión del enlace da por resultado una disminución en la longitud del polímero y la formación de dos o más moléculas. Por ejemplo, los polímeros de éter polivinílico más pequeños se pueden unir por vía de enlaces lábiles para formar polímeros grandes de éter polivinílico. Si el enlace escindible ocurre en la cadena lateral, entonces la escisión del enlace da por resultado la pérdida de átomos de la cadena lateral del polímero. En este documento se da a conocer una clase de copolímeros aleatorios de polivinilo anfipáticos. Los copolímeros de polivinilo se pueden sintetizar a partir de dos, tres o más monómeros diferentes. Los monómeros preferidos se pueden seleccionar de la lista que comprende: éter vinílico cargado, éter vinílico que contiene un grupo iónico protegido, éter vinílico de amina protegido con ftalimida, éter vinílico de acilo, éter vinílico de alquilo, éter vinílico de alquilo inferior, éter vinílico de alquilo superior, éter vinilico de butilo, éter vinilico de dodecilo, éter vinilico de octadecilo, éter vinilico de colesterol y otros éteres vinilicos hidrófobos que contienen hidrocarburos . Una clase de polímeros particularmente útiles comprende: copolímeros aleatorios de éter polivinilico que contienen amina polimerizados con tres monómeros: monómeros de ftalimida, monómeros hidrófobos pequeños y monómeros hidrófobos grandes. La desprotección del monómero de ftalimida produce un monómero de amina. Los monómeros hidrófobos pequeños comprenden cadenas de carbono-hidrógeno con dos a seis átomos de carbono. Los monómeros hidrófobos grandes comprenden cadenas de carbono-hidrógeno con aproximadamente diez a aproximadamente 22 átomos de carbono o aproximadamente 12 a aproximadamente 18 átomos de carbono. Los monómeros hidrófobos intermedios comprenden cadenas de carbono-hidrógeno con aproximadamente 6 a aproximadamente 10 átomos de carbono. Los polímeros de éter polivinilico de amino preferidos comprenden: amino/butilo/éter polivinilico de octadecilo o amino/butilo/éter polivinilico de dodecilo. Las propiedades biofísicas de los copolímeros aleatorios de éter poli (vinilico) son determinadas por los monómeros particulares seleccionados, la relación a la cual se incorporan en el polímero y el tamaño del polímero. Los diferentes polímeros se pueden hacer al alterar la relación de alimentación de los monómeros en la reacción de polimerización. Mientras que la relación incorporada de monómeros en un polímero puede ser la misma que la relación de alimentación de monómeros, las relaciones pueden ser diferentes. Si los monómeros se incorporan en la relación de alimentación o en una relación diferente, es posible alterar la relación de alimentación de monómeros para lograr una relación de incorporación de monómeros deseada. Un éter polivinílico de amino preferido es un tripolímero aleatorio de amina/butilo/octadecilo o amina/butilo/dodecilo activo en la membrana soluble en agua. Es posible sintetizar polímeros con un contenido similar de amina y monómero hidrófobo a partir de poliaminas tales como: polietilenimina, polilisina, polivinilamina y polialilamina u otros polímeros tales como alcohol polivinílico a través de la modificación de las cadenas laterales de estos polímeros. Los Polímeros de membrana activa preferidos de la invención son solubles en agua a 1 mg/ml o mayor. Los Polímeros de membrana activa preferidos de la invención son tensoactivos . Los Polímeros de membrana activa de la invención están preferiblemente en el intervalo de tamaño de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 100 kDa, más preferiblemente de aproximadamente 7.5 kDa a aproximadamente 50 kDa y más preferiblemente de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 30 kDa.

Agente de enmascaramiento Los polímeros capaces de suministrar un polinucleótido desde el exterior de una célula al citoplasma de una célula son tóxicos frecuentemente o tienen una pobre bio-distribución in vivo. Por lo tanto, es necesario enmascarar las propiedades de los polímeros que causan la toxicidad o la pobre bio-distribución. Debido a que la modificación del polímero para enmascarar estas propiedades también puede suprimir la actividad de transfección o actividad en la membrana del polímero, los agentes de enmascaramiento se unen al polímero por vía de uniones fisiológicamente reversibles. La escisión de la unión restituye la propiedad protegida o enmascarada del polímero. Como se utiliza en este documento, un agente de enmascaramiento comprende una molécula la cual, cuando se une a un polímero, protege, inhibe o inactiva una o más propiedades (características biofísicas o bioquímicas) del polímero. Un agente de enmascaramiento también puede agregar una actividad o función al polímero que el polímero no tenía en ausencia del agente de enmascaramiento. Las propiedades de los polímeros que se pueden enmascarar incluyen: actividades en la membrana, actividad endosomolítica, carga, carga efectiva, actividad de transfección, interacción con el suero, interacción con la célula y toxicidad. Los agentes de enmascaramiento también pueden inhibir o impedir la agregación del conjugado de polinucleótido-polimero en condiciones fisiológicas. Los agentes de enmascaramiento de la invención se pueden seleccionar del grupo que consiste de: estabilizadores esféricos, grupos de fijación como objetivo y modificadores de cargas. Los múltiples agentes de enmascaramiento se pueden unir reversiblemente a un polímero individual. Para inactivar una propiedad de un polímero, puede ser necesario unir más de un agente de enmascaramiento al polímero. Un número suficiente de agentes enmascaramiento se unen al polímero para lograr el nivel de inactivación deseado. El nivel de modificación deseado de un polímero por medio de la unión del (los) agente (s) de enmascaramiento se determina fácilmente utilizando ensayos de actividad de polímeros apropiados. Por ejemplo, si el polímero posee actividad en la membrana en un ensayo determinado, un nivel suficiente de agente de enmascaramiento se une al polímero para lograr el nivel de inhibición deseado de la actividad en la membrana en ese ensayo. Un número suficiente de agente de enmascaramiento se puede unir reversiblemente al polímero para inhibir la agregación del polímero en condiciones fisiológicas. Se puede utilizar más de una especie de agente de enmascaramiento. Por ejemplo, tanto estabilizadores esféricos como grupos de fijación como objetivo se pueden unir a un polímero. Los estabilizadores esféricos y grupos de fijación como objetivo también pueden funcionar o no como modificadores de cargas. Los agentes de enmascaramiento de la invención se unen reversiblemente al polímero. Como se utiliza en este documento, un agente de enmascaramiento se une reversiblemente a un polímero si la inversión de la unión da por resultado la restitución de la actividad enmascarada del polímero. Los agentes de enmascaramiento se unen al polímero a través de la formación de uniones covalentes reversibles con grupos reactivos en el polímero. Los grupos reactivos se pueden seleccionar de los grupos que comprenden: aminas, alcoholes, tioles, hidrazidas, aldehidos, carboxilos, etcétera. Desde uno hasta la totalidad de los grupos reactivos o grupos cargados en un polímero se pueden modificar reversiblemente. En una modalidad, por lo menos dos agentes de enmascaramiento se unen reversiblemente al polímero. En otra modalidad, los agentes de enmascaramiento se unen reversiblemente a aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% de los grupos reactivos en el polímero. En otra modalidad, los agentes de enmascaramiento se unen reversiblemente a aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% de los grupos cargados en el polímero. En otra modalidad, el porcentaje de agentes de enmascaramiento que unen reversiblemente el polímero a grupos cargados en el polímero es aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80%. Como se utiliza en este documento, un polímero se enmascara si una o más propiedades del polímero son inhibidas o inactivadas por la unión de uno o más agentes de enmascaramiento. Un polímero se enmascara reversiblemente si la escisión de enlaces que unen los agentes de enmascaramiento al polímero da por resultado la restitución de la propiedad enmascarada del polímero. Los agentes de enmascaramiento preferidos de la invención son capaces de modificar el polímero (forman un enlace reversible con el polímero) en solución acuosa. Es de utilidad particular un derivado de anhídrido maleico en el cual R1 es metilo (-CH3) y R2 es un grupo de ácido propiónico (- (CH2) 2CO2H) o ésteres/amidas derivados del ácido. Como se utiliza en este documento, un estabilizador esférico es un polímero hidrófilo, no iónico, natural, sintético o no natural que impide las interacciones intramoleculares o intermoleculares del polímero al cual se une con relación al polímero que no contiene un estabilizador esférico. Un estabilizador esférico obstaculiza el acoplamiento de un polímero en interacciones electrostáticas. Las interacciones electrostáticas son la asociación no covalente de dos o más sustancias debido a las fuerzas de atracción entre cargas positivas y negativas. Los estabilizadores esféricos pueden inhibir la interacción con componentes de la sangre y por lo tanto la opsonización, fagocitosis y captación por el sistema reticuloendotelial .

Los estabilizadores estéricos pueden incrementar de esta manera el tiempo de circulación de las moléculas a las cuales se unen. Los estabilizadores estéricos también pueden inhibir la agregación de un polímero. Los estabilizadores estéricos preferidos son polietilenglicol (PEG) y derivados de PEG. Como se utiliza en este documento, un PEG preferido puede tener aproximadamente. 1-500 monómeros de etilenglicol, 2-20 monómeros de etilenglicol, 5-15 monómeros de etilenglicol o aproximadamente 10 monómeros de etilenglicol. Como se utiliza en este documento, un PEG preferido también puede tener un promedio de peso molecular de aproximadamente 85-20,000 Daltons (Da), aproximadamente 200-1000 Da, aproximadamente 200-750 Da o aproximadamente 550 Da. Otros estabilizadores estéricos adecuados se pueden seleccionar del grupo que comprende: polisacáridos , dextrano, ciclodextrina, alcohol poli (vinílico) , polivinilpirrolidona, metacrilato de 2-hidroxipropilo (HPMA) y éter de celulosa soluble en agua. Los grupos de fijación como objetivo, o ligandos, se utilizan para fijar como objetivo o suministrar un polímero a células o tejidos objetivo o tipos de células específicos. Los grupos de fijación como objetivo mejoran la asociación de moléculas con una célula objetivo. De esta manera, los grupos de fijación como objetivo pueden mejorar las propiedades farmacocinéticas o de biodistribución de un conjugado al cual se unen para mejorar la distribución celular y captación celular del conjugado. Uno o más grupos de fijación como objetivo se pueden unir al polímero activo en la membrana ya sea directamente o por vía de una unión con un separador. El enlace de un grupo de fijación como objetivo, tal como un ligando, a una célula o receptor de células puede iniciar la endocitosis. Los grupos de fijación como objetivo pueden ser monovalentes, divalentes, trivalentes, tetravalentes o pueden tener una valencia más alta. Los grupos de fijación como objetivo se pueden seleccionar del grupo que comprende: compuestos con afinidad hacia una molécula de la superficie celular, ligandos de receptores de la célula y anticuerpos, fragmentos de anticuerpos e imitadores de anticuerpos con afinidad hacia las moléculas de la superficie celular. Un grupo de fijación como objetivo preferido comprende un ligando de receptor de la célula. Se ha utilizado una variedad de ligandos para fijar como .objetivo fármacos y genes hacia células y hacia receptores celulares específicos. Los ligandos de receptores de la célula se pueden seleccionar del grupo que comprende: carbohidratos, glicanos, sacáridos (que incluyen, pero no están limitados a: galactosa, derivados de galactosa, mañosa y derivados de mañosa), vitaminas, folato, biotina, aptámeros y péptidos (que incluyen, pero no están limitados a: péptidos que contienen RGD, insulina, EGF y transíerrina ) . Los ejemplos de grupos de fijación como objetivo incluyen aquellos que fijan como objetivo el receptor de asialoglicoproteina por medio del uso de asialoglicoproteinas o residuos de galactosa. Por ejemplo, los hepatocitos del hígado contienen Receptores de ASGP. Por lo tanto, los grupos de fijación como objetivo que contienen galactosa se pueden utilizar para fijar como objetivo los hepatocitos. Los grupos de fijación como objetivo que contienen galactosa incluyen, pero no están limitados a: galactosa, N-acetilgalactosamina, oligosacáridos y agrupaciones de sacáridos (tales como: Tyr-Glu-Glu- ( aminohexil GalNAc)3, agrupaciones de galactosa a base de lisina y agrupaciones de galactosa a base de colano) . Los conjugados adecuados, adicionales pueden incluir oligosacáridos que pueden enlazarse a dominios de reconocimiento de carbohidratos (CRD, por sus siglas en inglés) encontrados en el receptor de asialoglicoproteinas (ASGP-R, por sus siglas en inglés) . Las porciones de conjugados ejemplares que contienen oligosacáridos y/o complejos de carbohidratos se proporcionan en la Patente Norteamericana No. 6,525,031. Como se utiliza en este documento, un modificador de carga es un grupo que altera la carga de un grupo iónico en un polímero. El modificador de carga puede neutralizar un grupo cargado en un polímero o invertir la carga, de positiva a negativa o de negativa a positiva, de un ión de polímero. La modificación de carga de un poli-ión puede reducir la carga del poli-ión, formar un poli-ión de carga opuesta o formar un polianfolito . La modificación de carga también se puede utilizar para formar un polímero con una carga neta deseada o potencial zeta. Los conjugados con carga neta casi neutra o potencial zeta se prefieren para el suministro in vivo de polinucleótidos . Un modificador de carga preferido modifica reversiblemente un grupo cargado o iónico. Los modificadores de carga reversible se pueden seleccionar del grupo que comprende: CDM, DM, CDM-tioéster, CDM-agente de enmascaramiento, CDM-estabilizador estérico, CDM-ligando, CDM-PEG y CDM-galactosa . El potencial zeta es una propiedad física la cual es exhibida por cualquier partícula en suspensión y está relacionada estrechamente con la carga de la superficie. En medios acuosos, el pH de la muestra es uno de los factores más importantes que afecta el potencial zeta. Cuando la carga se basa en la protonación/desprotonación de bases/ácidos, la carga es dependiente del pH. Por lo tanto, un valor de potencial zeta debe incluir condiciones de solución, especialmente pH, que son significativas. Para las partículas típicas, la magnitud del potencial zeta proporciona una indicación de la estabilidad potencial del sistema coloidal. Si todas las partículas en suspensión tienen un potencial zeta negativo o positivo grande entonces tenderán a repelerse entre sí y no habrá una tendencia para las partículas a juntarse. Sin embargo, si las partículas tienen valores bajos de potencial zeta entonces no habrá una fuerza para impedir que las partículas se junten y se floculen. La línea divisoria general entre las suspensiones estables e inestables para partículas típicas se toma generalmente en ya sea +30 o -30 mV. Las partículas con potenciales zeta más positivos que +30 mV o más negativos que -30 mV se consideran normalmente estables. En este punto se muestra que los conjugados de polinucleótido-polímero enmascarados con CDM pueden formar partículas pequeñas, <20 nm o <10 nm (medidas por medio de la dispersión dinámica de luz, ultracentrifugación analítica o microscopía de fuerza atómica) que son estables a pesar de tener un potencial zeta entre +30 y -30 mV en sal fisiológica y pH 9. La carga neta, o potencial zeta de los conjugados de polinucleótido-polímero de la invención, puede ser controlada por la unión de los agentes de enmascaramiento o modificadores de carga. La carga del polímero, especialmente la carga positiva, puede dar por resultado · interacciones indeseadas con componentes del suero o células no objetivo. Al proteger la carga con estabilizadores esféricos o la modificación de la carga, los conjugados se pueden hacer fácilmente con una carga de la superficie aparente casi neutra. Al modificar los grupos cargados en el polímero, se pueden hacer partículas estables de suero en las cuales el potencial zeta, medido a pH 9, está entre +30 y -30 mV, entre +20 y -20 mV, entre +10 y -10 mV o entre +5 y -5 mV. A pH 7, se esperaría que la carga neta del conjugado fuera más positiva que a pH 9. La carga neta, o carga de la superficie, es un factor significativo en el suministro de complejos de polinucleótidos in vivo. Unión lábil Una unión o conector es una conexión entre dos átomos que une un grupo químico o segmento de interés a otro grupo químico o segmento de interés por vía de uno o más enlaces covalentes. Por ejemplo, una unión puede conectar un polinucleótido o agente de enmascaramiento a un polímero. La formación de una unión puede conectar dos moléculas separadas en una molécula individual o puede conectar dos átomos en la misma molécula. La unión puede ser de carga neutra o puede llevar una carga positiva o negativa. Una unión reversible o lábil contiene un enlace reversible o lábil. Una unión puede incluir opcionalmente un separador que incrementa la distancia entre los dos átomos unidos. Un separador puede agregar además flexibilidad y/o longitud a la unión. Los separadores pueden incluir, pero no están limitados a: grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos arilo, grupos aralquilo, grupos aralquenilo, grupos aralquinilo, cada uno de los cuales puede contener uno o más heteroátomos y heterociclos . Los grupos separadores son bien conocidos en el campo y la lista anterior no tiene por objeto limitar el alcance de la invención. Un enlace reversible o lábil es un enlace covalente diferente de un enlace covalente a un átomo de hidrógeno que puede ser roto o escindido selectivamente bajo condiciones que no romperán o escindirán otros enlaces covalentes en la misma molécula. Más específicamente, un enlace reversible o lábil es un enlace covalente que es menos estable (termodinámicamente) o se rompe más rápidamente (cinéticamente) bajo condiciones apropiadas diferentes de los enlaces covalentes no .lábiles en la misma molécula. La escisión de un enlace lábil dentro de una molécula puede dar por resultado la formación de dos o más moléculas. Para aquellas personas expertas en el campo, la escisión o la habilidad de un enlace se plantea generalmente en términos de vida media (t½) de la escisión del enlace o el tiempo requerido para que la mitad de los enlaces sean escindidos. Los enlaces ortogonales son enlaces que son escindidos bajo condiciones que escinden uno y no el otro. Dos enlaces se consideran ortogonales si sus vidas medias de escisión en un ambiente definido son 10 veces o más diferentes unas de las otras. De esta manera, los enlaces reversibles o lábiles incluyen enlaces que pueden ser escindidos selectivamente de una manera más rápida que otros enlaces de una molécula. La presencia ¦ de grupos donantes o retiradores de electrones se puede localizar en una molécula suficientemente cerca al enlace escindible de tal manera que los efectos electrónicos de los grupos donantes o retiradores de electrones influyen en la velocidad de escisión del enlace. Los grupos retiradores de electrones (E G, por sus siglas en inglés) son átomos o partes de moléculas que retiran la densidad de electrones de otro átomo, enlace o parte de la molécula en donde existe una disminución en la densidad de electrones para el enlace de interés (donante) . Los grupos donantes de electrones (EDG, por sus siglas en inglés) son átomos o partes de moléculas que donan electrones a otro átomo, enlace o parte de la molécula en donde existe una densidad de electrones incrementada para el enlace de interés (receptor) . Los grupos retiradores/donantes de electrones necesitan estar en una proximidad suficientemente estrecha para ejercer una influencia, la cual es típicamente dentro de aproximadamente 3 enlaces del enlace que se rompe. Otra estrategia para incrementar la velocidad de escisión de enlace es incorporar grupos funcionales en la misma molécula qúe el enlace lábil. La proximidad de los grupos funcionales entre sí dentro de una molécula puede ser tal que la reacción intramolecular es favorecida con relación 'a una reacción intermolecular. La proximidad de grupos funcionales entre sí dentro de la molécula puede dar por resultado en efecto concentraciones localmente más altas de los grupos funcionales. En general, las reacciones intramoleculares son mucho más rápidas que las reacciones intermoleculares. Los grupos reactivos separados por 5 y 6 átomos pueden formar enlaces particularmente lábiles debido a la formación de estados de transición de anillos de 5 y 6-miembros. Los ejemplos incluyen tener derivados de ácido carboxilico (ácidos, ésteres, amidas) y alcoholes, tioles, ácidos carboxilicos o aminas en la misma molécula que reaccionan juntos para hacer ésteres, ésteres carboxilicos y de carbonato, ésteres de fosfato, ésteres de tiol, anhídridos ácidos o amidas. Las interacciones esféricas también pueden cambiar la velocidad de escisión para un enlace. Las condiciones apropiadas son determinadas por el tipo de enlace lábil y son bien conocidas en la química orgánica. Un enlace lábil puede ser sensible al pH, condiciones oxidantes o reductivas o agentes, temperatura, concentración de sal, presencia de una enzima o presencia de un agente agregado. Por ejemplo, ciertos conectores de péptidos, ésteres o sacáridos pueden ser escindidos en presencia de la enzima apropiada. En otro ejemplo, el pH incrementado o disminuido puede ser la condición apropiada para un enlace lábil al pH. En todavía otro ejemplo, las condiciones oxidantes pueden ser las condiciones apropiadas para un enlace lábil de manera oxidante. En todavía otro ejemplo, las condiciones reductivas pueden ser las condiciones apropiadas para un enlace lábil de manera reductiva. Por ejemplo, un disulfuro construido a partir de dos tioles de alquilo se puede romper por medio de la reducción en presencia de tioles, sin la escisión de enlaces de carbono-carbono. En este ejemplo, los enlaces de carbono-carbono no son lábiles hacia las condiciones de reducción. La velocidad a la cual un grupo lábil se someterá a la transformación puede ser controlada al alterar los constituyentes químicos de la molécula que contiene el grupo lábil. Por ejemplo, la adición de porciones químicas particulares (por ejemplo, receptores o donantes de electrones) cerca del grupo lábil puede afectar las condiciones particulares (por ejemplo, pH) bajo las cuales ocurrirá la transformación química. Las moléculas pueden contener uno o más enlaces reversibles o lábiles. Si más de un enlace reversible o lábil está presente en la molécula y todos los enlaces reversibles o lábiles son del mismo tipo (escindidos a aproximadamente la misma velocidad bajo las mismas condiciones), entonces la molécula contiene múltiples enlaces reversibles o lábiles. Si más de un enlace reversible o lábil está presente en la molécula y los enlaces reversibles o lábiles son de tipos diferentes (con base en ya sea las condiciones apropiadas para la habilidad o el grupo funcional químico de los enlaces lábiles), entonces la molécula contiene enlaces reversibles o lábiles ortogonales. Los enlaces reversibles o lábiles ortogonales proporcionan la capacidad para escindir un tipo de enlace reversible o lábil mientras que deja un segundo tipo de enlace reversible no escindido o roto. En otras palabras, dos enlaces lábiles son ortogonales entre si, si uno puede ser escindido bajo condiciones que dejan el otro intacto. Los grupos protectores ortogonales son bien conocidos en la química orgánica y comprenden enlaces ortogonales . Como se utiliza en este documento, un enlace fisiológicamente lábil es un enlace lábil que es escindible bajo condiciones encontradas normalmente o análogas a aquellas encontradas dentro del cuerpo de un mamífero. Los grupos de unión fisiológicamente lábiles se seleccionan de tal manera que se someten a una transformación química (por ejemplo, escisión) cuando están presentes en cierta condiciones fisiológicas. Como se utiliza en este documento, un enlace celular fisiológicamente lábil es un enlace lábil que es escindible bajo condiciones intracelulares en mamíferos. Las condiciones intracelulares en mamíferos incluyen condiciones químicas tales como pH, temperatura, condiciones o agentes oxidantes o reductivos y concentración de sal encontrados en o análogos a aquellos encontrados en células de mamíferos. Las condiciones intracelulares de mamíferos también incluyen la presencia de actividad enzimática que está presente normalmente en una célula de mamífero tal como de enzimas proteolíticas o hidrolíticas . Un enlace celular fisiológicamente lábil también puede ser escindido en respuesta a la administración de un agente exógeno farmacéuticamente aceptable. Los enlaces fisiológicamente lábiles que son escindidos con una vida media menor de 45 minutos se consideran muy lábiles. Los enlaces fisiológicamente lábiles que son escindidos con una vida media menor de 15 minutos se consideran extremadamente lábiles . La transformación química (escisión del enlace lábil) se puede iniciar por medio de la adición de un agente farmacéuticamente aceptable a la célula o puede ocurrir espontáneamente cuando una molécula que contiene el enlace lábil alcanza un ambiente intra- y/o extra-celular apropiado. Por ejemplo, un enlace lábil al pH puede ser escindido cuando la molécula entra en un endosoma acidificado. De esta manera, se puede considerar que un enlace lábil al pH es un enlace escindible por endosomas. Los enlaces escindibles por enzimas pueden ser escindidos cuando se exponen enzimas tales como aquellas presentes en un endosoma o lisosoma o en el citoplasma. Un enlace de disulfuro puede ser escindido cuando la molécula entra al ambiente más reductor del citoplasma de la célula. De esta manera, se puede considerar que un disulfuro es un enlace escindible citoplásmico. Enlace lábil al pH: Como se utiliza en este documento, un enlace lábil al pH es un enlace lábil que se rompe selectivamente bajo condiciones ácidas (pH<7). Estos enlaces también se pueden denominar enlaces endosómicamente lábiles, puesto que los endosomas y lisosomas de la célula tienen un pH menor que 7. El término lábil al pH incluye enlaces que son lábiles al pH, muy lábiles al pH y extremadamente lábiles al pH. Los enlaces lábiles al pH se pueden seleccionar del grupo que comprende: a) cetales que son lábiles en ambientes ácidos (pH menor que 7, mayor que 4) para formar un diol y una cetona, b) acétales que son lábiles en ambientes ácidos (pH menor que 7, mayor que 4) para formar un diol y un aldehido, c) iminas o iminios que son lábiles en ambientes ácidos (pH menor que 7, mayor que 4) para formar una amina y un aldehido o una cetona, d) uniones de silicio-oxigeno-carbono que son lábiles bajo condiciones ácidas, e) uniones de silicio-nitrógeno (silazanos) y f) uniones de silicio-carbono (arilsilanos, vinilsilanos y alilsilanos) . g) enlaces de maleamatos-amida sintetizados a partir de derivados de anhídrido maleico y aminas h) orto-ésteres i) hidrazonas j) derivados de ácido carboxilico activados (ésteres, amidas) diseñados para someterse a la hidrólisis catalizada por ácido, k) éteres vinilicos. Los organosilanos han sido utilizados durante mucho tiempo como grupos protectores de oxigeno en la síntesis orgánica debido a tanto la facilidad en la preparación (de la unión de silicio-oxígeno-carbono) y la remoción fácil del grupo protector bajo condiciones ácidas. Por ejemplo, los éteres silílicos y éteres sililenolílieos , poseen ambos esta unión. Las uniones de silicio-oxígeno-carbono son susceptibles a la hidrólisis bajo condiciones ácidas que forman silanoles y un alcohol (o enol). La sustitución en cada uno del átomo de silicio y el carbono de alcohol puede afectar la velocidad de hidrólisis debido a efectos estéricos y electrónicos. Esto permite la posibilidad de ajustar la velocidad de hidrólisis de la unión de silicio-oxígeno-carbono al cambiar la sustitución en ya sea el organosilano, el alcohol o tanto el organosilano como el alcohol para facilitar el efecto deseado. Además, los grupos cargados o reactivos tales como aminas o carboxilato, se pueden unir al átomo de silicio, el cual confiere al compuesto lábil una carga y/o reactividad. La hidrólisis de un silazano conduce a la formación de un silanol y una amina. Los silazanos son inherentemente más susceptibles a la hidrólisis que a la unión de silicio-oxigeno-carbono, sin embargo, la velocidad de hidrólisis se incrementa bajo condiciones ácidas. La sustitución en tanto el átomo de silicio como la amina puede afectar la velocidad de hidrólisis debido a efectos estéricos y electrónicos. Esto permite la posibilidad de ajustar la velocidad de hidrólisis del silizano al cambiar la sustitución en ya sea el silicio o la amina para facilitar el efecto deseado. Otro ejemplo de un enlace lábil al pH es el uso de un enlace de éter enólico lábil al ácido. La velocidad a la cual es escindido este enlace lábil depende de las estructuras del compuesto de carbonilo formado y el alcohol liberado. Por ejemplo, los análogos de éter isopropenilico de etilo, los cuales se pueden sintetizar a partir de ß-haloéteres, tienen vidas medias de aproximadamente 2 minutos a pH 5. Los análogos de éter ciclohexenílico de etilo, los cuales se pueden sintetizar a partir de éteres fenólicos, tienen vidas medias de aproximadamente 14 minutos a pH 5. La reacción de un anhídrido con una amina forma una amida y un ácido. Típicamente, la reacción inversa (formación de un anhídrido y una amina) es muy lenta y desfavorable energéticamente. Sin embargo, si el anhídrido es un anhídrido cíclico, la reacción con una amina produce una molécula en la cual la amida y el ácido están en la misma molécula, un ácido de amida. La presencia de ambos grupos reactivos (la amida y el ácido carboxilico) en la misma molécula acelera la reacción inversa. En particular, el producto de aminas primarias con anhídrido maleico y derivados de anhídrido maleico, ácidos maleámicos, vuelve a la amina y el anhídrido 1 x 109 a 1 x 1013 veces más rápido que sus análogos no cíclicos (Kirby 1980) . Reacción de una amina con un anhídrido para formar una amida y un ácido Reacción de una amina con un anhídrido cíclico para formar un ácido de amida La escisión del ácido de amida para formar una amina y un anhídrido es dependiente del pH y se acelera en gran medida en un pH ácido. La reactividad dependiente del pH se puede explotar para formar enlaces y conectores sensibles al pH, reversibles. El ácido cis-aconítico se ha utilizado como esta molécula conectora sensible al pH. El ?-carboxilato se acopla primero a una molécula. En un segundo paso, ya sea el a- o ß-carboxilato se acopla a una segunda molécula para formar un acoplamiento sensible al pH de las dos moléculas. La vida media para la escisión de este conector a pH 5 es entre 8 y 24 horas. Estructuras de anhídrido cis-aconítico y anhídrido maleico ácido aconítico sistema de anhídrido maleico El pH al cual ocurre la escisión se controla por medio de la adición de constituyentes químicos a la porción lábil. La velocidad de conversión de ácidos maleámicos a aminas y anhídridos maleicos es poderosamente dependiente de la sustitución (R2 y R3) del sistema de anhídrido maleico. Cuando R2 es metilo, la velocidad de conversión es 50 veces más alta que cuando R2 y R3 son hidrógeno. Cuando existen sustituciones de alquilo en tanto R2 como R3 (por ej emplo, 2 , 3-dimetilmaleicanhídrido) el incremento de la velocidad es dramático, 10,000 veces más rápido que el anhídrido maleico no sustituido. El enlace de maleamato formado a partir de la modificación de una amina con anhídrido 2 , 3-dimetilmaleico es escindido para restaurar el anhídrido y la amina con una vida media entre 4 y 10 minutos a pH 5. Se anticipa que si R2 y R3 son grupos mayores que hidrógeno, la velocidad de conversión de ácido de amida a amina y anhídrido será más rápida que si R2 y/o R3 son hidrógeno. Enlace muy lábil al pH: Un enlace muy lábil al pH tiene una vida media para la escisión a pH 5 menor de 45 minutos. La construcción de enlaces muy lábiles al pH es bien conocida en el campo químico. Enlaces extremadamente lábiles al pH: Un enlace extremadamente lábil al pH tiene una vida media para la escisión a pH 5 menor de 15 minutos. La construcción de enlaces extremadamente lábiles al pH es bien conocida en el campo químico. Unión del polinucleótido al polímero La mayoría de métodos previos para el suministro del polinucleótido a las células han dependido de la formación de complejos del ácido nucleico aniónico con un agente de suministro catiónico tal como un polímero catiónico o lípido catiónico. Los complejos electrostáticos con polinucleótidos más grandes, por ejemplo plásmidos, tienden a agregarse y volverse grandes, >500 nm, en soluciones fisiológicas. Los polinucleótidos más pequeños, oligonucleótidos , debido a su tamaño pequeño, forman complejos electrostáticos inestables con agentes de suministro potenciales. Un método más efectivo para empacar polinucleótidos es unir covalentemente el polinucleótido al vehículo de suministro.

Sin embargo, la unión al polímero puede inhibir la actividad del polinucleótido en la célula. Se ha descubierto que al unir el polinucleótido al polímero por vía de un conector reversible que se rompe después de que el polinucleótido es suministrado a la célula, es posible suministrar un polinucleótido funcionalmente activo a una célula in vivo. El conector reversible se selecciona de tal manera que se somete a una transformación química (por ejemplo, escisión) cuando está presente en ciertas condiciones fisiológicas (por ejemplo, el ambiente reductor del citoplasma de la célula) . La unión de un polinucleótido a un polímero de suministro o activo en la membrana mejora el suministro del polinucleótido a una célula in vivo. La liberación del polinucleótido del polímero, por medio de la escisión del enlace reversible, facilita la interacción del polinucleótido con los componentes celulares apropiados para la actividad. Además de los polinucleótidos, otro suministro de otras moléculas impermeables hacia la membrana o moléculas con una baja permeabilidad hacia la membrana se pueden suministrar a células in vivo utilizando los vehículos de suministro de policonj ugados descritos. Las moléculas adecuadas para la unión reversible a un polímero activo en la membrana incluyen: proteínas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, factores de transcripción, fármacos de moléculas pequeñas, fármacos carcinostáticos y otras moléculas sintéticas que incluyen aquellas que afectan la transcripción . La unión de la molécula impermeable hacia la membrana a un polímero activo en la membrana hace posible la formación de un vehículo de suministro in vivo dimensionado apropiadamente. Los conjugados moleculares descritos son esencialmente poliméricos y tienen un tamaño y propiedades de fijación como objetivo similares que aquellas observadas para otros polímeros. Para el suministro intravascular (sistema), el vehículo necesita ser capaz de cruzar la barrera endotelial a fin de alcanzar las células parenquimatosas de interés. Las fositas endoteliales más grandes (orificios en la barrera endotelial) ocurren en el hígado y tienen un diámetro promedio de aproximadamente 100 nm. Los poros trans-epiteliales en otros órganos son mucho más pequeños. Por ejemplo, el endotelio muscular se puede describir como una estructura la cual tiene un gran número de poros pequeños con un radio de 4 nm y un número bajo de poros grandes con un radio de 20-30 nm. El tamaño del vehículo de suministro de polinucleótido también es importante para el proceso de captación celular. Se piensa que la internalización celular a través de endocitosis está limitada a complejos de aproximadamente 100 nm de diámetro, el tamaño de las vesículas de endocitosis. Los conjugados descritos son menores de 100 nm, más preferiblemente menores de 50 nM y más preferiblemente menores de 20 nM o menores de 10 nm. La ultrafiltración renal es una de las rutas principales de eliminación de proteínas hidrófilas, polímeros y conjugados de polímero-proteína de la sangre. Entre los parámetros que afectan este proceso están la composición química, tamaño, carga. Las proteínas globulares más grandes que aproximadamente 70 kDa son excluidas en gran medida de la eliminación por la ultrafiltración renal. Por lo tanto, la conjugación de estabilizadores estéricos tal como PEG disminuye la eliminación renal al incrementar el tamaño molecular efectivo de polímeros a los cuales se unen. La ultrafiltración de PEGs con un peso molecular más bajo que 8 kDa no está restringida, mientras que la ultrafiltración de PEGs en el intervalo de 8-30 kDa está gobernada por el tamaño molecular. Con un peso molecular que excede 30 kDa, la eliminación de PEG se disminuye dramáticamente. Por esta razón, se prefieren los conjugados enmascarados de polímero-polinucleótido en los cuales el tamaño total es más grande que aproximadamente 10 kDa, más grande que aproximadamente 20 kDa o más grande que aproximadamente 30 kDa. Además de disminuir la ultrafiltración por los ríñones, un incremento en el peso molecular de un polímero puede promover la acumulación dentro de tejidos permeables, tales como tumores, por medio del mecanismo de permeación y retención mejorado, pasivo.

Polinucleótido El término polinucleótido, o ácido nucleico o ácido polinucleico, es un término de la técnica que se refiere a un polímero que contiene por lo menos dos nucleótidos. Los nucleótidos son las unidades monoméricas de polímeros de polinucleótidos . Los polinucleótidos con menos de 120 unidades monoméricas se denominan frecuentemente oligonucleótidos . Los ácidos nucleicos naturales tienen una estructura principal de fosfato de desoxirribosa o ribosa. Un polinucleótido no natural o sintético es un polinucleótido que se polimeriza in vitro o en un sistema libre de células y contiene las bases idénticas o similares pero puede contener una estructura principal de un tipo diferente de la estructura principal de fosfato de ribosa o desoxirribosa natural. Los polinucleótidos se pueden sintetizar utilizando cualquier técnica conocida en el campo. Las estructuras principales de polinucleótidos conocidas en el campo incluyen: PNAs (ácidos nucleicos de péptidos), fosforotioatos , fosforodiamidatos , morfolinos y otras variantes de la estructura principal de fosfato de los ácidos nucleicos nativos. Las bases incluyen purinas y pirimidinas, las cuales incluyen además los compuestos naturales adenina, timina, guanina, citosina, uracilo, inosina y análogos naturales. Los derivados sintéticos de purinas y pirimidinas incluyen, pero no están limitados a, modificaciones las cuales colocan nuevos grupos reactivos en el nucleótido tales como, pero no están limitados a, aminas, alcoholes, tioles, carboxilatos y haluros de alquilo. El término base incluye cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN. El término polinucleótido incluye ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN) y combinaciones de ADN, ARN y otros nucleótidos naturales y sintéticos. El ADN puede estar en la forma de ADNc, ADN polimerizado in vitro, ADN plásmido, partes de un ADN plásmido, material genético derivado de un virus, ADN lineal, vectores (Pl, PAC, BAC, YAC y cromosomas artificiales), vectores de expresión, casetes de expresión, secuencias quiméricas, ADN recombinante, ADN cromosómico, un oligonucleótido, ADN antisentido o derivados de estos grupos. El ARN puede estar en la forma de ARN mensajero (ARNm) , ARN polimerizado in vitro, ARN ' recombinante,, ARN de oligonucleótido, ARN de transferencia (ARNt) , ARN nuclear pequeño (ARNnp) , ARN ribosómico (ARNr) , secuencias quiméricas, ARN antisentido, ARN interférente, ARN interferente pequeño (ARNip) , microARN (miARN) , ribozimas, secuencias guia externas, ARNs no mensajeros pequeños (ARNnmp) , ARN no traducido (ARNnt) , ARNsno (tetracosámeros, ARNnmp modificado que actúa por medio de un mecanismo antisentido) , ARNs no codificante muy pequeños (ARNncmp) , ARN horquilla pequeño (ARNhp) o derivados de estos grupos.

Además, el ADN y el ARN pueden ser monocatenarios , bicatenarios, tricatenarios o tetracatenarios . El polinucleótido bicatenario, tricatenario y tetracatenario puede contener tanto ARN como ADN u otras combinaciones de ácidos nucleicos naturales y/o sintéticos. Un polinucleótido de bloqueo es un polinucleótido que interfiere con la función o expresión del ADN o ARN. Los polinucleótidos de bloqueo no se traducen en la proteina pero su presencia o expresión en una célula altera la expresión o función de genes o ARN celular. Los polinucleótidos de bloqueo causan la degradación de o inhibición de la función o traducción de un ARN celular especifico, usualmente un ARNm, de una manera especifica para la secuencia. De esta manera, la inhibición de un ARN puede inhibir efectivamente la expresión de un gen a partir del cual se transcribe el ARN. Como se utiliza en este documento, un polinucleótido de bloqueo se puede seleccionar de la lista que comprende: oligonucleótido antisentido, polinucleótido de interferencia de ARN, ARNbc, ARNip, miARN, ARNh, ribozima, ribozima de cabeza de martillo, secuencias guia externas (Patente Norteamericana 5,962,426), ARNsno, ADN transcrito en ARN Polimerasa II de oligonucleótido formador de una hélice triple que codifica un polinucleótido de bloqueo, ADNs transcritos en ARN Polimerasa III que codifican un polinucleótido de bloqueo. El polinucleótido de bloqueo puede ser ADN, ARN, combinación de ARN y ADN o puede contener nucleótidos no natürales o sintéticos. Los polinucleótidos de bloqueo se pueden polimerizar in vitro, pueden ser recombinantes , contienen secuencias quiméricas o derivados de estos grupos. Un polinucleótido de bloqueo puede contener ribonucleótidos , desoxirribonucleótidos, nucleótidos sintéticos o cualquier combinación adecuada de tal manera que el ARN o gen objetivo es inhibido. Un polinucleótido de interferencia mediada por el ARN (iARN) es una molécula capaz de inducir la interferencia mediada por el ARN a través de la interacción con la maquinaria de la vía de interferencia mediada por el ARN de células de mamífero para degradar o inhibir la traducción de transcripciones de ARN mensajero (ARNm) de un transgen de una manera específica para la secuencia. Dos polinucleótidos de iARN primarios son ARN interferentes pequeños (o cortos) (ARNips) y microARNs (miARNs) . Sin embargo, se ha mostrado que otros polinucleótidos median la interferencia mediada por el ARN, los polinucleótidos de iARN se pueden seleccionar del grupo que comprende: ARNip, microARN, ARN bicatenario (ARNbc) , ARN de horquilla corto (ARNhc) y casetes de expresión que codifican el ARN capaz de inducir la interferencia mediada por el ARN. El ARNip comprende una estructura bicatenaria que contiene típicamente 15-50 pares de bases y preferiblemente 21-25 pares de bases y que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica (perfectamente complementaria) o casi idéntica (parcialmente complementaria) a una secuencia de codificación en un gen o ARN objetivo expresado dentro de la célula. Un ARNip puede tener proyecciones 3' de dinucleótido . Un ARNip puede estar compuesto de dos polinucleótidos hibridizados o un polinucleótido individual que forma una estructura de horquilla. Una molécula de ARNip de la invención comprende una región homosentido y una región antisentido. En una modalidad, el ARNip del conjugado se ensambla de dos fragmentos de oligonucleótidos , en donde un fragmento comprende la secuencia de nucleótidos de la cadena antisentido de la molécula de ARNip y un segundo fragmento comprende una secuencia de nucleótidos de la región homosentido de la molécula de ARNip. En otra modalidad, la cadena homosentido se conecta a la cadena antisentido por vía de una molécula conectora, tal como un conector de polinucleótido o un conector que no es nucleótido. Los microARNs (miARNs) son productos génicos de ARN no codificante pequeño de aproximadamente 22 nt de largo que dirigen la destrucción o represión por traducción de sus objetivos de ARNm. Si la complementariedad entre el miARN y el ARNm objetivo es parcial, entonces la traducción del ARNm objetivo se reprime, mientras que si la complementariedad es extensiva, el ARNm objetivo es escindido. Para los miARNs, el complejo se enlaza a los sitios objetivo localizados usualmente en ' la UTR 3' de los ARNms que comparten típicamente una homología solo parcial con el miARN. Una "región semilla" - un tramo de aproximadamente 7 nucleótidos consecutivos en el extremo 5' del miARN que forma un apareamiento de bases perfecto con su objetivo - juega un papel clave en la especificidad del miARN. El enlace del complejo de RISC/miARN al ARNm puede conducir a ya sea la represión de la traducción de proteínas o la escisión y degradación del ARNm. Los datos recientes indican que la escisión del ARNm sucede preferentemente si existe una homología perfecta a lo largo de la longitud completa del miARN y su objetivo en lugar de mostrar un apareamiento de bases perfecto solo en la región semilla (Pillai y colaboradores 2007). Un oligonucleótido antisentido comprende un polinucleótido que contiene una secuencia que es complementaria para una secuencia presente en un ARNm objetivo. El oligonucleótido antisentido se enlaza al (pares de bases con) ARNm de una manera específica para la secuencia. Este enlace puede impedir que otras enzimas celulares se enlacen al ARNm, conduciendo en consecuencia a la inhibición de la traducción del ARNm o la degradación del ARNm.

Las secuencias guia externas son oligorribonucleótidos antisentido cortos que inducen la escisión mediada por P de ARNasa de un ARN objetivo al formar un complejo tipo ARNt precursor (Patente Norteamericana 5,624,824). Las ribozimas son típicamente oligonucleótidos de ARN que contienen una secuencia complementaria para el ARN mensajero objetivo y una secuencia de ARN que actúa como una enzima para escindir el ARN mensajero. La escisión del ARNm impide la traducción. Un oligonucleótido que forma el polinucleótido de bloqueo puede incluir una porción de tapa terminal en el extremo 5' , el extremo 3' o tanto el extremo 5' como el extremo 3' . La porción de tapa puede ser, pero no está limitada a, una porción abásica de desoxi invertida, una porción de desoxi-timidina invertida, una porción de timidina o una modificación de glicerilo 3' . Los ADNs transcritos en ARN polimerasa II y III se pueden transcribir en la célula para producir ARNs de horquilla pequeños que pueden funcionar como ARNip, ARNip de cadena lineal homosentido y antisentido separados, ribozimas o ARNs lineales que pueden funcionar como ARN antisentido. Los ADNs transcritos en ARN polimerasa III contienen promotores seleccionados de la lista que comprende: promotores U6, promotores Hl y promotores de ARNt. Los promotores de ARN polimerasa II incluyen los promotores Ul, U2, U4 y U5, promotores de ARNnp, promotores de microARN y promotores de ARNm. Las listas de secuencias de miARN conocidas se pueden encontrar en bases de datos mantenidas por organizaciones de investigación tales como Wellcome Trust Sanger Institute, Penn Center for Bioinformatics , Memorial Sloan Kettering Cáncer Center y European Molecule Biology Laboratory, entre otras. Las secuencias de ARNip efectivas, conocidas y sitios de enlace cognados también están bien representados en la bibliografía relevante. Las moléculas de iARN se diseñan fácilmente y se producen por medio de tecnologías conocidas en el campo. Además, existen herramientas de computación que incrementan la probabilidad de descubrir configuraciones de secuencias efectivas y específicas (Pei y colaboradores 2006, Reynolds y colaboradores 2004, Khvorova y colaboradores 2003, Schwarz y colaboradores 2003, Ui-Tei y colaboradores 2004, Heale y colaboradores 2005, Chalk y colaboradores 2004, Amarzguioui y colaboradores 2004). Los polinucleótidos de la invención se pueden modificar químicamente. El uso de un polinucleótido modificado químicamente puede mejorar varias propiedades del polinucleótido que incluyen, pero no están limitadas a: resistencia a la degradación por nucleasa ín vivo, captación celular, actividad e hibridación especifica para la secuencia. Los ejemplos no limitantes de esta modificaciones químicas incluyen: uniones internucleótidos de fósforotioato, ribonucleótidos de 2' -O-metilo, ribonucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, ribonucleótidos de 2'-desoxi, nucleótidos de "base universal", nucleótidos de 5-C-metilo e incorporación de residuos abásicos de desoxi invertidos. Se muestra que estas modificaciones químicas, cuando se utilizan en varias construcciones de polinucleótidos , conservan la actividad de polinucleótido en células mientras que al mismo tiempo, incrementan dramáticamente la estabilidad en el suero de estos compuestos. El ARNip modificado químicamente también puede minimizar la posibilidad de estimular la actividad de interferón en humanos. En una modalidad, el polinucleótido de iARN modificado químicamente de la invención comprende una estructura dúplex que tiene dos cadenas, una o ambas de las cuales se pueden modificar químicamente, en donde cada cadena es de aproximadamente 19 a aproximadamente 29 (por ejemplo, aproximadamente 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) nucleótidos. En una modalidad, un polinucleótido de iARN de la invención comprende uno o más nucleótidos modificados mientras que mantiene la capacidad para mediar el iARN dentro de una célula o sistema in vitro reconstituido. Un polinucleótido de iARN se puede modificar en donde la modificación química comprende uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) de los nucleotidos. Un polinucleótido de iARN de la invención puede comprender nucleotidos modificados como un porcentaje del número total de nucleotidos presentes en el polinucleótido de iARN. Como tal, un polinucleótido de iARN de la invención puede comprender generalmente nucleotidos modificados de aproximadamente 5 a aproximadamente 100% de las posiciones de nucleotidos (por ejemplo, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de las posiciones de nucleotidos) . El porcentaje real de nucleotidos modificados presentes en un polinucleótido de iARN determinado depende del número total de nucleotidos presentes en el polinucleótido de iARN. Si el polinucleótido de iARN es monocatenario, el porcentaje de modificación se puede basar en el número total de nucleotidos presentes en el polinucleótido de iARN monocatenario. Del mismo modo, si el polinucleótido de iARN es bicatenario, el porcentaje de modificación se puede basar en el número total de nucleotidos presentes en la cadena homosentido, cadena antisentido o tanto la cadena homosentido como la cadena antisentido. Además, el porcentaje real de nucleotidos modificados presentes en un polinucleótido de iARN determinado también puede depender del número total de nucleotidos de purina y pirimidina presentes en el polinucleótido de iARN. Por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina y/o todos los nucleótidos de- purina presentes en el polinucleótido de iARN se modifican. Un polinucleótido de iARN modula la expresión del ARN codificado por un gen. Debido a que los múltiples genes pueden compartir algún grado de homología de secuencias entre sí, se puede diseñar un polinucleótido de iARN para fijar como objetivo una clase de genes con una homología de secuencias suficiente. De esta manera, un polinucleótido de iARN puede contener una secuencia que tiene complementariedad para las secuencias que son compartidas entre' diferentes objetivos de genes o son únicas para un objetivo, de gen específico. Por lo tanto, el polinucleótido de iARN se puede diseñar para fijar como objetivo regiones conservadas de una secuencia de ARN que tienen homología entre varios genes fijando como objetivo en consecuencia varios genes en una familia de genes (por ejemplo, diferentes isoformas de genes, variantes de empalme, genes mutantes, etcétera) . En otra modalidad, el polinucleótido de iARN se puede diseñar para fijar como objetivo una secuencia que es única para una secuencia de ARN específica de un gen individual. El término complementariedad se refiere a la capacidad de un polinucleótido para formar enlace (s) de hidrógeno con otra secuencia de polinucleótido por medio de ya sea el modelo tradicional de Watson-Crick u otros tipos que no son tradicionales. En referencia a las moléculas de polinucleotido de la presente invención, la energía libre de enlace para una molécula de polinucleotido con su objetivo (sitio de enlace efector) o secuencia complementaria es suficiente para permitir que la función relevante del polinucleotido proceda, por ejemplo escisión enzimática de ARNm o inhibición de traducción. La determinación de energías libres de enlace para las moléculas de ácido nucleico es bien conocida en el campo (Frier y colaboradores 1986, Turner y colaboradores 1987). Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de bases, en una cadena contigua, en una primera molécula de polinucleotido la cual puede formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, apareamiento de bases de ( atson-Crick) con una segunda secuencia de polinucleótidos (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 que son 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100% complementarias) . Perfectamente complementaria significa que todas las bases, en una cadena contigua de una secuencia de polinucleotido formarán enlaces de hidrógeno con el mismo número de bases contiguas en una segunda secuencia de polinucleotido. Por inhibir, regular por decremento o reducir la expresión de genes, se propone que la expresión del gen, medida por el nivel de ARN transcrito del gen, o el nivel de polipéptido, proteína o subunidad de proteína traducido del ARN, se reduce abajo de lo que se observa en ausencia de los conjugados de polinucleótido de bloqueo de la invención. La inhibición, regulación por decremento o reducción de expresión de genes, con un polinucleótido suministrado por las composiciones de la invención, está preferiblemente abajo de aquel nivel observado en presencia de un ácido nucleico inactivo de control, un ácido nucleico con una secuencia confusa o con apareamientos erróneos inactivadores o en ausencia de conjugación del polinucleótido al polímero enmascarado . Un polinucleótido suministrado puede permanecer dentro del citoplasma o núcleo apartado del material genético endógeno. Alternativamente, el ADN puede recombinarse con (llegar a ser una parte de) el material genético endógeno. La recombinación puede causar que el ADN sea insertado en el ADN cromosómico por medio de la recombinación ya sea homologa o no homologa. Un polinucleótido se puede suministrar a una célula para expresar una secuencia de nucleótidos exógena, para inhibir, eliminar, aumentar o alterar la expresión de una secuencia de nucleótidos endógena o para afectar una característica fisiológica específica que no está asociada naturalmente con la célula. Los polinucleótidos pueden contener un cásete de expresión codificado para expresar una proteína completa o parcial o ARN. Un cásete de expresión se refiere a un polinucleótido producido de manera natural o recombinante que es capaz de expresar una secuencia. El término recombinante utilizado en este documento se refiere a una molécula de polinucleótido que está comprendida de segmentos de polinucleótido unidos por medio de técnicas biológicas moleculares. El cásete contiene la región de codificación del gen de interés junto con cualquier otra secuencia que afecte la expresión de la secuencia de interés. Un cásete de expresión incluye típicamente un promotor (que permite el inicio de transcripción) y una secuencia transcrita. Opcionalmente, el cásete de expresión puede incluir, pero no está limitado a: potenciadores de transcripción, secuencias no codificadoras, señales de empalme, señales de terminación de transcripción y señales de poliadenilación . Un cásete de expresión de ARN incluye típicamente un codón de inicio de traducción (que permite el inicio de la traducción) y una secuencia que codifica una o más proteínas. Opcionalmente, el cásete de expresión puede incluir, pero no está limitado a, señales de terminación de traducción, una secuencia de poliadenosina . Sitios de entrada de ribosoma internos (IRES, por sus siglas en inglés) y secuencias no codificadoras. El polinucleótido puede contener secuencias que no sirven a una función específica en la célula objetivo pero que se utilizan en la generación del polinucleótido. Estas secuencias incluyen, pero no están limitadas a, secuencias requeridas para la replicación o selección del polinucleótido en un organismo hospedero. El término gen se refiere generalmente a una secuencia de polinucleótido que comprende secuencias de codificación necesarias para la producción de un polinucleótido terapéutico (por ejemplo, ribozima) o un polipéptido o precursor. El polipéptido puede ser codificado por una secuencia de codificación de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia de codificación siempre y cuando se retenga la actividad o propiedades funcionales deseadas (por ejemplo, actividad enzimática, enlace de ligandos, transducción de señales) del polipéptido de longitud completa o fragmento. El término también incluye la región de codificación de un gen y las secuencias inclusivas que están localizadas adyacentes a la región de codificación en los extremos tanto 5' como 3' por una distancia de aproximadamente 1 kb o más en cualquier extremo de tal manera que el gen corresponde a la longitud del ARNm de longitud completa. Las secuencias que están localizadas 5' de la región de codificación y las cuales están presentes en el ARNm son referidas como secuencias no traducidas 5' . Las secuencias que está localizadas 3' o cadena abajo de la región de codificación y las cuales están presentes en el ARNm son referidas como secuencias no traducidas 3' . El término gen incluye tanto ADNc como formas genómicas de un gen. Una forma ge'nómica o clon de un gen contiene la región de codificación interrumpida con secuencias no codificadoras denominadas intrones, regiones intermedias o secuencias intermedias. Los intrones son segmentos de un gen los cuales son transcritos dentro del ARN nuclear. Los intrones pueden contener elementos reguladores tales como potenciadores . Los intrones se retiran o eliminan de la transcripción nuclear o primaria; por lo tanto, los intrones están ausentes en la transcripción de ARN madura. El ARN mensajero (ARNm) funciona durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de aminoácidos en un polipéptido naciente. Un gen también puede incluir otras regiones o secuencias que incluyen, pero no ' están limitadas a, promotores, potenciadores, sitios de enlace de factores de transcripción, señales de poliadenilación, sitios de entrada de ribosomas internos, silenciadores, secuencias de aislamiento, regiones de unión de matriz. Estas secuencias pueden estar presentes cerca de la región de codificación del gen (dentro de 10,000 nucleótidos) o en sitios distantes (más de 10,000 nucleótidos). Estas secuencias no codificadoras influyen en el nivel o velocidad de transcripción y/o traducción del gen. La modificación covalente de un gen puede influir en la velocidad de transcripción (por ejemplo, metilación de ADN genómico) , la estabilidad del ARNm (por ejemplo, longitud de la cola de poliadenosina 3' ) , velocidad de traducción (por ejemplo, espacio ' 5' ) , reparación de ácido nucleico, transporte nuclear e inmunogenicidad. Un ejemplo de una modificación covalente de ácido nucleico involucra la acción de los reactivos LABEL I TMR (Minis Corporation, Madi son , WI ) . Como se utiliza en este documento, el término expresión de genes se refiere al proceso para convertir información genética codificada en un gen en el ARN (por ejemplo, ARN pequeño, ARNip, ARNm, ARNr, ARNt o ARNnp) a través de la transcripción de un gen desoxirribonucleico (por ejemplo, por vía de la acción enzimática de una ARN polimerasa) y para genes que codifican proteínas, en una proteína a través de la traducción del ARNm. La expresión de genes puede ser regulada en muchas etapas en el proceso. La regulación por incremento o activación se refiere a la regulación que incrementa la generación de productos de expresión de genes (es decir, ARN o proteína, mientras que la regulación por decremento o represión se refiere a la regulación que disminuye la producción. Las moléculas (por ejemplo, factores de transcripción) que están involucrados en la regulación por incremento o regulación por decremento son denominadas frecuentemente activadores y represores, respectivamente. El polinucleótido se puede utilizar para propósitos de investigación o para producir un cambio en una célula que puede ser terapéutico. El suministro de un polinucleotido para propósitos terapéuticos se denomina comúnmente terapia génica. El suministro de un polinucleotido puede conducir a la modificación del material genético presente en la célula objetivo. El término transfección estable o transfectado de manera estable se refiere generalmente a la introducción e integración de un polinucleotido exógeno dentro del genoma de la célula transfectada . El término transfectante estable se refiere a una célula la cual ha integrado de manera estable el polinucleotido dentro del ADN genómico. La transfección estable también se puede obtener al utilizar vectores de episoma que son duplicados durante la división de células eucarióticas (por ejemplo, vectores de ADN plásmido que contienen un origen de replicación de virus de papiloma, cromosomas artificiales) . El término transfección transitoria o transfectado de manera transitoria se refiere a la introducción de un polinucleotido dentro de una célula donde el polinucleotido no se integra en el genoma de la célula transfectada . Si el polinucleotido contiene un gen expresable, entonces el cásete de expresión se sujeta a los controles reguladores que gobiernan la expresión de los genes endógenos en los cromosomas. El término transfectante transitorio se refiere a una célula la cual ha tomado un polinucleotido pero no ha integrado el polinucleotido en su ADN genómico.

Formulación El conjugado de polinucleótido-polimero se forma al unir covalentemente el polinucleótido al polímero. El polímero se polimeriza o modifica de tal manera que contiene un grupo reactivo A. El polinucleótido también se polimeriza o modifica de tal manera que contiene un grupo reactivo B. Los grupos reactivos A y B se seleccionan de tal manera que se puedan unir por vía de una unión covalente reversible utilizando métodos conocidos en el campo. La conjugación del polinucleótido al polímero se puede realizar en presencia de un exceso de polímero. Debido a que el polinucleótido y el polímero pueden ser de carga opuesta durante la conjugación, la presencia del polímero en exceso puede reducir o eliminar la agregación del conjugado. Alternativamente, se puede utilizar un exceso de un polímero portador, tal como un policatión. El polímero en exceso se puede retirar del polímero conjugado antes de la administración del conjugado al animal o cultivo de células. Alternativamente, el polímero en exceso se puede co-administrar con el conjugado al animal o cultivo de células. Similarmente, el polímero se puede conjugar al agente de enmascaramiento en presencia de un exceso de polímero o agente de enmascaramiento. Debido a que el polinucleótido y el polímero pueden ser de carga opuesta durante la conjugación, la presencia de polímero en exceso puede reducir o eliminar la agregación del conjugado. Alternativamente, se puede utilizar un exceso de un polímero portador. El polímero en exceso se puede retirar del polímero conjugado antes de la administración del conjugado al animal o cultivo de células. Alternativamente, el polímero en exceso se puede co-administrar con el conjugado al animal o cultivo de células. El polímero se puede modificar antes de o subsecuente a la conjugación del polinucleótido al polímero. Reactivo de transfección El proceso para suministrar un polinucleótido a una célula se ha denominado comúnmente transfección o el proceso de transfección. El término transfección utilizado en este documento se refiere a la introducción de un polinucleótido u otro compuesto biológicamente activo desde el exterior de una célula al interior de la célula de tal manera que el polinucleótido tiene actividad biológica. El polinucleótido se puede utilizar para propósitos de investigación o para producir un cambio en una célula que puede ser terapéutico. El suministro de un polinucleótido puede conducir a la modificación del material genético presente en la célula objetivo. Un reactivo de transfección o vehículo de suministro es un compuesto o compuestos que se enlaza (n) a o que forma (n) complejos con los oligonucleótidos y polinucleótidos y media (n) su entrada en las células. Los reactivos de transfección in vitro, o vehículos de suministro, son compuestos o composiciones de compuestos que se enlazan a o forman complejos con oligonucleótidos y polinucleótidos y median su entrada en las células. Los ejemplos de reactivos de transfeccion incluyen, pero no están limitados a, complejos de proteina y polímero (poliplexos ) , lípidos y liposomas (lipoplexos) , combinaciones de polímeros y lípidos ,( lipopoliplexos ) , productos precipitados de fosfato de calcio y dendrímeros. Típicamente, el reactivo de transfeccion tiene un componente con una carga positiva neta que se enlaza a la carga negativa del oligonucleótido o del polinucleótido . Los agentes de transfeccion catiónicos también pueden condensar ácidos nucleicos grandes. Los agentes de transfeccion también se pueden utilizar para asociar grupos funcionales con un polinucleótido. Los grupos funcionales incluyen señales de fijación como objetivo de células, señales de localización nucleares, compuestos que aumentan la liberación de contenidos de endosomas u otras vesículas intracelulares (tales como compuestos activos en la membrana) y otros compuestos que alteran el comportamiento o interacciones del compuesto o complejo al cual se unen (modificadores de interacciones) . Los polinucleótidos conjugados de la presente invención proporcionan reactivos útiles y métodos para una variedad de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico, de validación de objetivos, de descubrimiento genómico, de ingeniería genética y farmacogenómicas . El polinucleótido conjugado tiene propiedades mejoradas de captación celular en comparación con el mismo polinucleótido no conjugado. Las rutas parenterales de administración incluyen inyecciones intravasculares (intravenosas, intraarteriales) , intramusculares, intraparenquimales , intradérmicas , subdérmicas, subcutáneas, intratumorales , intraperitoneales , intratecales, subdurales, epidurales e intralinfáticas que utilizan una jeringa y una aguja o catéter. Intravascular significa en este documento dentro de una estructura tubular denominada un vaso que está conectada a un tejido u órgano dentro del cuerpo. Dentro de la cavidad de la estructura tubular, un fluido corporal circula a o desde la parte del cuerpo. Los ejemplos de fluido corporal incluyen sangre, fluido cerebroespinal (CSF, por sus siglas en inglés) , fluido linfático o bilis. Los ejemplos de vasos incluyen arterias, arteriolas, vasos capilares, venas pequeñas, sinusoides, venas, conductos linfáticos, conductos biliares y conductos de las glándulas salivales u otras glándulas exocrinas. La ruta intravascular incluye el suministro a través de los vasos sanguíneos tal como una arteria o una vena. El sistema circulatorio de la sangre proporciona una propagación sistémica del producto farmacéutico. Una ruta de administración que involucra las membranas mucosas quiere decir que incluye una ruta nasal, bronquial, inhalación dentro de los pulmones o por vía de los ojos. Intraparenquimal incluye la inyección directa en un tejido tal como el hígado, pulmones, corazón, músculos (músculo esquelético o diafragama) , bazo, páncreas, cerebro (inclusive intraventricular) , médula espinal, ganglio, nodulos linfáticos, tejidos adiposos, tejido tiroideo, glándulas adrenales, ríñones, próstata y tumores. Las rutas transdérmicas de administración han sido afectadas por parches e iontoforesis . Otras rutas epiteliales incluyen las rutas de administración oral, nasal, respiratoria, rectal y vaginal . Los conjugados se pueden inyectar en una solución portadora farmacéuticamente aceptable. Farmacéuticamente aceptable se refiere a aquellas propiedades y/o sustancias las cuales son aceptables para el mamífero desde un punto de vista farmacológico/toxicológico . La frase farmacéuticamente aceptable se refiere a entidades moleculares, composiciones y propiedades que son tolerables fisiológicamente y que no producen típicamente una reacción alérgica u otra reacción adversa o tóxica cuando se administran a un mamífero. Preferiblemente, como se utiliza en este documento, el término farmacéuticamente aceptable significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listada en la Farmacopea Estadounidense u otra farmacopea reconocida generalmente para el uso en animales y más particularmente en humanos. Efecto terapéutico Se ha dado a conocer el suministro de polinucleótidos, que da por resultado la expresión de genes o la inhibición de la expresión de genes reporteros y genes endógenos en tejidos específicos. Los niveles de una expresión de genes reporteros (marcadores) medida después del suministro de un polinucleótido indican una expectativa razonable de niveles similares de expresión de genes después del suministro de otros polinucleótidos. Los niveles de tratamiento considerados como benéficos por una persona que tiene experiencia ordinaria en el campo difieren de enfermedad a enfermedad, por ejemplo: las Hemofilias A y B son causadas o deficiencias en los factores de coagulación unidos a X VIII y IX, respectivamente. Su curso clínico está influenciado en gran medida por el porcentaje de niveles normales en el suero del factor VIII o IX: < 2%, grave; 2-5%, moderado; y 5-30% suave. De esta manera, un incremento de 1% a 2% del nivel normal del factor circulante en pacientes graves se puede considerar benéfico. Los niveles mayores de 6% impiden los sangrados espontáneos pero no aquellos a consecuencia de una cirugía o lesión. Similarmente, la inhibición de un gen no necesita ser 100% para proporcionar un beneficio terapéutico. Una persona que tiene experiencia ordinaria en el campo de la terapia génica anticiparía razonablemente los niveles benéficos de expresión de un gen especifico para una enfermedad con base en los niveles suficientes de resultados de genes marcadores. En el ejemplo de la hemofilia, si los genes marcadores se expresaron para producir una proteina a un nivel comparable en volumen a 2% del nivel normal del factor VIII, se puede esperar razonablemente que el gen que codifica el factor VIII también seria expresado a niveles similares. De esta manera, los genes reporteros o marcadores tales como los genes para luciferasa y ß-galactosidasa sirven como paradigmas útiles para la expresión de proteínas intracelulares en general. Similarmente, los genes reporteros o marcadores fosfatasa alcalina secretada (SEAP) sirven como paradigmas útiles para las proteínas secretadas en general. Un efecto terapéutico de la proteína expresada de un polinucleótido suministrado en la atenuación o prevención de una enfermedad, condición o síntoma puede ser realizado por la proteína ya sea quedándose adentro de la célula, permaneciendo unida a la célula en la membrana o siendo secretada y disasociándose de la célula donde pueda entrar a la circulación general y la sangre. Las proteínas secretadas que pueden ser terapéuticas incluyen hormonas, citocinas, factores de crecimiento, factores de coagulación, proteínas anti-proteasa (por ejemplo alfa-antitripsina) y otras proteínas que están presentes en la sangre. Las proteínas en la membrana pueden tener un efecto terapéutico al proporcionar un receptor para que la célula tome una proteina o lipoproteina . Por ejemplo, el receptor de lipoproteinas de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés) se podría expresar en hepatocitos y niveles más bajos de colesterol en la sangre y prevenir en consecuencia las lesiones ateroscleróticas que pueden causar apoplejías o infarto de miocardio. Las proteínas terapéuticas que se quedan dentro de la célula pueden ser enzimas que eliminan un metabolito tóxico en circulación como en la fenilcetonuria . También pueden causar que una célula cancerosa sea menos proliferativa o cancerosa (por ejemplo menos metastática) . Una proteína dentro de una célula también interferirá con la replicación de un virus. El hígado es uno de los tejidos objetivo más importantes para la terapia génica dado su papel central en el metabolismo (por ejemplo, metabolismo de lipoproteinas en varias hipercolesterolemias ) y la secreción de proteínas circulantes (por ejemplo, factores de coagulación en la hemofilia) . Por lo menos una centena de diferentes trastornos genéticos se podrían corregir potencialmente; por medio de la terapia génica dirigida al hígado. Además, los trastornos adquiridos tales como hepatitis crónica y cirrosis son comunes y también se podrían tratar por medio de terapias al hígado a base de polinucleótidos . Las terapias génicas que implican la expresión heterotrópica de genes agrandarían adicionalmente el número de trastornos tratables por medio de la transferencia de genes dirigida al hígado. Por ejemplo, la diabetes mellitus podría ser tratada por medio de la expresión del gen de insulina dentro de hepatocitos cuya fisiología puede hacer posible la secreción de insulina regulada por glucosa. Además de incrementar o disminuir los genes implicados en el metabolismo o la enfermedad, el suministro de polinucleótidos a una célula in vivo también se podría utilizar para estimular el sistema inmune, estimular el sistema inmune para destruir las células cancerosas, inactivar los oncogenes o activar o suministrar genes supresores de tumores. Los polinucleótidos también se pueden suministrar para inducir inmunidad a agentes patógenos o para bloquear la expresión de genes patogénicos. Definiciones Misceláneas Como se utiliza en este documento, in vivo significa que toma lugar dentro de un organismo y más específicamente un proceso realizado en o sobre el tejido vivo de un organismo vivo, multicelular, completo (animal) , tal como un mamífero, opuesto a un organismo parcial o muerto . Como se utiliza en este documento, in vitro se refiere a un proceso realizado en un ambiente artificial creado fuera de un organismo multicelular vivo (por ejemplo, un tubo de ensayo o placa de cultivo) utilizado en la investigación experimental para estudiar una enfermedad o un proceso. Como se utiliza en este documento, in vitro incluye un proceso realizado en células intactas que crecen en un cultivo . Como se utiliza en este documento, in situ se refiere a procesos llevados a cabo en un tejido intacto. Sin embargo, el tejido puede estar en un organismo vivo o puede ser retirado del organismo. Como se utiliza en este documento, ex vivo se refiere a un proceso realizado en un ambiente artificial fuera del organismo en células o tejido vivo los cuales se retiran de un organismo y se regresan subsecuentemente a un organismo. Los reticuladores son moléculas bifuncionales utilizadas para conectar dos moléculas, es decir que forman una unión entre dos moléculas. Las moléculas bifuncionales pueden contener homo- o heterobifuncionalidad . Como se utiliza en este documento, un polímero tensoactivo disminuye la tensión superficial del agua y/o la tensión interfacial con otras fases y, por consiguiente, es absorbido positivamente en la interfaz de líquido/vapor. Un anticuerpo es cualquier inmunoglobulina, inclusive anticuerpos y fragmentos de la misma, que se enlaza a un epítopo específico. El término incluye anticuerpos policlonales , monoclonales y quiméricos. Un sitio de combinación de anticuerpo es aquella porción estructural de una molécula de anticuerpo comprendida de regiones variables e hipervariables de cadena pesada y ligera que se enlaza específicamente al antígeno. La frase molécula de anticuerpo en sus diversas formas gramaticales utilizadas en este documento contempla tanto una molécula de inmunoglobulina intacta como una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina. Las moléculas de anticuerpo ejemplares son moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y aquellas porciones de una molécula de inmunoglobulina que contienen el paratopo, inclusive aquellas porciones conocidas en el campo como Fab, Fab' , F(ab').sub.2 y F(v), porciones las cuales se prefieren para el uso en los métodos terapéuticos descritos en este documento. Las porciones Fab y F(ab').sub.2 de las moléculas de anticuerpo se preparan por medio de la reacción proteolítica de papaína y pepsina, respectivamente, en moléculas de anticuerpo sustancialmente intactas por medio de métodos que son bien conocidos. La frase anticuerpo monoclonal en sus diversas formas gramaticales se refiere a un anticuerpo que tiene solo una especie de sitio de combinación de anticuerpo capaz de inmunorreaccionar con un antígeno particular. De esta manera, un anticuerpo monoclonal exhibe típicamente una afinidad de enlace individual para algún antigeno con el cual inmunorreacciona . Por lo tanto, un anticuerpo monoclonal puede contener una molécula de anticuerpo que tiene una pluralidad de sitios de combinación de anticuerpo, cada uno inmunoespecifico para un antigeno diferente; por ejemplo, un anticuerpo monoclonal biespecifico (quimérico) . EJEMPLOS Ejemplo 1. Síntesis y ensamble de polinucleótidos . Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos de ARN sintéticos (Dharmacon, Lafayette CO) . Los ARNs de cadena homosentido contenían una amina primaria con un separador de seis átomos de carbono en 5' para permitir la conjugación al vehículo de suministro. Los oligonucleótidos de ARN protegidos con 2'ACE se desprotegieron antes del paso de hibridación de acuerdo con las instrucciones del fabricante, los ARNips tuvieron las siguientes secuencias: apoB (Ensembl# ENSMUST00000037520 ) ; ARNip de apoB-1 homosentido 5' -NH4-GAAmUGmUGGGmUGGmCAAmCmUmUmUmA*G, SEC ID 1, antisentido 5' -P-AmAAGUUGCCACCCACAUUCmA*G, SEC ID 2 ; ARNip de apoB-2 homosentido 5' -NH4-GGAmCAmUGGGmUmUCCAAAmUmUAmC*G, SEC ID 3, antisentido 5' -P-UmAAUUUGGAACCCAUGUCCmC*G, SEC ID 4; ppara (GenBank# NM_0.11144); ARNip de ppara-1, homosentido 5 ' -NH4-mUmCAmCGGAGmCmUmCAmCAGAAmUmUmC*U-3 ' , SEC ID 5, antisentido 5' -P-AmAUUCUGUGAGCUCCGUGAmC*U-3' , SEC ID 6; ARNip de ppara-2 homosentido 5' -NH4-mUmCCCAAAGCmUCCmUmUmCAAAAmU*U-3' , SEC ID 7, antisentido 5'- P-mUmUUUGAAGGAGCUUUGGGAmA*G-3' , SEC ID 8; ARNip de control (gen reportero de luciferasa GL-3), homosentido 5' -NH4-mCmUmUAmCGmCmUGAGmUAmCmUmUmCGAmU*U-3' ; SEC ID 9, antisentido 5'- P-UmCGAAGUACUCAGCGUAAGmU*U ; SEC ID 10; m = sustitución de 2'-0-CH3, * = unión de fosforotioato y P = P04. Los oligonucleótidos homosentido y antisentido para cada secuencia objetivo se hibridizaron al mezclar cantidades equimolares de cada uno y calentar a 94 °C durante 5 minutos, enfriar a 90°C durante 3 minutos, luego disminuir la temperatura en pasos de 0.3°C 250 veces, manteniendo cada paso durante 3 segundos. Ejemplo 2. Copolímeros aleatorios de éter polivinílico . A. Síntesis de un monómero de éter vinílico . La ftalimida de 2-viniloxi-etilo se preparó por vía de la reacción del éter vinilico de 2-cloroetilo (25 g, 0.24 mol) y ftalimida de potasio (25 g, 0.135 mol) en DCMF a 100°C (75 mi) utilizando bromuro de tetra n-butil-amonio (0.5 g) como el catalizador de transferencia de fases. Esta solución se calentó durante 6 horas y luego se colisionó en agua y se filtró. Este sólido entonces se recristalizó dos veces de metanol para proporcionar cristales color blanco. B. Polímeros de amina + éter polivinilico de alquilo inferior. Una serie de copolimeros se sintetizaron a partir de monómeros de éter vinilico con relaciones variantes de grupos alquilo con respecto a amina y con grupos alquilo que tienen de uno a cuatro átomos de carbono (Figura 1, R y R' pueden ser los mismos o diferentes) . La actividad en la membrana fue dependiente del tamaño (longitud de cadena de alquilo) y la relación de monómeros hidrófobos (Wakefield 2005) . Se descubrió que los polímeros derivados de propilo y butilo son líticos para la membrana utilizando liposomas modelo mientras que los polímeros que contienen metilo y etilo no lo son. Se denominan estos polímeros éteres aminovinílicos de metilo, etilo, propilo o butilo o (PMAVE, PEAVE, PPAVE, o PBAVE respectivamente) . Estos polímeros poseen suficiente carga para formar complejos con el ADN en concentraciones fisiológicas de sal. En contraste, los péptidos catiónicos pequeños líticos para la membrana tales como melitina son muy débiles y no pueden condensar el ADN en soluciones salinas isotónicas. El tamaño más grande de los polímeros antipáticos sintéticos no solo mejora su capacidad de enlace con el ADN, sino que también los hace más liticos en una base molar que la melitina. La capacidad para producir la lisis de membranas con un menor núme-ro de moléculas de polímero facilitará el suministro in vivo de ácido nucleico. Utilizando el ADN etiquetado con fluoróforo, se determinó la densidad de carga de los polímeros sintetizados y se confirmó su estabilidad en solución salina. C. Síntesis de terpolímeros de éter polivinilico-poliaminas activos en la membrana , antipáticos , solubles en agua. X% en mol del éter vinílico protegido con amino (por ejemplo, Ftalimida de 2-Viniloxi-Etilo) se agregó a un matraz de fondo redondo secado en un horno bajo un manto de nitrógeno en diclorometano anhidro. A esta solución se agregó Y% en mol de éter vinílico de alquilo (por ejemplo, etilo, propilo o butilo, seguido por Z% en mol de éter vinílico de alquilo dodecilo, octadecilo (Figura 1). Mientras que los polímeros detallados se derivan de 2-3 monómeros diferentes, la invención no está limitada a una composición específica de monómeros de éter vinílico. Los polímeros que comprenden más monómeros o monómeros diferentes se contemplaron fácilmente. La solución se llevó a -78 °C en un baño de acetona con hielo seco. A esta solución se agregó 10% en mol de BFsEtOEt y la reacción se dejó proceder durante 2-3 horas a -78 °C y luego se enfrió rápidamente con una solución de metanol-hidróxido de amonio. El polímero se llevó a la sequedad bajo presión reducida y luego se introdujo en 30 mi de 1 , 4-dioxano/metanol (2/1) . Se agregaron 20 equivalentes molares de hidrazina por ftalimida para retirar el grupo protector de la amina. La solución se calentó a reflujo durante 3 horas, luego se llevó a sequedad bajo presión reducida. El sólido se introdujo en 20 mi de HC1 0.5 M, se calentó a reflujo durante 15 minutos, se diluyó con 20 mi de agua destilada y se calentó a reflujo durante una hora adicional. La solución entonces se neutralizó con NaOH, se enfrió a temperatura ambiente, se transfirió a una tubería de celulosa molecular 3,500, se dializó durante 24 horas (2x20L) contra agua destilada y se secó por congelamiento. El peso molecular de los polímeros se calculó utilizando las columnas de exclusión de tamaño analítica de acuerdo con procedimientos estándar. Mientras que los polímeros que contienen los monómeros de éter vinílico indicados se describen en estos ejemplos, la invención no está limitada a esos monómeros particulares. Después de la remoción de los grupos ftalimida por medio del tratamiento secuencial con hidrazina y HC1, los polímeros se transfirieron a una tubería de celulosa molecular 3,500 y se dializaron durante 24 horas (2x20L) contra agua destilada y se secaron por congelamiento. Los polímeros entonces se disolvieron en agua y se colocaron sobre una columna sephadex G-15MR. Los polímeros que se excluyeron de la columna sephadex G-15MR se aislaron y se concentraron por medio de la liofilización . Los pesos moleculares de los polímeros entonces se determinaron por medio de GPC utilizando las columnas en serie CATSEC100MR, CATSEC300MR y CATSEC1000MR de Eprogen Inc. El amortiguador de conducción fue NaCl 50 mM, TFA al 0.1% y MeOH al 10%. Los estándares de polivinilpiridina se utilizaron como la curva de calibración. Los pesos moleculares de los polímeros estuvieron en el intervalo de 10,000-100,000 Da, con la mayoría de preparaciones de polímeros sobre 20,000 Da. D. Síntesis de DW1360. Un terpolímero de amina/butilo/éter polivinílico de octadecilo se sintetizó a partir de los monómeros Ftalimida de 2-Viniloxi-Etilo (3.27 g, 15 mmol), éter vinílico de butilo (0.40 g, 4 mmol) y éter vinílico de octadecilo (0.29 g, 1 mmol) . Los monómeros se disolvieron en 30 mi de diclorometano anhidro. Estas soluciones entonces se agregaron a un baño de hielo seco/acetona a -78°C. 2 minutos después, se agregó BF3OEt2 (0.042 g, 0.3 mmol) y la reacción se dejó proceder durante 3 horas a -78°C. La polimerización entonces se detuvo por medio de la adición de una mezcla 50/50 de hidróxido de amonio en metanol o una solución de borohidruro de litio. Los solventes entonces se retiraron por medio de la evaporación giratoria. El polímero entonces se disolvió en 30 mi de 1,4-dioxano/metanol (2/1). A esta solución se agregó hidrazina (0.44 g, 138 mmol) y la mezcla se calentó a reflujo durante 3 horas. Los solventes entonces se retiraron por medio de la evaporación giratoria y el sólido resultante se introdujo entonces en 20 mi de HCl 0.5 M y se calentó a reflujo durante 15 minutos, se diluyó con 20 mi de agua destilada y se calentó a reflujo durante una hora adicional. Esta solución entonces se neutralizó con NaOH, se enfrió a temperatura ambiente, se transfirió a una tubería de celulosa molecular 3,500 y se dializó durante 24 horas (2x20 L) contra agua destilada y se liofilizó. Similarmente, se pueden sintetizar otros polímeros que contienen varias relaciones de grupos amina, butilo y octadecilo. También se pueden incorporar otros monómeros. En particular, el éter vinílico de t-butilo, éter vinílico de dodecilo y éter vinílico oleico se han incorporado en polímeros. En una modalidad, los terpolímeros de amina/alquilo inferior/éter polivinilico de alquilo superior se pueden sintetizar utilizando monómeros a una relación de alimentación de 15 monómero de amina: 4 monómero de alquilo inferior: 1 monómero de alquilo superior. Bajo las condiciones descritas anteriormente, se determinó que la relación de incorporación era aproximadamente 5.4-7.5 monómero de amina: 3-3.5 monómero de alquilo inferior :1 monómero de alquilo superior. En otra modalidad, los terpolímeros de amina/alquilo inferior/éter polivinilico de alquilo superior se sintetizan utilizando monómeros a una relación de alimentación de 4-8 monómero de amina: 3-5 monómero de alquilo inferior :1 monómero de alquilo superior. En una modalidad preferida, los polímeros son solubles en agua (aproximadamente 1 mg/ml o mayor a 25°C) y tensoactivos . En una modalidad, los polímeros son fraccionados para producir polímeros de un peso molecular de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa y más preferiblemente de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 30 kDa. E. Otros terpolimeros . Los polímeros similares se pueden sintetizar de una modificación de diferentes polímeros base que incluyen, pero no están limitados a: poli-L-lisina (PLL) , polivinilamina (PVA) y polialilamina (PAA). Por medio de la unión de grupos alquilo a diferentes cadenas principales de estos polímeros, los terpolimeros se pueden hacer con una relación de amina: alquilo inferior : alquilo superior de aproximadamente 6:3:1. F. Lisis de liposomas . 10 mg de fosfatidilcolina de huevo se hidrataron con 1 mi de amortiguador que contenía carboxifluoresceína (CF) 100 mM y HEPES 10 mM pH 7.5. Los liposomas entonces se extruyeron a través de filtros de policarbonato con poros de 100 nm (Nucleopore, Pleasanton, CA) . La CF no atrapada se retiró por medio de la cromatografía de exclusión de tamaño utilizando Sepharose 4B- 200MR eluyendo con HEPES 10 mM pH 8, NaCl 0.1 M. Una alícuota de 200 µL de los liposomas cargados con CF se agregó a 1.8 mi de amortiguador isotónico. La fluorescencia (?e?=488, em=540) se midió 30 minutos después de la adición de 0.25 µg de polímeros o melitina a las suspensiones de vesículas. Al final de cada experimento, las vesículas se alteraron por la adición de 40 µ? de una solución de- Tritón X-100 al 1% para determinar la lisis máxima. Ejemplo 3. Agentes de enmascaramiento. A. Síntesis de anhídrido 2-propiónico-3 -metilmaleico (anhídrido carboxidimetilmaleico o CDM) . A una suspensión de hidruro de sodio (0.58 g, 25 mmol) en 50 mi de tetrahidrofurano anhidro se agregó trietil-2-fosfonopropionato (7.1 g, 30 mmol). Después de que la emisión de gas de hidrógeno se había detenido, se agregó dimetil-2-oxoglutarato (3.5 g, 20 mmol) en 10 mi de tetrahidrofurano anhidro y se agitó durante 30 minutos. El agua, 10 mi, entonces se agregó y el tetrahidrofurano se retiró por medio de la evaporación giratoria. La mezcla resultante de sólido y agua se extrajo con 3x50 mi de éter etílico. Las extracciones de éter se combinaron, se secaron con sulfato de magnesio y se concentraron a un aceite color amarillo claro. El aceite se purificó por medio de la elución con la cromatografía en gel de sílice con éter:hexano 2:1 para producir 4 g (rendimiento del 82%) del triéster puro. El anhídrido 2- propiónico-3-metilmaleico entonces se formó al disolver este triéster en 50 mi de una mezcla 50/50 de agua y etanol que contenia 4.5 g (5 equivalentes) de hidróxido de potasio. Esta solución se calentó a reflujo durante 1 hora. El etanol entonces se retiró por medio de la evaporación giratoria y la solución se acidificó a pH 2 con ácido clorhídrico. Esta solución acuosa entonces se extrajo con 200 mi de acetato de etilo, el cual se aisló, se secó con sulfato de magnesio y se concentró a un sólido color blanco. Este sólido entonces se recristalizó de diclorometano y hexano para producir 2 g (rendimiento del 80%) del anhídrido 2-propiónico-3-metilmaleico . Los tioésteres, ésteres y amidas se pueden sintetizar a partir de CDM por medio de la conversión de CDM a su cloruro ácido con cloruro de oxalilo seguido por la adición de un tiol, éster o amina y piridina. El CDM y sus derivados se modifican fácilmente por medio de métodos estándar en el campo, para agregar ligandos de fijación como objetivo, estabilizadores estéricos, grupos cargados y otros grupos reactivos. Las moléculas resultantes se pueden utilizar para modificar reversiblemente las aminas. B. Grupos de fijación como objetivo que contienen galactosa . Los ligandos de fijación como objetivo de hepatocitos estudiados más ampliamente son a base de galactosa, la cual se enlaza por medio del receptor de asialoglicoproteinas (ASGPr) en los hepatocitos. Se ha mostrado que la unión de galactosa facilita la fijación como objetivo en hepatocitos de algunos polímeros sin carga, sumamente solubles en agua que incluyen: el oligosacárido quitosan, un derivado de poliestireno y una poliacrilamida HPMA. Los grupos de fijación como objetivo de galactosa se generan fácilmente utilizando lactosa, un disacárido de galactosa-glucosa, por vía de la modificación del residuo de glucosa. El ácido lactobiónico (LBA, un derivado de lactosa en el cual la glucosa ha sido oxidada a ácido glucónico) se incorpora fácilmente en un derivado de anhídrido maleico utilizando técnicas de acoplamiento de amida estándar. La Figura 2 muestra la estructura de dos derivados de LBA que acoplan la galactosa al anhídrido maleico CDM. La modificación de maleamato convierte un grupo amina con carga positiva en un grupo amina con carga negativa. Esta modificación de carga puede reducir la interacción no específica del polímero con células y componentes del suero con carga negativa. Sin embargo, demasiada carga negativa puede aumentar la interacción con receptores depuradores. Un derivado de anhídrido maleico que contiene galactosa neutro, neto se puede generar al insertar un grupo de amina terciaria con carga positiva en el agente de enmascaramiento, creando un zwitterión. Este compuesto, CDM-Pip-LBA, se generó a partir de los componentes: CDM, propilaminopiperazina y ácido lactobiónico (Figura 2). C. Síntesis del estabilizador estérico CDM-PEG y grupo de fijación como objetivo CDM-NAG (N-acetil-galactosamina) (Figura 2) . A una solución de CDM (Rozema 2003) (300 mg, 0.16 mmol) en 50 mi de cloruro de metileno se agregó cloruro de oxalilo (2 g, 10 equivalentes en peso) y dimetilformamida (5 µ?) . La reacción se dejó proceder durante toda la noche tiempo en el cual el cloruro de oxalilo en exceso y el cloruro de metileno se retiraron por medio de la evaporación giratoria para producir el cloruro de ácido CDM. El cloruro de ácido se disolvió en 1 mi de cloruro de metileno. A esta solución se agregó 1.1 equivalentes molares de éter monometilico de polietilenglicol (PM promedio 450) para CDM-PEG o (aminoetoxi) etoxi-2- (acetilamino) -2-desoxi-p-D-glucopiranosida (es decir amino-bisetoxiletilo-NAG) para CDM-NAG y piridina (200 µ?, 1.5 equivalentes) en 10 mi de cloruro de metileno. La solución entonces se agitó durante 1.5 horas. El solvente entonces se retiró y el sólido resultante se disolvió en 5 mi de agua y se purificó utilizando la HPLC de fase inversa utilizando un gradiente de 0.1% de TFA-agua/acetonitrilo (Figura 2). Ejemplo 4. Unión reversible del polinucleótido al polímero. La modificación de los oligos de amino-ARNip con grupos S-acetilo dio por resultado tioles protegidos, estables que se podían liberar en una solución básica (pH>9) en presencia de un policatión que contiene amina. Las condiciones de desprotección estándares para la remoción de un grupo tioéster requieren la incubación con hidroxilamina . Sin embargo, estas condiciones de desprotección dan por resultado una formación significativa de dimero de ARNip y disulfuro. Típicamente, la reacción entre una amina de alquilo y un tioéster es relativamente lenta, pero en un complejo entre ARNip polianiónico y una amina policatiónica, la reacción entre grupos funcionales se volvió esencialmente intramolecular y se aceleró en gran medida (véase el paso 2a en la Figura 3) . Además de acelerar la desprotección, la reacción del tiol liberado con grupos de disulfuro activado en el policatión se aumentó en gran medida (Paso 2b) . El piridilditiol de disulfuro activado (PD) aseguró la formación selectiva de disulfuro y se unió fácilmente al policatión utilizando reactivos comercialmente disponibles. El resultado de estas reacciones intrapartículas fue >90% de conjugación de disulfuro al policatión. Ejemplo 5. Conjugación reversible del polinucleótido al polímero . A. Polinucleótido modificado con SATA. Los polinucleótidos modificados con N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) se sintetizaron por medio de la reacción del ARNip modificado con amina 5' con 1 equivalente en peso (eq. en peso) de reactivo de SATA (Pierce) y 0.36 eq. en peso de NaHC03 en agua a 4°C durante 16 horas. Los ARNips modificados con tiol protegidos se precipitaron por medio de la adición de 9 volúmenes de etanol y la incubación a -78 °C durante 2 horas. El producto precipitado se aisló, se disolvió en amortiguador de ARNip lx (Dharmacon) y se cuantificó al medir la absorbancia a la longitud de onda de 260 nm . El polímero, en este ejemplo PBAVE o D 1360 (30 mg/ml en TAPS 5 mM pH 9) , se modificó por la adición de 1.5% en peso de 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a- [2-piridilditio] -tolueno (SMPT, Pierce) . 1 hora después de la adición de SMPT, se agregaron 0.8 mg de SMPT-polímero a 400 µ? de solución isotónica de glucosa que contenía TAPS 5 mM pH 9. A esta solución se agregaron 50 µg de ARNip modificado con SATA. Para los experimentos de respuesta a la dosis donde la concentración de PBAVE era constante, se agregaron diferentes cantidades de ARNip. La mezcla entonces se incubó durante 16 horas. De esta manera, el polinucleótido se conjugó al polímero por vía de un enlace reversible de disulfuro. Un enlace de disulfuro para la conjugación entre el polímero y el ARNip proporciona una reversibilidad en el ambiente reductor del citoplasma. El conjugado de ARNip-polímero se enmascaró por la adición a la solución de 5.6 mg de base libre de HEPES seguida por una mezcla de 3.7 mg de CDM-NAG y 1.9 mg de CDM-PEG. La solución entonces se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) antes de la inyección. B. Cuantificación de polinucleótido conjugado. Para cuantificar la cantidad de ARNip conjugado, las alícuotas de 10 µ? de conjugado de ARNip-polímero que contenían 1 µg de ARNip se trataron con 2 µ? de DTT 1 M o sin aditivo a temperatura ambiente durante 16 horas. 100 µg de ácido poliacrílico y 300 µg de NaCl se agregaron a las muestras para neutralizar las interacciones electrostáticas. Después de una incubación .de 2 horas, las muestras se sometieron a la electroforesis en un gel de agarosa al 2% y el ARNip se visualizó por medio de la tinción con bromuro de etidio. Las bandas de ARNip se cuantificaron utilizando el programa Kodak Molecular Imaging Software v4.0. La cantidad de ARNip no conjugado se normalizó con la cantidad liberada en el tratamiento con DTT para determinar el porcentaje conjugado. La cantidad de ARNip conjugado fue típicamente 70-90%. Se puede utilizar otra química de conjugación de disulfuro en donde el tiol se protege como un disulfuro o no se protege del todo. Adicionalmente, el polímero se puede modificar con otros grupos de disulfuro activados, grupos de tiol o grupos de tiol protegidos. Ejemplo 6. Unión reversible de CDM-agente de enmascaramiento a conjugados de polinucleótido-polímeros . Los conjugados de polinucleótido-polímero se pueden modificar, tal como con derivados de ácido maleico, para modificar reversiblemente el polímero (Figura 3, Paso 4.). El conjugado de ARNip-polímero se enmascaró por medio de la adición a la solución de 5.6 mg de base libre de HEPES seguido por una mezcla de 3.7 mg de CDM-NAG y 1.9 mg de CDM-PEG. La solución entonces se incubó 1 hora a temperatura ambiente (TA) antes de la inyección in vivo. Ejemplo 7. Actividad de fijación como objetivo de conjugados enmascarados . Para demostrar la capacidad de agentes de CDM-PIP-LBA (que contienen galactosa) para hacer posible la fijación como objetivo al hígado del éter polivinílico anfipático (butilo : amina 25:75) 25/75-PBAVE, el polímero se etiquetó con el fluoróforo Cy3 seguido por la modificación con CDM-PEG y con o sin CDM-Pip-LBA. 100 µg de polímero enmascarado en 400 µ? de glucosa isotónica se inyectaron en la vena de la cola de ratones. Las muestras de hígado se retiraron una 1 después de la inyección y las secciones de hígado congeladas se prepararon y se procesaron para la inmunohistoquímica (Figuras 4A-4B) . Como se muestra en las Figuras 4A-4B, el polímero fijado como objetivo de CDM-Pip-LBA se localizó extensivamente dentro de los hepatocitos (Figura 4B) mientras que el polímero no fijado como objetivo se localizó principalmente con los macrófagos del hígado (Figura 4A) . El PBAVE modificado con CDM-LBA es sumamente aniónico y se encontró principalmente con macrófagos (no mostrado) . Los polímeros modificados con CDM-Pip-LBA (agente de enmascaramiento zwitteriónico) fueron casi neutros y exhibieron un incremento en la cantidad de polímero fijado como objetivo a hígado como un total y, más importantemente, a hepatocitos en particular (Figura 4B) . También es posible proteger la carga, tal como la carga negativa, con estabilizadores estéricos, que incluyen agentes de enmascaramiento de CDM-PEG. Ejemplo 8. Fijación como objetivo del polinucleótido a los hepatocitos . Un conjugado de oligonucleótido-polímero se hizo como se describiera anteriormente y se enmascaró con CDM-Pip-LBA. 20 µg de ARNip modificado con SATA/Cy3 se conjugaron a 1.8 mg de PLL modificado con PD y se modificaron con CDM-Pip-LBA. El conjugado enmascarado se inyectó en 400 µL de solución salina dentro de la vena de la cola de un ratón. La misma solución de inyección fue 100 µg de PBAVE modificado con CDM-Pip-LBA 25/75 etiquetado con Verde de Oregon. Los conjugados fueron solubles y no se agregaron en condiciones fisiológicas. 1 hora después de la inyección, el hígado se recolectó y las secciones congeladas de hígado se prepararon y se procesaron para la inmunohistoquímica . Se utilizó TO-PRO-3MR para teñir los núcleos de las células. Después de la inyección en la vena de la cola de ratones, el oligonucleótido etiquetado y PBAVE se observaron en los hepatocitos (panel izquierdo superior de la Figura 5) .

Ejemplo 9. Actividad In Vivo del Conjugado. Se evaluó la capacidad de los conjugados enmascarados de polinucleótido-polimero para suministrar el ARNip para la inhibición de un gen endógeno en el hígado de ratón, receptor alfa activado con proliferador de peroxisoma (PPARa). Los ratones C57B (n=4) se inyectaron con el conjugado de ARNip de PPARa-PLL modificado con CDM-Pip-LBA (20 µg de ARNip, 1.8 mg de PD-PLL) y 25/75-PBAVE (100 µ?) en 400 µL de glucosa isotónica por vía de la vena de la cola. El ARN se preparó a partir del hígado 48 horas después de la inyección. Los niveles de ARNm de PPARa se determinaron utilizando una PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR, por sus siglas en inglés). Los niveles de ARNm se normalizaron para los animales inyectados con ARNip anti-luciferasa . Los cambios a los niveles de ARNm se normalizaron para la GAPDH endógena. Se realizaron tres experimentos independientes. Como se muestra en la Figura 6, se obtuvo una inhibición de 20% de los niveles de ARNm de PPARa. Ejemplo 10. Suministro/actividad in vivo del conjugado. Los ratones macho de seis a ocho semanas de edad (cepa C57BL/6, 20-25 g) se obtuvieron de Harían Sprague Dawley ( Indianápolis , IN) . Los ratones se alojaron por lo menos 10 días antes de la inyección. La alimentación se realizó ad libitum con Dieta para Roedores Harían TekladMR (Harían, Madison I) . Los ratones se infucionaron en la vena de la cola en un volumen total de 0.4 mi de inyección de glucosa isotónica amortiguada con HEPES (5 mM, pH 7.5). Los ratones se inyectaron con conjugados de ya sea ADN o ARNip. Los ratones se mantuvieron en ayuno durante 4 horas antes de la recolección del suero por medio del sangrado retro-orbital y la recolección del hígado. El suero para el uso en los ensayos Western se recolectó y se agregó a un volumen igual de Cóctel Inhibidor de Proteasa Completo que contenía EDTA (Roche, Indianápolis IN) y se almacenó a -20°C. El ARN total se aisló del hígado inmediatamente después de la recolección utilizando TRI-REAGENTMR de acuerdo con el protocolo del fabricante (Molecular Research Center, Cincinnati OH) . Para el análisis de la fijación como objetivo de hepatocitos, el policonj ugado que contenía 10 µg de ADNbc heneicosámero etiquetado con Cy3 se formuló como se describiera anteriormente en un volumen total de 0.2 mi y se suministró en ratones macho ICR (20-25 g, Harían Sprague Dawley) por medio de una inyección i.v. 1 hora después de la inyección, los ratones se sacrificaron y las muestras de hígado se cortaron. En algunos experimentos, las muestras de tejido de pulmón, riñon, bazo, cerebro y páncreas también se cortaron. Las muestras de tejido se fijaron en paraformaldeído al 4%/PBS durante 6 horas y luego se colocaron en una solución de sacarosa al 30%/PBS durante toda la noche a 4°C. Las muestras de tejido fijadas entonces se colocaron en soportes de bloques que contenían medio de congelamiento de OCT (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Las secciones de tejido congeladas (8-10 µp?) se prepararon utilizando un criostato Microm HM 505NMR (Cari Zeiss, Thornwood, NY) y se colocaron en portaobjetos para microscopio Superfrost-PlusMR (Fisher Scientific) . Las secciones de tejido se contratiñeron con faloidina ALEXA-488MR (13 nM, Invitrogen, Carlsbad CA) y T0-PR0-3MR (40 nM, Invitrogen) en PBS durante 20 minutos. Los portaobjetos se montaron en un dispositivo VectashieldMR (Vector Laboratories, Burlingame CA) y se analizaron por medio de un microscopio confocal LSM510MR (Cari Zeiss). Las micrografías confocales de secciones de hígado tomadas de ratones 1 hora después de la inyección con el conjugado de polinucleótido-polímero que contenía un ADN bicatenario heneicosámero etiquetado con Cy3 se muestran en las Figuras 7A-7D (cuadrante izquierdo superior en cada panel). La actina se muestra en los cuadrantes derechos superiores para indicar los perfiles de las células. Los núcleos se muestran en los cuadrantes izquierdos inferiores. Las imágenes asociadas se muestran en los cuadrantes derechos inferiores. La acumulación del ADNbc etiquetado con Cy3 en hepatocitos se observó cuando el polímero contenía la porción de fijación como objetivo de NAG, con una captación mínima por las células Kupffer o la acumulación en los sinusoides del hígado (Figura 7A) . La distribución fue casi homogénea por todos los diferentes lóbulos del hígado. La inspección de otros órganos reveló una fluorescencia menor de Cy3 en los bazo y los ríñones, a niveles que se calcula que son por lo menos 20 veces más bajos que en el hígado. La inyección de polinucleótidos + polímero no conjugados o el reemplazo de CDM-NAG en el vehículo de suministro por CDM-glucosa dio por resultado la captación por hepatocitos marcadamente reducida y la captación incrementada por el bazo y los ríñones (Figuras 7B y 7C, respectivamente), lo cual es consistente con la baja afinidad hacia la glucosa por el receptor de asialoglicoproteína . El reemplazo de CDM-NAG en el vehículo de suministro por CDM-manosa dio por resultado la fijación como objetivo incrementada de macrófagos y células endoteliales del hígado (Figura 7D) . PCR Cuantitativa y Ensayos Invasores . En la preparación de la PCR cuantitativa, el ARN total (500 ng) se transcribió de manera inversa utilizando SUPERSCRIPT IIIMR (Invitrogen) y cebadores de oligo-dT de acuerdo con el protocolo del fabricante. La PCR cuantitativa se realizó al utilizar un sistema de PCR Rápido en Tiempo Real Modelo 7500 (Applied Biosystems, Foster City CA) . Los Ensayos de Expresión de Genes TAQMANMR para apoB y ppara se utilizaron en reacciones dobles por triplicado con cebadores y sonda de ARNm de GAPDH utilizando la Mezcla Maestra de PCR Universal TAQMANMR (Applied Biosystems) . Las secuencias de los cebadores y la sonda de GAPDH (IDT, Coralville IA) fueron: GAPDH-directo 5' -AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3 ' , SEC ID 11; GAPDH-inverso 5 ' -CATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG-3 ' , SEC ID 12; GAPDH-sonda 5' -Hex/CGTGCCGCCTGGAGAAACCTGCC/BHQ-3' , SEC ID 13. Las mediciones directas de los niveles de ARNm de ppara se realizaron utilizando un ensayo de ARNm INVADERMR hecho por encargo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Third ave Technologies, Madison WI). Las reacciones dobles se realizaron por triplicado utilizando la sonda expuesta para ubiquitina de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Inmunotransferencia western de ApoB, ensayos de citocina y toxicidad y paneles metabólicos del hígado. La separación de proteínas del suero (0.1 µ?) se realizó por medio de la electroforesis en geles de poliacrilamida al 3-8%/SDS. Las proteínas separadas se transfirieron de manera electroforética a una membrana de PVDF seguida por la incubación con una dilución 1:5000 de un anticuerpo anti-ApoB policlonal de conejo (Biodesign International, Saco ME) . La inmunotransferencia entonces se incubó con una dilución 1:80,000 de anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma) y el enlace de anticuerpos se detectó utilizando un equipo de detección quimioluminiscente mejorado (Amersham Biosciences, Piscataway NJ) . Los niveles en el suero de citocinas de ratón TNF-a e IL-6 se midieron por medio del ensayo ELISA de emparedado utilizando reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Minneápolis MN) . Los niveles en el suero de IFN-a de ratón se midieron utilizando un equipo de ensayo ELISA de emparedado de acuerdo con las instrucciones del fabricante ( PBL Biomedical, Piscataway NJ) . Los niveles en el suero de ALT, AST, colesterol y triglicéridos se midieron utilizando sistemas automatizados en the Marshfield Clinic Laboratories Veterinary Diagnostic División (Marshfield WI) . Niveles en el Suero de Citocinas y Enzimas del Hígado en Ratones tratados con el conjugado de ARNip n=5, los datos se muestran como un promedio ± s.d. Ejemplo 11. Reducción de genes objetivo en el hígado de ratones. Para demostrar la capacidad del sistema para suministrar ARNip y para reducir la expresión de genes objetivo in vivo, el conjugado que contenia ARNip de apoB-1 (800 µg de polímero, 50 µg de ARNip) se inyectó en ratones C57B1/6. Como en los estudios de fijación como objetivo in vivo,, el conjugado de ARNip se administró por medio de la infusión en una vena de la cola. Los hígados de los ratones inyectados se recolectaron dos días después de la inyección y se sometieron a ensayo por los niveles de ARNm de apoB utilizando la PCR cuantitativa de transcriptasa inversa (RT-qPCR, por sus siglas en inglés) . Los niveles de ARNm de apoB se midieron con relación al nivel de ARNm de GAPDH y µg de ARN de entrada total, a fin de reducir la posibilidad de que alguna diferencia en los niveles relativos de ARNm de apoB fuera debido a efectos no específicos sobre la expresión interna de genes. Como se muestra en la Figura 8A, los ratones tratados con el conjugado de ARNip de apoB-1 tuvieron niveles significativamente reducidos de ARNm de apoB en comparación con ratones que recibieron un ARNip de control sin apoB o ratones inyectados únicamente con solución salina (n=5, p<0.00001), medidos dos días después de la inyección. Específicamente, el nivel promedio de ARNm de apoB en ratones que recibieron el conjugado de ARNip de apoB-1 se redujo por 76±14% en comparación con el grupo tratado con solución salina con relación a los niveles de ARNm de GAPDH, mientras que los niveles de ARNm de apoB en ratones inyectados con el ARNip de control no fueron afectados. Se obtuvieron resultados similares si los niveles de ARNm de apoB se midieron con relación al ARN total. El análisis de inmunotransferencia Western de los niveles de proteínas de apoB-100 en el suero reflejó la reducción en los niveles de ARNm de apoB en el hígado (Figura 8B) . Para confirmar la especificidad de la reducción de apoB, un grupo separado de ratones se trató con un ARNip que fijaba como objetivo una región diferente en el ARNm de apoB . Los ratones que recibieron el conjugado de ARNip de apoB-2 también exhibieron una reducción significativa en los niveles de ARNm de apoB (reducción de 60±6%, n=5, p<0.00001, Figura 8A) . El análisis de inmunotransferencia Western de los niveles de proteína de apoB-100 en el suero reflejó la reducción en los niveles de ARNm de apoB en el hígado (Figura 8B) . La expresión de ARNm de ApoB no se redujo en el yeyuno, otro tejido que expresa el gen de apoB, lo que sugiere que el conjugado no fija como objetivo este tejido. Esta actividad específica para el tejido es consistente con la fijación como objetivo de hepatocitos. También se prepararon conjugados que contenían los ARNips que fijaban como objetivo el receptor alfa activado por proliferadores de peroxisoma (ppara) , un gen importante en el control del metabolismo de ácidos grasos en el hígado (Kersten 1999, Schoonjans 1996) . El suministro de dos diferentes ARNips que fijan como objetivo el ppara dio por resultado una reducción significativa de los niveles de ARNm de ppara, sometidos a ensayo por medio de dos métodos independientes para cuantificar los niveles de ARNm (Figura 8C) . Con relación a los ratones que recibieron un ARNip, los niveles de ARNm de ppara en ratones que recibieron el ARNip de ppara-1 se redujeron por entre 40±9% y 64±9%, sometidos a ensayo por medio de IINVADERMR o RT-qPCR, respectivamente. Una reducción similar en los niveles de ARNm de ppara se observó en ratones inyectados con un vehículo de suministro que contenía ARNip de ppara-2, el cual fija como objetivo una región separada de la secuencia de ARNm de ppara. La toxicidad potencial del sistema de suministro se sometió a ensayo al medir los niveles en el suero de enzimas y citocinas del hígado. Se detectaron ligeras elevaciones de los niveles de ALT y AST en ratones que recibieron el ARNip de control o conjugados de ARNip de apoB-1 en comparación con ratones tratados con solución salina, 48 horas después de la inyección. Sin embargo, los niveles incrementados no fueron significativos (p<0.05) y el examen histológico de secciones de hígado no reveló señales de toxicidad en el hígado. Similarmente, el análisis de los niveles de TNF-a e IL-6 en el suero utilizando un ensayo ELISA reveló que ambos se elevaron ligeramente 6 horas después de la inyección del conjugado de ARNip-polímero, pero regresaron a la línea de referencia en 48 horas. No se esperaría que los incrementos observados en 6 horas causaran una estimulación inmune significativa y son por lo menos cuatro órdenes de magnitud inferiores a aquellos observados con la estimulación con un lipopolisacárido (Matsumoto 1998, Matsuzaki 2001) y de uno a tres ordenes de magnitud inferiores a aquellos después de la inyección de adenovirus (Lieber 1997, Benihoud 2007). No se detectaron diferencias significativas en los niveles en el suero de INF-a en ninguno de los puntos de tiempo, excepto por un ligero incremento en 6 horas después e la inyección del conjugado de ARNip de apoB-1. Estos resultados indican que el sistema de suministro fijado como objetivo es bien tolerado . Ejemplo 12. Análisis de respuesta a la dosis y fenotípico . Se realizaron estudios de respuesta a la dosis de dos maneras: al disminuir la cantidad de conjugado de ARNip suministrado a los ratones o al mantener la cantidad de polímero constante . pero disminuyendo la cantidad de ARNip conjugado. Al comparar los resultados de estos experimentos, se espera determinar cual de los dos componentes del vehículo de suministro fue limitante para el suministro: el polímero endosomolítico o el ARNip mismo. La inyección de diluciones en serie simples del conjugado de ARNip de apoB-1 en ratones condujo a una disminución progresiva en la cantidad de reducción de ARNm de apoB en el hígado (Figura 9A) . A la dosis más alta inyectada (800 µg de polímero, 50 µg de ARNip, es decir 2.5 mg/kg). , los niveles de ARNm de apoB en el hígado se redujeron 84±5% con relación al ARNm de GAPDH en el Día 2 después de la inyección en comparación con ratones inyectados con solución salina únicamente. Se obtuvieron resultados similares cuando los niveles de ARNm de apoB se midieron con relación al ARN total. La inyección de dos veces menos conjugado de ARNip (400 µg de polímero, 25 µg de ARNip) dio por resultado una reducción de 50±8% en los niveles relativos de ARNm de apoB. La inyección de cuatro veces menos dio por resultado la falta de reducción de apoB en comparación con el grupo de control de solución salina. El mantenimiento constante de la cantidad de polímero pero disminuyendo la cantidad de ARNip de apoB-1 conjugado con el vehículo de suministro condujo a resultados cuantitativamente similares a aquellos obtenidos de las diluciones en serie (Figura 9B) . Este descubrimiento sugiere que la cantidad de polímero endosomolítico presente en el vehículo de suministro no es el factor limitante para la reducción observada, sino que preferiblemente es la cantidad, o potencia, del ARNip conjugado a éste. Una característica distintiva de la deficiencia de apoB son los niveles disminuidos de colesterol en el suero debido a un deterioro del ensamble de VLDL y transporte de colesterol del hígado (Burnett Zimmermann 200602). Para determinar si el nivel de reducción de apoB mostrado en la Figura 10 fue suficiente para producir una respuesta fisiológica en esos ratones, se midieron sus niveles totales de colesterol en el suero. A la dosis suministrada más alta de ARNip (50 µ?) , se observó una disminución significativa en los niveles promedio de colesterol en el suero (30±7%, n=5, p<0.001) con relación a ratones que recibieron un ARNip de control o solución salina únicamente (Figura 10) . Se obtuvieron resultados similares en animales tratados con el conjugado de ARNip de apoB-2. La disminución de la cantidad de ARNip suministrado condujo a una disminución progresiva en la cantidad de disminución de colesterol observada, consistente con la reducción de ARNm de apoB disminuida que se midió en esos animales. El deterioro del ensamble de VLDL en el hígado y la disminución resultante en la exportación de VLDL también se podría esperar que alterara los niveles hepáticos de triglicéridos debido a que los triglicéridos también se incorporan en las partículas de VLDL (Gibbons 2004) . En realidad, los ratones transgénicos que expresaban una forma truncada de apoB, similar a la versión encontrada en pacientes con hipobetalipoproteinemia familiar, también exhiben una capacidad reducida para transportar triglicéridos hepáticos (Chen 2000) . A fin de evaluar los efectos de la reducción de apoB sobre el transporte de triglicéridos, se realizó una tinción con "Oil Red" de secciones de hígado obtenidas de ratones inyectados con el conjugado de ARNip de apoB-1. La inspección de las secciones de hígado reveló un contenido dramáticamente incrementado de lípidos hepáticos en comparación con los ratones de control (Figuras 11A-11C) . La figura 11A muestra un ratón tratado con el ARNip de ApoB. La figura 11B muestra un ratón tratado con el ARNip de GL3 de control negativo. La figura 11C muestra un ratón inyectado con solución salina sola. Los niveles disminuidos de triglicéridos en el suero también se detectaron en esos ratones, proporcionando evidencia adicional para la capacidad disminuida de exportación de triglicéridos hepáticos. Juntos, estos resultados indican que la inyección simple i.v. del conjugado de dARNip de apoB-1 da por resultado un suministro funcional del polinucleótido a hepatocitos y por lo tanto la reducción de la expresión de apoB en el hígado con efectos fenotípicos esperados. Para el análisis de la acumulación de grasa en el hígado, las muestras de hígado de ratones tratados con el conjugado de ARNip y de control se congelaron en medio de congelamiento de OCT y las secciones de tejido congeladas (8-10 µp?) se prepararon como se describiera anteriormente. Las secciones de tejido secadas al aire se fijaron en formaldehído al 4%/PBS durante 20 minutos, se enjuagaron en varios cambios de agua destilada y luego se enjuagaron brevemente con isopropanol al 60%. La solución madre de "Oil Red O" se preparó al mezclar 0.5 g de "Oil Red O" en 100 mi de isopropanol durante toda la noche y se filtró utilizando papeles de filtro #1 WhatmanMR. La solución de trabajo de "Oil Red O" se preparó al mezclar 20 mi de agua con 30 mi de solución madre de "Oil Red O" y se filtró utilizando una unidad de filtración NalgeneMR 0.2 µp? (Fisher Scientific) . Las secciones fijadas se tiñeron con la solución de trabajo de "Oil Red O" preparada recientemente durante 15 minutos, se enjuagaron brevemente con isopropanol al 60%. La contratinción de los núcleos se realizó al sumergir los portaobjetos en solución de hematoxilina modificada de Harris (Sigma, St. Louis MO) 7 veces y se enjuagaron en agua destilada. Los portaobjetos enjuagados entonces se montaron con el medio Gel ountMR (Biomedia Corp., Foster City CA) . Los portabojetos teñidos se analizaron utilizando un microscopio Zeiss Axioplan 2MR equipado con una cámara digital (Axiocam, Cari Zeiss). Las imágenes digitales se capturaron utilizando el software AxioVisionMR (Cari Zeiss) . Ejemplo 13. Suministro de ARNip por medio de la conjugación al polímero activo en la membrana por una unión lábil a CDM o disulfuro . Conjugado de Disulfuro: 50 ng de ARNip fijado como objetivo contra luciferasa que tenia un grupo 5'-amino en la cadena homosentido se hizo reaccionar con 1 µg de N-succinimidil-S-acetiltioacetato en presencia de una base de HEPES pH 7.5. Separadamente, 50 µg de un éter polivinilico sintetizado de una mezcla 50/50 de monómeros protegidos con amina y de éter vinilico de butilo se hicieron reaccionar con 5 de éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 3- (2-piridilditio) propiónico en presencia de una base de HEPES pH 7.5. El ARNip modificado y el polímero modificado entonces se combinaron para permitir la unión covalente del ARNip al polímero. Después de 6-24 horas, el conjugado de polímero-ARNip se hizo reaccionar con 200 µg de anhídrido 2-propiónico-3-metilmaleico en presencia de HEPES. Las partículas se agregaron a una línea de células HEPA de hepatocitos de ratón que expresa de manera estable el gen luciferasa. Como control, las muestras que contenían el polímero modificado con CD (sin ARNip) se agregaron a las células. En las células expuestas al conjugado de polímero-polinucleótido, la expresión de luciferasa se suprimió 75% con relación a las células expuestas al polímero solo, indicando un suministro de ARNip funcional a las células. Conjugado de CDM: 50 ng de ARNip fijado como objetivo contra luciferasa que tenía un grupo 5'-amino en la cadena homosentido se hicieron reaccionar con 2 µg de tioéster de CDM en presencia de HEPES pH 7.9. Al ARNip se agregaron 50 µg de un éter polivinilico sintetizado a partir de una mezcla 50/50 de monómeros protegidos con amina y de éter vinilico de butilo. Después de 6-24 horas, el conjugado de polímero-ARNip se hizo reaccionar con 200 µg de anhídrido 2-propiónico-3-metilmaleico en presencia de base de HEPES. Las partículas se agregaron a una línea de células HEPA de hepatocitos de ratón que expresa de manera estable el gen luciferasa. Como control, las muestras que contenían el polímero modificado con CDM (sin ARNip) se agregaron a las células. En las células expuestas al conjugado de polímero-polinucleótido, la expresión de luciferasa se suprimió 86% con relación a las células expuestas al polímero solo, indicando un suministro de ARNip funcional a las células. Porcentaje de inhibición de actividad de luciferasa después de la transfección de células HEPA-Luc utilizando conjugados de polímero-ARNip activos en la membrana Ejemplo 14. Longevidad de reducción de apoB y su efecto fenotípico . Se realizó un experimento a través del tiempo para determinar la duración de la reducción de apoB y la disminución de colesterol en ratones después de la inyección de una dosis individual de conjugado de ARNip de apoB-1. Consistente con los resultados descritos en las secciones previas, la inyección del conjugado de ARNip de apoB-1 (800 µg de polímero, 50 µg de ARNip) dio por resultado la reducción de los niveles promedio de ARNm de apoB por 87±8% en el Día 2 con relación a los ratones de control (Figura 12A) . La reducción en la expresión de apoB estuvo acompañado por una reducción de 42±5% en los niveles totales de colesterol en el suero (Figura 12B) . Las disminuciones en la expresión de ARNm de apoB permanecieron significativas hasta el Día 10 y habían regresado a casi los niveles de control en el Día 15. La reducción en el colesterol en el suero permaneció significativa hasta el Día 4 (n=5, p<0.01) y no se recuperó completamente a los niveles de control hasta el Día 10. Estos resultados indican que la reducción sostenida de apoB y la generación del fenotipo se pueden lograr después de una inyección individual del conjugado de ARNip y que el fenotipo se puede invertir conforme la expresión de apoB regresa a un nivel normal a través del tiempo. Ejemplo 15. Suministro de oligonucleótido de morfolino de fosforodiamidato (PMO) a células utilizando conjugados de polímero-PMO. Utilizando la reticulación a base de CDM-tioéster utilizada para unir el ARNip y el polímero, también es posible conjugar reversiblemente otros tipos de oligonucleótidos a polímeros. En particular, se estudió el suministro de PMO a células. 5 nmol de amino-PMO (el cual bloquea un sitio de empalme mutante en la transcripción mutante de Luciferasas) ya sea descubierto o hibridizado con una cadena complementaria de ADN se hicieron reaccionar con nada o con 2 µ? de tioéster de CDM en presencia de HEPES pH 7.9. A esto se agregaron 200 µg de éter polivinilico sintetizado a partir de 50% de éter vinilico de amino, 45% de éter vinilico de butilo y 5% de éter vinilico de dodecilo (DW550) . Después de tres o más horas, el conjugado de polímero + PMO o polímero-PMO se hizo reaccionar con 500 µ? de CDM en presencia de HEPES para mantener el pH>7.5. Además de CDM, los conjugados se hicieron reaccionar con ésteres de PEG de CDM, los cuales se derivan del cloruro ácido de CDM y éteres monometílieos de PEG de diversos pesos moleculares. Los conjugados entonces se agregaron a células HeLa Luc/705 (Gene Tools, Philomath OR) desarrolladas bajo condiciones utilizadas para células HeLa. Las células se colocaron en platos de cultivo de 24 pocilios a una densidad de 3 x 106 células/pocilio y se incubaron durante 24 horas. Los medios se reemplazaron por 1.0 mi de DMEM que contenía complejos de amino-PMO 2.5 nmol. Las células se incubaron durante 4 horas en una incubadora humidificada de C02 al 5% a 37 °C. Los medios entonces se reemplazaron por DMEM que contenía suero bovino fetal al 10%. Las células entonces se incubaron durante 48 horas adicionales. Las células entonces se recolectaron y los lisados entonces se sometieron a ensayo por la expresión de luciferasa. Los resultados demuestran un suministro mejorado del polinucleótido sin carga cuando el agente de transfección es un conjugado de polímero de éter polivinílico DW550-PMO. Suministro de polinucleótidos sin carga a células Vehículo de transfección Veces de inducción de luciferasa sin unión DW550 + PMO descubierto 2 DW550 + PMO hibridizado con ADN 2 Coniuaado de oolímero-PMO DW550-PMO descubierto con CDM 7.5 DW550-PMO hibridizado con CDM 10 Ejemplo 16. Suministro del conjugado de ARNip al músculo. 40 µg de ARNip de PPARa o ARNip de control (GL3) se conjugaron al polímero de PBAVE y se enmascararon como se describiera anteriormente. 250 µ? del conjugado se inyectaron en el músculo gastronemio en ratones (n = 3) . La velocidad de inyección fue aproximadamente 25 µ?/segundo. Los niveles de expresión de PPARa se determinaron como se describiera anteriormente . Inhibición de PPARa en el músculo después de la inyección directa del conjugado enmascarado Ejemplo 17. Suministro in vivo del cásete de expresión de ARNip. 20 µg del cásete de expresión de ARNip de SEAP lineal generado por medio de PCR, el cual expresa el ARNip de SEAP bajo control del promotor U6, se hicieron en complejo con 400 µg del polímero activo en la membrana D 1453 (compuesto de la polimerización de los grupos 75% en mol de amino, 21% en mol de alquilo inferior (butilo) y 4% en mol de alquilo superior (C18, octadecilo) y se modificaron con galactosa con ácido lactobiónico (LBA) ) . La lactobionilación se realizó por medio de la adición de 43 mg de LBA a 60 mg de polímero seguido por la adición de 34 mg de EDC y 24 mg de NHS. Como control, un cásete que expresaba el ARNip de luciferasa (GL3) también se formuló. El ADN se conjugó al polímero por medio de la adición de 0.65 equivalentes en peso de glutaraldehído . Después de la conjugación durante toda la noche, los complejos se modificaron con 40% en mol de NHS-acetato para reducir la carga en el polímero. 500 g de DW1453 lactobionilado se modificaron con 7 equivalentes en peso de agente de enmascaramiento CDM-PEG (10 unidades en promedio) en presencia de 14 equivalentes en peso de base de HEPES y se inyectaron en la vena de la cola de ratones que expresaban la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) . 10 minutos después de la inyección del polímero enmascarado, los conjugados de ADN-polímero DW1453 co-fijados como objetivo se inyectaron. En los días 1 y 14, la sangre se extrajo y se sometió a ensayo por los niveles de SEAP.

La actividad fue el promedio de 4 animales ± desviación estándar . Ejemplo 18. Suministro de anticuerpos. 35 µg de anticuerpo IGG de conejo (Sigma) se modificaron con 2% en peso de SPDP (Pierce) . El DW1360 (30 mg/ml en TAPS 5 mM pH 9) se modificó por la adición de 2% en peso de iminotiolano . 530 g de iminotiolano-PBAVE se agregaron a 400 µ? de solución isotónica de glucosa que contenia TAPS 5 mM pH 9. A esta solución se agregaron 35 µg de anticuerpo modificado con SPDP. Después de 16 horas, el conjugado de anticuerpo-polímero se modificó con 7 equivalentes en peso de una mezcla 2:1 de CDM-NAG y CDM-PEG. El conjugado se inyectó' en la vena de la cola de un ratón. 20 minutos después de la inyección, el ratón se sacrificó y el hígado se recolectó y se procesó para el análisis microscópico. El examen del tejido del hígado indicó una acumulación significativa de anticuerpo en los hepatocitos (Figura 13) . El cuadrante izquierdo superior muestra los anticuerpos etiquetados, el cuadrante derecho superior muestra la actina, el cuadrante izquierdo inferior muestra los núcleos y el cuadrante derecho inferior muestra una imagen compuesta. Ejemplo 19. Conjugado enmascarado de polinucleótido-polímero como reactivo de transfección in vitro. Los hepatocitos primarios se recolectaron de ratones adultos (cepa C57BL/6) utilizando el procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos descrito previamente (Klaunig 1981) . La viabilidad de hepatocitos fue 85-90% determinada por medio de la exclusión de Azul de Tripano. Los hepatocitos se colocaron en placas a una densidad de 1.5 x 105 células por pocilio en placas de 12 pocilios revestidas con colágeno en 1 mi de medios que contenían suero bovino fetal al 10%. 24 horas después de la colocación en placas, las células en pocilios por triplicado se transfectaron sin cambio de medios con ARNip utilizando TRANSIT-SIQUESTMR (Mirus Bio, Madison WI)- de acuerdo con el protocolo del fabricante o con diferentes cantidades de conjugado de ARNip. Los hepatocitos se recolectaron 24 horas después de la transfección y el ARN total se aisló con el reactivo TRIREAGENTMR (Molecular Research Center, Cincinnati OH) . Para demostrar las propiedades de transfección in vitro de los conjugados enmascarados, descritos de polinucleótido-polímero, el ARNip específico para apolipoproteína B {apoB) se suministró a hepatocitos primarios utilizando reactivos de transfección de ARNip comercialmente disponibles o los conjugados de polinucleótidos descritos. La transfección de los hepatocitos primarios con el conjugado fue sumamente efectiva, dando por resultado una reducción casi de 80% del ARNm de apoB (Figura 14). El nivel de suministro de ARNip, medido por la reducción de genes objetivo fue comparable con aquel logrado con el reactivo comercial SIQUESTMR. Como se predijo, la disminución de la cantidad de conjugado agregado a las células condujo a una reducción de apoB progresivamente aminorada. Ejemplo 20. Conjugado enmascarado de Polinucleótido-polímero como reactivo de transfección in vitro. Las células Hepa-lclc7 se transfectaron con plásmidos que codificaban luciferasas de luciérnaga y renilla utilizando TRANSIT LT1MR (Mirus Bio) . 4 horas después de la transfección de plásmidos, 100 ng de ARNip de luciferasa conjugados con 9 µg de PD-PLL seguido por la modificación con CDM-Pip-LBA (45 g) se agregaron a las células. Para alguna muestra, el 25/75-PBAVE modificado con CDM-Pip-LBA (5 µg) también se agregó a las células. 48 horas después de la adición de ARNip, las células se recolectaron y se sometieron a ensayo por la luciferasa de luciérnaga y renilla. La cantidad de expresión de la luciérnaga se normalizó para la renilla para cada muestra y para las células no expuestas al ARNip para cada grupo. Los conjugados solos de PLL-ARNip no son estables para suministrar el ARNip a células in vitro (barra blanca, Figura 15) . La adición del polímero lítico para la membrana enmascarado con maleamato de PBAVE da por resultado una actividad igual al reactivo de transfección comercial (barra negra) . En general, las transfecciones de ARNip y ADN parecen requerir un reactivo en exceso. El polímero de liberación en exceso, por encima de aquel necesario para interactuar con el ARNip, puede mejorar el suministro funcional in vitro e in vivo (liberación de endosomas) . Debido al tamaño y carga similares entre los conjugados de ARNip-polímero y polímeros, éstos pueden fijar como objetivo simultáneamente hepatocitos in vivo. En apoyo a esta expectativa, se observó que la co-inyección del ARNip etiquetado con Cy3 conjugado a PLL con 25/75-PBAVE etiquetado con Verde de Oregon no se traslapó en realidad con los hepatocitos (véase anteriormente) . La actividad in vitro del conjugado de ARNip con los polímeros de suministro es igual al ARNip no conjugado que fue transfectado con el reactivo comercial TRANSIT TKOMR (Figura 15) . Los experimentos en paralelo con una unión irreversible de ARNip y el polímero con base en una química de alquilación de yodoacetamida (barra moteada del conjugado de IA en la Figura 15) demostraron que los conjugados de ARNip-polímero no son activos si la conjugación no es reversible, lo que sugiere que el enlace de disulfuro se debe reducir con el objeto de un suministro funcional del ARNip (la reducción del 20% observada es debido a aproximadamente el 10% del oligo que no se conjugó, determinado por medio del análisis de gel) . La actividad observada para los conjugados con maleamilo sugiere que, aunque el polímero ya no tiene carga positiva e interactúa con el oligonucleótido por medio de fuerzas electrostáticas, el conjugado de ARNip es resistente a la degradación por nucleasas en el suero. Los análogos de ARNip modificados que son resistentes a la nucleasa también se pueden utilizar. Ejemplo 21. Uniones lábiles para la adhesión de agentes de enmascaramiento y polinucleótídos a un polímero activo en la membrana. A. Enlace lábil al pH con un separador de PEG. Una modalidad de un grupo objetivo de ligando de ASGP-R se puede preparar de la siguiente manera: Compuesto I (Derivados de (aminoetoxi ) etilo de 2-acetamido-3, 4, 6-tri-0-acetil-2-desoxi-p-D-galactopiranosida Compuesto II Anhídrido maleico de N-acetil-galactosamina-PEG-metilo El compuesto I se utilizó como un precursor para crear el compuesto II, un agente de enmascaramiento del grupo de fijación como objetivo de galactosa capaz de modificar reversiblemente los Polímeros de membrana activa que contienen amina tales como los polímeros de PBAVE. La reacción del anhídrido maleico con un grupo amina en los polímeros da por resultado la formación de una unión lábil al pH entre la galactosa y el polímero. La modificación de un polímero de PBAVE con el compuesto II da por resultado: Compuesto III La modificación de los grupos amino de PBAVE con el compuesto III (relación molar del compuesto III con respecto a la amina del polímero 0.75:1) y CDM-PEG500 (relación molar de CDM-PEG con respecto a la amina del polímero 0.25) dio por resultado un conjugado el cual exhibió fijación como objetivo para hepatocitos in vivo. Las longitudes variantes del separador de grupos de etileno (n = 1, 2, 3 o 7) fueron efectivas todas en el suministro de ARNip a hepatocitos in vivo como fue evidenciado por la reducción de la expresión del gen objetivo.

B. Enlace lábil al pH con un separador de alquilo.

Los grupos separadores de alquilo también se pueden utilizar como se ilustra en el compuesto V. Sin embargo, los separadores de alquilo pueden incrementar la hidrofobicidad del agente de enmascaramiento, dando por resultado una solubilidad más baja del agente de enmascaramiento y el conjugado.

Compuesto V Agente de enmascaramiento de anhídrido maleico de N-acetil- galactosamida-metilo-C6 C. Grupos de fijación como objetivo multivalentes. Los grupos de fijación como objetivo con una valencia más alta también se pueden utilizar. Las modalidades ejemplares de grupos de fijación como objetivo de galactosa multivalentes se ilustran a continuación. Los ligandos de galactosa divalentes (VI) y trivalentes (VII) pueden tener una afinidad más alta por el ASGP-R. 20)2GalNHAc Compuesto VI Compuesto VII igandos de fijación como objetivo de control negativo. Los grupos de fijación como objetivo relacionados los cuales tienen una afinidad significativamente más baja por la célula objetivo se pueden utilizar como controles negativos para determinar la eficacia del grupo de fijación como objetivo preferido. Como un ejemplo, el ASGP-R de hepatocito se enlaza a galactosa, pero no a glucosa. Por lo tanto, los grupos de fijación como objetivo de glucosa (VIII) pueden servir como un control negativo en los ensayos de fijación como objetivo de células. ß-isómero de Glc VIII E. Grupos de fijación como objetivo de mañosa. Se sabe que los macrófagos y las células Kupffer de hígado tienen receptores los cuales se enlazan a sacáridos de mañosa. Por lo tanto, los grupos de fijación como objetivo con residuos de mañosa (IX) se pueden utilizar para fijar como objetivo esas células. a-isómero de Man IX F. Uniones con labilidad variante. Las uniones con labilidad variante (cinética de escisión) se pueden utilizar para conectar el agente de enmascaramiento o un polinucleótido al polímero activo en la membrana. Para el suministro de polinucleótidos antisentido, puede ser posible incrementar la duración de la reducción al disminuir la velocidad de liberación del polinucleótido del conjugado. Los enlaces de disulfuro se pueden hacer con una cinética de escisión variante en el ambiente reductivo en una célula de mamífero típica. Una liberación más lenta de agente de enmascaramiento del polímero puede incrementar el tiempo de circulación del conjugado in vivo. Por ejemplo, el 5-metil-2-iminotiolano (M2IT, Unión X) exhibe una velocidad de escisión 4x más lenta que una unión de SMTP (Compuesto XI) .

Unión X Unión de SMTP XI Se espera que la velocidad de escisión para el Compuesto XII sea aproximadamente 30x más lenta que para las uniones de anhídrido maleico disustituido.

Separador Ejemplo 22. Caracterización de PBAVE y conjugados de polinucleótido-PBAVE. A. Análisis anfipático. La fluorescencia de 1,6-difenil-1, 3, 5-hexatrieno (DPH, Invitrogen) (?e? = 350 nm; em = 452 nm) se aumenta en un ambiente hidrófobo. Este fluoróforo se utilizó para analizar el polímero de PBAVE (DW1360) . El DPH 0.5 µ? (concentración final) se agregó a 10 µg de PBAVE en presencia o ausencia de 40 de µg ADN plásmido en 0.5 mi de amortiguador de HEPES 50 mM, pH 8.0. La solución entonces se sometió a prueba por la acumulación de DPH en un ambiente hidrófobo al medir la fluorescencia de DPH. El incremento de la fluorescencia de DPH en presencia de los conjugados indica la formación de un ambiente hidrófobo por el polímero. La adición de ADN en exceso no alteró significativamente la fluorescencia de DPH (Figura 16). B. Peso Molecular. El peso molecular de DW1360 se determinó utilizando la cromatografía de exclusión de tamaño HPLC y un conjunto de polietilenglicoles como estándares (American Polymer Standard Corp.). Los polímeros se separaron en una GPC HPLC utilizando una columna Shodec SB-803 HQMR con LiC104 0.2 M, AcOH al 5% en metanol. La elución del polímero de PBAVE de la columna indicó un tamaño promedio de aproximadamente 12.8 kDa (Figuras 17A-17C) . C. Peso molecular del conjugado de polinucleótido-polímero. El peso molecular del conjugado enmascarado de polinucleótido-polimero se determinó utilizando la cromatografía de exclusión de tamaño FPLC y los ácidos nucleicos etiquetados con Cy3 como estándares. El conjugado y los estándares se separaron en una FPLC Shimadzu utilizando una columna Sephacryl S-500MR de 1x22 cm y se eluyeron con HEPES 50 mM, pH 8.0 a 1 ml/minuto. La elución del conjugado de la columna indicó un tamaño promedio de aproximadamente 77 kDa (Figura 18A-18C) . D. Estequiometría del conjugado. El peso molecular promedio del polímero de PBAVE se determinó experimentalmente que era aproximadamente 13 kDa. El peso molecular promedio del conjugado enmascarado de polinucleótido-polimero se determinó experimentalmente que era aproximadamente 77 kDa. El peso molecular promedio por carga (amina) del polímero de PBAVE se determinó experimentalmente que era aproximadamente 200 Da. El peso molecular promedio del agente de enmascaramiento de CDM se calculó que era de aproximadamente 550 Da. El grado promedio de modificación del polímero de PBAVE se determinó experimentalmente que era aproximadamente 75% de las aminas disponibles. El peso molecular promedio del ARNip conjugado se calculó que era aproximadamente 14 kDa. Utilizando estos valores, el peso molecular promedio del agente de enmascaramiento del polímero de PBAVE enmascarado con DCM se calculó que era aproximadamente 30 kDa. De esta manera, la estequiometría probable del ARNip con respecto al polímero enmascarado se calculó que era aproximadamente 1:2. E. Dimensionamiento de partículas y potencial Zeta. Los tamaños de los conjugados inyectados in vivo se midieron por medio de la dispersión de luz a 532 nm utilizando un Dimensionador de Partículas ZetaPlusMR de Brookhaven Instruments Corporation, 190. El análisis unimodal de los picos varió entre 100 y 30 nm. Utilizando el análisis multimodal, el pico con el número más grande (>95%) de partículas fue menor que 50 nm y más típicamente menor que 20 nm. El tamaño del policonj ugado también se puede medir utilizando una ultracentrifugación analítica o microscopía de fuerza atómica. De la misma manera, el potencial zeta de los conjugados se midió utilizando un dispositivo ZetaPALSMR de Brookhaven Instruments Corporation. El potencial zeta de los conjugados enmascarados con CDM varió entre 0 y -30 mV y más predominantemente entre 0 y -20 mV. El potencial zeta se midió en glucosa isotónica amortiguada a pH9 con- TAPS 5 mM. Los conjugados estables sin agregación también se formaron con potenciales zeta entre 0 y -10 mV y entre 0 y -5 mV bajo las mismas condiciones. A pH 7, se esperaría que los conjugados ganaran alguna carga positiva debido a la protonación de algunas de las aminas. Ejemplo 23. Suministro in vivo del conjugado a xenoinjerto de hepatoma humano en ratones desnudos . Para demostrar que los conjugados descritos se pueden utilizar 4 para fijar como objetivo células tumorales el conjugado de oligonucleótido-DW1360 modificado con CDM-NAG se inyectó en ratones que se habían implantado subcutáneamente (SC) con células HepG2 de hepatocarcinoma humano en el flanco. Los ratones desnudos atímicos hembras de seis semanas de edad se obtuvieron de Harían Spraque Dawley ( Indianápolis , IN) . Los ratones se inocularon con 2 millones de células HepG2 en 300 µ? de PBS por la ruta subcutánea en el flanco izquierdo. Las células HT-29 de carcinoma de colon de control (2 millones en 300 µ? de PBS) se inocularon SC en el flanco derecho 2 semanas después. La inyección posterior fue para compensar la velocidad de crecimiento más rápida. Cuando los tumores SC crecieron a aproximadamente 8 mm de anchura y longitud, el conjugado modificado con CDM-NAG y CDM-PEG que contenía 10 µg de ADNbc en heneicosámero etiquetado con Cy3 en 200 µ? de amortiguador de suministro se inyectó por vía de la vena de la cola. La acumulación del conjugado fijado como objetivo para NAG se observó en un gran porcentaje de la masa de tumor de hepatoma SC (30-60%, n=4, Figura 19A) . El área representativa de las células tumorales que muestran captación se muestra en la Figura 19 A. Un nivel muy bajo de fijación como objetivo al tumor se observó en ratones que recibieron el conjugado fijado como objetivo para la glucosa (Figura 19B, <5% de masa de tumor, n=3) . En los tumores de carcinoma de colon de control, sin receptor de galactosa, no se observó una señal de células tumorales con el conjugado modificado con ya sea NAG o glucosa (Figuras 19C-19D, n=2) . También se observaron resultados similares utilizando células de hepatocarcinoma HuH-7 para establecer xenoinjertos. Ejemplo 24. Modificación del Polímero con una Modificación Reversible con PEG antes de la conjugación . 400 µg del polímero DW1360 (formado a partir de una relación de alimentación de 75:20:5 de amina : butilo : éteres vinílicos de octadecilo) se modificó con 1.5% en peso de SMPT . 1 hora después, 2 equivalentes en peso de una mezcla 2:1 peso:peso de CDM-NAG (N-acetilgalactosamina) y CDM-PEG (11 unidades en promedio) se agregaron al polímero en presencia de 5.6 mg de base de HEPES. A esta solución se agregaron 20 µg de oligonucleótidos de ADN docosámero modificados con SATA/Cy3. Después de la incubación durante toda la noche, 5 equivalentes en peso de una' mezcla 2:1 peso:peso de CDM-NAG y CDM-PEG se agregaron al conjugado. El conjugado enmascarado se inyectó en 400 µ? de solución salina en la vena de la cola de un ratón. Se determinó que la modificación del polímero con CDM-NAG y CDM-PEG antes de la conjugación no redujo la eficiencia de conjugación. 1 hora después de la inyección, el hígado se recolectó y las secciones de hígado congeladas se prepararon y se procesaron para la inmunohistoquímica . El TO-PRO-3MR se utilizó para teñir los núcleos de las células.

Después de la inyección en la vena de la cola de los ratones, el oligonucleótido etiquetado se observó en los hepatocitos. Ejemplo 25. Cuantificación de grupos amina en el conjugado después de la modificación con CDM-reactivo . El conjugado de oligonucleótido-polimero DW1360 se sintetizó como se describiera previamente seguido por el tratamiento con 14 equivalentes en peso de base de HEPES y 7 equivalentes en peso de una mezcla 2:1 peso:peso de CD -NAG y CDM-PEG (11 unidades en promedio). Una hora después, el contenido de amina del conjugado tratado con derivado de anhídrido maleico se midió por medio del tratamiento con ácido sulfónico de trinitrobenceno (TNBS) en NaHC03 100 mM. Cuando se normalizó para un conjugado que no había sido modificado con maleamato, se determinó que la cantidad de aminas modificadas era aproximadamente 75% del total. Este grado de modificación se puede variar al cambiar la cantidad de anhídrido maleico agregado . Ejemplo 26. Electroforesis del conjugado de oligonucleótido-polimero y sus derivados de anhídrido maleico . Los conjugados de oligonucleótido-polimero DW1360 se hicieron como se describiera previamente. El conjugado que contenía 1 µg de oligonucleótido entonces se modificó con cantidades variantes de CDM-PEG (11 unidades en promedio) y CDM-NAG. Los conjugados entonces se colocaron en geles de agarosa (2% en peso) y se sometieron a la electroforesis . Se 4 observó con la tinción con bromuro de etidio que la carga de los conjugados se alteró dependiendo de los equivalentes del derivado de anhídrido maleico de positiva a neutra a negativa . Lo anterior se considera como ilustrativo solo de los principios de la invención. Además, puesto que numerosas modificaciones y cambios se les ocurrirán fácilmente a aquellas personas expertas en el campo, no se desea limitar la invención a la construcción y operaciones exactas que se muestran y se describen. Por lo tanto, todas las modificaciones y equivalentes adecuados se encuentran dentro del alcance de la invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición para suministrar una molécula a una célula, caracterizada porque comprende un conjugado de la fórmula: N-lZ-P- (L2-M)y, en donde N es una molécula impermeable hacia la membrana o una molécula con una baja permeabilidad hacia la membrana, L1 es una primera unión reversible que contiene un enlace fisiológicamente lábil, P es un polímero, L2 es una segunda unión reversible que contiene un enlace fisiológicamente lábil, M es un agente de enmascaramiento e y es un número entero mayor que 0. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula se selecciona del grupo que consiste de: un polinucleótido, proteína, péptido, anticuerpo y un fármaco impermeable hacia la membrana. 3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de: un polinucleótido modificado, ADN, ARN, ARNip, miARN y cásete de expresión. . La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polímero es más grande que 10 kDa. 5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el polímero es un polímero activo en la membrana. 6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el polímero activo en la membrana es una poliamina. 7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la poliamina activa en la membrana consiste de un copolímero aleatorio de éter polivinílico . 8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el copolímero aleatorio de éter polivinílico contiene tres o más monómeros diferentes. 9. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque los tres o más monómeros diferentes consisten de un monómero de éter vinílico que contiene amina, un monómero de éter vinílico de alquilo inferior y un monómero de éter vinílico de alquilo superior . 10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el monómero de éter vinilico de alquilo inferior consiste de un monómero de éter vinilico de butilo y el monómero de éter vinilico de alquilo superior consiste de un monómero de éter vinilico de octadecilo o monómero de éter vinilico de dodecilo. 11. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polímero es un polímero biodegradable. 12. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el enlace fisiológicamente lábil de la primera unión reversible es ortogonal al enlace fisiológicamente lábil de la segunda unión reversible. 13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la primera unión reversible y la segunda unión reversible contienen enlaces fisiológicamente lábiles que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: un enlace fisiológicamente lábil, enlace celular fisiológicamente lábil, enlace lábil al pH, enlace muy lábil al pH, enlace extremadamente lábil al pH, enlace de maleamato, enlace enzimáticamente escindible y enlace de disulfuro. 14. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque y es 2 o mayor. 15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque los agentes de enmascaramiento son los mismos o diferentes. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque los agentes de enmascaramiento se seleccionan del grupo que consiste de: estabilizadores esféricos, grupos de fijación como objetivo y agentes modificadores de carga. 17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque por lo menos uno de los agentes de enmascaramiento consiste de un grupo de fijación como objetivo seleccionado del grupo que consiste de: un compuesto con afinidad hacia una molécula de la superficie celular, ligando de receptor celular, anticuerpo con afinidad hacia una molécula de la superficie celular, ligando de receptor celular, sacárido, galactosa, derivado de galactosa, N-acetilgalactosamina, mañosa, derivado de mañosa, vitaminas, folato, biotina, aptámero, péptido, péptido que contiene RGD, insulina y EGF. 18. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque los agentes de enmascaramiento se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: anhídrido dimetilmaleico, anhídrido carboxi-dimetilmaleico (CDM) , CDM-tioéster , derivado de CDM, CDM- estabilizador estérico, CDM-PEG, CDM-PEG, CDM-ligando, CDM-galactosa, CDM-ácido lactobiónico (LBA) , CDM-Pip-LBA y CDM-NAG . 19. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además un exceso de polímero. 20. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el conjugado tiene un potencial zeta entre +30 mV y -30 mV a pH 7. 21. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el conjugado es más pequeño que 20 nm de diámetro. 22. Un método para suministrar un oligonucleótido a una célula en un mamífero in vivo caracterizado porque comprende: a) unir covalentemente el oligonucleótido a un polímero enmascarado reversiblemente por vía de un enlace fisiológicamente lábil para formar un conjugado; y b) administrar el conjugado al mamífero. 23. Una composición para suministrar una molécula a una célula, caracterizada porque comprende un conjugado de la fórmula: ?-??-?- (L2-M)y, en donde N es una molécula impermeable hacia la membrana o una molécula con una baja permeabilidad hacia la membrana, L1 es una primera unión reversible que contiene un enlace fisiológicamente lábil, P es un polímero, L2 es una segunda unión reversible que contiene un enlace ortogonal fisiológicamente lábil, M es un agente de enmascaramiento e y es un número entero mayor que 0. 24. Un conjugado para suministrar una molécula a una célula, caracterizado porque comprende: un polímero activo en la membrana unido de manera reversible a la molécula por vía de un enlace fisiológicamente lábil y unido adicionalmente a dos o más agentes de enmascaramiento por vía de enlaces fisiológicamente lábiles en donde dos o más de los agentes de enmascaramiento consisten de por lo menos un grupo de fijación como objetivo y por lo menos un estabilizador estérico o modificador de carga.