WO2019039403A1 - 修飾ポリヌクレオチド - Google Patents

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WO2019039403A1
WO2019039403A1 PCT/JP2018/030549 JP2018030549W WO2019039403A1 WO 2019039403 A1 WO2019039403 A1 WO 2019039403A1 JP 2018030549 W JP2018030549 W JP 2018030549W WO 2019039403 A1 WO2019039403 A1 WO 2019039403A1
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WO
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polynucleotide
modified
modified polynucleotide
dna
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PCT/JP2018/030549
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Inventor
阿部　洋
ジャオマー シュー
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国立大学法人名古屋大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to modified polynucleotides and the like.
  • cationic lipids are known to be cytotoxic.
  • An object of the present invention is to provide a technique for introducing a polynucleotide into cells more easily and in a state of reduced cytotoxicity.
  • the object of the present invention is to provide a technique for introducing a polynucleotide into cells more efficiently.
  • the polynucleotide modified with a molecule containing a structure containing a disulfide bond and / or a thiol group is complicated like complex formation with cationic lipid. It has been found that the modification polynucleotide can be more efficiently introduced into cells by simply adding the modified polynucleotide to the cell culture medium without requiring any manipulation. The modified polynucleotide was also found to be less cytotoxic. The inventor further studied based on these findings and completed the present invention.
  • the present invention includes the following aspects.
  • R 1 and R 2 are the same or different, and may be a single bond or a divalent group optionally containing at least one group selected from the group consisting of —S—S— and —SH Show.
  • R 3 is —O ⁇ or —O—R 31 (wherein, R 31 is at least one group selected from the group consisting of —S—S— and —SH) Group is shown).
  • Z 1 and Z 2 are the same or different and each represent —O— or —NH—. However, at least one of R 1 , R 2 and R 3 contains at least one group selected from the group consisting of —S—S— and —SH.
  • n is an arbitrary integer.
  • R 1 is an alkylene group or a group derived from a ring having —S—S— in the ring structure
  • R 2 is a single bond
  • R 3 is —O ⁇ or —O—R 31 a -S-S-R 31b
  • R 31a represents an alkylene group or -R 311a -NH-COO-R 312a- (R 311a and R 312a are the same or different and each represents an alkylene group).
  • 31b represents a protecting group.
  • R 1 is an alkylene group, R 2 is a single bond, and R 3 is —O—R 31 a —S—S—R 31 b (wherein R 31 a is an alkylene group or —R 311a -NH-COO-R 312a- (wherein R 311a and R 312a are the same or different and each represents an alkylene group), R 31b represents a protecting group, or
  • the R 1 is A group derived from a ring having a group represented by —S—S— in the ring structure, wherein R 2 is a single bond, and R 3 is —O 2 —
  • R 1 is an alkylene group having 3 to 6 carbon atoms
  • the R 2 is a single bond
  • the R 3 is —O—R 31 a —S—S—R 31 b
  • R 31a is an alkylene group having 3 to 6 carbon atoms
  • -R 311a -NH-COO-R 312a- R 311a and R 312a are the same or different, and represent an alkylene group having 2 to 6 carbon atoms.
  • R 31b represents an alkyl group or an aryl group) or (B1) derived from a 4- to 8-membered ring in which R 1 has a group represented by —S—S— in the ring structure R 2 is a single bond, and R 3 is —O 2 —
  • the modified polynucleotide according to any one of Items 1 to 3.
  • Item 5 The modified polynucleotide according to any one of Items 1 to 4, wherein n is 1 to 30.
  • Item 6 The modified polynucleotide according to any one of Items 1 to 5, wherein both Z 1 and Z 2 are —O—.
  • Item 7. The modified polynucleotide according to any one of Items 1 to 6, wherein the polynucleotide is a polynucleotide for introduction into a cell.
  • the polynucleotide is at least one selected from the group consisting of an antisense polynucleotide, siRNA, miRNA, miRNA precursor, aptamer, guide RNA, mRNA, noncoding RNA, DNA, non-natural nucleic acid (LNA, PNA, morpholino nucleic acid)
  • the modified polynucleotide according to any one of Items 1 to 7, which is
  • Item 9 The modified polynucleotide according to any one of Items 1 to 8, wherein the polynucleotide has a base length of 200 bases or less.
  • Item 10. The modified polynucleotide according to any one of Items 1 to 9, wherein the structure represented by the general formula (1) is linked to the end of the polynucleotide.
  • Item 11 The modified polynucleotide according to any one of Items 1 to 10, wherein the structure represented by the general formula (1) is linked to the 5 'end of the polynucleotide.
  • Item 12 An agent for introducing a modified polynucleotide into cells, comprising the modified polynucleotide according to any one of Items 1 to 11.
  • Item 13 A medicament comprising the modified polynucleotide according to any one of items 1 to 11.
  • Item 14 A reagent comprising the modified polynucleotide according to any one of items 1 to 11.
  • R 1 and R 2 are the same or different, and may be a single bond or a divalent group optionally containing at least one group selected from the group consisting of —S—S— and —SH Show.
  • R 3 is —O ⁇ or —O—R 31 (wherein, R 31 is at least one group selected from the group consisting of —S—S— and —SH) Group is shown).
  • Z 1 and Z 2 are the same or different and each represent —O— or —NH—. However, at least one of R 1 , R 2 and R 3 contains at least one group selected from the group consisting of —S—S— and —SH.
  • n is an arbitrary integer.
  • a polynucleotide modifying molecule comprising a structure represented by
  • the polynucleotide can be intracellularly more easily and in a state of reduced cytotoxicity.
  • NA indicates the case where the polynucleotide is not added to the medium, and the others indicate that the polynucleotides of Examples or Comparative Examples are directly added to the medium (DNA (Comparative Example 1), PS-DNA (Comparative Example 3), 5 DTT (Example 1), 10 DTT (Example 2), 5 ThioL (Example 3), 10 Thio L (Example 4), or DNA (Comparative Example 1) as a nucleic acid transfer reagent (Lipofectoamine 3000) Indicates when (DNA / Lipo 3000) is added to the medium using
  • the vertical axis shows the relative value of the intensity (average value) of the fluorescence derived from FAM added to the polynucleotide.
  • NA indicates the case where the polynucleotide is not added to the medium, and the others indicate that the polynucleotides of Examples or Comparative Examples are directly added to the medium (DNA (Comparative Example 1), PS-DNA (Comparative Example 3), 10 Thio L (Example 4), or DNA (Comparative Example 1), R-DNA (Comparative Example 2), or 10 Thio L (Example 4) using a nucleic acid transfer reagent (Lipofectoamine 3000) as a culture medium When added to ( ⁇ / Lipo 3000).
  • the vertical axis shows the relative value of the luciferase activity ratio (P.
  • NA indicates the case where the polynucleotide is not added to the medium, and the others indicate that the polynucleotides of Examples or Comparative Examples are directly added to the medium
  • DNA Comparative Example 1
  • PS-DNA Comparative Example 3
  • 5 x DTT Example 1
  • 10 x DTT Example 2
  • 5 x ThioL Example 3
  • 10 x ThioL Example 4
  • DNA Comparative Example 1
  • DNA / Lipo 3000 is added to the culture medium using a nucleic acid transfer reagent (Lipofectoamine 3000).
  • the vertical axis shows relative values of absorbance (average value).
  • the black column shows the case where the polynucleotide concentration in the added polynucleotide solution is 1 ⁇ M
  • the gray column shows the case where the same concentration is 5 ⁇ M. Bars on each column indicate standard error. On each column, * indicates that the P value for "NA” is less than 0.05, ** indicates that the P value for "NA” is less than 0.01, *** indicates the P value for "NA” It shows that it is less than 0.001.
  • the result of the cell membrane permeability test of Experiment 4 is shown.
  • NA indicates the case where the polynucleotide is not added to the medium, and the others indicate that the polynucleotides of the example or the comparative example are directly added to the medium (PS-DNA (Comparative Example 4), 5
  • the figure shows the case (PS-DNA / Lipo) in which xtBu (Example 5) or PS-DNA (Comparative Example 4) is added to the medium using a nucleic acid transfer reagent (Lipofectoamine 3000).
  • the vertical axis shows the relative value of the luciferase activity ratio (P. pyralis luciferase activity value / Renilla luciferase activity value) (average value).
  • control indicates the case where the polynucleotide is not added to the medium, and the others indicate that the polynucleotides of the example or the comparative example are directly added to the medium (PS DNA (comparative example 6), 5 ⁇ linker (Example 9)
  • PS DNA comparative example 6
  • 5 ⁇ linker Example 9
  • the case where PS DNA (comparative example 6) is added to a culture medium using a nucleic acid transfer reagent (Lipofectoamine 3000) (PS DNA / Lipo) is shown.
  • the vertical axis shows relative values of absorbance (average value). Bars on each column indicate standard error. * Indicates that the P value is less than 0.05.
  • the present invention relates to a compound represented by the general formula (1):
  • modified polynucleotide (herein also referred to as “modified polynucleotide of the present invention”) modified with a molecule containing a structure represented by In the present specification, the term “modification molecule of the present invention” is also referred to. This will be described below.
  • R 1 and R 2 are the same or different and each represents a single bond or a divalent group which may contain at least one group selected from the group consisting of —S—S— and —SH.
  • linker a group capable of functioning as a linker (hereinafter sometimes simply referred to as “linker”), a group derived from a ring, and two or more of these are linked And the like.
  • linker for example, an alkylene group, an alkenylene group, a heteroalkylene group (eg, a heteroalkylene group containing -S-S- in its main chain, a heteroalkylene group containing -NH-COO- in its main chain etc.), etc. It can be mentioned.
  • the linker includes any of linear or branched, and is preferably linear.
  • the number of atoms constituting the main chain of the linker (the number of carbon atoms in the case of an alkylene group and an alkenylene group) is not particularly limited, and is, for example, 3 to 10, preferably 3 to 6, and more preferably 3 to 4.
  • the linker is preferably an alkylene group, more preferably an alkylene group having 3 to 6 carbon atoms, still more preferably an alkylene group having 3 to 4 carbon atoms, and still more preferably the number of carbon atoms There may be mentioned 3 to 4 linear alkylene groups. Specific examples of such an alkylene group include n-propylene group, isopropylene group, n-butylene group, isobutylene group and the like.
  • the group derived from the ring is a divalent group obtained by removing two hydrogen atoms from the ring, and is not particularly limited in this limit.
  • the ring is not particularly limited, and is preferably monocyclic or bicyclic, more preferably monocyclic.
  • the ring-constituting atom is not particularly limited. For example, when it is only a carbon atom, it may include carbon atoms and hetero atoms (eg, nitrogen atom, sulfur atom, oxygen atom, etc.).
  • the number of ring-forming atoms is not particularly limited, and is, for example, 3 to 20, preferably 3 to 12, more preferably 4 to 8, and further preferably 5 to 7.
  • a ring having —S—S— in the ring structure for example, a ring having —S—S— in the ring structure, cycloalkane, cycloalkene, benzene, naphthalene and the like can be mentioned, and preferably a ring having —S—S— in the ring structure is It can be mentioned.
  • a ring having —S—S— in the ring structure specifically, one —C—C— in cycloalkane or cycloalkene (preferably cycloalkane) is replaced by —S—S— There is a ring.
  • R 1 is preferably a divalent group which may contain at least one group selected from the group consisting of —S—S— and —SH, more preferably an alkylene group, in the ring structure And groups derived from a ring having —S—S— and the like are mentioned, and more preferably an alkylene group is mentioned.
  • R 2 preferably includes a single bond.
  • R 3 represents —O ⁇ or —O—R 31 .
  • R 31 represents a monovalent group which may contain at least one group selected from the group consisting of —S—S— and —SH.
  • Examples of the monovalent group represented by R 31 include an alkyl group, an alkenyl group, a heteroalkyl group (eg, a heteroalkyl group containing -S-S- in the main chain, -NH-COO- in the main chain And heteroalkyl groups and the like, groups derived from the above-mentioned ring, and groups formed by linking two or more of these.
  • the monovalent group represented by R 31 includes both linear and branched ones.
  • the number of atoms constituting the main chain of the monovalent group represented by R 31 is not particularly limited, and is, for example, 1 to 20, preferably 3 to 12, and more preferably 5 to 9.
  • —O—R 31 preferably, a group represented by —O—R 31 a —S—S—R 31 b is mentioned.
  • R 31a represents an alkylene group or -R 311a -NH-COO-R 312a- (R 311a and R 312a are the same or different and each represents an alkylene group).
  • R 31a is preferably an alkylene group.
  • the alkylene group represented by R 31a includes linear or branched ones, and is preferably linear.
  • the number of carbon atoms of the alkylene group is not particularly limited, and is, for example, 3 to 10, preferably 3 to 6, and more preferably 3 to 4.
  • Specific examples of such an alkylene group include n-propylene group, isopropylene group, n-butylene group, isobutylene group and the like.
  • the alkylene group represented by R 311a or R 312a includes linear or branched ones, and is preferably linear.
  • the number of carbon atoms of the alkylene group is not particularly limited, and is, for example, 2 to 10, preferably 2 to 6, and more preferably 2 to 3.
  • Specific examples of such an alkylene group include ethylene group, n-propylene group, isopropylene group, n-butylene group, isobutylene group and the like.
  • R 31 b represents a protecting group.
  • the protective group is not particularly limited as long as it has a function of protecting a disulfide bond, and examples thereof include an alkyl group and an aryl group.
  • the alkyl group represented by R 31 b includes both linear and branched ones.
  • the alkyl group is preferably a branched alkyl group.
  • the carbon number of the alkyl group is not particularly limited, and is, for example, 1 to 6, preferably 2 to 5, more preferably 3 to 5, and still more preferably 4.
  • Specific examples of the alkyl group include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, sec-butyl group, n-pentyl group, neopentyl group, n -Hexyl group, 3-methyl pentyl group and the like.
  • a tert-butyl group is preferably mentioned.
  • the aryl group represented by R 31 b is not particularly limited, but preferably has 6 to 12 carbon atoms, more preferably 6 to 12 carbon atoms, and still more preferably 6 to 8 carbon atoms.
  • the aryl group may be either monocyclic or polycyclic (eg, bicyclic, tricyclic, etc.), but is preferably monocyclic.
  • Specific examples of the aryl group include phenyl group, naphthyl group, biphenyl group, pentarenyl group, indenyl group, anthranyl group, tetracenyl group, pentacenyl group, pyrenyl group, perylenyl group, fluorenyl group, phenanthryl group and the like. Be Among these, preferred is a phenyl group.
  • R 3 preferably, —O—R 31 is mentioned, and more preferably, —O—R 31 a —S—S—R 31 b is mentioned.
  • R 1 is an alkylene group
  • R 2 is a single bond
  • R 3 is -O-R 31a -S-S-R 31b (wherein R 31a is an alkylene group or -R 311a -NH-COO-R 312a- (wherein R 311a and R 312a are the same or different and represent an alkylene group.
  • R 31b represents a protective group).
  • R 1 is an alkylene group having 3 to 6 carbon atoms
  • the R 2 is a single bond
  • the R 3 is —O—R 31 a —S—S 31 b
  • R 31a is an alkylene group having 3 to 6 carbon atoms
  • -R 311a -NH-COO-R 312a- R 311a and R 312a are the same or different and are an alkylene group having 2 to 6 carbon atoms
  • R 31b is a t-butyl group
  • R 1 is a group derived from a ring having a group represented by —S—S— in the ring structure, said R 2 is a single bond, and said R 3 is —O —
  • the R 1 is a 4- to 8-membered ring-derived group having a group represented by —S—S— in the ring structure, the R 2 is a single bond, and the R 3 There -O - include combination of a.
  • combinations (A) and (A1) are preferable, and combination (A1) is more preferable.
  • At least one of R 1 , R 2 and R 3 includes at least one group selected from the group consisting of —S—S— and —SH. In other words, when all of R 1 , R 2 and R 3 do not simultaneously contain at least one group selected from the group consisting of —S—S— and —SH, in the general formula (1) It is excluded from the represented structure.
  • Z 1 and Z 2 are the same or different and each represent —O— or —NH—.
  • at least one of Z 1 and Z 2 is —O—, more preferably both Z 1 and Z 2 are —O—.
  • N is an arbitrary integer.
  • n is, for example, 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 3 to 30, still more preferably 5 to 20, still more preferably 7 to 20, particularly preferably 8 It is ⁇ 15.
  • modified with a molecule containing the structure represented by the general formula (1) means that a polynucleotide is modified with the molecule.
  • the mode of modification is not particularly limited.
  • the modified polynucleotide of the present invention is preferably a modified polynucleotide in which the structure represented by the general formula (1) is linked to the end of the polynucleotide, more preferably the 5 'end of the polynucleotide has the general formula (1) It is a modified polynucleotide in which the structures represented by) are linked.
  • the structure represented by the general formula (1) may be linked to both ends of the polynucleotide.
  • Z 1 may be at the 5 'side of the modified polynucleotide and R 2 may be at the 3' side of the modified polynucleotide, or vice versa, ie, Z 1 is 3 'of the modified polynucleotide. And, it may be oriented that R 2 is 5 'to the modified polynucleotide.
  • another molecule for example, a fluorescent label etc.
  • Z 1 or R 2 may be linked to the polynucleotide to be modified (preferably to the terminal nucleotide).
  • the polynucleotide to be modified is not particularly limited, and in addition to DNA, RNA and the like, known chemical modifications may be applied as exemplified below. Substitution of a phosphate residue (phosphate) of each nucleotide with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methyl phosphonate, phosphorodithionate or the like to prevent degradation by a hydrolase such as nuclease Can.
  • phosphate residue phosphate
  • PS phosphorothioate
  • methyl phosphonate methyl phosphonate
  • phosphorodithionate phosphorodithionate
  • hydroxyl group at position 2 of the sugar (ribose) of each ribonucleotide is represented by —OR (R is, for example, CH 3 (2′-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2′-O-MOE), CH 2 CH 2 NHC (NH) NH 2, CH2 CONHCH3, CH2CH2CN etc. may be substituted).
  • R is, for example, CH 3 (2′-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2′-O-MOE), CH 2 CH 2 NHC (NH) NH 2, CH2 CONHCH3, CH2CH2CN etc.
  • the base moiety pyrimidine, purine
  • the thing modified by the phosphoric acid part and the hydroxyl part for example, biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group etc. can be mentioned, it is not limited to this.
  • BNA LNA
  • BNA LNA
  • which is obtained by fixing the conformation of the sugar moiety to the N-type by cross-linking 2 'oxygen and 4' carbon of the sugar moiety of the nucleotide can also be preferably used.
  • the polynucleotide to be modified may be linked to another molecule.
  • Other molecules include, for example, fluorescent labels.
  • the base length of the polynucleotide to be modified is not particularly limited, and is, for example, 500 bases or less, preferably 200 bases or less, more preferably 100 bases or less, more preferably 50 bases or less, still more preferably 30 bases It is less than long.
  • the lower limit is not particularly limited, and is, for example, 5 bases long, 10 bases long, 15 bases long.
  • the polynucleotide to be modified is preferably mainly intended to be introduced into cells for use.
  • Such polynucleotides of interest include, for example, antisense polynucleotides, siRNAs, miRNAs, miRNA precursors, aptamers, guide RNAs, mRNAs and the like.
  • the modified polynucleotide of the present invention and the modifying molecule of the present invention can be synthesized according to or in accordance with known methods. For example, it can be obtained by performing nucleic acid synthesis by the phosphoroamidite method using a phosphoroamidite monomer capable of forming a structure represented by the general formula (1).
  • a phosphoroamidite monomer capable of forming a structure represented by the general formula (1).
  • R 1 is a divalent group which may contain at least one group selected from the group consisting of —S—S— and —SH
  • R 2 is a single bond.
  • a phosphoroamidite monomer for example, general formula (2):
  • DMTr represents a dimethyltrityl group.
  • R x represents -O-R 31 or -O- (CH 2 ) 2 -CN. Others are the same as described above.
  • the product can be isolated and purified by a conventional method such as chromatography.
  • the structure of the product can be identified by elemental analysis, MS (FD-MS) analysis, IR analysis, 1 H-NMR, 13 C-NMR or the like.
  • the modified polynucleotide of the present invention can efficiently be introduced into cells because it permeabilizes cell membranes efficiently without forming a complex with cationic lipids and the like.
  • the modified polynucleotide of the present invention has relatively low cytotoxicity.
  • the modified polynucleotide of the present invention can be used in various applications for the purpose of introducing the modified polynucleotide into cells, for example, an agent for introducing into cells, medicines, reagents, etc. (It may be shown as "the agent of this invention.)".
  • the agent of the present invention is not particularly limited as long as it contains the modified polynucleotide of the present invention, and may further contain other components as needed.
  • the other ingredients are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable ingredients, but for example, base, carrier, solvent, dispersant, emulsifier, buffer, stabilizer, excipient, binder And disintegrants, lubricants, thickeners, humectants, colorants, perfumes, chelating agents and the like.
  • the use mode of the agent of the present invention is not particularly limited, and an appropriate use mode can be adopted according to the type.
  • the agent of the present invention can be used, for example, in vitro (for example, added to the culture medium in the culture medium) or in vivo (for example, administered to an animal).
  • the application target of the agent of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats and rabbits; animal cells and the like.
  • the type of cells is also not particularly limited.
  • blood cells hematopoietic stem cells / progenitor cells, gametes (sperm, egg), fibroblasts, epithelial cells, vascular endothelial cells, neurons, hepatocytes, hepatocytes, keratinocytes, myocytes And epidermal cells, endocrine cells, ES cells, iPS cells, tissue stem cells, cancer cells and the like.
  • the type of cancer cell is not particularly limited.
  • renal cancer cells for example, renal cancer cells, leukemia cells, esophageal cancer cells, gastric cancer cells, colon cancer cells, liver cancer Cells, pancreatic cancer cells, lung cancer cells, prostate cancer cells, skin cancer cells, breast cancer cells, cervical cancer cells and the like.
  • the dosage form of the agent of the present invention is not particularly limited, and an appropriate dosage form can be taken depending on the use mode.
  • an appropriate dosage form can be taken depending on the use mode.
  • Oral agents such as confectionery tablets, sustained-release agents, sustained-release granules and the like; nasal agents, inhalants, rectal suppositories, insertion agents, external preparations such as enemas, jells and the like.
  • the agent of the present invention may be any of a solid agent, a semisolid agent and a solution.
  • the content of the modified polynucleotide of the present invention in the agent of the present invention depends on the mode of use, target of application, state of target of application, etc., and is not limited, for example, 0.0001 to 95% by weight, preferably It can be 0.001 to 50% by weight.
  • the dosage when administering the agent of the present invention to an animal is not particularly limited as long as it is an effective amount to exert a medicinal effect, and generally, it is generally orally administered as a weight of the modified polynucleotide of the present invention which is an active ingredient.
  • a weight of the modified polynucleotide of the present invention which is an active ingredient.
  • the above dose is preferably administered once a day or divided into two or three times, and can be appropriately increased or decreased depending on the age, condition and symptoms.
  • the DTT type modified polynucleotide (5DTT-DNA) in which the structure represented by is linked and the 3 'end is fluorescently labeled (FAM tag), ⁇ -cyanoethyl phosphoramidite (manufactured by Glen Research), DTT type Using a phosphoroamidite monomer (Reference Example 1) and 6-FAM, a DNA / RNA solid phase synthesizer (NTS M-2-MX, manufactured by Nippon Technoservice Co., Ltd.) was used to synthesize by a standard method.
  • SEQ ID NO: 1 is the antisense sequence of the P. pyralis-derived luciferase gene.
  • the resulting modified polynucleotide was subjected to resin removal and deprotection according to a conventional method, and purified by high performance liquid chromatography.
  • Column: C18 Hydrosphere 10 x 250 mm (manufactured by YMC), Column temperature: Room temperature, Measurement wavelength: 260 nm, Mobile phase: 50 mM triethylammonium acetate buffer (pH 7.0) (+ 5% acetonitrile) / acetonitrile 100: 0 ⁇ 70:30 (20 min, linear gradient).
  • the fraction containing the modified polynucleotide was fractionated and concentrated by a centrifugal evaporator. Structure determination was performed using mass spectrometry (MALDI-TOF MS).
  • the resulting modified polynucleotide was dissolved in ultrapure water, diluted appropriately, and the UV absorption spectrum was measured to determine the concentration.
  • MALDI-MS calcd. 7361.628 [M + H] ⁇ +>; found: 7362.888 [M + H] ⁇ +>.
  • a DTT type modified polynucleotide (10 DTT-DNA) in which the structure represented by was linked and whose 3 'end was fluorescently labeled (FAM labeled) was synthesized in the same manner as Example 1.
  • the Thio L-type modified polynucleotide (5 Thio L-DNA) in which the structure represented by is linked and the 3 'end is fluorescently labeled (FAM-labeled) is replaced with a Thio L-type phosphoroamidite monomer (Reference Example 1).
  • the synthesis was carried out in the same manner as in Example 1 except that the type 1 phosphoramidite monomer (Reference Example 2) was used.
  • MALDI-MS calcd. 7789.695 [M + H] + ; found: 7789.289 [M + H] + .
  • R-DNA DNA (R-DNA) consisting of the base sequence shown in 5'-ACACGTCCTTCTCAGCCCTC (SEQ ID NO: 2) and fluorescently labeled (FAM labeled) at the 3 'end, It was synthesized by a standard method.
  • PS-DNA Phosphorothioate DNA
  • FAM-labeled fluorescently labeled
  • HeLa cells were transfected with pGL3 (Promega), which is an expression plasmid for Photinus pyralis-derived and Renilla reniformis-derived luciferase, and pTK-Green Renilla Luc (manufactured by Thermo Fisher Scientific). By culturing this in the presence of G418 and puromycin, a cell line that stably expresses luciferase, HeLa-LucRluc, was established. The HeLa cells were cultured in DMEM medium (Wako) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U / mL penicillin, and 100 ⁇ g / mL streptomycin.
  • DMEM medium Wako
  • FBS fetal bovine serum
  • the culture conditions were: 37 ° C., an atmosphere of 5% CO 2 , and 95% humidity. 2 ⁇ 10 4 HeLa p13 cells were seeded per well of a 12-well plate and cultured for 1 day.
  • Each of the polynucleotides of Example and Comparative Example was added to 0.3 mL of serum-free DMEM medium to a concentration of 1 ⁇ M and mixed. The resulting mixture was added to the medium and incubated for 3 hours.
  • the unmodified polynucleotide of Comparative Example 1 was added to the culture medium using a nucleic acid transfer reagent (Lipofectoamine 3000, Invitrogen) according to the instructions of the reagent manual and incubated.
  • Test Example 2 Expression suppression test 1 by antisense sequence
  • the polynucleotides of Examples and Comparative Examples having the antisense sequence of the P. pyralis luciferase gene were added to the medium, and the expression level of luciferase was measured. As a result, it was examined whether the polynucleotide permeated through the cell membrane and could exert its function (effect of suppressing gene expression as an antisense nucleic acid). Specifically, it carried out as follows.
  • HeLa-LucRluc cells HeLa cells that stably express P. pyralis luciferase and Renilla luciferase) to 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U / mL penicillin, and 100 ⁇ g / mL streptomycin It culture
  • the culture conditions were: 37 ° C., an atmosphere of 5% CO 2 , and 95% humidity. 2 ⁇ 10 4 HeLa-LucRluc cells were seeded per well of a 12-well plate and cultured for 1 day.
  • each of the polynucleotides of Example and Comparative Example was added to 0.3 mL of serum-free DMEM medium to a concentration of 1 ⁇ M and mixed. The resulting mixture was added to the culture medium and incubated.
  • each of the polynucleotides of Example 4 and Comparative Examples 1 and 3 was added to the culture medium using a nucleic acid transfer reagent (Lipofectoamine 3000, Invitrogen) according to the instructions of the reagent manual and incubated. After the incubation, cells were lysed with reporter lysis buffer (Promega). The luciferase activity (P.
  • pyralis luciferase activity and Renilla luciferase activity were measured using a luminometer (uminescencer-PSN, manufactured by ATTO) and a luciferase assay reagent (manufactured by Promega).
  • Test Example 3 Cytotoxicity test 1 The cytotoxicity of the polynucleotides of Examples and Comparative Examples was examined by MTT assay. Specifically, it carried out as follows.
  • HeLa-LucRluc cells HeLa cells that stably express P. pyralis luciferase and Renilla luciferase) to 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U / mL penicillin, and 100 ⁇ g / mL streptomycin It culture
  • the culture conditions were: 37 ° C., an atmosphere of 5% CO 2 , and 95% humidity. 2 ⁇ 10 4 HeLa-LucRluc cells were seeded per well of a 96-well plate and cultured for 1 day.
  • the polynucleotides of Example and Comparative Example were added to 0.3 mL of serum-free DMEM medium to a concentration of 1 ⁇ M or 5 ⁇ M and mixed. The resulting mixture was added to the culture medium and incubated.
  • the unmodified polynucleotide of Comparative Example 1 was added to the culture medium using a nucleic acid transfer reagent (Lipofectoamine 3000, Invitrogen) according to the instructions of the reagent manual and incubated. After incubation for 24 hours, 20 ⁇ L of CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent (manufactured by Promega) was added and incubated for 2.5 hours. Absorbance at 490 nm was measured using a 96 well plate reader. The higher the absorbance, the lower the cytotoxicity of the added polynucleotide.
  • a Thio L-type modified polynucleotide (5 ⁇ tBu-PS-DNA) was synthesized in the same manner as in Example 3 in which the structures represented by were linked and the 3 'end was fluorescently labeled (FAM labeled).
  • a Thio L-modified modified polynucleotide (10 ⁇ tBu-PS-DNA) was synthesized in the same manner as in Example 3 in which the structures represented by were linked and the 3 'end was fluorescently labeled (FAM labeled).
  • PS-DNA Phosphorothioate DNA
  • FAM-labeled fluorescently labeled
  • the 3 'end of the RNA consisting of 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAAAUU has the following formula (C):
  • the objective is 1 ⁇ annealing buffer (60 mM KCl, 6 mM HEPES-KOH pH 7.5, 0.2 mM MgCl 2 )
  • the solution was adjusted to a concentration (0.1 to 1 ⁇ M), placed at 90 ° C. for 3 minutes, allowed to stand for 3 hours to return to room temperature, and double-stranded RNA (Thio L type siRNA (5 ⁇ Thio L siRNA (3 ⁇ 3 ')) was formed.
  • the objective is 1 ⁇ annealing buffer (60 mM KCl, 6 mM HEPES-KOH pH 7.5, 0.2 mM MgCl 2 )
  • the solution was adjusted to a concentration (0.1 to 1 ⁇ M), placed at 90 ° C. for 3 minutes, allowed to stand for 3 hours to return to room temperature, and double-stranded RNA (Thio L type siRNA (5 ⁇ Thio L siRNA (3 ⁇ 5 ')) was formed.
  • Comparative Example 5 Synthesis of unmodified siRNA RNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 and RNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 were synthesized by a standard method, and double-stranded (unmodified siRNA) was prepared in the same manner as in Example 7. It was formed.
  • Test Example 4 Cell membrane permeability test 2 The experiment was performed in the same manner as in Test Example 1 except that the antisense polynucleotides of Example 5 and Example 6 and Comparative Example 4 were used as the polynucleotide. The polynucleotide concentration was 100 nM.
  • Test Example 5 Expression suppression test 2 by antisense sequence The experiment was performed in the same manner as in Test Example 2 except that the antisense polynucleotides of Example 5 and Comparative Example 4 were used as the polynucleotide. The polynucleotide concentration was 1 ⁇ M.
  • Test Example 6 Cytotoxicity test 2 The experiment was carried out in the same manner as in Test Example 3 except that the antisense polynucleotides of Example 5 and Comparative Example 4 were used as polynucleotides.
  • the polynucleotide concentration was 5 ⁇ M.
  • Test Example 7 siRNA expression suppression test 1 The experiment was performed in the same manner as in Test Example 2 except that siRNAs of Example 7, Example 8 and Comparative Example 5 were used as polynucleotides.
  • the polynucleotide concentration was 1 ⁇ M or 100 nM.
  • a procationic modified polynucleotide (5 ⁇ cation-PS-DNA) in which the structure represented by is linked and whose 3 'end is fluorescently labeled (FAM labeled) is a procationic phosphoramidite monomer (Reference Example) It synthesize
  • PS-DNA Phosphorothioate DNA
  • FAM-labeled fluorescently labeled
  • a procationic modified single-stranded RNA (5 ⁇ cagtion guide strand (3 ′)) formed by linking the structures represented by is used in Example 1 using a procationic phosphoramidite monomer (Reference Example 3). It synthesize
  • the 3 'end of the RNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 has the following formula (E):
  • the objective is 1 ⁇ annealing buffer (60 mM KCl, 6 mM HEPES-KOH pH 7.5, 0.2 mM MgCl 2 )
  • the solution was adjusted to a concentration (0.1 to 1 ⁇ M), placed at 90 ° C. for 3 minutes, allowed to stand for 3 hours to return to room temperature, and then double-stranded RNA (procationic siRNA (5 ⁇ cation siRNA (3 ′ & 3 '))) was formed.
  • Example 1 using procationic phosphoramidite monomer (Reference Example 3) from procationic modified single-stranded RNA (5 ⁇ cation passenger strand (5 ′)) in which the structures represented by It synthesize
  • the objective is 1 ⁇ annealing buffer (60 mM KCl, 6 mM HEPES-KOH pH 7.5, 0.2 mM MgCl 2 )
  • the solution was adjusted to a concentration (0.1 to 1 ⁇ M), placed at 90 ° C. for 3 minutes, allowed to stand for 3 hours to return to room temperature, and then double-stranded RNA (procationic siRNA (5 ⁇ cation siRNA (3 ′ & 5 '))) was formed.
  • Test Example 8 Cell membrane permeability test 3 The experiment was performed in the same manner as in Test Example 1 except that the antisense polynucleotides of Example 9 and Comparative Example 6 were used as polynucleotides. The polynucleotide concentration was 100 nM.
  • Test Example 9 Cytotoxicity test 3 The experiment was carried out in the same manner as in Test Example 3 except that the antisense polynucleotides of Example 9 and Comparative Example 6 were used as polynucleotides.
  • the polynucleotide concentration was 1 ⁇ M.

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Abstract

より簡便に且つより細胞毒性が低減された状態で、ポリヌクレオチドを細胞内に導入する技術を提供することを課題し、該課題を、ジスルフィド結合及び／又はチオール基を含む構造を含む分子で修飾されたポリヌクレオチドにより解決する。

Description

修飾ポリヌクレオチド
　本発明は、修飾ポリヌクレオチド等に関する。
　医療分野等においては、siRNA等のポリヌクレオチドを細胞内に導入して、その機能を発現させる技術の開発が進められている。ポリヌクレオチドはリン酸基の存在により負に帯電しているので、同じく負に帯電している細胞膜を透過する効率が低い。このため、ポリヌクレオチドを細胞内に導入する場合、ポリヌクレオチドをカチオン性脂質と複合体化し、これを細胞内に導入することにより、導入効率を高めることが行われている（特許文献１）。
　ただ、カチオン性脂質を用いる場合、細胞内への導入前にポリヌクレオチドと複合体化する作業を要する。また、カチオン性脂質には細胞毒性があることが知られている。
特表第2002-529439号公報
　本発明は、より簡便に且つより細胞毒性が低減された状態で、ポリヌクレオチドを細胞内に導入する技術を提供することを課題とする。好ましくは、本発明は、より効率的に、ポリヌクレオチドを細胞内に導入する技術を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究をした結果、ジスルフィド結合及び／又はチオール基を含む構造を含む分子で修飾されたポリヌクレオチドであれば、カチオン性脂質との複合体形成のような煩雑な操作を要さず、単に該修飾ポリヌクレオチドを細胞培養培地に添加することにより、より効率的に細胞内に導入されることを見出した。また、該修飾ポリヌクレオチドは、細胞毒性がより低いことをも見出した。本発明者はこれらの知見に基づいてさらに研究を進め、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
［式中、R1及びR2は同一又は異なって、単結合、又は－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい二価の基を示す。R3は、－O－、又は－O－R31（式中、R31は、－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい一価の基を示す。）を示す。Z1及びZ2は同一又は異なって、－O－又は－NH－を示す。但し、R1、R2、及びR3の内の少なくとも1つは－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含む。nは任意の整数を示す。］
で表される構造を含む分子で修飾されてなる、修飾ポリヌクレオチド。
　項２．　前記R1がアルキレン基、又は環構造中に－S－S－を有する環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が－O－、又は－O－R31a－S－S－R31b（式中、R31aはアルキレン基又は－R311a－NH－COO－R312a－（R311a及びR312aは同一又は異なって、アルキレン基を示す。）を示す。R31bは保護基を示す。）である、項１に記載の修飾ポリヌクレオチド。
　項３．　（A）前記R1がアルキレン基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が－O－R31a－S－S－R31b（式中、R31aはアルキレン基又は－R311a－NH－COO－R312a－（R311a及びR312aは同一又は異なって、アルキレン基を示す。）を示す。R31bは保護基を示す。）である、或いは
（B）前記R1が環構造中に－S－S－で表される基を有する環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が－O－である、
項１又は２に記載の修飾ポリヌクレオチド。
　項４．　（A1）前記R1が炭素原子数が3～6のアルキレン基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が－O－R31a－S－S－R31b（式中、R31aは炭素原子数が3～6のアルキレン基又は－R311a－NH－COO－R312a－（R311a及びR312aは同一又は異なって、炭素原子数が2～6のアルキレン基を示す。）を示す。R31bはアルキル基又はアリール基を示す。）である、或いは
（B1）前記R1が環構造中に－S－S－で表される基を有する4～8員環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が－O－である、
項１～３のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
　項５．　前記nが1～30である、項１～４のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
　項６．　前記Z1及び前記Z2が共に－O－である、項１～５のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
　項７．　ポリヌクレオチドが、細胞内への導入用のポリヌクレオチドである、項１～６のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
　項８．　ポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、siRNA、miRNA、miRNA前駆体、アプタマー、ガイドRNA、mRNA、ノンコーディングRNA、DNA、非天然核酸(LNA、PNA、モルフォリノ核酸からなる群より選択される少なくとも1種である、項１～７のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
　項９．　ポリヌクレオチドの塩基長が200塩基長以下である、項１～８のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
　項１０．　ポリヌクレオチドの末端に前記一般式（1）で表される構造が連結されてなる、項１～９のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
　項１１．　ポリヌクレオチドの5´末端に前記一般式（1）で表される構造が連結されてなる、項１～１０のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
　項１２．　項１～１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、該修飾ポリヌクレオチドの細胞内への導入剤。
　項１３．　項１～１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、医薬。
　項１４．　項１～１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、試薬。
　項１５．　一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［式中、R1及びR2は同一又は異なって、単結合、又は－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい二価の基を示す。R3は、－O－、又は－O－R31（式中、R31は、－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい一価の基を示す。）を示す。Z1及びZ2は同一又は異なって、－O－又は－NH－を示す。但し、R1、R2、及びR3の内の少なくとも1つは－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含む。nは任意の整数を示す。］
で表される構造を含むポリヌクレオチド修飾用分子。
　本発明によれば、ジスルフィド結合及び／又はチオール基を含む構造を含む分子で修飾されたポリヌクレオチドを用いることにより、より簡便に且つより細胞毒性が低減された状態で、ポリヌクレオチドを細胞内に導入する技術を提供することができる。本発明の好ましい一態様においては、カチオン性脂質を用いる従来技術よりも効率的に、ポリヌクレオチドを細胞内に導入することが可能である。
試験例1の細胞膜透過性試験の結果を示す。横軸中、「N.A.」はポリヌクレオチドを培地に添加していない場合を示し、その他は、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（DNA（比較例1）、PS-DNA（比較例3）、5DTT（実施例1）、10DTT（実施例2）、5ThioL（実施例3）、10ThioL（実施例4））、或いはDNA（比較例1）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（DNA/Lipo3000）を示す。縦軸は、ポリヌクレオチドに付加されたFAMに由来する蛍光の強度（平均値）の相対値を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。各カラム上、**は「N.A.」に対するP値が0.01未満であることを示し、***は「N.A.」に対するP値が0.001未満であることを示し、#は「DNA/Lipo3000」に対するP値が0.05未満であることを示し、##は「DNA/Lipo3000」に対するP値が0.01未満であることを示し、###は「DNA/Lipo3000」に対するP値が0.001未満であることを示す。 試験例2の発現抑制試験の結果を示す。横軸中、「N.A.」はポリヌクレオチドを培地に添加していない場合を示し、その他は、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（DNA（比較例1）、PS-DNA（比較例3）、10ThioL（実施例4））、或いはDNA（比較例1）、R-DNA（比較例2）、又は10ThioL（実施例4）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（～/Lipo3000）を示す。縦軸は、ルシフェラーゼ活性比（P. pyralisルシフェラーゼ活性値／Renillaルシフェラーゼ活性値）（平均値）の相対値を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。各カラム上、*は「N.A.」に対するP値が0.05未満であることを示す。 試験例3の細胞毒性試験の結果を示す。横軸中、「N.A.」はポリヌクレオチドを培地に添加していない場合を示し、その他は、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（DNA（比較例1）、PS-DNA（比較例3）、5 x DTT（実施例1）、10 x DTT（実施例2）、5 x ThioL（実施例3）、10 x ThioL（実施例4））、或いはDNA（比較例1）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（DNA/Lipo3000）を示す。縦軸は、吸光度（平均値）の相対値を示す。黒カラムは添加したポリヌクレオチド液中のポリヌクレオチド濃度が1μMである場合を示し、グレーカラムは同濃度が5μMである場合を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。各カラム上、*は「N.A.」に対するP値が0.05未満であることを示し、**は「N.A.」に対するP値が0.01未満であることを示し、***は「N.A.」に対するP値が0.001未満であることを示す。 試験例4の細胞膜透過性試験の結果を示す。横軸中、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（PS-DNA（比較例4）、5×tBu（実施例5）、10×tBu（実施例6））、或いはPS-DNA（比較例4）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（PS-DNA/Lipo）を示す。縦軸は、ポリヌクレオチドに付加されたFAMに由来する蛍光の強度（平均値）を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。 試験例5の発現抑制試験の結果を示す。横軸中、「N.A.」はポリヌクレオチドを培地に添加していない場合を示し、その他は、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（PS-DNA（比較例4）、5×tBu（実施例5））、或いはPS-DNA（比較例4）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（PS-DNA/Lipo）を示す。縦軸は、ルシフェラーゼ活性比（P. pyralisルシフェラーゼ活性値／Renillaルシフェラーゼ活性値）（平均値）の相対値を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。 試験例6の細胞毒性試験の結果を示す。横軸中、「N.A.」はポリヌクレオチドを培地に添加していない場合を示し、その他は、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（PS-DNA（比較例4）、5×tBu（実施例5））、或いはPS-DNA（比較例4）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（PS-DNA/Lipo）を示す。縦軸は、吸光度（平均値）の相対値を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。 試験例7の発現抑制試験の結果を示す。横軸中、「N.A.」はポリヌクレオチドを培地に添加していない場合を示し、その他は、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（siRNA（比較例5）、5×ThioL (3’ & 3’)（実施例7）、5×ThioL (3’ & 5’)（実施例8））、或いはsiRNA（比較例5）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（siRNA/Lipo）を示す。縦軸は、ルシフェラーゼ活性比（P. pyralisルシフェラーゼ活性値／Renillaルシフェラーゼ活性値）（平均値）の相対値を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。***は「N.A.」に対するP値が0.001未満であることを示す。##は「siRNA/Lipo」に対するP値が0.01未満であることを示す。 試験例8の細胞膜透過性試験の結果を示す。横軸中、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（PSDNA（比較例6）、5×linker（実施例9））、或いはPSDNA（比較例6）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（PSDNA/Lipo）を示す。縦軸は、ポリヌクレオチドに付加されたFAMに由来する蛍光の強度（平均値）を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。***はP値が0.001未満であることを示す。 試験例9の細胞毒性試験の結果を示す。横軸中、「control」はポリヌクレオチドを培地に添加していない場合を示し、その他は、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（PSDNA（比較例6）、5×linker（実施例9））、或いはPSDNA（比較例6）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（PSDNA/Lipo）を示す。縦軸は、吸光度（平均値）の相対値を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。*はP値が0.05未満であることを示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　1．修飾ポリヌクレオチド及び修飾用分子
　本発明は、その一態様において、一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
で表される構造を含む分子で修飾されてなる、修飾ポリヌクレオチド（本明細書において、「本発明の修飾ポリヌクレオチド」と示すこともある。）、及び該構造を含むポリヌクレオチド修飾用分子（本明細書において、「本発明の修飾用分子」と示すこともある。）に係る。以下、これについて説明する。
　R1及びR2は同一又は異なって、単結合、又は－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい二価の基を示す。
　R1又はR2で示される二価の基としては、例えばリンカーとして機能し得る基（以下、単に「リンカー」と示すこともある。）、環由来の基、これらが2つ以上連結してなる基等が挙げられる。
　リンカーとしては、例えばアルキレン基、アルケニレン基、ヘテロアルキレン基（例えば、主鎖中に－S－S－を含むヘテロアルキレン基、主鎖中に－NH－COO－を含むヘテロアルキレン基等）等が挙げられる。リンカーは、直鎖状又は分岐鎖状のいずれのものも包含し、好ましくは直鎖状である。リンカーの主鎖を構成する原子数（アルキレン基及びアルケニレン基の場合は、炭素原子数）は、特に制限されず、例えば3～10、好ましくは3～6、より好ましくは3～4である。リンカーとして、好ましくはアルキレン基が挙げられ、より好ましくは炭素原子数3～6のアルキレン基が挙げられ、さらに好ましくは炭素原子数3～4のアルキレン基が挙げられ、よりさらに好ましくは炭素原子数3～4の直鎖状のアルキレン基が挙げられる。このようなアルキレン基の具体例としては、ｎ－プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ－ブチレン基、イソブチレン基等が挙げられる。
　環由来の基は、環から2つの水素原子が除かれてなる二価の基であり、この限りにおいて特に制限されない。環としては、特に制限されず、単環式又は二環式が好ましく、単環式がより好ましい。環構成原子は、特に制限されず、例えば炭素原子のみである場合、炭素原子とヘテロ原子（例えば、窒素原子、硫黄原子、酸素原子等）からなる場合等が挙げられる。環構成原子数は、特に制限されず、例えば、3～20、好ましくは3～12、より好ましくは4～8、さらに好ましくは5～7である。このような環としては、例えば環構造中に－S－S－を有する環、シクロアルカン、シクロアルケン、ベンゼン、ナフタレン等が挙げられ、好ましくは環構造中に－S－S－を有する環が挙げられる。環構造中に－S－S－を有する環として、具体的には、シクロアルカン又はシクロアルケン（好ましくはシクロアルカン）中の1つの－C－C－が－S－S－に置き換えられてなる環が挙げられる。
　R1としては、好ましくは－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい二価の基が挙げられ、より好ましくはアルキレン基、環構造中に－S－S－を有する環由来の基等が挙げられ、より好ましくはアルキレン基が挙げられる。
　R2としては、好ましくは単結合が挙げられる。
　R3は、－O－、又は－O－R31を示す。
　R31は、－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい一価の基を示す。R31で示される一価の基としては、例えばアルキル基、アルケニル基、ヘテロアルキル基（例えば、主鎖中に－S－S－を含むヘテロアルキル基、主鎖中に－NH－COO－を含むヘテロアルキル基等）、上記環由来の基、これらが2つ以上連結してなる基等が挙げられる。R31で示される一価の基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれの者も包含する。R31で示される一価の基の主鎖を構成する原子数は、特に制限されず、例えば1～20、好ましくは3～12、より好ましくは5～9である。
　－O－R31としては、好ましくは－O－R31a－S－S－R31bで示される基が挙げられる。
　R31aはアルキレン基又は－R311a－NH－COO－R312a－（R311a及びR312aは同一又は異なって、アルキレン基を示す。）を示す。R31aは好ましくはアルキレン基である。
　R31aで示されるアルキレン基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれのものも包含し、好ましくは直鎖状である。該アルキレン基の炭素原子数は、特に制限されず、例えば3～10、好ましくは3～6、より好ましくは3～4である。このようなアルキレン基の具体例としては、ｎ－プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ－ブチレン基、イソブチレン基等が挙げられる。
　R311a又はR312aで示されるアルキレン基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれのものも包含し、好ましくは直鎖状である。該アルキレン基の炭素原子数は、特に制限されず、例えば2～10、好ましくは2～6、より好ましくは2～3である。このようなアルキレン基の具体例としては、エチレン基、ｎ－プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ－ブチレン基、イソブチレン基等が挙げられる。
　R31bは保護基を示す。保護基としては、ジスルフィド結合を保護する機能を有するものであれば特に制限されず、例えばアルキル基、アリール基等が挙げられる。
　R31bで示されるアルキル基には、直鎖状又は分岐鎖状のいずれのものも包含される。該アルキル基は、好ましくは分岐鎖状アルキル基である。該アルキル基の炭素数は、特に制限されず、例えば1～6、好ましくは2～5、より好ましくは3～5、さらに好ましくは4である。該アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、n－プロピル基、イソプロピル基、n－ブチル基、イソブチル基、tert－ブチル基、sec－ブチル基、n－ペンチル基、ネオペンチル基、n－ヘキシル基、3－メチルペンチル基等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはtert-ブチル基が挙げられる。
　R31bで示されるアリール基は、特に制限されないが、炭素数が6～12のものが好ましく、6～12のものがより好ましく、6～8のものがさらに好ましい。該アリール基は、単環式又は多環式（例えば2環式、3環式等）のいずれでも有り得るが、好ましくは単環式である。該アリール基としては、具体的には、例えばフェニル基、ナフチル基、ビフェニル基、ペンタレニル基、インデニル基、アントラニル基、テトラセニル基、ペンタセニル基、ピレニル基、ペリレニル基、フルオレニル基、フェナントリル基等が挙げられる。これらの中でも好ましくはフェニル基が挙げられる。
　R3としては、好ましくは－O－R31が挙げられ、より好ましくは－O－R31a－S－S－R31bが挙げられる。
　本発明の好ましい一態様において、R1、R2、R3の組み合わせとして、
好ましくは
（A）前記R1がアルキレン基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が－O－R31a－S－S－R31b（式中、R31aはアルキレン基又は－R311a－NH－COO－R312a－（R311a及びR312aは同一又は異なって、アルキレン基を示す。を示す。R31bは保護基を示す。）であるという組み合わせが挙げられ、
より好ましくは
（A1）前記R1が炭素原子数が3～6のアルキレン基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が－O－R31a－S－S－R31b（式中、R31aは炭素原子数が3～6のアルキレン基又は－R311a－NH－COO－R312a－（R311a及びR312aは同一又は異なって、炭素原子数が2～6のアルキレン基を示す。）を示す。R31bはt-ブチル基を示す。）であるという組み合わせが挙げられる。
　本発明の別の好ましい一態様において、R1、R2、R3の組み合わせとして、
好ましくは
（B）前記R1が環構造中に－S－S－で表される基を有する環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が－O－であるという組み合わせが挙げられ、
より好ましくは
（B1）前記R1が環構造中に－S－S－で表される基を有する4～8員環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が－O－であるという組み合わせが挙げられる。　上記R1、R2、R3の組み合わせの中でも、組み合わせ（A）及び（A1）が好ましく、組み合わせ（A1）がより好ましい。
　上記R1、R2、及びR3の内の少なくとも1つは、－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含む。換言すれば、上記R1、R2、及びR3の全てが同時に－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含まない場合は、一般式（1）で表される構造からは除かれる。
　Z1及びZ2は同一又は異なって、－O－又は－NH－を示す。好ましくはZ1及びZ2の少なくとも一方が－O－であり、より好ましくはZ1及びZ2が共に－O－である。
　nは任意の整数を示す。nは、例えば1～50であり、好ましくは1～30であり、より好ましくは3～30であり、さらに好ましくは5～20であり、よりさらに好ましくは7～20であり、特に好ましくは8～15である。
　「一般式（1）で表される構造を含む分子で修飾されてなる」とは、ポリヌクレオチドが該分子で修飾されてなることを意味する。
　修飾の態様は、特に制限されない。本発明の修飾ポリヌクレオチドは、好ましくはポリヌクレオチドの末端に一般式（1）で表される構造が連結されてなる修飾ポリヌクレオチドであり、より好ましくはポリヌクレオチドの5´末端に一般式（1）で表される構造が連結されてなる修飾ポリヌクレオチドである。また、ポリヌクレオチドの両末端に一般式（1）で表される構造が連結されていてもよい。
　一般式（1）で表される構造の向きは特に制限されない。例えば、Z1が修飾ポリヌクレオチドの5´側であり且つR2が修飾ポリヌクレオチドの3´側という向きであってもよいし、その逆、すなわちZ1が修飾ポリヌクレオチドの3´側であり且つR2が修飾ポリヌクレオチドの5´側であるという向きであってもよい。
　本発明の修飾ポリヌクレオチドにおいては、末端のZ1又はR2には、他の分子（例えば、蛍光標識等）が連結していてもよいし、連結していなくてもよい。後者の場合、通常は、水素原子が連結している。また、Z1又はR2は、修飾対象のポリヌクレオチドに（好ましくは末端のヌクレオチドに）連結していてもよい。
　修飾対象のポリヌクレオチドは、特に制限されず、DNA、RNA等の他にも、次に例示するように、公知の化学修飾が施されていてもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、好ましく用いられ得る。
　修飾対象のポリヌクレオチドは、他の分子が連結されたものであってもよい。他の分子としては、例えば蛍光標識等が挙げられる。
　修飾対象のポリヌクレオチドの塩基長は、特に制限されず、例えば500塩基長以下、好ましくは200塩基長以下、より好ましくは100塩基長以下、さらに好ましくは50塩基長以下、よりさらに好ましくは30塩基長以下である。下限は、特に制限されず、例えば5塩基長、10塩基長、15塩基長である。
　修飾対象のポリヌクレオチドは、細胞内へ導入して使用されることを主な目的としたものであることが好ましい。このような目的のポリヌクレオチドとしては、例えばポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、siRNA、miRNA、miRNA前駆体、アプタマー、ガイドRNA、mRNA等が挙げられる。
　本発明の修飾ポリヌクレオチド及び本発明の修飾用分子は、公知の方法に従って又は準じて合成することができる。例えば、一般式（1）で表される構造を形成可能なホスホロアミダイトモノマーを用いて、ホスホロアミダイト法による核酸合成を行うことにより、得ることができる。具体例として、R1が－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい二価の基であり、且つR2が単結合である場合であれば、ホスホロアミダイトモノマーとして、例えば、一般式（2）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
［式中、DMTrはジメチルトリチル基を示す。Rxは－O－R31又は－O－(CH2)2－CNを示す。その他については前記に同じである。］
で表される化合物を用いて、定法に従って又は準じてホスホロアミダイト法による核酸合成を行う方法が挙げられる。
　合成終了後、生成物はクロマトグラフィー法等の通常の方法で単離精製することができる。また、生成物の構造は、元素分析、MS（FD-MS）分析、IR分析、1H-NMR、13C-NMR等により同定することができる。
　2．用途
　本発明の修飾ポリヌクレオチドは、カチオン性脂質等と複合体を形成させなくとも、単独で、効率的に細胞膜を透過するので、効率的に細胞内に導入することができる。また、本発明の修飾ポリヌクレオチドは、細胞毒性が比較的低い。このため、本発明の修飾ポリヌクレオチドは、該修飾ポリヌクレオチドの細胞内への導入を目的とする種々の用途、例えば細胞内への導入剤、医薬、試薬等（以下、これらを総称して「本発明の剤」と示すこともある。）に利用することができる。
　本発明の剤は、本発明の修飾ポリヌクレオチドを含有する限りにおいて特に制限されず、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
　本発明の剤の使用態様は、特に制限されず、その種類に応じて適切な使用態様を採ることができる。本発明の剤は、例えばin vitroで使用する（例えば、培養細胞の培地に添加する）こともできるし、in vivoで使用する（例えば、動物に投与する）こともできる。
　本発明の剤の適用対象は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類動物；　動物細胞等が挙げられる。細胞の種類も特に制限されず、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞等が挙げられる。
　本発明の剤を抗がん剤として用いる場合、そのがん細胞の種類は特に限定されず、例えば腎臓がん細胞、白血病細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、大腸がん細胞、肝臓がん細胞、すい臓がん細胞、肺がん細胞、前立腺がん細胞、皮膚がん細胞、乳がん細胞、子宮頚がん細胞等が挙げられる。
　本発明の剤の剤形は特に制限されず、その使用態様に応じて適切な剤形を採ることができる。例えば、動物に投与する場合であれば、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、シロップ剤、腸溶剤、徐方性カプセル剤、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放剤、徐放性顆粒剤等の経口剤；　点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤等の外用剤等が挙げられる。また、本発明の剤は、固形剤、半固形剤、液剤のいずれでもよい。
　本発明の剤中の本発明の修飾ポリヌクレオチドの含有量は、使用態様、適用対象、適用対象の状態等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～95重量％、好ましくは0.001～50重量％とすることができる。
　本発明の剤を動物に投与する場合の投与量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分である本発明の修飾ポリヌクレオチドの重量として、一般に経口投与の場合には一日あたり0.1～1000 mg/kg体重、好ましくは一日あたり0.5～50 mg/kg体重であり、非経口投与の場合には一日あたり0.01～100 mg/kg体重、好ましくは0.1～10 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2～3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　参考例1．DTT型ホスホロアミダイトモノマーの合成
　以下の合成スキームに従って、DTT型ホスホロアミダイトモノマー（化合物5）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　＜化合物3の合成＞
　ジチオスレイトール(DTT)(1.54 g, 10.0 mmol)にジメチルスルホキシド(0.78 mL)を加えて110℃で4時間撹拌した。室温に冷却後、生じた固体をジクロロメタンに懸濁させ、吸引ろ過にて濾取した。濾取した固体は少量の酢酸エチルで洗浄し、真空下で乾燥させることで目的化合物3を白色固体として得た(1.26 g, 82%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 5.24 (2H, d, J = 3.2 Hz), 3.33 (2H, br. s), 3.03 (2H, d, J = 13.2 Hz), 2.74 (1H, d, J = 13.2 Hz) , 2.72 (1H, d, J = 13.6 Hz)。
　＜化合物4の合成＞
　化合物3 (1 g, 6.57 mmol)をメタノールで２回、続いて無水ピリジンで２回共沸した。残渣を無水ピリジン(15 mL)に溶解させた後、ジメトキシトリチルクロライド(3.0 g, 8.85 mmol)を加えて室温にて撹拌した。４時間後、ジメトキシトリチルクロライド(2.0 g, 5.90 mmol)を追加して室温にて撹拌した。４時間後、反応液にメタノールを加えた後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解させて、水、続いて飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧濃縮した。得られた残渣を中性フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル =  90 : 10 + 1%トリエチルアミン → 80 : 20 + 1%トリエチルアミン)にて精製し、目的化合物4を白色泡状固体として得た(1.67 g, 56%)。
ESI-MS : calcd. for C25H26NaO4S2  477.1170[M+Na]+, found : 477.1262 [M+Na]+。
　＜化合物5の合成＞
　化合物4 (300 mg, 0.66 mmol)を無水アセトニトリルで２回共沸した。残渣をジクロロメタン(2 mL)に溶解させ、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(350 μL, 1.98 mmol)を加えた後、0℃にて2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(217 μL, 0.99 mmol)を滴下し撹拌した。20分後、反応液を酢酸エチルで希釈し、水、続いて飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧濃縮した。得られた残渣を中性フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル =  20 : 1, + 1%トリエチルアミン → 8 : 1, + 1%トリエチルアミン)にて精製し、目的化合物5を白色泡状固体として得た(280 mg, 65%)。
31P NMR (121 MHz, CDCl3)δ: 148.4, 148.1
ESI-MS : calcd for C34H43N2NaO5PS2  677.2249[M+Na]+, found : 677.2134 [M+Na]+。
　参考例2．ThioL型ホスホロアミダイトモノマーの合成
　以下の合成スキームに従って、ThioL型ホスホロアミダイトモノマー（化合物4）を合成した。3-メルカプトプロパノールを出発原料とし、チオール基をジスルフィド構造へと変換し化合物1を得た。別途合成したC3リンカー誘導体3とカップリングさせることでThioL型ホスホロアミダイトモノマー4を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　＜化合物1の合成＞
　アルゴン雰囲気下、撹拌中のジ-tert-ブチル1-(tert-ブチルチオ)-1,2-ヒドラジンジカルボキシレート(3.0 g, 9.36 mmol)とトリエチルアミン(1.09 mL, 7.80 mmol)のアセトニトリル溶液(36 mL)に3-メルカプトプロパノール(808 μL, 9.36 mmol)を滴下した。室温にて終夜撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。得られた残渣にヘキサン(10 mL)を加えて生じた沈殿を濾過にて除去し、濾液を減圧濃縮した。残渣を中性フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン/酢酸エチル = 15 : 1)にて精製し、目的化合物1を淡黄色油状物質として得た(731 mg, 85%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 3.75 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.82 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.93 (2H, m, J = 6.8 Hz), 1.33 (s, 9H)。
　＜化合物2の合成＞
　プロパンジオール(13 mL, 181.0 mmol)のピリジン溶液(52 mL)にジメトキシトリチルクロライド(3.0 g, 9.10 mmol)のピリジン溶液(20 mL)を加え、室温にて撹拌した。26時間後、反応液を減圧濃縮した後、酢酸エチル(20 mL)に溶解させ、水(80 mL)で2回、次いで飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧濃縮した。得られた残渣を中性フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル =  3 : 1 → 1 : 1)にて精製し、目的化合物2を白色固体として得た(2.50 g, 83%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ:7.43－7.38 (2H, m), 7.33－7.26 (5H, m), 7.24－7.16 (2H, m), 6.79－6.85 (4H, m), 3.87 (1H, t, J = 5.6 Hz), 3.79 (3H, s), 3.78 (3H, s), 3.28 (1H, t, J = 5.6 Hz), 1.91－1.80 (2H, m), 1.60 (1H, br. s)
ESI-MS : calcd. for C24H26NaO4  401.1723 [M+Na]+, found : 401.176 [M+Na]+。
　＜化合物4の合成＞
　ビス(N,N-ジイソプロピルアミノ)クロロフォスフィン(240　mg, 0.79 mmol)、トリエチルアミン(120 μL)の無水テトラヒドロフラン溶液(5 mL)に0℃にて化合物2 (300 mg, 0.79 mmol)の無水テトラヒドロフラン溶液(3 mL)を滴下した。室温にて反応溶液を撹拌し、100分後に31P NMRにて反応の終結を確認した(135.5 ppm から121.8 ppm, C6D6)。反応溶液に化合物1(142 mg, 0.79 mmol)、次いで5-ベンジルチオ-1H-テトラゾールのアセトニトリル溶液(0.25M, 750 μL)を加えた。室温にて反応溶液を撹拌し、80分後に31P NMRにて反応の終結を確認した(121.8 ppm から147.0 ppm, C6D6)。反応溶液を酢酸エチル(70 mL)で希釈し、飽和重曹水(70 mL)、水(70 mL)、次いで飽和食塩水(70 mL)で2回洗浄した。有機層を減圧濃縮し、得られた残渣を中性フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル =  15 : 1, +1%トリエチルアミン)にて精製し、目的化合物4を淡黄色油状物質として得た(189 mg, 63%)。
31P NMR (121 MHz, C6D6)  δ: 146.97
1H NMR (400 MHz, C6D6) δ:7.68 (d, 2H, J = 11.0 Hz), 7.51 (4H, d, J = 11.2 Hz), 7.19 (3H, d, J = 11.4 Hz)，6.79 (4H, d, J = 11 Hz), 3.31(14H, m), 2.11(2H, m), 1.92 (2H, m), 1.19 (9H, s, 3CH3; 12H, d, 3CH3)
13C NMR (100 MHz, C6D6) δ:158.7, 145.9, 136.7, 130.2, 128.4, 127.7, 126.5, 113.1, 86.0, 61.6, 61.4, 60.4, 54.4, 47.1, 42.8, 37.2, 32.2, 31.1, 29.6, 24.5,
ESI-MS : calcd. for C37H54NO5PS2, 598.276 [M-C4H9S]+; found : 598.277[M-C4H9S]+。
　実施例1．DTT型修飾ポリヌクレオチド（5DTT-DNA）の合成
　5´－AACCGCTTCCCCGACTTCC（配列番号1）で示される塩基配列からなるDNAの5´末端が、下記式（A）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
で表される構造が連結され、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるDTT型修飾ポリヌクレオチド（5DTT-DNA）を、β－シアノエチルホスホロアミダイト（Glen Research社製）、DTT型ホスホロアミダイトモノマー（参考例1）、及び6-FAMを用い、DNA/RNA固相合成機（NTS M-2-MX, 日本テクノサービス社製）を使用し、定法により合成した。なお、配列番号1は、P. pyralis由来ルシフェラーゼ遺伝子のアンチセンス配列である。得られた修飾ポリヌクレオチドは定法に従い脱樹脂・脱保護を行い、高速液体クロマトグラフィーによって精製した。カラム： C18Hydrosphere 10 x 250 mm (YMC社製)、カラム温度：室温、測定波長：260 nm、移動相：50 mM トリエチルアンモニウムアセテートバッファー(pH7.0)(+5% アセトニトリル)/アセトニトリル = 100 : 0 → 70 : 30 (20 min, linear gradient)。修飾ポリヌクレオチドを含む分画は分取後、遠心エバポレーターによって濃縮した。構造決定は質量分析法(MALDI-TOF MS)を用いて行った。得られた修飾ポリヌクレオチドは超純水に溶解し、適宜希釈後UV吸収スペクトルを測定し、濃度を決定した。
MALDI-MS : calcd. 7361.628 [M+H]+; found :7362.888 [M+H]+。
　実施例2．DTT型修飾ポリヌクレオチド（10DTT-DNA）の合成
　配列番号1で示される塩基配列からなるDNAの5´末端が、下記式（B）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
で表される構造が連結され、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるDTT型修飾ポリヌクレオチド（10DTT-DNA）を、実施例1と同様にして合成した。
MALDI-MS : calcd.8434.762 [M+H]+; found : 8434.22 [M+H]+。
　実施例3．ThioL型修飾ポリヌクレオチド（5ThioL-DNA）の合成
　配列番号1で示される塩基配列からなるDNAの5´末端が、下記式（C）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
で表される構造が連結され、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるThioL型修飾ポリヌクレオチド（5ThioL-DNA）を、DTT型ホスホロアミダイトモノマー（参考例1）に代えてThioL型ホスホロアミダイトモノマー（参考例2）を用いる以外は、実施例1と同様にして合成した。
MALDI-MS : calcd. 7789.695 [M+H]+; found : 7789.289 [M+H]+。
　実施例4．ThioL型修飾ポリヌクレオチド（10ThioL-DNA）の合成
　配列番号1で示される塩基配列からなるDNAの5´末端が、下記式（D）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
で表される構造が連結され、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるThioL型修飾ポリヌクレオチド（10ThioL-DNA）を、実施例3と同様にして合成した。
MALDI-MS : calcd. 9287.426 [M+H]+; found : 9288.527 [M+H]+。
　比較例1．未修飾ポリヌクレオチド（DNA）の合成
　配列番号1で示される塩基配列からなり、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるDNA（DNA）を、定法により合成した。
MALDI-MS : calcd. 6212.113 [M+H]+; found : 6212.705 [M+H]+。
　比較例2．未修飾ポリヌクレオチド（R-DNA）の合成
　5´－ACACGTCCTCTCAGCCCTC（配列番号2）で示される塩基配列からなり、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるDNA（R-DNA）を、定法により合成した。
　比較例3．ホスホロチオエートDNA（PS-DNA）の合成
　配列番号1で示される塩基配列からなり、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるホスホロチオエートDNA（PS-DNA）を、定法により合成した。
MALDI-MS : calcd. 6499.02 [M+H]+; found : 6502.773[M+H]+。
　試験例1．細胞膜透過性試験1
　FAMで修飾されている実施例又は比較例のポリヌクレオチドを培地に添加し、細胞の蛍光強度（＝ポリヌクレオチドの細胞内への取り込み量）を測定することにより、ポリヌクレオチドの細胞膜透過性を調べた。具体的には以下のようにして行った。
　HeLa細胞にPhotinus pyralis由来およびRenilla reniformis由来ルシフェラーゼの発現プラスミドであるpGL3(Promega社製)とpTK-Green Renilla Luc (Thermo Fisher Scientific社製) を導入した。これをG418およびピューロマイシン存在下で培養することでルシフェラーゼを安定して発現する細胞株、HeLa-LucRlucを樹立した。この HeLa 細胞を、ウシ胎児血清（FBS）を10％、ペニシリンを100 U/mL、ストレプトマイシンを100μg/mLになるように添加したDMEM培地（Wako社製）で培養した。培養条件は、37℃、CO2濃度5％の大気下、湿度95％とした。12ウェルプレートの1ウェル当たり、2×104のHeLa p13細胞を播種して、1日間培養した。実施例及び比較例のポリヌクレオチドそれぞれを、1μMの濃度になるように、血清を含まないDMEM培地0.3 mLに添加して、混合した。得られた混合液を培地に添加して、3時間インキュベートした。一方で、ポジティブコントロールとして、比較例1の未修飾ポリヌクレオチドを、核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000、Invitrogen社製）を用いて、試薬説明書の指示に従って、培地に添加し、インキュベートした。インキュベート終了後、細胞を、培地でリンスしてからトリプシン処理により剥した。得られた細胞のFAM由来の蛍光強度を、フローサイトメーター（BD FACSCanto II、Becton Dickinson社製）で測定した。この蛍光強度が高い程、より多くのポリヌクレオチド（FAM修飾されている）が細胞膜を透過して、細胞内に導入されたことを示す。
　結果を図１に示す。DNA（比較例1）はほとんど膜透過性を示さなかった。一方、DTT（実施例1及び2）及びThioL（実施例3及び4）は、それぞれ細胞内に取り込まれていることが分かった。特に、10ThioL（実施例4）は、市販のLipofetamine3000を用いた場合に比べて、2倍以上、細胞内に取り込まれていることが分かった。
　試験例2．アンチセンス配列による発現抑制試験1
　P. pyralis由来ルシフェラーゼ遺伝子のアンチセンス配列を有する実施例及び比較例のポリヌクレオチドを培地に添加し、ルシフェラーゼの発現量を測定した。これにより、ポリヌクレオチドが細胞膜を透過して、その機能（アンチセンス核酸としての遺伝子発現抑制効果）を発揮できるか否かを調べた。具体的には以下のようにして行った。
　HeLa-LucRluc細胞（P. pyralisルシフェラーゼとRenillaルシフェラーゼとを安定的に発現するHeLa細胞）を、ウシ胎児血清（FBS）を10％、ペニシリンを100 U/mL、ストレプトマイシンを100μg/mLになるように添加したDMEM培地（Wako社製）で培養した。培養条件は、37℃、CO2濃度5％の大気下、湿度95％とした。12ウェルプレートの1ウェル当たり、2×104のHeLa-LucRluc細胞を播種して、1日間培養した。実施例及び比較例のポリヌクレオチドそれぞれを、1μMの濃度になるように、血清を含まないDMEM培地0.3 mLに添加して、混合した。得られた混合液を培地に添加して、インキュベートした。一方で、実施例4、比較例1及び3のポリヌクレオチドそれぞれを、核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000、Invitrogen社製）を用いて、試薬説明書の指示に従って、培地に添加し、インキュベートした。インキュベート終了後、細胞を、reporter lysis buffer（Promega社製）で溶解させた。得られた細胞溶解液のルシフェラーゼ活性（P. pyralisルシフェラーゼ活性とRenillaルシフェラーゼ活性）を、ルミノメーター（uminescencer-PSN、ATTO社製）及びluciferase assay reagent（Promega社製）を用いて測定した。
　結果を図２に示す。DNA/Lipo3000やPS-DNA（比較例3）では全く遺伝子発現抑制効果を示さないが、10ThioL（実施例4）は遺伝子発現抑制効果を示した。これは、本手法が、ポリヌクレオチドを細胞に導入する手法としてリポソームよりも有用であり得ることを示す。
　試験例3．細胞毒性試験1
　実施例及び比較例のポリヌクレオチドの細胞毒性をMTTアッセイにより調べた。具体的には以下のようにして行った。
　HeLa-LucRluc細胞（P. pyralisルシフェラーゼとRenillaルシフェラーゼとを安定的に発現するHeLa細胞）を、ウシ胎児血清（FBS）を10％、ペニシリンを100 U/mL、ストレプトマイシンを100μg/mLになるように添加したDMEM培地（Wako社製）で培養した。培養条件は、37℃、CO2濃度5％の大気下、湿度95％とした。96ウェルプレートの1ウェル当たり、2×104のHeLa-LucRluc細胞を播種して、1日間培養した。実施例及び比較例のポリヌクレオチドそれぞれを、1μM又は5μMの濃度になるように、血清を含まないDMEM培地0.3 mLに添加して、混合した。得られた混合液を培地に添加して、インキュベートした。一方で、ポジティブコントロールとして、比較例1の未修飾ポリヌクレオチドを、核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000、Invitrogen社製）を用いて、試薬説明書の指示に従って、培地に添加し、インキュベートした。24時間インキュベート後、CellTiter 96（登録商標） AQueous One Solution Reagent（Promega社製）20μLを添加して、2.5時間インキュベートした。490 nmの吸光度を、96ウェルプレートリーダーを用いて測定した。吸光度が高い程、添加したポリヌクレオチドの細胞毒性がより低いことを示す。
　結果を図３に示す。DNA/Lipo3000およびPS-DNA（比較例3）は毒性を示したが、実施例のポリヌクレオチド（5 x DTT（実施例1）、10 x DTT（実施例2）、5 x ThioL（実施例3）、10 x ThioL（実施例4））は毒性を示さなかった。このことから、実施例のポリヌクレオチドは毒性が低いといえる。
　実施例5．ThioL型修飾ポリヌクレオチド（5×tBu-PS-DNA）の合成
　5´－CGGTATCCAGATCCACAAC（配列番号3）からなるPS-DNAの5´末端が、下記式（C）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
で表される構造が連結され、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるThioL型修飾ポリヌクレオチド（5×tBu-PS-DNA）を、実施例3と同様にして合成した。
　実施例6．ThioL型修飾ポリヌクレオチド（10×tBu-PS-DNA）の合成
　配列番号3で示される塩基配列からなるPS-DNAの5´末端が、下記式（D）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
で表される構造が連結され、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるThioL型修飾ポリヌクレオチド（10×tBu-PS-DNA）を、実施例3と同様にして合成した。
　比較例4．ホスホロチオエートDNA（PS-DNA）の合成
　配列番号3で示される塩基配列からなり、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるホスホロチオエートDNA（PS-DNA）を、定法により合成した。
　実施例7．ThioL型siRNA（5×ThioL siRNA (3’ & 3’)）の合成
　5´－UUUCGAAGUACUCAGCGUAAGUU（配列番号4）からなるRNAの3´末端が、下記式（C）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
で表される構造が連結されてなるThioL型修飾1本鎖RNA（5×ThioL guide strand (3’)）を、実施例3と同様にして合成した。
　一方で、5´－CUUACGCUGAGUACUUCGAAAUU（配列番号5）からなるRNAの3´末端が、下記式（C）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
で表される構造が連結されてなるThioL型修飾1本鎖RNA（5×ThioL passenger strand (3’)）を、実施例3と同様にして合成した。
　5×ThioL guide strand (3’)と5×ThioL passenger strand (3’)とを混合したのち、1×annealing buffer (60 mM KCl, 6 mM HEPES-KOH pH 7.5, 0.2 mM MgCl2) 中で目的濃度 (0.1～1 μM) になるように調製し、90℃で3分間置いた後、3時間室温に戻るまで静置し、二本鎖RNA（ThioL型siRNA（5×ThioL siRNA (3’ & 3’)））を形成させた。
　実施例8．ThioL型siRNA（5×ThioL siRNA (3’ & 5’)）の合成
　配列番号5で示される塩基配列からなるRNAの5´末端が、下記式（C）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
で表される構造が連結されてなるThioL型修飾1本鎖RNA（5×ThioL passenger strand (5’)）を、実施例3と同様にして合成した。
　5×ThioL guide strand (3’)と5×ThioL passenger strand (5’)とを混合したのち、1×annealing buffer (60 mM KCl, 6 mM HEPES-KOH pH 7.5, 0.2 mM MgCl2) 中で目的濃度 (0.1～1 μM) になるように調製し、90℃で3分間置いた後、3時間室温に戻るまで静置し、二本鎖RNA（ThioL型siRNA（5×ThioL siRNA (3’ & 5’)））を形成させた。
　比較例5．未修飾siRNAの合成
　配列番号4で示される塩基配列からなるRNA及び配列番号5で示される塩基配列からなるRNAを定法により合成し、実施例7と同様にして二本鎖（未修飾siRNA）を形成させた。
　試験例4．細胞膜透過性試験2
　ポリヌクレオチドとして、実施例5、実施例6及び比較例4のアンチセンスポリヌクレオチドを使用する以外は、試験例1と同様にして行った。ポリヌクレオチド濃度は100nMとした。
　結果を図４に示す。ThioL修飾の場合、市販のLipofetamine3000を用いた場合と同等或いはそれ以上の細胞膜透過性を示した。
　試験例5．アンチセンス配列による発現抑制試験2
　ポリヌクレオチドとして、実施例5及び比較例4のアンチセンスポリヌクレオチドを使用する以外は、試験例2と同様にして行った。ポリヌクレオチド濃度は1μMとした。
　結果を図５に示す。ThioL修飾の場合、市販のLipofetamine3000を用いた場合と同等の遺伝子発現抑制効果を示した。
　試験例6．細胞毒性試験2
　ポリヌクレオチドとして、実施例5及び比較例4のアンチセンスポリヌクレオチドを使用する以外は、試験例3と同様にして行った。ポリヌクレオチド濃度は5μMとした。
　結果を図６に示す。実施例のポリヌクレオチド（5×tBu-PS-DNA）は毒性を示さなかった。
　試験例7．siRNAによる発現抑制試験1
　ポリヌクレオチドとして、実施例7、実施例8及び比較例5のsiRNAを使用する以外は、試験例2と同様にして行った。ポリヌクレオチド濃度は1μM又は100nMとした。
　結果を図７に示す。ThioL修飾の場合、市販のLipofetamine3000を用いた場合と同等或いはそれ以上の遺伝子発現抑制効果を示した。
　参考例3．プロカチオン性ホスホロアミダイトモノマーの合成
　以下の合成スキームに従って、プロカチオン性ホスホロアミダイトモノマー（化合物4）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　＜化合物b：2-(tert-Buthyldisulfanyl)ethanolの合成＞
　100% ethanol (22 mL), 2-mercaptoethanol (0.77 mL, 23 mmol, 1.0 eq.) に2-methyl-2-propanethiol (12 mL, 230 mmol, 10 eq.) を加え、氷浴中で撹拌した。100% ethanol (17 mL ) にI2 (3.0 g, 36.8 mmol, 1.1 eq.) を溶かし、反応溶液に色が無色から赤色に変わるまで滴下し、一晩反応させた。NaHCO3 (飽和, 23 mL) をpH７以上になるまで加え、減圧留去した。AcOEtを加え、10% Na2S2O5、brineで分液し、有機層を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (中性フラッシュ、Hexane/AcOEt = 2/1) にて精製し、油状の化合物b (1.62 g, 9.72 mmol, 91%) を得た。 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.842 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.827 (2H, t, J = 6.0 Hz),1.317 (9H, s) 他各種スペクトルデータは文献記載のデータと良い一致を示した（Tetrahedron, 2005, 61, 6138.）。
　＜化合物c：2-(tert-Buthyldisulfanyl)ethyl 4-Nitrophenyl carbonateの合成＞
　化合物b (5.45 g, 32.8 mmol, 1.0 eq.) に4-nitrophenyl chloroformate (9.89 g, 49.1 mmol, 1.5eq.)、THF (10 mL) を加え、アルゴン雰囲気下、氷浴中で反応させた。さらに、TEA (6.8 mL)、脱水THF (25 mL) を滴下し、氷浴中で10分反応させた後、室温で18時間反応させた。反応液を濾過、洗浄し (Hexane/AcOEt = 5/1)、減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (中性フラッシュ、Hexane/AcOEt = 4/1) を行い、化合物c (9.69 g, 29.2 mmol, 89%) を得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.27 (2H, m), 7.37 (2H, m), 4.51 (3H, t, J = 6.8 Hz), 2.99 (3H, t, J = 6.8 Hz), 1.34 (9H, s) 他各種スペクトルデータは文献記載のデータと良い一致を示した（Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51, 10347.）。
　＜化合物d：2-(tert-butyldisulfanyel)ethyl (3-hydroxypropyl)carbamateの合成＞
　3-amino-1-propanol (3.2 mL, 41.4 mmol, 1.0 eq.) を加えたCH2Cl2 (25 mL) にTEA (6.4 mL)、化合物c (9.15 g, 27.6 mmol,1.0 eq.) を加えたCH2Cl2 (15 mL) を加え、1時間室温で撹拌した。減圧留去し、AcOEt (15 mL)に溶かし、水、飽和NaHCO3、0.1M NaOH、brineで洗浄した。Na2SO4で乾燥させ、減圧留去を行った。油状化合物4 (7.49 g, 27.0 mmol, 97%) を得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.28 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.67 (2H, t, J = 5.6 Hz), 3.13 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.88 (2H, t, J = 6.4 Hz), 1.69 (2H, t, J = 6.0 Hz), 1.31 (9H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ 157.22, 63.24, 59.60, 48.04, 39.19, 37.77, 32.55, 29.92; HRMS (ESI) calcd for C10H21NO3S2[M+Na]+:  290.10, found for 290.0913。
　＜化合物2：3-(4,4'-dimethoxytrityl)propan-1-olの合成＞
　4,4'-dimethoxytrityl chloride (3.09 mg，9.12 mmol) をピリジン (72 mL) に溶解し，アルゴン雰囲気下で propan-1,3-diol (13 mL，181 mmol) を加え，5.5 時間撹拌した。溶媒を減圧留去し，残渣を Et2O/H2O で抽出した。有機層を Na2SO4で脱水し，溶媒を減圧留去した。残差をカラムクロマトグラフィー (Hexane/AcOEt = 3/1 → 1/1，1% TEA) で精製し，化合物2 (1.58 g，3.28 mmol，65%) を黄色油状物質として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.43－7.40 (2H, m), 7.33－7.20 (7H, m), 6.88－6.78 (4H, m), 3.82－3.74 (8H, m), 3.27 (2H, q, J= 5.6 Hz), 2.24 (1H, t, J = 5.6 Hz), 1.85 (2H, q, J = 5.6) 他各種スペクトルデータは文献記載のデータと良い一致を示した。
　＜化合物4：2-(tert-butyldisulfaneyl)ethyl(3-(((3-(bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)ethoxy)propoxy) (diisopropylamino)phosphaneyl)propyl)carbamateの合成＞
　ピリジンで共沸したN,N-bis(diisopropylamino)chlorophosphine (776 mg, 2.91 mmol, 1.0 eq.) にTHF (脱水, 8 mL)、TEA (脱水, 0.5 mL, 3.96 mmol, 1.4 eq.)を加えた。化合物2 (1.06 mg, 2.8 mmol, 1.0eq.)にTHF (脱水, 3 mL) を加え、0 ℃、アルゴン雰囲気下で滴下した後、室温で2 時間反応させた。ピリジンで共沸した化合物4 (530 mg, 1.99 mmol, 0.7 eq.) にTHF (脱水, 4 mL) を加え、0 ℃、アルゴン雰囲気下で反応溶液に滴下した。1H-tetrazole (95.5 mg, 1.36 mmol, 0.5 eq.) にTHF (脱水, 3 mL) を加え、さらに滴下し、室温で2時間反応させた。CH2Cl2とNaHCO3を予め0 ℃で冷やしておき、分液した。有機層を減圧留去し、黄色油状crude (2.13 g) を得た。カラムクロマトグラフィー (中性フラッシュ, Hexane/AcOEt = 15/1 → 10/1, 1% TEA) により精製し、無色油状化合物4 (284 mg, 0.37 mmol, 19%) を得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ 7.24 (9H, m), 6.80 (4H, d), 4.23 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3.78 (6H, s), 3.59 (6H, m), 3.23 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.14 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.85 (t, 2H, J = 6.8 Hz) , 1.91 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 1.73 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 1.31 (s, 9H), 1.12 (d, 12H, J = 7.2 Hz);13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ 158.39, 145.36, 136.62, 130.12, 128.27, 127.73, 126. 67, 113.04, 85.85, 62.96, 60.49, 60.36, 47.93, 42.95, 42.82, 39.28, 38.84, 32.04, 31.96, 29.94, 24.72; 31P-NMR (162 MHz, CDCl3): δ 146.21; HRMS (ESI) calcd for C40H59N2O7PS2 [M+H]+: 775.35, found for 776.3627。
　実施例9．プロカチオン性修飾ポリヌクレオチド（5×cation-PS-DNA）の合成
　配列番号1で示される塩基配列からなるPS-DNAの5´末端が、下記式（E）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
で表される構造が連結され、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるプロカチオン性修飾ポリヌクレオチド（5×cation-PS-DNA）を、プロカチオン性ホスホロアミダイトモノマー（参考例3）を用いて、実施例1と同様にして合成した。
　比較例6．ホスホロチオエートDNA（PS-DNA）の合成
　配列番号1で示される塩基配列からなり、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるホスホロチオエートDNA（PS-DNA）を、定法により合成した。
　実施例10．プロカチオン性siRNA（5×ThioL siRNA (3’ & 3’)）の合成
　配列番号4で示される塩基配列からなるRNAの3´末端が、下記式（E）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
で表される構造が連結されてなるプロカチオン性修飾1本鎖RNA（5×cagtion guide strand (3’)）を、プロカチオン性ホスホロアミダイトモノマー（参考例3）を用いて、実施例1と同様にして合成した。
　一方で、配列番号5で示される塩基配列からなるRNAの3´末端が、下記式（E）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
で表される構造が連結されてなるプロカチオン性修飾1本鎖RNA（5×cation passenger strand (3’)）を、プロカチオン性ホスホロアミダイトモノマー（参考例3）を用いて、実施例1と同様にして合成した。
　5×cation guide strand (3’)と5×cation passenger strand (3’)とを混合したのち、1×annealing buffer (60 mM KCl, 6 mM HEPES-KOH pH 7.5, 0.2 mM MgCl2) 中で目的濃度 (0.1～1 μM) になるように調製し、90℃で3分間置いた後、3時間室温に戻るまで静置し、二本鎖RNA（プロカチオン性siRNA（5×cation siRNA (3’ & 3’)））を形成させた。
　実施例11．プロカチオン性siRNA（5×cation siRNA (3’ & 5’)）の合成
　配列番号5で示される塩基配列からなるRNAの5´末端が、下記式（E）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
で表される構造が連結されてなるプロカチオン性修飾1本鎖RNA（5×cation passenger strand (5’)）を、プロカチオン性ホスホロアミダイトモノマー（参考例3）を用いて、実施例1と同様にして合成した。
　5×cation guide strand (3’)と5×cation passenger strand (5’)とを混合したのち、1×annealing buffer (60 mM KCl, 6 mM HEPES-KOH pH 7.5, 0.2 mM MgCl2) 中で目的濃度 (0.1～1 μM) になるように調製し、90℃で3分間置いた後、3時間室温に戻るまで静置し、二本鎖RNA（プロカチオン性siRNA（5×cation siRNA (3’ & 5’)））を形成させた。
　試験例8．細胞膜透過性試験3
　ポリヌクレオチドとして、実施例9及び比較例6のアンチセンスポリヌクレオチドを使用する以外は、試験例1と同様にして行った。ポリヌクレオチド濃度は100nMとした。
　結果を図８に示す。プロカチオン修飾の場合、市販のLipofetamine3000を用いた場合と同等の細胞膜透過性を示した。
　試験例9．細胞毒性試験3
　ポリヌクレオチドとして、実施例9及び比較例6のアンチセンスポリヌクレオチドを使用する以外は、試験例3と同様にして行った。ポリヌクレオチド濃度は1μMとした。
　結果を図９に示す。実施例のポリヌクレオチド（5×cation-PS-DNA）は毒性を示さなかった。

Claims (15)

  1. 一般式（1）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、R1及びR2は同一又は異なって、単結合、又は－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい二価の基を示す。R3は、－O－、又は－O－R31（式中、R31は、－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい一価の基を示す。）を示す。Z1及びZ2は同一又は異なって、－O－又は－NH－を示す。但し、R1、R2、及びR3の内の少なくとも1つは－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含む。nは任意の整数を示す。］
    で表される構造を含む分子で修飾されてなる、修飾ポリヌクレオチド。
  2. 前記R1がアルキレン基、又は環構造中に－S－S－を有する環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が－O－、又は－O－R31a－S－S－R31b（式中、R31aはアルキレン基又は－R311a－NH－COO－R312a－（R311a及びR312aは同一又は異なって、アルキレン基を示す。）を示す。R31bは保護基を示す。）である、請求項１に記載の修飾ポリヌクレオチド。
  3. （A）前記R1がアルキレン基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が－O－R31a－S－S－R31b（式中、R31aはアルキレン基又は－R311a－NH－COO－R312a－（R311a及びR312aは同一又は異なって、アルキレン基を示す。）を示す。R31bは保護基を示す。）である、或いは
    （B）前記R1が環構造中に－S－S－で表される基を有する環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が－O－である、
    請求項１又は２に記載の修飾ポリヌクレオチド。
  4. （A1）前記R1が炭素原子数が3～6のアルキレン基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が－O－R31a－S－S－R31b（式中、R31aは炭素原子数が3～6のアルキレン基又は－R311a－NH－COO－R312a－（R311a及びR312aは同一又は異なって、炭素原子数が2～6のアルキレン基を示す。）を示す。R31bはアルキル基又はアリール基を示す。）である、或いは
    （B1）前記R1が環構造中に－S－S－で表される基を有する4～8員環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が－O－である、
    請求項１～３のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
  5. 前記nが1～30である、請求項１～４のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
  6. 前記Z1及び前記Z2が共に－O－である、請求項１～５のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
  7. ポリヌクレオチドが、細胞内への導入用のポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
  8. ポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、siRNA、miRNA、miRNA前駆体、アプタマー、ガイドRNA、mRNA、ノンコーディングRNA、DNA、非天然核酸(LNA、PNA、モルフォリノ核酸からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１～７のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
  9. ポリヌクレオチドの塩基長が200塩基長以下である、請求項１～８のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
  10. ポリヌクレオチドの末端に前記一般式（1）で表される構造が連結されてなる、請求項１～９のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
  11. ポリヌクレオチドの5´末端に前記一般式（1）で表される構造が連結されてなる、請求項１～１０のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
  12. 請求項１～１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、該修飾ポリヌクレオチドの細胞内への導入剤。
  13. 請求項１～１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、医薬。
  14. 請求項１～１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、試薬。
  15. 一般式（1）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、R1及びR2は同一又は異なって、単結合、又は－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい二価の基を示す。R3は、－O－、又は－O－R31（式中、R31は、－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい一価の基を示す。）を示す。Z1及びZ2は同一又は異なって、－O－又は－NH－を示す。但し、R1、R2、及びR3の内の少なくとも1つは－S－S－及び－SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含む。nは任意の整数を示す。］
    で表される構造を含むポリヌクレオチド修飾用分子。
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