WO2007094135A1 - オリゴヌクレオチド誘導体及びその利用 - Google Patents

オリゴヌクレオチド誘導体及びその利用 Download PDF

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WO2007094135A1
WO2007094135A1 PCT/JP2007/000087 JP2007000087W WO2007094135A1 WO 2007094135 A1 WO2007094135 A1 WO 2007094135A1 JP 2007000087 W JP2007000087 W JP 2007000087W WO 2007094135 A1 WO2007094135 A1 WO 2007094135A1
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oligonucleotide
compound
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oligonucleotide derivative
unit
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PCT/JP2007/000087
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Yukio Kitade
Yoshihito Ueno
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Gifu University
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
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    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
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    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
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    • C07F9/6512—Six-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
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    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
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    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
    • C07F9/65616—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings containing the ring system having three or more than three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members, e.g. purine or analogs

Definitions

  • the present invention relates to a novel oligonucleotide derivative, an oligonucleotide construct using the oligonucleotide derivative, a compound for synthesizing the oligonucleotide derivative, and a method for producing the oligonucleotide derivative.
  • oligonucleotides such as DNA and RNA have been used for therapeutic and diagnostic purposes.
  • Typical diagnostic applications include DNA chips and DNA microarrays, and therapeutic applications include the introduction of treatment-related genes and suppression of expression by knockdown of disease-related genes.
  • Attempts have also been made to use Abutama as a therapeutic agent.
  • RNA interference is mentioned as a knockdown method of a specific gene.
  • RNAi is a phenomenon in which double-stranded RNA (dsRNA) suppresses the function of genes with sequence homology. Specifically, suppression of gene expression by RNAi is recognized by Dicer, a member of the RNaselll family, and cleaved into 21-23-mer siRNAs (short interfering RNAs).
  • Dicer double-stranded RNA
  • siRNAs short interfering RNAs
  • siRNA homologous to the incorporated siRNA is cleaved at the center and degraded.
  • the present inventors converted the siRNA nuclease by converting the phosphodiester bond portion of the 3 ′ end dangling end of si RNA into a strong rubamate bond or urea bond to eliminate the negative charge of the bond portion.
  • has succeeded in increasing resistance and silencing activity Y. Ueno, T. Naito, K. Kawada, A. Shibata, Hye-Sook Kim, Y. Wataya, Y. Kid ade, Biochem Biophys Res Commun 330, 1168-1175 (2005)).
  • RISC which plays an important role in RNAi
  • RISC is known as a multidomain protein involved in the process of degradation of RNAi target mRNA.
  • co-crystal of PAZ domain and siRNA in RISC X-ray crystal Structural analysis was performed (vJ.B. Ma., K. Ye and DJ Pate, Nature., 429, 318-322 (2004).).
  • the PAZ domain recognizes the 3 ′ end dangling end of siRNA, and that 2 nucleotides of the 3 ′ end dangling end are recognized by entering the hydrophobic pocket of the PAZ domain ( JJ Song., J. Liu., NH Tol ia., J.
  • a molecular beacon is a genetic analysis tool.
  • a molecular beacon is a nucleic acid having a hepin structure having a stem portion and a loop portion, and is a gene analysis tool used as a probe for confirming the presence of a sequence complementary to the loop portion. Usually, it is quenched because the distance between the fluorescent agent and the quencher is short. However, there is a complementary sequence in the loop part And, since the loop part hybridizes with the complementary sequence, the hairpin structure opens, and the fluorescent agent and the quencher are separated, so fluorescence is detected. As a result, the target sequence can be detected.
  • the present invention provides an oligonucleotide derivative having good nuclease resistance, an oligonucleotide construct using the oligonucleotide derivative, a compound for synthesizing the oligonucleotide derivative, and the oligonucleotide derivative.
  • One object is to provide a manufacturing method.
  • the present invention also provides an oligonucleotide derivative having an improved gene expression suppression effect by RNAi, an oligonucleotide construct using the oligonucleotide derivative, a compound for synthesizing the oligonucleotide derivative, and the oligonucleotide derivative.
  • Another object is to provide a manufacturing method.
  • the present invention also provides functional nucleic acids such as siRNA and molecular beacons.
  • useful oligonucleoside analogs, modified oligonucleotides containing the oligonucleoside analogs, oligonucleotide constructs using the modified oligonucleotides, compounds for synthesizing the modified oligonucleotides and production of the modified oligonucleotides Another object is to provide a method.
  • RNA i RNA i
  • the present inventors have found that an oligonucleotide having a certain type of phosphate ester derivative has excellent nuclease resistance, and further has an excellent gene expression suppression effect by RNA i.
  • the present invention has been completed. That is, according to the present invention, the following means are provided.
  • an oligonucleotide derivative having at least one unit represented by the following formula (1).
  • each A may be selected from the compounds 2a and 2b in the formula (2).
  • the oligonucleotide derivative of the present invention may be represented by the following formula (3).
  • R 1 and R 2 each independently represent hydrogen or a hydroxyl protecting group, each X 1 independently represents 0, S or Se, and each X 2 independently represents OH or O -, SH or S_, 56 or ⁇ is 56_, represents an alkyl group or morpholino group having 1 to 4 carbon atoms, and m and n are each independently an integer of 0 or more, and at least one is 1
  • B and C are oligonucleotides which may be independently modified, and represent an oligonucleotide having a combined chain length of B and C of 3 or more. However, B and C do not include the hydroxyl groups at the 3 ′ end and 5 ′ end of the oligonucleotide.
  • each X 2 may be 0- or OH.
  • R 1 and R 2 can be H.
  • m can be 0, and I and m can both be 0.
  • I and m are 0, and n can be 1 or more and 5 or less. It is preferably 3 or less, more preferably 2 or less.
  • the chain lengths of B and C can be 10 or more and 35 or less.
  • a and B may be oligoliponucleotides.
  • B and C can have a partial sequence of mRNA of a predetermined gene or a complementary sequence thereof.
  • the oligonucleotide construct of the present invention can be a construct selected from single-stranded and double-stranded DNA, single-stranded and double-stranded RNA, DNAZRNA chimera, and DNAZRNA hybrid.
  • it can be selected from antisense, antisense, aptamer, siRN A. mi RN A. sh RN A, and liposome.
  • the oligonucleotide construct of the present invention may have a unit containing A in the dangling end portion.
  • siRNA wherein in the oligonucleotide derivative, I and m are 0, n is 1 or 2, and has a unity containing A at the 3 ′ terminal dangling end portion Can be a construct.
  • a diagnostic construct having any one of the above oligonucleotide derivatives.
  • This construct can be a probe or primer.
  • each A can be selected from compounds 2a to 2g in formula (2).
  • W 1 represents a hydroxyl-protecting group
  • W 2 is bound to or bound to H, a phosphoramidyl group, or a solid support. Represents a linked group.
  • a method for producing an oligonucleotide derivative wherein one or two or more types selected from any one of the above compounds are used.
  • a method for modifying an oligonucleotide wherein at least one unit represented by the following formula (1) is added to, substituted, or inserted into an oligonucleotide, or these: A method is provided that introduces a combination of the two.
  • an oligonucleotide having a certain type of phosphate ester derivative has excellent nuclease resistance and detectability as a probe, and has completed the present invention. That is, according to the present invention, the following means are provided.
  • an oligonucleotide derivative having at least one unit represented by the following formula (1 1).
  • the oligonucleotide derivative may be represented by the following formula (14).
  • R 1 and R 2 each independently represent hydrogen or a hydroxyl protecting group, each X 1 independently represents 0, S or Se, and each X 2 independently represents OH or O -, SH or S_, 56 or ⁇ is 56_, represents an alkyl group or morpholino group having 1 to 4 carbon atoms, and m and n are each independently an integer of 0 or more, and at least one is 1
  • B and C are oligonucleotides which may be independently modified, and represent an oligonucleotide having a combined chain length of B and C of 3 or more. However, B and C do not include the hydroxyl groups at the 3 ′ end and 5 ′ end of the oligonucleotide.
  • each X 2 may be 0_ or OH.
  • R 1 and R 2 can be H.
  • m can be 0, and I and m can both be 0.
  • I and m are 0, and n can be 1 or more and 5 or less. It is preferably 3 or less, more preferably 2 or less.
  • the chain lengths of B and C can be 10 or more and 35 or less.
  • a and B may be oligoliponucleotides or oligodeoxyliponucleotides.
  • B and C can have a partial distribution sequence of mRNA of a predetermined gene or a complementary sequence thereof.
  • an oligonucleotide construct for regulating gene expression which comprises any one of the above oligonucleotide derivatives.
  • This oligonucleotide construct can be a construct selected from single and double stranded DNA, single and double stranded RNA, DN AZRN A chimera and DN AZRN A hybrid, and its function. From the aspect, it can be selected from antigene, antisense, aptamer, siRN A. mi RN A. sh RN A and liposome.
  • the oligonucleotide construct of the present invention can have a unit containing the A in the dangling end portion.
  • the siRNA comprises the oligonucleotide
  • I and m are 0, n is 1, 2 or 3, and a construct having a unit containing A at the 3′-end dangling end portion can be obtained.
  • a diagnostic construct having any one of the above-described oligonucleotide derivatives.
  • This construct can be a probe or primer. It can also be a molecular beacon.
  • the A may be arranged in the stem portion or may be arranged in the loop portion.
  • nucleotide analog represented by the following formula (15) is provided.
  • each E independently represents the following formula (1 2);
  • Z represents CH or N
  • B AS E represents an optionally substituted base selected from 1 3 a to 1 3 e of the following formula (1 3), [Chemical 14]
  • W 1 represents H or a hydroxyl protecting group
  • W 2 represents H, a phosphoramidyl group or a linking group bound to or bound to a solid support.
  • nucleoside analogs for siRNA dangling units and the nucleoside analogs for molecular beacon stems or loops.
  • a method for producing an oligonucleotide derivative wherein one or more selected from one of the above nucleoside analogues is used.
  • a manufacturing method is provided.
  • a method for modifying an oligonucleotide wherein at least one unit represented by the following formula (1 1) is added to the oligonucleotide, any one of substitution and insertion, or a combination thereof: The method is introduced.
  • Z represents CH or N
  • B AS E represents an optionally substituted base selected from 1 3 a to 1 3 e of the following formula (1 3)]
  • the manufacturing method of the oligonucleotide containing the said oligonucleoside analog or its salt, and its utilization are also provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of an oligonucleotide construct (siRNA) of the present invention.
  • Figure 2 shows the chemical modification of the 3 ′ end dangling end obtained in Example 5.
  • FIG. 4 shows CD spectra of DNA oligonucleotides (1) to (4).
  • FIG. 3 is a diagram showing CD spectra of DNA oligonucleotides (5) to (8) obtained by chemically modifying the 3′-end dangling end obtained in Example 5.
  • FIG. 4 is a diagram showing CD spectra of RNA oligonucleotides (9) to (12) obtained by chemically modifying the 3 ′ terminal dangling end obtained in Example 6.
  • FIG. 4 is a diagram showing CD spectra of RNA oligonucleotides (9) to (12) obtained by chemically modifying the 3 ′ terminal dangling end obtained in Example 6.
  • FIG. 5 shows CD spectra of siRNA double-stranded oligonucleotides (13) to (20) obtained by chemically modifying the 3 ′ end dangling end obtained in Example 7.
  • FIG. 5 shows CD spectra of siRNA double-stranded oligonucleotides (13) to (20) obtained by chemically modifying the 3 ′ end dangling end obtained in Example 7.
  • FIG. 6 is a graph showing the protein expression suppression effect of 3′-end chemically modified siRNA by Dual Luciferase Assay.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of electrophoresis after snake venom exonuclease treatment showing the nuclease resistance of 3′-end chemically modified siRNA (single-stranded state).
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of electrophoresis after snake venom exonuclease treatment showing nuclease resistance of 3′-end chemically modified siRNA (double-stranded state).
  • Fig. 9 shows the dangling end of the 3 'end by Dual Luciferase Assay.
  • FIG. 3 is a graph showing the protein expression inhibitory effect of chemically modified siRNA (double-stranded state) comprising a 2-hydroxylmethylbenzene derivative.
  • FIG. 10 is a graph showing the protein expression suppression effect of chemically modified siRNA (double-stranded state) having a 1,4-hydroxymethylbenzene derivative at the 3 ′ end dangling end by Dual Luciferase Assay. .
  • Figure 11 shows the results of a chemically modified siRNA (double-stranded state) with a 2, 3-hydroxymethylnaphthalene derivative or 1,4-hydroxymethylnaphthalene derivative at the 3 'end dangling end by Dual Luciferase Assay. It is a graph which shows a protein expression inhibitory effect.
  • FIG. 12 shows the modified oligonucleotide obtained in Example 22 and the unmodified oligonucleotide. It is a figure which shows CD spectrum regarding the double strand formation ability (thermal stability) with a rigonucleotide.
  • FIG. 13 is a diagram showing CD vectors related to the ability to form a double strand (thermal stability) of a modified oligonucleotide molecular beacon and an unmodified oligomolecular molecular beacon.
  • Buffers are 10 mM sodium phosphate (pH 7), 10 OmMN a CU 1 OmM sodium phosphate (pH 7), 1 000 mM MN a CI and 1 OmM sodium phosphate (pH 7) was a 1 0 OmM N a CI and 1 OmM M g CI 2.
  • FIG. 14 is a diagram showing an electrophoresis result after snake venom exonuclease treatment showing nuclease resistance of chemically modified siRNA having an analog at the 3 ′ end (single-stranded state).
  • FIG. 15 is a graph showing the protein expression-suppressing effect of chemically modified siRNA (double-stranded state) having an analog at the 3 ′ end dangling end by Dual Luciferase Assay.
  • FIG. 16 is a diagram showing an example of chemical modification to a conventional oligonucleotide.
  • the present invention relates to an oligonucleotide derivative represented by the formula (1).
  • the oligonucleotide derivative of the present invention relates to an oligonucleotide derivative having at least one unit containing A in formula (1) in the oligonucleotide.
  • the present invention further discloses a construct containing such an oligonucleotide derivative and use thereof, a production method for producing the oligonucleotide derivative, and a compound therefor.
  • the oligonucleotide derivative of the present invention exhibits nuclease resistance by having at least one unit containing A shown in the formula (1). Therefore, such a unit can be provided at a target site of various nucleases (specific base sites such as 3 ′ end, 5 ′ end, non-3 ′ end and non-5 ′ end depending on the type of nuclease).
  • siRNA 3 'end dangling end By preparing for the hang site, the effect of RNAI to suppress gene expression is increased. Although this is an inference and does not restrict the present invention, this increase in the gene expression suppression effect is a result of improving the hydrophobicity of the 3 ′ end by providing a unit containing A at the 3 ′ end of siRNA. It is considered that the affinity or recognizability of PAZ has been improved, which has improved the silencing effect. Therefore, siRNA having a unit containing A at the 3 ′ end dangling end can have excellent nuclease resistance and silencing activity. Furthermore, such oligonucleotide derivatives can be synthesized efficiently.
  • oligonucleotide derivative according to an embodiment of the present invention, a method for producing the same, a compound used therefor, and a construct having the oligonucleotide derivative will be described in detail. It should be noted that conventional techniques of molecular biology and nucleic acid chemistry that are within the skill of the artisan of the present invention have been described in the literature. For example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
  • the oligonucleotide derivative is a compound represented by the formula (1).
  • the oligonucleotide derivative of the present invention comprises one or more units containing A in formula (1) (hereinafter also simply referred to as A unit) at one or two or more sites in the oligonucleotide. Can have. Nuclease resistance can be obtained at locations having this A unit. Two or more A units may be required for good nuclease resistance. Such an A unit can be added, substituted, inserted, or a combination of oligonucleotides of known or unknown sequence. Thus, the oligonucleotide derivative of the present invention can be obtained.
  • the oligonucleotide referred to here is an oligonucleotide that may be modified.
  • Each A in A unit can be a divalent cyclic compound-containing group having a monocyclic to polycyclic condensed ring having an aromatic ring and Z or a heterocyclic ring as a constituent ring.
  • the ring structure in the cyclic compound-containing group is preferably a monocyclic to tricyclic condensed ring, and more preferably a monocyclic or bicyclic condensed ring.
  • a divalent cyclic compound-containing group having a monocyclic aromatic ring and a heterocyclic ring is most preferred.
  • A is preferably hydrophobic as a whole and does not have a hydrophilic or polar substituent.
  • the substituent that may be present in the constituent ring of A is preferably a nonpolar substituent, and may have a chain alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. That is, a methyl group, an ethyl group, an n_propyl group, an isopropyl group, an n_butyl group, an isobutyl group, and a trt_butyl group are exemplified. Two chains of about 1 to 4 carbon atoms (preferably a methyl group and an ethyl group, more preferably a methyl group) bonded to the two carbon atoms (ring carbon atoms) constituting these rings, respectively.
  • the alkyl group is a linking moiety.
  • Each A in the A unit can be preferably selected from the compounds 2a to 2g represented by the formula (2).
  • each Z is independent and may be the same or different, but represents CH or N.
  • monocyclic 2a and 2b can be preferably used.
  • 2d can be preferably used.
  • the hydrogen atom bonded to the ring carbon atom of each A in A unit may be unsubstituted or substituted.
  • the substituent is preferably a chain alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. That is, a methyl group, an ethyl group, an n_propyl group, an isopropyl group, an n_butyl group, an isobutyl group, and a tert_butyl group can be mentioned.
  • a methyl group and an ethyl group may be preferably used.
  • the number of substituents is not particularly limited, but when steric hindrance is a problem, it is about 1 or 2 substituents. It is preferable.
  • a unit is bound to a part of the oligonucleotide via an appropriate linking group.
  • the linking group for example, a known linking group used for linking oligonucleotide units such as phosphodiester bonds can be used.
  • a linking group as exemplified in [Chemical Formula 15] (however, an oxygen atom linked to A is excluded) can be mentioned.
  • hydrogen or a known hydroxyl protecting group may be bound to one oxygen atom of the A unit.
  • an embodiment of the oligonucleotide derivative of the present invention represented by the formula (1) includes a compound represented by the formula (3).
  • R 1 and R 2 are each independently the same or different, and each represents a hydrogen or a hydroxyl group protecting group.
  • the hydroxyl protecting group may be any group that protects oxygen in the hydroxyl group substituted by the protecting group from an unintended reaction.
  • the protecting group is removed while maintaining the activity of the oligonucleotide derivative.
  • Such hydroxyl protecting groups are not particularly limited, and various conventionally known hydroxyl protecting groups can be used.
  • Preferred protecting groups of the present invention include fluorenylmethoxycarbonyl (FM0C), dimethoxytrityl (DMT),
  • Monomethoxytrityl, trifluoroacetyl, levulinyl, or silyl group is selected from a trityl group, such as dimethyltrityl (DMT).
  • DMT dimethyltrityl
  • the oligonucleotide derivative of this embodiment has one or two or more of three types of units containing A represented by formula (3).
  • a unit the unit containing A arranged at the 5 ′ end
  • a 3 unit the unit arranged at the 3 ′ end
  • a 2 unit the non-5 ′ end and non-3 'The unit located at the end.
  • A is independent and may be the same or different.
  • a in each of these units is synonymous with A in the A unit, and each of these units represents a specific form of the A unit in the equation (1).
  • Each X 1 in the A As unit is independent and may be the same or different, and represents 0, S or Se, and each X 2 is independently OH (or 0_), SH (Or S_), S or Se-, an alkyl group or a morpholino group having 4 to 8 carbon atoms.
  • Various phosphodiester bonds obtained by combining these X 1 and X 2 include For example, it can be mentioned in the following formula: A In Asuniz, these various phosphodiester bonds can be used alone or in combination of two or more.
  • a As unit can be provided in the form of an addition, substitution, insertion, or a combination of these to the sequence of an oligonucleotide derivative having a predetermined function.
  • Each of A to A 3 units may have I, m, and n, each of which is an integer of 0 or more, but at least one is 1 or more. It also depends on the function to be added to the oligonucleotide derivative by the A As unit. However, since the A unit is arranged at the 5 ′ end of the oligonucleotide, it is effective for conferring exonuclease resistance acting on the 5 ′ end, for example. Also, A 3 unit is effective in E exonuclease acting on the 3 'end.
  • a 2 unit is effective to impart endonuclease resistance in the non-3 'terminal non-5' end of the oligonucleotide.
  • a 3 unit is formed at the dangling end portion of the 3 ′ end of double-stranded RNA, it is effective in improving the silencing effect by RN A i.
  • I and m may be 0 when it is desired to improve 3′-end acting nuclease resistance.
  • m and n may be 0 in order to increase 5′-end-acting nuclease resistance.
  • m and n may be at least one, but may be two or more in combination with each other.
  • the number and location of A As units is determined by taking into account the effects on nucleoside derivatives by introducing nuclease-resistant and non-nucleoside A As units.
  • siRNA or shRNA is constructed using the oligonucleotide derivative of the present invention
  • I and m are 0, and nucleotides corresponding to the dangling end site at the 3 ′ end of these constructs (
  • an A 2 unit may be inserted into the 3 ′ end dangling end.
  • Bok is not to extend the chain length of si RNA.
  • an antigene, antisense, abutama, miRNA, and lipozyme using the oligonucleotide derivative of the present invention it is appropriately provided with A unit or A unit. do it .
  • a unit or A unit do it .
  • the 3 'end is on the side and the 5' end is , A 3 unit and A unit can be formed.
  • liposomes may have an A unit or A 2 unit at the non-5 'end non-3' end.
  • a unit, A 3 unit and Z or A unit can be provided on the 3 ′ end side and Z or 5 ′ end side, or the probe is immobilized on a solid support. If so, the A unit, or the A unit or A 3 unit can be provided on the free end side.
  • the primer may be appropriately equipped with an A unit or an AA unit as necessary.
  • oligonucleotide derivative of the present invention B and C each independently represent an oligonucleotide which may be the same or different but may be modified.
  • oligonucleotide as used herein means a polymer having a plurality of monomer units in which nucleotides, which are monomers constituting oligonucleotides, are used as monomer units.
  • the oligonucleotide means deoxyliponucleotide and Z or liponucleotide as a monomer unit.
  • RNA a polymer having deoxyliponucleotides as monomer units as nucleotides
  • DNA a polymer having deoxyliponucleotides as monomer units
  • RNA a polymer having liponucleotides as monomer units
  • the oligonucleotide derivatives of the present invention are generally referred to as DNA and RNA. In addition to these, oligomers of these monomer units are included. Oligonucleotides also include RNAZDNA chimeras.
  • oligonucleotides which may be modified include oligonucleotides consisting only of nucleotides containing natural bases such as guanine, cytosine, thymine, adenine, uracil or methylcytosine, which are purines and pyrimidines, as well as oligonucleotides. It includes oligonucleotides having one or more nucleotides that have been subjected to some chemical modification in various parts, ie, base, sugar part and phosphate part.
  • the base sequence of the oligonucleotide B and the base sequence of the oligonucleotide C are respectively or
  • it can have a DNA sense strand of a given gene, its antisense strand, or a partial sequence of mRNA or its complementary sequence. By having such complementarity, it is possible to hybridize with various target nucleic acids, thereby expressing the intended function of the ligigonucleotide derivative.
  • the chain lengths of B and C are not particularly limited, and can be set according to the use. Considering the synthesis of the oligonucleotide, it is preferably 10 or more and 35 or less. In the case of antisense, it can be about 10 or more and 30 or less, and in the case of siRNA, the total chain length of B and C is preferably 15 or more and 35 or less, More preferably, it is 30 or less. In the case of a primer, it is preferably 10 or more and 30 or less, and in the case of a probe, it is preferably 10 or more and 30 or less.
  • the B and C monomer units may be modified oligonucleotide oligonucleotides. That's right.
  • the present invention also relates to an oligonucleotide derivative having at least one unit represented by the following formula (1 1) (hereinafter, this oligonucleotide derivative is referred to as a second oligonucleotide derivative).
  • this oligonucleotide derivative is referred to as a second oligonucleotide derivative.
  • the oligonucleotide derivative having the A unit is also referred to as the first oligonucleotide derivative.
  • the second oligonucleotide derivative relates to an oligonucleotide derivative having at least one unit containing E in the formula (11) in the oligonucleotide.
  • the present invention further discloses a construct comprising a second oligonucleotide derivative and use thereof, a production method for producing a second oligonucleotide derivative, and a nucleoside analog.
  • the second oligonucleotide derivative and the related compound have resistance to nuclease by having at least one unit containing E unit shown in formula (11). Therefore, the E unit is the target site for each nuclease (3 'end depending on the type of nuclease End, 5 'end, non-3' end non-5 'end specific base sites, etc.).
  • the E unit contains a nucleobase, unlike the A unit, hybridization by base pairing with a single-stranded oligonucleotide is possible.
  • the second oligonucleotide derivative can be used as a primer or a probe. Therefore, the second oligonucleotide derivative can be used as a probe such as a molecular beacon having high selectivity by providing the E unit in the hybridization portion.
  • the first oligonucleotide derivative described above except for the aspect related to Eunic.
  • the second oligonucleotide derivative is a compound represented by the formula (1 1).
  • the oligonucleotide derivative of the present invention can have one or more units (E unit) containing E in the formula (11) at one or two or more sites in the oligonucleotide. Nuclease resistance can be obtained at locations with this E unit. Two or more E units may be required to achieve good nuclease resistance. Such an unit can be introduced, added, substituted or inserted, or a combination thereof, into an oligonucleotide of known or unknown sequence, thereby combining the second oligonucleotide derivative. Can be obtained.
  • the oligonucleotide referred to here is an oligonucleotide that may be modified.
  • Each E unit can be any base selected from 1 3 a to 13 e in formula (1 3) and any of these substituted bases.
  • Z in each of the E units is independent and may be the same or different, but represents CH or N.
  • the hydrogen atom bonded to each E ring-constituting carbon atom in the E unit may not be substituted or may be substituted.
  • the substituent is preferably a chain alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. That is, a methyl group, an ethyl group, an n_propyl group, an isopropyl group, an n_butyl group, an isobutyl group, and a trt_butyl group are exemplified. In consideration of steric hindrance, a methyl group and an ethyl group may be preferably used. Also, the number of substituents is not particularly limited, but when steric hindrance or the like is a problem, it is preferably about 1 or 2 substituents.
  • the E unit is bound to a part of the oligonucleotide via an appropriate linking group.
  • the linking group for example, a known linking group used for linking nucleotide units of an oligonucleotide such as a phosphoester bond can be used.
  • the linking group in the second oligonucleotide derivative those already applicable to the first oligonucleotide derivative can be used as they are.
  • hydrogen or a known hydroxyl protecting group may be bonded to one oxygen atom of the E unit.
  • the second oligonucleotide derivative represented by the formula (1 1) a compound represented by the formula (1 4) may be mentioned.
  • the second oligonucleotide derivative of this embodiment has an E represented by the formula (1 1) Has one or more of three types of units.
  • E unit the unit containing A arranged at the 5 ′ end
  • E 3 unit the unit arranged at the 3 ′ end
  • E 2 units the non-5 ′ end and non-3 the unit arranged to 'end
  • Each E in each unit is independent and may be the same or different.
  • E in each unit is synonymous with E in the E unit already described, and each of these units represents a specific mode of the E unit in the formula (1 1).
  • the various embodiments in the formula (3) already described can be applied to each group in the E Es unit.
  • the E Es unit may be provided in an additional, substitutional or insertional form or a combination thereof with respect to the sequence of the oligonucleotide derivative having a predetermined function. it can.
  • Each of E to E 3 units may have a number corresponding to each of I, m, and n which are integers of 0 or more, but at least one is 1 or more.
  • E E ⁇ E 3 Yuni' Bok by also differ by connexion to the function to be cane added to an oligonucleotide derivative but, E units, acting 'because, for example, 5 are arranged at the end' end 5 of the oligonucleotide It is effective for conferring xonuclease resistance.
  • E 3 units is effective to Ekisonukurea over zero acting on the 3 'end.
  • the E 2 unit is effective for imparting endonuclease resistance at the non-3 ′ end and non-5 ′ end of the oligonucleotide, and is also effective for exerting a hybridization function.
  • the E 3 unit is effective in improving the silencing effect by RN A i when it is formed at the dangling end part of the 3 ′ end of double-stranded RNA.
  • I and m may be 0 if it is desired to improve 3′-end acting nuclease resistance.
  • m and n may be 0 in order to increase the resistance at the 5 ′ end-acting nuclease.
  • each of m and n has at least one, but each has two or more in combination.
  • You can also The number and location of E Es units are determined in consideration of the effects on oligonucleotide derivatives by introducing nuclease resistant and non-nucleoside E to E 3 units. The number and site of introduction are determined in consideration of the hybridization characteristics.
  • the oligonucleotide derivative of the present invention can comprise both the A unit and the E unit. That is, the first oligonucleotide derivative represented by the formula (1) may be separately provided with an E unit, or any one of B and C of the first oligonucleotide derivative represented by the formula (3) Can be equipped with E.
  • the second oligonucleotide derivative may have an A unit
  • the second oligonucleotide derivative represented by the formula (11) may have an A unit, or the formula (14)
  • E can be provided instead of either or both of B and C.
  • an oligonucleotide derivative comprising at least one unit represented by the formula (1) and at least one unit represented by the formula (1 1) is also an oligonucleotide derivative of the present invention.
  • the oligonucleotide construct of the present invention has one or more kinds of the first oligonucleotide derivative of the present invention. Moreover, it can have one or more second oligonucleotide derivatives. Furthermore, it can have both the first oligonucleotide derivative and the second oligonucleotide derivative.
  • the construct can be converted into single-stranded DNA, double-stranded DNA, single-stranded RNA, double-stranded RNA, DN AZRN A chimera and
  • the form of DN AZRN A hybrid or the like can be used individually or in combination.
  • the oligonucleotide part constituting the oligonucleotide derivative contains a modified oligonucleotide, the oligonucleotide is also included in the modified form in the oligonucleotide construct. Sometimes.
  • Oligonucleotide constructs adopting these various forms are provided with A or AA sunit and Z or E or EE unit at the site that may be the target of nuclease. It is preferable. A or A or A 3 or E 3 or E 3 or E 3 can be prepared for terminal mismatch or dangling end. In consideration of exonucleotide resistance, it is preferable to equip the dangling end with an A unit, A unit, A 2 unit or unit. The A unit or A 2 unit and the Z or E unit or E 2 unit can be provided for bulges, mismatch internal loops, hairpin loops, and the like.
  • the oligonucleotide construct of the present invention has improved nuclease resistance, it can be used for gene expression regulation, or for various uses for research and diagnosis.
  • gene expression regulation applications include antigene, antisense, abtam, siRNA, miRNA, shRNA, and lipozyme.
  • to improve both nuclease resistance and silencing activity by introducing substitution or addition of A unit or A 2 unit to dT at the 3 'end overhang site in si RNA and sh RNA. Is possible.
  • FIG. 1 shows an example of siRNA having A 3 unit at the 3 ′ end.
  • probes and primers examples include probes and primers.
  • Probes are oligonucleotides that, by design or selection, have sequences that are specifically defined for the target nucleic acid and that are hybridized under a given stringency. Since the nuclease resistance is improved by using this oligonucleotide derivative in the probe, the influence of the nuclease mixed in the sample containing the target nucleic acid can be suppressed or avoided, and even if the nuclease removal degree is low or Sample preparation without nuclease removal is possible. This makes it possible to perform genetic diagnosis and testing easily.
  • the hybridization between the target and the target can be carried out by immobilizing the probe on a solid phase carrier such as a suitable glass substrate, plastic substrate or beads.
  • a solid phase carrier such as a suitable glass substrate, plastic substrate or beads.
  • the present invention also includes a solid phase carrier on which a probe containing the oligonucleotide derivative is immobilized.
  • a molecular beacon is an example of one probe.
  • it is preferable to impart nuclease resistance to the stem portion.
  • it is preferable to provide various A units and Z or E unit in the stem portion.
  • the stem portion may be provided with various E units having a hybridization function.
  • the loop portion may be provided with various Eunits having a hybridization function, and may include an A unit so as not to impair the hybridization function.
  • a unit or A unit and Z or non-5' 5 primers one comprising A units or A 2 units terminal non 3 'end.
  • An amplification product with good nuclease resistance can be obtained by performing a PCR reaction using these primers.
  • the compound represented by the formula (4) and the compound represented by the formula (15) (nucleoside analogue) are preferred compounds for use in producing the oligonucleotide derivative of the present invention. These compounds are preferable compounds for introducing AA sunit and Z or BB sunit into the oligonucleotide in the oligonucleotide derivative of the present invention, either by substitution, addition or insertion, or a combination thereof. is there.
  • A is synonymous with A in the oligonucleotide derivative represented by the formula (1)
  • E in the formula (15) is the oligonucleotide represented by the formula (11). Synonymous with E in derivatives.
  • W 1 represents a hydroxyl protecting group. Also in formula (1 5), W 1 can represent H.
  • the hydroxyl protecting group may be any group that protects oxygen in the hydroxyl group substituted by the protecting group from an unintended reaction. Preferably, the protecting group is removed while maintaining the activity of the oligonucleotide derivative.
  • the hydroxyl protecting group is not particularly limited, and various conventionally known hydroxyl protecting groups can be used.
  • Preferred protecting groups of the present invention are fluorenylmethoxycarbonyl (FM0C), dimethoxytrityl (DMT), monomethoxytrityl, trifluoracetyl, levulinyl, or silyl groups.
  • a preferred protecting group is a trityl group, for example selected from dimethoxytrityl (DMT) and W 2 represents H, a phosphoramidite group or a linking group bound to a solid support.
  • W 2 represents H
  • a phosphoramidite group or a linking group bound to a solid support e.g., a trityl group
  • a compound in which W 2 is H can be used as a precursor compound for nucleic acid synthesis.
  • a compound in which W 2 is a phosphoramidite group hereinafter also referred to as Compound II
  • the A and A 2 units in the formula (1) are introduced into the oligonucleotide.
  • the obtained oligonucleotide derivative can be obtained.
  • the phosphoramidai group can be represented by the following formula (5).
  • each Upsilon 1 is independently may be the same or different and represent branched or straight chain alkyl group having 1 to 5 carbon
  • Upsilon 2 is Branched or straight-chain alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or optionally substituted alkoxyl group Represents.
  • Y 1 is not particularly limited, but is preferably an isopropyl group
  • Y 2 includes _OCH 3 , —OE t CN, _OCH 2 CH CH 2, and the like.
  • a compound in which W 2 is a linking group bonded to a solid phase carrier (hereinafter also referred to as compound III) is a linking group and an amino group, etc. By being bonded to a predetermined functional group, it is held on a solid phase carrier.
  • a compound in which W 2 is a linking group bonded to a solid phase carrier (hereinafter also referred to as compound IV) is converted into an A unit (for example, via the linking group).
  • the first oligonucleotide of the present invention will correspond to a 3 Yuni' Bok.
  • oligonucleotides or E units is a solid phase Since it is bound to a carrier, it can be used as a starting material for various solid-phase nucleic acid synthesis methods, and by using this starting material, oligonucleotide derivatives having A 3 unit and E 3 unit can be produced.
  • the solid phase carrier a polymer carrier is generally used, and examples thereof include CPG (control led pored glass), HCP (highly cross-inked polystyrene), and a certain kind of gel.
  • the linking group may be a linker that links the solid phase carrier and the present compound, such as the succinate ester linker shown below.
  • An oxalic acid ester linker, a silane diyl linker, a silyl linker, etc. can be used.
  • a compound in which both W 1 and W 2 are H can be said to be a nucleoside analogue.
  • This nucleoside analog is converted into an oligonucleotide derivative and an oligonucleotide construct of the nucleoside analog. It is useful as various functional oligonucleotides based on nuclease resistance and hyper-precipitation function.
  • H a phosphoramidite linking group or a linking group bound to or bound to a solid phase carrier.
  • W H, phosphoramidite group or a linking group bonded to a solid phase carrier.
  • the present compounds can be produced, for example, according to the following scheme. That is, dimethyl phthalate or dimethyl pyridinedicarboxylate is reduced, and then converted to DMTr to obtain this compound (compound I). Furthermore, this compound (compound II) is obtained by reamididation with an amidite reagent, while the DMTr form is succinylated (compound II and further combined with a CPG resin to obtain this compound (compound IV)).
  • the above compound or nucleoside analog can be used as a unit for a site requiring nuclease resistance.
  • a dangling end unit arranged at the dangling end of siRNA.
  • the nucleoside analog can be preferably used for a partner strand recognition part such as a probe or primer.
  • a nucleoside analog can be used in a loop part which is a probe part as well as a stem part which forms a double strand inside in a molecular beacon.
  • the method for producing an oligonucleotide derivative of the present invention is characterized by using the above-described compounds I to IV of the present invention. Since the oligonucleotide of the present invention can be obtained by a conventionally known nucleic acid synthesis method, during the oligonucleotide synthesis process of such a nucleic acid synthesis method, the Auni or AA sunit and the Euni or the £ 3 unit. The oligonucleotide derivative of the present invention can be produced by appropriately using the compounds I to IV of the present invention at the site where is desired to be introduced.
  • the oligonucleotide is obtained by the conventional nucleic acid synthesis method at the 5' terminal.
  • Compound II which is a phosphoramidite reagent derived from Compound I, and other introduction reagents, Auni can be introduced.
  • a plurality of A units can be introduced continuously by connecting Bow I and then Compound I I to the A unit introduced as necessary. In this way, an oligonucleotide derivative having 1 or 2 or more A units on the 5 ′ end side can be obtained.
  • Eunit can also be introduced at a desired site in the oligonucleotide in the same manner as Aunit.
  • a compound IV derived from the compound 111 is used as a starting material.
  • various nucleic acid synthesis methods including It is only necessary to synthesize the nucleotide and cleave the product from the solid phase carrier in a form containing A unit.
  • Compound II is used as a starting material, whereas Compound II is introduced by the Amidai method or derived from Compound I.
  • the other introduction reagent By introducing the other introduction reagent, an oligonucleotide derivative having a plurality of continuous A units at the 3 ′ end can be obtained.
  • the E unit can be introduced into a desired site of oligonucleotide.
  • non-3 in order to obtain an oligonucleotide derivative having (2 Interview two Tsu DOO in equation (3)) is 'terminal non 5' end A unit, compound II and compound in the course conventional Origonukure Ochido synthesis Other introduction reagents derived from I may be used.
  • the E unit can be similarly introduced into the desired site of the oligonucleotide.
  • oligonucleotide derivatives having two or more of A unit and A A s unit, and E unit and E E s unit can be obtained by using the present compounds I to IV in combination.
  • At least one A unit and Z or unit are added to a known or unknown sequence of oligonucleotides, and any one or a combination of these is introduced. It is a method to do. These modifications can yield RNA constructs that have high nuclease resistance and high silencing effects.
  • the introduction of A unit and Z or E unit may be carried out according to the method for producing oligonucleotide derivatives.
  • the oligonucleotide derivative of the present invention can be used as a gene expression inhibitor by constructing it to function as siRNA or antisense. Further, the oligonucleotide derivative of the present invention can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for prevention / treatment of diseases in humans and non-human animals. For example, for diseases associated with gene expression, the present invention constructed as a gene expression inhibitor Oligonucleotide derivatives are effective for the prevention and treatment of these diseases.
  • the oligonucleotide derivative of the present invention can be used as a test reagent or a diagnostic reagent such as a probe or a primer by constructing it so as to exhibit its hybridization function.
  • a test reagent such as a probe or a primer
  • solid-phase carriers such as a chip
  • these test reagents and diagnostic agents can be used as test or diagnostic kits in combination with other reagent drugs, diagnostic agents, or devices.
  • the oligonucleotide derivative of the present invention can also be used in a gene expression suppression method using the gene expression suppression action of an oligonucleotide construct containing the oligonucleotide derivative of the present invention. Furthermore, the present invention can also be used in a gene detection method using the hybridization function of the oligonucleotide construct of the present invention. In the present specification, the following abbreviations and abbreviations are used.
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • dsRNA double-stranded RNA (double stranded RNA (double stranded RNA (double stranded RNA (double stranded RNA (double stranded RNA (double stranded RNA (double stranded RNA (double stranded RNA (double stranded RNA (double stranded RNA (double stranded RNA (double stranded RNA (double stranded RNA (double
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • FRET Fluorescence energy transfer
  • HNA hexitol nucleic acid
  • PMO phosphoramidomorpholino oligonucleotide (phosphoroamic Hte mor pho I ino I i gonuc I eot i de)
  • PN peptide nucleic acid (peptide
  • RISC RN A-induced silencing complex (RNA-induced
  • RNA Liponucleic acid
  • TBDPSCI tert-butyldiphenylsi lyl chloride
  • TFA trifluoroacetic acid (trif luoroacetic
  • TsCI p—Toluenesulfonic acid chloride (p-To I uenesu I fony I chloride)
  • WSC 1—Ethyl 3_ (3—Dimethylaminopropyl) monocarposimide hydrochloride (1-ethy I -3- (3-di methy I am i nop ropy I) -car bod i imide, hydroc hlor ide)
  • the absorbance at a wavelength of 498 nm was determined and calculated by substituting into the following formula.
  • a short-chain DNA having a dangling end chemically modified at the 3 ′ end was synthesized by an automatic nucleic acid synthesizer according to the solid phase phosphoramidite method.
  • the sequence of the synthesized oligonucleotide is shown below. Synthesis and purification are performed as follows.
  • Oligonucleotide synthesis was performed by a phosphoramidite method using an automatic nucleic acid synthesizer.
  • each amidite was prepared in a 0.1 M acetonitrile solution and each synthesized CPG carrier was used. Based on each activity, 1 mol of each resin was weighed on a column and set in an automatic nucleic acid synthesizer. The condensation time was 5 minutes, and the synthesis was completed with the DMTr group removed.
  • the oligonucleotide bound to the CPG resin was added with 2 mL of 28% NH 3 aqueous solution for DNA and incubated at 55 ° C for 12 hours to cleave from the resin and deprotect.
  • the filtrate after the reaction was transferred to an Eppendorf tube and dried under reduced pressure. I oad i ng so l ut i on (1 x TBE
  • the column was washed with sterilized water to remove salts, and eluted with 50 mL of CH 3 CN in H 2 03 mL, and dried under reduced pressure.
  • the oligonucleotide was dissolved in 201 mL of H 2 O, and the absorbance at 260 nm of the diluted solution was measured to determine its yield * 6 .
  • Identification was also performed by MALm-TOF / MS. Nucleic acid automatic The synthesizer used was Applied Biosystems, Nucleic Acid Synthesis System Expedite 8909 system. Nucleotide-CPG, various amidites, cleaning solutions and oxidation solutions were purchased from GLEN RESEARCH. Acetonitrile was purchased from LAB-SCAN.
  • a solution prepared by adjusting 1.81 g to 40 mL with water) was diluted 100 times.
  • ⁇ 2 ⁇ ( ⁇ 1 ⁇ ⁇ 2 ⁇ ) + ⁇ ( ⁇ 2 ⁇ ⁇ 3 ⁇ ) + ⁇ ⁇ ⁇ + ⁇ ( ⁇ ⁇ _ ⁇ ⁇ ⁇ ) ⁇ - ⁇ ( ⁇ 2 ) + ⁇ ( ⁇ 3 ) + ⁇ ⁇ ⁇ +
  • e (N n ) represents e 260 of a certain nucleic acid N n
  • e (N n — lP N n ) represents e 26 () of a certain nucleic acid dimer N n PN n
  • the concentration C (mol / L) was calculated using the following formula.
  • Figures 2 and 3 show the results of measuring circular dichroism (CD) spectra of various synthesized DNA oligonucleotides using JASCO J-600.
  • concentration of each strand in the CD spectra measurement of oligonucleotide was 10 M.
  • Buffer for measurement (10 mM NaH 2 P0 4 -Na 2 HP0 4
  • each DN A As shown in Fig. 2 and Fig. 3, the waveform of each DN A is almost the same as that of the control (natural double-stranded DNA), and even if one or two dangling ends are introduced, each DN A was considered to form a double strand.
  • thermodynamic parameter was computed using Formula (1). The results are shown in Table 1.
  • ⁇ G. ⁇ H. -TAS.
  • n Constant that is 1 for self-complementary strands and 4 for non-self-complementary strands.
  • thermodynamic energy is deviated from the equilibrium state of the reaction at a certain temperature when 1 mol single strand becomes 1 mol double strand in the standard state.
  • the thermodynamic stability of the chain can be evaluated.
  • the single sign of this value indicates that the double-stranded state is more stable than the single-stranded state, and the larger the absolute value, the more stable the double-stranded state.
  • ⁇ Represents the change in the thermal energy balance when a 1 mol single strand becomes a 1 mol double strand in the standard state.
  • the symbol 1 indicates an exothermic reaction. It shows that it is energetically stable.
  • AS. Represents the change in randomness when a 1 mol single strand becomes a 1 mol double strand in the standard state. Indicates that the smaller the is, the more advantageous it is for duplex formation.
  • AH ° AS. Is expressed by the formula (2).
  • thermodynamic stability of the double strand is determined by changes in the thermal energy balance and randomness of the reaction.
  • enthalpy change which is an indicator of stabilization of the double helix structure such as hydrogen bonding capacity and London dispersion force, increases when the number of dangling ends increases when a benzene ring is introduced.
  • pyridine and naphthalene are considered to be disadvantageous for double strand formation due to a decrease in enthalpy change ( ⁇ °) due to an increase in dangling ends.
  • RNA oligonucleotide having a 3 ′ end dangling end was synthesized by an automatic nucleic acid synthesizer according to the solid phase phosphoramidite method.
  • solid phase synthesis of nucleic acid was performed according to Example 5 except for the following, and the synthesized oligonucleotide was confirmed.
  • CD spectra were measured on various synthesized RNA oligonucleotides. The results are shown in Fig. 4. The CD spectrum was measured in the same manner as in Example 5 except that the short-chain RNA concentration was 20 M.
  • each RNA As shown in Figure 4, the waveform of each RNA is almost the same as that of the control (natural double-stranded RNA), and even if one or two dangling ends are introduced, each RNA has two It was thought to form a chain.
  • Buffer 10m NaH 2 P0 4 -Na 2 HP0 4 (pH7.0), 1M NaCI
  • Tm value increases with the introduction of dangling tend and is thermally stable. It can be seen that However, the degree of stabilization is much smaller than in the case of DNA.
  • free energy change AG °
  • RNA dangling ends are introduced. This suggests that the double strands are not necessarily stabilized.
  • siRNA having a dangling end at the 3 ′ end was synthesized by an automatic nucleic acid synthesizer according to the solid phase phosphoramidite method.
  • the sequence of the synthesized oligonucleotide is shown below.
  • SiRNA is c DN of Reni l la Lusiferase Designed based on the A sequence.
  • Renilla antisense Renilla sense 5 '-r (guaggaguag gaaaggcc II) -3' ® 5'-r (ggccuuucacuacuccuac ⁇ ) -3 '5' -r (guaggaguagugaaaggcc PyPy) -3 ' ⁇ 5'-r (ggccuu cacuacuccuac PyPy)- 3 5 '-r (guaggaguagugaaaggcc TT I) -3' @ 5'-r (ggccuuucacuacuccuac TT I) -3 '5' -r (guaggaguagugaaaggcc TTPy) -3 ® 5'-r (ggccuuucacuacuccuac TTPy) -3 ' '
  • siRNA double-stranded oligonucleotide with 3 'terminal dangling end (Annealing each synthesized siRNA strand with complementary strand to double strand ((13), (14), (15) and ( 16), (17) and (18), and (19) and (20)) were combined in a CD spectrum. The results are shown in FIG. The CD spectrum was measured in the same manner as in Example 5 except that the measurement concentration of siRNA was 3 M.
  • Buffer 10mM NaH 2 P0 4 -Na 2 HP0 4 (pH7.0), 100mM NaCI [0133]
  • direct chemical modification of the dangling end decreased Tm, but as shown on the left side of Table 3, additional chemicals were added to the thymidylate dimer. T m was improved by modification.
  • Luc Assay was performed at concentrations of 0.1, 0.5, 1, 5, and 10 nM. The operation was performed as follows.
  • HeLa cells were adjusted to 4000 cel l / mL, and 100 L was added to each wel l of a 96 wel l plate and cultured for 24 hours. Each strand of the synthesized siRNA was dissolved in TE buffer dOOmM NaCI), heated at 95 ° C for 3 minutes, allowed to stand for 1 hour and returned to room temperature. Each amount of siRNA, Medium (OPT ⁇ MEM), 0.2 g / L
  • Renilla luciferase measured by luciferase was divided by the value of 3 ⁇ 4rFire fly luciferase and compared using% of control.
  • Lumi nescenser JNRI I was used for luciferase measurement.
  • the state in which no siRNA was transfected was defined as 100%. The result is shown in FIG.
  • SVP snake venom phosphodiesterase
  • SVP resistance exonuclease resistance
  • the 32 P isotope labeling of the 5 ′ end of siRNA is performed by adding 10 1 ⁇ buffer 2 to 6 1 / buffer 2 of siRNA sense strand 50 0101 under ice-cooling and ⁇ - 32 ⁇ 1 L and 16 L of sterilized water was mixed and incubated at 37 ° C for 30 minutes. Then remove the contaminants using a spin column and unlabeled sense strand 50
  • oligonucleotide 100 pmol was added to make the total amount of oligonucleotide 100 pmol.
  • the purification with the spin force ram was performed according to the protocol in the attached instruction manual.
  • compound 2 (amidai rod) shown in the following scheme was synthesized.
  • Compound 1 (0.30 g, 0.67 mmol), which had been vacuum-dried in advance, was dissolved in dry THF (6.7 mL) and DIPEA (0.6 m, 3.50 mmol, 5
  • siRNA having a 3 ′ terminal dangling end was solid-phased using the various amidite rods and CPG resin obtained in Example 2, Example 3, Example 10 and Example 11.
  • the nucleic acid was synthesized with an automatic nucleic acid synthesizer according to the phosphoramidai method.
  • the sequence of the synthesized oligonucleotide is shown below.
  • SiRNA was designed based on the cDNA sequence of Reni 11 a Lusiferase.
  • n 1, 2, 3
  • siRNAs with 1,2-hydroxylmethylbenzene derivatives at the dangling ends all suppress protein expression more effectively than siRNAs with unmodified dangling ends. I understood it.
  • siRNAs with 1,4-hydroxymethylbenzene derivatives at the dangling ends all suppress protein expression more effectively than siRNAs with unmodified dangling ends. What to do It was. Furthermore, according to these results, it was found that the number of 1,2_ or 1,4_hydroxymethylbenzene derivatives at the dangling end was most effective and then 3 .
  • siRNA using either 2,3-hydroxymethylnaphthalene derivative or 1,4-hydroxymethylnaphthalene derivative is less than siRNA whose dangling end is unmodified. was also found to effectively suppress protein expression.
  • the target substance was isolated from the concentrate by silica gel column chromatography (hexane) to obtain white crystalline compound 3a and colorless oily compounds 3b and 3c (Yield and Yield: (3 -a) 600 mg, 1.48 mmol, 10%; (3-b) 3.17 g, 4 ⁇ 91 mmol, 34%; (3-c) 5.58 g, 6.32 mmo 1, 44%.
  • the synthesized compound 3_b was used to force-couple with each base and base precursor, thereby producing various force-bonding bodies A-1, GU TU.
  • U-1 (C-1) was obtained in a yield of 77%, 100% (mixture), 125% (mixture) and 86%, respectively.
  • an adenine analog amidite rod and deprotection were synthesized. That is, for the production of an Amidai rod, Compound A-1 was treated with ammonia methanol according to the following scheme to obtain Compound A_2 at a yield of 68%. The resulting compound A_2 was converted into Bz to obtain compound A_3 in a yield of 77%, and subsequently treated with TBAF to obtain compound A_4 in a yield of 48%. The obtained compound A-4 was converted to DMTr to obtain compound A-5 in a yield of 39%. Amida according to the usual method The target compound A — 6 was obtained in a yield of 62%.
  • compound A-7 was obtained by treating compound A-2 with TBAF according to the following scheme for the preparation of a deprotected body.
  • Compound A-8 was obtained in 49% yield by treating Compound A_1 with TBAF.
  • Compound I-1 was obtained in 15% yield by treating Compound A-1 with 50% TFA.
  • a deprotected form of a guanine analog was synthesized. That is, according to the following, compound G-1 was obtained in a yield of 12% (2steps) by treating compound G-1 synthesized with 50% TBAF.
  • a thymidine analog amidai rod, CPG and deprotection were synthesized. That is, according to the following scheme, compound T-1 is treated with TBAF. To obtain Compound T_2 in a yield of 87% (2 steps). Compound T_3 was synthesized with a yield of 69% by converting the obtained compound T_2 into DMTr. Amidation was performed according to a conventional method, and the target compound T_4 was synthesized in a yield of 52%.
  • compound ⁇ _3 was succinylated and combined with CPG resin to obtain compound ⁇ _5 with an activity of 42.2 mol / g (scheme 5b) .
  • compound T_1 is treated with ammonia methanol to obtain decompound ⁇ _6, followed by TBAF treatment to synthesize compound __7 in order to synthesize deprotectors. Synthesized at a rate of 50% (2 steps).
  • Activity (mo I / g) [Abs. (498 nm) xVol. (Solution) (mL) x 3] Z [W eight (support) (mg)]
  • uracil analog amidite rods and deprotected forms were synthesized.
  • Compound U_2 was treated with TBAF to obtain Compound U_2 in a yield of 79%.
  • Compound U_3 was synthesized in a yield of 55% by converting the obtained compound U_2 into DMTr.
  • amidite was converted into the desired compound U_4 with a yield of 37%.
  • compound U_1 was obtained by treating compound U_1 with ammonia methanol, followed by TBAF treatment to obtain compound U_6.
  • the target substance was isolated by the following to obtain white crystalline compound C_3, which was then crystallized by ethyl acetate (yield, yield: 116 mg, 0.44 mmol, 62%).
  • oligonucleotides were synthesized by an automatic nucleic acid synthesizer according to the solid phase phosphoramidide method using various synthesized nucleoside analogs.
  • the following table shows the sequences of the synthesized oligonucleotides and shows synthetic nucleoside analogs other than the natural nucleoside.
  • each natural amidite was adjusted to 0.1 M for each natural amidite, and each synthesized amidite was adjusted to a 0.12 M acetonitrile solution.
  • 1 mo I was weighed onto a column and set in an automatic nucleic acid synthesizer. The condensation time was 5 minutes for natural DNA and 20 minutes for those containing synthesized analogs, and the synthesis was completed with the DMTr group removed.
  • the filtrate was passed through a C-18 reverse phase column (Sep-Pak) equilibrated with 10 mL of acetonitrile followed by flowing 10 mL of 0.1 M TEAA buffer and adsorbed to the column.
  • the column was washed with sterilized water to remove the salt, eluted with 3 mL of 50% aqueous acetonitrile, and dried under reduced pressure.
  • S mark-Pak reverse phase column
  • the column was washed with sterilized water to remove salts, and eluted with 50% CH 3 CN in H 2 03 mL, and dried under reduced pressure.
  • 100 ⁇ of loading solution (1 x TBE in 90% formamide) was added, and the target oligonucleotide was isolated by 20% PAGE (500 V, 20 mA).
  • the target oligonucleotide was excised, 20 mL of 0.1 M TEAA buffer. 1 mM EDTA aqueous solution was added, and the mixture was shaken for 12 hours.
  • the filtrate was passed through an equilibrated C-18 reverse phase column (S mark-Pak) and adsorbed onto the column.
  • the column was washed with sterile water and eluted with 50% CH3CN in H 2 0 3 mL remove salt, it was evaporated to dryness under reduced pressure.
  • the oligonucleotide was used in an aqueous solution and diluted such that the absorbance at a wavelength of 260 (Abs 26 () ) was within the effective range of the absorptiometer. Abs 26Q was measured at room temperature using a quartz cell for measuring the optical path length (I) of 1 cm. The following formula was used to calculate the 0D 260 value.
  • V indicates the total amount of the solution.
  • ⁇ 2 ( ⁇ ( ⁇ 1 ⁇ ⁇ 2 ⁇ ) + ⁇ ( ⁇ 2 ⁇ ⁇ 3 ⁇ ) +- ⁇ -+ ⁇ ( ⁇ -1 ⁇
  • e (Nn) represents e 260 of a certain nucleic acid ⁇
  • e (Nn-1p Nn) represents ⁇ : 260 of a certain nucleic acid dimer Nn-1p Nn.
  • the concentration C (mol ⁇ was calculated as follows: The oligonucleotide was used as an aqueous solution, and diluted so that the absorbance at wavelength 260 (Abs 260 ) was within the effective range of the absorptiometer.
  • Optical path length (I) Abs 260 was measured at room temperature using a 1 cm absorbance measurement quartz cell, and calculated according to the following formula.
  • C Abs 260 ⁇ ⁇ 26o " 1 ⁇ I" 1
  • Example 5 the van't Hoff plot described in Example 5 was used to compare the duplex-forming ability of the modified oligonucleotide containing the nucleoside analog synthesized in Example 22 and the unmodified oligonucleotide.
  • the thermodynamic parameters were calculated using the relational equation.
  • the concentration of each strand in the 50% melting temperature (Tm) measurement of the oligonucleotide was adjusted to 3 M, and the measurement buffer (10 mM NaH 2 P0 4 -Na 2 HP0 4 (pH 7.0)) , 100 mM NaCI), dissolved in 400 L, heated at 95 ° C for 3 minutes, allowed to stand for 1 hour and returned to room temperature.
  • Oligonucleotide derivatives and unmodified oligonucleotides containing analogs in the sequence were synthesized by an automatic nucleic acid synthesizer according to the solid phase phosphoramidide method.
  • the solid phase phosphoramidite method was performed according to the method already described.
  • the structure of the synthesized compound is M A L D I—T O F
  • oligo nucleotides (oligonucleotide for molecular beacon and oligonucleotide for siRNA) synthesized with the target sequence and the structure based on the sequence are shown below. [Chemical 44]
  • Beacon analogue bMB G G U.
  • siRNA 1 3-T b T b -r (ccg gaa agu gau gag gau g) -5 '
  • siRNA 2 3 -T b T b -r (cau ecu cau cac uuu cc A Uc Ag Uc g) -5 '
  • the modified oligonucleotide as a molecular beacon was evaluated.
  • Two types of synthesized molecular beacons (MB (unmodified oligonucleotide) and b MB (modified oligonucleotide containing analogs) were measured for thermal stability with target sequences 1 and 2. The results are shown in Fig. 1 3. Shown in
  • the modified oligonucleotides (b MB) containing the synthesized analogs were similar to the unmodified oligonucleotides (MB). Showed stability.
  • unmodified oligonucleotides do not form stable duplexes, but modified oligonucleotides form relatively stable duplexes. It has been suggested.
  • the loop part is higher, and if the loop part is mismatched, it is also shown that a double strand is not formed. It was.
  • nuclease resistance was evaluated for the two types of synthesized siRNA 1 and siRNA 2.
  • SVP snake venom phosphorodiesterase
  • siRNA composed of modified oligonucleotides is an effective siRNA because it has a stronger inhibition of luciferase expression than siRNA composed of unmodified oligonucleotides.
  • SEQ ID NOs: 1-4, 15 and 16 si RNA
  • SEQ ID NOs: 5-10 Synthetic oligonucleotide
  • SEQ ID NOS: 1 3 and 1 4 Molecular beacons

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Abstract

　本発明は、良好なヌクレアーゼ抵抗性を有するオリゴヌクレオチド誘導体を提供することを目的とする。本発明は、この目的のため、ヌクレオシドに替えてベンゼン骨格を有するユニットを備える。

Description

明 細 書
オリゴヌクレオチド誘導体及びその利用
技術分野
[0001] 本発明は、 新規なォリゴヌクレオチド誘導体、 該ォリゴヌクレオチド誘導 体を用いたオリゴヌクレオチド構築物、 該オリゴヌクレオチド誘導体を合成 するための化合物及び該オリゴヌクレオチド誘導体の製造方法に関する。 背景技術
[0002] 近年、 D N Aや R N Aなど各種のォリゴヌクレオチドが治療、 診断等の用 途に用いられるようになってきている。 診断用途では、 代表的には、 DNA チップや DN Aマイクロアレイが挙げられ、 治療用途では、 治療関連遺伝子 の導入ほか、 疾患関連遺伝子のノックダウンによる発現抑制等が挙げられる 。 また、 アブタマ一を治療薬として用いる試みもなされている。
[0003] 近年、 注目される核酸技術としては、 特定遺伝子のノックダウン法として R NA干渉 (RNAi) が挙げられる。 RNAiとは、 二本鎖 RNA (dsRNA) により配列の 相同な遺伝子の働きが抑制される現象である。 RNAiによる遺伝子発現の抑制 は、 具体的には、 dsRNAが RNasel l lファミリーの一種である Dicerによって認 識、 切断されて 21 -23量体の si RNAs (short interfering RNAs) となり、 こ の s i RNAが R I SC (RNA- i nduced s i I enc i ng
complex) に取り込まれ、 続いて取り込まれた si RNAに相同的な mRNAが中央部 で切断され、 分解されることによる。
[0004] 生体内において外来性の DN Aや RN Aは、 各種ヌクレアーゼに曝されて おり、 特に、 RNAは、 ヌクレアーゼにより分解されやすいため、 図したノ ックダウン効果やその効果を安定的に維持させるのが困難なことがあった。 このため、 RN Aを化学修飾してヌクレアーゼ抵抗性を向上させることが検 討されてし λる (L. Be i gel man. , J. A. McSwiggen. , K. G. Draper et aに， J Biol chem. , 270， 25702-25708 (1995)27) 、 S. P. Zinnen. , K. Domenico. , M. Wi lson et al. , RNA.， 8， 214-228 (2002)及び S. Agrawal and E. R. Kandimal la. ， Curr. Cancer Drug Targets. , 1， 197-209
(2001)) 。 例えば、 s i RNAについても、 図 1 6に示すように、 様々な化 学修飾が試みられている (H. Hoshi. , FEBS
Letters. , 521， 195-199 (2002) ) 。 また、 本発明者らは、 si RNAの 3' 末端ダングリングェンドのリン酸ジエステル結合部分を力ルバメート結合や ゥレア結合に変換して結合部分の負電荷をなくすことにより、 si RNAのヌ クレアーゼ抵抗性とサイレンシング活性とを高めることに成功している （Y. Ueno, T. Naito, K. Kawada, A. Shibata, Hye-Sook Kim, Y. Wataya, Y. Kid ade, Biochem Biophys Res Commun 330， 1168-1175 (2005) ) 。
[0005] RNAiにおいて重要な役割を果たす RISCは RNAiの標的 mRNAの分解の過程に関 与するマルチドメインタンパクとして知られているが、 近年、 RISC中の PAZド メインと siRNAの共結晶 X線結晶構造解析が行われた （vJ.B. Ma. , K. Ye and D. J. Pateに， Nature. , 429, 318-322 (2004) . ) 。 その結果、 PAZドメインは siRNAの 3' 末端ダングリングエンドを認識しており、 3' 末端ダングリングェ ンドの 2ヌクレオチドが PAZドメィンの疎水性ポケッ卜に入り込んで認識され ていることが明らかとなった (J. J. Song. , J. Liu.， N. H. Tol ia.， J. Schn eiderman. , S. K. Smith. , R. A. Martienssen. , G. J. Hannon and L. Joshua- Tor. , Nat. Struct. Bioに， 10, 1026-1032 (2003)、 K. S. Yan. , S. Yan. , A. Farooq.， A. Han.， L. Zeng and M. M. Zhou.， Nature.， 426, 468-474 ( 2003)、 Zhang.， F. A. Kolb.， L. Jaskiewicz. , E. Westhof and W. Fi I ipowic z. , Cel I. , 118, 57-68 (2003)及び A. Lingel. , B. Simon. , E. Izaurralde and M. Sattler. , Nature. , 426， 465-469 (2003) ) 。
[0006] 他の核酸技術としては、 遺伝子解析ツールとしてモレキユラ一ビーコンが 挙げられる。 モレキュラービーコンは、 ステム部分とループ部分とを持つへ ァピン構造の核酸であり、 ループ部分と相補性のある配列の存在確認のため のプローブとして利用される遺伝子解析ツールである。 通常は蛍光剤と消光 剤の距離が近いため消光されている。 しかしループ部分に相補な配列がある と、 ループ部分が相補配列とハイブリダィズするため、 ヘアピン構造が開き 、 蛍光剤と消光剤が引き離されるため、 蛍光が検出される。 これにより標的 配列を検出することができる。 モレキュラービーコンにはステム部分とルー プ部分の、 ターゲット配列に対する相互作用の強弱が重要になる。 こうした モレキュラービーコンにおいては、 ヌクレアーゼ耐性のほか、 ループ部分お よびステム部分の相補配列への配列選択性、 二本鎖安定性の検討など検討さ れている。
発明の開示
[0007] 現在試みられている上記した各種の核酸の化学修飾は、 主として糖部及び 塩基の修飾であるか、 あるいはヌクレアーゼの作用点となるリン酸部を修飾 するものであった。 s i R N Aについては 3 ' 末端ダングリングエンドを標 的に化学修飾して安定性を向上させることも行われていない。 さらに、 ヌク レアーゼ抵抗性やサイレンシング活性の向上を意図した非ヌクレオシド性の 化学修飾も知られていない。 このように、 核酸の化学修飾とそのヌクレア一 ゼ抵抗性やサイレンシング活性との間には明確な関係が存在するわけではな かった。 また、 R I S Cの P A Zドメインの構造解析が行われたものの、 s i R N Aを P A Zドメインに適合させるための修飾は未だ検討されていない し、 P A Zドメインへの適合性はヌクレアーゼ抵抗性に関連付けられるもの ではない。
[0008] そこで、 本発明は、 良好なヌクレアーゼ抵抗性を有するオリゴヌクレオチ ド誘導体、 該ォリゴヌクレオチド誘導体を用いたォリゴヌクレオチド構築物 、 該オリゴヌクレオチド誘導体を合成するための化合物及び該オリゴヌクレ ォチド誘導体の製造方法を提供することを一つの目的とする。 また、 本発明 は、 R N A iによる遺伝子発現抑制効果が向上されたオリゴヌクレオチド誘 導体、 該オリゴヌクレオチド誘導体を用いたオリゴヌクレオチド構築物、 該 オリゴヌクレオチド誘導体を合成するための化合物及び該オリゴヌクレオチ ド誘導体の製造方法を提供することを他の一つの目的とする。
[0009] また、 本発明は s i R N Aやモレキュラービーコンなど機能型核酸として 有用なォリゴヌクレオシド類似体、 該ォリゴヌクレオシド類似体を含む修飾 オリゴヌクレオチド、 該修飾オリゴヌクレオチドを用いたオリゴヌクレオチ ド構築物、 該修飾オリゴヌクレオチドを合成するための化合物及び該修飾ォ リゴヌクレオチドの製造方法を提供することを他の一つの目的とする。
[0010] 本発明者らは、 ある種のリン酸エステル誘導体を有するオリゴヌクレオチ ドが優れたヌクレアーゼ抵抗性を有すること、 さらには、 R N A iによる優 れた遺伝子発現抑制効果を有することを見出し、 本発明を完成した。 すなわ ち、 本発明によれば以下の手段が提供される。
[0011 ] 本発明によれば、 少なくとも 1個の以下の式 （1 ) で表される単位を有す る、 オリゴヌクレオチド誘導体が提供される。
[化 1 ]
Figure imgf000005_0001
[式中、 Aは独立して以下の式 （2 )
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
から選択される置換されていてもよい環式化合物含有基を表す。 ]
[0012] 本発明のオリゴオリゴヌクレオチド誘導体においては、 各 Aは、 式（2)中 の化合物 2 a及び 2 bから選択されていてもよい。
[0013] 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、 以下の式 （3) で表されるもので あってもよい。
[化 3]
Figure imgf000007_0001
(3)
[式中、 R1及び R2は、 それぞれ独立して水素又はヒドロキシル保護基を表 し、 各 X1は独立して 0、 S又は S eを表し、 各 X2は独立して OH若しくは O -、 SH若しくは S_、 56若し<は56_、 炭素数 1〜 4個のアルキル基又 はモルホリノ基を表し、 し m及び nは独立して 0以上の整数であり、 少な くとも一つが 1以上であり、 B及び Cは独立して改変されていてもよいオリ ゴヌクレオチドであって Bと Cを合わせた鎖長が 3以上のオリゴヌクレオチ ドを表す。 ただし、 B及び Cにおいてオリゴヌクレオチドの 3' 末端と 5' 末端の水酸基を含まない。 ]
[0014] また、 この態様のオリゴヌクレオチド誘導体においては、 各 X2は、 0-又 は OHとしてもよい。 さらに、 R1及び R2は Hとすることができる。 さらに また、 mは 0とすることができるし、 I及び mはいずれも 0とすることもで き、 さらに、 I及び mは 0であり、 nは 1以上 5以下とすることができ、 好 ましくは 3以下、 より好ましくは 2以下とすることができる。
[0015] この態様のオリゴヌクレオチド誘導体においては、 B及び Cの鎖長は、 1 0以上 35以下とすることができる。 また、 本発明のオリゴオリゴヌクレオ チド誘導体においては、 A及び Bはオリゴリポヌクレオチドであってもよい 。 さらに、 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体においては、 B及び Cは、 所 定の遺伝子の m R N Aの部分配列又はその相補配列を有することができる。 [0016] また、 本発明によれば、 遺伝子発現調節用ォリゴヌクレオチド構築物であ つて、 上記いずれかのオリゴヌクレオチド誘導体を有する、 構築物が提供さ れる。
[0017] 本発明のオリゴヌクレオチド構築物は、 1本鎖及び 2本鎖 DNA、 1本鎖 及び 2本鎖 RN A、 DN AZRN Aキメラ並びに DN AZRN Aハイブリッ ドから選択される構築物とすることができ、 また、 その機能面からは、 アン チジーン、 アンチセンス、 ァプタマ一、 s i RN A. m i RN A. s h RN A及びリポザィムから選択することができる。
[0018] さらに、 本発明のオリゴヌクレオチド構築物は、 ダングリングエンド部分 に前記 Aを含むユニットを有することができる。 この態様においては、 s i RNAであって、 前記オリゴヌクレオチド誘導体において、 I及び mは 0で あり、 nは 1又は 2であり、 3' 末端ダングリングエンド部分に前記 Aを含 むュニッ卜を有する構築物とすることができる。
[0019] さらに、 本発明によれば、 上記いずれかのオリゴヌクレオチド誘導体を有 する、 診断用構築物が提供される。 本構築物は、 プローブ又はプライマーと することができる。
[0020] 本発明によれば、 以下の式 （4) で表される、 化合物が提供される。 本化 合物において、 各 Aは、 式（2)中の化合物 2 a〜2 gから選択されることが できる。
[化 4]
W10-A-OW2 (4)
[式中、 各 Aは独立して以下の式 （2) ；
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0002
から選択される置換されていてもよい環式化合物含有基を表し、 W1は、 ヒド 口キシル保護基を表し、 W2は、 H、 ホスホルアミダイ卜基又は固相担体に結 合される若しくは結合された連結基を表す。 ]
[0021 ] また、 本発明によれば、 s i R N Aのダングリングエンドユニット用であ る前記化合物も提供される。
[0022] また、 本発明によれば、 オリゴヌクレオチド誘導体の製造方法であって、 上記いずれかの化合物から選択される 1種又は 2種以上を用いる、 製造方法 が提供される。
[0023] また、 本発明によれば、 オリゴヌクレオチドの修飾方法であって、 オリゴ ヌクレオチドに、 少なくとも 1個の以下の式 （1 ) で表される単位を付加、 置換及び挿入のいずれか又はこれらを組み合わせて導入する、 方法が提供さ れる。
[化 6]
Figure imgf000010_0001
[式中、 Aは独立して以下の式 （2 )
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
から選択される置換されていてもよい環式化合物含有基を表す。 ]
[0024] 本発明者らは、 ある種のリン酸エステル誘導体を有するオリゴヌクレオチ ドが優れたヌクレアーゼ抵抗性やプローブとしての検出能を有することを見 出し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明によれば以下の手段が提供され る。
[0025] 本発明によれば、 少なくとも 1個の以下の式 （1 1 ) で表される単位を有 する、 オリゴヌクレオチド誘導体が提供される。
[化 8]
Figure imgf000012_0001
Eは独立して以下の式 （1 2)
H
Figure imgf000012_0002
[式（1 2) 中、 Zは、 CH又は Nを表し、 BAS Eは、 以下の式 （1 3) の 1 3 a〜 1 3 eから選択される置換されていてもよい塩基を表す。 ] [化 10]
Figure imgf000013_0001
(13a) (13b)
Figure imgf000013_0002
(13c) (13d) (13e)
(13)
前記オリゴヌクレオチド誘導体は、 以下の式 （1 4) で表されるものであ つてもよい。
[化 11]
Figure imgf000013_0003
(14) [式中、 R1及び R2は、 それぞれ独立して水素又はヒドロキシル保護基を表 し、 各 X1は独立して 0、 S又は S eを表し、 各 X2は独立して OH若しくは O -、 SH若しくは S_、 56若し<は56_、 炭素数 1〜 4個のアルキル基又 はモルホリノ基を表し、 し m及び nは独立して 0以上の整数であり、 少な くとも一つが 1以上であり、 B及び Cは独立して改変されていてもよいオリ ゴヌクレオチドであって Bと Cを合わせた鎖長が 3以上のオリゴヌクレオチ ドを表す。 ただし、 B及び Cにおいてオリゴヌクレオチドの 3' 末端と 5' 末端の水酸基を含まない。 ]
[0027] また、 この態様のオリゴヌクレオチド誘導体においては、 各 X2は、 0_又 は OHとしてもよい。 さらに、 R1及び R2は Hとすることができる。 さらに また、 mは 0とすることができるし、 I及び mはいずれも 0とすることもで き、 さらに、 I及び mは 0であり、 nは 1以上 5以下とすることができ、 好 ましくは 3以下、 より好ましくは 2以下とすることができる。
[0028] この態様のオリゴヌクレオチド誘導体においては、 B及び Cの鎖長は、 1 0以上 35以下とすることができる。 また、 本発明のオリゴヌクレオチド誘 導体においては、 A及び Bはオリゴリポヌクレオチドであってもよいしオリ ゴデォキシリポヌクレオチドであってもよい。 さらに、 本発明のオリゴヌク レオチド誘導体においては、 B及び Cは、 所定の遺伝子の mRN Aの部分配 列又はその相補配列を有することができる。
[0029] また、 本発明によれば、 遺伝子発現調節用ォリゴヌクレオチド構築物であ つて、 上記いずれかのオリゴヌクレオチド誘導体を有する、 構築物が提供さ れる。 このオリゴヌクレオチド構築物は、 1本鎖及び 2本鎖 DNA、 1本鎖 及び 2本鎖 RN A、 DN AZRN Aキメラ並びに DN AZRN Aハイブリッ ドから選択される構築物とすることができ、 また、 その機能面からは、 アン チジーン、 アンチセンス、 ァプタマ一、 s i RN A. m i RN A. s h RN A及びリポザィムから選択することができる。 さらに、 本発明のオリゴヌク レオチド構築物は、 ダングリングェンド部分に前記 Aを含むュニッ卜を有す ることができる。 この態様においては、 s i RNAであって、 前記オリゴヌ クレオチド誘導体において、 I及び mは 0であり、 nは 1、 2又は 3であり 、 3' 末端ダングリングエンド部分に前記 Aを含むユニットを有する構築物 とすることができる。
[0030] さらに、 本発明によれば、 上記いずれかのオリゴヌクレオチド誘導体を有 する、 診断用構築物が提供される。 本構築物は、 プローブ又はプライマーと することができる。 また、 モレキュラービーコンとすることもできる。 モレ キュラービーコンにおいて前記 Aは、 ステム部分に配されていてもよいし、 ループ部分に配されていてもよい。
[0031] 本発明によれば、 以下の式 （1 5) で表される、 ヌクレオチド類似体が提 供される。
[化 12]
W，0— E— OW2 、 10)
[式中、 各 Eは独立して以下の式 （1 2) ;
[化 13]
Figure imgf000015_0001
[式中、 Zは、 CH又は Nを表し、 B AS Eは、 以下の式 （1 3) の 1 3 a〜 1 3 eから選択される置換されていてもよい塩基を表し、 [化 14]
Figure imgf000016_0001
(13c) (13d) (13e)
(13)
W1は、 H又はヒドロキシル保護基を表し、 W2は、 H、 ホスホルアミダイ卜 基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。 ]
[0032] また、 s i RN Aのダングリングユニット用である前記ヌクレオシド類似 体やモレキュラービーコンのステム又はループ用である前記ヌクレオシド類 似体も提供される。
[0033] また、 本発明によれば、 オリゴヌクレオチド誘導体の製造方法であって、 上記いずれかのヌクレオシド類似体から選択される 1種又は 2種以上を用い る、 製造方法が提供される。
また、 本発明によれば、 オリゴヌクレオチドの修飾方法であって、 オリゴ ヌクレオチドに、 少なくとも 1個の以下の式 （1 1 )で表される単位を付加、 置換及び挿入のいずれか又はこれらを組み合わせて導入する、 方法が提供さ れる。
[化 15]
Figure imgf000017_0001
Eは独立して以下の式 （1 2)
[化 16]
H
Figure imgf000017_0002
[式（2)中、 Zは、 CH又は Nを表し、 B AS Eが以下の式 （1 3) の 1 3 a 〜 1 3 eから選択される置換されていてもよい塩基を表す]
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000018_0002
(13c) (13d) (13e)
(13)
また、 本発明によれば、 前記オリゴヌクレオシド類似体又はその塩を含む オリゴヌクレオチドの製造方法及びその利用も提供される。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、 本発明のオリゴヌクレオチド構築物 （s i RN A) の一例を示 す図である。
[図 2]図 2は、 実施例 5で取得した 3' 末端ダングリングエンドを化学修飾し た DN Aオリゴヌクレオチド （1 ) 〜 （4) の CDスペクトルを示す図であ る。
[図 3]図 3は実施例 5で取得した 3 ' 末端ダングリングェンドを化学修飾した DN Aオリゴヌクレオチド （5) 〜 （8) の CDスペクトルを示す図である
[図 4]図 4は、 実施例 6で取得した 3' 末端ダングリングエンドを化学修飾し た RN Aオリゴヌクレオチド （9) 〜 （12) の CDスペクトルを示す図。 を 示す図である。
[図 5]図 5は、 実施例 7で取得した 3' 末端ダングリングエンドを化学修飾し た s i RN A二本鎖オリゴヌクレオチド （1 3) 〜 （20) の CDスぺク卜 ルを示す図である。
[図 6]図 6は、 Dual Luciferase Assayによる 3' 末端化学修飾 siRNAのタンパ ク発現抑制効果を示すグラフ図である。
[図 7]図 7は、 3' 末端化学修飾 siRNA (単鎖状態） のヌクレアーゼ抵抗性を示 す蛇毒ェキソヌクレアーゼ処理後の電気泳動結果を示す図である。
[図 8]図 8は、 3' 末端化学修飾 siRNA (二本鎖状態） のヌクレアーゼ抵抗性を 示す蛇毒ェキソヌクレアーゼ処理後の電気泳動結果を示す図である。
[図 9]図 9は、 Dual Luciferase Assayによる 3' 末端ダングリングエンドに 1
， 2—ヒドロキシルメチルベンゼン誘導体を備える化学修飾 siRNA (二本鎖状 態） のタンパク質発現抑制効果を示すグラフ図である。
[図 10]図 1 0は、 Dual Luciferase Assayによる 3' 末端ダングリングエンド に 1， 4—ヒドロキシメチルベンゼン誘導体を備える化学修飾 siRNA (二本鎖 状態） のタンパク質発現抑制効果を示すグラフ図である。
[図 11]図 1 1は、 Dual Luciferase Assayによる 3' 末端ダングリングエンド に 2， 3—ヒドロキシメチルナフタレン誘導体又は 1， 4—ヒドロキシメチ ルナフタレン誘導体を備える化学修飾 siRNA (二本鎖状態） のタンパク質発現 抑制効果を示すグラフ図である。
[図 12]図 1 2は、 実施例 22で取得した修飾オリゴヌクレオチドと非修飾ォ リゴヌクレオチドとの二本鎖形成能 （熱的安定性） に関する CDスペクトル を示す図である。
[図 13]修飾ォリゴヌクレオチドモレキュラービーコンと非修飾ォリゴヌクレ ォチドモレキュラービーコンの二本鎖形成能 （熱的安定性） に関する CDス ベクトルを示す図である。 緩衝液は、 1 0mMリン酸ナトリウム （p H7) 、 1 0 OmMN a C U 1 OmMリン酸ナ卜リゥム （p H 7) 、 1 000m M N a C I及び 1 OmMリン酸ナ卜リゥム （p H 7) 、 1 0 OmM N a C I及び 1 OmM M g C I 2とした。
[図 14]図 1 4は、 類似体を 3' 末端に備える化学修飾 siRNA (—本鎖状態） の ヌクレアーゼ抵抗性を示す蛇毒ェキソヌクレアーゼ処理後の電気泳動結果を 示す図である。
[図 15]図 1 5は、 Dual Luciferase Assayによる 3' 末端ダングリングエンド に類似体を備える化学修飾 siRNA (二本鎖状態） のタンパク質発現抑制効果を 示すグラフ図である。
[図 16]従来のオリゴヌクレオチドに対する化学修飾の例を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0037] 本発明は、 式 （1 ) で表されるオリゴヌクレオチド誘導体に関している。
すなわち、 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、 オリゴヌクレオチド中に 式 （1 ) における Aを含むユニットを少なくとも 1つ有するオリゴヌクレオ チド誘導体に関する。 本発明はさらに、 こうしたオリゴヌクレオチド誘導体 を含む構築物及びその利用、 オリゴヌクレオチド誘導体を製造するための製 造方法並びにそのための化合物を開示する。 本発明のオリゴヌクレオチド誘 導体は、 式 （1 ) 中において示す Aを含有するユニットを少なくとも 1個有 することで、 ヌクレアーゼに対する抵抗性が発揮される。 したがって、 こう したユニットは、 各種ヌクレアーゼのターゲットとなる箇所 （ヌクレアーゼ の種類により 3' 末端、 5' 末端、 非 3' 末端非 5' 末端の特定の塩基部位 など） に備えることができる。
[0038] Aを含むユニットを s i RNAの 3' 末端ダングリングエンド （オーバー ハング部位） に備えることにより、 RN A iによる遺伝子発現抑制作用が増 大される。 推論であって本発明を拘束するものではないが、 こうした遺伝子 発現抑制作用の増大は、 s i RNAの 3' 末端に Aを含むユニットを備えさ せて 3' 末端の疎水性を向上させた結果、 PAZによる親和性ないし認識性が向 上し、 これによりサイレンシング効果が向上したものと考えられる。 したが つて、 Aを含むユニットを 3' 末端ダングリングエンドに有する s i RNA は、 優れたヌクレアーゼ抵抗性とサイレンシング活性とを有することができ る。 さらに、 こうしたオリゴヌクレオチド誘導体は効率的に合成することが できる。
[0039] 以下、 本発明の実施の形態であるオリゴヌクレオチド誘導体、 その製造方 法及びそれに用いる化合物、 オリゴヌクレオチド誘導体を有する構築物につ いて詳細に説明する。 なお、 本発明に関する当業者の技術の範囲内である分 子生物学および核酸化学の従来の技術は、 文献中で説明されている。 例えば 、 Sambrookら、 Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1 989年； Gaは， M. J. , 0I igonucleotideSynthesis,編集 (1984年) ； Hames, B. D.および Higgins, S. J.、 Nucleic Acid Hybridization, 編集 (1984年) ；お よび一連の Methods in Enzymo logy, Academic Press, Inc.を参照することが できる。
[0040] (ォリゴヌクレオチド誘導体）
本発明においてオリゴヌクレオチド誘導体は、 式 （1 ) で表される化合物 である。 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、 式（1)における Aを含有す るユニット （以下、 単に Aユニットともいう。 ） を、 オリゴヌクレオチド中 の 1箇所又は 2箇所以上に、 それぞれ 1個又は 2個以上有することができる 。 この Aュニッ卜を有する箇所においてヌクレアーゼ耐性を得ることができ る。 良好なヌクレアーゼ耐性を得るには、 2個以上の Aユニットを要する場 合もある。 このような Aユニットは、 配列既知又は配列未知のオリゴヌクレ ォチドに対して、 付加、 置換又は挿入のいずれかあるいはこれらを組み合わ せて導入することができ、 これによリ本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を 得ることができる。 なお、 ここでいうオリゴヌクレオチドは、 改変されてい てもよいオリゴヌクレオチドである。
[0041 ] Aュニッ卜における各 Aは芳香族環及び Z又は複素環を構成環とする単環 〜多環縮合環を有する 2価の環式化合物含有基とすることができる。 好まし くは環式化合物含有基における環構造は、 単環式〜 3環縮合環であり、 より 好ましくは単環式又は二環縮合環である。 単環式の芳香族環及び複素環を有 する 2価の環式化合物含有基が最も好ましい場合もある。 また、 Aは、 全体 として疎水性であって、 親水性又は極性の置換基を有していないことが好ま しい。 Aの構成環において有していてもよい置換基としては、 非極性の置換 基であることが好ましく、 炭素数 1〜 4個の鎖状アルキル基を有することが できる。 すなわち、 メチル基、 ェチル基、 n _プロピル基、 イソプロピル基 、 n _ブチル基、 イソブチル基及び t e r t _ブチル基が挙げられる。 これ らの環を構成する 2個の炭素原子 （環構成炭素原子） にそれぞれ結合した炭 素数 1〜 4個程度 （好ましくはメチル基及びェチル基、 より好ましくはメチ ル基） の 2個の鎖状アルキル基を連結部分としている。
[0042] こうした Aユニットの卜の各 Aとしては、 好ましくは、 式 （2 ) に記載の 化合物 2 a〜2 gから選択することができる。 これらの化合物において、 各 Zは、 それぞれ独立し、 同一であっても異なっていてもよいが、 C H又は N を表す。 化合物 2 a〜2 gのなかでも、 単環式である 2 a及び 2 bを好まし く用いることができる。 また、 2 dも好ましく用いることができる。
[0043] Aュニッ卜における各 Aの環構成炭素原子に結合する水素原子は置換され ていなくてもよいし、 置換されていてもよい。 置換基としては、 炭素数 1〜 4個の鎖状アルキル基とすることが好ましい。 すなわち、 メチル基、 ェチル 基、 n _プロピル基、 イソプロピル基、 n _ブチル基、 イソブチル基及び t e r t _ブチル基が挙げられる。 立体障害等を考慮したとき、 メチル基及び ェチル基を好ましく用いることができる場合がある。 また、 置換基の数も特 に限定しないが、 立体障害等が問題となる場合には、 1個又は 2個程度とす ることが好ましい。
[0044] 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、 Aュニッ卜を適当な連結基を介し てオリゴヌクレオチドの一部に結合されている。 連結基は例えば、 ホスホジ エステル結合等オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の連結に用いられる 公知の連結基を用いることができる。 例えば、 [化 1 5 ]に例示されるような 連結基 （ただし、 Aに連結される酸素原子を除くものとする。 ） が挙げられ る。 また、 Aユニットがオリゴヌクレオチドの末端にある場合には、 Aュニ ッ卜の一方の酸素原子には、 水素又は公知のヒドロキシル保護基が結合され ていてもよい。
[0045] また、 式（1 )で表される本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の一態様とし て、 式（3 )に表される化合物が挙げられる。 式 （3 ) においては、 R 1及び R 2は、 それぞれ独立し、 同一であっても異なっていてもよいが、 水素又はヒド 口キシル保護基を表している。 ヒドロキシル保護基としては、 該保護基によ リ置換されるヒドロキシル基中の酸素を意図しない反応から保護する基であ ればよい。 好ましくは、 保護基は、 オリゴヌクレオチド誘導体の活性を維持 して除去されるものである。 こうしたヒドロキシル保護基としては、 特に限 定しないで従来公知の各種のヒドロキシル保護基を用いることができる。 本 発明の好ましい保護基は、 フルォレニルメトキシカルボニル （FM0C) 、 ジメ トキシトリチル (DMT) 、
モノメトキシトリチル、 トリフルォロアセチル、 レブリニル、 またはシリル 基である。 例えば、 ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの 5'末端にある ヒドロキシル基についての好ましい保護基は、 トリチル基、 例えば、 ジメ卜 キシトリチル （DMT) から選択される。
[0046] この態様のオリゴヌクレオチド誘導体は、 式（3 )に示す Aを含む 3種類の ユニットのいずれか又は 2種類以上を有している。 以下、 式（3 )において、 5 ' 末端に配置される Aを含むユニットを A ユニットと称し、 3 ' 末端に配 置にされる該ユニットを A 3ユニットと称し、 非 5 ' 末端及び非 3 ' 末端に配 置される該ュニッ卜を A 2ュニッ卜と称する。 これらの各ュニッ卜における各 Aはそれぞれ独立し、 同一であっても異なっていてもよい。 これらの各ュニ ッ卜における Aについては Aュニッ卜における Aと同義であり、 これらの各 ュニッ卜はいずれも式（1)における Aュニッ卜の具体的態様を表している。
A Asユニットにおける各 X1はそれぞれ独立し、 同一であっても異なつ ていてもよく、 0、 S又は S eを表し、 また、 各 X 2はそれぞれ独立して OH (若しくは 0_) 、 SH (若しくは S_) 、 S又は S e -、 炭素数"!〜 4個のァ ルキル基又はモルホリノ基を表す。 これら X 1及び X 2の組み合わせてによつ て得られる各種のホスホジエステル結合としては、 例えば、 以下の式に挙げ ることができる。 A Asュニッ卜においてはこれらの各種のホスホジエス テル結合を 1種又は 2種以上を組み合わせて用いることができる。
[化 18]
o
II
-0-P-0- -p-
I I
o— CH 3
Figure imgf000025_0001
Se
II
-o-p-o- I
o一
Se
II
-o-p-o-
I
s一
Se
II
-o-p-o- I
Se_
Aュニッ卜と同様に、 A Asュニッ卜は、 所定の機能を持ったオリゴヌ クレオチド誘導体の有する配列に対して付加的、 置換的及び挿入的のいずれ かあるいはこれらを組み合わせた形態で備えることができる。 また、 A 〜A 3ュニッ卜は、 いずれも 0以上の整数である I、 m及び n個をそれぞれ有する ことができるが、 少なくとも一つが 1以上である。 また、 A Asユニット によってオリゴヌクレオチド誘導体に付加しょうとする機能によっても異な るが、 A ユニットは、 オリゴヌクレオチドの 5' 末端に配置されるため、 例 えば、 5' 末端に作用するェキソヌクレアーゼ抵抗性を付与するのに有効で ある。 また、 A3ユニットは、 3' 末端に作用するェキソヌクレアーゼに有効 である。 また、 A2ユニットは、 オリゴヌクレオチドの非 3' 末端非 5' 末端 においてエンドヌクレアーゼ抵抗性を付与するのに有効である。 また、 A3ュ ニットは、 二本鎖 RN Aの 3' 末端ダングリングエンド部分に形成するとき には、 RN A iによるサイレンシング効果の向上に有効である。 したがって 、 例えば、 3' 末端作用性ヌクレアーゼ抵抗性を向上させたい場合には、 I 及び mは 0であってもよい。 逆に、 5' 末端作用性ヌクレアーゼ抵抗性を高 める場合には、 m及び nは 0であってもよい。
[0049] また、 ヌクレアーゼ抵抗性を得る場合には、 し m及び nはいずれも少な くとも 1つ有していればよいが、 それぞれあるいは組み合わせて 2個以上有 することもできる。 A Asユニットの数や部位は、 ヌクレアーゼ抵抗性と 非ヌクレオシド性の A Asュニッ卜を導入することによるオリゴヌクレオ チド誘導体への影響を考慮して決定される。
[0050] 例えば、 本発明のォリゴヌクレオチド誘導体を利用して s i R N A又は s h RNAを構築する場合、 I及び mは 0とし、 これらの構築物の 3' 末端の ダングリングエンド部位に対応するヌクレオチド （例えば、 d T (デォキシ チミジン） ） の 3' 末端に 1個〜 3個 （n = 1〜3) 、 好ましくは 1個又は 2個 （n = 1、 2) の A3ユニットを付加してもよいし、 s i RNAの例えば 2つの d Tのうち 1個又は 2個を A3ユニットで置換してもよい （n = 1、 2 ) 。 さらには、 3' 末端ダングリングエンドに A2ユニットを揷入してもよい 。 既存ヌクレオチドを A3ユニットで置換する形態は、 s i RNAの鎖長を延 長することがないというメリッ卜がある。
[0051] また、 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を利用してアンチジーン、 アン チセンス、 アブタマ一、 m i RNA及びリポザィムを構築するときには必要 に応じて適宜 Aュニッ卜又は A Asュニッ卜） を備えるようにすればよい 。 例えば、 アンチセンス RNAには、 3' 末端が側及び 5' 末端側に Aュニ ット、 A 3ユニット及び A ユニットを形成することができる。 また、 ァプタ マーゃリポザィムにあっては、 非 5 ' 末端非 3 ' 末端における Aユニット又 は A 2ユニットが有効な場合もありえる。 また、 プローブにおいては、 3 ' 末 端側及び Z又は 5 ' 末端側に Aユニット、 A 3ユニット及び Z又は A ュニッ 卜を備えることもできるし、 あるいは、 プローブが固相担体に固定化されて いる場合には、 自由端側となる側に Aユニット、 又は A ユニット又は A 3ュ ニットを備えるようにすることができる。 さらに、 プライマーにおいては必 要に応じて適宜 Aュニッ卜や A A sュニッ卜を備えていてもよい。
[0052] 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体においては、 B及び Cは、 それぞれ独 立し、 同一であっても異なっていてもよいが、 改変されていてもよいオリゴ ヌクレオチドを表す。 ここで、 本明細書においてオリゴヌクレオチドとは、 一般にオリゴヌクレオチドゃポリヌクレオチドを構成するモノマーであるヌ クレオチドをモノマー単位として該モノマー単位を複数有するポリマーを意 味するものとする。 また、 オリゴヌクレオチドとは、 モノマー単位として、 デォキシリポヌクレオチド及び Z又はリポヌクレオチドを意味するものであ る。 一般に、 ヌクレオチドとしてデォキシリポヌクレオチドをモノマー単位 とするポリマーを D N Aと称し、 リポヌクレオチドをモノマー単位とするポ リマーを R N Aと称するが、 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、 一般に 称される D N A及び R N Aのほか、 これらのモノマー単位のォリゴマーを含 むものとする。 また、 オリゴヌクレオチドは、 R N AZ D N Aキメラも包含 している。 また、 改変されていてもよいオリゴヌクレオチドとは、 プリン及 びピリミジンであるグァニン、 シトシン、 チミン、 アデニン、 ゥラシルまた はメチルシトシンなどの天然塩基を含むヌクレオチドのみからなるオリゴヌ クレオチドのほか、 オリゴヌクレオチドの各種部分、 すなわち、 塩基、 糖部 分及びリン酸エステル部分において何らかの化学修飾が施された 1又は 2以 上のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを包含している。
[0053] 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体において、 Bのオリゴヌクレオチドの 塩基配列及び Cのオリゴヌクレオチドの塩基配列は、 それぞれ又はこれらを 合わせて所定の遺伝子の D N Aのセンス鎖、 そのアンチセンス鎖又は m R N Aの部分配列若しくはその相補配列を有することができる。 こうした相補性 を有することにより各種の標的核酸にハイブリダイズさせ、 それによリオリ ゴヌクレオチド誘導体に意図した機能を発現させることができる。
[0054] 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体において、 B及び Cの鎖長は特に限定 しないで、 用途に応じた長さとすることができる。 オリゴヌクレオチドの合 成を考慮すると、 1 0以上 3 5以下とすることが好ましい。 また、 アンチセ ンスの場合には、 1 0以上 3 0以下程度にすることができ、 また、 s i R N Aの場合には、 B及び Cの合計の鎖長は、 好ましくは 1 5以上 3 5以下、 よ リ好ましくは 3 0以下である。 プライマーの場合には、 1 0以上 3 0以下で あり、 プローブの場合には 1 0以上 3 0以下であることが好ましい。
[0055] 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を、 例えば、 s i R N A、 s h R N A 、 アンチセンス、 リポザィム及びアブタマ一に用いる場合は、 B及び Cのモ ノマー単位は改変されていてもよいオリゴリポヌクレオチドとすることがで さる。
[0056] 本発明は、 また、 少なくとも 1個の以下の式 （1 1 ) で表される単位を有す る、 オリゴヌクレオチド誘導体 (以下、 このオリゴヌクレオチド誘導体を第 2 のオリゴヌクレオチド誘導体というものとし、 特に、 Aユニットを有するォ リゴヌクレオチド誘導体を第 1のォリゴヌクレオチド誘導体というものとす る。 ） にも関する。 すなわち、 第 2のオリゴヌクレオチド誘導体は、 オリゴ ヌクレオチド中に式 （1 1 ) における Eを含むユニットを少なくとも 1つ有 するオリゴヌクレオチド誘導体に関する。 本発明はさらに、 第 2のオリゴヌ クレオチド誘導体を含む構築物及びその利用、 第 2のオリゴヌクレオチド誘 導体を製造するための製造方法並びにヌクレオシド類似体を開示する。 第 2 のオリゴヌクレオチド誘導体及びこれに関連する化合物は、 式 （1 1 ) 中に おいて示す Eュニッ卜を含有するュニッ卜を少なくとも 1個有することで、 ヌクレアーゼに対する抵抗性が発揮される。 したがって、 Eユニットは、 各 種ヌクレアーゼのターゲットとなる箇所 （ヌクレアーゼの種類により 3 ' 末 端、 5 ' 末端、 非 3 ' 末端非 5 ' 末端の特定の塩基部位など） に備えること ができる。
[0057] また、 Eユニットは、 核酸塩基を含んでいるため、 Aユニットとは異なり 、 1本鎖オリゴヌクレオチドとの間において塩基対合によるハイブリダィゼー シヨンが可能である。 ハイブリダィゼーシヨン機能を備えることにより、 プ ライマー又はプローブとして第 2のオリゴヌクレオチド誘導体を用いること ができるようになる。 したがって、 Eユニットをハイブリダィゼーシヨン部 位に備えることで選択性の高いモレキュラービーコンなどのプローブとして 第 2のオリゴヌクレオチド誘導体を利用することができる。
[0058] 第 2のオリゴヌクレオチド誘導体及びこれに関連するヌクレオシド類似体 などの化合物及びこれらの製造方法並びに利用については、 Eュニッ卜に関 する態様以外は、 既に説明した第 1のォリゴヌクレオチド誘導体における各 種の実施態様をそのまま適用できる。 以下、 第 2のオリゴヌクレオチド誘導 体及びヌクレオシド類似体についての Eュニッ卜に特有の実施態様について 説明する。
[0059] (第 2のォリゴヌクレオチド誘導体）
第 2のオリゴヌクレオチド誘導体は、 式 （1 1 ) で表される化合物である 。 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、 式（1 1 ) における Eを含有するュ ニット （Eユニット） を、 オリゴヌクレオチド中の 1箇所又は 2箇所以上に 、 それぞれ 1個又は 2個以上有することができる。 この Eユニットを有する 箇所においてヌクレアーゼ耐性を得ることができる。 良好なヌクレアーゼ耐 性を得るには、 2個以上の Eユニットを要する場合もある。 このような Eュ ニットは、 配列既知又は配列未知のオリゴヌクレオチドに対して、 付加、 置 換又は挿入のいずれかあるいはこれらを組み合わせて導入することができ、 これによリ第 2のオリゴヌクレオチド誘導体を得ることができる。 なお、 こ こでいうオリゴヌクレオチドは、 改変されていてもよいオリゴヌクレオチド である。 また、 Eユニットを備えることにより、 R N A iによる遺伝子発現 抑制作用が増大される。 [0060] 各 Eユニットは、 式 （1 3 ) に 1 3 a〜 1 3 eから選択されるいずれかの 塩基及び置換されているこれらのいずれかの塩基とすることができる。 ベン ゼン骨格に対してメチレン基を連結基として塩基を導入することにより、 ヌ クレアーゼ耐性とハイプリダイゼーション機能とを発揮することができる。
[0061 ] 第 2のオリゴヌクレオチド誘導体において、 こうした Eユニットの各巳に おける Zはそれぞれ独立し、 同一であっても異なっていてもよいが、 C H又 は Nを表す。 式 （ 1 3 ) における 1 3 a〜 1 3 eのうちでは特に限定しない で必要に応じて、 塩基の種類を選択すればよい。
[0062] Eュニッ卜における各 Eの環構成炭素原子に結合する水素原子は置換され ていなくてもよいし、 置換されていてもよい。 置換基としては、 炭素数 1〜 4個の鎖状アルキル基とすることが好ましい。 すなわち、 メチル基、 ェチル 基、 n _プロピル基、 イソプロピル基、 n _ブチル基、 イソブチル基及び t e r t _ブチル基が挙げられる。 立体障害等を考慮したとき、 メチル基及び ェチル基を好ましく用いることができる場合がある。 また、 置換基の数も特 に限定しないが、 立体障害等が問題となる場合には、 1個又は 2個程度とす ることが好ましい。
[0063] 第 2のオリゴヌクレオチド誘導体は、 Eユニットを適当な連結基を介して オリゴヌクレオチドの一部に結合されている。 連結基は例えば、 ホスホジェ ステル結合等オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の連結に用いられる公 知の連結基を用いることができる。 第 2のォリゴヌクレオチド誘導体におけ る連結基については、 既に、 第 1のオリゴヌクレオチド誘導体に適用するこ とができるものをそのまま利用できる。 また、 Eユニットがオリゴヌクレオ チドの末端にある場合には、 Eユニットの一方の酸素原子には、 水素又は公 知のヒドロキシル保護基が結合されていてもよい。
[0064] また、 式（1 1 ) で表される第 2のオリゴヌクレオチド誘導体の一態様とし て、 式（1 4 ) に表される化合物が挙げられる。 式 （1 4 ) においては、 Eュ ニット以外については、 既に説明した式 （3 ) についての実施態様を適用で きる。 この態様の第 2のオリゴヌクレオチド誘導体は、 式（1 1 ) に示す Eを 含む 3種類のユニットのいずれか又は 2種類以上を有している。 以下、 式（1 4) において、 5' 末端に配置される Aを含むユニットを E ユニットと称し 、 3' 末端に配置にされる該ユニットを E3ユニットと称し、 非 5' 末端及び 非 3' 末端に配置される該ユニットを E2ユニットと称する。 これらの各ュニ ッ卜における各 Eはそれぞれ独立し、 同一であっても異なっていてもよい。 これらの各ュニッ卜における Eについて既に説明した Eュニッ卜における E と同義であり、 これらの各ユニットはいずれも式（1 1 ) における Eユニット の具体的態様を表している。 また、 E Esユニットにおける各基について も、 既に説明した式 （3) における各種実施態様を適用することができる。
[0065] Eユニットと同様に、 E Esユニットは、 所定の機能を持ったオリゴヌ クレオチド誘導体の有する配列に対して付加的、 置換的及び挿入的のいずれ かあるいはこれらを組み合わせた形態で備えることができる。 また、 E 〜E 3ュニッ卜は、 いずれも 0以上の整数である I、 m及び nに対応する個数をそ れぞれ有することができるが、 少なくとも一つが 1以上である。 また、 E 〜 E3ュニッ卜によってオリゴヌクレオチド誘導体に付加しょうとする機能によ つても異なるが、 E ユニットは、 オリゴヌクレオチドの 5' 末端に配置され るため、 例えば、 5' 末端に作用するェキソヌクレアーゼ抵抗性を付与する のに有効である。 また、 E3ユニットは、 3' 末端に作用するェキソヌクレア ーゼに有効である。 また、 E2ユニットは、 オリゴヌクレオチドの非 3' 末端 非 5' 末端においてェンドヌクレアーゼ抵抗性を付与するのに有効であるほ か、 ハイブリダィゼーシヨン機能の発揮にも有効である。 また、 E3ユニット は、 二本鎖 RN Aの 3' 末端ダングリングエンド部分に形成するときには、 RN A iによるサイレンシング効果の向上に有効である。 したがって、 例え ば、 3' 末端作用性ヌクレアーゼ抵抗性を向上させたい場合には、 I及び m は 0であってもよい。 逆に、 5' 末端作用性ヌクレアーゼ抵抗性を高める場 合には、 m及び nは 0であってもよい。
[0066] また、 ヌクレアーゼ抵抗性を得る場合には、 し m及び nはいずれも少な くとも 1つ有していればよいが、 それぞれあるいは組み合わせて 2個以上有 することもできる。 E Esユニットの数や部位は、 ヌクレアーゼ抵抗性と 非ヌクレオシド性の E 〜 E 3ユニットを導入することによるオリゴヌクレオ チド誘導体への影響を考慮して決定される。 また、 導入数や導入部位はハイ ブリダイゼーション特性を考慮して決定される。
[0067] 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、 Aユニットと Eユニットとの双方 を備えることもできる。 すなわち、 式 （1 ) で表される第 1のオリゴヌクレ ォチド誘導体において Eユニットを別に備えていてもよいし、 式 （3) で表 される第 1のォリゴヌクレオチド誘導体の B及び Cのいずれかの部位に、 E を備えることができる。 また、 第 2のオリゴヌクレオチド誘導体が Aュニッ 卜を備えていてもよく、 式 （1 1 ) で表される第 2のオリゴヌクレオチド誘 導体において Aユニットを備えることもできるし、 式 （1 4) で表される第 2のオリゴヌクレオチドにおいて、 B及び Cのいずれかあるいは双方に替え て Eを備えることもできる。 このように、 すくなくとも一つの式 （1 ) で表 されるユニットと少なくとも一つの式 （1 1 ) で表されるユニットとを備え るオリゴヌクレオチド誘導体も本発明のオリゴヌクレオチド誘導体である。
[0068] (ォリゴヌクレオチド構築物）
本発明のオリゴヌクレオチド構築物は、 本発明の第 1のオリゴヌクレオチ ド誘導体を 1種又は 2種以上有している。 また、 第 2のオリゴヌクレオチド 誘導体を 1種又は 2種以上有することができる。 さらに、 第 1のオリゴヌク レオチド誘導体及び第 2のオリゴヌクレオチド誘導体との双方をそれぞれ有 することができる。
[0069] 本ォリゴヌクレオチド構築物における本ォリゴヌクレオチド誘導体の種類 や組み合わせにより、 本構築物は、 1本鎖 DNA、 2本鎖 DNA、 1本鎖 R NA、 2本鎖 RNA、 DN AZRN Aキメラ及び DN AZRN Aハイブリツ ド等の形態をそれぞれあるいは組み合わせた形態とすることができる。 なお 、 既に説明したように、 本オリゴヌクレオチド誘導体を構成するオリゴヌク レオチド部分は、 改変されたオリゴヌクレオチドを含んでいるため、 本オリ ゴヌクレオチド構築物においても改変形態をオリゴヌクレオチドが含まれる ことがある。
[0070] こうした各種形態を採るオリゴヌクレオチド構築物は、 ヌクレア一ゼのタ ーゲッ卜となる可能性のある部位に Aュニッ卜若しくは A A sュニッ卜及 び Z又は Eュニッ卜若しくは E E sュニッ卜を備えることが好ましい。 A ュニッ卜又は A ュニッ卜や A 3ュニッ卜及び Eュニッ卜又は E ュニッ卜や E 3ュニッ卜は、 ターミナルミスマッチやダングリングエンドに備えることがで きる。 ェキソヌクレオチド抵抗性を考慮すると、 ダングリングエンドに Aュ ニッ卜又は A ュニッ卜や A 2ュニッ卜や Eュニット等を備えることが好まし い。 また、 Aユニット又は A 2ユニット及び Z又は Eユニット又は E 2ュニッ 卜は、 バルジ、 ミスマッチインターナルループ、 ヘアピンループなどに備え ることができる。
[0071 ] 本発明のオリゴヌクレオチド構築物は、 ヌクレアーゼ抵抗性が向上されて いるため、 遺伝発現調節用、 又は研究用、 診断用の各種用途に用いることが できる。 遺伝子発現調節用途としては、 アンチジーン、 アンチセンス、 アブ タマ一、 s i R N A、 m i R N A、 s h R N A及びリポザィム等が挙げられ る。 特に、 s i R N A及び s h R N Aにおいて 3 ' 末端オーバーハング部位 の d Tに対し Aュニッ卜又は A 2ュニッ卜を置換的又は付加的に導入すること でヌクレアーゼ耐性とサイレンシング活性の双方を向上させることができる 。 図 1に、 A 3ユニットを 3 ' 末端に有する s i R N Aの一例を示す。
[0072] また、 診断用途又は研究用途としては、 プローブ及びプライマーが挙げら れる。 プローブは、 設計または選択により、 ターゲット核酸に特異的に規定 された配列を有しており、 所定のストリンジエンシーの下で、 それらがハイ ブリダィズするようにするに取得されたオリゴヌクレオチドである。 プロ一 ブに本オリゴヌクレオチド誘導体を用いることでヌクレアーゼ耐性が向上さ れるため、 ターゲッ卜核酸を含有するサンプル中に混在するヌクレアーゼの 影響を抑制又は回避して、 ヌクレアーゼの除去程度が低くてもあるいはヌク レアーゼ除去処理を省略したサンプル調製が可能になる。 これにより簡易に 遺伝子診断や検査をすることができるようになる。 なお、 こうしたプローブ とターゲッ卜とのハイブリダィゼーシヨンはプローブを適当なガラス基板、 プラスチック製基板又はビーズなどの固相担体に固定化して行うことができ る。 本発明には、 本オリゴヌクレオチド誘導体を含むプローブを固定化した 固相担体も含まれる。
[0073] なお、 プローブの一態様としてモレキュラービーコンが挙げられる。 モレ キュラービーコンにおいては、 ステム部分にヌクレアーゼ耐性を付与するこ とが好ましく、 このために、 ステム部分に各種 Aユニット及び Z又は Eュニ ットを備えることが好ましい。 また、 ステム部分には、 ハイブリダィゼーシ ヨン機能を有する各種 Eユニットを備えていてもよい。 さらに、 ループ部分 には、 ハイブリダィゼーシヨン機能を有する各種 Eュニッ卜を備えることが できるほか、 ハイブリダィゼーシヨン機能を損なわない程度に Aュニッ卜を 含んでいてもよい。
[0074] 例えば、 本発明によれば、 5 ' 末端側に Aユニット又は A ユニット、 及び Z又は非 5 ' 末端非 3 ' 末端に Aユニット又は A 2ユニットを備えるプライマ 一を得ることができる。 こうしたプライマーを用いて P C R反応を行うこと で、 ヌクレアーゼ抵抗性の良好な増幅産物を得ることができる。
[0075] (オリゴヌクレオチド誘導体の合成に適した化合物、 該化合物を用いたオリ ゴヌクレオチド誘導体の製造方法）
式 （4 ) で表される化合物及び式 （1 5 ) で表される化合物 （ヌクレオシ ド類似体） は、 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を製造のための使用に好 ましい化合物である。 これらの化合物は、 本発明のオリゴヌクレオチド誘導 体中、 A A sュニッ卜及び Z又は B B sュニッ卜をオリゴヌクレオチド において置換、 付加及び挿入のいずれかあるいはこれらを組み合わて導入す るのに好ましい化合物である。 なお、 式 （4 ) における Aは、 式 （1 ) で表 されるオリゴヌクレオチド誘導体における Aと同義であり、 式 （1 5 ) にお ける Eは、 式 （1 1 ) で表されるオリゴヌクレオチド誘導体における Eと同 義である。
[0076] 式 （4 ) 及び式 （1 5 ) において、 W1はヒドロキシル保護基を表す。 また 、 式 （1 5 ) においては、 W1は Hを表すことができる。 ヒドロキシル保護基 としては、 該保護基により置換されるヒドロキシル基中の酸素を意図しない 反応から保護する基であればよい。 好ましくは、 保護基は、 オリゴヌクレオ チド誘導体の活性を維持して除去されるものである。 こうしたヒドロキシル 保護基としては、 特に限定しないで従来公知の各種のヒドロキシル保護基を 用いることができる。 本発明の好ましい保護基は、 フルォレニルメ トキシカ ルポニル （FM0C) 、 ジメ トキシトリチル （DMT) 、 モノメ トキシトリチル、 卜 リフルォロアセチル、 レブリニル、 またはシリル基である。 好ましい保護基 は、 トリチル基であり、 例えば、 ジメ トキシトリチル （DMT) から選択される また、 W2は、 H、 ホスホルアミダイ卜基又は固相担体に結合される若しく は結合された連結基を表す。 W2が Hである化合物 （以下、 化合物 Iともいう 。 ） は、 核酸合成のための前躯体化合物として利用できる。 W2がホスホルァ ミダイ卜基である化合物 （以下、 化合物 I Iともいう。 ） は、 ホスホルアミダ ィ卜法によるホスホルアミダイ卜試薬として用いて、 オリゴヌクレオチドに 対して式 （1 ) における A 及び A 2ユニットを導入したオリゴヌクレオチド 誘導体を得ることができる。 なお、 本発明において、 ホスホルアミダイ卜基 は、 以下の式 （5 ) で表すことができる。
[化 19]
Figure imgf000035_0001
(式 （5 ) 中、 各 Υ 1は独立して、 同一であっても異なっていてもよく、 分枝 状又は直鎖状の炭素数 1〜 5個のアルキル基を表し、 Υ 2は、 分枝状又は直鎖 状の炭素数 1〜 5個のアルキル基又は置換されていてもよいアルコキシル基 を表す。 ） 上記式 （5) において、 Y1は、 特に限定しないがイソプロピル基 が好ましいものとして挙げられ、 また、 Y 2としては、 _OCH3、 -OE t CN、 _OCH2CH CH2等が挙げられる。
また、 式 （4) 及び式 （1 5) において W2が固相担体に結合される連結基 である化合物 （以下、 化合物 IIIともいう。 ） は、 当該連結基とアミノ基など 固相担体上の所定の官能基とを結合させることにより、 固相担体に保持され る。 そして、 式 （4) 及び式 （1 5) において、 W2が固相担体に結合された 連結基である化合物 （以下、 化合物 IVともいう。 ） は、 連結基を介して Aュ ニット （例えば、 本発明の第 1のオリゴヌクレオチドでは A 3ュニッ卜に対応 するであろう。 ） や Eユニット （本発明の第 2の 「オリゴヌクレオチドでは E3ユニットに対応するであろう。 ） が固相担体に結合されているため、 各種 の核酸固相合成法の出発材料として用いることができる。 この出発材料を用 いることで、 A 3ュニッ卜や E 3ュニッ卜を有するオリゴヌクレオチド誘導体 を製造することができる。 ここで、 固相担体とは、 一般に高分子担体が用い られ、 例えば、 CPG (control led pored glass) や HCP (highly cross- 1 inked polystyrene) 、 ある種のゲルなどが挙げられる。 また、 固相 担体には適切なスぺーサーを有していてもよい。 連結基は、 固相担体と本化 合物とを連結するリンカ一である。 こうした連結基としては、 以下に示すコ ハク酸エステルリンカ一、 シユウ酸エステルリンカ一、 シランジィルリンカ 一、 シリルリンカ一などを用いることができる。
[化 20]
Figure imgf000037_0001
■CCH2CH コハク酸エステルリンカ一
Figure imgf000037_0002
シユウ酸エステルリンカ一
Figure imgf000037_0003
ンランンィノレリンカ一
Figure imgf000037_0004
シリルリンカ一
また、 式 （1 5 ) において、 W1及び W2がいずれも、 Hである化合物は、 ヌ クレオシド類似体であるといえる。 このヌクレオシド類似体をオリゴヌクレ ォチド誘導体及びォリゴヌクレオチド構築物は、 当該ヌクレオシド類似体の ヌクレアーゼ抵抗性やハイプリダイゼーション機能に基づき各種機能型ォリ ゴヌクレオチドとして有用である。
[0080] H、 ホスホルアミダイ卜基又は固相担体に結合される若しくは結合された 連結基を表す。 W、 H、 ホスホルアミダイ卜基又は固相担体に結合される若 しくは結合された連結基を表す。 w
[0081] 本化合物 （化合物 l〜IV) は、 例えば、 以下のスキームで製造することがで きる。 すなわち、 フタル酸ジメチルあるいはピリジンジカルボン酸ジメチル 等を還元し、 続いて DMT r化して本化合物 （化合物 I ) を得る。 さらに、 これをアミダイ卜試薬によリアミダイト化して本化合物 （化合物 II) を得る 一方、 DMT r体をスクシニル化 （化合物 II し、 さらに CPG樹脂と結合 させて本化合物 （化合物 IV) を得る。
[化 21]
化合物 I 化合物 II
Figure imgf000038_0001
[0082] なお、 式 （ 1 5) で表される化合物 I〜 I Vは、 ベンジル誘導体等に塩基 をカップリングした後、 DMT r化して本化合物 （化合物 I ) を得る。 さら に、 これをアミダイ卜試薬によリアミダイト化して本化合物 （化合物 II) を 得る一方、 DMT r体をスクシニル化 （化合物 II し、 さらに CPG樹脂 έ 結合させて本化合物 （化合物 IV) を得ることができる。 なお、 ベンジル誘導 体に対する塩基のカップリングに先だって、 ベンジル誘導体が備える水酸基 に適当な保護基を付与しておき、 塩基のカップリング後、 DMT r化前の適 当な段階で脱保護することが好ましい。 [0083] 上記化合物又はヌクレオシド類似体は、 ヌクレアーゼ耐性を要する部位用 のユニット （単位） として用いることができる。 特に、 s i R N Aのダング リングエンドに配されるダングリングエンドュニッ卜用として好ましい。 ま た、 ヌクレオシド類似体についてはプローブやプライマー等の相手鎖認識部 分等にも好ましく用いることができる。 例えば、 ヌクレオシド類似体は、 モ レキユラ一ビーコンにおいては、 内部で二重鎖を形成するステム部分ほかプ ローブ部分であるループ部分にも用いることができる。
[0084] (ォリゴヌクレオチド誘導体の製造方法）
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法は、 上記した本発明の化合 物 I〜 I Vを用いることを特徴とする。 本発明のオリゴヌクレオチドは従来公 知の核酸合成法によって得ることができるため、 こうした核酸合成法のオリ ゴヌクレオチド合成工程中、 Aュニッ卜又は A A sュニッ卜及び Eュニッ 卜又は £ £ 3ュニッ卜を導入したい部位において、 適宜本発明の化合物 I 〜 I Vを利用することにより、 本発明のォリゴヌクレオチド誘導体を製造する ことができる。
[0085] 例えば、 5 ' 末端側に Aユニット （式（3 )においては A ユニット） を有す るオリゴヌクレオチド誘導体を得るには、 従来の核酸合成法により取得した オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端に上記化合物 Iから誘導したホスホアミダイ 卜試薬である化合物 I Iやその他の導入用試薬を用いることにより、 Aュニッ 卜を導入することができる。 さらに、 必要に応じ導入した Aユニットに対し て、 弓 Iき続き化合物 I I等を連結することで複数個の Aュニッ卜を連続して導 入することもできる。 こうして 5 ' 末端側に 1又は 2個以上の Aユニットを 有するオリゴヌクレオチド誘導体を得ることができる。 Eュニッ卜について も、 Aュニッ卜と同様にしてオリゴヌクレオチドの所望の部位に導入するこ とができる。
[0086] また、 3 ' 末端側に Aユニット （式（3 )においては A 3ユニット） を有する オリゴヌクレオチド誘導体を得るには、 化合物 1 1 1から誘導した化合物 I Vを出 発材料として用い、 アミダイト法をはじめとする各種核酸合成法によりオリ ゴヌクレオチドを合成し、 固相担体から Aュニッ卜を含んだ形態で生成物の 切り出しを行えばよい。 3 ' 末端側に複数個連続して Aユニットを有するォ リゴヌクレオチド誘導体を得るには、 化合物 I Vを出発材料として、 これに対 して、 化合物 I Iをアミダイ卜法により導入するか化合物 Iから誘導した他の 導入試薬を導入することで、 複数個連続した Aユニットを 3 ' 末端に有する オリゴヌクレオチド誘導体を得ることができる。 Eユニットについても、 同 様にしてォリゴヌクレオチドの所望の部位に導入することができる。
[0087] さらに、 非 3 ' 末端非 5 ' 末端に Aユニット （式（3 ) においては 2ュ二 ット） を有するオリゴヌクレオチド誘導体を得るには、 従来のオリゴヌクレ ォチド合成途中において化合物 I Iや化合物 Iから誘導したその他の導入試薬を 用いればよい。 Eユニットについても、 同様にしてオリゴヌクレオチドの所 望の部位に導入することができる。
[0088] さらに、 Aユニット及び A A sユニット並びに Eユニット及び E E s ュニッ卜のうち 2種類以上を有するオリゴヌクレオチド誘導体は、 本化合物 I〜 I Vを組み合わせて用いることにより得ることができる。
[0089] (ォリゴヌクレオチドの修飾方法）
本発明のォリゴヌクレオチドの修飾方法は、 配列既知又は配列未知のォリ ゴヌクレオチドに少なくとも 1個の Aュニッ卜及び Z又は Eュニッ卜を付加 、 置換及び挿入のいずれかあるいはこれらを組み合わせて導入する方法であ る。 こうした修飾により、 ヌクレアーゼ耐性のほか、 サイレンシング効果の 高い R N A構築物を得ることができる。 Aュニッ卜及び Z又は Eュニッ卜の 導入は、 オリゴヌクレオチド誘導体の製造方法に準じて実施すればよい。
[0090] (ォリゴヌクレオチド誘導体の利用）
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、 s i R N Aやアンチセンス等とし て機能するよう構築することで、 遺伝子発現抑制剤として利用できる。 また 、 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、 ヒト及び非ヒト動物における疾患 の予防■治療用医薬組成物の有効成分として用いることができる。 例えば、 遺伝子発現に伴う疾患に対して、 遺伝子発現抑制剤として構築した本発明の オリゴヌクレオチド誘導体はこうした疾患の予防や治療に有効である。
[0091] さらに、 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、 そのハイブリダィゼーシ ョン機能を発揮させるように構築することでプローブ、 プライマー等の検査 試薬や診断試薬として用いることができる。 さらに、 これらオリゴヌクレオ チド構築物をチップやビーズ等の固相担体等に保持したものは、 検査装置や 診断装置又はこれらの一部として利用することができる。 さらには、 こうし た検査試薬や診断薬は、 他の試薬薬や診断薬あるいは装置等と組み合わせた 検査用又は診断用キッ卜としても用いることがでくる。
[0092] 本発明のォリゴヌクレオチド誘導体は、 本発明のォリゴヌクレオチド誘導 体を含むォリゴヌクレオチド構築物の遺伝子発現抑制作用を利用した遺伝子 発現抑制方法にも利用できる。 さらに、 本発明のオリゴヌクレオチド構築物 のハイブリダィゼーシヨン機能を利用した遺伝子検出方法にも利用できる。 なお、 本明細書においては、 以下の略語及び略号を用いる。
APS：アンモニゥム /《一ォキシドサレフエ一卜 (ammonium peroxodi sulfate) Ar： ァ レゴン (argon)
BzCI ：塩化ベンゾィル (benzoyl chloride)
CeNA：シクロへキサン核酸 (cyclohexene
nucleic acid)
CPG：コントロールドポアガラス （controlled
pore glass)
DEAD：ジェチルァゾカルボキシレート （diethyl
azodicarboxylate)
DIPEA：ジイソプロピルェチルァミン (di isopropyl ethyl amine)
DMAP： 4—ジメチルァミノピリディン （4-d i methyl am inopyrideine) DMF：ジメチルホルムアミド (dimethylformamide)
DMS0：ジメチルスルホキシド (dimethyl sulfoxide)
DMTrCI
：ジメトキシトリチルクロライド (dimethoxytrityl chloride) DNA：デォキシリポ核酸 (deoxyribonucleic
acid)
dsRNA :二重鎖 RNA (double
strand RNA)
EDTA：エチレンジァミン四酢酸 （
ethy I ened i am i ne-N, N, N' , N' -tetraacet i c
acid)
FAB：高速原子衝撃 (fast atom bombardment)
FRET：蛍光エネルギー移動 （Fluorescence
resonance energy transfer)
Gly：グリセロール (glycerol)
HNA：へキシトール核酸 (hexitol
nucleic acid)
HPLC：高速液体クロマトグラフィー （high
performance liquid chromatgraphy)
HRMS：高分解能質量スぺク卜ロメ トリ (high-resolution mass spectrometry)
MS：質量分析 （MASS
spectroscopy)
MsCI ： メタンスルホニルクロライド (Methanesu I f ony I chlor ide)
NBA : 3 _ニトロべンジルアルコール （3-nは robenzylalcho NMR：核磁気共鳴 （nuclear
magnet i c resonance)
PAGE：ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (polyacryl am ide gel electrophoresis)
PCR：ポリメラーゼチェイン反応 （polymerase
chain reaction) PMO：ホスホロアミドモルホルノオリゴヌクレオチド （phosphoroamicHte mor pho I ino o I i gonuc I eot i de)
PN：ぺプチド核酸 (peptide
nucleic acid)
PPh3： トリフエニルホスフィン （tri phenyl
phosphine)
RISC： RN A誘導サイレンシング複合体 （RNA- induced
S i I enc i ng Comp I ex)
RNA： リポ核酸 (ribonucleic
acid)
TBAF： トリブチルアンモニゥムフロライド （tr i butyl ammoniumfluor ide) TBDPSCI ： tert—プチルジフエニルシリルクロライド (tert-butyldiphenylsi lyl chloride)
tc-DNA： トリサイクロ _DNA (tricyclo-DNA)
TEA： 卜リエチルァミン (tri ethyl amine)
TEAA： 卜リエチルァミン酢酸 （tr i ethyl ami ne-acetic
acid)
TEMED：テトラメチルエチレンジァミン （
N, N, N' , N' -tetramethy I -ethy I ened i am i ne)
TFA： トリフルォロ酢酸 (trif luoroacetic
acid)
Tris : tr i s (hydroxymethy I ) am i nomethane
TsCI ： p—トルエンスルホン酸クロライド (p-To I uenesu I f ony I chloride) WSC： 1—ェチルー 3_ (3—ジメチルァミノプロピル） 一カルポジミドハイ ドロクロライド (1 -ethy I -3- (3-d i methy I am i nop ropy I ) -car bod i imide, hydroc hlor ide) [0093] 以下、 本発明を、 実施例を挙げて具体的に説明するが、 これらの実施例は 本発明を限定するものではない。
[0094] (3' 末端ダングリングエンドの合成のためのイソフタル酸誘導体の合成） 本実施例では、 以下のスキーム Iに示す化合物 1〜化合物 5を合成した。 すなわち、 イソフタル酸ジメチルを還元し 1を収率 95%で得て、 続いて DMTr化 を行い化合物 2を収率 51%で得た。 DMTr体 2をアミダイ卜化して化合物 3を 94% の収率で得た。 また、 DMTr体 2をスクシニル化し、 CPG樹脂と結合させ、 化合 物 5を 108.6 mo l/gの活性で得た。 化合物 1〜 5の製造例を以下に示す。
[化 22]
Figure imgf000044_0001
4：117% 5 ι086μ moyg
スキーム 1
[0095] (化合物 1 ： 1, 3-bis-hydroxymethylbenzene の製造例）
イソフタル酸ジメチル (2.00 g， 10.30mmol) に Ar雰囲気下、 dry THF (51. 5mL, 0.2M solution) を加え、 水素化ホウ素リチウム（1.12g， 51.5隱 ol， 5eq )を加えた。 23時間攪拌した後、 氷浴で酢酸を数滴加えて反応液を中性にし、 反応を停止した。 しばらく攪拌した後、 析出した結晶を MeOHで溶解した。 反 応中の TLC (Hex:Et0Ac=1:1)では生成物は 1スポットであつたが、 反応を停止 すると 2スポットに分かれた。 溶媒を減圧留去後、 シリカゲルクロマトグラフ ィー (EtOAc only) で単離し、 化合物（1) (1.36g, 9.82mmol, 95%)を得た。 1H NMR (400MHz， CDCI3) δ [ppm] ： 7.39-7.26 (4H， m, aromatic protons), 4 .71 (4H， s, -CH2-0-) , 1.70 (2H， d， J=76.8 Hz, OH)
13C NMR (100MHz, CDCI3) ά [ppm] ： 139.28, 129.62, 128.47, 63.90
Mass (El) m/z： 138 (M+)， 120, 107, 79, 65， 51.
HRMS (El) Calcd for C8H1002138.06808 Found 138.06765.
Anal. Calcd for C8H1002 : C， 69.54； H， 7.30. Found : C， 69.45； H， 7.23.
[0096] (化合物 2 ： 1- (4,4， -d i methoxyt r i ty I oxy) methy I -3-hydroxymethy I benze neの製造例） 予め真空乾燥させておいた化合物 （1) (0.5g, 3.62mmol) を pyr idine (18mL)に溶解し、 DMAP (22.1mg, 0.18隱 ol， 0.05eq) と 4, 4' -Dimeth oxytrityl chloride (1.23g, 3.62mmol, 1eq)を加え、 Ar雰囲気下で 17時間 攪拌した。 TLC (Hex:EtOAc=3:1)により原料の消失を確認した。 EtOAcと sat NaHC03 aqで抽出し、 有機層を sat NaCI aqで洗浄、 無水 Na2S04を加え乾燥させ た。 溶媒を減圧留去後、 シリカゲルクロマトグラフィー （Hex:EtOAc=4:1)で 単離し、 化合物（2) (0.82g, 1.86mmol, 51%)を得た。
1H NMR (400MHz, CDCI3) d [ppm] ： 7.52-6.82 (17H, m, DMTr and aromatic p rotons) , 4.70 and 4.18 (4H， s, -CH2-0-) ， 3.80 (6H， t, J=4.0 Hz， H-m ethoxy) , 1.62 (2H， s, OH)
13C NMR (100MHz, CDCI3) ά [ppm] ： 158.42, 145.00, 140.76, 139.68, 136.24 ， 130.06, 128.50, 128.16, 127.83, 126.73, 126.31, 125.71, 125.55, 113 .10, 86.39, 65.43, 55.20
Mass (El) m/z： 440 (M+)， 303， 273， 227， 138, 121, 107, 79, 45.
HRMS (El) Calcd for C29H2804440.19876
Found 440.19806. Anal. Calcd for C29H2804■ 1/5H20: C， 78.27； H， 6.45. F ound： C， 78.33； H， 6.59.
[0097] (化合物 3 : 1- (4,4， -dimethoxytrityloxy) methy I -3-0- [ (2-cyanoethy I ) - (N, N-d i i sopropy I ) ] -phosphoam i d i cmethy I -hydroxymethy I benzeneの製造例
)
予め真空乾燥させておいた化合物 (2) (0.35g, 0.80mmol) を dry THF (8mL ) に溶解し、 DIPEA (0.4mし 4. OOmmo I， 5eq)と亜リン酸化試薬 (0.29mし 1■ 60 mmol, 2eq)を加え、 Ar雰囲気下で 1.5時間攪拌した。 TLC (EtOAc only) によ リ原料の消失を確認した。 EtOAcと sat NaHC03aqで抽出し、 有機層を sat NaCI aqで洗浄、 無水 Na2S04を加え乾燥させた。 溶媒を減圧留去後、 中性シリカゲル クロマトグラフィー （Hex:Et0Ac=1:1)で単離し、 化合物（3) (0.48g, 0.75mmo I， 94%)を得た。
32P NMR (162MHz, CDCI3) ά [ppm] : 148.8
Mass (FAB) m/z： 641 ( [M++H] ) ， 303， 201, 154.
HRMS (FAB) Calcd for C38H46N205P 641.31443 Found 641.31292.
(化合物 4 ：化合物 5 (イソフタル酸誘導体の CPG樹脂） の製造例） 化合物（2) (0.30g, 0.68mmmol)を pyridine (6.8mL)に溶解し、 そこに DMAP
(3.7mg, 0.03mmo 1 , 0.02eq) と無水コハク酸 (204mg, 2.04mmo 1 , 3eq)を加 え Ar雰囲気下で攪拌した。 24時間攪拌した後、 TLC (Hex:EtOAc=3: 1)により反 応の進行を確認し、 EtOAcと sat NaHC03 aqで抽出し、 有機層を sat NaCI aqで 洗浄、 無水 Na2S04を加え乾燥させた。 溶媒を減圧留去後、 真空乾燥させた。 こ の濃縮物 (4) (0.40g, 0.74mmol, 109%) に dry DMF (10mL)を加え溶解させ 、 CPG (500mg, 0.11mmol) を加え 30分間静置して反応液となじませた。 その 後、 WSC(110mg， 0.57mmol, 4.9eq)を加え室温で一日振とうさせた。 後処理と して、 pyridineで洗浄した後に 0.1M DMAP in pyr idine:無水酢酸
(9:1)溶液 （6mL) を加え、 16時間振とうさせた。 このものを Me0H、 acetone で洗浄し乾燥させ活性を測定した。 化合物 (5)の活性は 108.6 mo l/gであった 。 なお、 活性は、 乾燥した CPG樹脂 6 mgをガラスフィルターにのせ、 HCI04:Et 0H = 3:2の溶液を流し込み、 そのろ液の UV
498 nmの波長 （DMTr基の波長）の吸光度を求め、 以下の式に代入することに より算出した。
活性 （ molZg) =Abs. (498 nm) xVol. (solution) (mL) x 14.3ZWeight (support) (mg) [0099] (3' 末端ダングリングエンドのフタル酸誘導体の合成）
本実施例では、 以下のスキーム I Iに示す化合物 6〜化合物 1 0を合成した。 すなわち、 フタル酸ジメチルを還元し 6を収率 72%で得て、 続いて DMTr化を行 い化合物 7を収率 90%で得た。 DMTr体 7をアミダイ卜化して化合物 8を 98%の収 率で得た。 また、 DMTr体 7をスクシニル化し、 CPG樹脂と結合させ、 化合物 10 を 86.6 mo l/gの活性で得た。 化合物 6 1 0の製造例を以下に示す
[化 23]
Figure imgf000047_0001
9:81% 10 86.6 μ mol/g
スキーム 2
[0100] (化合物 6 1, 2-bis-hydroxymethylbenzeneの製造例）
フタル酸ジメチル （2.00 g 10.30mmol) に Ar雰囲気下、 無水 THF (51.5m し 0.2M solution) を加え、 水素化ホウ素リチウム（1.12g 51.5隱 ol 5eq) を加えた。 18時間攪拌した後、 氷浴で酢酸を数滴加えて反応液を中性にし、 反応を停止した。 しばらく攪拌した後、 析出した結晶を MeOHで溶解した。 反 応中の TLC (クロ口ホルム： メタノール =3:1)では生成物は 1スポッ卜であつ たが、 反応を停止すると 2スポットに分かれた。 溶媒を減圧留去後、 シリカゲ ルクロマトグラフィー （クロ口ホルム： メタノール =10:1)で単離し、 化合物 6 (1.02g, 7.38mmol, 72%)を得た。
1H NMR (400MHz, CDCI3) δ [ppm] 7.35-7.26 (4H m, aromatic protons), 4 ■ 65 (4H s, -CH2-) 13C NMR (100MHz, CDCI3) ά [ppm] ： 141.18, 128.73, 126.22, 125.52, 65.10 Mass (FAB) m/z： 139 ( [M++H] ) ， 277, 231, 185, 121, 93， 57.
HRMS (FAB) Calcd for
Figure imgf000048_0001
Found 139.07591.
Anal. Calcd for C8H1002： C， 69.54； H， 7.30. Found： C， 69.75； H， 7.32.
[0101] (化合物 7 ： 1- (4,4' -d i methoxyt r i ty I oxy) methy I -2-hydroxymethy I benze neの製造例）
予め真空乾燥させておいた化合物 (6) (0.5g, 3.62mmol) を pyridine (18mL )に溶解し、 DMAP (22.1mg, 0.18mmol, 0.05eq) と 4, 4' -Dimethoxytr ity I c hloride (1.23g, 3.62隱 ol， 1eq)を加え、 Ar雰囲気下で 25時間攪拌した。 TL C (へキサン：酢酸ェチル =1:1)により原料の消失を確認した。 酢酸ェチルと 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で抽出し、 有機層を sat NaCI aqで洗浄、 無水 Na2S04を加え乾燥させた。 溶媒を減圧留去後、 シリカゲルクロマトグラフィー (へキサン：酢酸ェチル =4:1)で単離し、 化合物（7) (1.44g, 3.27隱 ol， 90% )を得た。
1H NMR (400MHz, CDCI3) d [ppm] ： 7.50-6.67 (17H, m, DMTr and aromatic p rotons) , 4.44 ， 4.42 , and 4.18
(4H， d， J=8.0
Hz, s, -CH2-0-) ， 3.79 (6H， s, H-methoxy)
13C NMR (100MHz, CDCI3) ά [ppm] ： 158.59, 144.50, 140.46, 136.40, 135.71 ， 129.93, 129.75, 129.52, 128.55, 128.07, 127.91, 126.92, 113.35, 87. 55， 65.22, 63.59, 55.22
Mass (El) m/z： 440 (M+)， 303， 273， 227， 135.
HRMS (El) Calcd for C29H2804440.19876
Found 440.19908.
Anal. Calcd for C29H2804■ 1/5H20： C， 78.27；
H， 6.45. Found： C， 78.24； H， 6.61.
[0102] (化合物 8 ： 1- (4,4， -dimethoxytr ity I oxy) methy I -2-0- [ (2-cyanoethy I ) - (N, N-d i i sopropy I ) ] -phosphoam i d i cmethy I -hydroxymethy I benzeneの製造例
)
予め真空乾燥させておいた化合物 (7) (0.35g, 0.80mmol) を無水 THF (8mL ) に溶解し、 DIPEA (0.4mし 4. OOmmo I， 5eq)と亜リン酸化試薬 (0.29mし 1■ 60 mmol, 2eq)を加え、 Ar雰囲気下で 0.5時間攪拌した。 TLC (酢酸ェチルのみ） により原料の消失を確認した。 酢酸ェチルと sat NaHC03aqで抽出し、 有機層を sat NaCI aqで洗浄、 無水 Na2S04を加え乾燥させた。 溶媒を減圧留去後、 中性 シリカゲルクロマトグラフィー (CHCI3:acetone=1:1)で単離し、 化合物 (8) (0 .50g, 0.78隱 ol， 98%)を得た。
32P NMR (162MHz, CDCI3) ά [ppm] ： 148.95, 148.92, 148.46, 147.27
Mass (FAB) m/z： 641 ( [M++H] ) ， 303， 289， 219, 201, 154, 136, 107, 8
9.
HRMS (FAB) Calcd for C38H46N205P
641.31443 Found 641.31272.
(化合物 9、 化合物 1 0 ： フタル酸誘導体の CPG樹脂の製造例）
化合物 7 (0.50g， 1.13mmol) をピリジン (11.3mL)に溶解し、 そこに DMAP (2 .8mg, 0.023mmo 1 , 0.02eq) と無水コハク酸 (339mg, 3.39mmo 1 , 3eq)を加え A r雰囲気下で攪拌した。 24時間攪拌した後、 TLC (Hex:EtOAc=3:1)により反応 の進行を確認し、 EtOAcと sat NaHC03 aqで抽出し、 有機層を sat NaCI aqで洗 浄、 無水 Na2S04を加え乾燥させた。 溶媒を減圧留去後、 真空乾燥させた。 この 濃縮物（化合物 9) (0.40g， 0.74mmol, 81ο/0)に dry DMF (10mL)を加え溶解さ せ、 CPG (500mg, 0.11mmol) を加え 30分間静置して反応液となじませた。 そ の後、 WSC (65mg, 0.34mmol, 4.9eq)を加え室温で一日振とうさせた。 後処 理として、 pyr idineで ¾£浄した後に 0.1M DMAP in pyr id ine: acetic
anhydride (9:1)溶液 （6mL) を加え、 16時間振とうさせた。 このものを MeOH 、 acetoneで洗浄し乾燥させ活性を測定した。 化合物（10) の活性は 86.63 mo l/gであった。 [0104] (実施例 3 ： 3' 末端ダングリングエンドの合成のためのナフタレンジカル ボン酸ジメチル誘導体の合成）
本実施例では、 以下のスキーム I I Iに示す化合物 1 1〜化合物 1 5を合成した 。 すなわち、 2,3-ナフタレンジカルボン酸ジメチルを還元し 11を収率 88%で 得て、 続いて DMTr化を行い化合物 12を収率 730/0で得た。 DMTr体 12をアミダイ 卜化して化合物 13を 59%の収率で得た。 また、 DMTr体 12をスクシニル化し、 C PG樹脂と結合させ、 化合物 15を 41.3 mol/gの活性で得た。 化合物 1 1〜 1 5 の製造例を以下に示す。
[化 24]
Figure imgf000050_0001
41.3 μ mol/g
スキーム 3
[0105] (化合物 1 1 ： 2, 3-bis-hydroxymethyl naphthaleneの製造例)
2, 3-ナフタレンジカルボン酸ジメチル (0.20 g， 0.87mmol) に Ar雰囲気下、 無 水 THF (4.4mし 0.2M solution) を加え、 水素化ホウ素リチウム (0.95g， 4. 35mmol, 5eq)を加えた。 18時間攪拌した後、 氷浴で酢酸を数滴加えて反応液 を中性にし、 反応を停止した。 しばらく攪拌した後、 析出した結晶をメタノ ールで溶解した。 反応中の TLC (へキサン：酢酸ェチル =1:1)では生成物は 1 スポッ卜であつたが、 反応を停止すると 2スポッ卜に分かれた。 溶媒を減圧留 去後、 シリカゲルクロマトグラフィー （Hex:Et0Ac=1:1)で単離し、 化合物（11 ) (0.14g, 0.77mmol, 88%)を得た。
1H NMR (400MHz, CDCI3) δ [ppm] ： 7.85-7.26 (6H， m, aromatic protons) , 4. 93 (4H， s, -CH2-) , 1.57 (2H， s, OH)
13C NMR (100MHz, CDCI3) ά [ppm] ： 136.94, 133.12, 128.86, 127.69, 126.53 ， 64.67
Mass (El) m/z： 188 (M+)， 170, 141, 115.
HRMS (El) Calcd for C12H1202188.08373
Found 188.08281.
Anal. Calcd for C12H1202:
C， 76.57； H， 6.43. Found : C， 76.42； H， 6.61.
[0106] (化合物 1 2 ： 2- (4,4， -dimethoxytr ityloxy) methy I -3-hydroxymethy I nap hthaleneの製造例）
予め真空乾燥させておいた化合物（11) (0.5g， 3.62mmol) をピリジン
(5.3mL)に溶解し、 DMAP (6.5mg, 0.05隱 ol， 0.05eq) と 4, 4' -ジメ トキシ トリチルクロライド (0.36g， 1.06mmol, 1eq)を加え、 Ar雰囲気下で 22時間攪 拌した。 TLC (へキサン：酢酸ェチル =3:1)により原料の消失を確認した。 酢 酸ェチルと sat NaHC03
aqで抽出し、 有機層を sat NaCI aqで洗浄、 無水 Na2S04を加え乾燥させた。 溶 媒を減圧留去後、 シリカゲルクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチル = 4 :1〜1:1)で単離し、 化合物（12) (0.38g, 0.77mmol, 73%)を得た。
1H NMR (400MHz, CDCI3) d [ppm] ： 7.77-6.78 (19H, m, DMTr and aromatic p rotons)， 4.52 and , 4.31 , 4.28
(4H， s and d， J=12.0 Hz, -CH2-0-) ， 3.72 (6H， s, H-methoxy) , 1.51 (2H， s， OH)
Mass (El) m/z： 490 (M+)， 303， 273, 227, 141.
HRMS (El) Calcd for C33H3004490.21441
Found 490.21482.
[0107] (化合物 1 3 ： 2- (4,4， -dimethoxytr ityloxy) methy I -3-0- [ (2-cyanoethy I ) - (N, N-d i i sopropy I ) ] -phosphoam i d i cmethy I -hydroxymethy I naphta I eneの 製造例）
予め真空乾燥させておいた化合物 (12) (0.38g, 0.78隱 ol) を dry THF (7.8m L)に溶解し、 DIPEA
(0.39mし 3.9mmol, 5eq)と亜リン酸化試薬 (0.29mし 1.56mmol, 2eq)を加え 、 Ar雰囲気下で 1.5時間攪拌した。 TLC (酢酸ェチルのみ） により原料の消失 を確認した。 EtOAcと sat NaHC03 aqで抽出し、 有機層を sat NaCI aqで洗浄、 無水硫酸ナトリウムを加え乾燥させた。 溶媒を減圧留去後、 中性シリカゲル クロマトグラフィー （へキサン；酢酸ェチル =1:1)で単離し、 化合物 (13) (0. 41 g, 0.59mmol, 75%)を得た。
32P NMR (162MHz, CDCI3) ά [ppm] ： 149.1, 148.6
Mass (FAB) m/z： 691 ( [M++H] ) ， 303， 201, 154.
HRMS (FAB) Calcd for C42H48N205P
691.33008 Found 691.32774.
(化合物 1 4、 1 5 ：ナフタレンジカルボン酸ジメチル誘導体の CPG樹脂の製 造例）
化合物（12) (0.40g， 0.82mmmol)を pyridine(8.2mL)に溶解し、 そこに DMAP (2 .Omg, 0.016隱 ol， 0.02eq) と無水コハク酸 (251mg, 2.46mmo 1 , 3eq)を加え A r雰囲気下で攪拌した。 24時間攪拌した後、 TLC (クロ口ホルム： メタノール = 15:1)により反応の進行を確認し、 EtOAcと sat NaHC03aqで抽出し、 有機層を sat NaCI aqで洗浄、 無水 Na2S04を加え乾燥させた。 溶媒を減圧留去後、 真空 乾燥させた。 この濃縮物（化合物 14) (0.41 g, 0.69隱 ol， 85o/0)に dry DMF (8 .5mL)を加え溶解させ、 CPG (640mg, 0.085mmol)を加え 30分間静置して反応 液となじませた。 その後、 WSC (80.8mg, 0.42mmol, 4.9eq)を加え室温で一 曰振とうさせた。 後処理として、 ピリジンで洗浄した後に 0.1M DMAP in pyri dine:無水酢酸 （9:1)溶液 （6mL) を加え、 16時間振とうさせた。 このものを メタノール、 アセトンで洗浄し乾燥させ活性を測定した。 化合物（15) の活 性は 41.29 mo l/gであった。 実施例 4
[0109] (3' 末端ダングリングエンドの合成のためのピリジンカルボン酸ジメチル 誘導体の合成）
本実施例では、 以下のスキーム IVに示す化合物 1 6〜20を合成した。 す なわち、 2, 6-ピリジンカルボン酸ジメチルを還元し 16を収率 28%で得て、 続 いて DMTr化を行い、 化合物 17を収率 430/0で得た。 DMTr体 17をアミダイ卜化し て化合物 18を 93%の収率で得た。 また、 DMTr体 17をスクシニル化し、 CPG樹脂 と結合させ、 化合物 20を 73.9 mol/gの活性で得た。 化合物 1 6〜20の製造 例を以下に示す。
[化 25]
Figure imgf000053_0001
スキーム 4
[0110] (化合物 1 6 ： 2, 6-bis-hydroxymethylpyridineの製造例）
2,6ピリジンカルボン酸ジメチル （2.00 g， 10.25mmol) に Ar雰囲気下、 無水 T HF (51.3mし 0.2M solution) を加え、 水素化ホウ素リチウム（1.16g， 51.3m mol, 5eq)を加えた。 16時間攪拌した後、 氷浴で酢酸を数滴加えて反応液を中 性にし、 反応を停止した。 しばらく攪拌した後、 析出した結晶をメタノール で溶解した。 反応中の TLC (クロ口ホルム： メタノール =3:1)では生成物は 1 スポッ卜であつたが、 反応を停止すると 2スポッ卜に分かれた。 溶媒を減圧留 去後、 シリカゲルクロマトグラフィー （クロ口ホルム： メタノール =10:1~3:1
)で単離し、 化合物（16) (0.40g, 2.88mmol, 28%)を得た。
1H NMR (400MHz, CDCI3) δ [ppm] ： 7.72-7.00 (3H， m, aromatic protons), 4
.79
(4H， s, -CH2-)
13C NMR (100MHz, CDCI3) ά [ppm] ： 158.37, 137.44, 119.12, 64.33
Mass (FAB) m/z： 140 ( [M++H] ) ， 277, 185, 93， 57.
HRMS (FAB) Calcd for C7H10N02
140.07115 Found 140.07054.
Anal. Calcd for C7H10N02:
C， 60.42； H， 6.52; N， 10.07. Found : C， 60.28； H， 6.50; N， 9.95.
(化合物 1 7 ： 2- (4,4' -d i methoxyt r i ty I oxy) methy I -6-hydroxymethy I pyr idineの製造例）
予め真空乾燥させておいた化合物 （16) (0.5g， 3.60mmol) をピリジン
(18mL)に溶解し、 DMAP (22.1mg, 0.18mmol, 0.05eq) と 4, 4' -ジメ トキシ トリチルクロライド （1.22g， 3.60mmol, 1eq)を加え、 Ar雰囲気下で 16時間攪 拌した。 TLC (Hex:Et0Ac=1:1)により原料の消失を確認した。 酢酸ェチルと s at NaHC03 aqで抽出し、 有機層を sat NaCI aqで洗浄、 無水 Na2S04を加え乾燥さ せた。 溶媒を減圧留去後、 シリカゲルクロマトグラフィー （へキサン：酢酸 ェチル =4:1〜3:1)で単離し、 化合物（17) (0.27g, 0.61mmol, 43%)を得た
1H NMR (400MHz, CDCI3) d [ppm] ： 7.76-6.82 (16H, m, DMTr and aromatic p rotons)， 4.69 and 4.34 (4H， s, -CH2-0-) ， 3.79 (6H， s, H-methoxy)， 1 ■ 58 (2H， s, OH)
13C NMR (100MHz, CDCI3) ά [ppm] ： 158.51, 158.38, 157.59, 144.77, 137.27 ， 135.93, 130.01, 128.07, 127.89, 126.85, 119.35, 118.56, 113.18, 86. 67， 66.56, 63.62, 55.20
Mass (FAB) m/z： 442 ( [M++H] ) ， 303， 277, 185, 93， 57. HRMS (FAB) Calcd for C28H28N04
442.20183 Found 442.20332.
[0112] (化合物 1 8 ： 2- (4,4， -dimethoxytr ityloxy) methy I -6-0- [ (2-cyanoethy I ) - (N, N-d i i sopropy I ) ] -phosphoam i d i cmethy I -hydroxymethy I benzeneの製造 例）
予め真空乾燥させておいた化合物（17) (0.20g， 0.45隱 ol) を無水 THF (4.5m L)に溶解し、 DIPEA
(0.23mし 2.25mmol, 5eq)と亜リン酸化試薬 （0.16mし 0.90mmol, 2eq)を加 え、 Ar雰囲気下で 1時間攪拌した。 TLC (酢酸ェチルのみ） により原料の消失 を確認した。 酢酸ェチルと sat NaHC03aqで抽出し、 有機層を sat NaCI aqで洗 浄、 無水硫酸ナトリウムを加え乾燥させた。 溶媒を減圧留去後、 中性シリカ ゲルクロマトグラフィー （酢酸ェチルのみ） で単離し、 化合物 (18) (0.27g, 0.42mmol, 93%)を得た。
32P NMR (162MHz, CDCI3) ά [ppm] : 149.1
Mass (FAB) m/z： 642 ( [M++H] ) ， 303， 219, 201, 154, 136, 91, 73, 55
HRMS (FAB) Calcd for C37H45N305P
642.30968 Found 642.31160.
[0113] (化合物 1 9、 20 ： ピリジンカルボン酸ジメチル誘導体の CPG樹脂の製造例
)
化合物 (17) (0.20g, 0.45mmmo I )をピリジン (4.5mL)に溶解し、 そこに DMAP (1 .1mg, 0.009隱 ol， 0.02eq) と無水コハク酸 (136mg, 1.36mmo 1 , 3eq)を加え A r雰囲気下で攪拌した。 17時間攪拌した後、 TLC (へキサン：酢酸ェチル =1:1 )により反応の進行を確認し、 酢酸ェチルと sat NaHC03 aqで抽出し、 有機層を sat NaCI aqで洗浄、 無水硫酸ナトリウムを加え乾燥させた。 溶媒を減圧留去 後、 真空乾燥させた。 この濃縮物（19) (0.16g, 0.30隱 ol， 66%)に dry DMF
(7.5mL)を加え溶解させ、 CPG (338mg, 0.075mmol)を加え 30分間静置して反 応液となじませた。 その後、 WSC (71mg, 0.37mmol, 4.9eq)を加え室温で一 曰振とうさせた。 後処理として、 ピリジンで洗浄した後に 0. 1M
DMAP ピリジン溶液：無水酢酸 （9 : 1 )溶液 （6mL) を加え、 16時間振とうさせ た。 このものをメタノール、 アセトンで洗浄し乾燥させ活性を測定した。 化 合物（20) の活性は 73. 94 mo l /gであった。
実施例 5
[0114] (実施例 5 ：化学修飾ダングリングを有する自己相補鎖型 D N Aの合成）
3' 末端を化学修飾したダングリングェンドを有する短鎖 DNAを固相ホスホ 口アミダイ卜法に従って核酸自動合成機によって合成した。 以下に合成した オリゴヌクレオチドの配列を示す。 なお、 合成と精製は次のようにして行つ
[01 15] (オリゴヌクレオチドの合成と精製）
オリゴヌクレオチドの合成は核酸自動合成機によるホスホロアミダイ卜法に 従った。 各オリゴヌクレオチドの合成の際、 各アミダイ卜は 0. 1 Mのァセトニ トリル溶液に調整し、 合成した各 CPG担体を用いた。 それぞれの樹脂を各々の 活性に基づき 1 mo l分をカラムに量り取り、 核酸自動合成機にセッ卜した。 縮合時間は 5分とし、 DMTr基を除去した状態で合成を終了した。 合成終了後、 CPG樹脂に結合したォリゴヌクレオチドを DNAに関しては 28% NH3水溶液を 2mL 加え 55°Cで 12時間インキュベートし、 樹脂からの切り出し及び脱保護を行つ た。 反応後のろ液をエツペンドルフチューブに移し、 減圧下乾固した。 残渣 に I oad i ng so l ut i on (1 x TBE
i n 90% formam i de) 100 Lを加え 20% PAGE*1により（600V, 20mA) 目的のォ リゴヌクレオチドを単離した。 目的のォリゴヌクレオチドを切リ出し 0. 1 M TE M buffer*2、 1mM EDTA*3水溶液 20mLを加え、 12時間振とうした。 このろ液を C H3CN 10mし 0. 1 M TEAA buffer 10mLを流して平衡化した C-18逆相カラム (Sep-P ak)に通し、 カラムに吸着させた。 ここでカラムを滅菌水で洗浄して塩を取り 除き 50% CH3CN i n H20 3mLで溶出し、 減圧下乾固した。 オリゴヌクレオチド は H20 1mLに溶解し、 このものの希釈液の 260 nmにおける吸光度を測定し、 そ の収量を求めた *6。 また、 MALm-TOF/MSにより同定を行った。 なお、 核酸自動 合成機は、 Appl ied Biosystems、 Nucleic Acid Synthesis System Expedite 8909 systemを使用した。 ヌクレオチド- CPG、 各種アミダイ卜、 キヤッピン グ溶液及び酸化溶液は GLEN RESEARCH社より購入した。 ァセトニトリルは LAB- SCAN社より購入した。
*1 40% アクリルアミド (19:1)溶液*44501し 尿素 37.8g、 10xTBE buffer*59m Lを加えて溶解し、 水を加えて 90mLとした。 最後に APS 62mgを加えて溶解した 後、 TEMED 45 Lを加えて振り混ぜ、 1.5mmスぺーサーを挟んで固定した 2枚の ガラス板の間に流し込み、 1時間以上静置して固化させた。 1 xTBE bufferを 泳動用緩衝液として用いた。
*2 2N TEAA buffer (卜リェチルァミン 277.6mLを水に溶解させ、 酢酸で pH 7.
0に調整し 1Lとしたもの） を 20倍に希釈して使用した。
*30.1M EDTA水溶液 (EDTA■ 4Na
1.81gを水で 40mLに調整したもの）を 100倍に希釈した。
*4 アクリルアミド 190g、 Ν,Ν-ビスアクリルアミド、10gを水に溶解して 500mLに することで調整した。
*5Tris 109g、 ホウ酸 55g、 EDTA - 2Na 7.43 gを水に溶解して 1Lにすることで調 整した。
*601180^0|60 (16は水溶液とし、 波長 260での吸光度 （Abs260)が、 吸光度計の 有効範囲になるように希釈した。 光路長 （I) 1cmの吸光度測定用石英セルを 用い、 室温にて Abs26()を測定した。 0D26()値の計算には以下の式を用いた。 ここ で Vは溶液の全量を示す。
0D260 (Μ -1 ■ mL-1■ cm-1) = Abs26。 (Μ "1) ■ 1 (mL) ■ I
_1 (cm)
また、 Ν,ρ N2p N3p■ ■ ■ Nn_，p Nnで表される一本鎖 ol igonucleotideのモル吸光 係数 26Qの算出には次式を用いた。
ε= 2 {ε (Ν1Ρ Ν2ρ) +ε (Ν2ρ Ν3ρ)+ · ■ · +ε (Νη_ιΡ Νη) } - {ε (Ν2) +ε ( Ν3) +■ ■ ■ +
ε (Νη_，) } ここで e (Nn) はある核酸 Nnの e 260を示し、 e (Nn_lP Nn) はある核酸二量体 Nn P Nnの e26()を示す。 また、 濃度 C (mol/L)の算出は次式を用いた。
C = Abs260 ■ ε 26ο"1 ■ I "1
[0117] [化 26]
① ： 5'-d(GCGCGC 1)-3' ⑤ ： 5'-d(GCGCGC Π)-3'
② ： 5'- dfGCGCGC Ph)-3' ⑥ ： 5'- d(GCGCGC PhPh)-3'
③ ： 5'- d(GCGCGC Ν)-3' ⑦ ： 5'- d(GCGCGC腦 -3'
④： 5'- diGCGCGC Ρ )-3' ⑧ ： 5'- d(GCGCGC ΡνΡν)-3'
Figure imgf000058_0001
Ph N
[0118] 合成した各種 DNAオリゴヌクレオチドにっき、 円偏光二色性 （CD) ス ぺクトルを JASCO J-600を用いて測定した結果を図 2及び 3に示す。 なお、 ォ リゴヌクレオチドの CD spectra測定におけるそれぞれの鎖の濃度は 10 Mとし た。 測定用緩衝液 （10mM NaH2P04-Na2HP04
(pH 7.0)， 1mM NaCI) 400 Lに溶解し、 95°Cで 3分間過熱後、 1時間放置し 常温に戻した。 そのサンプルのうち 400 Lを専用セルに入れ、 室温にて測定 を行なった。
[0119] 図 2及び図 3に示すように、 各 DN Aの波形はコントロール （天然二本鎖 DNA) とほぼ同じであり、 ダングリングエンドを 1個又は 2個導入しても 、 各 DN Aは二本鎖を形成していると考えられた。
[0120] また、 各 DN Aについて、 3' 末端の化学修飾による熱力学的安定性を検討 するために Markyと Bleslaurの手法に従い、 van' t Hoff トランジシヨンェン タルピー （AH°) 、 エントロピー （AS°) 、 310Kにおける自由エネルギー （厶 G") を算出した。 本実施例では、 二本鎖の形成と解離の平衡がオリゴヌクレオ チドの総濃度に依存的に変化することを利用した方法を用いた。 オリゴヌク レオチドの濃度を数段階に分けて Tmを測定し、 式（1 )に基づいて 1/Tm対 ln(Ct/4 ) (Ctはオリゴヌクレオチド総濃度)のグラフを描き、 その傾きと切片から と AS。を算出した。 そして後述する式 （2) から AG。を求めた。 すなわち、 DN Aオリゴヌクレオチド （1) 〜（8)を用いて自己相補鎖を組み、 3 M,5 M,7 M , 10 M, 16 Mになるように測定用緩衝液 (10mM NaH2P04-Na2HP04(pH7.0) , 1mM NaCI) 400 Lに溶解し、 95°Cで 3分間過熱後、 1時間放置し常温に戻した。 そ のサンプルのうち 350 Lを専用セルに入れ、 25°Cから 95°Cへと加熱 （A0.5°C /min)して吸光度の変化を測定することで 50%融解温度 (Tm) を求めた。 そして 、 式（1 )を用いて熱力学的パラメーターを算出した。 結果を表 1に示す。
1/Tm = (R /AH°) In (Ct/n) +
(△S° /AH°) ■ ■ ■ (2)
△ H。 = R / slope
△ S。 = AH。x intercept
△ G。 = 厶 H。- TAS。
R：気体定数 （1.987 cal / kcal) 、 Ct：一本鎖核酸の全濃度、
n： 自己相補鎖の場合は 1、 非自己相補鎖の場合は 4となる定数、 本実施例では
4とした。
なお、 AG。は標準状態において 1molの一本鎖が 1molの二本鎖になる場合、 あ る温度における反応の平衡状態から熱力学的エネルギーとしてどの程度へだ つているかを示すものであり、 この値から二本鎖の熱力学的安定性を評価す ることができる。 この値の一符号は一本鎖状態よリも二本鎖状態が安定であ ることを表しており、 この絶対値が大きいほど二本鎖の状態が安定であるこ とを示している。 また、 ΔΗ。は標準状態において 1molの一本鎖が 1molの二本鎖 になるときの熱エネルギー収支の変化を表しておリ、 一の符号は発熱反応を 表し、 この絶対値が大きいほど二本鎖が熱エネルギー的に安定であることを 示している。 AS。は標準状態において 1molの一本鎖が 1molの二本鎖になるとき の乱雑さの変化を表しておリ、 一符号はよリ秩序のない状態に向かうことを 示すものであり、 この絶対値が小さいほど二本鎖形成に有利であることを示 す。 そして AG。と AH°、 AS。との関係は式（2)で表される。
△ G。 = ΔΗ°
- TAS° ■ ■ ■ (2)
すなわち、 二本鎖の熱力学的安定性は反応の熱エネルギー収支と乱雑さの変 化によって決まる。
[0122] [表 1]
5' -d(GCGCGGX)- 3 5， -d(GCGCGGXX)- 3 3， -d(XCGCGCG)- 5' 3， -d(XXCGCGCG)- 5'
Figure imgf000060_0001
Buffer： 10mM NaH2P04-Na2HP04 (pH7.0) , 1M NaCI
[0123] 表 1に示すように、 Tm値はダングリングエンドを導入することによりいず れも増加し、 熱的に安定化されていることがわかる。 また、 二本鎖形成能の 指標となる自由エネルギー変化 （AG°) の値も負に増加しており、 ダングリン グエンドを導入することで二本鎖は安定化されていることが示唆された。 し かし、 ダングリングェンドを一つ導入したものと二つ導入したものの自由ェ ネルギー変化 （AG°) を比較すると、 ベンゼン環である 1,3-ビスハイドロキシ ベンゼンおよび 1,2-ビスハイドロキシベンゼンを有する DNAは共にダングリン グェンドの数が増えると安定化しているが、 ピリジンやナフタレンを有する D NAはダングリングエンドを二つ導入したものよりも一つだけ導入したものの 方が安定である。 これは、 水素結合能や London分散力などの二重らせん構造 の安定化の指標となるェンタルピー変化 （ΔΗ°) が、 ベンゼン環を導入した場 合ダングリングェンドの数が多い方が増加しておリニ本鎖形成に有利に働い ている一方、 ピリジンゃナフタレンはダングリングェンドが増えることでェ ンタルピー変化 （ΔΗ°) が減少し二本鎖形成に不利であるためだと考えられる 実施例 6
[0124] (化学修飾ダングリングを有する自己相補鎖型 RN Αの合成）
次に、 3' 末端ダングリングエンドを有する RNAオリゴヌクレオチドを固相ホ スホロアミダイ卜法に従って核酸自動合成機によって合成した。 なお、 核酸 の固相合成は、 以下に記載する以外は、 実施例 5に準じて行い、 合成したォ リゴヌクレオチドを確認した。
[0125] RNAの固相合成に関しては CPG樹脂に結合したォリゴヌクレオチドを EtOH: N H3=3:1水溶液 2mLを加えて室温で 12時間振とうして樹脂からの切り出し及び脱 保護を行った。 また、 縮合時間は 15分とした。 反応後のろ液をエツペンドル フチューブに移し、 減圧下で乾固した。 残渣に 1M TBAF in THF溶液 1mLを加え 、 12時間振とうした。 この反応液を 0.1M TEMbufferで希釈して 30mLとした。 この反応液を平衡化した C-18逆相カラム (S印- Pak)に通し、 力ラムに吸着させ た。 ここでカラムを滅菌水で洗浄して塩を取り除き 50% CH3CN in H203mLで 溶出し、 減圧下乾固した。 残渣に loading solution (1 xTBE
in 90% formamide) 100 Lを加え 20% PAGEにより（600V, 20mA) 目的のオリ ゴヌクレオチドを単離した。 目的のォリゴヌクレオチドを切リ出し 0.1M TEAA buffer. 1mM EDTA水溶液 20mLを加え、 12時間振とうした。 このろ液を平衡化 した C-18逆相カラム (Sep-Pak)に通し、 カラムに吸着させた。 ここでカラムを 滅菌水で洗浄して塩を取り除き 50% CH3CN in H20 3mLで溶出し、 減圧下乾固 した。 以下に合成したオリゴヌクレオチドの配列を示す。 [化 27]
⑨： 5'-r(gcgcgc II) -3'
⑩： 5'-r(gcgcgc PhPh)-3'
⑪： 5'-r(gcgcgc腦 -3'
@： 5'-r(gcgcgc PyPy)-3'
Figure imgf000062_0001
Ph N
[0126] 合成した各種 RNAオリゴヌクレオチドにっき、 CDスペクトルを測定し た。 結果を図 4に示す。 CDスペクトルの測定は、 短鎖 RN A濃度を 20 Mと する以外は実施例 5に準じた。
[0127] 図 4に示すように、 各 RN Aの波形はコントロール （天然二本鎖 RNA) とほぼ同じであり、 ダングリングエンドを 1個又は 2個導入しても、 各 RN Aは二本鎖を形成していると考えられた。
[0128] また、 実施例 5と同様にして、 合成した RNAオリゴヌクレオチドについ て自己相補鎖を組み、 3 M, 5 M, 7 M, 10 M, 16 Mで 50%融解温度 Tmを測定し 、 熱力学的パラメーターを算出した。 結果を表 2に示す。
[表 2]
， 5， -r(gcgcgcXX)- 3
3 -r(XXcgcgcg)- 5
Figure imgf000063_0001
Buffer： 10m NaH2P04-Na2HP04 (pH7.0)， 1M NaCI 表 2に示すように、 Tm値はダングリングェンドを導入することによりいず れも増加し、 熱的に安定化されていることがわかる。 しかし、 DNAの場合と比 較すると安定化の度合いがかなり小さい。 また、 二本鎖形成能の指標となる 自由エネルギー変化 （AG°) の値は負に増加しているのと正に増加しているも のがあり、 RNAにおいてはダングリングェンドを導入することで必ずしも二本 鎖は安定化されないことが示唆された。 自由エネルギー変化 （AG°) を比較す ると、 ェンタルピー変化 （ΔΗ°) が増加しているフタル酸およびピリジンを有 する RNAは安定化しているが、 ェンタルピー変化 （ΔΗ°) が減少しているナフ タレンを有する RNAは不安定化していた。
(化学修飾ダングリングエンドを有する s i RNAの合成）
次に、 3' 末端ダングリングエンドを有する siRNAを固相ホスホロアミダイ 卜法に従って核酸自動合成機によって合成した。 以下に合成したオリゴヌク レオチドの配列を示す。 なお、 s i RNAは、 Reni l la Lusiferaseの c D N A配列に基づいて設計した。
⑬⑮⑰⑲
[化 28]
Renilla antisense Renilla sense 5 ' -r (guaggaguag gaaaggcc II) -3' ® 5'-r(ggccuuucacuacuccuac Π)-3' 5 ' -r (guaggaguagugaaaggcc PyPy)-3' © 5'-r(ggccuu cacuacuccuac PyPy)-3 5 ' -r (guaggaguagugaaaggcc TT I)-3' @ 5'-r(ggccuuucacuacuccuac TT I)-3' 5 ' -r (guaggaguagugaaaggcc TTPy)-3 ® 5'-r(ggccuuucacuacuccuac TTPy)-3'
Figure imgf000064_0001
I Py
[0131 ] 3' 末端ダングリングエンドを導入した s i RNA二本鎖オリゴヌクレオチド （ 合成した s i RNA各鎖を相補鎖とアニーリングして二本鎖 （ （13) と （14) 、 ( 15)と （16) 、 （17)と （18) 、 （19)と （20) ) を組見合わせた） の構造を CD スぺクトルで確認した。 結果を図 5に示す。 なお、 C Dスぺクトルの測定は 、 s i RNAの測定濃度を 3 Mとする以外は実施例 5に準じた。
[0132] 次に、 合成した s i RNA各鎖を相補鎖とアニーリングして二本鎖 （ （13) と （ 14) 、 （15)と （16) 、 （17)と （18) 、 （19)と （20) ) を組み、 実施例 5に 準じて各 s i RNA二本鎖の熱的安定性を 50%融解温度 Tmを測定し、 比較した。 結 果を表 3に示す。
[表 3]
Renilla antisense Renilla antisense
5 - guaggaguagugaaaggccTTX)- 3 5' - guaggaguagugaaaggccYY)- 3 3 - r(X Τ cauccucaucacuuuccgg)- 5 3 -r(YY cauccucaucacuuuccgg)- 5' Reniiia sense Renilla sense
Figure imgf000064_0002
Buffer： 10mM NaH 2P04-Na2HP04 (pH7.0) , 100mM NaCI [0133] 表 3右側に示すように、 ダングリングエンドを直接化学修飾 （TTを置換） すると Tmは減少したが、 表 3左側に示すように、 チミジル酸二量体に対して 付加的に化学修飾することで T mが改善された。
実施例 8
[0134] (Dual Luc iferase Assayによる 3' 末端化学修飾 si RNAのタンパク発現抑制効 果の評価）
本実施例では、 合成した 3' 末端化学修飾 Reni l la
siRNAのタンパク発現抑制効果を評価するために 0.1,0.5, 1,5, 10nMの濃度で Lu c Assayを行なった。 操作は以下のようにして行った。
[0135] (Luc Assay)
HeLa細胞を 4000 cel l / mLになるように調整し、 96 wel l plateの各 wel lに 100 Lずつ入れ 24時間培養した。 合成した siRNAのそれぞれの鎖を TE buffer dOOmM NaCI) に溶解し、 95°Cで 3分間過熱後、 1時間放置し常温に戻した。 この siRNA各量、 培地 （OPT卜 MEM)各量、 0.2 g/ L
psi -CHECK (Fire fly. Reni I la各々の seqenceを持つベクター） 1 し transf ast (トランスフエクション試薬） 3 Lを総量 350 Lになるように混合し、 培地を吸い出した 96 wel l plateの各 wel lに 35 Lずつ入れ、 1時間後培地を 1 00 L加えて 24時間培養した。 lysis bufferを各 we 11に 100 Lずつ加え振とう した。 発光測定用の 96 wel l p lateにサンプル 24 Lを移し、 Dual glo subst rate
(Fire flyの基質） 24 Lを加え 10分放置後、 Fire fly
I uc if eraseを測定した。 その後、 Stop and glo substrate 24// Lを加え 10分 放置後、 Reni I la
luciferaseを測疋した e Ren i l ia luciferaseの値 ¾rFire fly luciferaseの値 で割り、 ％ of controlを用いて比較した。 なお、 luciferase測定には、 Lumi nescenser JNRI Iを使用した。 なお、 siRNAをトランスフエクシヨンしていな い状態をコントロールとし 100%とした。 結果を図 6に示す。
[0136] 図 6に示すように、 Dual Luciferase Assayの結果、 今回合成した siRNAは いずれも低濃度で norma I typeの si RNAよりも活性を示すことが分かった。 実施例 9
[0137] (3' 末端化学修飾 si RNAのヌクレアーゼ抵抗性の評価）
3' 末端化学修飾 si RNAが normal si RNAと同等、 もしくはそれ以上の活性が得 られたことから、 ェキソヌクレアーゼの 1つである蛇毒ホスホジエステラーゼ (snake venom phosphodiesterase (SVP) ) を用しゝて、 ェキソヌクレア一 ゼ耐性について検討した。 SVPはリン酸ジエステル結合を選択的に切断する酵 素で、 オリゴヌクレオチドを 5' -モノリン酸ヌクレオチドに分解する。 操作 は、 以下のようにして行った。
[0138] (SVPによる分解）
単鎖状態でのェキソヌクレアーゼ抵抗性 （SVP耐性） の測定にあたっては 氷冷下、 20 Mのオリゴヌクレオチドを 4 し SVP 0.3u/mLを 10 し 緩衝液 (250 mM Tris-HCI, 50mM MgCI2(pH7.0)) を 6 L加え、 全量で 40 Lとなるよ うに滅菌水で調節した。 37°Cでインキュベートし、 1、 3、 5、 10、 30、 60分お きにあらかじめ別のマイクロチューブに分注しておいた loading
solution (8M urea XC BPB) 5 L中に、 反応液を 5 L加え、 各時間の反応溶 液とした。 なお、 0分のサンプルは酵素を加えていないものとした。 二本鎖状 態での SVP耐性の測定にあたっては氷冷下、 20 Mのアンチセンスオリゴヌク レオチドを 4 し SVP 0.3u/mLを 10 し 緩衝液 （250 mM Tris-HCI, 50mM MgCI2(pH
7.0)) を 6 L加え、 等量のセンスオリゴヌクレオチドを加え、 全量で 40 しと なるように滅菌水で調節した。 37°Cでインキュベートし、 1、 3、 5、 10、 30、 60分おきにあらかじめ別のマイクロチューブに分注しておいた I oad i ng so I ut ion (8M urea XC BPB) 5 L中に、 反応液を 5 L加え、 各時間の反応溶液と した。 なお、 0分のサンプルは酵素を加えていないものとした。 それらを 95 °Cで 3分間ァニーリングを行なつた。 これらを 20%ゥレア PAGEにて分離した 。 イメージングプレートを用いて分離したイメージを転写し、 このイメージ を BAS 2000を用いて取り込み、 RIイメージ解析ソフトにより画像処理、 及び 分析を行なった。 なお、 siRNAの 5' 末端の32 P同位体標識は、 氷冷下 siRNAのセ ンス鎖 50 0101を10 1^緩衝液2 し 6unit/ L T4 polynucleotide kinase 1 し ·τ-32Ρ ΑΤΡ 1 L及び滅菌水 16 Lを混合し、 37°Cにて 30分間インキュ ベー卜した。 その後スピンカラムを用いて夾雑物を除去し、 未標識のセンス 鎖 50
pmolを加え、 オリゴヌクレオチドの総量を 100 pmolとした。 なお、 スピン力 ラムでの精製は添付された取り扱い説明書にあるプロ卜コルに従った。
[0139] 3' 末端化学修飾した siRNA全てについて、 それぞれの siRNAのアンチセンス 鎖に32 Pラベルを施し、 単鎖状態および二本鎖状態について時間依存で SVP処理 した。 結果を図 7及び図 8に示す。
[0140] 図 7示すように、 単鎖状態にあっては、 normal型は 60分経つと完全鎖長の ものが消失しているのに対し、 各 3' 末端化学修飾 siRNAはそれぞれ完全鎖長 のものが残存していた。 また、 図 8に示すように、 二本鎖状態にあっては、 一本鎖ほど明確な差は確認されなかった。
[0141] 次に、 これらの結果を基に、 単鎖状態での完全鎖長のオリゴヌクレオチドが 半減するまでの時間 t1/2を算出した。 結果を表 4に示す。
[表 4]
Renitia antisense Reni!la antisense
5' - guaggaguagugaaaggccTTX)- 3 5，一 guaggaguagugaaaggccXX)- 3 3 - Χ ΓΤ cauccucaucacuuuccgg- 5
Renitia sense Ren ilia sense
type i1/2(min> fold type fold
Figure imgf000067_0001
[0142] 表 4に示すように、 ピリジン誘導体でダングリングエンドを形成している s iRNAの耐性が天然型に比べて 39.3倍と一番高く、 耐性が一番低かったィソフ タル酸誘導体をダングリングエンドに持つ siRNAでも天然型の 8.9倍の耐性を 持つことが明らかになった。 実施例 10
[0143] (1- (4,4， -dimethoxytrityloxy) methy I -4-0- [ (2-cyanoethy I ) - (N, N-d i i sopropy I ) ] -phosphoam i d i cmethy I -hydroxymethy I benzeneの合成)
本実施例では、 以下のスキームに示す化合物 2 (アミダイ卜体） を合成し た。 予め真空乾燥させておいた化合物 1 ( 0.30 g, 0.67 mmol ) を dry THF ( 6.7 mL ) に溶解し、 DIPEA ( 0.6 mし 3.50 mmol, 5
eq ) と亜リン酸化試薬 （0.3 mL 1.35 mmol, 2 eq ) を加え、 Ar雰囲気下で 20mins攪拌した。 TLC ( へキサン：酢酸ェチル = 1:1 ) により原料の消失 を確認した。 クロ口ホルムと sat NaHC03 aqで分液し、 有機層を飽和炭酸水素 ナトリウム溶液で洗浄、 無水 Na2S04を加え乾燥させた。 溶媒を減圧留去後、 中 性シリカゲルクロマトグラフィー （ 1% pyridine in EtOAc ) で単離し、 am idは e体である化合物 2 ( 0.38 g, 0.59 mmol, 88% ) を得た。
32P NMR (162MHz, CDCI3) ά [ppm] : 148.8
[化 29]
Figure imgf000068_0001
実施例 11
[0144] (ナフタレンジカルボン酸ジメチル誘導体のアミダイ卜ュニッ卜及び CPG 誘導体の合成）
本実施例では、 以下のスキームに従い、 ナフタレンジカルボン酸ジメチル誘 導体のアミダイ卜体 （化合物 4) 及び CPG誘導体 （化合物 6) を合成した [化 30]
Figure imgf000069_0001
[0145] ( 1 ) i, 4 - bis - hydroxymethylnaphthaleneの合成
化合物 1である 1,4-ナフタレンジカルボン酸ジメチル （1.51 g， 6.16 mmol ) に Ar雰囲気下、 dry THF ( 31 mL ) を加えた。 さらに水素化ホウ素リチウ ム (0.67 g, 30.95 mmol, 5
eq) を加え、 60°Cで一晩攪拌した。 翌日、 TLC (
へキサン：酢酸ェチル = 1:1 ) で原料の消失を確認した後、 氷浴で酢酸を数 滴加えて反応液を中性にし、 反応を停止した。 しばらく攪拌した後、 析出し た結晶を MeOHで溶解した。 溶媒を減圧留去後、 シリカゲルクロマトグラフィ 一 （ 0 ~ 3%
メタノールのクロ口ホルム溶液 ） で単離し、 化合物 2 (1.05 g， 5.59 mmol, 91 %)を得た。
1H NMR (400MHz, DMS0 ) δ [ppm] ： 8.11-7.49
( 6H， m, Ar ) ,
5.26 (2H， t, J= 5.6 Hz, -OH) , 4.93 ( 4H， d， J= 5.2 Hz, -CH2- )
13C NMR (100MHz, DMS0 ) ά [ppm] ： 137.60, 131.44, 126.12, 124.83, 124.3
61.87
[0146] (2) 1 - (4,4' -d i methoxyt r i ty I oxy) methy I -4-hydroxymethy I naphtha I ene の合成 予め真空乾燥させておいた化合物 2 ( 0.93 g, 4.94 mmol ) をピリジン （ 50 mL ) に溶解し、 DMAP ( 34.3mg, 0.28mmol, 0.06eq ) と DMTrCI ( 1.85g, 5.45mmol, 1eq ) を加え、 Ar雰囲気下で一晩攪拌した。 翌日、 酢酸ェ チルと sat NaHC03
aqで分液し、 有機層を sat NaCI aqで洗浄、 無水 Na2S04を加え乾燥させた。 溶 媒を減圧留去後、 シリカゲルクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチル二 4:"！〜 1:1 ) で単離し、 化合物 3 ( 1.24 g, 2.53 mmol, 51%) を得た。 1H NMR (400MHz, DMSO) d [ppm] ： 8.11-6.92 (19H, m, DMTr and Ar) ， 5.31 (1 H， t, J= 5.6 Hz, -OH) ，
4.95 ( 2H， d ， J= 5.6 Hz, -CH20H) , 4.44 (2H， s ， -CH20DMTr) ， 3.74 (6H ， s， -OMe)
13C NMR (100MHz, DMSO ) ά [ppm] ： 158.18, 137.81, 135.67, 130.97, 129.69 ， 127.98, 127.69, 126.81, 125.86, 124.79, 124.37, 113.35, 86.19, 63.4 8， 61.23, 55.05
[0147] (3) 1- (4,4， -dimethoxytrityloxy) methy I -4-0- [ (2-cyanoethy I ) - (N, N - d i i sopropy I ) ] -phosphoam i d i cmethy I -hydroxymethy I benzeneの合成
予め真空乾燥させておいた化合物 3 ( 0.46 g, 0.94 mmol) を dry TH F ( 9.4 mL ) に溶解し、 DIPEA ( 0.8 mし 4.7 mmol, 5 eq ) と亜リン酸化試薬
(0.4 mL, 1■ 79 mmol, 2
eq ) を加え、 Ar雰囲気下で 15 mins攪拌した。 T LC
( 酢酸ェチルのみ ） により原料の消失を確認した。 クロ口ホルムと sat NaH C03 aqで分液し、 有機層を sat NaCI aqで洗浄、 無水 Na2S04を加え乾燥させた。 溶媒を減圧留去後、 中性シリカゲルクロマトグラフィー （ 1% ピリジン酢酸 ェチル溶液 ） で単離し、 アミダイ卜体である化合物 4 (0.55 g, 0.80 mmol ， 85% ) を得た。
32P NMR (162MHz, CDCI3) ά [ppm] : 149.11
[0148] (4) ナフタレンジカルボン酸ジメチル誘導体の CPG樹脂の合成
化合物 3 ( 0.15 g, 0.30 mmmol ) をピリジン （ 3 mL ) に溶解し、 そこに DMAP
( 44.9 mg, 0.37 隱 ol, 1 eq)と無水コハク酸 （110 mg， 1.10
mmol, 4 eq ) を加え Ar雰囲気下攪拌した。 一晩攪拌した後、 TLC ( へキサ ン：酢酸ェチル = 1:2 ) により原料の消失を確認し、 酢酸ェチルと sat NaHC 03 aqで分液し、 有機層を sat NaCI aqで洗浄、 無水 Na2S04を加え乾燥させた。 溶媒を減圧留去後、 真空乾燥させた。 この濃縮物 5dry DMF ( 7.5mL)を加え 溶解させ、 CPG ( 388 mg, 0.05
mmol ) を加え反応液となじませた。 その後、 WSC ( 60
mg, 0.31 mmol, 1 eq ) を加え室温で一日振とうさせた。 後処理として、 ピ リジンで洗浄した後に 0.1M DMAP in ピリジン無水酢酸 （9:1)溶液 （ 6 mL ) を加え、 一晩振とうさせた。 このものをメタノール、 アセトンで洗浄し乾 燥させ活性を測定した。 化合物 6の活性は 60.6 mol/gであった。
実施例 12
本実施例では、 実施例 2、 実施例 3、 実施例 1 0及び実施例 1 1で得た各種 のアミダイ卜体及び CPG樹脂を用いて、 3' 末端ダングリングエンドを有する s iRNAを固相ホスホロアミダイ卜法に従って核酸自動合成機によって合成した 。 以下に合成したオリゴヌクレオチドの配列を示す。 なお、 s i RNAは、 R en i 11 a Lusiferaseの c D N A配列に基づいて設計した。
[化 31]
5，-r( gua gga gua gug aaa ggcc )Xn -3 3'-Xn - r( cau ecu cau cac uuu ccg g )- 5，
Figure imgf000072_0001
n= 1、2、3
実施例 13
[0150] (Dual Luc iferase Assayによる 3' 末端化学修飾 si RNAのタンパク発現抑制効 果の評価）
本実施例では、 実施例 1 2で合成した 3' 末端化学修飾 Reni l la siRNAのうちダングリングエンドにベンゼン誘導体を備える s i RNAのタン パク発現抑制効果を評価するために 0.1,0.5, 1,5, 10nMの濃度で Luc Assayを行 なった。 なお、 L u c As s a yの操作は、 実施例 8と同様にして行った。 結果を図 9及び図 1 0に示す。
[0151] 図 9に示すように、 1， 2—ヒドロキシルメチルベンゼン誘導体をダング リングエンドに有する s i RNAは、 いずれもダングリングエンドが未修飾 の s i RNAよりも効果的にタンパク質の発現を抑制することがわかった。 また、 図 1 0に示すように、 1， 4—ヒドロキシメチルベンゼン誘導体をダ ングリングエンドに有する s i RNAは、 いずれもダングリングエンドが未 修飾の s i RNAよりも効果的にタンパク質の発現を抑制することがわかつ た。 さらに、 これらの結果によれば、 ダングリングエンドにおける 1， 2_ 又は 1， 4_ヒドロキシメチルベンゼン誘導体の個数は 2個とすることが最 も効果的であり、 次いで 3個であることがわかった。
実施例 14
[0152] (Dual Luc iferase Assayによる 3' 末端化学修飾 si RNAのタンパク発現抑制効 果の評価）
本実施例では、 実施例 1 2で合成した 3' 末端化学修飾 Renilla siRNAのうちダングリングエンドにナフタレン誘導体を備える s i RNAのタ ンパク発現抑制効果を評価するために 0.1,0.5,1,5, 10nMの濃度で Luc Assayを 行なった。 なお、 L u c As s a yの操作は、 実施例 8と同様にして行った 。 結果を図 1 1に示す。
[0153] 図 1 1に示すように、 2， 3—ヒドロキシメチルナフタレン誘導体及び 1 ， 4—ヒドロキシメチルナフタレン誘導体のいずれを用いた s i RNAであ つても、 ダングリングエンドが未修飾の s i RNAよりも効果的にタンパク 質の発現を抑制することがわかった。
実施例 15
[0154] (ベンジル系ヌクレオシド類似体の合成）
本実施例では、 ヌクレオシドアナログ合成のため、 以下のスキームに従い 、 出発原料として Trimethy卜 1,3, 5-benzenetricarboxylateを還元して化合物 2を収率 91%で得て、 続いて TBDPS化を行い、 ベンジル系ヌクレオシド類似体 3 - bを収率 34 %で得た。
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000074_0002
[0155] ( 1 ) 1,3, 5-Tr i hydroxymethy I benzene の合成
化合物 1 4.00 g (15.9 mmol ) を dry
THF 25 mLに溶解し、 LiAIH4 1.80 g を dry THF 75 mLに懸濁し氷冷した。 氷冷 下、 化合物 1 I THFを LiAIH4 / THFに滴下し撹拌した。 6時間後、 酢酸、 エタ ノールによリクェンチした。 反応液をセライ卜ろ過することにより沈殿物を 除き、 ろ液を濃縮した。 濃縮物からシリカゲルカラムクロマトグラフィー （ へキサン：酢酸ェチル = 1 ： 9 v/v) により目的物質を単離、 濃縮し、 白色結 晶の化合物 2を得た （収量、 収率： 2.42 g， 14.4 mmol, 91%) 。
1H NMR (400MHz, DMS0-D6) d
[ppm] ： 4.46-4.47 ( 6H， d : J=3.2， 1,3, 5-tr i methylene) ， 5.13 (3H， br， 1,3, 5-tri hydroxy) , 7.11 (3H， s， 2, 4, 6-H)
[0156] (2) 3, 5-B i s (tert-buty I d i pheny I s i I any I oxymethy I )
-1 -hydroxymethy I benzeneの合成
化合物 2 2.42 g (14.4 mmol ) とイミダゾール 3.92 g を dry DMF 120 mL に、 TBDPS-C I 7.61 mLを dry DMF 70 mLに溶解し、 氷冷した。 氷冷下、 TBDPS -CI / DMFを化合物 2 / DMFにゆつくリ滴下し撹拌した。 12時間後 ethanolに よってクェンチし、 反応液を濃縮した。 酢酸ェチルと水で抽出、 SAT. NaHC03 aq.、 SAT. NaCI aq.で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥した。 濃縮物からシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン） により目的物質を単離し、 白色 結晶の化合物 3 aおよび、 無色オイル状の化合物 3 b及び 3 cを得た （収量 及び収率はそれぞれ： （3-a) 600 mg, 1.48 mmol, 10 %； (3-b) 3.17 g, 4 ■ 91 mmol, 34%； (3-c) 5.58g, 6.32mmo 1 , 44%であった。
(3-b) 1H NMR (400MHz, CDCI3) d [ppm] ： 1.09
(18H, s, 3, 5-Bis(tert-butyl)) ， 4.65-4.66 (2H， d: J=6.0， 1 -methylene )， 4.76 (4H， s, 3, 5-B is (methylene)) ， 7.19-7.71 (23H， m, 2, 4, 6-H and 3, 5-Bis(di phenyl) ) ， （1H， br， 1 -hydroxy)
MASS :ca led for C41H4803Si2； 644.9890， found； 643
EL : ca I cd for C41 H4803S i 2■ 1 /5H20； C : 75.82， H : 7.53， found； C : 75.81， H:7.48
実施例 16
(ベンジル骨格一塩基カップリング体の合成）
本実施例では、 以下のスキームに従い、 合成した化合物 3 _ bを用い、 そ れぞれの塩基および塩基前駆体と力ップリングすることによリ各種の力ップ リング体 A-1、 G-U T-U U-1 (C-1 ) をそれぞれ収率 77%、 100% ( 混合物 ) 、 125% ( 混合物 ） 、 86%で得た。
Figure imgf000076_0001
( 1 ) 9-[3' ,5' -B i s (tert-buty I d i pheny I s i I any I oxymethy I )
-1 ' -methy I benzy I ] - 6 - ch I oropur i neの合成
化合物 3 _ b 300 mg ( 0.465 隱 ol ) と 6-クロロプリン 110 mg と PPh3 183 mg を dry THF 25 mLに溶解し、 氷冷下撹拌した。 氷冷下、 DEAD 320 Lを滴下し、 室温にて撹拌した。 15時間後に反応液を濃縮し、 濃縮物からシ リカゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン） により目的物質を単離、 濃 縮し、 白色結晶の化合物 A_ 1を得た （
収量、 収率： 274 mg, 0.360 mmol, 77 % ) 。
1H NMR (400MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 0.91 (18H, s, 3' ,5' -Bis (tert-buty I )) ， 4.69 (4H， s, 3' ,5' -B i s (methy I ene) ) ， 5.55 (2H， s, V -methyl ene), 7.14-7.56 (23H， m, 2' ,4' ,6' -H, 2' ,4' -Bis(diphenyl) ) , 8.7 3 (1H, s， 8-H), 8.80 (1H, s， 2-H)
MASS :ca led for
C46H50N402Si2CI ； 781.31608, found； 781.31701 [0159] (2) 2-Amino-9-[3' ,5' -B i s (tert-buty I d i pheny I s i I any I oxymethy I ) -1 ' -methy I benzy I ] - 6 - ch I oropur i neの合成
化合物 3_ b300 mg ( 0.465 隱 ol ) と 2-ァミノ 6-クロ口プリン 126 mg と PPh3 185 mg を dry
THF 25 mLに溶解し、 氷冷下撹拌した。 氷冷下、 DEAD 320 Lを滴下し、 室温 にて撹拌した。 16時間後に反応液を濃縮し、 濃縮物からシリカゲルカラムク 口マトグラフィー （へキサン） により目的物質を単離、 濃縮し、 白色結晶の 化合物 G_ 1を得た （収量、 収率： 371 mg, 0.457 mmol, 100%) 。
1H NMR (400MHz, DMS0-D6) ά [ppm] : 1.05 (18H, s, 3' ,5' -Bis (tert-buty I )) ， 4.71 (4H， s, 3' ,5' -B i s (methy I ene) ) ， 5.09 (2H， br， 2-amino), 5.22 (2H， s, V -methylene), 7.09-7.65 (23H， m, 2' ,4' ,6' -H and 3' ,5' -Bis(diphenyl) ) , 7.70 (1H, s, 8-H)
MASS :ca led for C46H51N502Si2CI ； 796.32699, found； 796.32677
[0160] (3) 3N-Benzoy卜 1-[3' ,5' -B i s (tert-buty I d i pheny I s i I any I oxymethy I ) -1' -methy I benzy I] - thymineの合成
化合物 3_ b1.30 g ( 2.02 隱 ol ) と 3-ベンゾィルチミン 696 mg と PPh3 792 mg を dry THF 150 mLに溶解し、 氷冷下撹拌した。 氷冷下、 DEAD 1.4 O mLを滴下し、 室温にて撹拌した。 13時間後に反応液を濃縮し、 濃縮物から シリカゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン） により目的物質を単離、 濃縮し、 白色結晶の化合物 T_ 1を得た （
収量、 収率： 2.17 g, 2.53 mmol, 125% mixture ) 。
1H NMR (400MHz, CDCI3) d [ppm] : 1.00 (18H, s, 3' ,5' -Bis (tert-buty I) ) ， 1.81 (3H， s, 5-methyl) ， 4.75 (4H， s, 3' ,5' -B i s (methy I ene) ) ， 4.92 (2H， s, V -methylene), 7.18-7.73 (25H， m, 3-N-benzoyl and 3' ,5' -B i s (d i pheny I ) )
13C NMR (DMS0-D6) d [ppm] ： 168.86, 162.97, 150.02, 142.24, 139.40, 135.57, 135.45, 134.89, 133.21, 131.56, 130.41, 129.79, 129.07, 127.7 7， 127.74, 124.10, 111.09, 65.20, 51.18, 19.25, 14.43, 12.43 MASS :ca led for C53H57N205S i 2； 857.38061, found； 857.37951
EL:calcd for C53H56N205S i 2； C:74.26, H:6.58， N:3.27, found ; C: 74.07
， H:6.56， N:3.26
[0161] (4) 3N-Benzoyl-1-[3' ,5' -B i s (tert-buty I d i pheny I s i I any I oxymethy I ) -1 ' -methy I benzy l]-uraci Iの合成
乾燥した、 化合物 (3-b) 300 mg (0.465
mmol) と 3-ベンゾィルゥラシル 79.7 mgと PPh3 186mgを dry THF 25 mLに溶解し 、 氷冷下撹拌した。 氷冷下、 DEAD 320 Lを滴下し、 室温にて撹拌した。 16 時間後に反応液を濃縮し、 濃縮物からシリカゲル力ラムクロマトグラフィー (へキサン） により目的物質を単離、 濃縮し、 白色結晶の化合物 （U-1) を得 た （収量、 収率： 338mg, 0.401 mmol, 86 %) 。
'Η NMR (400MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 1.09 (18H, s, 3' ,5' -Bis (tert-buty I) ) , 4.76 (4H， s， 3' ,5' -B i s (methy I ene) ) ， 4.89 (2H， s， 1' -methylene )， 7.12-7.69 (28H， m, 2' ,4' ,6' -H, 3' ,5' -Bis(diphenyl) and 3-N-be nzoyl), 7.89-7.91 (2H， ss, 5-H and 6-H)
MASS :ca led
for C52H55N205Si2； 843.36496， found； 843.36443
Eし： G3 I cd
for C53H56N205Si2■ 1/3H20: C:64.77, H:5.44， N:7.19, found ; C: 64.59， H:5.46， N:7.02
実施例 17
[0162] (アデ二ン類似体の誘導体の合成）
本実施例では、 アデニン類似体のアミダイ卜体及び脱保護体を合成した。 すなわち、 アミダイ卜体のの作製のため、 以下のスキームに従い、 化合物 A - 1を、 アンモニアメタノールで処理することにより化合物 A_ 2を収率 68 %で得た。 得られた化合物 A_ 2を Bz化し化合物 A_ 3を収率 77%で得て、 続いて TBAF処理することにより化合物 A _ 4を収率 48%で得た。 得られた化 合物 A-4を DMTr化することで化合物 A-5を収率 39%で得た。 常法に従いァミダ イト化し、 目的の化合物 A _ 6を収率 62%で得た。 さらに、 脱保護体の作製 のため、 以下のスキームに従い、 化合物 A—2を TBAF処理することで化合物 A - 7を得た。 化合物 A _ 1を TBAF処理することで化合物 A-8を収率 49%で得 た。 化合物 A-1を 50% TFAで処理することにより化合物 I― 1を収率 15%で得
[化 34]
Figure imgf000079_0001
A-4： 48% A-5： 39% A-6： 62%
[化 35]
Figure imgf000080_0001
A-1 -1： 15%
(1 ) 9- [3， ,5' -B i s (tert-buty I d i pheny I s i I any I oxymethy I )
-1' -methy I benzy I ] - adenineの合成
化合物 A_ 1 1.21 g (1.57 mmol) を 27% NH3 / メタノール 90 mLに溶解 し、 スチール管で、 120°Cにて撹拌した。 28時間後、 反応液を濃縮し、 残渣を シリカゲルカラムクロマ卜グラフィー （酢酸ェチル： メタノール = 100： 1v/ V) により目的物質を単離し、 白色泡状結晶の化合物 A_ 2を得た （収量、 収 率： 806 mg, 1.06 mmol, 68%) 。
1H NMR (400MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 0.94 (18H, s, 3' ,5' -Bis (tert-buty I )) ， 4.68 (4H， s, 3' ,5' -B i s (methy I ene) ) ， 5.37 (2H， s, V -methyl en e)， 7.16-7.56 (23H， m, 2' ,4' ,6' -H, 2' ,4' -Bis(diphenyl) ) , 8.10
(1H, s, 6-NH2) , 8.30 (1H, s, 8-H) , 8.30 (1H, s, 2-H)
13C NMR(DMS0-D6) d [ppm] ： 153.34, 142.26, 140.60, 135.69, 133.43, 132 .31, 132.21, 132.09, 132.06, 129.89, 128.59, 127.87, 123.85, 123.66, 119.55, 65.33， 47.32， 26.94， 19.38
MASS： calcd for C46H50N402S i 2C I ； 781.31608, found； 781.31701
[0164] (2) N6-Benzoy卜 9-[3' ,5' -b i s (tert-buty I d i pheny I s i I any I oxymethy I ) -1' -methy I benzyl] - adenineの合成
化合物 A— 2 1.20 g (1.57 mmol ) をピリジン 16 mLに溶解し、 BzCI 230 Lを滴下し室温にて撹拌した。 24時間後酢酸ェチルと水で抽出、 SAT. NaHC 03 aq.、 SAT. NaCI aq.で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥した。 濃縮物からシリ 力ゲルカラムクロマ卜グラフィー （へキサン：酢酸ェチル = 6： 1~) により 目的物質を単離し、 白色結晶の化合物 A_ 3を得た （収量、 収率： 1.04g， 1. 21mmol, 77%) 。
1H NMR (400MHz, CDCI3) d [ppm] ： 1.07 (18H, s, 3' ,5' -Bis (tert-buty I)) ， 4.72 (4H， s， 3' ,5' -B i s (methy I ene) ) ， 5.37 (2H， s， 1' -methylene) ， 7.17-7.85 (28H， m, 2' ,4' ,6' -H, 2' ,4' -Bis(diphenyl) and 6-N-ben zoyl), 8.02 (1H, s, 8-H), 8.66 (1H, s, 2-H) (1H, br， 6-NH)
13C NMR (CDC 13) d [ppm] ： 172.25, 152.31, 144.59, 142.30, 135.52, 134.4 6， 134.13, 133.23, 132.87, 129.76, 129.42, 128.64, 127.74, 124.30, 12 3.92, 65.15, 47.75, 26.81, 19.25
MASS: calcd for C53H55N503S i 2； 866.20670, found； 866.39165
[0165] (3) N6-Benzoy卜 9-[3' ,5' -b i s (hyd r oxymethy I )-1' -methy I benzy I ]
- adenineの合成
化合物 A_3 1.07g (1.20 mmol) を THF19
mLに溶解し、 TBAF 2.0 mLを滴下し室温にて撹拌した。 17時間後酢酸ェチルと 水で抽出、 SAT. NaHC03 aq.、 SAT. NaCI aq.で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥し た。 濃縮物からシリカゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチ ル = 2 : 1v/v) により目的物質を単離し、 白色結晶の化合物 A_4 を得た （ 収量、 収率： 226 mg, 0.58 mmol, 48 %) 。
1H NMR (400MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 4.45 (4H， s, 3' ,5' -B i s (methy I ene) ) ， 5.48-5.53 (2H， d: J=17， V -methylene), 7.19-8.05 (8H， m, 2' ,4' ,6 ， -H, 6-N-benzoyl), 8.62 (1H, s, 8-H), 8.71 (1H, s, 2-H), 11, 18 (1H, br， 6-NH)
13C NMR (隱 -D6) S [ppm] : 144.72， 143.01, 136.86, 136.58, 136.24, 133. 46， 132.41, 129.19, 128.84, 128.46, 125.38, 125.28, 125.23, 124.10, 1 23.93， 65.89， 62.68， 62.48， 48.60， 46.59
MASS :ca led for C21H19N503； 390.15662, found； 390.15764
(4) N6-Benzoy卜 9-[3' - (4,4， -d i methoxyt r i ty I oxymethy I )
- 5' -hydr oxymethy 1-1' -methy I benzy I ] -aden i ne の合成
化合物 A— 4 315.7 mg ( 0.81 mmol ) を無水ピリジン 30 mLに溶解し、 DMTr-CI 339 mgを加え、 撹拌した。 14時間後濃縮して、 残渣を酢酸ェチルと 水で抽出、 SAT. NaHC03 aq.、 SAT. NaCI aq.で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥し た。 濃縮物からシリカゲルカラムクロマトグラフィー （ hexane： ethyl aceta te = 3 : 1v/v) により目的物質を単離し、 白色結晶の化合物 A_5 を得た （ 収量、 収率： 201
mg, 0.29 mmo I， 39 %) 。
1H NMR (400MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 3.78
(6H， s， 3' -dimethoxy), 4.07-4.09 (2H， m, 5' -methylene), 4.51-4.52 (2H， d: J=5.8， 3' -methylene), 5.25-5.27 (1H, t: J=5.6， 5' -hydroxy )， 5.59 (2H， s, V -methylene), 6.93-7.82 (21 H， m, 3' -trityl, 2' ,4 ， ,6' -H, 6-N-benzoyl), 8.37 (1H, s, 8-H), 8.73 (1H, s, 2H) ， 8.85 (1H ， s, 6-NH)
13C NMR(DMS0-D6) ά [ppm] ： 179.99, 172.00, 158.09, 151.76, 147.20, 143. 35， 135.54, 133.43, 133.27, 129.56, 128.93, 127.91, 127.56, 124.44, 1 13.26, 85.88， 79.14, 64.73, 62.55， 55.01, 46.85
MASS :ca led
for C42H38N505； 692.78182, found； no
date
[0167] (5) N6-Benzoyl-9-[5' -[[ (2-cyanoethoxy) -
(N, N-d i i sopropy I am i no) phosph i ny I ] oxymethy I ] -3' - (4,4' -dimethoxytr i ty I oxymethy I ) -1' -methy I benzy I ] -aden i ne の合成
グローブバッグ中
(アルゴン下、 完全無水） 、 DNA条件で反応させた。 化合物 A_5 199 mg (0 .28 mmol) にジクロロメタン 1.5 mL を加え、 溶解させた。 ここに Huning' s
Base (N-ェチルジイソプロピルァミン） 150 Lを加え、 さらにアミダイ卜 試薬
100 Lを、 攪拌しながらゆっくり滴下した。 グローブバッグから取り出し、 20分間攪拌した後、 クロ口ホルム に溶解し、 SAT. NaHC03 aq.、 SAT. NaCI aq .で洗浄し硫酸ナ卜リゥムで乾燥した。 濃縮物からシリカゲル力ラムクロマト グラフィー （へキサン：酢酸ェチル =2 ： 1 ) により白色結晶の化合物 A _ 6
を得た （収量、 収率： 155 mg, 0.174 mmol, 62%) 。
31P NMR (162MHz, DMS0-D6) d [ppm]： 148.78, 148.76
[0168] (6) 9-[3' ,5' -b i s (hydr oxymethy I ) -1 ' -methy I benzy I ] -6-ch I oropur i ne の合成
化合物 A— 1 500 mg (0.66
mmol) を THF 4 mLに溶解し、 TBAF 1 mLを滴下し室温にて撹拌した。 17時間後 酢酸ェチルと水で抽出、 SAT. NaHC03
aq.、 SAT. NaCI aq.で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥した。 濃縮物からシリカ ゲルカラムクロマ卜グラフィー （へキサン：酢酸ェチル = 1 : 2 v/v) により 目的物質を単離し、 白色結晶の化合物 A_ 8 を得た （収量、 収率： 106 mg, 0.35 mmo I， 53 %) 。 1H NMR (400MHz, DMS0-D6) δ [ppm] ： 3.95 (4H， d:J=5.9， 3' ,5' -Bis(methy lene)) ， 5.15-5.17 (2H， t : J=5.5， 3' ,5' -hydroxy), 5.51 (2H， s, V - methylene) ， 7.15-7.18 (3H， m, 2' ,4' ,6' -H)， 8.79 (1H, s, 8-H), 8.8 4 (1H, s, 2-H)
MASS :ca led
for C21H19N503； 301.30080, found； no
date
[0169] (7) 9- [3' ,5' -bis(hydroxymethyl)-1' -methyl benzyl ] - inosine の合成 化合物 A— 1 500 mgを 50% TFA in 4:1 = THF:水 10 mLに溶解し、 12時間室 温にて撹拌した。 溶液を濃縮後、 濃縮物からシリカゲルカラムクロマトダラ フィー （へキサン：酢酸ェチル = 1 : 2 v/v) により目的物質を単離し、 白色 結晶の化合物 I _2 を得た （収量、 収率： 30 mg, 0.10 mmol, 15 %)。
1H NMR (400MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 4.42 (4H， s, 3' ,5' -B i s (methy I ene) ) ， 5.24 (2H， br， 3' ,5' -hydroxy), 5.51 (2H， s, V -methylene) ， 7.11- 7.18 (3H， m, 2' ,4' ,6' -H)， 8.79 (1H, s， 8-H), 8.84 (1H, s， 2-H) 13C NMR(DMS0-D6) d [ppm] ： 152.64, 152.56, 149.95, 148.37, 143.85, 136. 47， 131.61, 125.0, 124.69, 63.45， 47.90
MASS :ca led for C21H19N503； 301.30080, found； no date
実施例 18
[0170] (グァニン類似体の誘導体の合成）
本実施例では、 グァニン類似体の脱保護体を合成した。 すなわち、 以下のに 従い、 合成した化合物 G— 1を、 50%TBAFで処理することにより化合物 G_ 2を収率 12% (2steps) で得た。
Figure imgf000085_0001
[0171] (9-[3' ,5' -b i s (hydroxymethy I ) -1 ' -methyl benzyl] - guanine の合成) 化合物 G_ 1を 50% TFA in water 10 mし メタノール少量に溶解し、 18時 間室温にて撹拌した。 溶液を濃縮後、 ろ過し、 得られた溶液を濃縮した。 濃 縮物からシリカゲルカラムクロマトグラフィー （ 酢酸ェチル v/v) により目 的物質を単離し、 白色結晶の化合物 G_2) を得た （収量、 収率： 170 mg, 0.56 mmol, 12% (2steps) ) 。
1H NMR (400MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 4.45 (4H， s, 3' ,5' -B i s (methy I ene) ) ， 5.48-5.5
(2H， d: J=17， V -methylene), 7.19-8.05 (8H， m, 2' ,4' ,6' -H, 6-N-be nzoyl), 8.62 (1H, s, 8-H), 8.71 (1H, s, 2-H), 11, 18 (1H, br， 6-NH) 13C NMR(DMS0-D6) ά [ppm] ： 144.72, 143.01, 136.86, 136.58, 136.24, 133. 46， 132.41, 129.19, 128.84, 128.46, 125.38, 125.28, 125.23, 124.10, 1 23.93， 65.89， 62.68， 62.48， 48.60， 46.59
MASS： calcd for C21H19N503； 301.30080, found； no date
実施例 19
[0172] (チミジン類似体の誘導体の合成）
本実施例では、 チミジン類似体のアミダイ卜体、 CPG体及び脱保護体を合 成した。 すなわち、 以下のスキームに従い、 化合物 T— 1を TBAF処理するこ とにより化合物 T_ 2を収率 87% (2 steps) で得た。 得られた化合物 T_2 を DMTr化することで化合物 T _ 3を収率 69%で合成した。 常法に従いァミダ イト化し、 目的の化合物 T_ 4を収率 52%で合成した。 また、 オリゴヌクレ ォチド作成に用いる樹脂を作成するため、 さらに、 以下のスキームに従い、 化合物 Τ_ 3をスクシニル化し、 CPG樹脂と結合させ、 化合物 Τ_ 5を 42.2 mol/gの活性で得た （scheme 5b) 。 さらに、 以下のスキームに従い、 脱保 護体の合成のため、 化合物 T_ 1をアンモニアメタノールで処理することに よリ化合物 Τ _ 6を得て、 続いて TBAF処理することにより化合物 Τ _ 7を収 率 50% (2 steps) で合成した。
[化 37]
Figure imgf000086_0001
Figure imgf000086_0002
[化 38]
Figure imgf000087_0001
-1 T-6 T-7： 50% ( 2 steps )
( 1 ) 3N-Benzoy I -1-[3， ,5' -Bis(hydroxymethyl)-1' -methy I benzy I ] -thy mineの合成
化合物 T_ 1 2.17 g (2.53 mmol mixture) を THF 20 mLに溶解し、 TBAF 1 mLを滴下し室温にて撹拌した。 5時間後酢酸ェチルと水で抽出、 SAT. NaHC03 aq.、 SAT. NaCI aq.で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥した。 濃縮物からシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチル =2 ： 1 v/v) により 目的物質を単離し、 白色結晶の化合物 （T_2)を得た （収量、 収率： 668 mg ， 1.58 mmol, 87% 2 steps ) 。
'Η NMR (400MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 1.84 (3H， s, 5-methyl) ， 4.47-4.49 ( 4H， d: J=5.6， 3' ,5' -B i s (methy I ene) ) ， 4.90 (2H， s， 1' -methylene), 5.21-5.24 (2H， t: J=5.6， 3' ,5' -hydroxy), 7.14 (2H， s， 2' -H and 6' -H)， 7.20 (1H, s, 4' -H)， 7.57-7.94 (6H， m, 3-N-benzoyl and 6-H) 13C NMR (DMS0-D6) ά [ppm] ： 169.65, 162, 86, 149.56, 142.96, 136.01, 131 ■ 08， 130.34, 129.51, 123.66, 109.06, 62.72， 11.96
MASS： calcd for C21 H21 N205； 381.14505， found； 381.14425
EL : ca I cd for C21 H20N205 · 1 /3H20； C : 65.28 ;
H:5.39， N:7.25， found ; C: 65.23， H:5.40， N:7.16
(2) 3N-Benzoyl-1-[3' - (4,4， -d i methoxyt r i ty I oxymethy I ) -5' -hydrox ymethy I -1 ' -methy I benzy I ] -thym i neの合成
化合物 T_2 580 mg (1.52 mmol) と DMAPを無水ピリジン 10mLに、 DMTr-CI 568mgを dry pyrideine 5mLに溶解し氷冷した。 氷冷下、 DMTr-CI/pyr idine を化合物 （T-2) /ピリジンに滴下し、 氷冷下撹拌した。 5時間後酢酸ェチルと 水で抽出、 SAT. NaHC03
aq.、 SAT. NaCI aq.で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥した。 濃縮物からシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチル =3 ： 1 v/v) により 目的物質を単離し、 白色結晶の化合物 （T-3) を得た （収量、 収率： 718mg， 1 .05mmo 1 , 69%) 。
1Η NMR (400MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 1.84
(3H， s, 5-methyl) ， 3.70-3.72 (6H， d:
J=6.4， 3' -dimethoxy), 4.05 (2H， s， 3' -methylene), 4.48-4.50
(2H， d: J=6.0， 5' -methylene), 4.93 (2H， s, V -methylene), 5.23-5. 25 (1H, t:J=5.6， 5' -hydroxy), 6.85-7.94 (22H， m, 3' -trityl, 2' ,4 ' , 6' -H, 3-N-benzoy I
and 6-H)
13C NMR (DMS0-D6) d [ppm] ： 169.57, 162.84, 158.09, 149.54, 144.82, 143.28, 142.47, 135.60, 135.59, 130.18, 129.60, 129.43, 127.60, 126.7 4， 124.12, 124.11, 113.25, 109.00, 85.93， 85.88， 62.63， 59.73, 55.00 ， 11.87
MASS： calcd for C42H39N207； 683.27573, found； 683.27683 [0175] (3) 3N - Benzoyト 1 - [5' -[[ (2-cyanoethoxy) (N, N-di isopropylamino) phosph i ny I ] oxymethy I ] -3' - (4,4' -d i methoxyt r i ty I oxymethy I ) -1' -meth y I benzyl] thymine (化合物 T_ 4)の合成
グローブバッグ中 （アルゴン下、 完全無水） 、 DNA条件で反応させた。 化合 物 T— 3 650 mg ( 0.95 mmol ) にジクロロメタン 4.80 mL を加え、 溶解さ せた。 ここに Huning' s Base ( N-ェチルジイソプロピルアミン
) 490 Lを加え、 さらにアミダイ卜試薬 250 Lを、 攪拌しながらゆつく リ滴下した。 グローブバッグから取り出し、 1 h 攪拌した後、 クロ口ホルム に溶解し、 SAT. NaHC03 aq.、 SAT. NaCI aq.で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥し た。 濃縮物からシリカゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチ ル =2 ： 1 )により白色結晶の化合物 T_ 4を得た （ 収量、 収率： 434 mg， 0 ■ 492 mmol, 52 % ) 。
31P NMR (162MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 148.899
[0176] (4) チミン類似体の CPG樹脂の合成
化合物 T— 4 150 mg ( 0.21 mmol ) 、 DMAP 51 mg. 撹拌子をー晚乾燥し た。 乾燥を止め、 アルゴン下、 ピリジン 1.5mし 無水コハク酸 52.4mgを加え 室温で 2日間撹拌した。 酢酸ェチルと水で抽出、 SAT. NaHC03 aq.、 SAT. NaCI aq.で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥し、 濃縮した。 濃縮した残渣に CPG 338 mg 、 DMF 4.5 mL 加え、 30分放置。 WSC 29 mg加え室温で 2日間振とうした。 後 処理として、 ピリジンで洗浄した後に 0.1 M DMAP ピリジン溶液：無水酢酸 = 9： 1 溶液 4.5mL を加え、 1日振とうした。 このものをメタノール、 アセトン で洗浄し乾燥させ、 活性を測定した。 作成した CPG樹脂 （T-5) の活性は 42.2 mol I
gであった。
[0177] 活性は、 以下の方法で算出した。 すなわち、 乾燥した CPG樹脂 6 mgをガラス フィルターにのせ、 H C I 04：エタノール = 3： 2の溶液を流し込み、 そのろ 液の UV 498 nmの波長 (DMTr基の波長） の吸光度を測定し、 以下の式に代入す ることにより算出した。 活性 （ mo I /g) = [Abs. (498 nm) xVol. (solution) (mL) x 3]Z[W eight (support) (mg) ]
[0178] (5) 1-[3， ,5' -B i s (tert-buty I d i pheny I s i I any I oxymethy I )
-1' -methyl benzyl] - thymineの合成
化合物 3_ b 3.5 g (5.4
mmol) と チミン 1.02 g と PPh3
2.8 g を無水 THF 100 mLに溶解し、 氷冷下撹拌した。 氷冷下、 DEAD4.9 mLを 滴下し、 室温にて撹拌した。 13時間後に反応液を濃縮し、 濃縮物からシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン） により目的物質を単離、 濃縮し 、 白色結晶の化合物 T_ 6を混合物として得た。
[0179] (5) 1-[3' ,5' -Bis(hydr oxymethy 1)-1' -methyl benzyl] -thymineの合成 化合物 T_6 (混合物） を THF 15 mLに溶解し、 TBAF 2 mLを滴下し室温に て撹拌した。 17時間後に反応液を濃縮し、 メタノールで結晶化し、 白色結晶 の化合物 T_ 7を得た （収量、 収率： 250 mg， 0.905 mmol, 50
% 2 steps) o
1H NMR (400MHz, DMS0-D6) d
[ppm] ： 1.74 (3H， s, 5-methyl) ， 4.45-4.46 (4H， d: J=5.5， 3' ,5' -Bis( methy I ene) ) ， 4.81
(2H， s, V -methylene), 5.17-5.20 (2H， t: J=5.7， 3' ,5' -hydroxy), 7 .09 (2H， s， 2' -H and 6' -H)， 7.17 (1H, s， 4' -H)， 7.58-7.58 (1H, d:J =1.2, 6-H)
13C NMR (DMS0-D6) d [ppm] ： 164.40, 151.12, 142.94, 141.44, 136.79, 12
3.96， 123.87, 109.04, 92.08, 62.96, 62.87, 50.15,
MASS： calcd for C14H16N204； 277.11884, found； 277.11940
EL： calcd for C14H16N204 · 1/7H20； C:60.21；
H:5.89, N:10.03, found； C: 60.18, H:5.81, N:9.95
実施例 20
[0180] 本実施例では、 ゥラシル類似体のアミダイ卜体及び脱保護体を合成した。 す なわち、 以下のスキームに従い、 化合物 U _ 1を TBAF処理することによリ化 合物 U _ 2を収率 79%で得た。 得られた化合物 U _ 2を DMTr化することで化 合物 U _ 3を収率 55%で合成した。 常法に従いアミダイ卜化し、 目的の化合 物 U _ 4を収率 37%で合成した。 また、 以下のスキームに従い、 脱保護体の 合成のため、 化合物 U _ 1をアンモニアメタノールで処理することによリ化 合物 U _ 5を得て、 続いて TBAF処理することにより化合物 U _ 6を収率 61 % (2 steps ) で合成した
[化 40]
Figure imgf000091_0001
U-1 ( C-1 ) U-2： 79%
Figure imgf000091_0002
U-3： 55%
U-4： 37%
Figure imgf000092_0001
[0181] ( 1 ) 3N-Benzoy卜 1-[3' ,5' -Bis (hydroxymethy I )-1' -methyl benzyl] -urac i I の合成
化合物 U_ 1 1.02 g (1.21 mmol混合物 ) を THF 5 mLに溶解し、 TBAF 1 m Lを滴下し室温にて撹拌した。 5時間後酢酸ェチルと水で抽出、 SAT. NaHC03 aq.、 SAT. NaCI aq.で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥した。 濃縮物からシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチル =2 ： 1 v/v) により 目的物質を単離し、 白色結晶の化合物 U_ 2)を得た （収量、 収率： 351mg、 0 .958mmol, 79%) 。
1H NMR (400MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 4.47-4.49 (4H， d: J=5.5， 3' ,5' -Bis( methylene)) ， 4.94 (2H， s, V -methylene), 5.21-5.24 (2H， t:J=5.5， 3 ， ,5' -hydroxy), 5.89-5.92 (1H, d: J=9.5， 5- H)， 7.14 (2H， s, 2' -H an d 6' -H)， 7.20 (1H, s, 4' -H)， 7.58-8.00 (4H， m, 3-N-benzoy I ) , 8.02-8 .02 (1H, d： J=9.1, 6-H)
13C NMR (DMS0-D6) ά [ppm] ： 164.38, 150.31, 146.74, 142.98, 135.90, 135 ■ 83， 130.22, 129.54, 101.05, 62.69， 51.02
MASS： calcd for C20H19N205； 367.12940, found； 367.13011
EL： calcd for C20H18N205 · 1/5H20:
C:64.90, H:5.10, N:7.46， found ; C: 64.77， H:5.03， N:7.55
[0182] (2) 3N-Benzoyl-1-[3' - (4,4， -d i methoxyt r i ty I oxymethy I ) -5' -hydrox ymethy I -1 ' -methy I benzy I] -urac i Iの合成
化合物 U_2 335 mg ( 0.914 mmol ) と DMAPを無水ピリジン 9 mLに溶解 し、 DMTr-CI 372 mgを加え、 撹拌した。 17時間後酢酸ェチルと水で抽出、 SA T. NaHC03 aq.、 SAT. NaCI aq.で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥した。 濃縮物か らシリカゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチル =3 ： 1 ~) により目的物質を単離し、 白色結晶の化合物 U_ 3を得た （ 収量、 収率： 33 8 mg, 0.505 mmo I， 55
% ) 。
1H NMR (400MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 3.72
(6H， s， 3' -dimethoxy), 3.99-4.05 (2H， m, 3' -methylene), 4.48-4.49 (2H， d: J=5.5， 5' -methylene), 4.98 (2H， s, V -methylene), 5.25 (1 H， t: J=5.6， 5' -hydroxy), 5.94-5.96 (1H, d: J=7.9， 5- H)， 6.88-7.92
(21H, m, 3' -trityl, 2' ,4' ,6' -H and
3-N-benzoyl), 8.05-8.07 (1H, d: J=7.9， 6-H)
13C NMR (DMS0-D6) ά [ppm] ： 158.11, 146.87, 135.58, 135.45, 130.16, 129 ■ 60， 129.45, 127.93, 127.61, 124.11, 123.61, 113.27, 101.02, 62.62, 5 9.74， 55.01
MASS： calcd for C41H37N207； 669.26008， found； 669.25945
(3) 3N-Benzoyl -1-[5' -[[ (2-cyanoethoxy)
(N, N-d i i sopropy I am i no) phosph i ny I ] oxymethy I ] -3' - (4,4' -dimethoxytr i ty I oxymethy I) - 1 ' -methy I benzy I ] - urac i Iの合成
グローブバッグ中アルゴン下 （完全無水)、 DNA条件で反応させた。 化合物 U-3 315 mg ( 0.47 mmol ) にジクロロメタン 2.0 mL を加え、 溶解させ た。 ここに Huning' s Base ( N-ェチルジイソプロピルァミン） 250 しを加 え、 さらにアミダイ卜試薬 160 Lを、 攪拌しながらゆっくり滴下した。 グ ローブバッグから取り出し、 1.5 h 攪拌した後、 クロ口ホルム に溶解し、 SA T. NaHC03 aq.、 SAT. NaCI aq.で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥した。 濃縮物か らシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー （へキサン：酢酸ェチル =2： 1)によ リ白色結晶の化合物 （U-4) を得た （
収量、 収率： 153 mg, 0.18 mmol, 37 % ) 。 31P NMR (162MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 148.388
MASS： calcd for C50H54N408P； 869.36790, found； 869.36872
[0184] (4) 1-[3' ,5' -B i s (tert-buty I d i pheny I s i I any I oxymethy I ) -1 ' -methyl be nzyl] - uraci Iの合成
化合物 U_ 1 3.70 g ( 4.39 mmol ) に NH3/メタノール 30 mLを加え、 撹 拌した。 反応液を濃縮し、 濃縮物からシリカゲルカラムクロマトグラフィー (へキサン：酢酸ェチル =5： 1 v/v) により目的物質を単離し、 白色結晶の 化合物 （U-5) を得た （収量、 収率： 3.0 g, 4.06 mmol, 93 %) 。
[0185] (5) 1-[3' ,5' -Bis(hydr oxymethy 1)-1' -methyl benzyl]- uraci Iの合成 化合物 U_5 1.02 g (1.38 mmol mixture ) を THF 10 mLに溶解し、 TBAF 3 mLを滴下し室温にて撹拌した。 5時間後酢酸ェチルと水で抽出、 SAT. NaHC03 aq.、 SAT. NaCI aq.で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥した。 濃縮物からシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチル = 2： 1 v/v) により 目的物質を単離し、 白色結晶の化合物 U— 6を得た （収量、 収率： 622mg， 0. 84隱 ol， 61% (2 steps) ) 。
1H NMR (400MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 4.45-4.46
(4H， d: J=5.9， 3' ,5' -B i s (methy I ene) ) ， 4.84 (2H， s， 1' -methylene )， 5.18-5.21
(2H， t: J=5.5， 3' ,5' -hydroxy), 5.58-5.60 (1H, d:
J=7.9， 5-H), 7.09 (2H, s， 2' -H and 6' -H), 7.18 (1H, s， 4' -H), 7. 71 (1H, s, 6-H), 11.31 (2H， br， 6-NH2)
実施例 21
[0186] (シトシン類似体の脱保護体の合成）
本実施例では、 シトシン類似体の脱保護体を合成した。 すなわち、 以下のス キームに従い、 化合物 U _ 5を常法に従いゥラシルをシ卜シンへ変換し化合 C-2を収率 72%で得た。 化合物 C-2を TBAF処理することにより化合物 C-3を 収率 62%で得た。 [化 42]
Figure imgf000095_0001
U-5 C-2： 72% C-3： 62%
[0187] ( 1 ) 1-[3' ,5' -b i s (tert-buty I d i pheny I s i I any I oxymethy I )
-1 ' -methy I benzy I ] -cytos i ne
(化合物 C一 2)の合成
化合物 U_5 739 mg ( 1.0 mmol ) . TPBSCI 605 mg、 DMAP 245 mg、 撹拌 子を一晩乾燥させた。 乾燥をやめ、 ァセトニトリル 5 mLに溶解し、 トリェチ ルァミン 280 L加えて一晩撹拌した。 NH3
aq. 5 mL加え、 再び 3時間ほど撹拌した。 溶液を濃縮した後、 クロ口ホルム に溶解し、 飽和炭酸水素ナトリウム溶液、 SAT. NaCI aq.で洗浄し無水硫酸ナ トリウムで乾燥した。 濃縮物からシリカゲルカラムクロマトグラフィー （酢 酸ェチル： TEA = 100：1) により白色結晶の化合物 C_ 3を得た （収量、 収率
： 528.3mg, 0.72隱 ol， 72% ) 。
1H NMR (400MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 3.78 (6H， s, 3' -d i methoxy) , 4.07-4.0 9 (2H， m, 5' -methylene), 4.51-4.52 (2H， d: J=5.8， 3' -methylene), 5. 25-5.27 (1H, t: J=5.6， 5' -hydroxy), 5.59 (2H， s， V -methylene), 6. 93-7.82 (21 H， m, 3' -trityl, 2' ,4' ,6' -H, 6-N-benzoy I ) , 8.37 (1H, s ， 8-H), 8.73 (1H, s， 2H) ， 8.85 (1H, s， 6-NH)
13C NMR(DMS0-D6) d [ppm] ： 179.99, 172.00, 158.09, 151.76, 147.20, 143
■ 35， 135.54, 133.43, 133.27, 129.56, 128.93, 127.91, 127.56, 124.44, 113
■ 26， 85.88， 79.14, 64.73， 62.55， 55.01, 46.85
MASS :ca led for C42H38N505； 738.35473, found； 738.35608
[0188] (2) 1-[3' ,5' -b i s (hyd r oxymethy I )-1' -methy I benzy I] -cytos ineの合成 化合物 C_2 528 mg ( 0.72 mmol ) を THF 10 mLに溶解し、 TBAF 2.0 mL を滴下し室温にて撹拌した。 1時間後、 溶液を濃縮した。 濃縮物からシリカゲ ルカラムクロマトグラフィー （ 酢酸ェチル v/v)
により目的物質を単離し、 白色結晶の化合物 C_ 3を得た後、 酢酸ェチルに よって結晶化させた （ 収量、 収率： 116mg， 0.44mmol, 62% ) 。
1H NMR (400MHz, DMS0-D6) d [ppm] ： 4.45 (4H， s, 3' ,5' -B i s (methy I ene) ) ， 5.48-5.53 (2H， d: J=17， V -methylene), 7.19-8.05 (8H， m, 2' ,4' ,6' -H, 6-N-benzoyl), 8.62 (1H, s, 8-H), 8.71 (1H, s, 2-H), 11, 18 (1H ， br， 6-NH)
13C NMR (隱 -D6) S [ppm] : 144.72， 143.01, 136.86, 136.58, 136.24, 133.
46， 132.41, 129.19, 128.84, 128.46, 125.38, 125.28, 125.23, 124.10, 1
23.93， 65.89， 62.68， 62.48， 48.60， 46.59
MASS： calcd for C21H19N503； 389.40746, found； no date
実施例 22
本実施例では、 合成した各種ヌクレオシド類似体を用いて、 固相ホスホロ アミダイド法に従い核酸自動合成機によってオリゴヌクレオチドを合成した 。 以下の表に合成したオリゴヌクレオチドの配列を示すとともに天然のヌク レオチオシド以外の合成ヌクレオシド類似体をそれぞれ示す。
[表 5]
Figure imgf000097_0002
[化 43]
Figure imgf000097_0001
なお、 表 5に示す各オリゴヌクレオチドの合成の際、 天然型各アミダイ卜 は 0. 1 M、 合成した各アミダイ卜は 0. 12 Mのァセトニトリル溶液に調整し、 天 然、 合成、 各 CPG担体を用いた。 それぞれの樹脂を各々の活性に基づき 1 mo I分をカラムに量り取り、 核酸自動合成機にセットした。 縮合時間は天然型 DN Aが 5分、 合成したアナログを含むものは 20分とし、 DMTr基を除去した状態で 合成を終了した。 [0191] 合成終了後、 CPG樹脂に結合したオリゴヌクレオチドを、 DNAに関しては、 2 8% NH3水溶液を 1.5 mL加え 55°Cで 12時間インキュベートし、 樹脂からの切り 出し及び脱保護を行った。 反応後のろ液をエツペンドルフチューブに移し、 減圧下乾固した。 残渣に loading solution ( 1 xTBE in 90% ホルミアミド ) 150 Lを加え 20 % PAGE*1により （500 V, 20 mA ) 目的のオリゴヌクレ ォチドを単離した。 目的のオリゴヌクレオチドを切り出し 0.1 M TEAA buffer *2、 1 mM EDTA*3水溶液 20 mLを加え、 12時間振とうした。 このろ液をァセトニ トリル 10 mし 0.1 M TEAA buffer 10 mLを流して平衡化した C-18逆相カラム (Sep-Pak ) に通し、 カラムに吸着させた。 ここでカラムを滅菌水で洗浄し て塩を取り除き 50 % ァセトニトリル水溶液 3 mLで溶出し、 減圧下乾固した
[0192] RNAに関しては、 CPG樹脂に結合したォリゴヌクレオチドをェタノール： NH3 = 3： 1水溶液 2 mLを加えて室温で 12時間振とうして樹脂からの切り出し及び 脱保護を行った。 反応後のろ液をエツペンドルフチューブに移し、 減圧下乾 固した。 残渣に 1 M TBAF in THF溶液 1 mLを加え、 12時間振とうした。 この反 応液を 0.1 M TEAA bufferで希釈して 30 mLとした。 この反応液を平衡化した C -18逆相カラム （S印- Pak ) に通し、 カラムに吸着させた。 ここでカラムを滅 菌水で洗浄して塩を取り除き 50% CH3CN in H20 3 mLで溶出し、 減圧下乾固し た。 残渣に loading solution ( 1 xTBE in 90 % ホルムアミド ） 100 μΐ を加え 20 % PAGEにより （500 V， 20 mA ) 目的のオリゴヌクレオチドを単離 した。 目的のオリゴヌクレオチドを切り出し 0.1 M TEAA buffer. 1 mM EDTA 水溶液 20 mLを加え、 12時間振とうした。 このろ液を平衡化した C-18逆相カラ ム （S印- Pak ) に通し、 カラムに吸着させた。 ここでカラムを滅菌水で洗浄 して塩を取り除き 50 % CH3CN in H20 3 mLで溶出し、 減圧下乾固した。
[0193] *1 40%アクリルアミド （ 19： 1 ) 溶液 *4
40mし 尿素 33.6g、 10xTBE buffer*5 8 mLを加えて溶解し、 水を加えて 80 mL とした。 最後に APS 56 mgを加えて溶解した後、 TEMED 40 Lを加えて振り混 ぜ、 1.5 mmスぺーサーを挟んで固定した 2枚のガラス板の間に流し込み、 1時間以上静 置して固化させた。 1 xTBE bufferを泳動用緩衝液として用いた。
*2 2 N TEM buffer (卜リエチルァミン 277.6mLを水に溶解させ、 酢酸で pH
7.0に調整し 1 Lとしたもの ） を 20倍に希釈して使用した。
*3 0.1 M EDTA水溶液 （EDTA■ 4Na 1.81gを水で 40mLに調整したもの） を 100 倍に希釈した。
*4 ァクリルアミド 190g、 Ν,Ν-ビスァクリルアミド、10gを水に溶解して 500mLに することで調整した。
*5 Tris 109g、 ホウ酸 55g、 EDTA - 2Na 7.43g水に溶解して 1 Lにすることで 調整した。
[0194] 合成したオリゴヌクレオチドは H20 1 mLに溶解し、 このものの希釈液の 260 nmにおける吸光度を測定し、 その収量を求めた。 また、 MAL -TOF / MSによ リ同定を行なった。 なお、 結果を表 5に併せて示す。
[0195] なお、 吸光度の測定にあたり、 オリゴヌクレオチドは水溶液とし、 波長 260 での吸光度 （ Abs26() ) が、 吸光度計の有効範囲になるように希釈した。 光路 長 （I ) 1 cmの吸光度測定用石英セルを用い、 室温にて Abs26Qを測定した。 0D 260値の計算には以下の式を用いた。 ここで Vは溶液の全量を示す。
0D260 (Μ -1 - mL-1 - cm-1) =Abs260 (Με-1) - V-1 (mL) ■ 1-1 (cm)
[0196] また、 N1p N2p N3p■ ■ ■ Nn-1p Nnで表される一本鎖オリゴヌクレオチドの モル吸光係数 e 260の算出には次式を用いた。
ε= 2 {ε (Ν1ρ Ν2ρ) +ε (Ν2ρ Ν3ρ) + - ■ - +ε (Νη-1ρ
Νη) } - {ε (Ν2) +ε (Ν3) +■ ■ - +ε (Νη-1)}
ここで、 e (Nn) はある核酸 Νηの e 260を示し、 e (Nn-1p Nn) はある核酸二 量体 Nn-1p Nnの ε:260を示す。
[0197] なお、 濃度 C (mol■ リ の算出は以下のとおりとした。 すなわち、 オリゴ ヌクレオチドを水溶液とし、 波長 260での吸光度 （Abs260) が、 吸光度計の有効 範囲になるように希釈し、 光路長 （I) 1 cmの吸光度測定用石英セルを用い、 室温にて Abs260を測定し、 以下の式に従い算出した。 C = Abs260 ■ ε 26o"1■ I "1
実施例 23
[0198] 本実施例では、 実施例 22で合成したヌクレオシド類似体を含む修飾オリ ゴヌクレオチドと非修飾オリゴヌクレオチドのニ本鎖形成能を比較するため に実施例 5に記載の van' t Hoff plotによる関係式を用いて熱力学的パラメ ータを算出した。
[0199] オリゴヌクレオチドの 50%融解温度 （ Tm ) 測定におけるそれぞれの鎖の 濃度は 3 Mになるように調整し、 測定用緩衝液 （ 10 mM NaH2P04-Na2HP04 ( pH 7.0 ) ， 100 mM NaCI ) 400 Lに溶解し、 95°Cで 3分間過熱後、 1時間 放置し常温に戻した。 そのサンプルのうち 350 Lを専用セルに入れ、 25°Cか ら 95°Cへと加熱 （A0.5°C / min) して吸光度の変化を測定することで 50o/o融 解温度 （ Tm ) を求めた。 また、 スタツキング効果測定では 1.0 μΜ、 2.0 u M、 3.0 μΜ、 4.0 μΜ、 5.0 μΜ、 6.0 Μのものを用いた。
[0200] 得られた結果と、 実施例 5に記載の式を用いて、 各オリゴヌクレオチドの 二本鎖形成時でのェンタルピー （厶 So) 、 エントロピー （ΔΗο) 、 自由エネ ルギ一変化 （AGo) を求めた。 結果を表 6及び図 1 2に示す。
[表 6]
Figure imgf000100_0001
Figure imgf000100_0002
Figure imgf000100_0003
[0201] 表 6及び図 1 2に示すように、 合成した類似体を含む修飾オリゴヌクレオ チドの非修飾ォリゴヌクレオチドとの 2本鎖形成能は、 非修飾ォリゴヌクレオ チド同士の 2本鎖形成能よりも不利であることが示唆された。 さらに、 導入し たアナログの数が増えることにより、 二本鎖形成には、 より不利になること も示唆された。
[0202] これは、 導入したアナログ部位に、 様々な立体構造変化が起き、 それが 2本 鎖形成能に大きく寄与したと考えられる。 糖部の平面化による塩基部、 リン 酸基部の自由度の減少、 糖部ベンゼン置換による自己鎖内および相補鎖間の リン酸間の距離の変化、 または自己鎖内のリン原子-塩基の距離の変化、 2鎖 の距離の変化などから影響される、 らせんおよび塩基間水素結合のゆがみが 、 2本鎖形成能を低下させたと推測できる。 以上のことから、 これら類似体を 用いるォリゴヌクレオチド修飾体に、 非修飾体間でのハイプリッド形成に対 する高い選択性を付与できることがわかった。
実施例 24
[0203] 合成した類似体を含む機能型修飾オリゴヌクレオチドを合成し、 その機能 を評価した。
[0204] ( 1 ) オリゴヌクレオチド及びォリゴヌクレオチド誘導体の合成
配列中に類似体を含むォリゴヌクレオチド誘導体及び非修飾ォリゴヌクレ ォチドを、 固相ホスホロアミダイド法に従って核酸自動合成機によって合成 した。 固相ホスホロアミダイト法は既に説明した方法に準じて行った。 合成 した化合物の構造は、 M A L D I—T O F
M Sによって確認した。 蛍光色素は常法に従い導入した。 以下にターゲット 配列と合成したォリゴヌクレオチド （モレキユラ一ビーコン用ォリゴヌクレ ォチド及び S i R N A用オリゴヌクレオチド） の配列及び当該配列に基づく構 造を示す。 [化 44]
タ一ゲッ卜 1： 3'-r(guc guc cuu ug cca ggu gaa cac gag acg uga gua a)- 5' タ一ゲッ卜 2： 3'-r(guc guc cuu ugp aca gcu qau cac caq acg uga gua a)- 5'
Beacon nature： MB ^ U C
5' -Flu- A A A A A A - C
3 -Dab- T T T T T T - C
C G
2 -O-Me
Beacon analogue： bMB G G U。
5' -Flu- Ab Ab Ab Ab Ab Ab- C
3'-Dab-TbTbTb TbTb Tb - C
c G
2 -O-Me
siRNA 1： 3 - TbTb - r( ccg gaa agu gau gag gau g )-5'
siRNA 2： 3 -TbTb - r( cau ecu cau cac uuu cc A Uc Ag Uc g )- 5'
実施例 25
[0205] 本実施例では、 モレキュラービーコンとしての修飾オリゴヌクレオチドの評 価をした。 合成した 2種類のモレキュラービーコン （M B (非修飾オリゴヌ クレオチド） 及び b M B (類似体を含む修飾オリゴヌクレオチド） にっき、 ターゲッ卜配列 1及び 2との熱的安定性を測定した。 結果を図 1 3に示す。
[0206] 図 1 3に示すように、 それぞれについて測定した Tmの結果によれば、 合成 した類似体を含む修飾オリゴヌクレオチド （b M B ) は、 非修飾のオリゴヌ クレオチド （M B ) に類似した熱的安定性を示した。 また、 実施例 2 3で測 定した T mを考慮すると、 非修飾ォリゴヌクレオチドとは安定な二本鎖を形 成しないが、 修飾オリゴヌクレオチド同士では比較的安定な二本鎖を形成す ることが示唆された。 また、 モレキュラービーコンのステム部分と、 ターゲ ッ卜と相補となるループ部分の Tmを比較してもループ部分の方が高く、 また 、 ループ部分がミスマッチとなると二本鎖を形成しないことも示された。 こ れは、 モレキュラービーコンのループ部分が相補となる配列が存在するとき だけハイブリダィズし、 ステム部分は天然の核酸とはハイブリダィズしない ため、 蛍光剤は容易にフリーになることが示唆され、 それによつて安定した 蛍光が見られるはずである。 このことは遺伝子解析ツールとして用いるモレ キュラービーコンとして有利である。
実施例 26
[0207] 本実施例では、 合成した 2種類の siRNA 1と siRNA 2についてヌクレアーゼ 耐性を評価した。 すなわち、 ェキソヌクレアーゼの 1つである蛇毒ホスホロジ エステラーゼ （SVP) を用いてェキソヌクレアーゼ耐性について検討した。
[0208] ( 1 ) siRNAの 5' 末端の32 P同位体標識
氷冷下 siRNAのアンチセンス鎖 10 0101を10 1^緩衝液2 //し 6 unit/ L T4ポリヌクレオチドキナーゼ 1 //し r-32P
ATP 2 L及び滅菌水 15 Lを混合し、 37°Cにて 30分間インキュベートした。 その後スピンカラムを用いて夾雑物を除去し、 未標識のセンス鎖 90 pmolを加 え、 オリゴヌクレオチドの総量を 100 pmolとした。 なお、 スピンカラムでの 精製は添付された取り扱い説明書にあるプロ卜コルに従った。
[0209] (2) SVPによる分解
氷冷下、 2 Mのオリゴヌクレオチドを 10 μΐ (20pmol) 、 SVP 1 u/mLを 8 //し 緩衝液 （250 mM
Tris-HCI, 50 mM MgCI2 (pH 8.0 ) ) を 6 L加え、 全量で 40 Lとなるように 滅菌水 （16 で調節した （オリゴヌクレオチド最終濃度 0.5 M)。 37°Cで インキュベートし、 1、 3、 5、 7、 10、 30、 60分おきにあらかじめ別のマイク 口チューブに分注しておいた loading solution ( 8 M urea XC BPB ) 5 a L中に、 反応液を 5 L加え、 各時間の反応溶液とした。 なお、 0分のサンプル は酵素を加えていないものとした。
[0210] 得られた S VP反応液を 20% urea PAGEにて分離した。 イメージングプレ ートを用いて分離したイメージを転写し、 このイメージを BAS 2000を用いて 取り込み、 RIイメージ解析ソフトにより画像処理及び分析を行い、 SVPに よる分解半減期を算出した。 結果を図 1 4に示す。 [0211] 図 1 4に示すように、 類似体を用いた修飾オリゴヌクレオチドは、 天然ヌ クレオシドのみからなる未修飾オリゴヌクレオチドに対して約 3倍程度のヌ クレアーゼ耐性を備えていることがわかった。
実施例 27
[0212] 本実施例では、 合成した 2種類の siRNA 1と siRNA 2とを s i RNAとして 用いてデュアルルシフェラーゼアツセィを行った （図 1 5参照） 。 デュアル ルシフェラーゼアツセィは、 実施例 8と同様にして行った。 結果を図 1 5に 示す。
[0213] 図 1 5に示すように、 修飾オリゴヌクレオチドからなる s i RNAは非修 飾ォリゴヌクレオチドからなる s i RNAよリルシフェラーゼ発現抑制が強く、 効 果的な s i RNAであることがわかつた。
[0214] 配列表フリーテキスト
配列番号 1〜4、 1 5， 1 6 ： s i RNA
配列番号 5〜 1 0 ：合成ォリゴヌクレオチド
配列番号 1 3、 1 4 ：モレキュラービーコン

Claims

請求の範囲
少なくとも 1個の以下の式 （1 ) で表される単位を有する、 オリゴヌクレオ チド誘導体。
[化 45]
Figure imgf000105_0001
[式中、 Aは独立して以下の式 （2)
[化 46]
Figure imgf000106_0001
Figure imgf000106_0002
Figure imgf000106_0003
Figure imgf000106_0004
Figure imgf000106_0005
Figure imgf000106_0006
CH又は Nを表す。 ] から選択される置換されていてもよい環式化合物含有基を表す。 ]
[2] 各 Aは、 式（2)中の化合物 2 a及び 2 bから選択される、 請求項 1に記載 のオリゴヌクレオチド誘導体。
[3] 以下の式 （3) で表される、 請求項 1又は 2に記載のオリゴヌクレオチド誘 導体。
[化 47]
Figure imgf000107_0001
(3)
[式中、 R1及び R2は、 それぞれ独立して水素又はヒドロキシル保護基を表 し、 各 X1は独立して 0、 S又は S eを表し、 各 X2は独立して OH若しくは O -、 SH若しくは S_、 56若し<は56_、 炭素数 1〜 4個のアルキル基又 はモルホリノ基を表し、 し m及び nは独立して 0以上の整数であり、 少な くとも一つが 1以上であり、 B及び Cは独立して改変されていてもよいオリ ゴヌクレオチドであって Bと Cを合わせた鎖長が 3以上のオリゴヌクレオチ ドを表す。 ただし、 B及び Cにおいてオリゴヌクレオチドの 3' 末端と 5' 末端の水酸基を含まない。 ]
X2は、 OH又は 0-である、 請求項 3に記載のオリゴヌクレオチド誘導体
[5] R1及び R2は Hである、 請求項 3又は 4に記載のオリゴヌクレオチド誘導 体。
[6] mは 0である、 請求項 3〜 5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド誘導 体。
[7] I及び mはいずれも 0である、 請求項 3〜 6のいずれかに記載のオリゴヌ クレオチド誘導体。
[8] I及び mは 0であり、 nは 1以上 5以下である、 請求項 3〜 7のいずれか に記載のォリゴヌクレオチド誘導体。 B及び Cは、 所定の遺伝子の mRN Aの部分配列又はその相補配列を有す る、 請求項 3〜 8のいずれかに記載のォリゴヌクレオチド誘導体。
B及び Cを合わせた鎖長は、 1 0以上 35以下である、 請求項 3〜9に記 載のォリゴヌクレオチド誘導体。
B及び Cはオリゴリポヌクレオチドである、 請求項 3〜1 0のいずれかに 記載のォリゴヌクレオチド誘導体。
遺伝子発現調節用オリゴヌクレオチド構築物であって、
請求項 1〜 1 1のいずれかに記載のォリゴヌクレオチド誘導体を有する、 構築物。
1本鎖及び 2本鎖 DNA、 1本鎖及び 2本鎖 RNA、 DNAZRNAキメ ラ並びに DNAZRNAハイブリツドから選択される構築物である、 請求項
1 2に記載の構築物。
アンチジーン、 アンチセンス、 ァプタマ一、 s i RNA、 m i RNA、 s h RN A及びリポザィムから選択される、 請求項 1 2又は 1 3に記載の構築 物。
ダングリングエンド部分に前記 Aを含むュニッ卜を有する、 請求項 1 2〜
1 4のいずれかに記載の構築物。
s i RN Aであって、 前記オリゴヌクレオチド誘導体において、 I及び mは
0であり、 nは 1又は 2であり、 3' 末端ダングリングエンド部分に前記 A を含むュニッ卜を有する、 請求項 1 5に記載の構築物。
遺伝子診断用オリゴヌクレオチド構築物であって、
請求項 1〜 1 1のいずれかに記載のォリゴヌクレオチド誘導体を有する、 構築物。
プローブ又はプライマーである、 請求項 1 7に記載の構築物。
以下の式 （4) で表される、 化合物。
[化 48]
W，0— A— OW2 (4) [式中、 各 Aは独立して以下の式 （2)
[化 49]
Figure imgf000109_0001
Figure imgf000109_0002
Figure imgf000109_0003
Figure imgf000109_0004
(2d)
H£C' CH2
Figure imgf000109_0005
Figure imgf000109_0006
[式（2 )中、 Zは、 C H又は Nを表す。 ]
から選択される置換されていてもよい環式化合物含有基を表し、 W 1は、 ヒド 口キシル保護基を表し、 W2は、 H、 ホスホロアミダイ卜基又は固相担体に結 合される若しくは結合された連結基を表す。 ]
[20] 各 Aは、 式（2 )中の化合物 2 a及び 2 bから選択される、 請求項 1 9に記 載の化合物。
[21 ] s i R N Aのダングリングエンドユニット用である、 請求項 1 9又は 2 0に 記載の化合物。
[22] オリゴヌクレオチド誘導体の製造方法であって、
請求項 1 9又は 2 0に記載の化合物から選択される 1種又は 2種以上を用 いる、 製造方法。
[23] オリゴヌクレオチドの修飾方法であって、
オリゴヌクレオチドに、 少なくとも 1個の以下の式 （1 ) で表される単位 を付加、 置換及び挿入のいずれか又はこれらを組み合わせて導入する、 方法
[化 50]
Figure imgf000110_0001
[式中、 Aは独立して以下の式 （2 )
Figure imgf000111_0001
Figure imgf000111_0002
Figure imgf000111_0003
Figure imgf000111_0004
Figure imgf000111_0005
Figure imgf000111_0006
少なくとも 1個の以下の式 （1 1 ) で表される単位を有する、 オリゴヌク レオチド誘導体 c
[化 52]
Figure imgf000112_0001
[式中、 Eは独立して以下の式 （1 2)
[化 53]
Figure imgf000112_0002
[式（1 2) 中、 Zは、 CH又は Nを表し、 BAS Eは、 以下の式 （1 3) の 1 3 a〜 1 3 eから選択される置換されていてもよい塩基を表す。 ]
[化 54]
Figure imgf000113_0001
(13a) (13b)
Figure imgf000113_0002
(13c) (13d) (13e)
(13)
前記オリゴヌクレオチド誘導体は、 以下の式 （1 4) で表される、 24に記載のォリゴヌクレオチド誘導体。
[化 55]
Figure imgf000113_0003
(14) [式中、 R1及び R2は、 それぞれ独立して水素又はヒドロキシル保護基を表 し、 各 X1は独立して 0、 S又は S eを表し、 各 X2は独立して OH若しくは O -、 SH若しくは S_、 56若し<は56_、 炭素数 1〜 4個のアルキル基又 はモルホリノ基を表し、 し m及び nは独立して 0以上の整数であり、 少な くとも一つが 1以上であり、 B及び Cは独立して改変されていてもよいオリ ゴヌクレオチドであって Bと Cを合わせた鎖長が 3以上のオリゴヌクレオチ ドを表す。 ただし、 B及び Cにおいてオリゴヌクレオチドの 3' 末端と 5' 末端の水酸基を含まない。 ]
[26] 遺伝子発現調節用オリゴヌクレオチド構築物であって、 請求項 24又は 25 に記載のオリゴヌクレオチド誘導体を有する、 構築物。
[27] 診断用オリゴヌクレオチド構築物であって、 請求項 24又は 25にずれかの オリゴヌクレオチド誘導体を有する、 構築物。
[28] 以下の式 （1 5) で表される、 ヌクレオシド類似体。
[化 56]
W10-E-OW2
[式中、 各 Eは独立して以下の式 （1 2) ;
[化 57]
Figure imgf000114_0001
[式中、 Zは、 CH又は Nを表し、 B AS Eは、 以下の式 （1 3) の 1 3 a〜 1 3 eから選択される置換されていてもよい塩基を表し、 [化 58]
Figure imgf000115_0001
(13c) (13d) (13e)
(13)
W1は、 H又はヒドロキシル保護基を表し、 W2は、 H、 ホスホアミダイト基 又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。 ]
[29] s i RN Aのダングリングュニッ卜用である、 請求項 28に記載のヌクレ オシド類似体。
[30] モレキュラービーコンのステム又はループ用である、 請求項 28に記載の ヌクレオシド類似体。
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Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010055789A1 (ja) 2008-11-14 2010-05-20 独立行政法人科学技術振興機構 オリゴヌクレオチド誘導体、ラベル化剤及びその利用
WO2010058824A1 (ja) * 2008-11-19 2010-05-27 国立大学法人岐阜大学 間葉系細胞の分化を調節するための薬剤及びその利用
JP2010189276A (ja) * 2009-02-13 2010-09-02 Gifu Univ オリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド誘導体を用いたオリゴヌクレオチド構築物、オリゴヌクレオチド誘導体を合成するための化合物及びオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法
JP2010195698A (ja) * 2009-02-24 2010-09-09 Gifu Univ オリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド誘導体を用いたオリゴヌクレオチド構築物、オリゴヌクレオチド誘導体を合成するための化合物及びオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法
CN102666480A (zh) * 2009-12-08 2012-09-12 国立大学法人岐阜大学 芳香族化合物、低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体、低聚核苷酸衍生物及低聚核苷酸构建物
WO2014084354A1 (ja) 2012-11-29 2014-06-05 国立大学法人岐阜大学 Ｒｎａ干渉剤、その製造方法及びその利用
WO2017047594A1 (ja) * 2015-09-14 2017-03-23 国立大学法人岐阜大学 ヌクレオシド誘導体及びその利用
WO2018079841A1 (ja) * 2016-10-31 2018-05-03 国立大学法人岐阜大学 二本鎖核酸分子、およびその用途
JP2018153164A (ja) * 2017-03-21 2018-10-04 国立大学法人岐阜大学 細胞増殖抑制剤およびがんの予防・治療剤
US20190144678A1 (en) * 2016-05-11 2019-05-16 Sony Corporation Ultra bright dimeric or polymeric dyes
US11874280B2 (en) 2018-03-19 2024-01-16 Sony Group Corporation Use of divalent metals for enhancement of fluorescent signals
US11931419B2 (en) 2017-11-16 2024-03-19 Sony Group Corporation Programmable polymeric drugs
US11939474B2 (en) 2013-08-22 2024-03-26 Sony Group Corporation Water soluble fluorescent or colored dyes and methods for their use
US11945955B2 (en) 2019-09-26 2024-04-02 Sony Group Corporation Polymeric tandem dyes with linker groups
US11981820B2 (en) 2016-04-01 2024-05-14 Sony Group Corporation Ultra bright dimeric or polymeric dyes
US12006438B2 (en) 2018-06-27 2024-06-11 Sony Group Corporation Polymeric dyes with linker groups comprising deoxyribose
US12018159B2 (en) 2017-07-27 2024-06-25 Sony Group Corporation Ultra bright dimeric or polymeric dyes and methods for preparation of the same

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10512569A (ja) * 1995-01-18 1998-12-02 ファーマジェニックス，インコーポレイテッド 非ヌクレオチドリンエステルオリゴマー
JP2000506513A (ja) * 1996-02-01 2000-05-30 ファーマジェニックス，インコーポレイテッド 非ヌクレオチドリンエステルオリゴマー
JP2005200405A (ja) * 2003-12-02 2005-07-28 F Hoffmann La Roche Ag 分子ロッドを含むオリゴヌクレオチド
WO2006027862A1 (ja) * 2004-09-07 2006-03-16 Gifu University ヌクレオシド類似体、およびそれを含むオリゴヌクレオチド類似体

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10512569A (ja) * 1995-01-18 1998-12-02 ファーマジェニックス，インコーポレイテッド 非ヌクレオチドリンエステルオリゴマー
JP2000506513A (ja) * 1996-02-01 2000-05-30 ファーマジェニックス，インコーポレイテッド 非ヌクレオチドリンエステルオリゴマー
JP2005200405A (ja) * 2003-12-02 2005-07-28 F Hoffmann La Roche Ag 分子ロッドを含むオリゴヌクレオチド
WO2006027862A1 (ja) * 2004-09-07 2006-03-16 Gifu University ヌクレオシド類似体、およびそれを含むオリゴヌクレオチド類似体

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACKERMANN D. ET AL.: "Nonnucleosidic Base Surrogates: The Effect of 1,2-Disubstituted Phenanthrenes on DNA Duplex Stability", HELVETICA CHIMICA ACTA, vol. 87, 2004, pages 2790 - 2804, XP003016651 *
ESTEBAN J.A. ET AL.: "Structural basis or heterogeneous kinetics: Reengineering the hairpin ribozyme", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 95, 1998, pages 6091 - 6096, XP002234998 *
KAWATA K. ET AL.: "Dangling End Bui o Kagaku Shushoku shita siRNA no Gosei to Sono RNAase L Hatsugen Yokusei Koka", CHUBU KAGAKU KANKEIGAKU KYOKAI SHIBU RENGO SHUKI TAIKAI KOEN YOKOSHU, vol. 35TH, 2004, pages 38, XP003016652 *
UENO Y. ET AL.: "Benzene-Phosphate Backbone kara Naru Jinko Kakusan no Gosei to Sono Seishitsu", CSJ: THE CHEMICAL SOCIETY OF JAPAN DAI 84 KAI SHUNKI NENKAI - KOEN YOKOSHU II, 2004, pages 1052, XP003016649 *
UENO Y. ET AL.: "Benzene-Phosphate Backbone o Motsu Shinki Kakusan Analog no Gosei", CSJ: THE CHEMICAL SOCIETY OF JAPAN DAI 83 KAI SHUNKI NENKAI - KOEN YOKOSHU II, 2003, pages 1113, XP003016650 *
UENO Y. ET AL.: "Overhung Bui ni Shiyosei Zanki o Donyu shita siRNA no Gosei to Sono Tanpaku Hatsugen Yokusei Koka", CSJ: THE CHEMICAL SOCIETY OF JAPAN KOEN YOKOSHU, vol. 86TH, no. 2, 13 March 2006 (2006-03-13), pages 841, XP003016647 *
UENO Y. ET AL.: "Synthesis and Properties of Nucleic Acid Analogues Consisting of a Benzene-Phosphate Backbone", J. ORG. CHEM., vol. 70, 2005, pages 7925 - 7935, XP003016648 *

Cited By (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8354515B2 (en) 2008-11-14 2013-01-15 Japan Science And Technology Agency Oligonucleotide derivative, labeling agent and use for labeling agent
JP4815015B2 (ja) * 2008-11-14 2011-11-16 独立行政法人科学技術振興機構 オリゴヌクレオチド誘導体、ラベル化剤及びその利用
JPWO2010055789A1 (ja) * 2008-11-14 2012-04-12 独立行政法人科学技術振興機構 オリゴヌクレオチド誘導体、ラベル化剤及びその利用
WO2010055789A1 (ja) 2008-11-14 2010-05-20 独立行政法人科学技術振興機構 オリゴヌクレオチド誘導体、ラベル化剤及びその利用
WO2010058824A1 (ja) * 2008-11-19 2010-05-27 国立大学法人岐阜大学 間葉系細胞の分化を調節するための薬剤及びその利用
JP5794559B2 (ja) * 2008-11-19 2015-10-14 国立大学法人岐阜大学 間葉系細胞の分化を調節するための薬剤及びその利用
JP2010189276A (ja) * 2009-02-13 2010-09-02 Gifu Univ オリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド誘導体を用いたオリゴヌクレオチド構築物、オリゴヌクレオチド誘導体を合成するための化合物及びオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法
JP2010195698A (ja) * 2009-02-24 2010-09-09 Gifu Univ オリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド誘導体を用いたオリゴヌクレオチド構築物、オリゴヌクレオチド誘導体を合成するための化合物及びオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法
EP2511260A1 (en) * 2009-12-08 2012-10-17 Gifu University Aromatic compound, modification carrier that uses same and is used for synthesizing an oligonucleotide derivative, oligonucleotide derivative, and oligonucleotide construct
US8633304B2 (en) 2009-12-08 2014-01-21 Gifu University Oligonucleotide derivative comprising an aromatic compound
CN102666480B (zh) * 2009-12-08 2014-04-09 国立大学法人岐阜大学 芳香族化合物、低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体、低聚核苷酸衍生物及低聚核苷酸构建物
JP5721180B2 (ja) * 2009-12-08 2015-05-20 国立大学法人岐阜大学 芳香族化合物、並びに、それを用いたオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体、オリゴヌクレオチド誘導体及びオリゴヌクレオチド構築物
CN102666480A (zh) * 2009-12-08 2012-09-12 国立大学法人岐阜大学 芳香族化合物、低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体、低聚核苷酸衍生物及低聚核苷酸构建物
EP2511260A4 (en) * 2009-12-08 2013-11-13 Univ Gifu AROMATIC COMPOUND, MODIFICATION VECTOR USING THE SAME AND IS USED TO SYNTHESIZE AN OLIGONUCLEOTIDE DERIVATIVE, OLIGONUCLEOTIDE DERIVATIVE, AND OLIGONUCLEOTIDE CONSTRUCTION
WO2014084354A1 (ja) 2012-11-29 2014-06-05 国立大学法人岐阜大学 Ｒｎａ干渉剤、その製造方法及びその利用
JPWO2014084354A1 (ja) * 2012-11-29 2017-01-05 国立大学法人岐阜大学 Ｒｎａ干渉剤、その製造方法及びその利用
US10006024B2 (en) 2012-11-29 2018-06-26 Gifu University RNA interference agent, method for producing same, and use therefor
US11939474B2 (en) 2013-08-22 2024-03-26 Sony Group Corporation Water soluble fluorescent or colored dyes and methods for their use
WO2017047594A1 (ja) * 2015-09-14 2017-03-23 国立大学法人岐阜大学 ヌクレオシド誘導体及びその利用
JPWO2017047594A1 (ja) * 2015-09-14 2018-10-11 国立大学法人岐阜大学 ヌクレオシド誘導体及びその利用
US11981820B2 (en) 2016-04-01 2024-05-14 Sony Group Corporation Ultra bright dimeric or polymeric dyes
US20190144678A1 (en) * 2016-05-11 2019-05-16 Sony Corporation Ultra bright dimeric or polymeric dyes
US11685835B2 (en) * 2016-05-11 2023-06-27 Sony Corporation Ultra bright dimeric or polymeric dyes
US10874688B2 (en) 2016-10-31 2020-12-29 Gifu University Double-stranded nucleic acid molecule and use thereof
WO2018079841A1 (ja) * 2016-10-31 2018-05-03 国立大学法人岐阜大学 二本鎖核酸分子、およびその用途
JP2018153164A (ja) * 2017-03-21 2018-10-04 国立大学法人岐阜大学 細胞増殖抑制剤およびがんの予防・治療剤
US12018159B2 (en) 2017-07-27 2024-06-25 Sony Group Corporation Ultra bright dimeric or polymeric dyes and methods for preparation of the same
US11931419B2 (en) 2017-11-16 2024-03-19 Sony Group Corporation Programmable polymeric drugs
US11874280B2 (en) 2018-03-19 2024-01-16 Sony Group Corporation Use of divalent metals for enhancement of fluorescent signals
US12006438B2 (en) 2018-06-27 2024-06-11 Sony Group Corporation Polymeric dyes with linker groups comprising deoxyribose
US11945955B2 (en) 2019-09-26 2024-04-02 Sony Group Corporation Polymeric tandem dyes with linker groups

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