JP2010189276A - オリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド誘導体を用いたオリゴヌクレオチド構築物、オリゴヌクレオチド誘導体を合成するための化合物及びオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この化合物は、siRNAのダングリングエンドの化学修飾用のユニットとして用いることができる。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、上記式(1)で示されるユニットを、オリゴヌクレオチド誘導体の少なくとも1箇所に有するものである。このユニットの存在により、優れたヌクレアーゼ耐性を得ることができる。このようなユニットは、配列既知又は配列未知のオリゴヌクレオチドに対して、付加、置換又は挿入のいずれか、あるいは、これらを組み合わせて導入することができ、こうして本発明のオリゴヌクレオチド誘導体とすることができる。なお、ここでいうオリゴヌクレオチドとは、改変されてもよいオリゴヌクレオチドである。
本発明のオリゴヌクレオチド構築物は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を1種又は2種以上有している。本オリゴヌクレオチド構築物における本オリゴヌクレオチド誘導体の種類や組み合わせにより、本構築物は、1本鎖DNA、2本鎖DNA、1本鎖RNA、2本鎖RNA、DNA/RNAキメラ及びDNA/RNAハイブリツド等の形態をそれぞれあるいは組み合わせた形態とすることができる。なお、既に説明したように、本オリゴヌクレオチド誘導体を構成するオリゴヌクレオチド部分は、改変されたオリゴヌクレオチドを含んでいるため、本オリゴヌクレオチド構築物においても改変形態をオリゴヌクレオチドが含まれることがある。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法は、上記した本発明の化合物I〜IVを用いることを特徴とする。オリゴヌクレオチドは従来公知の核酸合成法によって得ることができるため、こうした核酸合成法のオリゴヌクレオチド合成工程中、式(1)のユニット又はユニットl〜ユニット3を導入したい部位において、適宜本発明の化合物I〜IVを利用することにより、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を製造することができる。
さらに、式(1)のユニット及びユニットl〜ユニット3のうち2種類以上を有するオリゴヌクレオチド誘導体は、本化合物I〜IVを組み合わせて用いることにより得ることができる。
オリゴヌクレオチドの修飾方法は、配列既知又は配列未知のオリゴヌクレオチドに少なくとも1個の式(1)のユニットを付加、置換及び挿入のいずれかあるいはこれらを組み合わせて導入することができる。こうした修飾により、ヌクレアーゼ耐性の他、サイレンシング効果の高いRNA構築物を得ることができる。式(1)のユニットの導入は、オリゴヌクレオチド誘導体の製造方法に準じて実施すればよい。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、siRNAやアンチセンス等として機能するように構築することで、遺伝子発現抑制剤として利用できる。また、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、ヒト及び非ヒト動物における疾患の予防・治療用医薬組成物の有効成分として用いることができる。例えば、遺伝子発現に伴う疾患に対して、遺伝子発現抑制剤として構築した本発明のオリゴヌクレオチド誘導体はこうした疾患の予防や治療に有効である。
なお・本明細書においては、以下の略語及び略号を用いる。
Ar:アルゴン(argon)
BzCl=塩化べンゾイル(benzoyl chloride)
CPG:コントロールドポアガラス(controllde pore glass)
DEAD:ジエチルアゾカルボキシレート(diethyl azodicarboxylate)
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン(diisopropylethylamine)
DMAP:4一ジメチルアミノピリデイン(4−dimethylaminopyrideine)
DMF:ジメチルホルムアミド(dimethylformamide)
DMSO:ジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide)
DMTrCl:ジメトキシトリチルクロライド(dimethoxytritylchloride)
dsRNA:二重鎖RNA(double Strand RNA)
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
HPLC:高速液体クロマトグラフィー(high Performanc liquid Comatgraphy)
HRHS:高分解能質量スペクトロメトリ (high−resolution mass spectrometry)
MS:質量分析(MASS Spectroscopy)
NMR:核磁気共鳴(nuclear magnetic resonance)
PHO:ホスホロアミドモルホルノオリゴヌクレオチド(phosphoroamidite morpholino
oligonuoleotide)
RISC:RNA誘導サイレンシング複合体(RNA−induced Silencing Complex)
WSC:1−エチルー3−(3−ジメチルアミノブロビル)−カルポジイミドハイドロクロライド(1−methy−3−(3−dimethylaminopropyl)−carbodiimide,hydro chloride)
<フルオロメチルベンゼンユニットの合成>
Trihydroxymethylbenzene(8)の合成
出発原料である
Trimethyl-1,3,5-Benzene-Tricarboxylate(4.00g,15.9 mmol)をdryTHF25
mLに溶解し、LiAlH4(1.80g,3eq)をdryTHF75mLに懸濁し氷冷した。氷冷下、出発原料/THFをLiAlH4/THFに滴下し撹拌した。8時間後、ethanolにより氷浴下でクエンチングした。反応液をセライトろ過することにより沈殿物を除き、ろ液を濃縮した。濃縮物からシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHCl3:MeOH=7:1→5:1)により目的物質を単離し、白色結晶の化合物8(2.34g,13.9mmol,88%)を得た。
1H NMR (400MHz, DMSO- d6) δ[ppm]:7.11(3H,s, Ph-2,4,6)、5.13(3H, s, OH-1’,3’,5’)、4.46(6H,s, -CH2-1’,3’,5’)
一晩真空乾燥させた化合物8(1.52g,9.01mmol)をdry CH2Cl2(45mL,0.2M solution)とdry pyridine(15mL)に溶解させた。次にBzCl(2.20mL, 2.1eq.)を加え、Ar雰囲気下で約8時間攪拌した。TLC(CHCl3 : MeOH=30: 1)にて反応の進行を確認した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルクロマトグラフィー(CHCl3:MeOH=70:1→30:1→10:1)にて単離精製し、目的化合物9(2.06g,5.46mmol, 61%)を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ[ppm]:8.08(4H, d, -COPh-2,6)、7.57 (2H, t, -COPh-4)、7.46-7.42(7H,m, Ph-2,4,6 and -COPh-3,5)、5.39(4H,s, -CH2-3’,5’)、4.75(2H,s, -CH2-1’)
fluoromethyl- 3,5- dibenzoyloxymethylbenzene(10)の合成
一晩真空乾燥させた化合物9(2.06g,5.46mmol)をdry CH2Cl2(54.6mL,0.1M solution)に溶解させた。続いて氷浴下、DAST(1.43mL,2eq)を徐々に加え、2時間撹拌させた。TLC(Hex:EtOAc=2:1)にて反応の進行を確認した。MeOHでクエンチングを行い、一度溶液を濃縮した後、EtOAcとsat.NaHCO3 aq.で抽出し、有機層をsat. NaCl aq.で洗浄の後、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、シリカゲルクロマトグラフィー(Hex:EtOAc=5:1)で単離し、目的化合物10(1.24g,3.28mmol, 62%)を得た。
1H NMR (400MHz, DMSO- d6) δ[ppm]:8.07(4H, d, -COPh-2,6)、7.58(2H,t, -COPh-4)、7.52(3H, s, Ph-2,4,6)、7.48(4H,t, COPh-3,5)、5.43(2H, br, -CH2-1’)、4.75(4H,s, -CH2-3’,5’)
一晩真空乾燥させた化合物10(1.24g,3.28mmol)をdry CHCl3(10mL)とdryMeOH(50mL)に溶解させた。続いて氷浴下、CH3ONa in MeOH(2.5mL,0.052eq)を徐々に加え、Ar雰囲気下で24時間撹拌させた。TLC(Hex:EtOAc=4:1)にて反応の進行を確認した。その後80%酢酸を加え、pH=7を確認した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルクロマトグラフィー(EtOAc only)で単離し、目的化合物11(0.40g,2.36mmol, 72%)を得た。
1H NMR (400MHz, DMSO- d6) δ[ppm]:7.21(3H,s, Ph-2,4,6)、5.38(2H, d, -CH2-1’)、4.21(2H,t, OH-3’,5’)、4.49(4H, d, -CH2-3’,5’)
fluoromethyl- 3- (4,4’- dimethoxytrityloxy) methyl- 5- hydroxymethylbenzene(12)の合成
一晩真空乾燥させた化合物11(400mg,2.4mmol)をdry pyridine(24mL,0.1M solution)に溶解し、氷浴下で4,4’-dimethoxytrityl chloride(880mg,1.1eq)を加え、Ar雰囲気下で3時間半攪拌した。TLC(Hex:EtOAc=1:1)にて反応の進行を確認した。その後、EtOAcと水及びsat.NaHCO3 aq.で抽出し、有機層をsat. NaCl aq.で洗浄の後、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、シリカゲルクロマトグラフィー(Hex:EtOAc=1:1)で単離し、化合物12(0.31g,0.66mmol, 28%)を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ[ppm]:7.51〜6.82(16H,m, Tr and Ph-2,4,6)、5.39(2H,d, -CH2-1’)、4.72(2H,d, -CH2-5’)、4.20(2H,s, -CH2-3’)、3.80 (6H, s, -Tr-OCH3)
19F NMR (372MHz, CDCl3) δ[ppm]:-143.37
グローブバック中、完全無水条件下で反応操作を行った。一晩真空乾燥させた化合物12(150mg,0.31mmol)をdry THF(3.2mL,0.1M solution)に溶解させ、Hunig’s Base(0.16mL,3eq)と亜リン酸化試薬(0.11mL, 1.5eq)を加えた。その後グローブバックから取り出し、Ar雰囲気下で0.5時間攪拌した。TLC(Hex: EtOAc=1:1)により原料の消失を確認した。その後CHCl3とsatNaHCO3 aqで抽出し、有機層をsat NaClaqで洗浄し、無水Na2SO4を加え乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルクロマトグラフィー(Hex: EtOAc=1: 1)にて単離精製し、目的化合物13(0.19g,0.27mmol, 87%)を得た。
31P NMR (160MHz, CDCl3)
δ[ppm]:149.04
一晩真空乾燥した化合物12(160mg,0.33mmol)をdry DMF(3.3mL,0.1Msolution)に溶解し、そこにDMAP(4mg,0.1eq)と無水コハク酸(100mg, 3eq)を加えAr雰囲気下、室温で32時間攪拌した。TLC(Hex:EtOAc=1:1)で原料の消失を確認した。その後、EtOAcとsat.NaHCO3 aq.で抽出し、有機層をsat. NaCl aq.で洗浄、無水Na2SO4で乾燥した。溶媒を減圧留去し、目的中間体化合物をmixtureで得た。
一晩真空乾燥した中間体(mixture; スクシニル化が100%進行したと仮定。0.33mmol, CPG:4eq)をAr雰囲気下、dryDMF(8.3mL, CPG:0.01Msolution)に溶解させ、CPG樹脂(77μmol/g,1.07g, 0.083mmol)を加えて溶液となじませた。その後WSC(250mg,CPG:4eq)を加え、室温で一晩振とうした。この反応液をpyridineで洗浄し、樹脂を回収した後、これに0.1M DMAP in(pyridine:無水酢酸=9:1)を30mL加え、室温で一晩振とうした。次の日さらにこの反応液をpyridine、EtOH、acetonitrileで洗浄し、回収した樹脂を一晩真空乾燥した。得られたCPG樹脂14の活性を測定した。活性値は45.2 μmol/gであった。
以上のようにして得られた、アミダイト体である化合物13及び化学修飾されたCPG樹脂14を用いて、下記表1に示した配列(この配列はRenilla Luciferaseをターゲットにするものである)のオリゴヌクレオチドを核酸自動合成により合成した。そして、得られたオリゴヌクレオチドを水溶液とし、波長260での吸光度(Abs260)を計測した。光路長(l)を考慮し、濃度C (mol/L) の算出は次式を用いた。
C = Abs260 ・ε260 -1・l
-1
antisense(as)鎖とsense(s)鎖をそれぞれ等モル量ずつ合わせ、アニーリングすることにより実施例の2本鎖siRNAとした。2本鎖のTm値(50%解離温度)をそれぞれ計測した。結果を表1に示す。
<メチルベンゼンユニットの合成>
比較例では、実施例で用いた上記式(1)に示すフルオロメチルベンゼンユニットに替えて、メチルベンゼンユニットを用い、実施例と同様な合成を行なった。すなわち、下記合成経路に示すように、5-メチルイソフタル酸(化合物1)を出発原料とし、イオン交換樹脂のDOWEX(登録商標)(H+型)を用いエステル化反応を行い化合物2を得た。次にこのエステル体をLiBH4によって還元し、ジオール体である化合物3を得た。さらに化合物3の一方の水酸基をDMTr化し、トリチル体である化合物4を得た後、これを亜リン酸化することでアミダイト体である化合物5を得た。また化合物4からスクシニル化を経てCPG担体である化合物6を得た。各工程の詳細を以下に示す。
dimethylcarboxytoluene(2)の合成
一晩真空乾燥した原料、5-メチルイソフタル酸(560mg, 3.35mmol)をCH3OH(100mL)に溶かし、そこへH+ 条件に活性化したDOWEX(登録商標)を50mLを加え、14時間撹拌した。反応の経過をTLC(EtOAc: MeOH=3:1)で確認したが変化が見られなかったので、WSC(1.92g, 3eq)を加えた。90分後、原料の消失を確認した。綿栓ろ過でDOWEXの除去を行った後、シリカゲルクロマトグラフィー(Hex:EtOAc=1:1)にて単離し、目的化合物2(520mg,
2.68mmol, 80%)を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ[ppm]:8.49(1H,s,Ph-4)、8.05(2H,s,Ph-2,4,6)、3.95(6H,s,-OCH3)、2.46(3H,s, CH3 -Ph)
一晩真空乾燥した化合物2(1.35g,6.95mmol)をdry THF(34.8mL,0.2 M solution)に溶解させ、そこにLiBH4(0.76g,5eq)を加え、60℃で16時間撹させた。反応の進行をTLC(Hex:EtOAc=1:1)にて確認し、反応液に氷浴中でsat NaHCO3 aqを加えLiBH4を失活させた後、溶媒を減圧留去した。その後、セライトろ過を行い無機物の除去を行った。最後にシリカゲルクロマトグラフィー(Hex:EtOAc=2:1)にて単離し、目的化合物3(0.75g,4.92mmol, 71%)を得た。
1H NMR (400MHz,DMSO-d) δ[ppm]:7.11(3H,s, Ph-2,4,6)、5.13(3H, s, -CH2-3’,5’)、3.80(6H,s, -OCH3)、2.11(3H,s, CH3 -Ph)
一晩真空乾燥させた化合物3(0.75g,4.9mmol)をdry pyridine(35mL,0.15M solution)に溶解し、氷浴下で4,4’-dimethoxytrityl chloride(1.83g,1.1eq)を加え、Ar雰囲気下で24時間攪拌した。TLC(Hex:EtOAc=1:1)にて反応の進行を確認した。その後、EtOAcと水及びsat.NaHCO3 aq.で抽出し、有機層をsat. NaCl aq.で洗浄の後、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、中性シリカゲルクロマトグラフィー(Hex:EtOAc=2:1)で単離し、化合物4(0.97g,2.14mmol, 44%)を得た。
1H NMR (400MHz,CDCl3) δ[ppm]:7.52〜6.82(16H,m, Tr and Ph-2,4,6)、4.66 and 4.13(4H,s, -CH2-3’,5’)、3.80(6H,s, -OCH3)、2.11(3H,s, CH3 -Ph)
グローブバック中、完全無水条件下で操作を行った。一晩真空乾燥させた化合物4(150mg,0.31mmol)をdry THF(3.2mL,0.1M solution)に溶解させ、Hunig’s Base(0.16mL,3eq)と亜リン酸化試薬(0.11mL, 1.5eq)を加えた。その後グローブバックから取り出し、Ar雰囲気下で0.5時間攪拌した。TLC(Hex: EtOAc=1:1)により原料の消失を確認した。その後CHCl3とsat.NaHCO3 aq.で抽出し、有機層をsat. NaCl aq.で洗浄し、無水Na2SO4を加え乾燥した。溶媒を減圧留去後、中性シリカゲルクロマトグラフィー(Hex:EtOAc=1:1)にて単離精製し、目的化合物5(0.19g,0.27mmol, 87%)を得た。
31P NMR (160MHz, CDCl3)
δ[ppm]:149.04
一晩真空乾燥した化合物4(0.97g,2.14mmol)をdry DMF(21.4mL,0.1Msolution)に溶解し、そこにDMAP(26mg,0.1eq)と無水コハク酸(0.64g, 3eq)を加えAr雰囲気下、室温で43時間攪拌した。TLC(Hex:EtOAc=1:1)で原料の消失を確認した。その後、EtOAcとsat.NaHCO3 aq.で抽出し、有機層をsat. NaCl aq.で洗浄、無水Na2SO4で乾燥した。溶媒を減圧留去し、目的中間体化合物4´(1.47g, 2.71mmol)をmixtureで得た。
一晩真空乾燥した中間体(0.62mmol, CPG:4eq)をAr雰囲気下、dryDMF(14.5mL, CPG:0.02Msolution)に溶解させ、CPG樹脂(77μmol/g,3.73g, 0.29mmol)を加えて溶液となじませた。その後WSC(220mg,CPG:4eq)を加え、室温で一晩振とうした。この反応液をpyridineで洗浄し、0.1M DMAP溶液(pyridine:無水酢酸=9:1)
を30mL加え、室温で一晩振とうした。次の日さらにこの反応液をpyridine、EtOH、acetonitrileで洗浄し、一晩真空乾燥した。得られたCPG樹脂6の活性を測定した。活性値は33.2 μmol/gであった。
以上のようにして得られた、アミダイト体である化合物5及び化学修飾されたCPG樹脂6を用いて、実施例と同じ配列のオリゴヌクレオチドを核酸自動合成により合成した。そして、得られたオリゴヌクレオチドを水溶液とし、波長260での吸光度(Abs260)を計測した。計測方法は実施例のsiRNAの測定と同様に行った。さらに、こうして得られたantisense(as)鎖とsense(s)鎖をそれぞれ等モル量ずつ合わせ、アニーリングすることにより比較例の2本鎖siRNAとした。2本鎖のTm値(50%解離温度)をそれぞれ計測した。結果を表2に示す。
上記のようにして得られた実施例及び比較例のsiRNA2本鎖及び天然型のsiRNA2本鎖を用い、HeLa細胞を用いたDual Luciferase repoter assayを行い、ノックダウン効果を評価した。合成したsiRNAはRenilla Luciferaseをターゲットにしており、この遺伝子とコントロール遺伝子(firefly Luciferase)を発現するベクターとsiRNAを同時にHeLa細胞にトランスフェクションすることで、そのノックダウン効果を測定した。なお、天然型のsiRNA2本鎖のダングリングエンドはチミン塩基が2つ並んだヌクレオチドからなる。
Claims (21)
- R1及びR2はHであることを特徴とする請求項3に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
- bは0であることを特徴とする請求項3又は4記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
- a及びbはともに0であることを特徴とする請求項3乃至5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
- cは1以上5以下であることを特徴とする請求項6記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
- A及びBは、所定の遺伝子mRNAの部分配列又はその相補配列を有する請求項3乃至7のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
- A及びBを合わせた鎖長は、10以上35以下である請求項3乃至8のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
- A及びBはオリゴリボヌクレオチドであることを特徴とする請求項3乃至9のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
- 遺伝子発現調節用オリゴヌクレオチド構築物であって、
請求項1乃至10のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体を有する構築物。 - 1本鎖及び2本鎖DNA、1本鎖及び2本鎖RNA、DNA/RNAキメラ並びにDNA/RNAハイブリッドから選択される遺伝子発現調節用オリゴヌクレオチド構築物であって請求項11に記載の構築物。
- アンチジーン、アンチセンス、アプタマー、siRNA、miRNA、shRNA及びリポザイムから選択される請求項11又は12に記載の構築物。
- 遺伝子診断用オリゴヌクレオチド構築物であって、請求項1乃至10のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド誘導体を有する構築物。
- プローブ又はプライマーであることを特徴とする請求項16に記載の構築物。
- siRNAのダングリングエンドユニット用である請求項18に記載の化合物。
- 請求項18に記載の化合物から選択される1種又は2種以上を用いることを特徴とするオリゴヌクレオチドの修飾方法。
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