WO2014084354A1 - Ｒｎａ干渉剤、その製造方法及びその利用 - Google Patents

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paz domain
interference agent
strand
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幸夫 北出
礼美 中島
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国立大学法人岐阜大学
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    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Definitions

  • RNA interference hereinafter, also simply referred to as RNAi
  • RNAi RNA interference
  • RNAi can cause degradation of mRNA in a sequence-specific manner and suppress expression of a target gene.
  • SiRNA and miRNA causing RNAi are expected to be used for functional analysis of genes and clinical application from the viewpoint of simplicity as a technology and high gene suppression effect.
  • siRNA double-stranded siRNA or miRNA is usually taken up into a protein complex called RISC and dissociated into single strands in the cell.
  • the strand that remains in the RISC as it is and participates in gene expression is called a guide strand (antisense strand), and the other strand released from the RISC is called a passenger strand (sense strand).
  • the RISC complex containing the guide strand recognizes the target mRNA having a sequence complementary to the guide strand, and cleaves the target mRNA by the slicer activity of ago2. .
  • miRNA the target mRNA is recognized and the translation process is suppressed. As a result, it is believed that the expression of the target gene is suppressed.
  • the passenger chain may be incorporated as if it were a guide chain.
  • a so-called off-target effect occurs.
  • the off-target effect is a phenomenon that suppresses other genes that are not originally intended other than the target gene.
  • RNAi when the passenger strand is incorporated into RISC, the base sequence of the passenger strand (complementary to the guide strand) acts on the mRNA of another gene that is not the original target gene, and its expression is reduced. It can occur that it is suppressed.
  • Patent Document 1 As an attempt to suppress such an off-target effect, it has been disclosed to introduce a modified nucleotide into the passenger strand (Patent Document 1). Moreover, providing a discontinuous part in a passenger chain
  • the RISC PAZ (Piwi / Argonaute / Zwille) domain is known to have a universally hydrophobic pocket, and the 3′-end of the guide strand interacts with this hydrophobic pocket to guide the chain. It is known that a RISC complex is formed (Non-patent Document 1).
  • the disclosure of the present specification provides an RNA interference agent that can obtain an off-target effect suppression effect with a simple configuration.
  • the present inventors have incorporated the passenger strand (sense strand) into the PAZ domain at the 3 ′ end. Inferred that it is effective to suppress Therefore, a polar group was introduced at the 3 ′ end of the RNA duplex guide strand and / or passenger strand to evaluate the suppression of the off-target effect. As a result, it was found that single-stranded RNA having a polar group introduced at the 3 'end cannot exhibit the RNAi effect as a result. Based on such knowledge, the disclosure of the present specification provides the following means.
  • a single-stranded oligonucleotide comprising one or more PAZ domain low affinity units at the 3 ′ end is provided.
  • the PAZ domain low affinity unit may be represented by the following formula.
  • Y represents a group having 2 or more carbon atoms
  • n represents an integer of 1 or more.
  • Y may represent a group having 2 carbon atoms.
  • the PAZ domain low affinity unit may be a unit represented by the following formula, for example.
  • the 3 ′ end preferably comprises two PAZ domain low affinity units.
  • a guide strand oligonucleotide having an antisense site with respect to a predetermined base sequence of a target gene, and a single-stranded oligonucleotide disclosed herein, which is specific to the antisense site And a passenger strand oligonucleotide that hybridizes to an RNA interference agent.
  • a PAZ domain high affinity unit may be provided at the 3 'end of the guide strand oligonucleotide.
  • PAZ domain high affinity unit may be represented by the following formula.
  • A independently represents one of the following formulas, and m represents an integer of 1 or 2 or more.
  • a passenger strand and a guide strand that are single-stranded oligonucleotides having one or more PAZ domain low-affinity units at the 3 ′ end are prepared, and duplexed by hybridization.
  • an oligonucleotide synthesis reagent represented by the following formula is provided.
  • Y represents an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms
  • W1 represents a hydrogen atom or a hydroxyl protecting group
  • W2 is bonded to a hydrogen atom, a phosphoramidite group or a solid phase carrier. Or, it represents a linked linking group.
  • a method for evaluating the function of a gene the step of preparing an RNA interference agent disclosed in the present specification using the gene as a target gene, and the cell holding the gene in the cell
  • an evaluation method comprising introducing an RNA interference agent and evaluating a change in the cell.
  • a method for screening an RNA interference agent which is disclosed in one or more of the present specification, each having an antisense site candidate for one or more different predetermined base sequences of a target gene, respectively.
  • Preparing an RNA interference agent to be prepared, and introducing the one or more RNA interference agents into a cell holding the target gene and evaluating the expression state of the target gene in the cell A screening method is provided.
  • a method for screening an RNA interference agent comprising a guide strand having an antisense site for a predetermined base sequence of a target gene, and one or more PAZ domain low affinity at the 3 ′ end
  • a screening method comprising the step of evaluating.
  • RNA interference agent disclosed by this specification. It is a figure which shows the outline
  • the disclosure of the present specification relates to an RNA interference agent used for RNA interference, a production method thereof, use of the RNA interference agent, and the like.
  • the single-stranded oligonucleotide disclosed in the present specification as the passenger strand of the RNA interference agent, the off-target effect by the passenger strand can be suppressed.
  • RNA interference agents Since the off-target effect of RNA interference agents is suppressed, gene function analysis and drug screening can be performed with high reliability. Gene therapy can also be performed with high safety.
  • the off-target effect of the RNA interference agent is suppressed, the degree of freedom in selecting an antisense site in the guide strand can be increased, and the RNA interference effect can be further enhanced.
  • FIG. 1 An example of a single-stranded oligonucleotide disclosed in the present specification is shown in FIG.
  • the single-stranded oligonucleotide disclosed herein can comprise one or more PAZ domain low affinity units at the 3 ′ end.
  • PAZ domain low affinity units are provided, they are shown as typical examples and are not intended to limit the present invention.
  • This single-stranded oligonucleotide disclosed in the present specification is used as a passenger strand of an RNA interference agent as shown in FIG.
  • the single-stranded oligonucleotide disclosed in the present specification is also referred to as a passenger oligonucleotide.
  • the PAZ domain recognizes a 3 'terminal 2 base overhanging site of siRNA.
  • the PAZ domain has a hydrophobic pocket.
  • the PAZ domain low-affinity unit may be any unit having a structure in which the interaction with this pocket is weaker than, for example, TT constituting the 3 'end of a conventional siRNA.
  • PAZ domain low-affinity unit means a unit that makes RNA strands less likely to bind to the RISC PAZ domain when it has 2 units at the 3 'end of the RNA strand than when it has TT at the 3' end. is doing.
  • the PAZ domain low affinity unit can be obtained, for example, as follows. A double-stranded RNA in which the 3 'end of each single-stranded RNA protrudes by 2 units each and a double-stranded RNA in which each 3' end of the passenger strand is TT is prepared as a control RNA duplex.
  • a test double-stranded RNA identical to the control double-stranded RNA is prepared except that 2 units of PAZ domain low affinity unit candidates are introduced at the 3 'end of the guide strand. Then, when the control double-stranded RNA and the test double-stranded RNA are introduced into cells holding the gene that is the target of expression suppression under the same conditions, the effect of suppressing the expression of the target gene is lower than that of the control double-stranded RNA.
  • a candidate for the 3 ′ end of the test double-stranded RNA can be referred to as a PAZ domain low affinity unit. More specifically, it refers to a unit whose expression suppression effect does not improve even when the amount of test double-stranded RNA introduced is increased.
  • the cell may be a human cell, a non-human animal cell, or another cell.
  • Such a PAZ domain low affinity unit preferably contains a polar group. This is because it is generally known that a highly hydrophobic unit has a high affinity for the PAZ domain.
  • the PAZ domain recognizes a 2 base overhanging site at the 3 ′ end of the siRNA guide strand.
  • the PAZ domain of RISC has a hydrophobic pocket in which hydrophobic residues having an aromatic ring are densely packed, and is thought to recognize a two-base overhanging site of the siRNA guide strand by hydrophobic interaction.
  • the PAZ domain low affinity unit may be provided so that the 3 ′ end of the passenger strand weakens the interaction with the hydrophobic pocket more than the 3 ′ end of the guide strand.
  • Such a structure is not particularly limited.
  • acidic groups such as a carboxyl group (—COOH) and a phosphate group (—PO 3 H, —PO 3 H—) that are acidic in the cell
  • a basic group such as an amino group (—NH 2 , —NH—) that exhibits basicity. Further, it may be a hydroxyl group (—OH) or an ether bond (—O—).
  • the PAZ domain low affinity unit is represented, for example, by the following formula (1).
  • the PAZ domain low affinity unit is at the 3 'end, the right end of the following formula is a hydrogen or phosphate group.
  • X is a linking group
  • Y is a group having 2 or more carbon atoms.
  • n represents the number of PAZ domain low affinity units and represents an integer of 1 or 2 or more. When n is 2 or more, PAZ domain low affinity units are provided in succession. According to such a PAZ domain low-affinity unit, it can be easily synthesized and the binding of the passenger oligonucleotide to the PAZ domain can be effectively suppressed.
  • Examples of the PAZ domain low affinity unit containing the linking group X include the divalent groups described below.
  • R represents a substituent such as an alkyl group or an acyl group, and preferably represents an acyl group having an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • Y may be a group having 2 or more carbon atoms, and preferably represents an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms.
  • An alkylene group is preferred. It may be linear or branched.
  • the alkylene group preferably has 1 to 3 carbon atoms, more preferably 2 or 3 carbon atoms, and even more preferably 2 carbon atoms.
  • the hydrogen atom of the alkylene group may be substituted, but is preferably not substituted.
  • a preferred PAZ domain low affinity unit is represented by the following formula.
  • Y and n have the same meaning as in formula (1), but Y is an unsubstituted linear or branched alkylene group having 1 to 3 carbon atoms. More preferably, it is an ethylene group having 2 carbon atoms.
  • PAZ domain low affinity units can be provided at the 3 'end of the passenger oligonucleotide. Preferably, two or more can be provided. When a plurality of PAZ domain low affinity units are provided, they are preferably provided continuously. The number of PAZ domain low affinity units is preferably 4 or less, more preferably 3 or less, and even more preferably 2. Note that an oligonucleotide that is not a PAZ domain low affinity unit may be provided at the 3 'end. Preferably, a PAZ domain low affinity unit is provided continuously from the terminal at the 3 'end.
  • the passenger oligonucleotide can be provided with an element as a normal passenger oligonucleotide, except that the passenger oligonucleotide is provided with such a 3 'end. That is, it has a sense site that specifically hybridizes with the antisense site of the guide strand to be combined.
  • the sense site is preferably a base sequence consisting of RNA bases (A, G, C and U) that are completely complementary to the antisense site.
  • a nucleoside derivative or the like can be used in addition to a modified base as appropriate for the purpose of enhancing stability as an RNA interference agent.
  • the length of the passenger oligonucleotide is not limited, but it is preferably 19 or more and 49 or less, more preferably 19 or more and 30 or less, including a PAZ domain low affinity unit, where one unit is 1 nucleotide. More preferably 19 or more and 24 or less, and still more preferably 19 or more and 22 or less. Most preferred is 21 nucleotides.
  • the passenger oligonucleotide since the passenger oligonucleotide has a PAZ domain low affinity unit at its 3 'end, the 3' end of the passenger oligonucleotide hardly binds to the PAZ domain.
  • the RNA interference agent when the RNA interference agent is constituted with the guide strand using the passenger oligonucleotide as the passenger strand, the passenger strand is selectively released from the RISC. Therefore, an unintended single strand (passenger strand) -RISC is not formed. For this reason, the expression of genes other than the target gene is not suppressed. That is, the target effect (off-target effect) by the passenger oligonucleotide can be suppressed.
  • the passenger oligonucleotide is a simple unit containing a polar group, the synthesis cost can be reduced. Furthermore, the passenger oligonucleotide can suppress the off-target effect by providing a simple polar unit only at the 3 'end.
  • RNA interference agent The RNA interference agent disclosed in the present specification can comprise a guide strand oligonucleotide having an antisense site with respect to a predetermined base sequence of a target gene, and a passenger oligonucleotide.
  • FIG. 2 shows an example of an RNA interference agent.
  • FIGS. 2 (a) and 2 (b) show a form without a PAZ domain high affinity unit and a form with the unit at the 3 ′ end of the guide strand, respectively.
  • RNA interference agent since the passenger oligonucleotide is provided as the passenger strand, formation of an unintended RISC complex with the passenger strand is suppressed (see FIG. 3). As a result, the off-target effect is suppressed. As a result, the expression of the target gene can be suppressed with high selectivity.
  • the guide strand of the RNA interference agent has an antisense site that specifically hybridizes with a predetermined base sequence (sense sequence) of the target gene.
  • the antisense site has a base sequence composed of RNA bases (A, G, C and U) which are preferably completely complementary to the base sequence of the target gene.
  • a nucleoside derivative or the like can be used as appropriate in addition to a modified base for the purpose of enhancing stability as an RNA interference agent.
  • the guide strand typically has a dangling end at the 3 'end that protrudes from the 5' end of the passenger strand by 1 base or 2 bases (preferably 2 bases) when hybridized with the passenger strand.
  • the guide strand can be provided with nucleotides such as UU or TT at the 3 'end thereof as in the case of conventionally known siRNA.
  • the 3 'end of the guide strand can be provided with a combination of one or more U, T, or other bases.
  • the guide strand of the RNA interference agent can have a PAZ domain high affinity unit at the 3 'end.
  • the PAZ domain high-affinity unit means a unit that binds more easily to a RISC PAZ domain when two units are provided at the 3 'end of the RNA strand than when TT is provided at the 3' end.
  • the PAZ domain high affinity unit can be obtained, for example, as follows. Each of a guide strand (having an RNA base sequence complementary to the sense strand of a predetermined gene) and a passenger strand constituting a double-stranded RNA in which the 3 ′ end of each single-stranded RNA protrudes by 2 units.
  • RNA duplex a test double-stranded RNA identical to the control heavy-chain RNA is prepared except that 2 units of a PAZ domain high-affinity unit candidate are introduced at the 3 'end of the guide strand.
  • the control double-stranded RNA and the test double-stranded RNA are introduced into cells holding the gene that is the target of expression suppression under the same conditions, the effect of suppressing the expression of the target gene is higher than that of the control double-stranded RNA.
  • the unit constituting the 3 ′ end of such test double-stranded RNA More specifically, it refers to a unit whose expression suppression effect improves as the amount of test double-stranded RNA introduced increases.
  • the PAZ domain high affinity unit has a higher expression suppression effect than the PAZ domain low affinity unit. It can also be said that the PAZ domain high affinity unit is a unit having a lower polarity (higher hydrophobicity) than the PAZ domain low affinity unit.
  • the PAZ domain high affinity unit may be a sugar-phosphate skeleton of a natural nucleotide as its backbone, or may be another non-natural skeleton.
  • the unit may be a natural nucleotide, a modified nucleotide, or a non-nucleotide compound.
  • Such a PAZ domain high affinity unit is preferably a unit having a benzene-like skeleton.
  • the PAZ domain high affinity unit is represented, for example, by the following formula (2).
  • the PAZ domain high affinity unit is at the 3 'end, the right end of the following formula is a hydrogen or phosphate group.
  • m represents the number of PAZ domain high affinity units and represents an integer of 1 or 2 or more. When m is 2 or more, PAZ domain high affinity units are continuously provided.
  • A independently represents one of the following formulas, and m represents an integer of 1 or 2 or more.
  • the PAZ domain high affinity unit can comprise one or more units at the 3 'end of the passenger oligonucleotide. Preferably, two or more can be provided. When a plurality of PAZ domain high affinity units are provided, they are preferably provided continuously.
  • the PAZ domain high affinity unit is preferably 4 or less, more preferably 3 or less, and even more preferably 2.
  • the method for producing an RNA interference agent disclosed in the present specification can comprise a step of preparing a passenger oligonucleotide and a guide strand and forming a double-stranded RNA by hybridization. According to this production method, an RNA interference agent in which the off-target effect is suppressed can be easily produced.
  • the passenger oligonucleotide can be synthesized by a known phosphoramidite method by using a phosphoramidite body or CPG reagent for imparting a PAZ domain low affinity unit at the time of synthesis of the 3 'end.
  • a compound represented by the following formula can be used as a reagent for oligonucleotide synthesis such as a phosphoramidite body or CPG reagent for imparting a PAZ domain low affinity unit.
  • W 1 may represent a hydrogen atom or a hydroxyl protecting group.
  • the hydroxyl protecting group may be any group that protects hydroxyl groups from unintended reactions. Such a hydroxyl protecting group is not particularly limited, and various conventionally known hydroxyl protecting groups can be used.
  • Preferred protecting groups of the present invention include fluorenylmethoxycarbonyl group (FMOC group), dimethoxytrityl group (DMT group), quaternary butyldimethylsilyl group (TBDMS group), monomethoxytrityl group, trifluoroacetyl group, levulinyl group Or a silyl group.
  • a preferred protecting group is a trityl group, for example selected from dimethoxytrityl (DMT) and quaternary butyldimethylsilyl group (TBDMS group).
  • W 2 represents a hydroxyl group protecting group, a phosphoramidite group, or a linking group bound to or bound to a solid phase carrier.
  • a compound (amidite compound) in which W 2 is a phosphoramidite group can be used as a phosphoramidite reagent by the phosphoramidite method to synthesize oligonucleotides.
  • the phosphoramidite group can be represented by the following formula.
  • each Y 1 may independently be the same or different and represents a branched or straight-chain alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and Y 2 represents a branched group. Or a linear alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or an optionally substituted alkoxyl group.
  • Y 1 is not particularly limited, an isopropyl group is preferable, and examples of Y 2 include —OCH 3 , —OCH 2 CH 2 ECN, —OCH 2 CHCH 2 and the like.
  • a compound in which W 2 is a linking group bonded to a solid phase carrier such as CPG is held on the solid phase carrier by binding the linking group to a predetermined functional group on the solid phase carrier such as an amino group. Is done.
  • the —OYO- moiety of the PAZ domain low affinity unit binds to the solid phase carrier via a predetermined solid phase linking group. Therefore, this reagent can be used as a starting material for nucleic acid solid phase synthesis of passenger oligonucleotides.
  • a plurality of PAZ domain low affinity units can be linked to this reagent by a phosphoramidite method using a phosphoramidite reagent having an -OYO- moiety.
  • oligonucleotide having a predetermined length containing a sense site can be synthesized using a commonly used ribonucleotide phosphoramidite reagent.
  • a polymer carrier is generally used as the solid phase carrier, and examples thereof include CPG (controlled pored glass), HCP (highly cross-linked polystyrene), and a certain kind of gel.
  • the solid phase carrier may have an appropriate spacer.
  • the linking group is a linker that links the solid phase carrier and the present compound.
  • a known succinate linker, oxalate linker, silanediyl linker, silyl linker, or the like can be used.
  • the reagent represented by such a formula is synthesized by combining known methods. For example, it can be synthesized by the following scheme.
  • a benzene-like skeleton unit can be introduced by a known method as described above.
  • the antisense part in the guide strand is appropriately selected from the base sequence of the target gene.
  • the gene functional analysis method disclosed in the present specification includes a step of preparing an RNA interference agent disclosed in the present specification using the gene as a target gene, and introducing the RNA interference agent into a cell holding the gene And a step of evaluating a change in the cell. According to this evaluation method, since the off-target effect is suppressed, the expression of only the target gene can be suppressed with high selectivity. As a result, gene evaluation can be performed accurately.
  • RNA interference agent In introducing an RNA interference agent into a cell, a known general method can be employed.
  • the cell include various cells including in vitro human cells or non-human animal cells. Further, the cell may be a cell in the living body of a non-human animal.
  • the evaluation items and the evaluation method in the process of evaluating changes in cells can be appropriately determined by those skilled in the art according to the type of target gene and the like. For example, in addition to evaluating the expression state of a target gene in a cell (whether or not expression is suppressed, etc.), a possible biological, chemical and / or physical change in the cell is detected. Can be mentioned. In the case where an in vivo cell is used as the cell, it is possible to detect a biological, chemical and / or physical change in a non-human animal in which the cell exists.
  • the method for screening an RNA interference regulator disclosed in the present specification includes one or more RNAs disclosed in the present specification each having candidate antisense sites for one or more different predetermined base sequences of a target gene.
  • the off-target effect is suppressed, and the target gene expression suppression effect of an RNA interference agent having an antisense site candidate can be accurately evaluated. For this reason, an antisense site effective as an RNA interference agent can be efficiently screened.
  • an RNA interference agent having an effective antisense site with an off-target effect suppressed can be screened.
  • the passenger strand of the RNA interference agent As the passenger strand of the RNA interference agent, the passenger oligonucleotides of various aspects already described can be used. The same applies to the guide chain. An antisense site is provided in the guide strand.
  • Examples of cells into which the RNA interference agent is introduced include various cells including human cells or non-human animal cells in vitro. Further, the cell may be a cell in the living body of a non-human animal.
  • RNA interference agents for introducing RNA interference agents into cells and evaluation of target gene expression status are well known to those skilled in the art, and those skilled in the art can appropriately select the type of target gene and the mode of cells into which RNA interference agents are introduced. be able to. Typically, a luciferase assay as shown in the examples can be employed.
  • the method for screening an RNA interference agent disclosed in the present specification has a guide strand having an antisense site for a predetermined base sequence of a target gene, and one or more PAZ domain low affinity unit candidates at the 3 ′ end.
  • a step of preparing one or more RNA interference agents having a passenger strand, a step of introducing the one or more RNA interference agents into a cell holding the target gene, and evaluating a change in the cells; Can be provided.
  • a PAZ domain low affinity unit candidate effective for suppressing the off-target effect can be screened, and an RNA interference agent in which the off-target effect is suppressed can be obtained.
  • a luciferase assay as shown in the examples can be employed.
  • the PAZ domain low affinity unit candidate may be a unit having a polar or high polarity group such as an acidic group or a basic group.
  • Various aspects of the PAZ domain low affinity unit described above may be applied to the PAZ domain low affinity unit candidate. Thereby, the most effective PAZ domain low affinity unit according to the kind of gene and the kind of cell can be screened.
  • the cells into which the RNA interference agent is introduced include various cells including in vitro human cells or non-human animal cells. Further, the cell may be a cell in the living body of a non-human animal. Also in this screening method, methods for introducing RNA interference agents into cells and evaluation of target gene expression status are well known to those skilled in the art, and those skilled in the art can introduce target gene types and RNA interference agents. The mode of the cell to be selected can be appropriately selected.
  • Trityl compounds (compounds 6 to 10) amidite compounds (compounds 11 to 15) and CPG reagents (compounds 16 to 20) for the PAZ domain low affinity unit were synthesized by the scheme shown below.
  • CPG carrier 16-20 ⁇ Production of CPG carrier 16-20> CPG reagents 16 to 20 were obtained by binding each of the trityl compounds 6 to 10 to a CPG resin via succinylation. Details will be described below.
  • the succinyl compound (assuming that the above succinylation reaction was 100% yield) was vacuum-dried overnight and dissolved in dry DMF (0.02M solution to CPG), and CPG resin (76-103 ⁇ mol / g, 1/4 equivalent of the raw material) was added and blended with the solution.
  • WSC 4 eq to CPG
  • the activities of the obtained CPG reagents 16-20 were measured.
  • the activity values were CPG resin 16: 56.6 ⁇ mol / ⁇ g, 17: 52.2 ⁇ mol / ⁇ g, 18: 23.2 ⁇ mol / ⁇ g, 19: 29.4 ⁇ mol / ⁇ g, and 20: 53.1 ⁇ mol / ⁇ g.
  • RNA interference agent Synthesis of oligonucleotide and preparation of RNA interference agent
  • Oligonucleotides having a predetermined 3 ′ terminal dangling end were synthesized by an automatic nucleic acid synthesizer according to the solid phase phosphoramidite method.
  • a guide strand (antisense strand) and a passenger strand (sense strand) having a 3 ′ dangling end shown in the following table were synthesized. Base sequences other than the 3 ′ dangling ends of the guide strand and passenger strand are shown below.
  • This RNA interference agent is intended to suppress the expression of a gene encoding Renilla Luciferase, which is a fluorescent protein of Renilla.
  • a sense strand and an antisense strand having the following PB at the 3 ′ end were also synthesized as described in the pamphlet of WO2007 / 094135.
  • the antisense strands and guide strands thus synthesized were combined in equimolar amounts, respectively, and annealed with a combination of guide strands and passenger strands of various embodiments as shown in FIG. Produced.
  • RNA interference agent produced in Example 2 was performed as follows. That is, using the RNA interference agents of Examples and Comparative Examples, a Dual Luciferase repoter assay using HeLa cells was performed to evaluate the knockdown effect.
  • the synthesized siRNA targets Renilla Luciferase, and the knockdown effect was measured by simultaneously transfecting a HeRNA cell with a vector expressing this gene and a control gene (firefly Luciferase) and siRNA. Specific operations and reagents are shown below. The results are shown in FIGS.
  • Cell HeLa cell plate: 96 well plate (BD falcon) Medium: D-MEM (Wako) + 10% BS (SIGMA) or OPTI-MEM (Invitrogen)
  • Transfection reagent transfast TM (0.1 mM concentration, 0.3 ⁇ L / well)
  • siRNA siRNA targeting Renilla gene (each concentration shown)
  • Vector psiCHECK TM -2 Vectors (promega, 20ng / well)
  • Assay kit Dual-Glo TM Luciferase Assay System (promega)
  • microarray analysis was used to confirm the effect of suppressing the off-target effect by the passenger by introducing a highly polar puzz domain low affinity unit into the 3 'end of the passenger strand.
  • an RNA interference agent according to the present disclosure siRNA, which is intended to suppress the expression of a gene encoding RenillaiferLuciferase, a Renilla fluorescent protein as in Examples 2 and 3
  • siRNA siRNA, which is intended to suppress the expression of a gene encoding RenillaiferLuciferase, a Renilla fluorescent protein as in Examples 2 and 3
  • the transfected plasmid is Promega psi-check-2 vector, and the siRNA sequence used was antisense strand: 5'- guaggaguagugaaaggcc -3 '(SEQ ID NO: 1), sense strand: 5'- ggccuuucacuacuccuacac-3' (SEQ ID NO: 2).
  • serum-containing medium 500 ⁇ l / well
  • cells were collected using a trypsin-EDTA solution (Invitrogen).
  • RNA extraction Total RNA was extracted from the collected cells using the Qiagen RNeasy mini kit with reference to the recommended protocol. The absorbance of the obtained total RNA solution was measured and found to be A: 792.4 ng / ⁇ l, B: 941.6 ng / ⁇ l, and C: 642.8 ng / ⁇ l.
  • RNA extracted from the cells was mailed to Hokkaido System Science Co., Ltd. on a frozen flight containing dry ice, and microarray analysis (SurePrint G3 Human GE Ver. 2.0 8x60K 1color from Agilent Technologies) was requested. This request analysis included quality RNA inspection, cDNA synthesis from total RNA, cRNA labeling (Cy3) and amplification, hybridization, and scanning.
  • the delivered raw data was analyzed in detail using GeneSpring 12.5, a microarray data analysis software. First, all raw data was normalized with 75% tile (inter-chip correction). Thereafter, filtering by expression level (20-100% tile) was performed.
  • RNA was extracted from each of the cells transfected under the conditions of A, B, and C described above, and relative quantification of the GAPDH gene and the NCF1 gene from the Ct value was performed using a real-time RT-PCR method.
  • PCR was performed according to the recommended protocol using TaKaRa's One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit (SYBR Green I detection system).
  • SYBR Green I detection system As a result, when the GAPDH gene was used as a control, it was confirmed that the NCF1 gene was correlated as shown in FIG.
  • the primer sequences used in the PCR reaction are as follows.
  • GAPDH-For TATAAATTGAGCCCGCAGCC (SEQ ID NO: 3) GAPDH-Rev CCATGGTGTCTGAGCGATGT (SEQ ID NO: 4) NCF1-For GAAGGTGTCCCCCATGACTG (SEQ ID NO: 5) NCF1-Rev TCCAGTGCATTTAAGGCGCA (SEQ ID NO: 6)
  • the number of genes in which the difference in expression level was recognized in A (negative control) vs B (positive control) (hereinafter A / B) was 19955, and of these, the gene whose expression level was decreased in B from A ( In the figure, A / B up) was 11658, and the increase (A / B down) was 8297.
  • the number of genes in which the difference in the expression level was recognized in A / C was 19814.
  • the gene whose expression level decreased in C from A (A / C up in the figure) was 11631.
  • a / C ⁇ down in the figure was 8183.
  • siRNA SEQ ID NO: 3 to 6 Primer SEQ ID NO: 7 to 12: Probe

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Abstract

簡易な構成でオフ・ターゲット効果の抑制効果が得られるＲＮＡ干渉剤を提供する。このため、本開示は、３'末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上を備える、一本鎖オリゴヌクレオチドをパッセンジャー鎖として備えるＲＮＡ干渉剤とする。

Description

ＲＮＡ干渉剤、その製造方法及びその利用
　本明細書は、ＲＮＡ干渉（以下、単に、ＲＮＡｉともいう。）剤、その製造方法及びその利用等に関する。
　ＲＮＡｉは、配列特異的にｍＲＮＡの分解を生じさせ、ターゲットとなる遺伝子の発現を抑制することができる。ＲＮＡｉを引き起こすｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡは、技術としての簡便性及びその高い遺伝子抑制効果の観点から、遺伝子の機能解析や臨床応用が期待されている。
　ＲＮＡｉ経路では、通常、細胞内で二本鎖ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡがＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質複合体に取り込まれ、一本鎖に解離する。そのままＲＩＳＣ中に残されて遺伝子発現に関与する鎖をガイド鎖（アンチセンス鎖）といい、他方、ＲＩＳＣから放出される他方の鎖をパッセンジャー鎖（センス鎖）という。ｓｉＲＮＡの場合には、ガイド鎖が正しくＲＩＳＣに取り込まれると、ガイド鎖を含むＲＩＳＣ複合体は、ガイド鎖と相補的な配列を有するターゲットｍＲＮＡを認識し、ａｇｏ２のスライサー活性によって標的ｍＲＮＡを切断する。また、ｍｉＲＮＡの場合には、標的ｍＲＮＡを認識し、翻訳過程を抑制する。こうした結果、ターゲット遺伝子の発現が抑制されると考えられている。
　ＲＩＳＣがこれら二本鎖のうちどのような機構で一方の鎖をガイド鎖として認識するかについては、二本鎖両末端の熱力学的安定性に起因すると推測されている。
　ここで、パッセンジャー鎖があたかもガイド鎖のように取り込まれうる場合もある。こうした場合には、いわゆるオフ・ターゲット効果が生じてしまう。オフ・ターゲット効果とは、ターゲット遺伝子以外の本来意図していない他の遺伝子を抑制してしまう現象をいう。ＲＮＡｉにおいては、パッセンジャー鎖がＲＩＳＣに取り込まれることで、パッセンジャー鎖の有する塩基配列（ガイド鎖と相補的である）が本来のターゲット遺伝子でない他の遺伝子のｍＲＮＡに対して作用して、その発現を抑制してしまうことが生じうる。
　こうしたオフ・ターゲット効果を抑制するための試みとして、パッセンジャー鎖に修飾ヌクレオチドを導入することが開示されている（特許文献１）。また、パッセンジャー鎖に不連続部位を設けることが開示されている（特許文献２）。さらに、センス鎖（パッセンジャー鎖）の一又は両方の末端のヌクレオチドの２’位の水酸基にメチル基等で修飾することで、アンチセンス鎖（ガイド鎖）の取り込をＲＩＳＣへの取り込みを促進することなどが開示されている（特許文献３）。
　また、ＲＩＳＣのＰＡＺ（Piwi/Argonaute/Zwille）ドメインは、普遍的に疎水性ポケットを有することがわかっており、この疎水性ポケットにガイド鎖の３’－末端が相互作用することでガイド鎖－ＲＩＳＣ複合体が形成されることがわかっている（非特許文献１）。
特表２０１０－５３８６７７号公報 特表２００９－５３０３１９号公報 特表２０１１－５１１６３６号公報
J.B. Ma, K. Ye, D. J. Patel, Structural basis for overhang-specific small interfering RNA recognition by the PAZ domain. Nature 429, 318-320 (2004)
　しかしながら、パッセンジャー鎖への修飾ヌクレオチドの導入は通常煩雑であった。また、ＲＮＡｉによるターゲット遺伝子の抑制効果及びオフ・ターゲット効果の抑制効果の双方が十分に確保されているとはいえなかった。
　そこで、本明細書の開示は、簡易な構成でオフ・ターゲット効果抑制効果が得られるＲＮＡ干渉剤を提供する。
　本発明者らは、ＲＮＡ干渉において、本来ターゲット遺伝子でない他の遺伝子の発現を抑制してしまうオフ・ターゲット効果を抑制するには、パッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端のＰＡＺドメインへの取り込みを抑制することが有効であるという推論を立てた。そこで、ＲＮＡ二重鎖のガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖の３’末端に極性基を導入して、オフ・ターゲット効果の抑制について評価した。その結果、３’末端に極性基を導入した一本鎖ＲＮＡは、結果としてＲＮＡｉ効果を発揮しえないことがわかった。こうした知見に基づき、本明細書の開示は、以下の手段を提供する。
　本明細書の開示によれば、３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上を備える、一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。前記ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、以下の式で表されていてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （ただし、Ｘは、連結基であり、Ｙは、炭素数が２以上の基を表し、ｎは１以上の整数を表す。）Ｙは炭素数が２の基を表していてもよい。
　ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、例えば、以下の式で表されるユニットであってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　前記３’末端には、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットを２個備えることが好ましい。
　本明細書の開示によれば、標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、本明細書に開示される一本鎖オリゴヌクレオチドであって前記アンチセンス部位に特異的にハイブリダイズするパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと、を備える、ＲＮＡ干渉剤が提供される。前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドの３’末端には、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットを備えていてもよい。
　さらに、前記ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、以下の式で表されるものでもあってよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、Ａは独立して以下のいずれかの式を表し、ｍは１又は２以上の整数を表す。]
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　本明細書の開示によれば、３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上を備える、一本鎖オリゴヌクレオチドであるパッセンジャー鎖とガイド鎖とを準備し、ハイブリダイゼーションにより二重鎖ＲＮＡを形成する工程、を備える、ＲＮＡ干渉剤の製造方法が提供される。
　本明細書の開示によれば、以下の式で表される、オリゴヌクレオチド合成試薬が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、Ｙは、炭素数が１以上４以下のアルキレン基を表し、Ｗ１は、水素原子又はヒドロキシル保護基を表し、Ｗ２は、水素原子、ホスホロアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。）
　本明細書の開示によれば、遺伝子の機能の評価方法であって、前記遺伝子を標的遺伝子として、本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、前記遺伝子を保持する細胞に前記ＲＮＡ干渉剤を導入して、前記細胞における変化を評価する工程、を備える、評価方法が提供される。
　本明細書の開示によれば、ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法であって、標的遺伝子の１又は２以上の異なる所定の塩基配列に対するアンチセンス部位候補をそれぞれ有する１又は２以上の本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における前記標的遺伝子の発現状態を評価する工程と、を備える、スクリーニング方法が提供される。
　本明細書の開示によれば、ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法であって、標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖と、３’末端に１又は２以上のＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補を有するパッセンジャー鎖と、を有する１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における変化を評価する工程と、を備える、スクリーニング方法が提供される。
本明細書に開示される一本鎖ＲＮＡの一例を示す図である。 本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤の例を示す図である。 本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤の作用の概要を示す図である。 実施例で作製したＲＮＡ干渉剤を示す図である。 ＲＮＡ干渉剤の評価結果を示す図である。 ＲＮＡ干渉剤の評価結果を示す図である。 マイクロアレイ解析における各アレイ（Ａ、Ｂ、Ｃ）間における相関の評価結果を示す図である。 フィルタリング指定地を１．１５としたときのマイクロアレイ解析結果を示す図である。 フィルタリング指定地を１としたときのマイクロアレイ解析結果を示す図である。 ＲＮＡ干渉剤のセンス鎖によるオフ・ターゲット効果の抑制をアレイ上の９スポットについて評価した結果を示す図である。
　本明細書の開示は、ＲＮＡ干渉に用いられるＲＮＡ干渉剤、その製造方法並びにＲＮＡ干渉剤の利用等に関する。本明細書に開示される一本鎖オリゴヌクレオチドをＲＮＡ干渉剤のパッセンジャー鎖として用いることで、パッセンジャー鎖によるオフ・ターゲット効果を抑制できる。
　ＲＮＡ干渉剤のオフ・ターゲット効果が抑制されることで、遺伝子の機能解析や薬剤スクリーニングを高い信頼性を行うことができる。また、遺伝子治療も高い安全性で行うことができる。
　また、ＲＮＡ干渉剤のオフ・ターゲット効果が抑制されることで、ガイド鎖におけるアンチセンス部位の選択の自由度を高めることができ、よりＲＮＡ干渉効果を高めることができる。
　以下、本明細書の開示を、図１～図３を適宜参照しながら詳細に説明する。
（一本鎖オリゴヌクレオチド）
　本明細書に開示される一本鎖オリゴヌクレオチドの一例を図１に示す。図１に示すように、本明細書に開示される一本鎖オリゴヌクレオチドは、３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上を備えることができる。なお、図１においてはＰＡＺドメイン低親和性ユニットを２個備えているが、典型例として示すものであり、これに限定する趣旨ではない。
　本明細書に開示されるこの一本鎖オリゴヌクレオチドは、図２に示すように、ＲＮＡ干渉剤のパッセンジャー鎖として用いられるものである。以下、本明細書に開示される一本鎖オリゴヌクレオチドを、パッセンジャーオリゴヌクレオチドともいう。
　本明細書の開示は、ＲＮＡｉ経路において、ＲＩＳＣ中のＰＡＺドメイン構造に着目している。ＰＡＺドメインはｓｉＲＮＡの３’末端２塩基突出部位を認識する。ＰＡＺドメインは疎水性ポケットを有している。ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、例えば、従来のｓｉＲＮＡの３’末端を構成しているＴＴなどに比較して、このポケットとの相互作用が弱まる構造を有するものであればよい。
　ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、ＲＮＡ鎖の３’末端に２単位備えられたとき、ＲＩＳＣのＰＡＺドメインに対して、３’末端にＴＴを備える場合よりもＲＮＡ鎖を結合しにくくするユニットを意味している。ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、例えば、以下のようにして取得できる。各一本鎖ＲＮＡの３’末端がそれぞれ２単位突出している二重鎖ＲＮＡのガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各３’末端をＴＴとした二重鎖ＲＮＡを対照ＲＮＡ二重鎖として準備する。また、ガイド鎖の３’末端に２単位のＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補を導入したこと以外は対照の二重鎖ＲＮＡとは同一の被験二重鎖ＲＮＡを準備する。そして、対照二重鎖ＲＮＡと被験二重鎖ＲＮＡを同等の条件で発現抑制の標的となる遺伝子を保持する細胞に導入したとき、対照二重鎖ＲＮＡよりも標的遺伝子の発現抑制効果が低くなるような被験二重鎖ＲＮＡの３’末端の候補をＰＡＺドメイン低親和性ユニットということができる。より具体的には、被験二重鎖ＲＮＡの導入量を高めても発現抑制効果が向上しないようなユニットをいう。
　なお、上記細胞は、ヒト細胞であってもよく、非ヒト動物細胞であってもよく、さらに、他の細胞であってもよい。
　こうしたＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、極性基を含んでいることが好ましい。ＰＡＺドメインには、疎水性の高いユニットが高い親和性を有することが一般的に知られているからである。ＰＡＺドメインは、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の３’末端の２塩基突出部位を認識する。ＲＩＳＣのＰＡＺドメインは、芳香環を有する疎水性残基が密集した疎水性ポケットを有しており、疎水性相互作用によりｓｉＲＮＡのガイド鎖の２塩基突出部位を認識すると考えられている。このため、パッセンジャー鎖の３’末端が、ガイド鎖の３’末端よりも疎水性ポケットとの相互作用を弱めるような構造をＰＡＺドメイン低親和性ユニットを備えるようにすればよい。こうした、構造としては、特に限定されないが、例えば、細胞内において、酸性を呈するカルボキシル基（-ＣＯＯＨ）、リン酸基（-ＰＯ3Ｈ、-ＰＯ3Ｈ-）などの酸性基や、細胞内において塩基性を呈するアミノ基（-ＮＨ2、―ＮＨ－）などの塩基性基が挙げられる。また、水酸基（-ＯＨ）やエーテル結合（－Ｏ－）などであってもよい。
　好ましくは、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、例えば、以下の式（１）で表される。ＰＡＺドメイン低親和性ユニットが３’末端の端末にあるとき、以下の式の右端は、水素又はリン酸基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　上記式（１）において、Ｘは、連結基であり、Ｙは、炭素数が２以上の基である。また、上記式（１）においてｎはＰＡＺドメイン低親和性ユニットの個数を表し、１又は２以上の整数を表している。ｎが２以上のとき、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、連続して備えられる。こうしたＰＡＺドメイン低親和性ユニットによれば、簡易に合成できるとともに、効果的にパッセンジャーオリゴヌクレオチドのＰＡＺドメインへの結合を抑制できる。
　連結基Ｘを含むＰＡＺドメイン低親和性ユニットとしては、例えば、以下に記載の二価の基が挙げられる。以下の式においてＲは、アルキル基やアシル基等の置換基を表し、好ましくは炭素数１～４のアルキル基又は炭素数１～４のアルキル基を備えるアシル基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　Ｙは、炭素数が２以上の基であればよいが、好ましくは、炭素数が１以上４以下のアルキレン基を表している。アルキレン基であることが好ましい。直鎖状であっても分岐状であってもよい。アルキレン基は、好ましくは、炭素数が１～３個であり、より好ましくは、２個又は３個であり、一層好ましくは２個である。アルキレン基の水素原子は、置換されていてもよいが、置換されていないことが好ましい。
　好ましいＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、以下の式で表される。以下の式において、Ｙ及びｎは、式（１）と同義であるが、Ｙは炭素数が１～３個の無置換の直鎖状又は分岐状のアルキレン基である。より好ましくは炭素数が２個のエチレン基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、パッセンジャーオリゴヌクレオチドの３’末端に１又は２個以上備えることができる。好ましくは、２個以上を備えることができる。ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、複数個備えるとき、連続して備えることが好ましい。また、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、４個以下であることが好ましく、より好ましくは３個以下であり、さらに好ましくは２個である。なお、３’末端には、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットでないオリゴヌクレオチドを備えていてもよい。好ましくは、３’末端の端末から連続してＰＡＺドメイン低親和性ユニット備えている。
　パッセンジャーオリゴヌクレオチドは、こうした３’末端を備えることを特徴とする以外は、通常のパッセンジャーオリゴヌクレオチドとしての要素を備えることができる。すなわち、組み合わされるガイド鎖のアンチセンス部位と特異的にハイブリダイズするセンス部位を備えている。センス部位は、好ましくは、アンチセンス部位と完全に相補的なＲＮＡ塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる塩基配列である。センス部位等においては、ＲＮＡ干渉剤としての安定性を高めることなどを目的として適宜修飾塩基のほか、ヌクレオシド誘導体などを用いることができる。
　パッセンジャーオリゴヌクレオチドの長さは限定しないが、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットを含み、当該１ユニットを１ヌクレオチドとしたとき、１９以上４９以下のヌクレオチドであることが好ましく、より好ましくは１９以上３０以下であり、さらに好ましくは１９以上２４以下であり、一層好ましくは１９以上２２以下である。最も好ましくは２１ヌクレオチドである。
　図１に示すように、パッセンジャーオリゴヌクレオチドは、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットをその３’末端に有しているため、パッセンジャーオリゴヌクレオチドの３’末端はＰＡＺドメインと結合しにくい。その結果、図２及び図３に示すように、パッセンジャーオリゴヌクレオチドをパッセンジャー鎖としてガイド鎖とともにＲＮＡ干渉剤を構成したとき、このパッセンジャー鎖は、ＲＩＳＣから選択的に放出されることになる。したがって、意図しない一本鎖（パッセンジャー鎖）－ＲＩＳＣが形成されない。このため、標的遺伝子以外の他の遺伝子の発現を抑制することがない。すなわち、パッセンジャーオリゴヌクレオチドによるターゲット効果（オフ・ターゲット効果）を抑制できる。
　さらに、パッセンジャーオリゴヌクレオチドは、極性基を含む簡易な単位であるため、合成コストを低減できる。さらにまた、パッセンジャーオリゴヌクレオチドは３’末端のみに簡易な極性単位を備えることで、オフ・ターゲット効果を抑制できる。
　こうしたパッセンジャーオリゴヌクレオチドの合成方法は、後段にて詳述する。
（ＲＮＡ干渉剤）
　本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤は、標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、パッセンジャーオリゴヌクレオチドと、を備えることができる。図２には、ＲＮＡ干渉剤の一例を示す。図２（ａ）及び（ｂ）は、それぞれガイド鎖の３’末端にＰＡＺドメイン高親和性ユニットを備えない形態及び当該ユニットを備える形態を示す。
　本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤によれば、パッセンジャーオリゴヌクレオチドをパッセンジャー鎖として備えているため、パッセンジャー鎖との意図しないＲＩＳＣ複合体の形成が抑制される（図３参照）。この結果、オフ・ターゲット効果が抑制される。結果として、高い選択性で標的遺伝子の発現を抑制できる。
　ＲＮＡ干渉剤のガイド鎖は、標的遺伝子の所定の塩基配列（センス配列）と特異的にハイブリダイズするアンチセンス部位を有している。ここでアンチセンス部位は標的遺伝子の塩基配列と好ましくは完全に相補的なＲＮＡ塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる塩基配列を有している。ガイド鎖のアンチセンス部位等においては、ＲＮＡ干渉剤としての安定性を高めることなどを目的として適宜修飾塩基のほか、ヌクレオシド誘導体などを用いることができる。
　ガイド鎖は、典型的には、パッセンジャー鎖とハイブリダイズ時においてパッセンジャー鎖の５’末端から１塩基又は２塩基以上（好ましくは２塩基）突出するダングリング末端を３’末端に備えている。ガイド鎖は、従来公知のｓｉＲＮＡと同様、その３’末端には、ＵＵないしＴＴなどのヌクレオチドを備えることができる。ガイド鎖の３’末端は、Ｕ、Ｔ、又はその他の塩基を１又は２以上組み合わせて備えることができる。
　ＲＮＡ干渉剤のガイド鎖は、３’末端にＰＡＺドメイン高親和性ユニットを備えることができる。ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、ＲＮＡ鎖の３’末端に２単位備えられたとき、ＲＩＳＣのＰＡＺドメインに対して、３’末端にＴＴを備える場合よりも結合しやすいユニットを意味している。ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、例えば、以下のようにして取得できる。各一本鎖ＲＮＡの３’末端がそれぞれ２単位突出している二重鎖ＲＮＡを構成するガイド鎖（所定の遺伝子のセンス鎖に対して相補的なＲＮＡ塩基配列を有する）及びパッセンジャー鎖の各３’末端をＴＴとした二重鎖ＲＮＡを対照ＲＮＡ二重鎖として準備する。また、ガイド鎖の３’末端に２単位のＰＡＺドメイン高親和性ユニット候補を導入したこと以外は対照の重鎖ＲＮＡとは同一の被験二重鎖ＲＮＡを準備する。そして、対照二重鎖ＲＮＡと被験二重鎖ＲＮＡを同様の条件で発現抑制の標的となる遺伝子を保持する細胞に導入したとき、対照二重鎖ＲＮＡよりも標的遺伝子の発現抑制効果が高くなるような被験二重鎖ＲＮＡの３’末端を構成するユニットをいう。より具体的には、被験二重鎖ＲＮＡの導入量を高めたら発現抑制効果も向上するようなユニットをいう。
　ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットよりも発現抑制効果が高いということもできる。また、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットよりも極性が低い（疎水性が高い）ユニットであるということもできる。
　また、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、そのバックボーンとして天然型ヌクレオチドの糖－リン酸骨格であってもよいし、その他の非天然骨格であってもよい。そして、当該ユニットは、天然型のヌクレオチドであってもよいし、修飾型ヌクレオチドであってもよいし、非ヌクレオチド化合物であってもよい。
　こうしたＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、ベンゼン様骨格を有する単位を好ましく用いることができる。ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、例えば以下の式（２）で表される。ＰＡＺドメイン高親和性ユニットが３’末端の端末にあるとき、以下の式の右端は、水素又はリン酸基である。式（２）においてｍはＰＡＺドメイン高親和性ユニットの個数を表し、１又は２以上の整数を表している。ｍが２以上のとき、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、連続して備えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 ［式中、Ａは独立して以下のいずれかの式を表し、ｍは１又は２以上の整数を表す。]
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　こうしたベンゼン様骨格を有する単位は、例えば、国際公開第ＷＯ2007/094135号等にその詳細が記載されており、当業者であれば、こうした単位をＰＡＺドメイン高親和性ユニットとして付与することができる。
　ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、パッセンジャーオリゴヌクレオチドの３’末端に１又は２単位以上備えることができる。好ましくは、２個以上を備えることができる。ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、複数個備えるとき、連続して備えることが好ましい。また、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、４個以下であることが好ましく、より好ましくは３個以下であり、さらに好ましくは２個である。
（ＲＮＡ干渉剤の製造方法）
　本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤の製造方法は、パッセンジャーオリゴヌクレオチドと、ガイド鎖とを準備し、ハイブリダイゼーションにより二重鎖ＲＮＡを形成する工程を備えることができる。この製造方法によれば、オフ・ターゲット効果が抑制されたＲＮＡ干渉剤を簡易に製造することができる。
　パッセンジャーオリゴヌクレオチドは、その３’末端の合成時に、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットを付与するためのホスホアミダイト体やＣＰＧ試薬を用いることで、公知のホスホアミダイト法により合成することができる。
　ＰＡＺドメイン低親和性ユニット付与のためのホスホアミダイト体やＣＰＧ試薬などのオリゴヌクレオチド合成用試薬としては、例えば以下の式で表される化合物を用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　上記式において、Ｗ１は水素原子又は水酸基保護基を表すことができる。水酸基保護基としては、水酸基を意図しない反応から保護する基であればよい。こうした水酸基保護基としては、特に限定しないで従来公知の各種の水酸基保護基を用いることができる。本発明の好ましい保護基は、フルオレニルメトキシカルボニル基（ＦＭＯＣ基）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ基）、四級ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）、モノメトキシトリチル基、トリフルオロアセチル基、レブリニル基、またはシリル基である。好ましい保護基は、トリチル基であり、例えば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及び四級ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）から選択される。
　また、Ｗ２は、水酸基保護基、ホスホルアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。Ｗ２がホスホルアミダイト基である化合物（アミダイト化合物）は、ホスホルアミダイト法によるホスホルアミダイト試薬として用いて、オリゴヌクレオチドを合成するのに用いることができる。なお、本発明において、ホスホルアミダイト基は、以下の式で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （式中、各Ｙ１は独立して、同一であっても異なっていてもよく、分枝状又は直鎖状の炭素数１～５個のアルキル基を表し、Ｙ２は、分枝状又は直鎖状の炭素数１～５個のアルキル基又は置換されていてもよいアルコキシル基を表す。）
　上記式において、Ｙ１は、特に限定しないがイソプロピル基が好ましいものとして挙げられ、また、Ｙ２としては、－ＯＣＨ３、－ＯＣＨ2ＣＨ2ＥＣＮ、－ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２等が挙げられる。
　また、Ｗ2がＣＰＧなどの固相担体に結合される連結基である化合物は、当該連結基とアミノ基など固相担体上の所定の官能基とを結合させることにより、固相担体に保持される。そして、上記式において、Ｗ２が固相担体に結合された連結基である化合物は、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットの－ＯＹＯ－部分が所定の固相用連結基を介して固相担体に結合されているため、この試薬をパッセンジャーオリゴヌクレオチドの核酸固相合成法の出発材料として用いることができる。この試薬に対して－ＯＹＯ－部分を有するホスホアミダイト試薬でホスホアミダイト法等でＰＡＺドメイン低親和性ユニットを複数個連結していくことができる。
　さらに、適数個のＰＡＺドメイン低親和性ユニットを付与したら、一般的に用いられるリボヌクレオチドのホスホアミダイト試薬を用いてセンス部位を含む所定長のオリゴヌクレオチドを合成することができる。
　ここで、固相担体とは、一般に高分子担体が用いられ、例えば、ＣＰＧ（controlled pored glass）やＨＣＰ（highly cross-linked polystyrene）、ある種のゲルなどが挙げられる。また、固相担体には適切なスペーサーを有していてもよい。連結基は、固相担体と本化合物とを連結するリンカーである。こうした連結基としては、公知のコハク酸エステルリンカー、シュウ酸エステルリンカー、シランジイルリンカー、シリルリンカーなどを用いることができる。
このような式で表される試薬は既知の方法を組み合わせて合成される。例えば、以下のスキームで合成できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　ガイド鎖における３’末端にＰＡＺドメイン高親和性ユニットを導入する場合には、既に説明したように公知の方法によりベンゼン様骨格単位を導入することができる。ガイド鎖におけるアンチセンス部は、標的とする遺伝子の塩基配列から適宜選択される。
（遺伝子の機能の評価方法）
　本明細書に開示される遺伝子の機能解析方法は、前記遺伝子を標的遺伝子として、本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、前記遺伝子を保持する細胞に前記ＲＮＡ干渉剤を導入して、前記細胞における変化を評価する工程と、を備えることができる。本評価方法によれば、オフ・ターゲット効果が抑制されているので、標的遺伝子のみの発現を高い選択性で抑制できる。この結果、遺伝子の評価を的確に行うことができる。
　ＲＮＡ干渉剤を細胞に導入するのにあたっては、既に知られている一般的な方法を採用できる。細胞としては、生体外におけるヒト細胞あるいは非ヒト動物細胞を含む各種細胞が挙げられる。また、細胞は、非ヒト動物の生体内にある細胞であってもよい。
　細胞における変化を評価する工程における評価項目や評価方法は、標的遺伝子の種類等に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、細胞における標的遺伝子の発現状態（発現が抑制されたか否か、その程度など）を評価することのほか、細胞における想定されうる生物学的、化学的及び／又は物理的な変化を検出することが挙げられる。細胞として生体内細胞を用いる場合には、当該細胞が存在する非ヒト動物における生物学的、化学的及び／又は物理的な変化を検出することが挙げられる。
（ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法）
　本明細書に開示されるＲＮＡ干渉制御剤のスクリーニング方法は、標的遺伝子の１又は２以上の異なる所定の塩基配列に対するアンチセンス部位候補をそれぞれ有する１又は２以上の本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における前記標的遺伝子の発現状態を評価する工程と、を備えることができる。このスクリーニング方法によると、オフ・ターゲット効果が抑制されており、アンチセンス部位候補を備えるＲＮＡ干渉剤の標的遺伝子の発現抑制効果を的確に評価することができる。このため、ＲＮＡ干渉剤として有効なアンチセンス部位を効率的にスクリーニングできる。また、オフ・ターゲット効果が抑制され、かつ有効なアンチセンス部位を有するＲＮＡ干渉剤をスクリーニングできる。
　ＲＮＡ干渉剤のパッセンジャー鎖としては、既に説明した各種態様のパッセンジャーオリゴヌクレオチドを用いることができる。ガイド鎖についても、同様である。アンチセンス部位は、ガイド鎖に備えられる。
　ＲＮＡ干渉剤を導入する細胞は、生体外におけるヒト細胞あるいは非ヒト動物細胞を含む各種細胞が挙げられる。また、細胞は、非ヒト動物の生体内にある細胞であってもよい。
　ＲＮＡ干渉剤を細胞に導入する方法及び標的遺伝子の発現状態の評価は、当業者において周知であり、当業者であれば、標的遺伝子の種類やＲＮＡ干渉剤を導入する細胞の態様において適宜選択することができる。典型的には、実施例に示すようなルシフェラーゼアッセイ等を採用できる。
（ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法）
　本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法は、標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖と、３’末端に１又は２以上のＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補を有するパッセンジャー鎖と、を有する１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における変化を評価する工程と、を備えることができる。このスクリーニング方法によれば、オフ・ターゲット効果の抑制に効果的なＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補をスクリーニングすることができ、オフ・ターゲット効果が抑制されたＲＮＡ干渉剤を得ることができる。典型的には、実施例に示すようなルシフェラーゼアッセイ等を採用できる。
　ＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補としては、酸性基や塩基性基など極性を有するあるいは極性の高い基を含むユニットとすることができる。ＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補は、既に説明したＰＡＺドメイン低親和性ユニットの各種態様を適用してもよい。これにより、遺伝子の種類や細胞の種類に応じた最も効果的なＰＡＺドメイン低親和性ユニットをスクリーニングできる。
　このスクリーニング方法においても、ＲＮＡ干渉剤を導入する細胞は、生体外におけるヒト細胞あるいは非ヒト動物細胞を含む各種細胞が挙げられる。また、細胞は、非ヒト動物の生体内にある細胞であってもよい。また、このスクリーニング方法においても、ＲＮＡ干渉剤を細胞に導入する方法及び標的遺伝子の発現状態の評価は、当業者において周知であり、当業者であれば、標的遺伝子の種類やＲＮＡ干渉剤を導入する細胞の態様において適宜選択することができる。
　以下、本明細書の開示を、具体例を挙げて説明する。
（ＰＡＺドメイン低親和性ユニットのための試薬合成）
　ＰＡＺドメイン低親和性ユニットのための、トリチル体（化合物６～１０）アミダイト体（化合物１１～１５）及びＣＰＧ試薬（化合物１６～２０）を以下に示すスキームで合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
＜化合物6～10の合成＞
　スキームに示す化合物1～5を出発原料とし、DMTrClにて片方の水酸基のトリチル保護を行い、トリチル体6～10を得た。以下に、その詳細を説明する。なお、それぞれの反応は化合物別に行ったものである。
　良く乾燥したDMTrCl 1.00gにdry pyridine 30mLを加えて溶かし、そこに各々3当量分のエチレングリコール（化合物1、0.49mL）、プロパンジオール（化合物2、0.64mL）、ブタンジオール（化合物3、0.79mL）、ペンタンジオール（化合物4、0.93mL）、ヘキサンジオール（化合物5、1.05g）を加え、室温で3時間攪拌した。その後、酢酸エチルと蒸留水で分液し、有機層を飽和NaHCO3 aq.、飽和NaCl aq.で洗浄し、無水Na2SO4を加え乾燥した。溶媒を減圧留去後、中性シリカゲルクロマトグラフィー（Hex:EtOAc=3:1）にて単離精製し、目的化合物6（0.82g、76%）、7（0.67g、62%）、8（0.90g、77%）、9（0.71g、60%）、10（1.09g、88%）をそれぞれ得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ [ppm] ; 
(化合物6) : 7.45~7.20 ( 9H, m ), 6.83 ( 4H, d, J = 8.8 Hz ) , 3.79 ( 6H, s) , 3.73 ( 2H, m) , 3.26 ( 2H, t, J= 4.8 Hz ) 
(化合物7) : 7.43~7.20 ( 9H, m), 6.83 ( 4H, d, J = 8.4 Hz ) , 3.79 ( 6H, s) , 3.76 ( 2H, t, J = 5.8 Hz) , 3.28 ( 2H, t, J= 5.8 Hz ) , 1.85 ( 2H, q, J = 5.8 Hz )
(化合物8) : 7.44~7.20 ( 9H, m ), 6.82 ( 4H, d, J = 7.6 Hz ) , 3.79 ( 6H, s ) , 3.64 ( 2H, s ) , 3.11 ( 2H, s ) , 1.68 ( 4H, s )
(化合物9) : 7.44~7.20 ( 9H, m ), 6.82 ( 4H, d, J = 8.8 Hz) , 3.79 ( 6H, s ) , 3.63 ( 2H, q,  J = 6.1 Hz ) , 3.06 ( 2H, t, J = 6.4 Hz ) , 1.66~1.17 ( 6H, m )
(化合物10) : 7.43~7.18 ( 9H, m ), 6.82 ( 4H, d, J = 8.4 Hz ) , 3.79 ( 6H, s ) , 3.62 ( 2H, q, J = 5.6 Hz ) , 3.05 ( 2H, t, J = 6.0 Hz ) , 1.66~1.16 ( 8H, m )
＜化合物11～15の合成＞
　トリチル体６～１０の残った片方の水酸基を亜リン酸化しアミダイト体11～15を得た。以下、詳細を説明する。なお、以下の反応は化合物別に行ったものである。また、グローブバック中、完全無水条件下で操作を行った。
　一晩真空乾燥した化合物6（0.294g）、同7（0.g）、同8（0.g）、同9（0.172g）、同10（0.g）をdry THFに溶解させ、各々DIPEA（3当量分）と亜リン酸化試薬（1.5当量分）を加えた。その後、グローブバックから取り出し、室温で0.5～1時間攪拌した。TLC（Hex:EtOAc=2:1）により原料の消失を確認した。その後CHCl3と飽和NaHCO3 aqで抽出し、有機層を飽和NaCl aqで洗浄し、無水Na2SO4を加え乾燥した。溶媒を減圧留去後、中性シリカゲルクロマトグラフィー（Hex:EtOAc=3:1）にて単離精製し、目的化合物11（0.82g、76%）、12（0.67g、62%）、13（0.90g、77%）、14（0.71g、60%）、15（1.09g、88%）を得た。
31P NMR（160MHz、CDCl3）[ppm] : 149.21（化合物11）、149.13（化合物12）、147.92（化合物13）、147.90（化合物14）、147.76（化合物15）
＜CPG担体16～20の作成＞
　トリチル体6～10からそれぞれスクシニル化を経てＣＰＧ樹脂に結合させることで、CPG試薬16～20を得た。以下、詳細を説明する。
一晩真空乾燥した化合物6（0.29g）、化合物7（0.30g）、化合物8（0.24g）、化合物9（0.09g）、化合物10（0.08g）をdry DMF （0.1Msolution） に溶解し、そこに0.5当量分のDMAPと3当量分の無水コハク酸を加えAr雰囲気下、室温で48～72攪拌した。TLC（Hex:EtOAc=2:1）にて原料の消失を確認した。その後、EtOAcと飽和NaHCO3 aqで抽出し、有機層を飽和NaCl aqで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。溶媒を減圧留去し、それぞれのスクシニル体化合物を得た。
　次いで、一晩真空乾燥したスクシニル体（上記のスクシニル化反応が100％の収率だったと仮定）をdry DMF（CPGに対して0.02M solution）に溶解し、CPG樹脂（76～103μmol/g, 原料の1/4当量）を加えて溶液となじませた。この溶液にWSC（CPGに対して4eq）を加え、室温で72～120h振とうした。この樹脂をpyridineで洗浄し、0.1M DMAP溶液（pyridine:無水酢酸=9:1）を15mL加え、室温で48h振とうした。さらに樹脂をpyridine、EtOH、acetonitrileで洗浄し、デシケーター中で一晩真空乾燥した。得られたCPG試薬１６～２０の活性を測定した。活性値はCPG樹脂16：56.6 μmol/ g、同17：52.2 μmol/ g、同18：23.2 μmol/ g、同19：29.4 μmol/ g、同20：53.1 μmol/ gであった。
　なお、活性は以下の方法で測定した。すなわち、乾燥したCPG樹脂を6mgをガラスフィルターにのせ、HClO4 : EtOH＝3 : 2の溶液を流し込み、そのろ液のUV498nmの波長(DMTr基の波長)の吸光度を求め、以下の式に代入することにより算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000020
（オリゴヌクレオチドの合成及びＲＮＡ干渉剤の作製）
所定の３’末端ダングリングエンドを有するオリゴヌクレオチドを固相ホスホロアミダイト法に従って核酸自動合成機によって合成した。以下の表に示す３’ダングリング末端を有するガイド鎖（アンチセンス鎖）及びパッセンジャー鎖（センス鎖）をそれぞれ合成した。ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各３’ダングリング末端以外の塩基配列を以下に示す。このＲＮＡ干渉剤は、ウミシイタケの蛍光タンパク質であるRenilla Luciferaseをコードする遺伝子の発現抑制を意図したものとなっている。
　また、３’末端に以下に示すＰＢを有するセンス鎖及びアンチセンス鎖もWO2007/094135号パンフレットの記載に従い合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　こうして合成したアンチセンス鎖及びガイド鎖をそれぞれ等モル量ずつ合わせ、図４に示すように、各種態様のガイド鎖及びパッセンジャー鎖の組み合わせでアニーリングすることにより、実施例及び比較例のＲＮＡ干渉剤を作製した。
　ガイド鎖：５’－gua gga gua gug aaa ggc c-３’（配列番号１）
　パッセンジャー鎖：５’－ggc cuu uca cua cuc cua c-３’（配列番号２）
　なお、核酸の固相合成は、ホスホロアミダイト法に準じて行い、その後CPG樹脂からの切り出し及び保護基の除去を行い精製後（PAGEまたはHPLC）、MALDI-TOF/MSにて目的オリゴヌクレオチドの分子量を確認した。表１に、精製後のオリゴヌクレオチドの収量及び収率を以下に示す、
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
（評価）
　実施例２で作製したＲＮＡ干渉剤の評価を以下のようにして行った。すなわち実施例及び比較例のＲＮＡ干渉剤を用い、HeLa細胞を用いたDual Luciferase repoter assayを行い、ノックダウン効果を評価した。合成したｓｉＲＮＡはRenilla Luciferaseをターゲットにしており、この遺伝子とコントロール遺伝子（firefly Luciferase）を発現するベクターとｓｉＲＮＡを同時にHeLa細胞にトランスフェクションすることで、そのノックダウン効果を測定した。なお、具体的操作及び試薬を以下に示す。また、結果を図５及び図６に示す。
（操作）
　細胞をプレートに播種し（4～5×103 cells/ well）、２４時間培養後、OPTI-MEMとtransfastを用いて各量のsiRNAとvectorをトランスフェクションした。トランスフェクション時間は、１時間で行った。２４時間培養後、培地を吸引し、その後、細胞を一晩 －８０℃で保存した。翌日、評価を行った。評価は、プロメガ社のプロトコールに従って行った。
（試薬等）
細胞：HeLa細胞
プレート：９６ウェルプレート（BD falcon)
培地：D-MEM(Wako)+10%BS(SIGMA) or OPTI-MEM (Invitrogen)
トランスフェクション試薬: transfastTM（0.1mM concentration, 0.3μL/ well）
siRNA : Renilla遺伝子を標的とするsiRNA（図示する各濃度）
ベクター: psiCHECKTM-2 Vectors (promega, 20ng/ well)
アッセイキット: Dual-GloTMLuciferase Assay System (promega)
　図５及び図６に示すように、オリゴヌクレオチドの３’末端に極性の高いユニットを導入すると、当該オリゴヌクレオチドがガイド鎖として作用することが抑制されることがわかった。したがって、こうしたユニットをパッセンジャー鎖の３’末端に導入しておくことで、パッセンジャー鎖によるオフ・ターゲット効果が抑制されることがわかった。
　本実施例では、マイクロアレイ解析を用いて、パッセンジャー鎖の３’末端への極性の高いパズドメイン低親和性ユニットを導入することによるパッセンジャーによるオフ・ターゲット効果の抑制効果を確認した。操作としては、細胞に本開示に係るＲＮＡ干渉剤（ｓｉＲＮＡ、実施例２及び３と同様にウミシイタケの蛍光タンパク質であるRenilla Luciferaseをコードする遺伝子の発現抑制を意図したもの）とコントロールｓｉＲＮＡを導入したのち、全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを調製してマイクロアレイで遺伝子発現を確認することにより行った。
（トランスフェクション）
　10%BS含有細胞培養液（D-MEM、Wako）で継代培養を行っているHeLa細胞を用いた。トランスフェクション前日に24ウェルプレートに5000cells/wellになるように播種した。翌日、A：plasmid only（ネガティブコントロール）、B：plasmid + TT:TT siRNA(100nM)（ポジティブコントロール）、C：plasmid + TT:EE siRNA(100nM)（本開示のＲＮＡ干渉剤）の3つの条件でOPTI-MEM (Invitrogen) を用いてトランスフェクションを行った。なお、ＣのプラスミドにおけるTT:EEのEEは、エチレングリコールを２個連結していることを意味している。
　トランスフェクションしたプラスミドはプロメガ社のpsi-check-2 vectorであり、用いたsiRNAの配列はアンチセンス鎖：5’- guaggaguagugaaaggcc -3’（配列番号１）、センス鎖：5’- ggccuuucacuacuccuac -3’（配列番号２）であった。1時間後に血清入りメディウム（500μl /well）を追加した。24時間経過後に細胞をトリプシン-EDTA溶液（Invitrogen）を用いて回収した。
（RNA抽出）
　Qiagen社のRNeasy mini kitを用いて、推奨プロトコルを参考に回収した細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNA溶液の吸光度を測定したところ、A：792.4ng/μl、B：941.6 ng/μl、C：642.8 ng/μlであった。
（マイクロアレイ解析）
　細胞から抽出したtotal RNAをドライアイス入りの冷凍便で北海道システムサイエンス株式会社へ郵送し、マイクロアレイ解析（Agilent Techologies社のSurePrint G3 Human GE Ver. 2.0 8x60K 1color）を依頼した。この依頼解析にはtotal RNAの品質検査、total RNAからのcDNAの合成、cRNAのラベル（Cy3）化と増幅、ハイブリダイズ、スキャン作業は含まれていた。納品された生データをマイクロアレイデータ解析ソフトであるGeneSpring 12.5を用いて詳細解析した。まず、すべてのraw dataを75%tileでノーマライズ（チップ間補正）した。その後発現量でのフィルタリング（20-100%tile）を行った。
（ハウスキーピング遺伝子発現量の比較）
　Agilent Techologies社のDNAマイクロアレイ上のスキーピング遺伝子は同一遺伝子であってもプローブ配列が違うチップが数箇所存在していたため、用いるアレイデータの信頼性の担保として比較を行った。その結果、条件Aを1とした場合、すべてのチップで比較発現量の値が0.85から1.15の幅であった。よって以後、この間の発現量の振れ幅は差がないものとして扱うこととした。逆に述べると、0.85倍以下もしくは1.15倍以上に発現量に増減があった遺伝子について、差があるものとして扱うこととした。
（マイクロアレイ解析結果とリアルタイムRT-PCRでの遺伝子発現相対定量結果の比較）
　既述のA、B、Cの条件でトランスフェクションを行ったそれぞれの細胞からtotal RNAを抽出し、GAPDH遺伝子とNCF1遺伝子についてリアルタイムRT-PCR法を用いてCt値からの相対定量を行った。リアルタイムRT-PCR についてはTaKaRa社のOne Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit (SYBR Green I検出系) を用い、推奨プロトコル通りにPCR反応を行った。その結果、GAPDH遺伝子をコントロールとした場合でNCF1遺伝子は図７の通り相関が見られることが確認できた。2つの遺伝子について、PCR反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
GAPDH-For　　　　　TATAAATTGAGCCCGCAGCC（配列番号３）
GAPDH-Rev　　　　　CCATGGTGTCTGAGCGATGT（配列番号４）
NCF1-For　　　　　 GAAGGTGTCCCCCATGACTG（配列番号５）
NCF1-Rev　　　　　 TCCAGTGCATTTAAGGCGCA（配列番号６）
（マイクロアレイデータ解析による数的解釈1）
　上述でフィルタリングをかけて得られたマイクロアレイデータから、fold change解析を行った。fold changeフィルタリング時の指定値は、ハウスキーピング遺伝子の発現量の比較結果から、1.15とした。結果を図８に示す。
　その結果、A（ネガティブコントロール） vs B（ポジティブコントロール）（以下、Ａ／Ｂ）で発現量の差が認められた遺伝子は19955個であり、この内AよりBで発現量が減少した遺伝子（図中A/B up）は11658個、増加したもの（図中A/B down）は8297個であった。またＡ／Ｃ（本開示のＲＮＡ干渉剤）で発現量の差が認められた遺伝子数は19814であり、この内AよりCで発現量が減少した遺伝子（図中A/C up）は11631個、増加したもの図中A/C down）は8183個であった。この数値の相違がすべてセンス鎖によるオフ・ターゲット効果とその抑制結果に起因するとは言えない（アンチセンス鎖によるオフ・ターゲット効果も存在するため）が、コントロールをAとした場合、CよりBで発現抑制的に働く遺伝子が２７個存在することが判明し、本開示のＲＮＡ干渉剤によるオフ・ターゲット効果の抑制を確認できた。
（マイクロアレイデータ解析による数的解釈2）
　また、図９のようにfold changeフィルタリングの指定値を1とした場合、総数44428遺伝子の内、AよりBで減少した遺伝子（図中A/B up）は26436、増加した遺伝子（図中A/B down）は17992であり、AよりCで減少した遺伝子（図中A/C up）は21476、増加した遺伝子（図中A/C down）は22952となった。既述の通りこの数値がすべてセンス鎖によるオフ・ターゲット効果とその抑制結果に起因するとは言えないが、コントロールをAとした場合、CよりBで発現抑制的に働く遺伝子が4960個存在することが判明し、本開示のＲＮＡ干渉剤によるオフ・ターゲット効果の抑制を確認できた。
（マイクロアレイデータ解析による特定遺伝子についての発現量の比較）
　本開示のＲＮＡ干渉剤（Ｃ）のセンス鎖配列を用いたBLAST検索より、ターゲットとなり得る可能性の高い特定の遺伝子を同定した。それぞれの遺伝子についてマイクロアレイデータから発現量の比較を行った。１本鎖化されたsiRNAがターゲットmRNAを認識し切断する部位は、5’側から数えて10番目と11番目の間であることが既に分かっている。その部位とシード領域（2～8番目）を含めた相補配列が一致する遺伝子4種類についてＡ～Ｃ条件における発現強度を比較した（Ａを基準とした）。結果を図１０に示す。
　図１０に示すように、上記遺伝子４種類に対応するマイクロアレイ上の９スポットに関し、Ｂのアレイ解析では蛍光強度が低かったのがＣのアレイ解析においては蛍光強度が増大し、Ａ（ネガティブコントロール）のアレイ解析結果に近づいた。これらの結果から、Ｃのマイクロアレイにおいてオフ・ターゲット効果の回避が確認された。マイクロアレイ上の各遺伝子検出用のプローブ配列（60mer（配列番号７～１２）を以下に示す。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
配列番号１、２：ｓｉＲＮＡ
配列番号３～６：プライマー
配列番号７～１２:プローブ

Claims (13)

  1. 　３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上を備える、一本鎖オリゴヌクレオチド。
  2. 　前記ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、以下の式（１）で表される、請求項１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （ただし、Ｘは、酸性基又は塩基性基又はこれらを有する連結基であり、Ｙは、炭素数が２以上の基を表し、ｎは１又は２以上の整数を表す。）
  3. 　Ｙは炭素数が２の基を表す、請求項２に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
  4. 　前記式（１）は、以下の式で表される、請求項２又は３に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  5. 　前記ＰＡＺドメイン低親和性ユニットを２個備える、請求項１～４のいずれかに記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
  6. 　標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、
    　請求項１～５のいずれかに記載の一本鎖オリゴヌクレオチドであって前記アンチセンス部位に特異的にハイブリダイズするパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと、
    を備える、ＲＮＡ干渉剤。
  7. 　前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドの３’末端には、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットを備える、請求項６に記載のＲＮＡ干渉剤。
  8. 　前記ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、以下の式で表される、請求項７に記載のＲＮＡ干渉剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ａは独立して以下のいずれかの式を表し、ｍは１又は２以上の整数を表す。]
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  9. 　ＲＮＡ干渉剤の製造方法であって、
    　３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上を備える、一本鎖オリゴヌクレオチドであるパッセンジャー鎖とガイド鎖とを準備し、ハイブリダイゼーションにより二重鎖ＲＮＡを形成する工程、
    を備える、製造方法。
  10. 　以下の式で表される、オリゴヌクレオチド合成試薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式中、Ｙは、炭素数が１以上４以下のアルキレン基を表し、Ｗ１は、水素原子又はヒドロキシル保護基を表し、Ｗ２は、水素原子、ホスホルアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。）
  11. 　遺伝子の機能の評価方法であって、
    　前記遺伝子を標的遺伝子として、請求項６～８のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
    　前記遺伝子を保持する細胞に前記ＲＮＡ干渉剤を導入して、前記細胞における変化を評価する工程、
    を備える、評価方法。
  12. 　ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法であって、
    　標的遺伝子の１又は２以上の異なる所定の塩基配列に対するアンチセンス部位候補をそれぞれ有する１又は２以上の請求項６～８のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
    　前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における前記標的遺伝子の発現状態を評価する工程と、
    を備える、スクリーニング方法。
  13. 　ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法であって、
    　標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖と、３’末端に１又は２以上のＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補を有するパッセンジャー鎖と、を有する１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
    　前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における変化を評価する工程と、
    を備える、スクリーニング方法。
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