WO2023224102A1 - 新規Ｓｔａｐｌｅ核酸 - Google Patents

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WO2023224102A1
WO2023224102A1 PCT/JP2023/018646 JP2023018646W WO2023224102A1 WO 2023224102 A1 WO2023224102 A1 WO 2023224102A1 JP 2023018646 W JP2023018646 W JP 2023018646W WO 2023224102 A1 WO2023224102 A1 WO 2023224102A1
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WO
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nucleic acid
guanine
target nucleic
nucleotide sequence
sequence
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PCT/JP2023/018646
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陽介 勝田
敏博 井原
裕介 北村
匠人 嘉村
克典 下竹
結愛 五木
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国立大学法人熊本大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to developing novel Staple nucleic acids.
  • the invention also relates to developing uses for traditional and novel Staple nucleic acids.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 2
  • siRNA can be designed relatively easily, and by referring to existing reports on the target gene, it is possible to design multiple target sequences for one target mRNA. By selection, gene expression can be strongly suppressed.
  • Non-patent Document 3 Since both technologies exert gene expression suppression function through a simple mechanism of binding to mRNA, the problem is that unexpected effects (off-target effects) are unavoidable (Non-patent Document 3). However, there are issues that must be resolved before it can be used in the human body.
  • Non-Patent Document 4 Non-Patent Document 4
  • guanine tetranucleotide that binds to a target mRNA sequence in a sequence-specific manner and utilizes the four guanine repeat sequences present on the target mRNA.
  • a Staple nucleic acid that has the function of inducing the formation of a heavy chain structure, and developed a method for inhibiting ribosomal peptide synthesis reactions and protein translation reactions using the guanine quadruplex structure induced by the Staple nucleic acids.
  • An object of the present invention is to develop a Staple nucleic acid that can form a guanine quadruplex structure on a target nucleic acid even when there are no four guanine repeat sequences on the target nucleic acid.
  • the present invention also aims to develop various uses of existing Staple nucleic acids and Staple nucleic acids of the present invention.
  • the inventors of the present invention have provided a guanine repeat sequence using an oligonucleotide, and as a result, a total of four guanine repeat sequences, ie, a guanine repeat on the target nucleic acid and a guanine repeat on the oligonucleotide, can be applied to the target nucleic acid.
  • the above problems were solved by developing Staple nucleic acids (second generation Staple nucleic acids) that can form a guanine quadruplex structure.
  • the present invention has also developed novel uses of Staple nucleic acids for first generation Staple nucleic acids and second generation Staple nucleic acids.
  • the G-supplying oligonucleotide changes the conformation of the target nucleic acid by hybridizing the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence to the target nucleic acid, and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid and the G-supplying oligonucleotide
  • the G-supply type oligonucleotide wherein the spatial distance of the four guanine repeat sequences is shortened together with the guanine repeat sequence, and a guanine quadruplex structure is formed by the four guanine repeat sequences; [2]:
  • the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence of the G-supplying oligonucleotide are nucleotide sequences on the 5' side or 3' side of
  • the G-supplying oligonucleotide changes the conformation of the target nucleic acid by hybridizing the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence to the target nucleic acid, and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid and the G-supplying oligonucleotide comprising the G-supplying oligonucleotide, which shortens the spatial distance of the four guanine repeat sequences and forms a guanine quadruplex structure by the four guanine repeat sequences; pharmaceutical composition; [5]:
  • the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence of the G-supplying oligonucleotide are nucleotide sequences on the 5' side or 3' side of the guanine repeat sequence on the
  • the method for producing a G-supplying oligonucleotide comprising: The first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence of the G-supply oligonucleotide hybridize to the target nucleic acid, and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid and the guanine repeat sequence on the G-supply oligonucleotide form a total of four locations.
  • the method characterized in that the G-supply oligonucleotide is designed and synthesized so as to be folded back so as to shorten the spatial distance of the guanine repeat sequences; [8]:
  • the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence of the G-supplying oligonucleotide are nucleotide sequences on the 5' side or 3' side of the guanine repeat sequence on the 3' end side of the guanine repeat sequence on the target nucleic acid.
  • the G-supplying oligonucleotide changes the conformation of the target nucleic acid by hybridizing the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence to the target nucleic acid, and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid and the G-supplying oligonucleotide
  • the spatial distance of the four guanine repeat sequences becomes shorter, and the four guanine repeat sequences form a guanine quadruplex structure, which increases protein expression from the target nucleic acid.
  • the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence of the G-supplying oligonucleotide are nucleotide sequences on the 5' side or 3' side of the guanine repeat sequence on the 3' end side of the guanine repeat sequence on the target nucleic acid.
  • the G-supplying oligonucleotide changes the conformation of the target nucleic acid by hybridizing the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence to the target nucleic acid, and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid and the G-supplying oligonucleotide
  • the spatial distance of the four guanine repeat sequences becomes shorter, and these four guanine repeat sequences form a guanine quadruplex structure, which facilitates protein expression from the target nucleic acid.
  • a kit for suppressing protein expression comprising the G-supplying oligonucleotide; [15]: The first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence of the G-supplying oligonucleotide are nucleotide sequences on the 5' side or 3' side of the guanine repeat sequence on the 3' end side of the guanine repeat sequence on the target nucleic acid. part, - The protein expression suppression kit described in [14], which hybridizes to the nucleotide sequence portion on the 5' or 3' side of the guanine repeat sequence on the 5'end; [16]: The protein expression suppression kit according to [14] or [15], wherein the protein expression is suppressed by suppressing reverse transcription reaction or protein translation reaction.
  • the oligonucleotide comprising: The oligonucleotide changes the three-dimensional structure of the target nucleic acid by hybridizing the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence to the target nucleic acid, and changes the guanine repeat sequence on the target nucleic acid and the guanine repeat sequence on the oligonucleotide.
  • the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence of the oligonucleotide are a nucleotide sequence portion on the 5' side or 3' side of the guanine repeat sequence on the 3' end side of the guanine repeat sequence on the target nucleic acid, -
  • the method for producing the modified protein according to [17] which hybridizes to the nucleotide sequence portion on the 5' or 3' side of the guanine repeat sequence on the 5'end; [19]: A method for producing the modified protein according to [17] or [18], which is DNA, RNA, modified nucleic acid
  • An oligonucleotide comprising, hybridization of the first nucleotide sequence of the oligonucleotide to the first target nucleic acid and the hybridization of the second nucleotide sequence of the oligonucleotide to the second target nucleic acid, and the oligonucleotide changes the conformation of the target nucleic acids; 1 to 2 guanine repeat sequences on the first target nucleic acid, 1 to 2 guanine repeat sequences on the second
  • the spatial distance between the four guanine repeat sequences becomes shorter, and these four guanine repeat sequences form a guanine quadruplex structure, which allows the first target nucleic acid and the second target nucleic acid to A method for producing a fusion protein of a translation product of a partial sequence of a first target nucleic acid and a translation product of a partial sequence of a second target nucleic acid by ribosome shunting between the target nucleic acid; [21]:
  • the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence of the oligonucleotide are a nucleotide sequence portion on the 5' side or 3' side of the guanine repeat sequence on the 3' end side of the guanine repeat sequence on the target nucleic acid, -
  • the oligonucleotide comprising: The oligonucleotide changes the three-dimensional structure of the target nucleic acid by hybridizing the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence to the target nucleic acid, and changes the guanine repeat sequence on the target nucleic acid and the guanine repeat sequence on the oligonucleotide.
  • the spatial distance of the four guanine repeat sequences becomes shorter, and these four guanine repeat sequences form a guanine quadruplex structure, which inhibits the binding of nuclease to the target nucleic acid or degrades the nucleic acid.
  • a method of stabilizing a target nucleic acid by inhibiting the function of an enzyme [24]: The first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence of the oligonucleotide are a nucleotide sequence portion on the 5' side or 3' side of the guanine repeat sequence on the 3' end side of the guanine repeat sequence on the target nucleic acid, - The method for stabilizing the target nucleic acid described in [23], which hybridizes to the nucleotide sequence portion on the 5' or 3' side of the guanine repeat sequence on the 5'end; [25]: A method for stabilizing the target nucleic acid according to [29] or [30], which is DNA, RNA, modified nucleic acid, or a combination thereof.
  • the present invention provides a guanine repeat sequence using an oligonucleotide, and as a result, a guanine quadruplex is formed on the target nucleic acid by a total of four guanine repeat sequences: the guanine repeat on the target nucleic acid and the guanine repeat on the oligonucleotide.
  • the present invention can also provide novel uses of oligonucleotides for first generation Staple nucleic acids and second generation Staple nucleic acids.
  • FIG. 1 is a diagram showing the formation of a guanine quadruplex structure when the binding mode of G-supplied Staple nucleic acids is changed.
  • FIG. 2 is a diagram showing the construction of a guanine quadruplex structure using G-supplied Staple nucleic acids in the model sequences 2+1 100nt, 1+1 100nt_mut 1, and 1+1 100nt_mut 2.
  • (A) is the result of fluorescence measurement using Thioflavin T in m2+1 100nt RNA
  • (B) is the result of fluorescence measurement using Thioflavin T in 1+1 100nt_mut 1 RNA
  • ( C) shows the results of fluorescence measurement using Thioflavin T on 1+1 100nt_mut 2 RNA.
  • FIG. 3 is a diagram showing the identification of the formation position of a guanine quadruplex structure in various target nucleic acid sequences.
  • (A) shows the results of a stop assay on a 1+1 100nt RNA sequence
  • (B) shows the results of a stop assay on a TRPC6 5'UTR RNA sequence
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of examining the length of G-supplied Staple nucleic acid and T linker in the TRPC6 5'UTR sequence.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of evaluating the influence of a guanine quadruplex structure constructed using a G-supplied Staple nucleic acid on a protein translation reaction.
  • (A) shows a schematic diagram of each nucleic acid template used for in vitro translation
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of evaluating whether target nucleic acid stability is improved depending on the presence or absence of Staple nucleic acid.
  • Figure 7 shows PTC GFP (no Staple nucleic acid), ⁇ type1 GFP (no Staple nucleic acid), PTC GFP (Staple nucleic acid 1), PTC GFP (Staple nucleic acid 2 ) is a diagram showing the results of comparing GFP signal intensities.
  • FIG. 8-1 is a diagram showing that the stability of target nucleic acid was significantly improved by the presence of Staple nucleic acid.
  • FIG. 8-2 is a diagram showing that when cells were used, the presence of Staple nucleic acid increased the stability of the target nucleic acid, resulting in enhanced protein expression within the cells.
  • FIG. 9-1 is a diagram showing that the stability of the target nucleic acid was significantly improved by the presence of Staple nucleic acid.
  • FIG. 9-2 is a diagram showing that when cells were used, the presence of Staple nucleic acid increased the stability of the target nucleic acid, resulting in enhanced protein expression within the cells.
  • FIG. 10 is a diagram showing that ribosome shunting can be caused within a single molecule by using the Staple nucleic acid of the present invention.
  • FIG. 11 is a diagram showing that the Staple nucleic acid of the present invention can cause ribosome shunting between two molecules.
  • Staple nucleic acid hybridizes to two sequences on a target nucleic acid in a sequence-specific manner, changes the three-dimensional structure of the target nucleic acid, and uses the guanine repeat sequence present on the target nucleic acid to generate a guanine quadruple
  • Non-G-supplied Staple nucleic acids also referred to as non-G-supplied oligonucleotides, first-generation Staple nucleic acids
  • G-supplied Staple nucleic acids also referred to as G-supplied oligonucleotides, second-generation Staple nucleic acids
  • Non-G-supplying Staple nucleic acid This is one type of Staple nucleic acid, and is a Staple nucleic acid that does not contain a guanine repeat sequence within the Staple nucleic acid itself, which is created with reference to the Staple nucleic acid disclosed in Patent Document 1. means.
  • the non-G-supplying Staple nucleic acid in the present invention is also referred to as a non-G-supplying oligonucleotide or a first-generation Staple nucleic acid.
  • G-supplied Staple nucleic acid This is one type of Staple nucleic acid, and refers to a Staple nucleic acid newly disclosed in the present invention that contains at least one guanine repeat sequence within the Staple nucleic acid itself. It hybridizes to two sequences on the target nucleic acid in a sequence-specific manner, changing the three-dimensional structure of the target nucleic acid, and creating a link between the guanine repeat sequence present on the target nucleic acid and the guanine repeat sequence present in the G-supplied Staple nucleic acid.
  • the G-supplied Staple nucleic acid in the present invention is also referred to as a G-supplied oligonucleotide or second-generation Staple nucleic acid.
  • Nucleic acid The nucleic acid constituting the Staple nucleic acid in the present invention refers to either a naturally occurring nucleic acid or a non-naturally occurring nucleic acid (non-natural nucleic acid).
  • Naturally occurring nucleic acids refer to DNA or RNA that are composed of nucleobases (ie, adenine (a), guanine (g), cytosine (c), thymine (t), and uracil (u)).
  • a nucleic acid that does not exist in nature is a nucleic acid whose physical properties have been changed by modifying the nucleobase, sugar, or phosphodiester moiety, and is also called a modified nucleic acid.
  • the first generation Staple nucleic acid in the present invention refers to a Staple nucleic acid prepared with reference to the Staple nucleic acid disclosed in Patent Document 1. That is, this first generation Staple nucleic acid is structurally characterized in that it does not contain a guanine repeat sequence constituting a guanine quadruplex structure within the Staple nucleic acid itself.
  • the first-generation Staple nucleic acid of the present invention is a nucleotide sequence portion containing four guanine repeat sequences on a target nucleic acid, in the vicinity of any two of the guanine repeat sequences (i.e., 5 guanine repeat sequences).
  • an oligonucleotide comprising a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence that hybridize to a nucleotide sequence (' or 3' side),
  • the three-dimensional structure of the target nucleic acid hybridized to the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence is changed, the spatial distance of the four guanine repeat sequences on the target nucleic acid is shortened, and the four guanine repeats are It refers to the oligonucleotide described above that has the function of forming a guanine quadruplex structure with repeating sequences.
  • a guanine quadruplex structure in a cell is a stable nucleic acid higher-order structure that is constructed when guanine repeat sequences of 3 or more bases exist in four locations in close spatial arrangement of less than 7 bases.
  • the inventors of the present invention have realized that even if the guanine repeat sequences exist at positions separated by a spacing of 7 bases or more on a target nucleic acid, the appropriately designed first nucleotide sequence and second nucleotide sequence of the present invention can be used.
  • guanine repeat sequence in the target nucleic acid to which the first generation Staple nucleic acid binds refers to a continuous sequence containing three or more guanine bases present on the target nucleic acid, or between guanine and guanine.
  • Specific guanine repeat sequences include, for example, GGG, GNGG (N may be any base, and the number may be one or more).
  • the type of target nucleic acid may be either RNA or DNA.
  • the type of target nucleic acid is determined depending on the intended use of the Staple nucleic acid.
  • the oligonucleotide In order for the first generation Staple nucleic acid of the present invention to form a guanine quadruplex structure in cells, the oligonucleotide must be ⁇ The ability to recognize the target nucleic acid sequence, - It is necessary to simultaneously have the ability to induce the formation of a guanine quadruplex structure.
  • the ability of the first-generation Staple nucleic acid to recognize the sequence of the target nucleic acid is due to the fact that the oligonucleotide that is the first-generation Staple nucleic acid is located near the guanine repeat sequence (i.e., on the 5' or 3' side) of the target nucleic acid. This is accomplished by including a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence that hybridize to the nucleotide sequence.
  • the sequences of the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence in the first generation Staple nucleic acid are different depending on the sequence of the target nucleic acid, and the spatial distance between the four guanine repeat sequences on the target nucleic acid is different from each other depending on the sequence of the target nucleic acid. It is possible to select two sequence parts on a target nucleic acid so that they can be brought close to each other, and to determine a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence so as to hybridize to those two sequence parts. can.
  • the first nucleotide sequence and second nucleotide sequence of the first generation Staple nucleic acid can be designed as appropriate.
  • a nucleotide sequence downstream (3' side) of one of the guanine repeat sequences of the target nucleic acid for example, immediately downstream ( A region of 13 to 20 bases starting from the bases within 20 bases from the 3' side (i.e., the 1st to 20th bases downstream of the guanine repeat sequence), or the upstream side of the guanine repeat sequence of the target nucleic acid ( Nucleotide sequence (for example, a region of 13 to 20 bases on the upstream side (5' side)) starting from the bases within 20 bases from the 5' side (i.e., the 1st to 20th bases downstream of the guanine repeat sequence) etc., and the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence can be designed to hybridize with those
  • the distance of the nucleotide sequence region on the target nucleic acid to which the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence hybridize from the guanine repeat sequence of the target nucleic acid (the distance from the guanine repeat sequence of the first nucleotide sequence or the second nucleotide sequence)
  • the number of nucleotides sandwiched between the nucleotide at the proximal end and G of the guanine repeat sequence can be appropriately determined by calculation regarding thermodynamic stability, and the distance (number of nucleotides) is not particularly limited. In studies conducted by the present inventors, the formation of a guanine quadruplex structure has been confirmed even when there is a distance of 20 nucleotides between them.
  • the starting point of the region to which the Staple nucleic acid hybridizes is preferably within 20 bases from the immediate downstream (3' side) or the immediate upstream (5' side) of the guanine repeat sequence (i.e., the downstream base of the guanine repeat sequence).
  • 1st to 5th bases downstream or upstream of the guanine repeat sequence more preferably 3 bases immediately downstream (3' side) or immediately upstream (5' side) of the guanine repeat sequence. (i.e., the first to third bases on the downstream or upstream side of the guanine repeat sequence) can be selected.
  • First generation Staple nucleic acids can be composed of DNA, RNA, modified nucleic acids, or a combination thereof.
  • the first generation Staple nucleic acid of the present invention has a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence linked directly or indirectly via a linker.
  • preferred nucleic acid forms can be selected in each region of the first nucleotide sequence, the second nucleotide sequence, and the optional linker.
  • the number of bases existing between the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence is the number of bases present in the linker of any nucleic acid.
  • the first-generation Staple nucleic acid changes the three-dimensional structure of the target nucleic acid, thereby changing the four positions on the target nucleic acid. It is necessary that the length is such that the spatial distance of the guanine repeating sequence can be shortened.
  • the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence are linked directly or indirectly through a linker, and the length of the entire Staple nucleic acid is determined by the nucleotide sequence of the target nucleic acid.
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid may be of any length designed based on criteria generally known in the art, such as GC content, Tm value, etc. It may have a longer nucleotide length.
  • the overall length of the Staple nucleic acid may be 26 to 40 nucleotides in length, but is not limited to these lengths.
  • the length of the region where the Staple nucleic acid hybridizes to the target nucleic acid may be the same or different. , but not limited to.
  • the hybridization reaction between the first-generation Staple nucleic acid designed as described above and the target nucleic acid can be performed either in vivo or in vitro, for example, ⁇ By mixing Staple nucleic acid in a solution containing target nucleic acid and annealing, ⁇ By simply mixing Staple nucleic acid into a solution containing target nucleic acid, ⁇ By introducing a short hairpin expression vector and expressing Staple nucleic acid from within cells, It can be carried out.
  • the hybridization reaction between the target nucleic acid and the Staple nucleic acid can be carried out, for example, at a reaction temperature of 24 to 55°C, for example, in 1 minute to 2 days.
  • the ability of the first-generation Staple nucleic acid to induce the formation of a guanine quadruplex structure is due to the presence of four guanine repeat sequences on the target nucleic acid, and the fact that the Staple nucleic acid hybridized to the target nucleic acid Changing the three-dimensional structure, shortening the spatial distance of the four guanine repeat sequences on the target nucleic acid, and as a result, inducing a guanine quadruplex structure by the four guanine repeat sequences on the target nucleic acid. It is realized by doing.
  • the formation reaction of a guanine quadruplex structure using the first generation Staple nucleic acid of the present invention can be carried out, for example, by causing a hybridization reaction between the target nucleic acid and the Staple nucleic acid and leaving it as it is. It can be carried out.
  • the formation reaction of the guanine quadruplex structure may be performed at the same temperature and time as the hybridization reaction between the target nucleic acid and the Staple nucleic acid, for example, at a reaction temperature of 24 to 55°C, for example, in 1 minute to 2 days. There may be.
  • Confirmation that a guanine quadruplex structure has been formed can be performed, for example, by an in vitro translation assay, a fluorescence signal measurement method by reacting with thioflavin T, a stop assay method, or the like.
  • the oligonucleotide described as a "short-chain nucleic acid" in this chemical formula 1 means a Staple nucleic acid, and by introducing this oligonucleotide, the four guanine repeat sequences on the target nucleic acid are brought into close proximity, and the guanine It induces the formation of a quadruplex structure.
  • the second generation Staple nucleic acid in the present invention refers to a Staple nucleic acid in which part of the four guanine repeat sequences constituting the guanine quadruplex structure is supplied by oligonucleotides. say. Specifically, this second generation Staple nucleic acid is structurally characterized in that it contains a guanine repeat sequence within the Staple nucleic acid itself.
  • the second-generation Staple nucleic acid in the present invention is a nucleotide sequence portion containing one to three guanine repeat sequences on a target nucleic acid, and a nucleotide sequence in the vicinity of any two of the guanine repeat sequences. (i.e., 5' or 3') and between 3 and 1 guanine, depending on the number of guanine repeats on the target nucleic acid.
  • a G-supplying oligonucleotide comprising a repeating sequence
  • the G-supplying oligonucleotide changes the conformation of the target nucleic acid by hybridizing the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence to the target nucleic acid, and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid and the G-supplying oligonucleotide
  • the above-mentioned G-supplying oligonucleotide is one in which the spatial distance of the four guanine repeat sequences is shortened together with the guanine repeat sequence, and a guanine quadruplex structure is formed by these four guanine repeat sequences. say.
  • "contains 1 to 3 guanine repeat sequences on the target nucleic acid” means that there is at least one guanine repeat sequence on the target nucleic acid to form a guanine quadruplex structure. This means that four or more guanine repeat sequences may be present on the target nucleic acid. When four or more guanine repeat sequences are present on the target nucleic acid, a guanine quadruplex structure is formed by one to three of the guanine repeat sequences. means.
  • the number of guanine repeat sequences on the target nucleic acid refers to the number of guanine repeat sequences on the target nucleic acid used to form a guanine quadruplex structure using the second generation Staple nucleic acid of the present invention. means number. For example, even if there are 4 or more guanine repeat sequences on the target nucleic acid, two of the guanine repeat sequences and the two guanine repeat sequences supplied by the G-supplying oligonucleotide When forming a guanine quadruplex structure, the "number of guanine repeat sequences on the target nucleic acid" is intended to be two.
  • the guanine quadruplex structure in cells is generally a stable nucleic acid high-order structure that is constructed when guanine repeat sequences of 3 or more bases exist in 4 locations in close spatial arrangement of less than 7 bases. It is a structure.
  • the inventors of the present invention have demonstrated that even when there are 1 to 3 guanine repeat sequences spaced apart by 7 or more bases on a target nucleic acid, the appropriately designed method of the present invention
  • These targets can be targeted by using G-supplied oligonucleotides containing one nucleotide sequence and a second nucleotide sequence, and between three and one guanine repeats, depending on the number of guanine repeats on the target nucleic acid.
  • a total of 4 guanine repeat sequences, 1 to 3 guanine repeat sequences present in nucleic acids and 3 to 1 guanine repeat sequences present in G-supply oligonucleotides, are brought spatially close to each other, We have discovered that it is possible to induce an artificial guanine quadruplex structure in a target nucleic acid.
  • a guanine repeat sequence in a target nucleic acid to which a second generation Staple nucleic acid binds refers to a continuous sequence containing 3 or more bases of guanine present on the target nucleic acid or 3 bases present in the Staple nucleic acid. Refers to a continuous sequence that contains more than one base of guanine.
  • Specific guanine repeat sequences include, for example, guanine repeat sequences that can be a forming element of a guanine quadruplex structure, such as GGG and GNGG (N indicates any nucleotide), which have been reported in papers. .
  • the type of target nucleic acid can be either RNA or DNA. There may be.
  • the type of target nucleic acid is determined depending on the intended use of the Staple nucleic acid.
  • the oligonucleotide In order for the second generation Staple nucleic acid of the present invention to form a guanine quadruplex structure in cells, the oligonucleotide must be ⁇ The ability to recognize the target nucleic acid sequence, ⁇ Depending on the number of guanine repeat sequences present on the target nucleic acid (however, if there are 4 or more guanine repeat sequences on the target nucleic acid, one of those guanine repeat sequences (meaning the use of ⁇ 3 guanine repeat sequences), the ability to supply guanine repeat sequences so that the total number of guanine repeat sequences is 4; - It is necessary to simultaneously have the ability to induce the formation of a guanine quadruplex structure.
  • the ability of the second generation Staple nucleic acid to recognize the sequence of the target nucleic acid is due to the fact that the oligonucleotide that is the second generation Staple nucleic acid is located near the guanine repeat sequence (i.e., on the 5' side or 3' side) on the target nucleic acid. This is accomplished by including a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence that hybridize to the nucleotide sequence.
  • the sequences of the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence in the second generation Staple nucleic acid are different depending on the sequence of the target nucleic acid, and the guanine repeat sequences at 1 to 3 positions on the target nucleic acid and the guanine repeat sequences at 1 to 3 positions on the target nucleic acid
  • Two sequence parts on the target nucleic acid can be used to reduce the spatial distance between the three to one guanine repeat sequences on the second-generation Staple nucleic acid and the four guanine repeat sequences in total.
  • a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence can be determined such that they hybridize to the two selected sequence portions.
  • the first nucleotide sequence and second nucleotide sequence of the second generation Staple nucleic acid can be designed as appropriate.
  • the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence of the Staple nucleic acid are the nucleotides near the 3'-most guanine repeat sequence (i.e., 5' side or 3' side) among the guanine repeat sequences on the target nucleic acid. array part, - You may select one that hybridizes to the nucleotide sequence portion closest to the 5' end (ie, 5' or 3' side) of the guanine repeat sequence.
  • the second generation Staple nucleic acid of the present invention a region of 13 to 20 bases immediately downstream (3' side) of one of the guanine repeat sequences of the target nucleic acid, and a region upstream of the guanine repeat sequence of the target nucleic acid.
  • the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence can be designed to select a region of 13 to 20 bases on the side (5' side) and hybridize with that region.
  • the first nucleotide sequence and second nucleotide sequence of the second-generation Staple nucleic acid of the present invention can be appropriately designed according to the intended use. For example, but not limited to the following characteristics: - at least one of the first nucleotide sequence or the second nucleotide sequence hybridizes to a portion of the nucleotide sequence in the vicinity of a guanine repeat sequence that precedes a stop codon on the target nucleic acid; - at least one of the first nucleotide sequence or the second nucleotide sequence hybridizes to a portion of the nucleotide sequence in the vicinity of a guanine repeat sequence present in the 5' untranslated region on the target nucleic acid; - The first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence both hybridize to a nucleotide sequence portion in the vicinity of a guanine repeat sequence present in the 5' untranslated region on the target nucleic acid; - The first nucleo
  • the distance of the nucleotide sequence region on the target nucleic acid to which the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence hybridize from the guanine repeat sequence of the target nucleic acid (the distance from the guanine repeat sequence of the first nucleotide sequence or the second nucleotide sequence)
  • the number of nucleotides sandwiched between the nucleotide at the proximal end and G of the guanine repeat sequence can be appropriately determined by calculation regarding thermodynamic stability, and the distance (number of nucleotides) is not particularly limited. In studies conducted by the present inventors, the formation of a guanine quadruplex structure has been confirmed even when there is a distance of 20 nucleotides between them.
  • Second generation Staple nucleic acids can be composed of DNA, RNA, modified nucleic acids, or a combination thereof.
  • the second generation Staple nucleic acid of the present invention has a first nucleotide sequence, a second nucleotide sequence, and 3 to 1 guanine repeat sequences linked directly or indirectly via a linker.
  • preferred forms of nucleic acids can be selected for each region of the first nucleotide sequence, the second nucleotide sequence, the 3 to 1 guanine repeat sequence, and the optionally included linker.
  • a linker connecting a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence refers to a linker connecting a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence.
  • the number of bases other than the first nucleotide sequence, second nucleotide sequence, and guanine repeat sequence existing between the guanine repeat sequence on the Staple nucleic acid and the guanine repeat sequence on the Staple nucleic acid is Refers to a linker for any nucleic acid.
  • the second generation Staple nucleic acid changes the three-dimensional structure of the target nucleic acid, thereby forming a guanine repeat sequence on the target nucleic acid. It is necessary that the length is such that the spatial distance between the four guanine repeat sequences can be shortened together with the guanine repeat sequences on the Staple nucleic acid.
  • the second generation Staple nucleic acid is one in which the first nucleotide sequence, the second nucleotide sequence, and 3 to 1 guanine repeat sequence are linked directly or indirectly via a linker, and the entire Staple nucleic acid is
  • the length varies depending on the nucleotide sequence of the target nucleic acid, and can be of any length designed based on criteria generally known in the art, such as GC content, Tm value, etc. It may be something.
  • the overall length of the Staple nucleic acid may be 26 to 40 nucleotides in length, but is not limited to these lengths.
  • the length of the region where the Staple nucleic acid hybridizes to the target nucleic acid may be the same or different. , but not limited to.
  • the hybridization reaction between the second generation Staple nucleic acid designed as described above and the target nucleic acid can be performed either in vivo or in vitro, as in the case of the first generation Staple nucleic acid, for example, ⁇ By mixing Staple nucleic acid in a solution containing target nucleic acid and annealing, ⁇ By simply mixing Staple nucleic acid into a solution containing target nucleic acid, ⁇ By introducing a short hairpin expression vector and expressing Staple nucleic acid from within cells, It can be carried out.
  • the hybridization reaction between the target nucleic acid and the Staple nucleic acid may be carried out at a reaction temperature of, for example, 24 to 55°C for, for example, 1 minute to 2 days.
  • the second generation Staple nucleic acid supplies guanine repeat sequences such that the number of guanine repeat sequences is four in total, depending on the number of guanine repeat sequences present on the target nucleic acid.
  • the second generation Staple nucleic acid is a G-supply type oligonucleotide in the sense of an oligonucleotide that supplies the guanine repeat sequence. It can be referred to as an oligonucleotide or a G-supplied Staple nucleic acid.
  • the ability of the second generation Staple nucleic acid to form a guanine quadruplex structure is determined by the ability of the guanine repeat sequence present on the target nucleic acid and the guanine repeat sequence present on the second generation Staple nucleic acid at four locations.
  • the presence of a guanine repeat sequence, the Staple nucleic acid hybridized to the target nucleic acid changes the three-dimensional structure of the target nucleic acid, and the space of the guanine repeat sequence at four locations on the target nucleic acid and the second generation Staple nucleic acid. This is achieved by shortening the target distance and, as a result, inducing a guanine quadruplex structure by a total of four guanine repeat sequences on the target nucleic acid and the second generation Staple nucleic acid.
  • the formation reaction of a guanine quadruplex structure using the second generation Staple nucleic acid of the present invention can be carried out, for example, by causing a hybridization reaction between the target nucleic acid and the Staple nucleic acid and leaving it as it is. It can be carried out.
  • the formation reaction of the guanine quadruplex structure may be performed at the same temperature and time as the hybridization reaction between the target nucleic acid and the Staple nucleic acid, for example, at a reaction temperature of 24 to 55°C, for example, in 1 minute to 2 days. There may be.
  • Confirmation that a guanine quadruplex structure has been formed can be performed, for example, by an in vitro translation assay, a fluorescence signal measurement method by reacting with thioflavin T, a stop assay method, or the like.
  • pattern A is the case where guanine repeat sequences are supplied at 3 positions by oligonucleotides
  • pattern B is when guanine repeat sequences at 2 positions are supplied by oligonucleotides
  • pattern B is the case where guanine repeat sequences at 1 position are supplied by oligonucleotides
  • Pattern C shows the case where nucleotides are used.
  • the present invention can also provide a method for producing the second generation Staple nucleic acid (G-supplied oligonucleotide) described above.
  • a nucleotide sequence containing one to three guanine repeat sequences on a target nucleic acid is hybridized to a nucleotide sequence near the guanine repeat sequence (i.e., on the 5' side or 3' side).
  • a method for producing a G-supplying oligonucleotide comprising a first nucleotide sequence, a second nucleotide sequence, and a guanine repeat sequence at three to one positions depending on the number of guanine repeat sequences on a target nucleic acid.
  • the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence of the G-supply oligonucleotide hybridize to the target nucleic acid, and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid and the guanine repeat sequence on the G-supply oligonucleotide form a total of four locations. It is possible to provide the above-mentioned method, which is characterized in that the G-supply oligonucleotide is designed and synthesized so as to be folded back so as to shorten the spatial distance of the guanine repeat sequence.
  • the Staple nucleic acid of the present invention it is important to appropriately design the structure of the Staple nucleic acid, that is, the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence for hybridizing to the target nucleic acid. It is important to appropriately design the number of guanine repeat sequences to be provided, and the linker connecting these sequence parts that may be included.
  • the Staple nucleic acid it is preferable to design it so as to reflect the characteristics of the second generation Staple nucleic acid described above.
  • Both the first generation Staple nucleic acid and the second generation Staple nucleic acid of the present invention can exhibit similar functions as a result of the formation of a guanine quadruplex structure.
  • the functions exerted by the first generation Staple nucleic acids can also be exerted by the second generation Staple nucleic acids
  • the functions exerted by the second generation Staple nucleic acids can also be exerted by the first generation Staple nucleic acids. able to demonstrate.
  • the function of the Staple nucleic acid of the present invention arises as a result of the formation of a guanine quadruplex structure, and is formed in both the first generation Staple nucleic acid and the second generation Staple nucleic acid. This is because the properties of the guanine quadruplex structures are similar.
  • a method for suppressing protein expression for example, as a result of the formation of a guanine quadruplex structure, ribosomes cannot bind to the target nucleic acid (mRNA), or ribosomes bound to the target nucleic acid (mRNA)
  • mRNA target nucleic acid
  • mRNA target nucleic acid
  • the sequence of the Staple nucleic acid of the present invention must be designed so that a guanine quadruplex structure is formed in the 5'UTR region and open reading frame region on the target nucleic acid. It is possible to perform the functions described above.
  • oligonucleotides having this structure are formed with the participation of guanine repeat sequences present in the 5' untranslated region (5'UTR) of the target nucleic acid.
  • 5'UTR 5' untranslated region
  • oligonucleotides having this structure are formed with the participation of guanine repeat sequences present in the 5' untranslated region (5'UTR) of the target nucleic acid.
  • guanine quadruplex structure protein translation reactions can be suppressed, resulting in an enzyme-independent protein translation suppression system (Chem. 3, upper left figure). ). This is because even if a ribosome binds to the 5'UTR of the target nucleic acid, the guanine quadruplex structure prevents the ribosome from proceeding to the 3' side of the target nucleic acid, and protein translation stops.
  • reverse transcriptase cannot bind to the target nucleic acid (RNA), or ) shows a case in which the progression of reverse transcriptase bound to 3' ⁇ 5' direction is stopped at the position of the guanine quadruplex structure, resulting in suppression of the protein expression reaction.
  • RNA target nucleic acid
  • a G-supplying oligonucleotide comprising a sequence, a second nucleotide sequence, and a guanine repeat sequence at three to one positions depending on the number of guanine repeat sequences on the target nucleic acid
  • the G-supplying oligonucleotide changes the conformation of the target nucleic acid by hybridizing the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence to the target nucleic acid, and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid and the G-supplying oligonucleotide
  • the spatial distance of the four guanine repeat sequences becomes shorter, and the four guanine repeat sequences form a guanine quadruplex structure, which increases protein expression from the target nucleic acid.
  • a suppression method can be provided.
  • the protein expression suppression function shown here is that even if the guanine quadruplex structure formed by the second-generation oligonucleotides, the guanine quadruplex structure formed by those oligonucleotides is It was shown in the present invention that this occurs similarly when it is formed in association with a guanine repeat sequence present in the translated region (5'UTR).
  • guanine quadruplex structure When a guanine quadruplex structure is formed by four guanine repeat sequences including a guanine repeat sequence present in the 3' untranslated region (3'UTR) of a target nucleic acid, the guanine quadruplex structure This is because it becomes unable to proceed to the 5' side of the target nucleic acid and suppresses the decomposition of the target nucleic acid by 3' ⁇ 5' exonuclease (Chem. 3, upper right figure).
  • the Staple nucleic acid of the present invention must be sequenced so that a guanine quadruplex structure is formed in the 3'UTR region of the target nucleic acid.
  • the oligonucleotide comprising: The oligonucleotide changes the three-dimensional structure of the target nucleic acid by hybridizing the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence to the target nucleic acid, and changes the guanine repeat sequence on the target nucleic acid and the guanine repeat sequence on the oligonucleotide.
  • the spatial distance of the four guanine repeat sequences becomes shorter, and these four guanine repeat sequences form a guanine quadruplex structure, which inhibits the binding of nuclease to the target nucleic acid or degrades the nucleic acid.
  • a method of stabilizing a target nucleic acid by inhibiting enzyme function can be provided.
  • the function of suppressing target nucleic acid degradation is the guanine quadruplex structure formed by first-generation oligonucleotides and the guanine quadruplex structure formed by second-generation oligonucleotides.
  • a similar phenomenon occurs when the guanine quadruplex structure formed by the oligonucleotide is formed in association with a guanine repeat sequence present in the 3' untranslated region (3'UTR) of the target nucleic acid.
  • the oligonucleotide comprising: The oligonucleotide changes the three-dimensional structure of the target nucleic acid by hybridizing the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence to the target nucleic acid, and changes the guanine repeat sequence on the target nucleic acid and the guanine repeat sequence on the oligonucleotide.
  • the spatial distance of the four guanine repeat sequences becomes shorter, and by forming a guanine quadruplex structure with these four guanine repeat sequences, a loop portion is formed in a part of the target nucleic acid, and the ribosome can provide a method for producing a modified protein from a target nucleic acid by shunting the loop portion.
  • the function of modifying and translating a partial sequence of a target nucleic acid has the ability to modify the guanine quadruplex structure formed by first-generation oligonucleotides and the guanine quadruplex structure formed by second-generation oligonucleotides.
  • the guanine quadruplex structure formed by these oligonucleotides is formed in association with guanine repeat sequences present in the exon region of the target nucleic acid, the same occurs.
  • a guanine quadruplex structure can also be formed between (also referred to as a first target nucleic acid and a second target nucleic acid), and the two types of target nucleic acids are substantially linked. Can be done.
  • ribosome shunt occurs in which the helicase activity does not function and the stable nucleic acid higher-order structure is bypassed.
  • ribosome shunting phenomenon does not occur unless a very long stem structure is constructed, but the guanine quadruplex structure formed by the oligonucleotide of the present invention is an extremely stable nucleic acid conformation. Therefore, it is possible to induce ribosome shunting between two types of target nucleic acids without the need for a long stem structure.
  • guanine quadruplex structure When a guanine quadruplex structure is formed in the exon region of each of the two types of target nucleic acids, when the ribosome bound to the first target nucleic acid advances in the 3' direction, the guanine quadruplex structure formed within the exon The ribosome shunts from the first target nucleic acid to the second target nucleic acid, and the translation of the subsequence of the first target nucleic acid is followed by the translation of the subsequence of the second target nucleic acid. can be translated by merging them (C4).
  • a nucleotide sequence portion containing one or two guanine repeat sequences on the first target nucleic acid is hybridized to a nucleotide sequence near the guanine repeat sequence (i.e., on the 5' side or 3' side).
  • a nucleotide sequence portion containing one to two guanine repeat sequences on the second target nucleic acid is hybridized to a nucleotide sequence near the guanine repeat sequence (i.e., on the 5' side or 3' side).
  • oligonucleotide comprising, hybridization of the first nucleotide sequence of the oligonucleotide to the first target nucleic acid and the hybridization of the second nucleotide sequence of the oligonucleotide to the second target nucleic acid, and the oligonucleotide changes the conformation of the target nucleic acids; 1 to 2 guanine repeat sequences on the first target nucleic acid, 1 to 2 guanine repeat sequences on the second target nucleic acid, and 2 to 0 guanine repeat sequences on the oligonucleotide.
  • the spatial distance between the four guanine repeat sequences becomes shorter, and these four guanine repeat sequences form a guanine quadruplex structure, which allows the first target nucleic acid and the second target nucleic acid to
  • the present invention provides a method for producing a fusion protein between a translation product of a partial sequence of a first target nucleic acid and a translation product of a partial sequence of a second target nucleic acid, by shunting of ribosomes between the target nucleic acid and the target nucleic acid. can.
  • the present invention can Pharmaceutical compositions containing Staple nucleic acids of the invention can be provided.
  • the pharmaceutical composition containing the Staple nucleic acid of the present invention may be in a form in which Staple nucleic acid prepared outside the body is administered, or in a form in which a vector that produces Staple nucleic acid is administered to an organism to produce Staple nucleic acid in vivo.
  • compositions of the invention include a therapeutically effective amount of the Staple nucleic acids of the invention, either alone or in combination with pharmaceutically acceptable carriers (additives), excipients, and/or diluents.
  • a vector capable of producing a therapeutically effective amount of the Staple nucleic acid of the present invention in vivo may be used alone or in a pharmaceutically acceptable carrier (additive) or excipient. It can be prepared by formulating it together with an agent and/or a diluent.
  • the term "therapeutically effective amount” as used herein refers to the amount of the Staple nucleic acid of the present invention that is effective to obtain a therapeutic effect based on the desired main effect, regardless of the presence or absence of side reactions.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to those commonly used in the art and does not cause undue toxicity, irritation, allergic reactions, or other problems or complications. Means a carrier suitable for application to human and animal tissues without generation.
  • Such carriers include pharmaceutically acceptable materials, compositions, or vehicles that are involved in transporting or transporting the compound of interest from one organ or body part to another, e.g. , liquid or solid fillers, diluents, excipients, manufacturing aids (e.g., lubricants, talc, magnesium, calcium stearate, zinc stearate, or stearic acid), or solvents containing materials. , but not limited to these.
  • compositions containing Staple nucleic acids of the invention can be used in combination with other ingredients. There are no particular limitations on such other components, and they may be used in combination with any other components. Since the Staple nucleic acid (oligonucleotide) of the present invention also has the functions described above in the section of "Function of oligonucleotide", a kit for realizing these functions containing the Staple nucleic acid of the present invention is provided. can do.
  • the contents of the kit are expanded, so are the contents of the kit.
  • a protein expression suppression kit containing Staple nucleic acid for realizing the function of "(1) Protein expression suppression" described above for example, A first nucleotide that hybridizes to a nucleotide sequence in the vicinity of the guanine repeat sequence (i.e., on the 5' side or 3' side) with respect to a nucleotide sequence portion containing one to three guanine repeat sequences on the target nucleic acid.
  • a G-supplying oligonucleotide comprising a sequence, a second nucleotide sequence, and a guanine repeat sequence at three to one positions depending on the number of guanine repeat sequences on the target nucleic acid
  • the G-supplying oligonucleotide changes the conformation of the target nucleic acid by hybridizing the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence to the target nucleic acid, and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid and the G-supplying oligonucleotide
  • the spatial distance of the four guanine repeat sequences becomes shorter, and these four guanine repeat sequences form a guanine quadruplex structure, which facilitates the binding of ribosomes to the target nucleic acid.
  • a kit for suppressing protein expression can be provided, which includes the G-supplying oligonucleotide, which inhibits or inhibits ribosome function.
  • Example 1 Design of second-generation Staple nucleic acid
  • a second-generation Staple was created that targets several mRNAs and supplies guanine repeat sequences with oligonucleotides to form a guanine quadruplex structure.
  • Nucleic acid was created.
  • This sequence has two guanine repeat sequences in the target nucleic acid, and only when two guanine repeat sequences are supplied by the second generation Staple nucleic acid of the present invention, a guanine quadruplex structure is created. This means that it can be formed.
  • oligonucleotides were designed and produced for this target nucleic acid.
  • type I oligonucleotides have two guanine repeats located between the first and second nucleotide sequences
  • type II oligonucleotides have two guanine repeats located between the first and second nucleotide sequences.
  • the repeating sequence is arranged so as to sandwich the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence.
  • Type I oligonucleotide As a type I oligonucleotide, (1-1) G-supply Staple nucleic acid (for 1+1 100nt RNA, type I): Type I G-supply Staple nucleic acid (1-2) Staple_A (for 1+1 100nt RNA, type I) 1+1 100nt RNA, type I): An oligonucleotide (1-1) in which the guanine repeat sequence was changed to an adenine repeat sequence was designed and synthesized.
  • oligonucleotides used herein were purchased from Thermo Fisher Scientific, Inc. In addition, all samples were desalted and purified before use.
  • oligonucleotides were used to evaluate the ability of G-supplied Staple nucleic acids to construct guanine quadruplex structures against target nucleic acids, which are known to bind to guanine quadruplex structures and emit fluorescence. Fluorescence measurements were performed using Thioflavin T (ThT).
  • Thioflavin T was performed by preparing the RNA sample of SEQ ID NO: 1 under the following conditions and performing fluorescence measurement using ThT.
  • a mixed solution (total volume: 50 ⁇ l) of RNA sample (2 ⁇ M), KCl (100 mM), 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6), and G-supplied Staple nucleic acid (2.5 ⁇ M) was heated at 90°C for 2 minutes. It was cooled down to 20°C at a rate of 1°C per minute.
  • Second-generation Staple nucleic acid with 2+1 100nt RNA as the target nucleic acid we designed and used another model target nucleic acid, "2+1 100nt RNA.”
  • the base sequence of 2+1 100nt RNA used as the target nucleic acid is as follows.
  • This sequence has three guanine repeat sequences in the target nucleic acid, and only when one guanine repeat sequence is supplied by the second generation Staple nucleic acid of the present invention, a guanine quadruplex structure is created. This means that it can be formed.
  • oligonucleotides were designed and produced for this target nucleic acid.
  • this oligonucleotide an attempt was made to design the oligonucleotide based on the positional relationship between the binding site of the first nucleotide sequence and the binding site of the second nucleotide sequence on the target nucleic acid and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid. That is, the oligonucleotide of this example is arranged such that one guanine repeat sequence is located between the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence.
  • G-supply Staple nucleic acid for 2+1 100nt RNA
  • G-supply Staple nucleic acid 2-2
  • Staple_A for 2+1 100nt RNA
  • oligonucleotides were used to evaluate the ability of G-supplied Staple nucleic acids to construct guanine quadruplex structures against target nucleic acids, which are known to bind to guanine quadruplex structures and emit fluorescence. Fluorescence measurements were performed using Thioflavin T (ThT).
  • This sequence has two guanine repeat sequences in the target nucleic acid, and only when two guanine repeat sequences are supplied by the second generation Staple nucleic acid of the present invention, a guanine quadruplex structure is created. This means that it can be formed.
  • oligonucleotides were designed and produced for this target nucleic acid.
  • this oligonucleotide an attempt was made to design the oligonucleotide based on the positional relationship between the binding site of the first nucleotide sequence and the binding site of the second nucleotide sequence on the target nucleic acid and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid. That is, the oligonucleotide of this example is arranged such that two guanine repeat sequences are located between the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence.
  • oligonucleotide As an oligonucleotide, (3-1) G-supplied Staple nucleic acid (for 1+1 100nt_mut 1 RNA): 1+1 100nt_mut 1 G-supplied Staple nucleic acid that targets RNA (3-2) Staple_A (for 1+1 100nt_mut 1 RNA): An oligonucleotide (3-1) in which the guanine repeat sequence portion was changed to an adenine repeat sequence was designed and prepared.
  • oligonucleotides were used to evaluate the ability of G-supplied Staple nucleic acids to construct guanine quadruplex structures against target nucleic acids, which are known to bind to guanine quadruplex structures and emit fluorescence. Fluorescence measurements were performed using Thioflavin T (ThT).
  • This sequence has two guanine repeat sequences in the target nucleic acid, and only when two guanine repeat sequences are supplied by the second generation Staple nucleic acid of the present invention, a guanine quadruplex structure is created. This means that it can be formed.
  • oligonucleotides were designed and produced for this target nucleic acid.
  • this oligonucleotide an attempt was made to design the oligonucleotide based on the positional relationship between the binding site of the first nucleotide sequence and the binding site of the second nucleotide sequence on the target nucleic acid and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid. That is, the oligonucleotide of this example is arranged such that two guanine repeat sequences are located between the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence.
  • oligonucleotide As an oligonucleotide, (4-1) G-supplied Staple nucleic acid (for 1+1 100nt_mut 2 RNA): 1+1 100nt_mut 2 G-supplied Staple nucleic acid that targets RNA (4-2) Staple_A (for 1+1 100nt_mut 2 RNA): An oligonucleotide (4-1) in which the guanine repeat sequence portion was changed to an adenine repeat sequence was designed and prepared.
  • oligonucleotides were used to evaluate the ability of G-supplied Staple nucleic acids to construct guanine quadruplex structures against target nucleic acids, which are known to bind to guanine quadruplex structures and emit fluorescence. Fluorescence measurements were performed using Thioflavin T (ThT).
  • Second-generation Staple nucleic acid with 1+1 100nt RNA-2 as the target nucleic acid we designed and used another model target nucleic acid, "1+1 100nt RNA-2.”
  • the base sequence of 1+1 100nt RNA-2 used as the target nucleic acid is as follows.
  • This sequence has two guanine repeat sequences in the target nucleic acid, and only when two guanine repeat sequences are supplied by the second generation Staple nucleic acid of the present invention, a guanine quadruplex structure is created. This means that it can be formed.
  • oligonucleotides were designed and produced for this target nucleic acid.
  • this oligonucleotide an attempt was made to design the oligonucleotide based on the positional relationship between the binding site of the first nucleotide sequence and the binding site of the second nucleotide sequence on the target nucleic acid and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid. That is, the oligonucleotide of this example is arranged such that two guanine repeat sequences are located between the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence.
  • G-supply Staple nucleic acid for 1+1 100nt RNA-2): G-supply Staple nucleic acid (5-2) Staple_A (for 1+1) with 1+1 100nt RNA-2 as the target nucleic acid 100nt RNA-2):
  • Staple_A for 1+1 with 1+1 100nt RNA-2 as the target nucleic acid 100nt RNA-2):
  • An oligonucleotide (5-1) in which the guanine repeat sequence was changed to an adenine repeat sequence was designed and prepared. This Staple nucleic acid was used in the stop assay.
  • This sequence has two guanine repeat sequences in the target nucleic acid, and only when two guanine repeat sequences are supplied by the second generation Staple nucleic acid of the present invention, a guanine quadruplex structure is created. This means that it can be formed.
  • oligonucleotides were designed and produced for this target nucleic acid.
  • this oligonucleotide an attempt was made to design the oligonucleotide based on the positional relationship between the binding site of the first nucleotide sequence and the binding site of the second nucleotide sequence on the target nucleic acid and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid. That is, the oligonucleotide of this example is arranged such that two guanine repeat sequences are located between the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence.
  • TRPC6 5'UTR RNA As an oligonucleotide, (6-1) G-supplied Staple nucleic acid_T (1-1-1) (for TRPC6 5'UTR RNA): TRPC6 5'UTR RNA is the target nucleic acid, and the arrangement of T near the guanine repeat sequence is G-supply Staple nucleic acid (6-2) G-supply Staple nucleic acid_T (2-1-2) (for TRPC6 5'UTR RNA): TRPC6 5'UTR RNA is used as the target nucleic acid, and the arrangement of T's near the guanine repeat sequence is 2 T's - G repeat sequence - 1 T - G repeat sequence - 2 T's.
  • G-supplied Staple nucleic acid_T (3-1-3) (for TRPC6 5'UTR RNA): A G-supplied Staple nucleic acid (6-3) near the guanine repeat sequence that uses TRPC6 5'UTR RNA as a target nucleic acid.
  • G-supplied Staple nucleic acid (6-4) G-supplied Staple nucleic acid_T (1-2 -1) (for TRPC6 5'UTR RNA): TRPC6 5'UTR RNA is the target nucleic acid, and the T arrangement near the guanine repeat sequence is 1 T - G repeat sequence - 2 T - G repeat sequence G-supplied Staple nucleic acid with one -T (6-5) G-supplied Staple nucleic acid_T (1-3-1): TRPC6 5'UTR RNA is the target nucleic acid, and T in the vicinity of the guanine repeat sequence is G-supplied Staple nucleic acid (6-6) G-supplied Staple nucleic acid_T (2-2-2) whose arrangement is 1 T - G repeat sequence - 3 T - G repeat sequence - 1 T ): TRPC6 5'UTR RNA is the target nucleic acid, and the T arrangement near the guanine repeat sequence is 2 Ts - G repeat
  • G-supplied Staple nucleic acid_T(2-1-2)_32 mer Oligonucleotide of (6-2) shortened by 4 bases from the 5' end and 4 bases from the 3' end, respectively.
  • (6-9) G-supplied Staple nucleic acid_T(2-1-2)_28 mer: The oligonucleotide of (6-2) shortened by 6 bases from the 5' end and 6 bases from the 3' end, respectively. designed and synthesized. These Staple nucleic acids were used in the stop assay.
  • This sequence has two guanine repeat sequences in the target nucleic acid, and only when two guanine repeat sequences are supplied by the second generation Staple nucleic acid of the present invention, a guanine quadruplex structure is created. This means that it can be formed.
  • oligonucleotides were designed and produced for this target nucleic acid.
  • this oligonucleotide an attempt was made to design the oligonucleotide based on the positional relationship between the binding site of the first nucleotide sequence and the binding site of the second nucleotide sequence on the target nucleic acid and the guanine repeat sequence on the target nucleic acid. That is, the oligonucleotide of this example is arranged such that two guanine repeat sequences are located between the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence.
  • (7-1) G-supplied Staple nucleic acid (for TRPC6 5'UTR RNA): A G-supplied Staple nucleic acid using TRPC6 5'UTR RNA as a target nucleic acid was designed and prepared. This Staple nucleic acid was used in an in vitro translation assay.
  • Example 2 Examination of the formation site of guanine quadruplex structure on target nucleic acid using second-generation Staple nucleic acid
  • each Staple nucleic acid prepared in (5) and (6) of Example 1 was examined.
  • cDNA Full-length complementary DNA
  • RNA containing a guanine quadruplex structure the guanine quadruplex structure inhibits the cDNA elongation reaction of reverse transcriptase, resulting in the generation of short cDNA.
  • the stop assay simultaneously measures the location of the guanine quadruplex structure by reverse transcription and identifies the target DNA sequence by the Sanger method. By doing so, it is possible to determine where in the sequence reverse transcription has stopped.
  • a reverse transcription reaction solution containing the annealing sample, Rever Tra Ace reverse transcriptase (TOYOBO, Inc.) (100 units), MgCl 2 (5 mM), and dNTPs (0.86 mM) was reacted at 42°C for 30 minutes, and then RNase 60 units of H was added and reacted at 37°C for 30 minutes.
  • the final reaction solution obtained was analyzed using a capillary sequencer CEQ8000 (BECKMAN COULTER, Inc.). DNA size standard-600 (BECKMAN COULTER, Inc.) was used as a sequence marker.
  • a stop assay was performed using the same protocol using Staple_A nucleic acid in which the G repeat sequence was replaced with the same number of A instead of G-supplied Staple nucleic acid (6-1) (SEQ ID NO: 19). .
  • TRPC6 5'UTR RNA SEQ ID NO: 18
  • TRPC6 5'UTR RNA (SEQ ID NO: 18) in (6) of Example 1 was used as a target nucleic acid, and (A ) for G-supplied Staple nucleic acids (6-1) to (6-6) and (6-10) to (6-12) (SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 24, SEQ ID For (B), use (6-2) (SEQ ID NO: 20) and the length of the first and second nucleotide sequences of (6-2).
  • the same procedure as described above was performed in the stop assay using shortened G-supplied Staple nucleic acids (6-7) to (6-9) (SEQ ID NO: 25 to SEQ ID NO: 27, respectively). A stop assay was performed in the procedure.
  • the reverse transcription inhibitory effect on RTase does not depend on the length of the linker between the G repeat sequences of the G-supplied Staple nucleic acid, but rather depends on the length of the linker between the G-supplied Staple nucleic acid and the target nucleic acid. It was suggested that it depends on the stability (length) of the main chain.
  • Example 3 Examination of the protein expression suppressing effect of second generation Staple nucleic acid
  • using the second generation Staple nucleic acid prepared in Example 1 we investigated whether the protein expression suppressing effect actually occurs. It was confirmed.
  • Example 1 As a target nucleic acid and a G-supplied Staple nucleic acid for it, Example 1 “(7-1) G supply to “TRPC6 5’UTR RNA” (SEQ ID NO: 28) prepared in “(7) Second generation Staple nucleic acid with TRPC6 5’UTR RNA as target nucleic acid” Type Staple Nucleic Acid (for TRPC6 5'UTR RNA)' (SEQ ID NO: 29) Using (7) TRPC6 5'UTR RNA, the influence of the guanine quadruplex structure constructed by G-supplied Staple nucleic acids on the protein translation reaction was evaluated by in vitro translation assay.
  • the influence on the protein translation reaction from each target nucleic acid is determined by two types of reporter genes: Firefly luciferase (FL), which is translated in a Cap-dependent manner, and Renilla luciferase (RL), which is translated via IRES. (The outline is shown in Figure 5 (A)).
  • FL Firefly luciferase
  • RL Renilla luciferase
  • In vitro translation evaluation was performed using a cell-free protein expression mixture (RTS 100 Wheat Germ CECF Kit, 5 Prime, Inc) with or without 0.14 ⁇ M G-supplied Staple nucleic acid using each target nucleic acid as an mRNA template (1 ⁇ g). 20 ⁇ L was reacted at 24°C for 150 minutes. Luciferase activity was measured using Luciferase Assay System (Promega, Inc.), Renilla Luciferase Assay System (Promega, Inc.), and POWERSCAN H1 microplate reader (BioTek, Inc.).
  • Example 4 Examination of stabilizing effect of target nucleic acid by Staple nucleic acid of the present invention
  • the stabilizing effect of target nucleic acid was investigated using first-generation Staple nucleic acid and second-generation Staple nucleic acid. I checked to see if it would occur.
  • the group of the present inventors has successfully developed RGB-1, a compound that selectively binds and stabilizes guanine quadruplex structures (JACS, 2016).
  • RGB-1 a compound that selectively binds and stabilizes guanine quadruplex structures
  • StopAssay which can identify the formation position of guanine quadruplex structures
  • the formation of guanine quadruplex structures was Investigation revealed that RGB-1 induces the formation of guanine quadruplex structures in the 3'UTR of specific mRNAs.
  • a target nucleic acid with the following sequence was designed (SEQ ID NO: 32) and used.
  • a Staple nucleic acid that acts on this target nucleic acid was further produced as follows.
  • Example 5 Examination of the ribosome shunting effect within a single target nucleic acid by the Staple nucleic acid of the present invention
  • a partial sequence of a single target nucleic acid was determined using a first generation Staple nucleic acid. It was confirmed that the effect of ribosome shunting occurs.
  • ribosomal shunting which bypasses (bypasses) this structure and continues protein translation.
  • target nucleic acids with the following sequences were designed (for PTC GFP, SEQ ID NO: 34, for ⁇ type1 GFP, SEQ ID NO: 35) and used.
  • PTC GFP mRNA has the characteristic that "TGA" present between the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence shown in the underlined part functions as a stop codon, and translation stops at this codon.
  • Staple nucleic acid to act on this target nucleic acid was prepared as follows.
  • the Staple nucleic acid is a first generation type, and both Staple nucleic acid B1 and Staple nucleic acid B2 can bind to the target nucleic acid of PTC GFP, but do not bind to ⁇ type1 GFP.
  • Both Staple nucleic acids are designed to skip the stop codon, creating a ribosomal shunt.
  • Staple nucleic acid B1 has three bases (GCT) on the 3' end side shortened compared to Staple nucleic acid B2.
  • FIG. 7 This figure shows PTC GFP (no Staple nucleic acid), ⁇ type1 GFP (no Staple nucleic acid), PTC GFP (Staple nucleic acid B1), PTC GFP (Staple nucleic acid B2), with the GFP signal intensity when GFP mRNA is expressed as 100. ) is a comparison of the GFP signal intensities.
  • the signal intensity of PTC GFP without Staple nucleic acid
  • that of PTC GFP (Staple nucleic acid B1) and PTC GFP (Staple nucleic acid B2) was approximately 37% and 8%, respectively. Increased strength.
  • Example 6 Examination of the stabilizing effect of the first generation Staple nucleic acid of the present invention on target nucleic acids
  • a target nucleic acid with the following sequence "Random sequence_2+2 100nt” (a target nucleic acid having a sequence combining Random sequence and 2+2 100nt) was designed (SEQ ID NO: 41) and used. there was.
  • Random sequence_2+2 100nt MutA in which the four guanine repeat sequences of the target nucleic acid “Random sequence_2+2 100nt” were modified to "AAA” (SEQ ID NO: 42).
  • a first generation Staple nucleic acid that acts on this target nucleic acid was also produced as follows. This configuration is designed so that the Staple nucleic acid forms a guanine quadruplex structure in the region corresponding to the 3'UTR of the target nucleic acid.
  • Random sequence_2+2 100nt MutA which does not contain a guanine repeat sequence, does not form a guanine quadruplex structure, so in the presence of RNaseR, "Random sequence_2+2 100nt MutA” is formed by 3' ⁇ 5' exonuclease activity. was shown to be degraded to the same extent as the negative control (“w/oligo” group) ( Figure 8-1, lower panel). Therefore, the presence of Staple nucleic acid significantly improved stability.
  • a target nucleic acid "Firefly_2+2" (a 2+2 sequence linked to the firefly luciferase gene sequence) with the following sequence was designed (SEQ ID NO: 44) and used.
  • a first generation Staple nucleic acid that acts on this target nucleic acid was also produced as follows. This configuration is designed so that the Staple nucleic acid forms a guanine quadruplex structure in the region corresponding to the 3'UTR of the target nucleic acid.
  • HEK 293T cell #16 cells were seeded in a 96-well plate at a cell density of 2 ⁇ 10 4 cells/ml and cultured for 72 hours in 100 ⁇ l of D-MEM medium containing 10% FBS and 1% penicillin. After confirming that the cells were 80% confluent, the medium was replaced with 100 ⁇ l of D-MEM medium containing 10% FBS, and cultured for 3 hours.
  • pSuper which expresses the Staple nucleic acid sequence under the control of the H1 promoter
  • pSuper which expresses the Staple nucleic acid sequence under the control of the H1 promoter
  • the protein expression of firefly luciferase is determined by comparing the luciferase luminescence intensity of each sample with the luciferase luminescence intensity when "Firefly_2+2" is expressed for 24 hours in the group without Staple nucleic acid added, assuming that the protein expression level is 100%. was measured, and the protein expression amount ratio (%) was calculated from there.
  • Example 7 Examination of the stabilizing effect of the second generation Staple nucleic acid of the present invention on the target nucleic acid
  • the second generation Staple nucleic acid was used to stabilize the target nucleic acid even when cells were used. We confirmed whether a stabilizing effect would occur.
  • NF1 Neurofibromin 1
  • SEQ ID NO: 46 a target nucleic acid "part of NF1 3'UTR" (target nucleic acid having the NF1 gene sequence) with the following sequence was designed (SEQ ID NO: 46), and this was Using.
  • a second generation Staple nucleic acid that acts on this target nucleic acid was also produced as follows.
  • two guanine repeat sequences present in the 3'UTR of the target nucleic acid are used, and the Staple nucleic acid supplies the two guanine repeat sequences to the region corresponding to the 3'UTR of the target nucleic acid.
  • the Staple nucleic acid sequence is transcribed by RNA pol III using a U6-based promoter, but at that time, RNA polymerase terminates transcription due to the continuous T sequence, so it cannot be used in cells. In order to do this, some T's were replaced with A's.
  • Figure 9-1 The results are shown in Figure 9-1 ( Figure 9-1, the left diagram shows the results for the second generation Staple nucleic acid, and Figure 9-1, the right diagram shows the results for the first generation Staple nucleic acid).
  • a first-generation Staple nucleic acid or a second-generation Staple nucleic acid By introducing a first-generation Staple nucleic acid or a second-generation Staple nucleic acid, it is possible to induce the formation of a guanine quadruplex structure at the 3'-end "NF1 3'UTR" of the target nucleic acid, and in the presence of RNaseR. It was also confirmed that the resistance of the target nucleic acid to 3' ⁇ 5' exonuclease activity was improved and the stability of the target nucleic acid was improved ( Figure 9-1). However, in the case of this combination of target nucleic acid and Staple nucleic acid, it was shown that the second generation Staple nucleic acid improves the stability of the target
  • the NF1 sequence used in (7-1) above was used as the target nucleic acid, and the second generation Staple nucleic acid was used as the Staple nucleic acid.
  • MCF-7 #9 cells were seeded in a 10 cm dish at a density of 1.0 x 10 5 and cultured for 72 hours in 10 ml of E-MEM medium containing 10% FBS and 1% penicillin. After confirming that the cells were 80% confluent, the medium was replaced with 10 ml of E-MEM medium containing 10% FBS, and cultured for 3 hours.
  • the above sample was separated using Mini-PROTEAN TGX Gels (BIO-RAD) by electrophoresis at 125 V and 126 mA for 110 minutes, and blotted.
  • Signal Enhancer HIKARI for West was applied to the protein-blotted membrane with a primary antibody against NF1 (Neurofibromin 1 D7R7D Rabbit mAb #14623: Cell Signaling Technology) and a primary antibody against Vinculin (Vinculin Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody 42H89L44: Invitrogen) as a control. ern A solution diluted to 1/1000 using Blotting and ELISA (Nacalai Tesque) was applied and shaken at room temperature for 90 minutes.
  • a secondary antibody against rabbit IgG (#7074 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody: Cell Signaling Technology) was diluted to 1/1000 using Signal Enhancer HIKARI for Western Blotting and ELISA. , shaken for 60 min at room temperature.
  • Chemi-Lumi One Super (Nacalai Tesque) was applied to the membrane, and after allowing it to stand at room temperature for 1 minute, bands were detected using ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare).
  • Example 8 Examination of ribosome shunt effect within a single target nucleic acid by the Staple nucleic acid of the present invention (2) In this example, it was confirmed that a first generation Staple nucleic acid or a second generation Staple nucleic acid was used to cause ribosome shunting of a partial sequence of a single target nucleic acid.
  • F Luc firefly luciferase gene
  • SEQ ID NO: 49 a template for mRNA
  • SEQ ID NO: 49 the target nucleic acid of the first generation Staple nucleic acid.
  • the nucleotide sequence of the gene was designed.
  • This modified F Luc gene mRNA as a target nucleic acid is generated within the molecule of the target nucleic acid when the first generation Staple nucleic acid of the present invention hybridizes and a guanine quadruplex structure is formed by the target nucleic acid and the Staple nucleic acid.
  • the F Luc protein was designed to produce functional F Luc protein only when ribosome shunting occurs.
  • a first generation Staple nucleic acid that acts on the target nucleic acid described above was produced as follows. Specifically, these first-generation Staple nucleic acids are two types that include a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence that hybridize with the binding region of the Staple nucleic acid shown in the underlined part of the nucleotide sequence of the target nucleic acid described above. Staple nucleic acids (Staple nucleic acid B3 (SEQ ID NO: 50), Staple nucleic acid B4 (SEQ ID NO: 51)) were produced.
  • the nucleotide sequence of the modified FLuc gene was also designed to serve as a template for mRNA (SEQ ID NO: 52), which is the target nucleic acid of the second generation Staple nucleic acid.
  • SEQ ID NO: 52 is the target nucleic acid of the second generation Staple nucleic acid.
  • This modified F Luc gene mRNA as a target nucleic acid is generated within the molecule of the target nucleic acid when the second generation Staple nucleic acid of the present invention hybridizes and a guanine quadruplex structure is formed by the target nucleic acid and the Staple nucleic acid.
  • the F Luc protein was designed to produce functional F Luc protein only when ribosome shunting occurs.
  • a second generation Staple nucleic acid that acts on the target nucleic acid described above was produced as follows. Specifically, these second-generation Staple nucleic acids contain a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence that hybridize in the binding region of the Staple nucleic acid shown in the underlined part of the nucleotide sequence of the target nucleic acid described above, and two nucleotide sequences.
  • One type of Staple nucleic acid (Staple nucleic acid B5 (SEQ ID NO: 53)) containing a guanine repeat sequence was produced.
  • modified F Luc gene mRNA SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 52
  • cell-free protein expression mixture RTS 100 Wheat Germ CECF
  • Kit, 5 Prime, Inc 20 ⁇ L was reacted at 24°C for 150 minutes.
  • RNA as an mRNA template (1 ⁇ g)
  • 20 ⁇ L of a cell-free protein expression mixture (RTS 100 Wheat Germ CECF Kit, 5 Prime, Inc.) containing or not containing 0.14 ⁇ M Staple nucleic acid was reacted at 24°C for 150 minutes. .
  • the excitation wavelength was set to 480 nm, and fluorescence measurements were performed using a fluorescence spectrophotometer (Jasco FP-8500) at 25°C.
  • a fluorescence spectrophotometer Jasco FP-8500
  • a sample in which F Luc was expressed based on the nucleotide sequence of the F Luc gene was used as a positive control, and a sample in which modified F Luc was expressed without applying Staple nucleic acid was used as a negative control.
  • FIG. 10 shows the modified F Luc expression sample (without Staple nucleic acid), the first generation Staple nucleic acid, and the positive control F Luc signal intensity when F Luc is expressed based on the nucleotide sequence of the F Luc gene as 100.
  • Modified F Luc expression sample (Staple nucleic acid B3, and Staple nucleic acid B4) in the presence of (left panel), modified F Luc expression sample (Staple nucleic acid B5) in the presence of second generation Staple nucleic acid (right panel)
  • the F Luc signal intensity in the modified F Luc expression sample was 9.1 or 6.2% of the positive control, whereas the F Luc signal intensity when applying the first generation Staple nucleic acid was The F Luc signal intensity increased to 68.4% (Staple nucleic acid B3), 35.4% (Staple nucleic acid B4), and 88.6% (Staple nucleic acid B5) when the second generation Staple nucleic acid was applied.
  • Example 9 Examination of the ribosome shunt effect between two types of target nucleic acids by the Staple nucleic acid of the present invention
  • two types of Staple nucleic acids were used, a first-generation Staple nucleic acid and a second-generation Staple nucleic acid. It was confirmed that ribosome shunting of partial sequences between target nucleic acids occurs.
  • a guanine quadruplex structure is formed between a fragment of gene A and a fragment of gene B using Staple nucleic acid as shown in (1), and the ribosome absorbs gene A at the location of the guanine quadruplex structure. This was confirmed by examining whether RNA switches from RNA to gene B RNA. The transfer from gene A RNA to gene B RNA was confirmed by preparing a nucleotide sequence that exhibits functionality through gene A-gene B binding when ribosome shunting is performed at the relevant location. Note that (2) to (4) all function as controls in which a guanine quadruplex structure cannot be formed.
  • a first generation Staple nucleic acid used in method (1) and a control nucleic acid used in method (2) were further produced for these target nucleic acids as follows.
  • the above gene A and the above gene B were mixed at a concentration ratio of 1:1, 1.5 equivalents of Staple nucleic acid was added thereto, and the temperature was lowered from 90°C by 1°C per minute for annealing.
  • Staple nucleic acid C1 is added under the condition (1)
  • Staple nucleic acid C2 is added under the condition (2)
  • no Staple nucleic acid is added under the condition (3).
  • Staple nucleic acid C1 was used for the conditions (4).
  • luciferase activity was evaluated using a Luciferase Assay kit (Promega) and a POWERSCAN H1 microplate reader (BioTek).
  • the present invention provides a guanine repeat sequence using an oligonucleotide, and as a result, a guanine quadruplex is formed on the target nucleic acid by a total of four guanine repeat sequences: the guanine repeat on the target nucleic acid and the guanine repeat on the oligonucleotide.
  • a new Staple nucleic acid (second generation Staple nucleic acid) that can form a structure can be developed and provided.
  • the present invention can also provide novel uses of Staple nucleic acids for first generation Staple nucleic acids and second generation Staple nucleic acids.

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Abstract

本発明は、標的核酸上に4か所のグアニン繰り返し配列が存在しない場合でも、標的核酸に対してグアニン四重鎖構造を形成させることができるStaple核酸を開発することを課題とする。本発明はまた、既存のStaple核酸および本発明のStaple核酸の様々な用途を開発することを課題とする。　本発明の発明者らは、オリゴヌクレオチドによりグアニン繰り返し配列を供給し、結果的に標的核酸上のグアニン繰り返しとオリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列の合計4か所のグアニン繰り返し配列により、標的核酸上にグアニン四重鎖構造を形成させることができるオリゴヌクレオチド（第二世代型Staple核酸）を開発することにより、上記課題を解決した。本発明はまた、第一世代型Staple核酸および第二世代型Staple核酸について、Staple核酸の新規な用途を開発した。

Description

新規Ｓｔａｐｌｅ核酸
　本発明は、新規Staple核酸を開発することに関する。本発明はまた、従来のStaple核酸および新規Staple核酸の用途を開発することに関する。
　遺伝子発現抑制技術として、マイクロRNAやsiRNAなど様々なツールが知られている（非特許文献1、非特許文献2）。標的遺伝子の配列情報が知られていれば、比較的簡単にsiRNAを設計することができ、標的遺伝子についての既存の報告を参考にすることにより、一つの標的mRNAに対して複数の標的配列を選定することで、強力に遺伝子発現を抑制することができる。
　いずれの技術に関してもmRNAに結合するという単純な機構で遺伝子発現抑制機能を発揮するため、予期せぬ効果（オフ・ターゲット効果）が避けられないことが問題となっており（非特許文献3）、ヒトの体内において使用するためには解決しなければならない課題を内包している。
　現在のバイオインフォマティクスの技術向上により、目的外遺伝子の発現抑制（オフ・ターゲット効果）も最小限に止めることができるようになっている。しかしながら、医薬品化という観点からは、siRNA開発は決して順調に進んでいるとは言えない。その理由は核酸医薬には、修飾核酸を利用する必要があることにある。修飾核酸を利用する場合、マイクロRNA効果やsiRNA活性が著しく低下し、期待するタンパク質翻訳抑制効果が得られない問題も生じることが知られている（非特許文献4）。
　これらの課題を解決すべく、様々な人工修飾核酸が合成されているが、医薬品としての汎用性の高い人工修飾核酸の開発は未だ継続して進められている現状にある。人工修飾核酸の開発を困難にしている最大の原因は、siRNAが、標的mRNAの切断活性をもつ酵素反応との連動を必要とすること、すなわち、核酸に化学修飾を施すことでヌクレアーゼ耐性を獲得する一方で、酵素反応の基質としての被認識能を失うことにある。
　これらのような問題を解決するため、本発明の発明者らは、これまでに、配列特異的に標的mRNA配列に結合し、標的mRNA上に存在する4つのグアニン繰り返し配列を利用してグアニン四重鎖構造の形成を誘発する機能を有するStaple核酸を開発し、そのStaple核酸により誘発されたグアニン四重鎖構造により、リボゾームのペプチド合成反応を阻害し、タンパク質翻訳反応を抑制する方法を開発した（特許文献1）。
　従来のStaple核酸は、標的mRNA上に4か所のグアニン繰り返し配列が必要であり、そのような構造を有する標的mRNAに対してしか、グアニン四重鎖構造を形成させることができなかった。
WO2020/085510
Fire, A., et al., Nature 1998, 391, 806. Ambros, V. Nature 2004, 431, 350. Jackson, A.L. and Linsley, P.S. Nature reviews. Drug discovery 2010, 9, 57. Jackson, A.L., et al., Rna 2006, 12, 1197.
　本発明は、標的核酸上に4か所のグアニン繰り返し配列が存在しない場合でも、標的核酸に対してグアニン四重鎖構造を形成させることができるStaple核酸を開発することを課題とする。本発明はまた、既存のStaple核酸および本発明のStaple核酸の様々な用途を開発することを課題とする。
　本発明の発明者らは、オリゴヌクレオチドによりグアニン繰り返し配列を供給し、結果的に標的核酸上のグアニン繰り返しとオリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列の合計4か所のグアニン繰り返し配列により、標的核酸上にグアニン四重鎖構造を形成させることができるStaple核酸（第二世代型Staple核酸）を開発することにより、上記課題を解決した。本発明はまた、第一世代型Staple核酸および第二世代型Staple核酸について、Staple核酸の新規な用途を開発した。
　より具体的には、本件出願は、前述した課題を解決するため、以下の態様を提供する：
［1］：　標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドであって、
　当該G供給型オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記G供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させる、前記G供給型オリゴヌクレオチド；
［2］：　前記G供給型オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
にハイブリダイズする、［1］に記載のG供給型オリゴヌクレオチド；
［3］：　DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせである、［1］または［2］に記載のG供給型オリゴヌクレオチド；
［4］：　標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドであって、
　当該G供給型オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記G供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させる、前記G供給型オリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物；
［5］：　前記G供給型オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
にハイブリダイズする、［4］に記載の医薬組成物；
［6］：　DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせである、［4］または［5］に記載の医薬組成物；
［7］：　標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
　当該G供給型オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列が、標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸上のグアニン繰り返し配列とG供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離を短くするようにG供給型オリゴヌクレオチドが折り返されるように設計し合成することを特徴とする前記方法；
［8］：　前記G供給型オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
にハイブリダイズする、［7］に記載のG供給型オリゴヌクレオチドを製造する方法；
［9］：　DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせである、［7］または［8］に記載のG供給型オリゴヌクレオチドを製造する方法；
［10］：　標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドであって、
　当該G供給型オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記G供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることによる、標的核酸からのタンパク質発現の抑制方法 ；
［11］：　前記G供給型オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
にハイブリダイズする、［11］に記載のタンパク質発現の抑制方法；
［12］：　DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせである、［10］または［11］に記載のタンパク質発現の抑制方法；
［13］：　タンパク質発現の抑制が、逆転写反応の抑制またはタンパク質翻訳反応の抑制によるものである、［10］または［11］に記載のタンパク質発現の抑制方法。
［14］：　標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドであって、
　当該G供給型オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記G供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることにより、標的核酸からのタンパク質発現を抑制する、前記G供給型オリゴヌクレオチド
を含む、タンパク質発現抑制キット；
［15］：　前記G供給型オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
にハイブリダイズする、［14］に記載のタンパク質発現抑制キット；
［16］：　タンパク質発現の抑制が、逆転写反応の抑制またはタンパク質翻訳反応の抑制によるものである、［14］または［15］記載のタンパク質発現抑制キット。
［17］：　標的核酸上の1か所～4か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～0か所のグアニン繰り返し配列、を含むオリゴヌクレオチドであって、
　当該オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることにより、標的核酸の一部にループ部分が形成されてリボゾームが当該ループ部分をシャントし、標的核酸から改変タンパク質を製造する方法；
［18］：　前記オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
にハイブリダイズする、［17］に記載の改変タンパク質を製造する方法；
［19］：　DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせである、［17］または［18］に記載の改変タンパク質を製造する方法；
［20］：　第1の標的核酸上の1か所～2か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列、
　第2の標的核酸上の1か所～2か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第2ヌクレオチド配列、および
　第1の標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数および第2の標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて2か所～0か所のグアニン繰り返し配列、
を含むオリゴヌクレオチドであって、
　当該オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列の第1の標的核酸へのハイブリダイズおよび第2ヌクレオチド配列の第2の標的核酸へのハイブリダイズ、および当該オリゴヌクレオチドがこれら標的核酸の立体構造を変化させ、前記第1の標的核酸上の1か所～2か所のグアニン繰り返し配列、第2の標的核酸上の1か所～2か所のグアニン繰り返し配列、および前記オリゴヌクレオチド上の2か所～0か所グアニン繰り返し配列の合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることにより、第1の標的核酸と第2の標的核酸との間でリボゾームがシャントすることによる、第1の標的核酸の部分配列の翻訳物と第2の標的核酸の部分配列の翻訳物とを融合タンパク質を製造する方法；
［21］：　前記オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
にハイブリダイズする、［20］に記載の融合タンパク質を製造する方法；
［22］：　DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせである、［20］または［21］に記載の融合タンパク質を製造する方法；
［23］：　標的核酸上の1か所～4か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～0か所のグアニン繰り返し配列、を含むオリゴヌクレオチドであって、
　当該オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることにより、標的核酸に対する核酸分解酵素の結合を阻害または核酸分解酵素の機能を阻害することによる、標的核酸を安定化させる方法；
［24］：　前記オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
にハイブリダイズする、［23］に記載の標的核酸を安定化させる方法；
［25］：　DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせである、［29］または［30］に記載の標的核酸を安定化させる方法。
　本発明は、オリゴヌクレオチドによりグアニン繰り返し配列を供給し、結果的に標的核酸上のグアニン繰り返しとオリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列の合計4か所のグアニン繰り返し配列により、標的核酸上にグアニン四重鎖構造を形成させることができる、新規オリゴヌクレオチド（第二世代型Staple核酸）を開発し、提供することができる。本発明はまた、第一世代型Staple核酸および第二世代型Staple核酸について、オリゴヌクレオチドの新規な用途を提供することができる。
図1は、G供給型Staple核酸の結合様式を変えた場合のグアニン四重鎖構造の形成を示す図である。 図2は、モデル配列である2+1 100nt、1+1 100nt_mut 1、1+1 100nt_mut 2における、G供給型Staple核酸を用いたグアニン四重鎖構造の構築を示す図である。ここで、（A）は、ｍ2+1 100nt RNAにおけるThioflavin Tを用いた蛍光測定の結果を、（B）は、1+1 100nt_mut 1 RNAにおけるThioflavin Tを用いた蛍光測定の結果を、そして（C）は、1+1 100nt_mut 2 RNAにおけるThioflavin Tを用いた蛍光測定の結果を、それぞれ示す。 図3は、各種標的核酸配列におけるグアニン四重鎖構造の形成位置の特定を示す図である。ここで、（A）は、1+1 100nt RNA配列におけるストップアッセイの結果、（B）は、TRPC6 5’UTR RNA配列におけるストップアッセイの結果をそれぞれ示している。 図4は、TRPC6 5’UTR配列におけるG供給型Staple核酸の長さとTリンカーの検討を行った結果を示す図である。ここで、（A）は、G供給型Staple核酸中のTリンカーの数を変化させた場合のストップアッセイの結果、（B）は、G供給型Staple核酸の長さを変化させた場合のストップアッセイの結果をそれぞれ示している。 図5は、G供給型Staple核酸により構築したグアニン四重鎖構造がタンパク質翻訳反応に与える影響を評価した結果を示す図である。ここで、（A）は、in vitro translationに用いた各核酸テンプレートの概要図を、（B）は、TRPC6 5’UTR配列におけるin vitro translationの結果（n = 2）を示している。 図6は、Staple核酸の有無による標的核酸安定性が向上するかどうかを評価した結果を示す図である。 図7は、GFPのmRNAを翻訳させた場合のGFPシグナル強度を100として、PTC GFP（Staple核酸なし）、Δtype1 GFP（Staple核酸なし）、PTC GFP（Staple核酸1）、PTC GFP（Staple核酸2）のGFPシグナル強度を比較した結果を示す図である。 図8-1は、Staple核酸が存在することにより、標的核酸の安定性が顕著に向上したことを示す図である。 図8-2は、細胞を使用した場合に、Staple核酸が存在することにより、標的核酸の安定性が上昇し、結果的に細胞内でのタンパク質発現が亢進したことを示す図である。 図9-1は、Staple核酸が存在することにより、標的核酸の安定性が顕著に向上したことを示す図である。 図9-2は、細胞を使用した場合に、Staple核酸が存在することにより、標的核酸の安定性が上昇し、結果的に細胞内でのタンパク質発現が亢進したことを示す図である。 図10は、本発明のStaple核酸により、単一分子内でリボゾームシャンティングを生じさせることができることを示す図である。 図11は、本発明のStaple核酸により、二分子間でのリボゾームシャンティングを生じさせることができることを示す図である。
　本発明において使用する用語を以下の通り定義する：
（a）Staple核酸：配列特異的に標的核酸上の2か所の配列にハイブリダイズし、標的核酸の立体構造を変化させ、標的核酸上に存在するグアニン繰り返し配列を利用して、グアニン四重鎖構造の形成を誘発する機能を有するオリゴヌクレオチドのことをいう。後述する非G供給型Staple核酸（非G供給型オリゴヌクレオチド、第一世代型Staple核酸ともいう）と、G供給型Staple核酸（G供給型オリゴヌクレオチド、第二世代型Staple核酸ともいう）とが存在する；
（b）非G供給型Staple核酸：Staple核酸の一つの型であり、特許文献1で開示したStaple核酸を参考に作成される、Staple核酸自体の中にグアニン繰り返し配列を含まないStaple核酸のことをいう。配列特異的に標的核酸上の2か所の配列にハイブリダイズし、標的核酸の立体構造を変化させ、標的核酸上に存在する4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離を近づけて、グアニン四重鎖構造の形成を誘発する機能を有するオリゴヌクレオチドのことをいう。本発明における非G供給型Staple核酸は、非G供給型オリゴヌクレオチドともいい、あるいは第一世代型Staple核酸ともいう。；
（c）G供給型Staple核酸：Staple核酸の一つの型であり、本発明において新たに開示する、Staple核酸自体の中に少なくとも1つのグアニン繰り返し配列を含むStaple核酸のことをいう。配列特異的に標的核酸上の2か所の配列にハイブリダイズし、標的核酸の立体構造を変化させ、標的核酸上に存在するグアニン繰り返し配列とG供給型Staple核酸に存在するグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離を近づけて、グアニン四重鎖構造の形成を誘発する機能を有するオリゴヌクレオチドのことをいう。本発明におけるG供給型Staple核酸は、G供給型オリゴヌクレオチドともいい、あるいは第二世代型Staple核酸ともいう。
（d）核酸：本発明におけるStaple核酸を構成する核酸は、天然に存在する核酸、または天然には存在しない核酸（非天然核酸）のいずれかのことをいう。天然に存在する核酸は、核酸塩基（すなわち、アデニン（a）、グアニン（g）、シトシン（c）、チミン（t）、ウラシル（u））から構成されるDNAまたはRNAのことをいう。天然には存在しない核酸（非天然核酸）は、核酸塩基・糖・リン酸ジエステル部に修飾を加えることで物性を変化させた核酸のことをいい、修飾核酸ともいう。
　第一世代型Staple核酸の構造
　本発明における第一世代型Staple核酸は、特許文献1で開示されたStaple核酸を参考に作成されるStaple核酸のことをいう。すなわち、この第一世代型Staple核酸は、Staple核酸自体の中にグアニン四重鎖構造を構成するグアニン繰り返し配列を含まないものであることを構造的な特徴とする。
　本発明における第一世代型Staple核酸は、標的核酸上の4か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列のうちのいずれか2つのグアニン繰り返し配列の近傍（すなわち、5'側あるいは3'側）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、
　前記第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列にハイブリダイズした標的核酸の立体構造を変化させ、、前記標的核酸上の4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させるという機能を有する、前記オリゴヌクレオチドのことをいう。
　一般的に、細胞内におけるグアニン四重鎖構造は、3塩基以上のグアニン繰り返し配列が、7塩基未満の近接した空間配置で4箇所存在する時に構築される安定な核酸高次構造である。本発明の発明者らは、標的核酸上で7塩基以上のスペーシングで離れた位置に存在するグアニン繰り返し配列であっても、適切に設計した本発明の第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを使用することにより、これらの標的核酸に存在するグアニン繰り返し配列を人為的に空間的に近接させ、標的核酸に人為的なグアニン四重鎖構造を誘起させることができることを見出した。
　本発明において、第一世代型Staple核酸が結合する対象である標的核酸における、グアニン繰り返し配列という場合、標的核酸上に存在する3塩基以上のグアニンが含まれる連続した配列あるはグアニンとグアニンの間にバルジ構造を形成するヌクレオチド配列を含む3塩基以上のグアニンが含まれる配列のことをいう。具体的なグアニン繰り返し配列としては、例えば、GGG、GNGG（Nはいずれの塩基であってもよく、数は1または複数であってもよい）などが含まれる。
　本発明において、第一世代型Staple核酸がグアニン四重鎖構造を形成する対象である標的核酸という場合、標的核酸の種類は、RNA、DNAのいずれであってもよい。Staple核酸により実現したい用途に応じて、標的核酸の核酸の種類は決定される。
　本発明の第一世代型Staple核酸が細胞内でグアニン四重鎖構造を形成するには、オリゴヌクレオチドが、
・標的核酸の配列を認識する能力と、
・グアニン四重鎖構造の形成を誘導する能力
とを同時に有することが必要である。
　第一世代型Staple核酸が標的核酸の配列を認識する能力は、第一世代型Staple核酸であるオリゴヌクレオチドが、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の近傍（すなわち、5'側あるいは3'側）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列を含むことにより実現される。
　本発明において、第一世代型Staple核酸における第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列の配列は、標的核酸の配列ごとに異なるものであり、標的核酸上の4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離を近づけることができるように、標的核酸上の2か所の配列部分を選択し、それらの2か所の配列部分にハイブリダイズするように第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列を決定することができる。
　第一世代型Staple核酸の第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列は、適宜設計することができる。例えば、限定されるわけではないが、この本発明の第一世代型Staple核酸の一例として、標的核酸のグアニン繰り返し配列の一つの下流側（3'側）のヌクレオチド配列（例えば、すぐ下流側（3'側）から20塩基以内の塩基（すなわちグアニン繰り返し配列の下流側の1塩基目から20塩基目）を起点とした13～20塩基の領域）、または標的核酸のグアニン繰り返し配列の上流側（5'側）から20塩基以内の塩基（すなわちグアニン繰り返し配列の下流側の1塩基目から20塩基目）を起点としたヌクレオチド配列（例えば上流側（5'側）の13～20塩基の領域）などを選択し、それらの領域とハイブリダイズするように、第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列を設計することができる。
　この第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列がハイブリダイズする標的核酸上のヌクレオチド配列領域の、標的核酸のグアニン繰り返し配列からの距離（第1ヌクレオチド配列または第2ヌクレオチド配列のグアニン繰り返し配列から見て最も近位端のヌクレオチドと、グアニン繰り返し配列のGとの間に挟まれるヌクレオチド数）は、熱力学的安定性に関する計算により適宜決定することができ、距離（ヌクレオチド数）は特に限定されない。本発明者らの検討においては、20ヌクレオチドが挟まれる距離があっても、グアニン四重鎖構造の形成は確認されている。したがって、Staple核酸がハイブリダイズする領域の起点としては、好ましくはグアニン繰り返し配列のすぐ下流側（3'側）又はすぐ上流側（5’側）から20塩基以内の塩基（すなわちグアニン繰り返し配列の下流側又は上流側の1塩基目から20塩基目）、より好ましくはグアニン繰り返し配列のすぐ下流側（3'側）又はすぐ上流側（5’側）から15塩基以内の塩基（すなわちグアニン繰り返し配列の下流側又は上流側の1塩基目から15塩基目）であり、より好ましくはグアニン繰り返し配列のすぐ下流側（3'側）又はすぐ上流側（5’側）から10塩基以内の塩基（すなわちグアニン繰り返し配列の下流側又は上流側の1塩基目から10塩基目）であり、より好ましくはグアニン繰り返し配列のすぐ下流側（3'側）又はすぐ上流側（5’側）から5塩基以内の塩基（すなわちグアニン繰り返し配列の下流側又は上流側の1塩基目から5塩基目）であり、より好ましくはグアニン繰り返し配列のすぐ下流側（3'側）又はすぐ上流側（5’側）から3塩基以内の塩基（すなわちグアニン繰り返し配列の下流側又は上流側の1塩基目から3塩基目）を選択することができる。
　第一世代型Staple核酸は、DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせから構成することができる。本発明の第一世代型Staple核酸は、第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列を直接的にまたはリンカーを介して間接的に結合したものである。本発明において、第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および場合により含まれていてもよいリンカーのそれぞれの領域において、好ましい核酸の形態を選択することができる。
　ここで、第一世代型Staple核酸において、第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列とをつなぐリンカーという場合、第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列の間に存在する塩基数は任意の核酸のリンカーのことをいう。第1ヌクレオチド配列と標的核酸の結合および第2ヌクレオチド配列と標的核酸との結合の上で、第一世代型Staple核酸が標的核酸の立体構造を変化させ、それにより標的核酸上の4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離を短くできるような長さのものであることが必要である。
　第一世代型Staple核酸は、第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列を直接的にまたはリンカーを介して間接的に結合されるものであり、Staple核酸全体の長さは、標的核酸のヌクレオチド配列により変動するものであり、GC含有率、Tm値など、当該技術分野において一般的に知られている基準に基づいて設計されるどのような長さのものであってもよく、その設計に応じてそれよりも長いヌクレオチド長のものであってもよい。一例として、Staple核酸全体の長さが、26～40ヌクレオチド長であってもよいが、これらの長さには限定されない。Staple核酸が標的核酸にハイブリダイズする領域の長さは、前記一端側（例えば3'側）領域および他端側（例えば5'側）領域の長さは、同じであっても異なってもよく、限定されるものではない。
　上記のとおり設計された第一世代型Staple核酸と標的核酸とのハイブリダイズ反応は、in vivoあるいはin vitroのいずれでも行うことができ、例えば、
・標的核酸を含む溶液中にStaple核酸を混合して、アニーリングすることにより、
・標的核酸を含む溶液中にStaple核酸を単に混ぜることにより、
・Short hairpin expression vectorを導入し、細胞内からStaple核酸を発現させることにより、
行うことができる。標的核酸とStaple核酸とのハイブリダイズ反応は、例えば24～55℃の反応温度で、例えば1分～2日で行うことができる。
　また、第一世代型Staple核酸がグアニン四重鎖構造の形成を誘導する能力は、標的核酸上に4か所のグアニン繰り返し配列が存在すること、標的核酸にハイブリダイズしたStaple核酸が標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上の4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなること、その結果として、標的核酸上の4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を誘導すること、により実現される。
　本発明の第一世代型Staple核酸を使用したグアニン四重鎖構造の形成反応は、例えば、標的核酸とStaple核酸との間のハイブリダイズ反応を生じさせて、そのまま静置しておくことにより、行うことができる。グアニン四重鎖構造の形成反応は、標的核酸とStaple核酸とのハイブリダイズ反応を行う温度および時間と同じであってもよく、例えば24～55℃の反応温度で、例えば1分～2日であってもよい。グアニン四重鎖構造が形成されたことの確認は、例えば、in vitroトランスレーションアッセイ、チオフラビンTと反応させることによる蛍光シグナル測定法、ストップアッセイ法などにより行うことができる。
　第一世代型Staple核酸の具体的な構造の一例を、以下の化1に示す。この化1において「短鎖核酸」と記載されるオリゴヌクレオチドが、Staple核酸を意味しており、このオリゴヌクレオチドの導入により、標的核酸上にある4か所のグアニン繰り返し配列を近接させて、グアニン四重鎖構造の形成を誘導するものである。
　第二世代型Staple核酸の構造
　本発明における第二世代型Staple核酸は、グアニン四重鎖構造を構成する4か所のグアニン繰り返し配列のうち一部を、オリゴヌクレオチドにより供給するStaple核酸のことをいう。すなわち、この第二世代型Staple核酸は、具体的には、Staple核酸自体の中にグアニン繰り返し配列を含むものであることを構造的な特徴とする。
　本発明における第二世代型Staple核酸は、標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列のうちのいずれか2つのグアニン繰り返し配列の近傍（すなわち、5'側あるいは3'側）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドであって、
　当該G供給型オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記G供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させる、前記G供給型オリゴヌクレオチドのことをいう。
　ここで、「標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含む」という場合、標的核酸上にグアニン四重鎖構造を形成するためのグアニン繰り返し配列が少なくとも1か所以上存在していればよいことを意味しており、標的核酸上に4か所以上のグアニン繰り返し配列が存在していてもよい。標的核酸上に4か所以上のグアニン繰り返し配列が存在している場合には、それらのグアニン繰り返し配列のうちの1か所～3か所のグアニン繰り返し配列によりグアニン四重鎖構造を形成することを意味する。また、「標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数」は、本発明の第二世代型Staple核酸を使用してグアニン四重鎖構造を形成するために使用される、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数を意味する。例えば、標的核酸上に4か所以上のグアニン繰り返し配列が存在する場合であっても、そのうちの2か所のグアニン繰り返し配列と、G供給型オリゴヌクレオチドにより供給される2か所のグアニン繰り返し配列によりグアニン四重鎖構造を形成させる場合、「標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数」は2か所となる趣旨である。
　前述したように、一般的に、細胞内におけるグアニン四重鎖構造は、3塩基以上のグアニン繰り返し配列が、7塩基未満の近接した空間配置で4箇所存在する時に構築される安定な核酸高次構造である。本発明の発明者らは、標的核酸上で7塩基以上のスペーシングで離れた位置に存在するグアニン繰り返し配列が1～3か所存在する場合であっても、適切に設計した本発明の第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドを使用することにより、これらの標的核酸に存在する1～3か所のグアニン繰り返し配列とG供給型オリゴヌクレオチドに存在する3～1か所のグアニン繰り返し配列の合計4か所のグアニン繰り返し配列を人為的に空間的に近接させ、標的核酸に人為的なグアニン四重鎖構造を誘起させることができることを見出した。
　本発明において、第二世代型Staple核酸が結合する対象である標的核酸における、グアニン繰り返し配列という場合、標的核酸上に存在する3塩基以上のグアニンが含まれる連続した配列またはStaple核酸に存在する3塩基以上のグアニンが含まれるが連続した配列のことをいう。具体的なグアニン繰り返し配列としては、例えば、GGG、GNGG（Nはいずれかのヌクレオチドを示す）、など論文報告が挙げられているグアニン四重鎖構造の形成要素になり得るグアニン繰り返し配列が含まれる。
　本発明において、第一世代型Staple核酸の場合と同様、第二世代型Staple核酸がグアニン四重鎖構造を形成する対象である標的核酸という場合、標的核酸の種類は、RNA、DNAのいずれであってもよい。Staple核酸により実現したい用途に応じて、標的核酸の核酸の種類は決定される。
　本発明の第二世代型Staple核酸が細胞内でグアニン四重鎖構造を形成するには、オリゴヌクレオチドが、
・標的核酸の配列を認識する能力と、
・標的核酸上に存在するグアニン繰り返し配列の数に応じて（ただし、標的核酸上に4か所以上のグアニン繰り返し配列が存在している場合には、それらのグアニン繰り返し配列のうちの1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を使用することを意味する）、グアニン繰り返し配列の数が合わせて4か所となるようにグアニン繰り返し配列を供給できる能力、
・グアニン四重鎖構造の形成を誘導する能力
とを同時に有することが必要である。
　第二世代型Staple核酸が標的核酸の配列を認識する能力は、第二世代型Staple核酸であるオリゴヌクレオチドが、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の近傍（すなわち、5'側あるいは3'側）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列を含むことにより実現される。
　本発明において、第二世代型Staple核酸における第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列の配列は、標的核酸の配列ごとに異なるものであり、標的核酸上の1～3か所のグアニン繰り返し配列と第二世代型Staple核酸上の3～1か所のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離を近づけることができるように、標的核酸上の2か所の配列部分を選択し、それらの2か所の配列部分にハイブリダイズするように第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列を決定することができる。
　第二世代型Staple核酸の第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列は、適宜設計することができる。例えば、Staple核酸の第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列は、標的核酸上のグアニン繰り返し配列のうち
・最も3'末端側のグアニン繰り返し配列の近傍（すなわち、5'側あるいは3'側）のヌクレオチド配列部分、
・最も5'末端側のグアニン繰り返し配列の近傍（すなわち、5'側あるいは3'側）のヌクレオチド配列部分
にハイブリダイズするものを選択してもよい。
　例えば、この本発明の第二世代型Staple核酸の一例として、標的核酸のグアニン繰り返し配列の一つのすぐ下流側（3'側）の13～20塩基の領域、および標的核酸のグアニン繰り返し配列の上流側（5'側）の13～20塩基の領域を選択し、それらの領域とハイブリダイズするように、第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列を設計することができる。
　本発明の第二世代型Staple核酸の第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列は、その用途に合わせて適宜設計することができるものである。例えば、以下のような特徴（ただし、これらに限定されるものではない）：
・第1ヌクレオチド配列または第2ヌクレオチド配列の少なくとも１つが、標的核酸上のストップコドンより前に存在するグアニン繰り返し配列の近傍のヌクレオチド配列部分にハイブリダイズする；
・第1ヌクレオチド配列又は第2ヌクレオチド配列の少なくとも１つが、標的核酸上の5’非翻訳領域に存在するグアニン繰り返し配列の近傍のヌクレオチド配列部分にハイブリダイズする；
・第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、共に標的核酸上の5’非翻訳領域に存在するグアニン繰り返し配列の近傍のヌクレオチド配列部分にハイブリダイズする；
・第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、共に3’非翻訳領域に存在するグアニン繰り返し配列の近傍のヌクレオチド配列部分にハイブリダイズする；
を有するように、適宜設計することができるが、これ以外の用途で使用する場合には、祖の用途に合わせて、適宜設計する。
　この第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列がハイブリダイズする標的核酸上のヌクレオチド配列領域の、標的核酸のグアニン繰り返し配列からの距離（第1ヌクレオチド配列または第2ヌクレオチド配列のグアニン繰り返し配列から見て最も近位端のヌクレオチドと、グアニン繰り返し配列のGとの間に挟まれるヌクレオチド数）は、熱力学的安定性に関する計算により適宜決定することができ、距離（ヌクレオチド数）は特に限定されない。本発明者らの検討においては、20ヌクレオチドが挟まれる距離があっても、グアニン四重鎖構造の形成は確認されている。
　第二世代型Staple核酸は、DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせから構成することができる。本発明の第二世代型Staple核酸は、第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、3～1か所のグアニン繰り返し配列を直接的にまたはリンカーを介して間接的に結合したものである。本発明において、第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、3～1か所のグアニン繰り返し配列、および場合により含まれていてもよいリンカーのそれぞれの領域に好ましい核酸の形態を選択することができる。
　ここで、第二世代型Staple核酸において、第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列とをつなぐリンカーという場合、第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列の間、第1ヌクレオチド配列および／または第2ヌクレオチド配列とStaple核酸上のグアニン繰り返し配列との間、Staple核酸上のグアニン繰り返し配列とグアニン繰り返し配列との間、に存在する、第1ヌクレオチド配列、第2ヌクレオチド配列、グアニン繰り返し配列以外の、塩基数は任意の核酸のリンカーのことをいう。第1ヌクレオチド配列と標的核酸の結合および第2ヌクレオチド配列と標的核酸との結合の上で、第二世代型Staple核酸が標的核酸の立体構造を変化させ、それにより標的核酸上のグアニン繰り返し配列とStaple核酸上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離を短くできるような長さのものであることが必要である。
　第二世代型Staple核酸は、第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、3～1か所のグアニン繰り返し配列を直接的にまたはリンカーを介して間接的に結合されるものであり、Staple核酸全体の長さは、標的核酸のヌクレオチド配列により変動するものであり、例えば、GC含有率、Tm値など、当該技術分野において一般的に知られている基準に基づいて設計されるどのような長さのものであってもよい。一例として、Staple核酸全体の長さが、26～40ヌクレオチド長であってもよいが、これらの長さには限定されない。Staple核酸が標的核酸にハイブリダイズする領域の長さは、前記一端側（例えば3'側）領域および他端側（例えば5'側）領域の長さは、同じであっても異なってもよく、限定されるものではない。
　上記のとおり設計された第二世代型Staple核酸と標的核酸とのハイブリダイズ反応は、第一世代型Staple核酸の場合と同様に、in vivoあるいはin vitroのいずれでも行うことができ、例えば、
・標的核酸を含む溶液中にStaple核酸を混合して、アニーリングすることにより、
・標的核酸を含む溶液中にStaple核酸を単に混ぜることにより、
・Short hairpin expression vectorを導入し、細胞内からStaple核酸を発現させることにより、
行うことができる。標的核酸とStaple核酸とのハイブリダイズ反応は、例えば24～55℃の反応温度で、例えば1分～2日であってもよい。
　本発明の一態様において、第二世代型Staple核酸は、標的核酸上に存在するグアニン繰り返し配列の数に応じて、グアニン繰り返し配列の数が合わせて4か所となるようにグアニン繰り返し配列を供給できる能力を有することを特徴とする。すなわち、標的核酸上に存在するグアニン繰り返し配列の数に関わらず、標的核酸上に存在するグアニン繰り返し配列のいずれか1か所を使用してグアニン四重鎖構造を形成させる場合、Staple核酸により3か所のグアニン繰り返し配列を供給し、標的核酸上に存在するグアニン繰り返し配列のいずれか2か所を使用してグアニン四重鎖構造を形成させる場合、Staple核酸により2か所のグアニン繰り返し配列を供給し、標的核酸上に存在するグアニン繰り返し配列のおいずれか3か所を使用してグアニン四重鎖構造を形成させる場合、Staple核酸により1か所のグアニン繰り返し配列を供給することができる。
　このように、グアニン四重鎖構造を形成するためのグアニン繰り返し配列を、Staple核酸により供給することから、第二世代型Staple核酸は、グアニン繰り返し配列を供給するオリゴヌクレオチドという意味で、G供給型オリゴヌクレオチドあるいはG供給型Staple核酸と言い換えることができる。
　また、第二世代型Staple核酸がグアニン四重鎖構造を形成する能力は、標的核酸上に存在するグアニン繰り返し配列と第二世代型Staple核酸上に存在するグアニン繰り返し配列の合わせて4か所のグアニン繰り返し配列が存在すること、標的核酸にハイブリダイズしたStaple核酸が標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上および第二世代型Staple核酸上の合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなること、その結果として、標的核酸上および第二世代型Staple核酸上の合わせて4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を誘導することにより実現される。
　本発明の第二世代型Staple核酸を使用したグアニン四重鎖構造の形成反応は、例えば、標的核酸とStaple核酸との間のハイブリダイズ反応を生じさせて、そのまま静置しておくことにより、行うことができる。グアニン四重鎖構造の形成反応は、標的核酸とStaple核酸とのハイブリダイズ反応を行う温度および時間と同じであってもよく、例えば24～55℃の反応温度で、例えば1分～2日であってもよい。グアニン四重鎖構造が形成されたことの確認は、例えば、in vitroトランスレーションアッセイ、チオフラビンTと反応させることによる蛍光シグナル測定法、ストップアッセイ法などにより行うことができる。
　具体的な構造の一例を、以下の化2に示す。この化2において、3か所のグアニン繰り返し配列をオリゴヌクレオチドにより供給する場合をパターンA、2か所のグアニン繰り返し配列をオリゴヌクレオチドにより供給する場合をパターンB、1か所のグアニン繰り返し配列をオリゴヌクレオチドにより供給する場合をパターンCとして示す。このオリゴヌクレオチドの導入により、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記G供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造の形成を誘導するものである。
　第二世代型Staple核酸の製造方法
　本発明において、上述した第二世代型Staple核酸（G供給型オリゴヌクレオチド）を製造する方法もまた、提供することができる。
　具体的には、標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の近傍（すなわち、5'側あるいは3'側）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
　当該G供給型オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列が、標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸上のグアニン繰り返し配列とG供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離を短くするようにG供給型オリゴヌクレオチドが折り返されるように設計し合成することを特徴とする前記方法
を提供することができる。
　本発明の第二世代型Staple核酸の製造においては、Staple核酸の構造を適切に設計することが重要であり、すなわち、標的核酸に対してハイブリダイズするための第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、供給するグアニン繰り返し配列の数、および場合により含まれていてもよいこれらの配列部分をつなぐリンカーを、適切に設計することが重要である。Staple核酸を構成する配列の設計に際しては、前述した第二世代型Staple核酸の特徴を反映させるように設計することが好ましい。Staple核酸の構造が設計できれば、Staple核酸自体を製造することは、通常の核酸合成方法により合成することができる。
　核酸オリゴヌクレオチドの機能
　本発明の第一世代型Staple核酸および第二世代型Staple核酸のいずれにおいても、グアニン四重鎖構造が形成される結果として、同様の機能を発揮することができる。すなわち、第一世代型Staple核酸により発揮される機能は、第二世代型Staple核酸によっても発揮することができ、第二世代型Staple核酸により発揮される機能は、第一世代型Staple核酸によっても発揮することができる。これは、本発明のStaple核酸の機能が、グアニン四重鎖構造が形成される結果として生じるものであり、かつ第一世代型Staple核酸および第二世代型Staple核酸のいずれにおいても、形成されるグアニン四重鎖構造の性質は同様であるためである。
　（1）タンパク質発現抑制
　本発明において、標的核酸上でグアニン四重鎖構造が形成される結果、標的核酸からのタンパク質の発現を抑制することができる。
　タンパク質の発現を抑制する方法の具体例として、例えばグアニン四重鎖構造が形成される結果、標的核酸（mRNA）に対してリボゾームが結合できなくなることにより、あるいは標的核酸（mRNA）に結合したリボゾームの5'→3'方向への進行がグアニン四重鎖構造の位置で停止することにより、タンパク質翻訳反応を抑制し、結果的にタンパク質発現を抑制することができる。このような機能を発揮するためには、例えば、標的核酸上の5'UTR領域、オープンリーディングフレーム領域で、グアニン四重鎖構造が形成されるように本発明のStaple核酸の配列を設計することで、上述した機能を発揮することができる。
　第一世代型Staple核酸の例として特許文献1において示したように、この構造を有するオリゴヌクレオチドは、標的核酸の5'非翻訳領域（5'UTR）に存在するグアニン繰り返し配列が関与して形成されるグアニン四重鎖構造を形成させることにより、タンパク質翻訳反応を抑制することができ、その結果として、酵素非依存型のタンパク質翻訳抑制システムとなることが示された（化3、上左図）。これは、標的核酸の5'UTRにリボゾームが結合しても、グアニン四重鎖構造によりリボゾームが標的核酸の3'側へと進むことができなくなり、タンパク質翻訳が停止するためである。
　また、タンパク質の発現を抑制する別の方法の具体例として、グアニン四重鎖構造が形成される結果、標的核酸（RNA）に対して逆転写酵素が結合できなくなることにより、あるいは標的核酸（RNA）に結合した逆転写酵素の3'→5'方向への進行がグアニン四重鎖構造の位置で停止することにより、結果としてタンパク質発現反応が抑制される場合を示す。
　したがって、本発明において、
　標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の近傍（すなわち、5'側あるいは3'側）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドであって、
　当該G供給型オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記G供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることによる、標的核酸からのタンパク質発現の抑制方法
を提供することができる。
　ここで示すタンパク質発現の抑制機能は、第二世代型オリゴヌクレオチドにより形成されるグアニン四重鎖構造であっても、それらのオリゴヌクレオチドにより形成されるグアニン四重鎖構造が標的核酸の5'非翻訳領域（5'UTR）に存在するグアニン繰り返し配列に関連して形成される場合にも、同様に生じるものであることが、本発明において示された。
　（2）標的核酸の安定化
　化3に示す事例のもう一方において、グアニン四重鎖構造が形成される結果、例えばmRNAに結合したエキソヌクレアーゼなどの核酸分解酵素の5'方向への進行がグアニン四重鎖構造の位置で停止し、標的核酸分解反応が抑制される場合を示す。グアニン四重鎖構造が標的核酸の3'非翻訳領域（3'UTR）に存在するグアニン繰り返し配列を含む4か所のグアニン繰り返し配列により形成される場合に、グアニン四重鎖構造によりエキソヌクレアーゼが標的核酸の5'側へと進むことができなくなり、3'→5'エキソヌクレアーゼによる標的核酸の分解作用を抑制するためである（化3、上右図）。このような機能を発揮するためには、例えば、標的核酸がmRNAである場合、標的核酸上の3'UTR領域で、グアニン四重鎖構造が形成されるように本発明のStaple核酸の配列を設計することで、上述した機能を発揮することができる。
　このように分解作用が停止されることにより、標的核酸が安定化されることになり、また標的核酸からのタンパク質の翻訳量が増大することになる。
　したがって、本発明は、
　標的核酸上の1か所～4か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の近傍（すなわち、5'側あるいは3'側）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～0か所のグアニン繰り返し配列、を含むオリゴヌクレオチドであって、
　当該オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることにより、標的核酸に対する核酸分解酵素の結合を阻害または核酸分解酵素の機能を阻害することによる、標的核酸を安定化させる方法
を提供することができる。
　標的核酸分解の抑制機能は、第一世代型オリゴヌクレオチドにより形成されるグアニン四重鎖構造であっても、第二世代型オリゴヌクレオチドにより形成されるグアニン四重鎖構造であっても、それらのオリゴヌクレオチドにより形成されるグアニン四重鎖構造が標的核酸の3'非翻訳領域（3'UTR）に存在するグアニン繰り返し配列に関連して形成される場合には、同様に生じるものである。
 
　（3）単一の標的核酸内でのリボゾームシャンティングと部分配列の改変翻訳
　本発明のオリゴヌクレオチド（第一世代型オリゴヌクレオチドおよび第二世代型オリゴヌクレオチドを含む）により形成されるグアニン四重鎖構造が、標的核酸のうちのエクソン領域で形成される結果、グアニン四重鎖構造によりループを形成されることとなり、標的核酸に結合したリボゾームが3'方向に進行する際、グアニン四重鎖構造部分でその標的核酸を乗り越え（リボゾームシャントし）、標的核酸の部分配列の改変されたタンパク質を翻訳することができる。
　したがって、本発明は、
　標的核酸上の1か所～4か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の近傍（すなわち、5'側あるいは3'側）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～0か所のグアニン繰り返し配列、を含むオリゴヌクレオチドであって、
　当該オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることにより、標的核酸の一部にループ部分が形成されてリボゾームが当該ループ部分をシャントし、標的核酸から改変タンパク質を製造する方法
を提供することができる。
　標的核酸の部分配列の改変翻訳をする機能は、第一世代型オリゴヌクレオチドにより形成されるグアニン四重鎖構造であっても、第二世代型オリゴヌクレオチドにより形成されるグアニン四重鎖構造であっても、それらのオリゴヌクレオチドにより形成されるグアニン四重鎖構造が標的核酸のエクソン領域に存在するグアニン繰り返し配列に関連して形成される場合には、同様に生じるものである。
　（4）2種類の標的核酸間でのリボゾームシャンティングと部分配列の融合翻訳
　本発明のオリゴヌクレオチド（第一世代型オリゴヌクレオチドおよび第二世代型オリゴヌクレオチドを含む）は、2種類の標的核酸（本明細書において、第1の標的核酸および第2の標的核酸と呼ぶこともある）の間でもグアニン四重鎖構造を形成することができ、当該2種類の標的核酸を実質的に連結させることができる。このように連結した核酸がmRNAである場合、mRNAに対してリボゾームの反応が進行すると、ヘリカーゼ活性が機能せず安定な核酸高次構造をバイパスするリボゾームシャントと呼ばれる反応が進行する。既存の報告では非常に長いStem構造が構築されないとこのリボゾームシャントの現象は起きないとされていたが、本発明のオリゴヌクレオチドにより形成するグアニン四重鎖構造は非常に安定な核酸高次構造であるため、長いStem構造を必要とすることなく、2種類の標的核酸間でのリボゾームのシャントを誘起することができる。
　当該2種類の標的核酸のそれぞれにおいてエクソン領域でグアニン四重鎖構造を形成すると、第1の標的核酸に結合したリボゾームが3'方向に進行する際、エクソン内で形成されたグアニン四重鎖構造部分で、第1の標的核酸から第2の標的核酸にリボゾームが乗り越え（リボゾームシャントし）、第1の標的核酸の部分配列の翻訳物に続いて、第2の標的核酸の部分配列の翻訳物を融合して翻訳することができる（化4）。
　したがって、本発明は、
　第1の標的核酸上の1か所～2か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の近傍（すなわち、5'側あるいは3'側）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列、
　第2の標的核酸上の1か所～2か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の近傍（すなわち、5'側あるいは3'側）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第2ヌクレオチド配列、および
　第1の標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数および第2の標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて2か所～0か所のグアニン繰り返し配列、
を含むオリゴヌクレオチドであって、
　当該オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列の第1の標的核酸へのハイブリダイズおよび第2ヌクレオチド配列の第2の標的核酸へのハイブリダイズ、および当該オリゴヌクレオチドがこれら標的核酸の立体構造を変化させ、前記第1の標的核酸上の1か所～2か所のグアニン繰り返し配列、第2の標的核酸上の1か所～2か所のグアニン繰り返し配列、および前記オリゴヌクレオチド上の2か所～0か所グアニン繰り返し配列の合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることにより、第1の標的核酸と第2の標的核酸との間でリボゾームがシャントすることによる、第1の標的核酸の部分配列の翻訳物と第2の標的核酸の部分配列の翻訳物との融合タンパク質を製造する方法
を提供することができる。
 
　本発明のStaple核酸の用途
　本発明のStaple核酸（オリゴヌクレオチド）は、「オリゴヌクレオチドの機能」の項において上述したような機能を有することから、これらの機能を使用することにより、本発明は、本発明のStaple核酸を含む医薬組成物を提供することができる。
　本発明のStaple核酸を含む医薬組成物は、体外で調製したStaple核酸を投与する形態としても、Staple核酸を産生するベクターを生体に投与して生体内でStaple核酸を産生させる形態としてもよい。従って、本発明の医薬組成物は、治療有効量の本発明のStaple核酸を、単独で、あるいは薬学的に許容される担体（添加剤）、賦形剤、および／または希釈剤と共に、製剤化することにより調製することができ、あるいは治療有効量の本発明のStaple核酸を生体内で産生させることが可能なベクターを、単独で、あるいは薬学的に許容される担体（添加剤）、賦形剤、および／または希釈剤と共に、製剤化することにより調製することができる。
　ここで、本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、副反応の有無にかかわらず、望ましい主作用に基づく治療効果を得るために有効な、本発明のStaple核酸の量のことをいう。
　本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」は、当該技術分野において一般的に使用されているものを指し、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題や合併症を発生させることなく、ヒトおよび動物の組織に適用させるのに適した担体を意味する。このような担体としては、目的の化合物をある器官または体の一部から別の器官または体の一部への運搬または輸送に関与する薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルク、マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、もしくはステアリン酸）、もしくは材料を包含する溶媒が含まれるが、これらのものに限定されない。
　本発明のStaple核酸を含む医薬組成物は、別の成分と組み合わせて使用することができる。このような別の成分として特に限定はなく、どのようなものと組み合わせて使用してもよい。
　本発明のStaple核酸（オリゴヌクレオチド）はまた、「オリゴヌクレオチドの機能」の項において上述したような機能を有することから、本発明のStaple核酸を含む、これらの機能を実現するためのキットを提供することができる。すなわち、
・上述の「（1）タンパク質発現抑制」の機能を実現するためのStaple核酸を含むタンパク質発現抑制用キット、
・上述の「（2）標的核酸の安定化」の機能を実現するためのStaple核酸を含む標的核酸の安定化用キット、
・上述の「（3）単一の標的核酸内でのリボゾームシャンティングと部分配列の改変翻訳」の機能を実現するためのStaple核酸を含む標的核酸の部分配列の改変タンパク質製造用キット、
・上述の「（4）2種類の標的核酸間でのリボゾームシャンティングと部分配列の融合翻訳」の機能を実現するためのStaple核酸を含む2種類の標的核酸の部分配列の融合タンパク質製造用キット、
を提供することができるが、本発明のStaple核酸の用語が拡張するとともに、キットの内容も拡張することができる。
　例えば、より具体的な態様として、例えば、上述の「（1）タンパク質発現抑制」の機能を実現するためのStaple核酸を含むタンパク質発現抑制用キットとして、
　標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の近傍（すなわち、5'側あるいは3'側）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドであって、
　当該G供給型オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記G供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることにより、標的核酸に対するリボゾームの結合を阻害またはリボゾームの機能を阻害する、前記G供給型オリゴヌクレオチド
を含む、タンパク質発現抑制キット
を提供することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。下記に示す実施例はいかなる方法によっても本発明を限定するものではない。
　実施例1：第2世代型Staple核酸の設計
　本実施例においては、いくつかのmRNAを標的として、グアニン繰り返し配列をオリゴヌクレオチドにより供給してグアニン四重鎖構造を形成する、第2世代型Staple核酸を作製した。
　（1）1+1 100nt RNAを標的核酸とする第2世代型Staple核酸
　この実験では、100 塩基のループ配列の両端に隣接したグアニン繰り返し配列が1つ存在するモデル核酸RNA配列（1+1 100nt RNA）を設計し、これを用いた。標的核酸とする1+1 100nt RNAの塩基配列は、以下の通りである。
 
　この配列は、標的核酸中にグアニン繰り返し配列を2か所有するものであり、本発明の第二世代型Staple核酸により2か所のグアニン繰り返し配列を供給する場合にのみ、グアニン四重鎖構造を形成しうることになる。
　この標的核酸に対して、以下のオリゴヌクレオチドを設計し、作製した。このオリゴヌクレオチドの設計にあたり、標的核酸上の第1ヌクレオチド配列の結合部位および第2ヌクレオチド配列の結合部位と、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の位置関係から、type Iのオリゴヌクレオチドとtype IIのオリゴヌクレオチドの設計を試みた。すなわち、type Iのオリゴヌクレオチドは、2か所のグアニン繰り返し配列が第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列との間に位置するように配置するもの、type IIのオリゴヌクレオチドは、2か所のグアニン繰り返し配列が第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列とを挟むように位置するように配置するもの、である。
　type I型のオリゴヌクレオチドとして、
（1-1）G供給型Staple核酸（for 1+1 100nt RNA, type I）：1+1 100nt RNAを標的核酸とする、type I型のG供給型Staple核酸
（1-2）Staple_A（for 1+1 100nt RNA, type I）：（1-1）のオリゴヌクレオチドの、グアニン繰り返し配列部分をアデニン繰り返し配列に変更したもの
を設計し、合成した。
　本明細書で利用したオリゴヌクレオチドはすべて、Thermo Fisher Scientific, Inc.から購入した。また、全てのサンプルは脱塩精製してから使用した。
 
　また、type II型のオリゴヌクレオチドとして、
（1-3）G供給型Staple核酸（type II）：1+1 100nt RNAを標的核酸とする、type II型のG供給型Staple核酸
（1-4）Staple_A（type II）：（1-3）のオリゴヌクレオチドの、グアニン繰り返し配列部分の片方をアデニン繰り返し配列に変更したもの
を設計し、調製した。
 
　これらのオリゴヌクレオチドを使用して、標的核酸に対するG供給型Staple核酸のグアニン四重鎖構造の構築機能を評価するために、グアニン四重鎖構造に結合して蛍光を発することが知られているThioflavin T（ThT）を用いた蛍光測定を行った。
　Thioflavin T（ThT）を用いた蛍光測定は、SEQ ID NO： 1のRNAサンプルに対して以下の条件でサンプル調製し、ThTを利用した蛍光発光測定により行った。RNAサンプル（2μM）、KCl（100 mM）、20 mM Tris-HCl buffer（pH 7.6）、G供給型Staple核酸（2.5μM）の混合溶液（Total volume：50μl）を90℃で2分間加熱し、20℃まで毎分1℃ずつ冷却した。その後、終濃度が0.5μMとなるように3μM ThT溶液10μl（Total volume：60μl）を混合溶液に添加し、室温で30分間インキュベートした。このサンプルをFP-8500 spectrofluorometer（JASCO, Inc.）を用いて440 nmの光で励起させ、487 nmの蛍光シグナルを測定した。測定波長は450 nm～600 nm、掃引速度は200 nm/min、積算3回で測定を行った。
　type I型である（1-1）のオリゴヌクレオチドおよび（1-2）のオリゴヌクレオチドを使用した蛍光測定の結果を、図1（A）に示す。すなわち、（1-1）のG供給型Staple核酸存在下では、ThT由来の大きな蛍光シグナルが得られた一方で、グアニン四重鎖構造を形成しないようグアニン繰り返し配列をアデニンに変異させた（1-2）のStaple核酸（Staple_A）の存在下では、蛍光シグナルが大きく変化しなかった（図1（A））。
　type II型である（1-3）のオリゴヌクレオチドおよび（1-4）のオリゴヌクレオチドを使用した蛍光測定の結果を、図1（B）に示す。すなわち、（1-3）のG供給型Staple核酸存在下では、type I型のオリゴヌクレオチドと比較して蛍光シグナルは弱いものの、ThT由来の蛍光シグナルが得られた一方で、グアニン四重鎖構造を形成しないようグアニン繰り返し配列をアデニンに変異させた（1-4）のStaple核酸（Staple_A）の存在下では、蛍光シグナルが大きく変化しなかった（図1（B））。
　これらの結果から、（1-1）のオリゴヌクレオチドおよび（1-3）のオリゴヌクレオチドはともに、G供給型Staple核酸として機能していることが示された。また、G供給型Staple核酸におけるグアニン繰り返し配列挿入位置により蛍光シグナルに差異があり、グアニン繰り返し配列を中心にグアニン繰り返し配列を挿入した設計において、より大きな蛍光シグナルが得られた（図1）ことから、グアニン四重鎖構造の形成効率がG供給型Staple核酸の結合様式に依存していることが示唆された。
　（2）2+1 100nt RNAを標的核酸とする第2世代型Staple核酸
　この実験では、別のモデル標的核酸である「2+1 100nt RNA」を設計し、これを用いた。標的核酸とする2+1 100nt RNAの塩基配列は、以下の通りである。
 
　この配列は、標的核酸中にグアニン繰り返し配列を3か所有するものであり、本発明の第二世代型Staple核酸により1か所のグアニン繰り返し配列を供給する場合にのみ、グアニン四重鎖構造を形成しうることになる。
　この標的核酸に対して、以下のオリゴヌクレオチドを設計し、作製した。このオリゴヌクレオチドの設計にあたり、標的核酸上の第1ヌクレオチド配列の結合部位および第2ヌクレオチド配列の結合部位と、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の位置関係から、オリゴヌクレオチドの設計を試みた。すなわち、この実施例のオリゴヌクレオチドは、1か所のグアニン繰り返し配列が第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列との間に位置するように配置するもの、である。
　オリゴヌクレオチドとして、
（2-1）G供給型Staple核酸（for 2+1 100nt RNA）：2+1 100nt RNAを標的核酸とする、G供給型Staple核酸
（2-2）Staple_A（for 2+1 100nt RNA）：（2-1）のオリゴヌクレオチドの、グアニン繰り返し配列部分をアデニン繰り返し配列に変更したもの
を設計し、調製した。
 
　これらのオリゴヌクレオチドを使用して、標的核酸に対するG供給型Staple核酸のグアニン四重鎖構造の構築機能を評価するために、グアニン四重鎖構造に結合して蛍光を発することが知られているThioflavin T（ThT）を用いた蛍光測定を行った。
　Thioflavin T（ThT）を用いた蛍光測定は、上述した方法により行った。
　（2-1）のオリゴヌクレオチドおよび（2-2）のオリゴヌクレオチドを使用した蛍光測定の結果を、図2（A）に示す。すなわち、（2-1）のG供給型Staple核酸存在下では、ThT由来の大きな蛍光シグナルが得られた一方で、グアニン四重鎖構造を形成しないようグアニン繰り返し配列をアデニンに変異させた（2-2）のStaple核酸（Staple_A）の存在下では、蛍光シグナルが大きく変化しなかった（図2（A））。
　この結果から、（2-1）のオリゴヌクレオチドは、G供給型Staple核酸として機能していることが示された。
　（3）1+1 100nt_mut 1 RNAを標的核酸とする第2世代型Staple核酸
　この実験では、別のモデル標的核酸である「1+1 100nt_mut 1 RNA」を設計し、これを用いた。標的核酸とする1+1 100nt_mut 1 RNAの塩基配列は、以下の通りである。
 
　この配列は、標的核酸中にグアニン繰り返し配列を2か所有するものであり、本発明の第二世代型Staple核酸により2か所のグアニン繰り返し配列を供給する場合にのみ、グアニン四重鎖構造を形成しうることになる。
　この標的核酸に対して、以下のオリゴヌクレオチドを設計し、作製した。このオリゴヌクレオチドの設計にあたり、標的核酸上の第1ヌクレオチド配列の結合部位および第2ヌクレオチド配列の結合部位と、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の位置関係から、オリゴヌクレオチドの設計を試みた。すなわち、この実施例のオリゴヌクレオチドは、2か所のグアニン繰り返し配列が第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列との間に位置するように配置するもの、である。
　オリゴヌクレオチドとして、
（3-1）G供給型Staple核酸（for 1+1 100nt_mut 1 RNA）：1+1 100nt_mut 1 RNAを標的核酸とする、G供給型Staple核酸
（3-2）Staple_A（for 1+1 100nt_mut 1 RNA）：（3-1）のオリゴヌクレオチドの、グアニン繰り返し配列部分をアデニン繰り返し配列に変更したもの
を設計し、調製した。
 
　これらのオリゴヌクレオチドを使用して、標的核酸に対するG供給型Staple核酸のグアニン四重鎖構造の構築機能を評価するために、グアニン四重鎖構造に結合して蛍光を発することが知られているThioflavin T（ThT）を用いた蛍光測定を行った。
　Thioflavin T（ThT）を用いた蛍光測定は、上述した方法により行った。
　（3-1）のオリゴヌクレオチドおよび（3-2）のオリゴヌクレオチドを使用した蛍光測定の結果を、図2（B）に示す。すなわち、（3-1）のG供給型Staple核酸存在下では、ThT由来の大きな蛍光シグナルが得られた一方で、グアニン四重鎖構造を形成しないようグアニン繰り返し配列をアデニンに変異させた（3-2）のStaple核酸（Staple_A）の存在下では、蛍光シグナルが大きく変化しなかった（図2（B））。
　この結果から、（3-1）のオリゴヌクレオチドは、G供給型Staple核酸として機能していることが示された。
　（4）1+1 100nt_mut 2 RNAを標的核酸とする第2世代型Staple核酸
　この実験では、別のモデル標的核酸である「1+1 100nt_mut 2 RNA」を設計し、これを用いた。標的核酸とする1+1 100nt_mut 2 RNAの塩基配列は、以下の通りである。
 
　この配列は、標的核酸中にグアニン繰り返し配列を2か所有するものであり、本発明の第二世代型Staple核酸により2か所のグアニン繰り返し配列を供給する場合にのみ、グアニン四重鎖構造を形成しうることになる。
　この標的核酸に対して、以下のオリゴヌクレオチドを設計し、作製した。このオリゴヌクレオチドの設計にあたり、標的核酸上の第1ヌクレオチド配列の結合部位および第2ヌクレオチド配列の結合部位と、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の位置関係から、オリゴヌクレオチドの設計を試みた。すなわち、この実施例のオリゴヌクレオチドは、2か所のグアニン繰り返し配列が第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列との間に位置するように配置するもの、である。
　オリゴヌクレオチドとして、
（4-1）G供給型Staple核酸（for 1+1 100nt_mut 2 RNA）：1+1 100nt_mut 2 RNAを標的核酸とする、G供給型Staple核酸
（4-2）Staple_A（for 1+1 100nt_mut 2 RNA）：（4-1）のオリゴヌクレオチドの、グアニン繰り返し配列部分をアデニン繰り返し配列に変更したもの
を設計し、調製した。
 
　これらのオリゴヌクレオチドを使用して、標的核酸に対するG供給型Staple核酸のグアニン四重鎖構造の構築機能を評価するために、グアニン四重鎖構造に結合して蛍光を発することが知られているThioflavin T（ThT）を用いた蛍光測定を行った。
　Thioflavin T（ThT）を用いた蛍光測定は、上述した方法により行った。
　（4-1）のオリゴヌクレオチドおよび（4-2）のオリゴヌクレオチドを使用した蛍光測定の結果を、図2（C）に示す。すなわち、（4-1）のG供給型Staple核酸存在下では、ThT由来の大きな蛍光シグナルが得られた一方で、グアニン四重鎖構造を形成しないようグアニン繰り返し配列をアデニンに変異させた（4-2）のStaple核酸（Staple_A）の存在下では、蛍光シグナルが大きく変化しなかった（図2（C））。
　この結果から、（4-1）のオリゴヌクレオチドは、G供給型Staple核酸として機能していることが示された。
　（5）1+1 100nt RNA-2を標的核酸とする第2世代型Staple核酸
　この実験では、別のモデル標的核酸である「1+1 100nt RNA-2」を設計し、これを用いた。標的核酸とする1+1 100nt RNA-2の塩基配列は、以下の通りである。
 
　この配列は、標的核酸中にグアニン繰り返し配列を2か所有するものであり、本発明の第二世代型Staple核酸により2か所のグアニン繰り返し配列を供給する場合にのみ、グアニン四重鎖構造を形成しうることになる。
　この標的核酸に対して、以下のオリゴヌクレオチドを設計し、作製した。このオリゴヌクレオチドの設計にあたり、標的核酸上の第1ヌクレオチド配列の結合部位および第2ヌクレオチド配列の結合部位と、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の位置関係から、オリゴヌクレオチドの設計を試みた。すなわち、この実施例のオリゴヌクレオチドは、2か所のグアニン繰り返し配列が第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列との間に位置するように配置するもの、である。
　オリゴヌクレオチドとして、
（5-1）G供給型Staple核酸（for 1+1 100nt RNA-2）：1+1 100nt RNA-2を標的核酸とする、G供給型Staple核酸
（5-2）Staple_A（for 1+1 100nt RNA-2）：（5-1）のオリゴヌクレオチドの、グアニン繰り返し配列部分をアデニン繰り返し配列に変更したもの
を設計し、調製した。このStaple核酸は、ストップアッセイにおいて使用した。
 
　（6）TRPC6 5’UTR RNAを標的核酸とする第2世代型Staple核酸
　この実験では、別の標的核酸である「TRPC6 5’UTR RNA」に対するStaple核酸を設計し、これを用いた。標的核酸とするTRPC6 5’UTR RNAに対するStaple核酸の塩基配列は、以下の通りである。
 
　この配列は、標的核酸中にグアニン繰り返し配列を2か所有するものであり、本発明の第二世代型Staple核酸により2か所のグアニン繰り返し配列を供給する場合にのみ、グアニン四重鎖構造を形成しうることになる。
　この標的核酸に対して、以下のオリゴヌクレオチドを設計し、作製した。このオリゴヌクレオチドの設計にあたり、標的核酸上の第1ヌクレオチド配列の結合部位および第2ヌクレオチド配列の結合部位と、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の位置関係から、オリゴヌクレオチドの設計を試みた。すなわち、この実施例のオリゴヌクレオチドは、2か所のグアニン繰り返し配列が第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列との間に位置するように配置するもの、である。
　オリゴヌクレオチドとして、
（6-1）G供給型Staple核酸_T（1-1-1）（for TRPC6 5’UTR RNA）：TRPC6 5’UTR RNAを標的核酸とする、グアニン繰り返し配列近傍のTの配置が、Tが1個-G繰り返し配列-Tが1個-G繰り返し配列-Tが1個であるG供給型Staple核酸
（6-2）G供給型Staple核酸_T（2-1-2）（for TRPC6 5’UTR RNA）：TRPC6 5’UTR RNAを標的核酸とする、グアニン繰り返し配列近傍のTの配置が、Tが2個-G繰り返し配列-Tが1個-G繰り返し配列-Tが2個であるG供給型Staple核酸
（6-3）G供給型Staple核酸_T（3-1-3）（for TRPC6 5’UTR RNA）：TRPC6 5’UTR RNAを標的核酸とする、グアニン繰り返し配列近傍のTの配置が、Tが3個-G繰り返し配列-Tが1個-G繰り返し配列-Tが3個であるG供給型Staple核酸
（6-4）G供給型Staple核酸_T（1-2-1）（for TRPC6 5’UTR RNA）：TRPC6 5’UTR RNAを標的核酸とする、グアニン繰り返し配列近傍のTの配置が、Tが1個-G繰り返し配列-Tが2個-G繰り返し配列-Tが1個であるG供給型Staple核酸
（6-5）G供給型Staple核酸_T（1-3-1）：TRPC6 5’UTR RNAを標的核酸とする、グアニン繰り返し配列近傍のTの配置が、Tが1個-G繰り返し配列-Tが3個-G繰り返し配列-Tが1個であるG供給型Staple核酸
（6-6）G供給型Staple核酸_T（2-2-2）：TRPC6 5’UTR RNAを標的核酸とする、グアニン繰り返し配列近傍のTの配置が、Tが2個-G繰り返し配列-Tが2個-G繰り返し配列-Tが2個であるG供給型Staple核酸
（6-7）G供給型Staple核酸_T（2-1-2）_36 mer：（6-2）のオリゴヌクレオチドの5'末端から2塩基および3'末端から2塩基をそれぞれ短縮したもの
（6-8）G供給型Staple核酸_T（2-1-2）_32 mer：（6-2）のオリゴヌクレオチドの5'末端から4塩基および3'末端から4塩基をそれぞれ短縮したもの
（6-9）G供給型Staple核酸_T（2-1-2）_28 mer：（6-2）のオリゴヌクレオチドの5'末端から6塩基および3'末端から6塩基をそれぞれ短縮したもの
を設計し、合成した。これらのStaple核酸は、ストップアッセイにおいて使用した。
 
　（7）TRPC6 5’UTR RNAを標的核酸とする第2世代型Staple核酸
　この実験では、別の標的核酸である「TRPC6 5’UTR RNA」に対するStaple核酸を設計し、これを用いた。標的核酸とするTRPC6 5’UTR RNAに対するStaple核酸の塩基配列は、以下の通りである。
 
　この配列は、標的核酸中にグアニン繰り返し配列を2か所有するものであり、本発明の第二世代型Staple核酸により2か所のグアニン繰り返し配列を供給する場合にのみ、グアニン四重鎖構造を形成しうることになる。
　この標的核酸に対して、以下のオリゴヌクレオチドを設計し、作製した。このオリゴヌクレオチドの設計にあたり、標的核酸上の第1ヌクレオチド配列の結合部位および第2ヌクレオチド配列の結合部位と、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の位置関係から、オリゴヌクレオチドの設計を試みた。すなわち、この実施例のオリゴヌクレオチドは、2か所のグアニン繰り返し配列が第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列との間に位置するように配置するもの、である。
　オリゴヌクレオチドとして、
（7-1）G供給型Staple核酸（for TRPC6 5’UTR RNA）：TRPC6 5’UTR RNAを標的核酸とする、G供給型Staple核酸
を設計し、調製した。このStaple核酸は、in vitro translationアッセイにおいて使用した。
 
　実施例2：第2世代型Staple核酸による標的核酸上でのグアニン四重鎖構造の形成部位の検討
　本実施例においては、実施例1の（5）および（6）において調製した各Staple核酸について、標的核酸上のどのような部位においてグアニン四重鎖構造を形成するかを確認するためのストップアッセイを行った。
　逆転写を行うとRNAから完全長の相補DNA（cDNA）が生成する。その一方で、グアニン四重鎖構造が存在するRNAに対して逆転写を行うと、逆転写酵素のcDNA伸長反応をグアニン四重鎖構造が阻害し、短いcDNAが生成される。これを確認することで、標的核酸のどこでグアニン四重鎖構造が形成されているかを確認できる。
　ストップアッセイでは、逆転写によるグアニン四重鎖構造の存在位置の測定とターゲットDNAの配列をサンガー法によって特定する、という作業を同時に行う。そうすることで逆転写が配列のどの位置で停止したかを把握することができる。
　実施例1の「（5）1+1 100nt RNA-2を標的核酸とする第2世代型Staple核酸」において調製した、「1+1 100nt RNA-2」（SEQ ID NO: 15）に対する「（5-1）G供給型Staple核酸（for 1+1 100nt RNA-2）」（SEQ ID NO: 16）および「（5-2）Staple_A（for 1+1 100nt RNA-2）」（SEQ ID NO: 17）を使用したストップアッセイにおいて、逆転写反応の際に鋳型RNA「1+1 100nt RNA-2」（SEQ ID NO: 15）（0.3μM）、G供給型Staple核酸（5-1）（SEQ ID NO: 16）（1.0μM）、KCl（100 mM）、Tris-HCl buffer（pH 7.6、50 mM）、5'-CD4 labeled 3'-DNAプライマー［5’-CD4-CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC CAT GAT TA-3’］（SEQ ID NO: 30）（0.3μM）となるような混合溶液を、90℃で2分間加熱し、20℃まで毎分1℃ずつ冷却した。その後、アニーリングサンプル、Rever Tra Ace逆転写酵素（TOYOBO, Inc.）（100 units）、MgCl2（5 mM）、dNTPs（0.86 mM）の逆転写反応溶液を42℃で30分間反応させ、さらにRNase H 60 unitsを添加し、37℃で30分間反応させた。得られた最終反応溶液はキャピラリーシーケンサーCEQ8000（BECKMAN COULTER, Inc.）で解析した。シークエンスマーカーとして、DNAサイズスタンダード-600（BECKMAN COULTER, Inc.）を利用した。陰性対照として、G供給型Staple核酸（5-1）（SEQ ID NO: 16）に代えて、Staple_A核酸（5-2）（SEQ ID NO: 17）を使用して、同プロトコルでストップアッセイを行った。
　実施例1の「（6）TRPC6 5’UTR RNAを標的核酸とする第2世代型Staple核酸」において調製した、「TRPC6 5’UTR RNA」（SEQ ID NO: 18）に対する「（6-1）G供給型Staple核酸_T（1-1-1）（for TRPC6 5’UTR RNA）」（SEQ ID NO: 19）を使用したストップアッセイにおいて、逆転写反応の際の鋳型RNA「TRPC6 5’UTR RNA」（SEQ ID NO: 18）（0.3μM）、G供給型Staple核酸（1.0μM）、5'-CD4 labeled 3'-DNAプライマー［5’-CD4-GAG ATT TCC AAC TAT GTA TAC CTG-3’］（SEQ ID NO: 31）（0.3μM）を使用する以外は、前述したストップアッセイと同じ手順で、ストップアッセイを行った。陰性対照として、G供給型Staple核酸（6-1）（SEQ ID NO: 19）に代えて、G繰り返し配列を同数のAで置換したStaple_A核酸を使用して、同プロトコルでストップアッセイを行った。
　これらのストップアッセイの結果を、図3に示す。「1+1 100nt RNA-2」（SEQ ID NO: 15）を標的核酸とした場合において、グアニン四重鎖構造由来のRTase stop signalはG供給型Staple核酸（5-1）存在下で検出されたが、Staple_A（5-2）存在下では検出されなかった（図3（A））。
　TRPC6遺伝子の5’UTR（「TRPC6 5’UTR RNA」（SEQ ID NO: 18））を標的核酸としてG供給型Staple核酸（6-1）を使用して検討した場合、G供給型Staple核酸存在下で、RTase stop signalが検出された（図3（B））。
　これらの結果から、モデル配列（1+1 100nt RNA）（図3（A））だけでなく、遺伝子（TRPC6）（図3（B））においても、G供給型Staple核酸によりグアニン四重鎖構造の構築が可能であることが示された。
　本実施例においては、さらに、（A）G供給型Staple核酸中のTリンカーの数がStaple核酸の機能にどのような影響を与えるか、そして（B）G供給型Staple核酸の長さ自体を変化させた場合にStaple核酸の機能にどのような影響を与えるかを調べるため、実施例1の（6）の「TRPC6 5’UTR RNA」（SEQ ID NO: 18）を標的核酸として、（A）については、（6-1）～（6-6）および（6-10）～（6-12）のG供給型Staple核酸（それぞれ、SEQ ID NO: 19～SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 38～SEQ ID NO: 40）を使用して、（B）については（6-2）（SEQ ID NO: 20）と（6-2）の第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の長さを短縮した（6-7）～（6-9）のG供給型Staple核酸（それぞれ、SEQ ID NO: 25～SEQ ID NO: 27）を使用して、ストップアッセイにおいて、前述した手順と同じ手順で、ストップアッセイを行った。
　G供給型Staple核酸中の標的核酸認識配列とグアニン繰り返し配列の間のTリンカーの長さを変えたところ、Tリンカーが0～3個のいずれの構造であってもRTaseの逆転写反応を阻害していることが明らかになった（図4（A））。また、標的核酸認識領域である第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の長さを短くしたところ、32塩基より短くなるとRTase stop signal が検出されなかった（図4（B））。
　これらの結果から、RTaseに対する逆転写阻害効果は、G供給型Staple核酸のG繰り返し配列の間のリンカーの長さには依存せず、G供給型Staple核酸と標的核酸の間で形成される二本鎖の安定性（長さ）に依存していることが示唆された。
　実施例3：第2世代型Staple核酸によるタンパク質発現抑制作用の検討
　本実施例においては、実施例1において調製した第2世代型Staple核酸を使用して、実際にタンパク質発現抑制作用が生じるかどうかを確認した。
　標的核酸およびそれに対するG供給型Staple核酸として、
　実施例1「（7）TRPC6 5’UTR RNAを標的核酸とする第2世代型Staple核酸」において調製した「TRPC6 5’UTR RNA」（SEQ ID NO: 28）に対する「（7-1）G供給型Staple核酸（for TRPC6 5’UTR RNA）」（SEQ ID NO: 29）
を使用して、（7）TRPC6 5’UTR RNAにおいて、それぞれに対するG供給型Staple核酸により構築したグアニン四重鎖構造が、タンパク質翻訳反応に与える影響を、in vitro translationアッセイにより評価した。
　それぞれの標的核酸からのタンパク質翻訳反応に与える影響は、Cap依存的に翻訳されるFirefly luciferase（FL）とIRESを介して翻訳されるRenilla luciferase（RL）の2種類のレポーター遺伝子（標的核酸に連結されているもの）を利用した（概要を図5（A）に示す）。FLとRL由来の発光シグナルを比較することで、構築したグアニン四重鎖構造が遺伝子発現に与える影響を定量的に評価することができる。
　in vitro translationによる評価は、それぞれの標的核酸をmRNAテンプレート（1μg）として、G供給型Staple核酸を0.14μM含むか含まない無細胞タンパク質発現混合液（RTS 100 Wheat Germ CECF Kit, 5 Prime, Inc）20μLを24℃で150分間反応させた。ルシフェラーゼ活性は、Luciferase Assay System（Promega, Inc.）およびRenilla Luciferase Assay System（Promega, Inc.）、POWERSCAN・H1 microplate reader（BioTek, Inc.）を用いて行った。
　in vitro translationの結果、G供給型Staple核酸存在下では各遺伝子の配列を持つ転写産物の翻訳効率が低下した（図5（B）。これらの結果から、試験管内においてG供給型Staple核酸を用いて標的遺伝子の発現を抑制できることが示された。
　実施例4：本発明のStaple核酸による、標的核酸の安定化作用の検討
　本実施例においては、第一世代型Staple核酸および第2世代型Staple核酸を使用して、標的核酸の安定化作用が生じるかどうかを確認した。
　本発明者らのグループでは、これまで、グアニン四重鎖構造に対して選択的に結合安定化する化合物RGB-1の開発に成功した（JACS, 2016）。細胞に対して、RGB-1を添加すると、タンパク質発現量が向上する遺伝子がいくつか見出され、さらにグアニン四重鎖構造の形成位置を特定することが可能なStopAssayによりグアニン四重鎖構造の探索を行ったところ、RGB-1が特定のmRNAの3’UTRでグアニン四重鎖構造形成を誘導していることが明らかになった。
　そこで、本実施例において、グアニン四重鎖構造が標的核酸中に存在することで、エキソヌクレアーゼを物理的にブロックして耐性を獲得すること可能性があると考え、標的核酸の3’UTR領域を標的としたStaple核酸を設計・作製し、標的核酸安定性の向上（ひいてはタンパク質の発現亢進）を図った。
　本実施例において、以下の配列の標的核酸を設計し（SEQ ID NO： 32）、これを用いた。本実施例においてはさらに、この標的核酸に対して作用させるStaple核酸を以下の通り作製した。
 
　作製したtemplate RNAを標的核酸として用いて、template RNAとStaple核酸をKCl（150 mM）、Tris-HCl buffer（pH 7.6）（20 mM）の組成で90℃で2分間インキュベートし、1℃/minで20℃まで下げアニーリングした（template RNA：Staple＝1：1.25）。アニーリング溶液を用いて、RNA（0,04μM）、1×RNaseR Buffer、RNase R（0.01 units）またはmilliQ（control）となるように測定溶液（Total volume：150μl）を調製した。UV/VIS Spectrophotometer V-560（JASCO）を用いて260 nmの吸収スペクトルを37℃で１時間測定した。これを3回繰り返しN＝3とした。この手順において、標的核酸が分解されると、UV吸収値が上昇することで、標的核酸の分解を検出することができる
　Staple核酸の導入により標的核酸の3'UTRにおいてグアニン四重鎖構造の形成を誘導した結果、RNaseRの存在下においても、顕著に標的核酸の安定性が向上することを確認できた（図6）。従って、Staple核酸が存在することにより、安定性が顕著に向上した。これは、結果的に、タンパク質の発現量増大をもたらした。
　実施例5：本発明のStaple核酸による、単一の標的核酸内でのリボゾームシャント作用の検討
　本実施例においては、第一世代型Staple核酸を使用して、単一の標的核酸の部分配列をリボゾームシャンティングさせる作用が生じることを確認した。
　リボゾームは、熱安定が高く嵩高い高次構造に反応の進行を阻まれると、この構造を読み飛ばして（迂回して）タンパク質翻訳を継続するRibosomal Shuntingという戦略をとることが知られている。本実施例においては、Ribosomal Shuntingを制御し、単一の標的核酸において、終始コドンをバイパスする技術を確立した。
　本実施例において、以下の配列の標的核酸を設計し（PTC GFPについて、SEQ ID NO： 34、Δtype1 GFPについて、SEQ ID NO： 35）、これを用いた。PTC GFPのmRNAは、下線部で示す第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列との間に存在する「TGA」が終止コドンとして機能し、そのコドンで翻訳が停止する特徴を有する。
 
　本実施例においては、この標的核酸に対して作用させるStaple核酸を以下の通り作製した。ここで、Staple核酸は第一世代型であり、Staple核酸B1およびStaple核酸B2ともにPTC GFPの標的核酸には結合できるが、Δtype1 GFPには結合しないものである。両方のStaple核酸ともに、終止コドンを読み飛ばすように、リボゾームシャントを生じさせるように設計したものである。なお、Staple核酸B1はStaple核酸B2と比較して、3'末端側3塩基（GCT）が短縮化されているものである。
 
　上記配列PTC GFP（SEQ ID NO： 34）またはΔtype1 GFP（SEQ ID NO： 35）を転写したmRNAをテンプレート（1μg）として、各Staple核酸を0.14μM含むもしくは加えない状態で、無細胞タンパク質発現混合液（RTS 100 Wheat Germ CECF Kit, 5 Prime, Inc）20μLを24℃で150分間反応させた。得られたRNAをmRNAテンプレート（1μg）として、Staple核酸を0.14μM含むか含まない無細胞タンパク質発現混合液（RTS 100 Wheat Germ CECF Kit, 5 Prime, Inc）20μLを24℃で150分間反応させた。励起波長は480 nmに設定し25℃の条件下で蛍光分光光度計（Jasco FP-8500）を用いて蛍光測定を行った。
　結果を図7に示す。この図は、GFPのmRNAを発現させた場合のGFPシグナル強度を100として、PTC GFP（Staple核酸なし）、Δtype1 GFP（Staple核酸なし）、PTC GFP（Staple核酸B1）、PTC GFP（Staple核酸B2）のGFPシグナル強度を比較したものである。この結果、PTC GFP（Staple核酸なし）ではシグナル強度がGFPの3％であったのに対して、PTC GFP（Staple核酸B1）、PTC GFP（Staple核酸B2）ではそれぞれ37％、8％程度まで強度が増大した。
　実施例6：本発明の第一世代型Staple核酸による、標的核酸の安定化作用の検討
　本実施例においては、第一世代型Staple核酸を使用して、mRNAを標的核酸とした場合のその安定化作用が生じ、また結果としてタンパク質の発現が亢進されるかどうかを確認した。
　（6-1）mRNAの安定化作用
　実施例4において前述したように、本発明の第一世代型Staple核酸が、標的核酸の安定化作用を発揮できることを無細胞系で示した。
　本実施例において、以下の配列の標的核酸「Random sequence_2+2 100nt」（Random sequenceと2+2 100ntとを連結した配列を有する標的核酸）を設計し（SEQ ID NO： 41）、これを用いた。また、対照として、標的核酸「Random sequence_2+2 100nt」の4か所のグアニン繰り返し配列を「AAA」に改変した「Random sequence_2+2 100nt MutA」を設計した（SEQ ID NO： 42）。
 
　本実施例においてはさらに、この標的核酸に対して作用させる第一世代型Staple核酸を以下の通り作製した。この構成では、Staple核酸により、標的核酸の3'UTRに相当する領域にグアニン四重鎖構造が形成されるように設計されている。
 
　作製したtemplate RNAを標的核酸として用いて、template RNAとStaple核酸をKCl（150 mM）、Tris-HCl buffer（pH 7.6）（10 mM）の組成で90℃で2分間インキュベートし、1℃/minで20℃まで下げアニーリングした（template RNA：Staple＝1：1.25）。アニーリング溶液を用いて、RNA（0,04μM）、1×RNaseR Buffer、RNase R（0.1 units）またはmilliQ（control）となるように測定溶液（Total volume：150μl）を調製した。UV/VIS Spectrophotometer V-560（JASCO）を用いて260 nmの吸収スペクトルを37℃で１時間測定した。これを3回繰り返しN＝3とした。この手順において、標的核酸が分解されると、UV吸収値が上昇することで、標的核酸の分解を検出することができる。
　Staple核酸の導入により、標的核酸「Random sequence_2+2 100nt」の3'末端側にグアニン四重鎖構造の形成を誘導した結果、RNaseRの存在下においても、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性に対する標的核酸の耐性が向上し、標的核酸の安定性が顕著に向上することを確認できた（図8-1上図）。一方、グアニン繰り返し配列を含まない「Random sequence_2+2 100nt MutA」ではグアニン四重鎖構造が形成されないため、RNaseRの存在下では、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性により「Random sequence_2+2 100nt MutA」の分解が陰性対照（「w/ oligo」群）と同程度で行われることが示された（図8-1下図）。従って、Staple核酸が存在することにより、安定性が顕著に向上した。
　（6-2）タンパク質の発現量増大作用
　本実施例において、細胞内においても、本発明のStaple核酸がグアニン四重鎖構造を標的核酸中に形成することができること、そしてその結果として細胞内においても標的核酸安定性の向上（ひいてはタンパク質の発現亢進）を生じることができるかどうかを確認した。
　本実施例において、以下の配列の標的核酸「Firefly_2+2」（ホタルルシフェラーゼの遺伝子配列に2+2の配列を連結したもの）を設計し（SEQ ID NO： 44）、これを用いた。
 
　本実施例においてはさらに、この標的核酸に対して作用させる第一世代型Staple核酸を以下の通り作製した。この構成では、Staple核酸により、標的核酸の3'UTRに相当する領域にグアニン四重鎖構造が形成されるように設計されている。
 
　HEK 293T cell #16細胞を、2×104 cell/mlの細胞密度で96ウェルプレートに播種し、10％FBS、1％ペニシリンを含むD-MEM培地100μlで72時間培養した。80％コンフルエントであることを確認し、培地を10％FBSを含むD-MEM培地100μlに交換し、3時間培養した。
　細胞を2群に分け、Staple核酸を適用する群については、H1プロモーターの制御下でStaple核酸の配列を発現するpSuper、Staple核酸を適用しない群については、インサートが挿入されていない空のpSuperのベクター溶液を、FuGENE（登録商標）HD Transfection Reagent（Promega E2311）のプロトコルに従い1μg培地に加え、CO2 5％、37℃で24時間培養した。
　その後、両群に対して、CMVプロモータの制御下で「Firefly_2＋2」を発現するpBI-CMV1 MCS1の溶液を、FuGENE（登録商標）HD Transfection Reagent（Promega E2311）のプロトコルに従い1μg培地に加え、CO2 5％、37℃で8時間、12時間、24時間培養した時点で、細胞をサンプリングした。
　ホタルルシフェラーゼのタンパク質発現は、Staple核酸を添加しない群で、「Firefly_2＋2」を24時間発現させた場合のルシフェラーゼ発光強度をタンパク質発現量100％とし、この値と比較してそれぞれのサンプルのルシフェラーゼ発光強度を測定し、そこからタンパク質発現量比（％）を算出した。
　結果を図8-2に示す。この図においても示されるように、Staple核酸の存在により、3'末端UTR領域に形成されたグアニン四重鎖構造により、細胞内におけるタンパク質発現量が増加することが示された。
　実施例7：本発明の第二世代型Staple核酸による、標的核酸の安定化作用の検討
　本実施例においては、第二世代型Staple核酸を使用して、細胞を使用した場合にも標的核酸の安定化作用が生じるかどうかを確認した。
　（7-1）mRNAの安定化作用
　前述したように、本発明の第二世代型Staple核酸が、標的核酸の安定化作用を発揮できることを無細胞系で示した。
　本実施例において、Neurofibromin 1（NF1）に関して、以下の配列の標的核酸「NF1 3'UTRの一部」（NF1の遺伝子配列を有する標的核酸）を設計し（SEQ ID NO： 46）、これを用いた。
 
　本実施例においてはさらに、この標的核酸に対して作用させる第二世代型Staple核酸を以下の通り作製した。この構成では、標的核酸の3'UTRに存在する2か所のグアニン繰り返し配列を使用し、Staple核酸により2か所のグアニン繰り返し配列を供給し、標的核酸の3'UTRに相当する領域にグアニン四重鎖構造が形成されるように設計されている。なお、細胞内では、U6系のプロモーターを用いてRNA pol IIIによってStaple核酸の配列を転写させるが、その際、Tの連続配列によってRNAポリメラーゼが転写を終了させてしまうことから、細胞内で利用するためには一部のTをAに置換した。
 
　mRNAの安定化を調べる方法は、基本的に実施例6（6-1）に記載した方法に従って調べた。作製したtemplate RNAを標的核酸として用いて、template RNAとStaple核酸をKCl（150 mM）、Tris-HCl buffer（pH 7.6）（10 mM）の組成で90℃で2分間インキュベートし、1℃/minで20℃まで下げアニーリングした（template RNA：Staple＝1：1.25）。アニーリング溶液を用いて、RNA（0,04μM）、1×RNaseR Buffer、RNase R（0.1 units）またはmilliQ（control）となるように測定溶液（Total volume：150μl）を調製した。UV/VIS Spectrophotometer V-560（JASCO）を用いて260 nmの吸収スペクトルを37℃で１時間測定した。これを3回繰り返しN＝3とした。この手順において、標的核酸が分解されると、UV吸収値が上昇することで、標的核酸の分解を検出することができる。
　結果を図9-1に示す（図9-1、左図が第2世代型Staple核酸、図9-1、右図が第一世代型Staple核酸の結果を示す）。第一世代型Staple核酸または第二世代型Staple核酸の導入により、標的核酸の3'末端側「NF1 3'UTR」にグアニン四重鎖構造の形成を誘導することができ、RNaseRの存在下においても、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性に対する標的核酸の耐性が向上し、標的核酸の安定性が向上することを確認できた（図9-1）。ただし、この標的核酸およびStaple核酸の組み合わせの場合には、第一世代型Staple核酸よりも、第二世代型Staple核酸の方が、標的核酸の安定性をより向上することが示された。
　（7-2）タンパク質の発現量増大作用
　本実施例において、細胞内においても、本発明のStaple核酸がグアニン四重鎖構造を標的核酸中に形成することができること、そしてその結果として細胞内においても標的核酸安定性の向上（ひいてはタンパク質の発現亢進）を生じることができるかどうかを確認した。
　本実施例において、上記の（7-1）で使用したNF1の配列を標的核酸として使用し、第二世代型Staple核酸をStaple核酸として使用した。
　MCF-7 #9細胞を10 cm Dishに1.0×105になるよう播種し、10％FBS、1％ペニシリンを含むE-MEM培地10 mlで72時間培養した。80％コンフルエントであることを確認し、培地を10％FBSを含むE-MEM培地10 mlに交換し、3時間培養した。
　細胞を2群に分け、Stapleオリゴヌクレオチドを適用する群については、Stapleオリゴヌクレオチドの配列を発現するpIRES、Stapleオリゴヌクレオチドを適用しない群については、インサートが挿入されていない空のpIRESのベクター溶液を、FuGENE（登録商標）HD Transfection Reagent（Promega E2311）のプロトコルに従い17μg培地に加えた。その後、CO2 5％、37℃で48時間培養した。
　それぞれの細胞を48時間の培養後、培地を除去し、D-PBS(-) 5 mlで2回細胞を洗浄した。RIPA buffer（ナカライテスク）：プロテアーゼインヒビターカクテル（Promega）＝99：1で混合した溶液350μlをDishにかけ、セルスクレーパーを用いて細胞を回収した。細胞溶解液を25 Gのニードルに10回通し、4℃で10分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、6×SDS試料緩衝液（ナカライテスク）と混合し、95℃で5分間加熱した。
　上記のサンプルをMini-PROTEAN TGX Gels（BIO-RAD）を用いて、125 V、126 mAで110分泳動することで分離し、ブロットした。
　タンパク質をブロットしたメンブレンに対して、NF1に対する一次抗体（Neurofibromin 1 D7R7D Rabbit mAb #14623：Cell Signaling Technology）、対照としてのVinculinに対する一次抗体（Vinculin Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody 42H89L44：Invitrogen）をSignal Enhancer HIKARI for Western Blotting and ELISA（ナカライテスク）によって1/1000に希釈した液をかけ、室温で90分震盪した。
　PBSでメンブレンを洗浄したのち、ウサギIgGに対する二次抗体（#7074 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody：Cell Signaling Technology）をSignal Enhancer HIKARI for Western Blotting and ELISAによって1/1000に希釈した液をかけ、室温で60分震盪した。
　PBSでメンブレンを洗浄したのち、Chemi-Lumi One Super（ナカライテスク）をメンブレンにかけ、室温で1分間静置したのちにImageQuant LAS 500（GE Healthcare）でバンドを検出した。
　結果を図9-2に示す。Staple核酸を適用した場合に、適用しなかった場合と比較して、標的核酸であるNF1のタンパク質発現が大幅に増加したことが示された。
　実施例8：本発明のStaple核酸による、単一の標的核酸内でのリボゾームシャント作用の検討（2）
　本実施例においては、第一世代型Staple核酸または第二世代型Staple核酸を使用して、単一の標的核酸の部分配列をリボゾームシャンティングさせる作用が生じることを確認した。
　本実施例において、公知のホタルルシフェラーゼ（F Luc）遺伝子の一部の配列を改変して、第一世代型Staple核酸の標的核酸となるmRNA（SEQ ID NO： 49）の鋳型となる改変F Luc遺伝子のヌクレオチド配列を設計した。この標的核酸としての改変F Luc遺伝子mRNAは、本発明の第一世代型Staple核酸がハイブリダイズして、標的核酸とStaple核酸によりグアニン四重鎖構造が形成された場合に、標的核酸の分子内でリボゾームシャンティングを生じた場合にのみ、機能的なF Lucタンパク質を産生できるように設計したものである。
 
　本実施例においては、上述の標的核酸に対して作用させる第一世代型Staple核酸を以下の通り作製した。具体的には、これらの第一世代型Staple核酸は、上述の標的核酸のヌクレオチド配列の下線部で示すStaple核酸の結合領域でハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列とを含む2種類のStaple核酸（Staple核酸B3（SEQ ID NO： 50）、Staple核酸B4（SEQ ID NO： 51））を作製した。
 
　本実施例においてはまた、第二世代型Staple核酸の標的核酸となるmRNA（SEQ ID NO： 52）の鋳型となる改変F Luc遺伝子のヌクレオチド配列もまた設計した。この標的核酸としての改変F Luc遺伝子mRNAは、本発明の第二世代型Staple核酸がハイブリダイズして、標的核酸とStaple核酸によりグアニン四重鎖構造が形成された場合に、標的核酸の分子内でリボゾームシャンティングを生じた場合にのみ、機能的なF Lucタンパク質を産生できるように設計したものである。
 
　本実施例においてはまた、上述の標的核酸に対して作用させる第二世代型Staple核酸を以下の通り作製した。具体的には、これらの第二世代型Staple核酸は、上述の標的核酸のヌクレオチド配列の下線部で示すStaple核酸の結合領域でハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列、および2個のグアニン繰り返し配列とを含む1種類のStaple核酸（Staple核酸B5（SEQ ID NO： 53））を作製した。
 
　改変F Luc遺伝子mRNA（SEQ ID NO： 49またはSEQ ID NO： 52）をテンプレート（1μg）として、各Staple核酸を0.14μM含むもしくは加えない状態で、無細胞タンパク質発現混合液（RTS 100 Wheat Germ CECF Kit, 5 Prime, Inc）20μLを24℃で150分間反応させた。得られたRNAをmRNAテンプレート（1μg）として、Staple核酸を0.14μM含むか含まない無細胞タンパク質発現混合液（RTS 100 Wheat Germ CECF Kit, 5 Prime, Inc）20μLを24℃で150分間反応させた。励起波長は480 nmに設定し25℃の条件下で蛍光分光光度計（Jasco FP-8500）を用いて蛍光測定を行った。陽性対照として、F Luc遺伝子のヌクレオチド配列に基づいてF Lucを発現させたサンプルを使用し、陰性対照としてはStaple核酸を適用せずに改変F Lucを発現させたサンプルを使用した。
　結果を図10に示す。この図は、陽性対照であるF Luc遺伝子のヌクレオチド配列に基づいてF Lucを発現させた場合のF Lucシグナル強度を100として、改変F Luc発現サンプル（Staple核酸なし）、第一世代型Staple核酸の存在下での改変F Luc発現サンプル（Staple核酸B3、およびStaple核酸B4）（左図）、第二世代型Staple核酸の存在下での改変F Luc発現サンプル（Staple核酸B5）（右図）のF Lucシグナル強度を比較したものである。この結果、改変F Luc発現サンプル（Staple核酸なし）ではF Lucシグナル強度が陽性対照の9.1または6.2％であったのに対して、第一世代型Staple核酸を適用した場合のF Lucシグナル強度は68.4％（Staple核酸B3）、および35.4％（Staple核酸B4）、また第二世代型Staple核酸を適用した場合のF Lucシグナル強度は88.6％（Staple核酸B5）まで強度が増大した。
　実施例9：本発明のStaple核酸による、2種類の標的核酸間でのリボゾームシャント作用の検討
　本実施例においては、第一世代型Staple核酸および第二世代型Staple核酸を使用して、2種類の標的核酸間での部分配列をリボゾームシャンティングさせる作用が生じることを確認した。
　第一世代型Staple核酸を例に、2種類の標的核酸間でのリボソームシャンティングの確認方法の概要を、以下のスキームに示す。具体的には、遺伝子Aの断片と、遺伝子Bの断片とのあいだで（1）のようにStaple核酸によりグアニン四重鎖構造を形成させ、リボゾームがグアニン四重鎖構造の場所で遺伝子AのRNAから遺伝子BのRNAに乗り換えるかどうかを調べることにより、確認した。遺伝子AのRNAから遺伝子BのRNAへの乗り換えは、該当する箇所でリボゾームシャンティングすると、遺伝子A－遺伝子Bの結合により機能性を発揮するようなヌクレオチド配列を準備することにより確認した。なお、（2）～（4）はいずれもグアニン四重鎖構造を形成できない対照として機能するものである。
 
 
　第一世代型Staple核酸がリボゾームシャンティングを生じるかを検討するために、標的配列として、以下の遺伝子Aおよび遺伝子Bの配列を設計した。
 
 
　本実施例においてはさらに、これらの標的核酸に対して（1）の方法において使用する第一世代型Staple核酸および（2）の方法において使用する対照核酸を以下の通り作製した。
 
　第二世代型Staple核酸がリボゾームシャンティングを生じるかを検討するために、標的配列として、以下の遺伝子Aおよび遺伝子Bの配列を設計した。
 
 
　本実施例においてはさらに、これらの標的核酸に対して（1）および（4）の方法において使用する第二世代型Staple核酸（Staple核酸C3）および（2）の方法において使用する対照核酸（対照核酸C4）を以下の通り作製した。
 
　上記の遺伝子Aおよび上記の遺伝子Bを、濃度比において1：1にて混合し、Staple核酸はこれに対し1.5当量加えて90℃から毎分1℃ずつ温度を低下させ、アニーリングさせた。ここで、第一世代型Staple核酸に関しては、（1）の条件についてはStaple核酸C1を、（2）の条件についてはStaple核酸C2を、（3）の条件についてはStaple核酸を添加せず、（4）の条件についてはStaple核酸C1を、それぞれ使用した。
　この複合体mRNA総量1μgを、無細胞タンパク質合成反応溶液（RTS 100 Wheat Germ Kit、biotechrabbit）中12.5μlのmRNA（1μg）として用いた。この反応溶液を24℃で1時間インキュベートした後、Luciferase Assay kit（Promega）とPOWERSCAN・H1 microplate reader（BioTek）を用いてルシフェラーゼ活性を評価した。
　結果を図11に示す。この図からも示されるように、第一世代型Staple核酸でも第二世代型Staple核酸でも同様に、（2）～（4）ではルシフェラーゼの蛍光がほとんど検出されないのに対して、（1）ではルシフェラーゼの蛍光が強く検出された。この結果、本発明のStaple核酸を使用して二分子間でグアニン四重鎖構造を形成させると、その部分でリボゾームが2分子間でシャンティングを生じていることが示された。
　本発明は、オリゴヌクレオチドによりグアニン繰り返し配列を供給し、結果的に標的核酸上のグアニン繰り返しとオリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列の合計4か所のグアニン繰り返し配列により、標的核酸上にグアニン四重鎖構造を形成させることができる、新規Staple核酸（第二世代型Staple核酸）を開発し、提供することができる。本発明はまた、第一世代型Staple核酸および第二世代型Staple核酸について、Staple核酸の新規な用途を提供することができる。

Claims (25)

  1. 　標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドであって、
    　当該G供給型オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記G供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させる、前記G供給型オリゴヌクレオチド。
  2. 　前記G供給型オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
    ・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
    ・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
    にハイブリダイズする、請求項1に記載のG供給型オリゴヌクレオチド。
  3. 　DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせである、請求項1または2に記載のG供給型オリゴヌクレオチド。
  4. 　標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドであって、
    　当該G供給型オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記G供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させる、前記G供給型オリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
  5. 　前記G供給型オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
    ・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
    ・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
    にハイブリダイズする、請求項4に記載の医薬組成物。
  6. 　DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせである、請求項4または5に記載の医薬組成物。
  7. 　標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
    　当該G供給型オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列が、標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸上のグアニン繰り返し配列とG供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離を短くするようにG供給型オリゴヌクレオチドが折り返されるように設計し合成することを特徴とする前記方法。
  8. 　前記G供給型オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
    ・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
    ・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
    にハイブリダイズする、請求項7に記載のG供給型オリゴヌクレオチドを製造する方法。
  9. 　DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせである、請求項7または8に記載のG供給型オリゴヌクレオチドを製造する方法。
  10. 　標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドであって、
    　当該G供給型オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記G供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることによる、標的核酸からのタンパク質発現の抑制方法。
  11. 　前記G供給型オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
    ・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
    ・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
    にハイブリダイズする、請求項10に記載の抑制方法。
  12. 　DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせである、請求項10または11に記載の抑制方法。
  13. 　タンパク質発現の抑制が、逆転写反応の抑制またはタンパク質翻訳反応の抑制によるものである、請求項10または11に記載の抑制方法。
  14. 　標的核酸上の1か所～3か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～1か所のグアニン繰り返し配列、を含むG供給型オリゴヌクレオチドであって、
    　当該G供給型オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記G供給型オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることにより、標的核酸からのタンパク質発現を抑制する、前記G供給型オリゴヌクレオチド
    を含む、タンパク質発現抑制キット。
  15. 　前記G供給型オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
    ・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
    ・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
    にハイブリダイズする、請求項14に記載のタンパク質発現抑制キット。
  16. 　タンパク質発現の抑制が、逆転写反応の抑制またはタンパク質翻訳反応の抑制によるものである、請求項14または15に記載のタンパク質発現抑制キット。
  17. 　標的核酸上の1か所～4か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～0か所のグアニン繰り返し配列、を含むオリゴヌクレオチドであって、
    　当該オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることにより、標的核酸の一部にループ部分が形成されてリボゾームが当該ループ部分をシャントし、標的核酸から改変タンパク質を製造する方法。
  18. 　前記オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
    ・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
    ・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
    にハイブリダイズする、請求項17に記載の改変タンパク質を製造する方法。
  19. 　DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせである、請求項17または18に記載の改変タンパク質を製造する方法。
  20. 　第1の標的核酸上の1か所～2か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列、
    　第2の標的核酸上の1か所～2か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第2ヌクレオチド配列、および
    　第1の標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数および第2の標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて2か所～0か所のグアニン繰り返し配列、
    を含むオリゴヌクレオチドであって、
    　当該オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列の第1の標的核酸へのハイブリダイズおよび第2ヌクレオチド配列の第2の標的核酸へのハイブリダイズ、および当該オリゴヌクレオチドがこれら標的核酸の立体構造を変化させ、前記第1の標的核酸上の1か所～2か所のグアニン繰り返し配列、第2の標的核酸上の1か所～2か所のグアニン繰り返し配列、および前記オリゴヌクレオチド上の2か所～0か所グアニン繰り返し配列の合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることにより、第1の標的核酸と第2の標的核酸との間でリボゾームがシャントすることによる、第1の標的核酸の部分配列の翻訳物と第2の標的核酸の部分配列の翻訳物とを融合タンパク質を製造する方法。
  21. 　前記オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
    ・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
    ・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
    にハイブリダイズする、請求項20に記載の融合タンパク質を製造する方法。
  22. 　DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせである、請求項20または21に記載の融合タンパク質を製造する方法。
  23. 　標的核酸上の1か所～4か所のグアニン繰り返し配列を含むヌクレオチド配列部分に対し、前記グアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列、および標的核酸上のグアニン繰り返し配列の数に応じて3か所～0か所のグアニン繰り返し配列、を含むオリゴヌクレオチドであって、
    　当該オリゴヌクレオチドが、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の標的核酸へのハイブリダイズにより標的核酸の立体構造を変化させ、前記標的核酸上のグアニン繰り返し配列と前記オリゴヌクレオチド上のグアニン繰り返し配列との合わせて4か所のグアニン繰り返し配列の空間的距離が短くなり、それら4か所のグアニン繰り返し配列によるグアニン四重鎖構造を形成させることにより、標的核酸に対する核酸分解酵素の結合を阻害または核酸分解酵素の機能を阻害することによる、標的核酸を安定化させる方法。
  24. 　前記オリゴヌクレオチドの第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列が、標的核酸上のグアニン繰り返し配列の
    ・3'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分、
    ・5'末端側のグアニン繰り返し配列の5'側または3'側のヌクレオチド配列部分
    にハイブリダイズする、請求項23に記載の標的核酸を安定化させる方法。
  25. 　DNA、RNA、修飾核酸、またはこれらの組み合わせである、請求項23または24に記載の標的核酸を安定化させる方法。
     

     
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